АНАЛОГИ ИНСУЛИНА ДЛИТЕЛЬНОГО ДЕЙСТВИЯ И ИХ ПРОИЗВОДНЫЕ Российский патент 2022 года по МПК C07K14/62 C12P21/02 C07K1/14 A61K38/28 

Область изобретения

Настоящее изобретение относится к аналогам инсулина длительного действия и их производным, и более конкретно к аналогам инсулина длительного действия, имеющим увеличенный период полувыведения in vivo, в которых заменена аминокислота в положении 22 В-цепи нативного инсулина, и дополнительно заменены одна или более аминокислот А-цепи или В-цепи нативного инсулина, и к производным аналогов инсулина длительного действия, имеющим дополнительно увеличенный период полувыведения in vivo, в которых альбумин-связывающий домен дополнительно слит с аналогами инсулина длительного действия.

Предшествующий уровень техники

Диабет представляет собой метаболическое заболевание, отличающееся высокими уровнями глюкозы, и развивается в результате сочетания генетических факторов и факторов окружающей среды. Диабет включает диабет 1-го типа, диабет 2-го типа, гестационный диабет и другие состояния, которые вызывают гипергликемию. Диабет подразумевает нарушение метаболизма, при котором поджелудочная железа продуцирует недостаточные количества инсулина или при котором клетки организма человека не способны соответствующим образом отвечать на инсулин, и, таким образом, их способность поглощать глюкозу нарушается. В результате, глюкоза накапливается в крови.

Диабет 1-го типа, также называемый инсулинозависимым сахарным диабетом (IDDM - от англ. insulin-dependent diabetes mellitus) и юношеским диабетом, обусловлен разрушением бета-клеток, приводящим к абсолютному дефициту инсулина. С другой стороны, диабет 2-го типа, известный как инсулиннезависимый сахарный диабет (NIDDM - от англ. non-insulin dependent diabetes mellitus) и приобретенный диабет, ассоциирован с преобладающей инсулинорезистентностью и, таким образом, относительным дефицитом инсулина и/или преобладающим дефектом секреции инсулина с инсулинорезистентностью.

В частности, диабет ассоциирован с разными осложнениями, такими как сердечно-сосудистое заболевание и ретинопатия, и, вследствие этого, представляет собой заболевание, которое становится очень тяжелым, если не оказывается надлежащий контроль течения заболевания, как например, контроль уровня глюкозы в крови. Ожидается, что мировой рынок лекарственных средств против диабета расширится с $ 41,7 миллиарда в 2015 году до $ 66,1 миллиардов к 2022 году, и, как ожидается, станет вторым по величине после рынка противораковых лекарственных средств. Глобально, имеется 422 миллиона взрослых людей с диабетом в 2014 году, что составляет 8,5% всего взрослого населения, почти в два раза больше, по сравнению с 4,5% в 1980 году (ВОЗ (Всемирная организация здравоохранения), 2016 год). Кроме того, общие всемирные расходы на здравоохранение из-за диабета оцениваются на уровне $ 673 миллиардов, и ожидается, что число пациентов с диабетом в возрасте 20-79 лет будет увеличиваться до примерно 620 миллионов к 2040 году.

Наиболее репрезентативные способы лечения диабета включают способ введения инсулина для контроля уровня глюкозы в крови пациента до нормального уровня. Инсулин представляет собой гормон, регулирующий уровень глюкозы в крови, который секретируется в поджелудочной железе человека. Он функционирует, осуществляя перенос избытка глюкозы в крови к клеткам, снабжая клетки энергией и поддерживая уровни глюкозы в крови на нормальных уровнях.

Когда была разработана технология изготовления рекомбинантных белков, множество препаратов инсулина было выпущено в продажу. Препараты инсулина можно широко подразделить на пять типов в соответствии с их действием. Среди данных препаратов, инсулин короткого действия, который демонстрирует самое быстрое действие, отличается тем, что он демонстрирует быструю эффективность, начинает действовать через 1-20 минут и демонстрирует самую высокую эффективность, спустя примерно 1 час, и его эффективность сохраняется в течение 3-5 часов. Типичные препараты короткого действия включают инсулин аспарт (NovoRapid^®), инсулин лизпро (Humalog^®) и инсулин глулизин (Apidra^®). Инсулин, который демонстрирует второе по быстроте действие, представляет собой регулярный инсулин. Регулярный инсулин начинает снижать уровни глюкозы в крови через 30 минут после введения и демонстрирует самую высокую эффективность через 2-4 часа, и его эффективность сохраняется в течение 6-8 часов. Типичные препараты регулярного инсулина включают Actrapid^®, Humilin^® R, Hypurin Neutral и т.п. Инсулин средней продолжительности действия представляет собой вещество, полученное посредством добавления протамина или цинка для замедления его действия. Данный инсулин начинает действовать через примерно 1 час 30 минут после инъекции, и его эффективность достигает самого высокого уровня через 4-2 часов и сохраняется в течение 16-24 часов. Типичные препараты средней продолжительности действия включают Protaphane^®, Humulin^® NPH и Hypurin Isophane^®. Инсулин комбинированного действия получают посредством предварительного смешивания инсулина короткого действия или регулярного инсулина с инсулином средней продолжительности действия, таким образом, что два данных вида инсулина можно легко вводить посредством одной единственной инъекции. Имеющиеся в продаже препараты инсулина комбинированного действия включают NovoMix^® 30 (30% инсулина аспарт и 70% протамин-кристаллического инсулина аспарт), Humalog^®Mix 25 (25% инсулина лизпро и 75% протаминовой суспензии инсулина лизпро) и Humalog^®Mix 50 (50% инсулина лизпро и 50% протаминовой суспензии инсулина лизпро). Наконец, инсулин длительного действия инъецируют один раз или два раза в сутки, и его эффективность сохраняется в течение вплоть до 24 часов. Он обычно используется в качестве базального инсулина, и имеющиеся в продаже препараты инсулина длительного действия включают La nt us^® (инсулин гларгин, ЕР 0368187), Leve mir^® (инсулин детемир, США 5750497) и Tresiba^® (инсулин деглудек, США 7615532).

Инсулин используют в разных применениях, в зависимости от его действия. Для диабета 1-го типа помимо регулярного инсулина или инсулина короткого действия нужно вводить инсулин длительного действия, и для диабета 2-го типа, при котором требуется инсулинотерапия, регулярный инсулин или инсулин короткого действия можно вводить вместе с инулином длительного действия или можно также вводить только инсулин длительного действия.

Как описано выше, введение инсулина представляет собой наиболее типичный способ лечения диабета. Однако, инсулины длительного действия являются неудобными тем, что они должны вводиться один раз или два раза в сутки, поскольку их период полувыведения еще не является достаточно длительным. Это причиняет неудобство пациентам с диабетом, которые самостоятельно вводят инсулин посредством инъекции.

