Способ качественного и количественного колориметрического определения формальдегида в молоке Российский патент 2023 года по МПК G01N33/04 

Изобретение относится к области аналитической химии и может быть использовано для качественного и количественного колориметрического определения формальдегида в молоке. Формальдегид является канцерогеном и аллергеном, поэтому определение его содержания в продуктах питания представляет собой важную задачу для контроля их качества.

Известен способ определения формальдегида в пищевых продуктах [1], в соответствии с которым выполняют дериватизацию формальдегида с помощью 2,4-динитрофенилгидразина и выделение продукта реакции в ацетонитрил, который относится к токсичным органическим растворителям. Для очистки проб с высоким содержанием жиров выполняют экстракцию в н-гексан, насыщенный ацетонитрилом (10 см³ на одну пробу). На следующей стадии проводят фильтрацию полученного раствора и определяют содержание дериватива формальдегида методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с ультрафиолетовым детектированием (ВЭЖХ-УФ), используя в качестве подвижной фазы смесь воды и ацетонитрила в соотношении 40:60 соответственно.

Известен способ определения формальдегида в жидкостях [2], в соответствии с которым выполняют центрифугирование пробы на высокоскоростной центрифуге, ультрафильтрацию полученного супернатанта и определение содержания формальдегида спектрофотометрическим методом. Для этого в спектральную кювету помещают раствор гидроксида натрия, фотометрический фенольный реагент и супернатант пробы. Способ предполагает длительное термостатирование реакционной смеси (в течение 30 мин) для образования окрашенного раствора дериватива, оптическая плотность которого пропорциональна концентрации формальдегида в пробе.

Для определения концентрации формальдегида флуориметрическим методом в соответствии с [3] выполняют предварительную перегонку определяемого вещества с водяным паром. Далее к дистилляту добавляют раствор 1,3-циклогександиона и уксуснокислого аммония, после чего смесь подвергают длительному термостатированию (45 мин при температуре 60°С). Измеряют интенсивность флуоресценции раствора дериватива, которая пропорциональна концентрации формальдегида в пробе.

Известен способ качественного определения формальдегида в молоке [4], основанный на способности формальдегида восстанавливать AgNO₃ до металлического серебра в щелочной среде. Для проведения качественного анализа пробу молока переносят в колориметрический цилиндр, добавляют растворы нитрата серебра и гидроксида натрия, встряхивают и термостатируют, после чего наблюдают за изменением цвета реакционной смеси. Тест на формальдегид считают положительным при появлении окраски металлического серебра.

Также известен способ качественного определения формальдегида в молоке [5], предполагающий введение в пробу концентрированной серной кислоты со следами азотной кислоты. Полученную смесь перемешивают и по появлению окрашенного продукта реакции судят о наличии формальдегида в молоке.

Учитывая тот факт, что формальдегид вырабатывается в небольших количествах большинством живых организмов в рамках метаболических процессов и, следовательно, может присутствовать в молоке естественным образом, недостатком способов качественного определения является отсутствие возможности количественной оценки содержания формальдегида, на основании которой можно судить о пригодности продукта к употреблению.

Наиболее близким к заявленному изобретению и выбранным в качестве прототипа является способ определения формальдегида в молоке [6], включающий осаждение белков, дериватизацию формальдегида с использованием 2,4-динитрофенилгидразина, экстракцию полученного деривата в ацетонитрил с вымораживанием водной фазы при -4°С в течение нескольких часов и ВЭЖХ-УФ анализ жидкой органической фазы с выделенным в нее дериватом. Недостатком предложенного способа является использование токсичного органического растворителя ацетонитрила, который к тому же является прекурсором запрещенных веществ. Кроме того, стадия экстракции предполагает длительное вымораживание водной фазы, что негативно сказывается на производительности предложенного способа.

Техническим результатом заявленного изобретения по сравнению с прототипом является производительный и экологичный способ подготовки проб молока, позволяющий качественно и количественно определять формальдегид в молоке.

Техническая задача заявленного изобретения состоит в сокращении объема применяемого экстрагента, использовании экологически безопасного растворителя, увеличении производительности.