В настоящее время коммерческие препараты базального инсулина представляют собой главным образом композиции для ежесуточного введения, и не существует препарата, обладающего улучшенным удобством введения, по сравнению с данными препаратами. В Novo Nordisk разработали аналог инсулина (США №2011/0092419 А1), имеющий увеличенный период полувыведения in vivo, за счет введения мутации в последовательность инсулина, таким образом, чтобы обладать устойчивостью к протеазам in vivo, и также разработали инсулин, имеющий дополнительно увеличенный период полувыведения, посредством ацилирования аналога инсулина (WO 2009/115469, WO 2011/161125), но данный инсулин может быть использован в качестве композиции для ежесуточного введения. В Hanmi Pharmaceuticals разработали инсулин, имеющий увеличенный период полувыведения в результате конъюгирования области Fc с аналогом инсулина (KR 10-2015-0087130). Однако, способ получения инсулина, разработанный Hanmi Pharmaceuticals, является сложным, поскольку инсулин и Fc получают по отдельности и подвергают ПЭГилированию.

Таким образом, настоящее изобретение предназначено для устранения описанных выше проблем для минимизации неудобства, с которым встречаются, когда число инъекций является большим при применении традиционного базального инсулина, разработки инсулина, время действия которого увеличено, и также улучшения способа его получения.

Альбумин представляет собой наиболее многочисленный белок в крови, и оказывает действие на in vivo фармакокинетику многих лекарственных средств, и, вследствие этого, многие исследования проводились для осуществления контроля аффинности связывания лекарственных средств в отношении альбумина при разработке нового лекарственного средства. Например, для разработки инсулина длительного действия в Novo Nordisk разработали препарат (инсулин детемир, инсулин деглудек), который может всасываться из подкожной ткани (участок введения) в кровь с пониженной скоростью, посредством ацилирования инсулина жирной кислотой, обладающей аффинностью связывания в отношении альбумина. Аффинность связывания жирных кислот в отношении альбумина демонстрирует высокую корреляцию со скоростью всасывания инсулина. Когда инсулин ацилирован жирной кислотой, обладающей высокой аффинностью связывания в отношении альбумина, период полувыведения инсулина увеличивается. Например, инсулин детемир связывается с альбумином в крови, таким образом, увеличивая свой период полувыведения. Когда человеческий инсулин вводили внутривенно, он имел период полувыведения 2,4 минуты, тогда как инсулин детемир имел период полувыведения от 18 до 25 минут, который был по меньшей мере в 10 раз длительнее. Инсулин деглудек обладал повышенной в 2,4 раза аффинностью связывания в отношении альбумина, по сравнению с инсулином детемир, и, таким образом, имел увеличенный период полувыведения.

Однако, ацилированный инсулин обладает аффинностью связывания (Kd), составляющей несколько мМ (Biochem. J. 312, 725-731 (1995)) в отношении альбумина, и, таким образом, не имеет улучшенных фармакокинетических профилей, по сравнению с композициями для ежесуточного введения. Соответственно, настоящее изобретение предназначено для максимизации эффекта увеличения периода полувыведения, вызываемого альбумином, посредством использования альбумин-связывающего домена (ABD - от англ. albumin-binding domain), чья аффинность связывания в отношении альбумина достигает уровней пМ.

Соответственно, авторы настоящего изобретения сделали всесторонние попытки разработать инсулин длительного действия, имеющий улучшенный период долговечности, который устраняет неудобство, заключающееся в частом введении инсулина пациентам с диабетом, и, в результате, обнаружили, что производное аналога инсулина, полученное посредством замены одной или более аминокислот А-цепи и В-цепи нативного инсулина и дополнительно слияния альбумин-связывающего домена, имеет значимо увеличенный период полувыведения in vivo, осуществляя, таким образом, настоящее изобретение.

Раскрытие изобретения

Техническая проблема

Цель настоящего изобретения заключается в предложении нового аналога инсулина, который демонстрирует устойчивость к расщеплению под действием клострипаина, а также увеличенный период полувыведения in vivo, нуклеотида, кодирующего данный аналог, вектора, содержащего данный нуклеотид, и рекомбинантного микроорганизма, имеющего введенный в него данный вектор.

Еще одна цель настоящего изобретения заключается в предложении нового производного аналога инсулина, которое демонстрирует устойчивость к расщеплению ферментом клострипаин, а также увеличенный период полувыведения in vivo, нуклеотида, кодирующего данное производное аналога, вектора, содержащего данный нуклеотид, и рекомбинантного микроорганизма, имеющего введенный в него данный вектор.

Еще одна цель настоящего изобретения заключается в предложении способа получения активной формы производного аналога инсулина длительного действия, имеющего увеличенный период полувыведения in vivo.

Техническое решение

Для достижения цели, приведенной выше, согласно настоящему изобретению предложен аналог инсулина, содержащий вариант В-цепи инсулина, представленный аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 2, аргинин (Arg) в положении аминокислоты 22 В-цепи инсулина замещен лизином (Lys) в нативном инсулине.

Согласно настоящему изобретению также предложен полинуклеотид, кодирующий аналог инсулина.

Согласно настоящему изобретению также предложен рекомбинантный вектор, содержащий данный полинуклеотид.

Согласно настоящему изобретению также предложен рекомбинантный микроорганизм, имеющий введенный в него данный рекомбинантный вектор.

Согласно настоящему изобретению также предложено производное аналога инсулина длительного действия, в котором альбумин-связывающий домен слит с аналогом инсулина.

Согласно настоящему изобретению также предложен полинуклеотид, кодирующий производное аналога инсулина.

Согласно настоящему изобретению также предложен рекомбинантный вектор, который содержит полинуклеотид, кодирующий аналог инсулина, и полинуклеотид, кодирующий альбумин-связывающий домен, содержащий альбумин-связывающий мотив, представленный следующей аминокислотной последовательностью:

GVSDFYKKLIX_aKAKTVEGVEALKX_bX_cl,

где:

X_a независимо выбран из D и Е,

X_b независимо выбран из D и Е, и

Х_с независимо выбран из А и Е.

Согласно настоящему изобретению также предложен рекомбинантный микроорганизм, имеющий вставленный в него рекомбинантный вектор.

Согласно настоящему изобретению также предложен способ получения активной формы производного аналога инсулина длительного действия, имеющего увеличенный период полувыведения in vivo, причем способ включает следующие стадии: а) культивирование рекомбинантного микроорганизма; (b) лизис культивированного рекомбинантного микроорганизма, с получением, таким образом, производного аналога инсулина длительного действия; (с) индукция повторного сворачивания полученного производного аналога инсулина длительного действия, с получением, таким образом, препроформы производного аналога инсулина; (d) превращение препроформы производного аналога инсулина в активную форму посредством обработки клострипаином и СрВ; и (е) очистка активной формы производного аналога инсулина длительного действия.

Краткое описание графических материалов

На Фиг. 1 показаны результаты анализа стабильности аналога инсулина, слитого с ABD, сконструированного посредством замены аргинина (Arg) в положении 22 В-цепи инсулина лизином (Lys), посредством обработки клострипаином. Масс-спектрометрия показала, что когда в В-цепи инсулина содержался аргинин (Arg) в положении 22, происходило ее расщепление, а когда аргинин (Arg) был заменен лизином (Lys), расщепления В-цепи не происходило.

На Фиг. 2 показаны результаты анализа экспрессии производных аналога инсулина, слитых с ABD, 1-10 в рекомбинантных E.coli посредством SDS-PAGE (от англ. sodium dodecyl sulphate - polyacrylamide gel electrophoresis - электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия). Даже когда одну или более мутаций вводили в последовательность инсулина, сохранялась экспрессия белка в E.coli.

На Фиг. 3 показаны результаты отслеживания солюбилизации и повторного сворачивания аналога инсулина 4, слитого с ABD, посредством ОФ-ВЭЖХ (Обращенно-фазовая высоко-эффективная жидкостная хроматография). Когда структура белка была несвернута в результате солюбилизации и сопровождалась индукцией повторного сворачивания, наблюдали сдвиг времени удерживания в ОФ-ВЭЖХ вследствие образования трехмерной структуры.

На Фиг. 4 показаны результаты, полученные посредством проведения ферментативной реакции в соответствии с примером настоящего изобретения и подтверждения эффектов повышения эффективности превращения в активную форму инсулина и уменьшения примесей (молекулярная масса основной примеси: 10296 Да; молекулярная масса активной формы инсулина: 11238 Да).

На Фиг. 5 показаны результаты анализа аналога инсулина 4, слитого с ABD, посредством SDS-PAGE после расщепления инсулина клострипаином и СрВ и его очистки.

На Фиг. 6 показаны результаты анализа эксклюзионной хроматографии, проводимого для исследования того, образовывался ли гексамер при добавлении цинка и фенола к аналогу инсулина, слитому с ABD, в соответствии с примером настоящего изобретения.

На Фиг. 7 показаны результаты оценки способности аналогов инсулина, слитых с ABD, снижать уровень глюкозы в крови в соответствии с примером настоящего изобретения.

Наилучший способ осуществления изобретения

Если не определено иное, все технические и научные термины, используемые в данном документе, имеют то же значение, обычно подразумеваемое одним из средних специалистов в области, к которой принадлежит данное раскрытие. Обычно, номенклатура, используемая в данном документе, и экспериментальные способы, которые будут описаны ниже, хорошо известны и обычно используются в данной области.

В настоящем изобретении обнаружили, что аналог инулина, в котором аминокислота аргинин (Arg) в положении 22 В-цепи нативного инсулина заменена с аргинина (Arg) на лизин (Lys), и одна или более аминокислот А-цепи или В-цепи нативного инсулина дополнительно заменены, имеет увеличенный период полувыведения in vivo, и, в то же время, может быть легко получен с использованием микроорганизма. Кроме того, обнаружили, что когда альбумин-связывающий домен дополнительно слит с аналогом инсулина, период полувыведения in vivo аналога инсулина может быть дополнительно увеличен.

Настоящее изобретение включает слитый белок инсулин-ABD, имеющий значимо увеличенный период полувыведения, в котором альбумин-связывающий домен (ABD), обладающий высокой аффинностью связывания в отношении альбумина, слит с нативным инсулином таким образом, что скорость всасывания инсулина в кровь может быть снижена, и таким образом, что стабильность инсулина в крови может быть повышена. Кроме того, настоящее изобретение включает аналог инсулина, в котором аминокислота аргинин (Arg) в положении 22 В-цепи нативного инсулина заменена с аргинина (Arg) на лизин (Lys), и/или заменены одна или более аминокислот А-цепи или В-цепи нативного инсулина, что минимизирует, таким образом, расщепление протеазами или удаление, опосредованное инсулиновым рецептором. Кроме того, настоящее изобретение включает слитый белок аналог инсулина-ABD, в котором указанный разнообразный аналог инсулина слит с альбумин-связывающим доменом (ABD). Данный слитый белок сохраняет присущее инсулину свойство образования гексамера и таким образом может использоваться в разработке препарата и позволяет улучшать скорость всасывания.

Таким образом, в одном аспекте настоящее изобретение направлено на аналог инсулина, содержащий вариант В-цепи инсулина, представленный аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 2, аргинин (Arg) в положении аминокислоты 22 В-цепи инсулина заменен лизином (Lys) в нативном инсулине. Согласно настоящему изобретению, когда аминокислота аргинин (Arg) в положении 22 В-цепи инсулина заменена на лизин (Lys), аналог инсулина может демонстрировать устойчивость к расщеплению ферментом клострипаин, делая возможным превращение инсулина в активную форму под действием фермента клострипаин, отличного от трипсина, в процессе получения аналога инсулина в микроорганизмах или клетках, отличных от организма человека.

В настоящем изобретении фраза «аналог инсулина, содержащий вариант В-цепи инсулина, представленный аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 2, аргинин (Arg) в положении аминокислоты 22 В-цепи инсулина заменен лизином (Lys) в нативном инсулине» означает, что аналог инсулина может дополнительно содержать вариант аминокислоты в А-цепи инсулина или В-цепи инсулина помимо замены аргинина (Arg) на лизин (Lys) в положении аминокислоты 22 В-цепи нативного инсулина.

В настоящем изобретении аналог инсулина может дополнительно содержать одну или более аминокислотных замен, выбранных из группы, состоящей из нижеследующего: (i) замена валина (Val) на лейцин (Leu) в положении аминокислоты 3 А-цепи инсулина, представленной аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 4; (ii) замена треонина (Thr) на аспарагиновую кислоту (Asp) в положении аминокислоты 8 А-цепи инсулина, представленной аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 4; (iii) замена изолейцина (IIe) на лизин (Lys) в положении аминокислоты 10 А-цепи инсулина, представленной аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 4; (iv) замена тирозина (Tyr) на глутаминовую кислоту (Glu) в положении аминокислоты 14 А-цепи инсулина, представленной аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 4; (v) замена тирозина (Tyr) на фенилаланин (Phe) в положении аминокислоты 19 А-цепи инсулина, представленной аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 4; (vi) замена гистидина (His) на треонин (Thr) в положении аминокислоты 5 варианта В-цепи инсулина, представленного аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 2; (vii) замена серина (Ser) на аспарагиновую кислоту (Asp) в положении аминокислоты 9 варианта В-цепи инсулина, представленного аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 2; (viii) замена глутаминовой кислоты (Glu) на аланин (Ala) в положении аминокислоты 13 варианта В-цепи инсулина, представленного аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 2; (ix) замена лейцина (Leu) на глутамин (Gin) в положении аминокислоты 17 варианта В-цепи инсулина, представленного аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 2; и (х) замена фенилаланина (Phe) на серии (Ser) в положении аминокислоты 24 варианта В-цепи инсулина, представленного аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 2, но не ограничивается ими.

В настоящем изобретении аналог инсулина может иметь увеличенный период полувыведения in vivo, по сравнению с нативным инсулином. Период полувыведения in vivo может длиться на протяжении предпочтительно по меньшей мере 48 часов, более предпочтительно по меньшей мере 72 часов.