Указанный технический результат достигается тем, что на этапе пробоподготовки для осаждения белков пробу молока подкисляют соляной кислотой и нагревают смесь при 80±5°С в течение 5 мин, после чего центрифугируют в течение 5 мин и путем добавления концентрированного раствора гидроксида натрия доводят рН полученного супернатанта до значения 5,0-5,5, необходимого для последующего этапа дериватизации, который осуществляется добавлением смешанного реактива (водный раствор ацетилацетона, уксусной кислоты и ацетата аммония в мольном соотношении 1:1:30 соответственно) к отобранному супернатанту. Образование и экстракция деривата в природный экологически безопасный растворитель - тимол, происходит одновременно при нагревании (80±5°С) и перемешивании в течение 8-10 мин. Разделение водной и органической фаз достигают путем центрифугирования при 5000 об/мин в течение 5 мин, после чего с помощью дозатора отбирают 0,015 см³ верхней фазы экстракта и наносят ее тонким слоем на бумажную подложку для застывания. В качестве материала подложки используют черную бумагу, поскольку она не дает фонового сигнала на спектре флуоресценции. Качественное определение формальдегида проводят путем сравнения исходного цвета экстрагента и цвета полученного экстракта на подложке, появление желтой окраски свидетельствет о содержании формальдегида ≥300 мкг/дм³ (естественное содержание формальдегида в молоке варьируется в диапазоне 100-300 мкг/дм³). Количественное определение проводят путем помещения подложки с экстрактом в держатель для твердых образцов в спектрофлуориметр и измерения интенсивности флуоресценции деривата на подложке при длинах волн возбуждения и эмиссии 420 и 494 нм соответственно. Количественное определение аналита в пробе проводят с использованием метода абсолютной градуировки. Предложенный способ обеспечивает степень извлечения формальдегида от 83 до 100%. Предел обнаружения составляет 15 мкг/дм³, диапазон определяемых концентраций 45-500 мкг/дм³, время проведения одного анализа - 35 мин.

Отличительными признаками заявляемого способа от наиболее близкого аналога, взятого за прототип, являются:

- использование в качестве экстрагента тимола - природного растворителя с низкой температурой плавления (50,5°С);

- использованием микрообьемов органического экстрагента (тимола);

- проведение жидкостной экстракции при нагревании (80±5), что значительно сокращает лимитирующую стадию пробоподготовки;

- качественное определение формальдегида за счет визуальной фиксации изменения интенсивности окраски экстракта.

Заявляемые отличительные признаки позволяют проводить качественное и количественное определение формальдегида в молоке без использования токсичных органических экстрагентов и больших временных затрат при сохранении чувствительности способа в случае количественного определения.

Заявленный способ был апробирован в лабораторных условиях СПбГУ, результаты апробации представлены в виде конкретных примеров реализации. Исследования проведены с использованием оборудования ресурсного центра «Методы анализа состава вещества» Научного парка СПбГУ и инструментального обеспечения кафедры аналитической химии.

Пример 1.

Пробоотбор

Образец молока №1 был приобретен в местном супермаркете (г. Санкт-Петербург). Сохранность продукта обеспечивали соблюдением условий, указанными производителем на упаковке.

Пробоподготовка

На первом этапе для устранения мешающего влияния компонентов пробы проводили денатурацию и осаждение белков. Для этого к 7,0 см³ пробы молока добавляли 1,4 см³ соляной кислоты с концентрацией 4,0 моль/дм³. Полученную смесь нагревали в течение 5 мин при 75°С, перемешивали и центрифугировали при 5000 об/мин в течение 5 мин. Далее к 5,0 см³ надосадочного раствора добавляли 290 мкл водного раствора гидроксида натрия с концентрацией 10 моль/дм³ для установления рН=5,0. На втором этапе проводили дериватизацию формальдегида для получения окрашенной в желтый цвет формы, в том числе способной к флуоресценции, а также концентрировали продукт реакции путем микроэкстракции для снижения пределов обнаружения. Для дериватизации формальдегида в узком эппендорфе к аликвоте 4,0 см³ полученного раствора добавляли 0,4 см³ раствора смешанного реактива, представляющего собой водный раствор ацетилацетона, уксусной кислоты и ацетата аммония в мольном соотношении 1:1:30 соответственно, и 0,1 см³ расплава тимола. Эппендорф помещали в термостат при 80°С и перемешивали смесь в течение 8 мин. Далее проводили центрифугирование при 5000 об/мин в течение 5 мин, с помощью дозатора отбирали 0,015 см³ фазы экстракта и наносили ее тонким слоем на подложку из черной бумаги (овал 6×12 мм). Экстракт оставляли на подложке при комнатной температуре до застывания.

Анализ

Качественное определение формальдегида проводили визуально. Изменения окраски не наблюдалось.