В другом аспекте настоящее изобретение направлено на полинуклеотид, кодирующий аналог инсулина. В еще одном аспекте настоящее изобретение направлено на рекомбинантный вектор, содержащий данный полинуклеотид. В еще одном аспекте настоящее изобретение направлено на рекомбинантный микроорганизм, имеющий введенный в него рекомбинантный вектор.

Между тем, настоящее изобретение направлено на производное аналога инсулина длительного действия, в котором альбумин-связывающий домен слит с аналогом инсулина. Производное аналога инсулина длительного действия, слитого с альбумин-связывающим доменом, обладает сравнительно высокой аффинностью в отношении альбумина.

В одном примере настоящего изобретения альбумин-связывающий домен может содержать альбумин-связывающий мотив, представленный следующей аминокислотной последовательностью:

GVSDFYKKLIX_aKAKTVEGVEALKX_bX_cl,

где:

Х_а независимо выбран из D и Е,

X_b независимо выбран из D и Е, и

Х_с независимо выбран из А и Е.

В одном примере настоящего изобретения Х_а представляет собой D, X_b представляет собой D, и Х_с представляет собой А.

В одном примере настоящего изобретения альбумин-связывающий домен может содержать следующую аминокислотную последовательность:

LAX₃AKX₆X₇ANX₁₀ELDX₁4_Y-[BM]-LX₄₃X₄₄LP,

где:

[ВМ] представляет собой альбумин-связывающий мотив, как определено в предыдущем абзаце,

Х₃ независимо выбран из С, Е, Q и S;

Х₆ независимо выбран из С, Е и S;

Х₇ независимо выбран из А и S;

Х₁₀езависимо выбран из A, R и S;

Х₁₄ независимо выбран из А, С, K и S;

Х₄₃ независимо выбран из А и K; и

Х₄₄ независимо выбран из А, Е и S.

Альбумин-связывающий домен может быть представлен аминокислотными последовательностями, выбранными из группы, состоящей из SEQ ID NO: 6-13, но не ограничивается ими. Альбумин-связывающий домен может предпочтительно быть представлен аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 6.

В настоящем изобретении предпочтительно, чтобы альбумин-связывающий домен был слит с С-концом А-цепи в инсулине или аналоге инсулина В-цепь - С -цепь - А-цепь в отношении эффективности повторного сворачивания белка, эффективности ферментативной реакции и активности полученного производного инсулина или производных аналога инсулина. В связи с этим, линкер может быть введен между инсулином (или аналогом инсулина) и альбумин-связывающим доменом.

Функция производного аналога инсулина длительного действия согласно настоящему изобретению варьирует в зависимости от трехмерной структуры производного. Таким образом, возможно вносить небольшие изменения в аминокислотную последовательность производного аналога инсулина длительного действия согласно настоящему изобретению, не влияя на функцию данного производного. Таким образом, настоящее изобретение включает варианты альбумин-связывающего домена или производного аналога инсулина длительного действия, которые сохраняют свойство связывания альбумина или высокую устойчивость к ферментативному расщеплению. Например, аминокислотные остатки, принадлежащие к конкретной функциональной группе аминокислотных остатков (например, гидрофобность, гидрофильность, полярность и т.д.), могут быть заменены другими аминокислотными остатками, принадлежащими к той же функциональной группе.

В том виде, в котором они используются в данном документе, термины «альбумин-связывающий» и «аффинность связывания в отношении альбумина» относятся к свойству полипептида или белка, которое можно тестировать посредством применения технологии поверхностного плазмонного резонанса, как например, с помощью прибора Biacore. Например, аффинность связывания альбумина можно тестировать в эксперименте, в котором альбумин или его фрагмент иммобилизуют на сенсорном чипе прибора, и образец, содержащий полипептид или белок, подлежащий тестированию, пропускают через чип.

В качестве альтернативы, полипептид или белок, подлежащий тестированию, иммобилизуют на сенсорном чипе прибора, и образец, содержащий альбумин или его фрагмент, пропускают через чип. В связи с этим, альбумин может представлять собой альбумин сыворотки, происходящей из млекопитающего, как например, альбумин сыворотки человека. Специалисты в данной области могут интерпретировать результаты, полученные с помощью таких экспериментов, для установления количественного показателя аффинности связывания полипептида или белка в отношении альбумина. Если количественный показатель является желательным, например, для определения значения K_D для взаимодействия, могут быть также использованы методы поверхностного плазмонного резонанса. Величины связывания могут, например, быть определены на приборе Biacore 2000 (Biacore АВ). Альбумин подходящим образом иммобилизован на измерительном сенсорном чипе, и образцы полипептида или белка, чья аффинность подлежит определению, получают посредством серийного разведения и инъецируют в случайном порядке. Значения K_D можно, затем, рассчитывать на основании результатов, используя, например, 1:1 модель связывания Ленгмюра программного обеспечения BIAevaluation 4.1, предоставленного производителем прибора.

В одном воплощении настоящего изобретения альбумин, с которым связывается производное аналога инсулина длительного действия, может быть выбран из альбумина сыворотки человека, альбумина сыворотки крысы, альбумина сыворотки яванского макака и альбумина сыворотки мыши, но не ограничивается ими.

В одном конкретном воплощении альбумин, с которым связывается производное аналога инсулина длительного действия, представляет собой альбумин сыворотки человека.

Аналог инсулина и альбумин-связывающий домен связаны друг с другом пептидной связью; полипептидным линкером; или непептидильным линкером, выбранным из группы, состоящей из полиэтилен гликоля, полипропиленгликоля, сополимера этиленгликоля и пропиленгликоля, полиоксиэтилированного полиола, поливинилового спирта, полисахаридов, декстрана, простого поливинилэтилового эфира, биоразлагаемых полимеров, жирных кислот, нуклеотидов, липидных полимеров, хитина, гиалуроновой кислоты и их комбинаций, но не ограничиваются ими.

В настоящем изобретении линкер, состоящий из повтора последовательности (GGGGS)_n (где n представляет собой целое число, находящееся в интервале от 1 до 6), может быть вставлен между аналогом инсулина и альбумин-связывающим доменом. Это основано на результатах экспериментов, указывающих на то, что когда линкер не был введен, выход повторного сворачивания был низким, а когда два или более повторов последовательности (GGGGS) были введены, отсутствовало значимое различие в выходе повторного сворачивания. Между тем, при увеличении числа (n) повторов данной последовательности, скорость превращения в активную форму инсулина под действием клострипаина повышалась, но фармакокинетика in vivo аналога инсулина не подвергалась значимому влиянию. Принимая во внимание все описанные выше результаты, линкер предпочтительно состоит из 2-4 повторов последовательности GGGGS.

Таким образом, в настоящем изобретении аналог инсулина и альбумин-связывающий домен могут быть связаны друг с другом полипептидным линкером, и полипептидный линкер может содержать (GGGGS)_n (где n представляет собой целое число, находящееся в интервале от 1 до 6), но не ограничивается ими. Предпочтительно, полипептидный линкер может быть представлен аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 5.

В еще одном аспекте настоящее изобретение направлено на рекомбинантный вектор, который содержит: полинуклеотид, кодирующий аналог инсулина; и полинуклеотид, кодирующий альбумин-связывающий домен, содержащий альбумин-связывающий мотив, представленный следующей аминокислотной последовательностью:

GVSDFYKKLIX_aKAKTVEGVEALKX_bX_cl,

где:

Х_а независимо выбран из D и Е,

X_b независимо выбран из D и Е, и

X_c независимо выбран из А и Е.

В одном воплощении настоящего изобретения альбумин-связывающий домен может содержать следующую аминокислотную последовательность:

LAX₃AKX₆X₇ANX_1oELDX₁₄Y-[BM]-LX₄₃X₄₄LP, где:

[ВМ] представляет собой альбумин-связывающий мотив, как определено в предыдущем абзаце,

Х₃ независимо выбран из С, Е, Q и S;

X₆ независимо выбран из С, Е и S;

Х₇ независимо выбран из А и S;

Х₁₀ независимо выбран из A, R и S;

Х₁₄ независимо выбран из А, С, K и S;

Х₄₃ независимо выбран из А и K; и

Х₄₄ независимо выбран из А, Е и S.

Альбумин-связывающий домен может быть представлен аминокислотными последовательностями, выбранными из группы, состоящей из SEQ ID NO: 6-13, но не ограничивается ими. Альбумин-связывающий домен может предпочтительно быть представлен аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 6.

В настоящем изобретении полинуклеотид, кодирующий аналог инсулина, и нуклеотид, кодирующий альбумин-связывающий домен, можно вводить в рекомбинантный вектор таким образом, чтобы аналог инсулина и альбумин-связывающий домен могли экспрессироваться в виде слитого белка.

Другое описание альбумин-связывающего домена, введенного в рекомбинантный вектор, перекрывается с описанием альбумин-связывающего домена производного аналога инсулина длительного действия, и, таким образом, опущено. Кроме того, полинуклеотид, кодирующий полипептидный линкер, может быть включен между полинуклеотидом, кодирующим аналог инсулина, и полинуклеотидом, кодирующим альбумин-связывающий домен. Описание полипептидного линкера также перекрывается с описанием полипептидного линкера производного аналога инсулина длительного действия, и, таким образом, его подробное описание будет опущено для того, чтобы избежать избыточности.

Между тем, описание альбумин-связывающего мотива и альбумин-связывающего домена (или альбумин-связывающего полипептида) истолковывается как включающее содержание, раскрытое в выложенной для всеобщего ознакомления публикации корейского патента №10-2015-0058454, соответствующей WO 2014048977.

Рекомбинантный вектор согласно настоящему изобретению может быть сконструирован в качестве вектора для общепринятого клонирования или экспрессии, и может быть сконструирован в качестве вектора для применения прокариотической или эукариотической клетки в качестве клетки-хозяина.

В том виде, в котором он используется в данном документе, термин «вектор» относится к рекомбинантному вектору, способному экспрессировать целевой белок в соответствующей клетке-хозяине, который представляет собой генетическую конструкцию, включающую существенные регуляторные факторы, функционально связанные, для обеспечения экспрессии вставки нуклеиновой кислоты. Согласно настоящему изобретению можно получать рекомбинантный вектор, который включает нуклеиновую кислоту, кодирующую аналог инсулина и/или производное аналога инсулина. Аналог инсулина и/или производное аналога инсулина по настоящему изобретению можно получать в рекомбинантном микроорганизме, в который введен рекомбинантный вектор посредством трансформации или трансфекции, посредством лизиса и очистки культивируемого рекомбинантного микроорганизма.

В настоящем изобретении нуклеиновая кислота, кодирующая аналог инсулина и производное аналога, функционально связана с последовательностью контроля экспрессии нуклеиновой кислоты. В том виде, в котором он используется в данном документе, термин «функционально связан» относится к функциональной связи между последовательностью контроля экспрессии нуклеиновой кислоты (например, промотором, сигнальной последовательностью, сайтом связывания рибосом, последовательностью терминации транскрипции и т.д.) и другой нуклеотидной последовательностью, и, таким образом, регуляторная последовательность может контролировать транскрипцию и/или трансляцию другой нуклеотидной последовательности.

В том виде, в котором он используется в данном документе, термин «промотор» относится к нетранслируемой последовательности нуклеиновой кислоты, расположенной выше кодирующей области, которая включает сайт связывания полимеразы, и обладает активностью инициации транскрипции гена, расположенного ниже промотора, в мРНК, а именно, сайт ДНК, с которым связывается полимераза и инициирует транскрипцию гена, и он расположен в 5' области участка инициации транскрипции мРНК.

Например, когда вектор по настоящему изобретению представляет собой рекомбинантный вектор, и в качестве клетки-хозяина используется прокариотическая клетка, обычно включены сильный промотор, способный стимулировать транскрипцию (такой как промотор tac, промотор lac, промотор lacUV5, промотор Ipp, промотор plλ, промотор pRλ, промотор rac5, промотор amp, промотор recA, промотор SP6, промотор trp, промотор trc, промотор phoA, промотор araBAD, промотор Т5 и промотор Т7), сайт связывания рибосом для инициации трансляции и последовательности терминации транскрипции/трансляции.

Кроме того, вектор, который может быть использован в настоящем изобретении, может быть получен посредством манипуляций с плазмидами (например, pSC101, pGV1106, pACYC177, ColE1, pKT230, рМЕ290, pBR322, pUC8/9, pUC6, pBD9, pHC79, pIJ61, pLAFRI, pHV14, серия pGEX, серия pET, серия pPICZα, pUC19 и т.д.), фагами (например, λgt4λB, λCharon, λΔz1, M13 и т.д.) или вирусами (например, SV40 и т.д.), которые обычно используются в данной области, но, не ограничиваясь ими.

Между тем, когда вектор по настоящему изобретению представляет собой рекомбинантный вектор, и эукариотическую клетку используют в качестве клетки-хозяина, можно использовать промоторы, происходящие из геномов клеток млекопитающего (например, промотор металлотионеина), промоторы, происходящие из вирусов млекопитающего (например, поздний промотор аденовируса, 7,5K промотор вируса осповакцины, промотор SV40, промотор цитомегаловируса и tk промотор HSV (от англ. Herpes Simplex Virus - вирус простого герпеса)), и, в общем, вектор включает полиаденилированную последовательность (например, терминатор гормона роста крупного рогатого скота и полиаденилированную последовательность, происходящую из SV40) в качестве последовательности терминации транскрипции.

Кроме того, рекомбинантный вектор по настоящему изобретению включает ген устойчивости к антибиотику, обычно используемый в данной области в качестве селективного маркера, и может включать, например, гены устойчивости к ампициллину, гентамицину, карбенициллину, хлорамфениколу, стрептомицину, канамицину, генетицину, неомицину или тетрациклину.