Количественное определение формальдегида проводили при помощи спектрофлуориметра. Подложку с застывшей фазой экстракта помещали в держатель для твердых образцов в спектрофлуориметр для измерения интенсивности флуоресценции при длинах волн возбуждения и эмиссии 420 и 494 нм соответственно. Количественное определение аналита в пробе проводили с использованием метода абсолютной градуировки. Результаты анализа представлены в таблице 1. Содержание формальдегида в пробе составило 105 мкг/дм³, что не превышает норм естественного содержания формальдегида в молоке.

Пример 2.

Пробоотбор

Образец молока №2 был приобретен в местном супермаркете (г. Санкт-Петербург). Сохранность продукта обеспечивали соблюдением условий, указанными производителем на упаковке.

Пробоподготовка

На первом этапе для устранения мешающего влияния компонентов пробы проводили денатурацию и осаждение белков. Для этого к 7,0 см³ пробы молока добавляли 0,5 см³ концентрированной соляной кислоты. Полученную смесь нагревали в течение 5 мин при 80°С, перемешивали и центрифугировали при 5000 об/мин в течение 5 мин. Далее к 5,0 см³ надосадочного раствора добавляли 300 мкл водного раствора гидроксида натрия с концентрацией 10 моль/дм³ для установления рН=5,3. На втором этапе проводили дериватизацию формальдегида для получения окрашенной в желтый цвет формы, в том числе способной к флуоресценции, а также концентрировали продукт реакции путем микроэкстракции для снижения пределов обнаружения. Для дериватизации формальдегида в узком эппендорфе к аликвоте 4,0 см³ полученного раствора добавляли 0,4 см³ раствора смешанного реактива, представляющего собой водный раствор ацетилацетона, уксусной кислоты и ацетата аммония в мольном соотношении 1:1:30 соответственно, и 0,1 см³ расплава тимола. Эппендорф помещали в термостат при 80°С и перемешивали смесь в течение 9 мин. Далее проводили центрифугирование при 5000 об/мин в течение 5 мин, с помощью дозатора отбирали 0,015 см³ фазы экстракта и наносили ее тонким слоем на подложку из черной бумаги (овал 6×12 мм). Экстракт оставляли на подложке при комнатной температуре до застывания.

Анализ

Качественное определение формальдегида проводили визуально. Изменения окраски не наблюдалось.

Количественное определение формальдегида проводили при помощи спектрофлуориметра.

Подложку с застывшей фазой экстракта помещали в держатель для твердых образцов в спектрофлуориметр для измерения интенсивности флуоресценции при длинах волн возбуждения и эмиссии 420 и 494 нм соответственно. Количественное определение аналита в пробе проводили с использованием метода абсолютной градуировки. Результаты анализа представлены в таблице 2. Содержание формальдегида в пробе составило 117 мкг/дм³, что не превышает норм естественного содержания формальдегида в молоке.

Пример 3.

Пробоотбор

Образец молока №2 был приобретен в местном супермаркете (г. Санкт-Петербург). Сохранность продукта обеспечивали соблюдением условий, указанными производителем на упаковке.

Пробоподготовка

На первом этапе для устранения мешающего влияния компонентов пробы проводили денатурацию и осаждение белков. Для этого к 8,0 см³ пробы молока добавляли 0,6 см³ концентрированной соляной кислоты. Полученную смесь нагревали в течение 5 мин при 85°С, перемешивали и центрифугировали при 5000 об/мин в течение 5 мин. Далее к 5,0 см³ надосадочного раствора добавляли 300 мкл водного раствора гидроксида натрия с концентрацией 10 моль/дм³ для установления рН=5,5. На втором этапе проводили дериватизацию формальдегида для получения окрашенной в желтый цвет формы, в том числе способной к флуоресценции, а также концентрировали продукт реакции путем микроэкстракции для снижения пределов обнаружения. Для дериватизации формальдегида в узком эппендорфе к аликвоте 4,0 см³ полученного раствора добавляли 0,4 см³ раствора смешанного реактива, представляющего собой водный раствор ацетилацетона, уксусной кислоты и ацетата аммония в мольном соотношении 1:1:30 соответственно, и 0,1 см³ расплава тимола. Эппендорф помещали в термостат при 80°С и перемешивали смесь в течение 10 мин. Далее проводили центрифугирование при 5000 об/мин в течение 5 мин, с помощью дозатора отбирали 0,015 см³ фазы экстракта и наносили ее тонким слоем на подложку из черной бумаги (овал 6×12 мм). Экстракт оставляли на подложке при комнатной температуре до застывания.