Рекомбинантный вектор по настоящему изобретению может дополнительно включать другую последовательность для облегчения очистки выделенных целевых белков, а именно, аналога инсулина и/или производного аналога инсулина. Последовательность, подлежащая дополнительному включению, может представлять собой последовательность метки для очистки белка, например, глутатион-5-трансферазу (Pharmacia, США), мальтоза-связывающий белок (NEB, США), FLAG (IBI, США), 6-гистидин и т.д., но виды последовательности, необходимой для очистки целевых белков, не ограничиваются ими. Слитые белки, экспрессируемые рекомбинантным вектором, включая указанную выше последовательность метки, могут быть очищены посредством аффинной хроматографии. Например, когда подвергают слиянию глутатион S-трансферазу, можно использовать глутатион, который представляет собой субстрат данного фермента, и когда используется 6-гистидиновая метка, желательный целевой белок может быть с легкостью собран посредством колонки Ni-NTA. Рекомбинантный микроорганизм, трансформированный вектором, может быть сконструирован, используя рекомбинантный вектор, содержащий полинуклеотид, кодирующий аналог инсулина и/или производное аналога инсулина.

В том виде, в котором он используется в данном документе, термин «трансформация» относится к способу введения ДНК в клетку-хозяина и получения ДНК, реплицируемой в ней, в виде хромосомного фактора или посредством выполнения хромосомной интеграции, которая является явлением искусственного осуществления генетического изменения посредством введения экзогенной ДНК в клетку.

Способ трансформации, используемый в настоящем изобретении, может представлять собой любой способ трансформации, и его можно легко осуществлять в соответствии с общепринятым способом, используемым в данной области. Примеры обычно используемого способа трансформации могут включать способ осаждения с использованием CaCl₂, способ Hanahan с улучшенной эффективностью, используя диметилсульфоксид (ДМСО) в качестве восстанавливающего агента в способе осаждения с использованием CaCl₂, электропорацию, способ осаждения с использованием CaPO₄, способ слияния протопластов, способ перемешивания с использованием карбидокремниевого волокна, способ трансформации, опосредованной агробактериями, способ трансформации с использованием ПЭГ (полиэтиленгликоль), трансформации, опосредованные сульфатом декстрана, липофектамином и сушкой/давлением, и т.д.

Способ трансформации рекомбинантным вектором, включающим нуклеиновую кислоту, кодирующую аналог инсулина и/или производное аналога инсулина согласно настоящему изобретению, может не ограничиваться данными способами, но любой способ трансформации или трансфекции, обычно используемый в данной области, можно использовать без ограничения.

Рекомбинантный трансформант по настоящему изобретению может быть получен посредством введения рекомбинантного вектора, включающего нуклеиновую кислоту, кодирующую аналог инсулина и/или производное аналога инсулина, в клетку-хозяина.

Соответствующий хозяин, подлежащий использованию в настоящем изобретении, может особым образом не ограничиваться при условии, что он может экспрессировать нуклеиновую кислоту по настоящему изобретению. Примеры соответствующего хозяина могут включать бактерии, принадлежащие к роду Escherichia, как например, Е. coii, бактерии, принадлежащие к роду Bacillus, как например, Bacillus subtilis, бактерии, принадлежащие к роду Pseudomonas, как например, Pseudomonas putida, дрожжи, как например Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae и Schizosaccharomyces pombe, клетку насекомого, как например Spodoptera frugiperda (SF9), и животные клетки, такие как СНО (от англ. -Chinese Hamster Ovary - яичник китайского хомячка), COS и BSC, но не ограничиваются ими.

Согласно настоящему изобретению также предложена композиция для лечения диабета, содержащая аналог инсулина или производное аналога инсулина.

Согласно настоящему изобретению также предложен способ лечения диабета, включающий стадию введения аналога инсулина или производного аналога инсулина субъекту, нуждающемуся в контроле уровня глюкозы в крови.

Согласно настоящему изобретению также предложен аналог инсулина или производное аналога инсулина для применения в лечении диабета.

Согласно настоящему изобретению также предложено применение аналога инсулина или производного аналога инсулина для изготовления лекарственного средства для лечения диабета.

Согласно настоящему изобретению также предложен способ получения активной формы производного аналога инсулина длительного действия, имеющего увеличенный период полувыведения in vivo, причем способ включает следующие стадии: (а) культивирование рекомбинантного микроорганизма; (b) лизис культивируемого рекомбинантного микроорганизма, с получением, таким образом, производного аналога инсулина длительного действия; (с) индукция повторного сворачивания полученного производного аналога инсулина длительного действия, с получением, таким образом, препроформы производного аналога инсулина; (d) превращение препроформы производного аналога инсулина в активную форму посредством обработки клострипаином и СрВ; и (е) очистка активной формы производного аналога инсулина длительного действия.

Примеры

Далее в данном документе, настоящее изобретение будет описано более подробно со ссылкой на примеры. Специалисту, обладающему средней квалификацией в данной области, будет очевидно, что данные примеры представлены исключительно в иллюстративных целях, и не должны истолковываться как ограничивающие объем настоящего изобретения.

В приведенных ниже примерах аналог инсулина, слитый с ABD, используют в том же значении, как производное аналога инсулина длительного действия в настоящем изобретении.

Пример 1: Конструирование экспрессионного вектора и штамма с инсулином, слитым с ABD

Человеческий инсулин синтезируется в форме пре-про-инсулина, препоследовательность отщепляется в эндоплазматическом ретикулуме, и проинсулин обрабатывается в аппарате Гольджи и эндоплазматическом ретикулуме, с образованием, таким образом, зрелого инсулина. На основе данного факта, для получения рекомбинантного инсулина способом экспрессии белка проинсулина в Е. coli и затем удаления С-цепи обработкой трипсином, конструировали проинсулин. Для повышения эффективности экспрессии проинсулина в E.coli и эффективности очистки, метку слияния включали в N-конец, и проводили оптимизацию кодонов.

Число участков инсулина, с которыми может быть слит альбумин-связывающий домен (ABD), теоретически равно четырем. Однако, N-конец А-цепи представляет собой положение, важное для активности инсулина, и, вследствие этого, его исключали из положений слияния. Несмотря на то, что N-конец В-цепи важен для образования гексамера инсулина, он был включен в положения слияния, поскольку активность инсулина могла сохраняться. Если ABD слит между В-цепью и С-цепью, он может оказывать действие на сворачивание белка. Таким образом, конструкцию инсулина конструировали или в порядке В-С-А или порядке А-С-В в качестве структуры кандидата. Наконец, генные структуры для экспрессии следующих трех форм инсулина, слитого с ABD, конструировали следующим образом:

Ndel - Метка слияния - В-цепь - С-цепь - А-цепь - Линкер - ABD - EcoRI,

Ndel - Метка слияния - ABD - Линкер - В-цепь - С-цепь - А-цепь - EcoRI и

Ndel - Метка слияния - А- цепь - С- цепь - В- цепь - линкер - ABD - EcoRI.