Анализ

Качественное определение формальдегида проводили визуально. Изменения окраски не наблюдалось.

Количественное определение формальдегида проводили при помощи спектрофлуориметра. Подложку с застывшей фазой экстракта помещали в держатель для твердых образцов в спектрофлуориметр для измерения интенсивности флуоресценции при длинах волн возбуждения и эмиссии 420 и 494 нм соответственно. Количественное определение аналита в пробе проводили с использованием метода абсолютной градуировки. Результаты анализа представлены в таблице 3. Содержание формальдегида в пробе составило 108 мкг/дм³, что не превышает норм естественного содержания формальдегида в молоке.

Предложенный способ прост в реализации, обеспечивает высокую производительность и чувствительность определения за счет микроэкстракционного концентрирования, исключает использование токсичных растворителей, что полностью соответствует современным тенденциям «зеленой» аналитической химии. Способ может быть использован пищевыми лабораториями для контроля качества молочных продуктов.

Список использованных источников информации

1. CN 109342620 A "Method for rapidly determining formaldehyde in foods by derivative extraction method".

2. CN 105606603 A "Method for measuring formaldehyde content in liquid".

3. ГОСТ P 55227-2012 "ВОДА. Методы определения содержания формальдегида".

4. CN 1266469 С "Quick detecting method for formaldehyde in fresh milk".

5. SU 1727060 A1 "Способ определения наличия формальдегида в молоке".

6. F.B. de Freitas Rezende et al., "Determination of formaldehyde in bovine milk using a high sensitivity HPLC-UV method", Microchem. J., vol. 134, pp. 383-389, 2017, doi: 10.1016/j.microc.2017.07.003 (прототип).

Изобретение относится к молочной промышленности и касается качественного и количественного колориметрического определения формальдегида в молоке. Предварительно проводят денатурацию и осаждение белков пробы молока путем подкисления соляной кислотой, нагревания полученной смеси и центрифугирования. Создают необходимый для реакции рН при помощи раствора гидроксида натрия, добавляют раствор смешанного реактива: водный раствор ацетилацетона, уксусной кислоты и ацетата аммония и нагревают. Микроэкстракцию полученного деривата проводят в микрообъем расплавленного тимола. Разделение водной и органической фаз достигают путем центрифугирования; после чего отбирают верхнюю фазу экстракта, наносят ее тонким слоем на подложку из черной бумаги и проводят визуальное и/или инструментальное – спектрофлуориметрическое определение. Количественное определение аналита в пробе проводят на основе предварительно построенного градуировочного графика с применением калибровочных растворов аналита. Изобретение позволяет полностью исключить применение токсичных растворителей, обеспечить низкий расход реагентов и безопасных растворителей, а также высокую производительность и чувствительность определения. 1 з.п. ф-лы, 3 табл., 3 пр.

1. Способ качественного и количественного колориметрического определения формальдегида в молоке, включающий осаждение белков, дериватизацию, жидкостную экстракцию деривата в экстрагент и анализ экстракта, отличающийся тем, что осаждение белков осуществляют смешиванием соляной кислоты и пробы молока в объемном соотношении 1:13-1:15 при 80±5°С в течение 5 мин, после чего смесь центрифугируют и рН полученного супернатанта доводят до значения 5,0-5,5 добавлением концентрированного раствора гидроксида натрия, дериватизацию формальдегида и экстракцию полученного деривата проводят одновременно путем добавления реакционной смеси, состоящей из водного раствора ацетилацетона, уксусной кислоты и ацетата аммония, взятых в мольных соотношениях 1:1:30 соответственно, и предварительно расплавленного экстрагента тимола к отобранному супернатанту в объемных соотношениях 1:10 и 1:40 соответственно, смесь перемешивают и нагревают при температуре 80±5°С в течение 8-10 мин, после чего центрифугируют, отбирают верхнюю органическую фазу экстракта, наносят ее на подложку и оставляют на открытом воздухе для застывания; после чего осуществляют визуальное сравнение исходного цвета экстрагента и цвета полученного экстракта на подложке и по изменению интенсивности окраски судят о присутствии формальдегида в пробе, количественное определение проводят путем измерения интенсивности флуоресценции деривата на подложке при длинах волн возбуждения и эмиссии 420 и 494 нм соответственно.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что центрифугирование осуществляют в течение 5-10 мин при 5000 об/мин.