В качестве экспрессионного вектора использовали вектор pJ401(DNA 2.0). Вектор расщепляли рестриктазами Ndel и EcoRI, и затем ДНК-фрагменты разделяли посредством электрофореза в 1%-ном агарозном геле. Генетические структуры для экспрессии слитых белков ABD и ДНК-фрагменты, полученные из экспрессионного вектора, как описано выше, лигировали друг с другом, используя ДНК-лигазу Т4, конструируя, таким образом, плазмиды. Далее, каждой из данных плазмид трансформировали Е. coli BL21(DE3) способом на основе хлорида кальция. Отбирали трансформированные штаммы, обладающие устойчивостью к канамицину, и из них выделяли ДНК. То, была ли ДНК правильно вставлена, определяли способом анализа на основе расщепления эндонуклеазами рестрикции.

Когда конструировали ген, имеющий следующую структуру: Ndel - метка слияния - ABD - Линкер - В-цепь - С-цепь - А-цепь - EcoRI, его определяли ненадлежащим из-за очень низкого выхода повторного сворачивания белка. Кроме того, когда конструировали ген, имеющий следующую структуру Ndel - метка слияния - А-цепь - С-цепь - В-цепь - Линкер - ABD - EcoRI, слитый с ABD инсулин обладал активностью инсулина, но он демонстрировал низкий выход повторного сворачивания и выход ферментативной обработки, таким образом, он считался неподходящим в качестве способа получения активной формы инсулина. Таким образом, среди данных трех форм инсулина, слитого с ABD, структуру Ndel - метка слияния - В-цепь - С-цепь - А-цепь - линкер - ABD - EcoRI выбирали и использовали в последующем эксперименте.

Между А-цепью и альбумин-связывающим доменом (ABD) вставляли линкер, состоящий из 1-6 повторов последовательности (GGGGS). В данном случае, когда линкер не вводили, выход повторного сворачивания был очень низким, но когда вводили линкер, состоящий из двух или более повторов последовательности (GGGGS), не было значимого различия в выходе повторного сворачивания. Между тем, при увеличении n в последовательности (GGGGS)_n, скорость превращения в активную форму инсулина под действием клострипаина повышалась, но фармакокинетика in vivo инсулина значимо не подвергалась воздействию. Принимая во внимание все описанные выше результаты, конструировали линкер, состоящий из 2-4 повторов последовательности GGGGS.

Аминокислотные последовательности каждого из фрагментов для инсулина, слитого с ABD, используемого в настоящем изобретении, показаны ниже в Таблице 1.

Пример 2: Конструирование аналогов инсулина, слитых с ABD, имеющих модифицированные аминокислотные последовательности инсулина

Для получения инсулина, используя рекомбинантные Е. coli, необходим способ превращения проинсулина в активную форму посредством применения трипсина. Однако, трипсин расщепляет двухосновные аминокислоты с высокой эффективностью и также расщепляет единичные аминокислоты, такие как лизин (Lys) или аргинин (Arg), осложняя получение желательной активной формы инсулина. Кроме того, последовательность ABD также включает некоторое количество остатков лизина (Lys) и аргинина (Arg), дополнительно осложняя получение желательного инсулина, слитого с ABD, обладающего активностью, посредством применения трипсина.

По этой причине, клострипаин использовали в качестве фермента, способного заменять трипсин для индукции превращения в активную форму. В данном случае, когда клострипаин взаимодействовал с инсулином, слитым с ABD, происходило расщепление аргинина (Arg) в положении 22 В-цепи инсулина. Для решения данной проблемы аргинин (Arg) в положении 22 В-цепи заменяли лизином (Lys). В данном случае расщепление в положении 22 В-цепи инсулина под действием клострипаина значимо уменьшалось и, таким образом, активная форма слитого с ABD инсулина могла быть эффективно получена (Фиг. 1).

Помимо мутации, как описано выше, дополнительные мутации вводили в инсулин, слитый с ABD, для дополнительного увеличения стабильности и in vivo периода полувыведения инсулина, слитого с ABD. Пять аминокислот в каждой из А-цепи и В-цепи заменяли, и замененные положения показаны ниже в Таблице 2.

Оптимизацию кодонов для экспрессии генов в Е. coli проводили, используя алгоритм GeneArt, и синтезировали гены, имеющие замененные аминокислоты.

Плазмиды, сконструированные как описано выше, вводили в Е, coil BL21 (DE3) таким же образом, как описано в Примере 1, конструируя, таким образом, штаммы Е, coii.

Пример 3: Экспрессия аналогов инсулина, слитых с ABD

Для экспрессии аналогов инсулина, слитых с ABD, каждый из рекомбинантных штаммов Е. coli инокулировали в 100 мл среды LB и культивировали при встряхивании при 37°С в течение 16 часов, и культуры использовали в качестве культур для посева. 2 л среды LB добавляли в 7-л ферментер (New Brunswick BioFlo), стерилизовали и затем инокулировали с культурой для посева. Культивирование проводили в условиях температуры 35°С, скорости потока воздуха 3 об/об/мин и скорости перемешивания 1000 об/мин, и рН во время культивирования поддерживали на уровне 6,8 с помощью аммония и фосфорной кислоты. В момент времени, в который источник углерода в среде истощался, начинали подачу и в тот же момент времени экспрессию белка индуцировали IPTG (от англ. isopropylthiogalactoside - изопропилтиогалактозид). Дополнительное культивирование проводили в течение 10 часов после индукции экспрессии, и рекомбинантные штаммы выделяли, используя центрифугу.

Аналоги инсулина, слитые с ABD, экспрессировали в виде телец включения в штамме Е, coli, и даже когда аминокислотные мутации вводили в домены инсулина, уровни экспрессии обнаруживались в векторной системе, используемой в настоящем изобретении (Фиг. 2).

Пример 4: Индукция лизиса клеток и солюбилизации/повторного сворачивания

Каждый из штаммов, экспрессирующих инсулин, слитый с ABD, или аналоги инсулина, слитые с ABD, суспендировали в лизирующем буфере (20 мМ Tris, 10 мМ ЭДТА, 10% сахароза, 0,2 М NaCl, рН 8,0), и клетки лизировали, используя гомогенизатор высокого давления. Лизированные клетки центрифугировали в высокоскоростной центрифуге при 7000 об/мин, и растворимый белок и некоторые обломки клеток удаляли, выделяя, таким образом, осадок, включающий тельце включения. Выделенное тельце включения промывали буфером (содержащим 1% Triton X-100, 0,2 M NaCl и 1 M мочевину) и затем центрифугировали при 7000 об/мин. Осажденное тельце включения дополнительно два раза промывали дистиллированной водой и затем хранили при -80°С до применения.

Хранящееся в замороженном виде тельце включения растворяли в солюбилизирующем буфере (25 мМ Tris, 8 М мочевина, 30 мМ цистеин-HCl, рН 10,5) и затем разбавляли в буфере для повторного сворачивания (25 мМ Tris-HCl, рН 10,5) и подвергали повторному сворачиванию при 4°С в течение 16 часов. Происходило ли повторное сворачивание, определяли посредством анализа ОФ-ВЭЖХ. Когда солюбилизированный раствор анализировали посредством ОФ-ВЭЖХ, пик белка наблюдался на уровне примерно 20 минут вследствие высокой гидрофобности, но когда происходило повторное сворачивание, наблюдался сдвиг данного пика к 16 минутам (Фиг. 3). Причина этого состоит в том, что когда протекает повторное сворачивание, гидрофобность снижается, по сравнению с гидрофобностью в солюбилизированном растворе. Повторное сворачивание продолжали до тех пор, пока сдвига пика белка больше не наблюдалось во время анализа посредством ОФ-ВЭЖХ.

Пример 5: Превращение в активную форму посредством применения фермента

Для получения инсулина, используя рекомбинантный штамм Е. coli, требуется превращение проинсулина в активную форму посредством применения трипсина. Однако, инсулин, слитый с ABD, или аналог инсулина, слитый с ABD, имеет целый ряд сайтов расщепления трипсином в своей последовательности, и по этой причине клострипаин использовали в качестве фермента, способного заменить трипсин для индукции превращения в активную форму.

Когда индуцировали превращение в активную форму, используя клострипаин, происходило расщепление в положении 22 В-цепи инсулина, осложняя получение желательной формы инсулина. По данной причине, аналог инсулина, слитый с ABD, полученный посредством замены в положении 22 В-цепи аргинина (Arg) на лизин (Lys), использовали для получения активной формы инсулина.

Клострипаин содержит цистеин (Cys) в своем активном сайте, и, таким образом, требует восстанавливающих условий для демонстрации ферментативной активности. Кроме того, когда раствор для повторного сворачивания обрабатывают восстанавливающим агентом для сохранения активности клострипаина, дисульфидная связь в области инсулина с высокой долей вероятности будет разорвана. По данной причине, требуется установить условия, которые повышают выход ферментативной реакции без разрыва дисульфидной связи. Таким образом, эксперимент проводили, используя восстанавливающий агент ДТТ, содержащийся в растворе ферментативной реакции.

Поскольку клострипаин существует в виде проформы, для его активации индуцировали авторасщепление. С этой целью сублимированный клострипаин (Worthington, США) растворяли в дистиллированной воде и затем активировали при 4°С в течение 30 минут после добавления активирующего буфера (500 мМ Tris, 50 мМ ДТТ, 25 мМ CaCl₂, рН 7,8). Активированный клострипаин добавляли к повторно свернутому белку в концентрации 0,1-5 единиц на мг белка и позволяли взаимодействовать при 25-40°С в течение 2-8 часов. После реакции с клострипаином СрВ добавляли в концентрации 0,001-1 единица на 1 мг белка и давали прореагировать. Ферментативную реакцию останавливали, снижая рН до 3,5 или меньше посредством применения HCl.

В результате, как можно видеть на Фиг. 4, ферментативная реакция демонстрировала эффекты повышения эффективности превращения в активную форму инсулина и уменьшения примесей.

Пример 6: Очистка инсулина, слитого с ABD

Образец, ферментативно обработанный клострипаином и СрВ, сначала очищали посредством хроматографии на ионообменной смоле, используя Fractogel® EMD COO (М) (Merck) в соответствии с инструкцией ее производителя, и затем дополнительно очищали посредством обращенно-фазовой хроматографии, используя Pharmprep® Р100 RP-18e (Merck) в соответствии с инструкцией ее производителя.

В результате, как может быть видно на Фиг. 5, активная форма беспримесного инсулина, слитого с ABD, могла быть очищена двумя данными способами очистки.

Пример 7: Измерение аффинностей связывания аналогов инсулина, слитых с ABD, в отношении альбумина

Для измерения аффинностей связывания белков - аналогов инсулина, слитых с ABD, в отношении альбумина использовали аналитический метод поверхностный плазмонный резонанс (SPR - от англ. surface plasmon resonance, BIACORE 3000, GE healthcare). Рекомбинантный человеческий сывороточный альбумин иммобилизовали на чипе СМ5 способом связывания аминогрупп, и ABD или аналоги инсулина, слитые с ABD, разведенные до пяти и более концентраций, связывались с ним, и измеряли их аффинности в отношении человеческого сывороточного альбумина.

В результате, как может быть видно ниже в Таблице 3, аффинности аналогов инсулина в отношении человеческого сывороточного альбумина сохранялись на уровнях пМ, даже при том, что они были ниже, чем аффинность самого ABD.

Пример 8: Сравнение аффинностей нативного инсулина и аналогов инсулина, слитых с ABD, в отношении инсулинового рецептора

Для измерения афинностей связывания нативного инсулина и аналогов инсулина, слитых с ABD, в отношении инсулинового рецептора, использовали метод анализа поверхностный плазмонный резонанс (SPR, BIACORE 3000, GE healthcare). Инсулиновый рецептор иммобилизовали на чипе СМ5 способом связывания аминогрупп, и каждый из нативного инсулина и аналогов инсулина, слитых с ABD, разведенных до пяти или более концентраций, связывался с ним, и измеряли их аффинности в отношении инсулинового рецептора.

В результате, как можно видеть ниже в Таблице 4, аффинности аналогов инсулина, слитых с ABD, уменьшались, по сравнению с аффинностью нативного инсулина. В частности, аффинность аналога 3 демонстрировала наибольшее уменьшение и падала до уровня 19,4% относительно нативного инсулина.

Эффективности аналогов инсулина, слитых с ABD, оценивали в сравнении с эффективностью инсулина гларгин в моделях диабета 1-го типа, индуцируемого стрептозотоцином. Аналоги 1, 3 и 10 исключали из кандидатов, поскольку они демонстрировали способность снижения уровня глюкозы в крови 50% или меньше, в сравнении с инсулином гларгин.

Пример 9: Синтез гексамера

Инсулин связывается с цинком in vivo, образуя, вследствие этого, стабильную гексамерную структуру. Свойство инсулина образовывать гексамер также используется в разработке препарата и может играть важную роль в увеличении периода полувыведения in vivo инсулина. Соответственно, будут ли аналоги инсулина, слитые с ABD, сохранять свойство образования гексамеров, анализировали посредством эксклюзионной хроматографии. В результате, было показано, что аналог 4 сохранял способность образовывать гексамер посредством добавления цинка и фенола (Фиг. 6). Образование гексамера также наблюдали во всех аналогах, за исключением аналогов 7, 9 и 10. Таким образом, среди аналогов, имеющих последовательности, показанные в Таблице 2, аналоги 7 и 9 дополнительно исключали из кандидатов.

Пример 10: Оценка фармакокинетики in vivo и способности снижения уровня глюкозы в крови аналогов инсулина, слитых с ABD

Для оценки in vivo фармакокинетики шести аналогов инсулина, слитых с ABD, каждый из аналогов инсулина вводили подкожно нормальным крысам SD (возраст 6 недель), и затем брали образцы крови в моменты времени 0, 1,4, 8, 24, 48, 72 и 96 часов. Концентрацию каждого аналога инсулина, слитого с ABD, оставшегося в крови в каждый из моментов времени, измеряли, используя ELISA (от англ. enzyme-linked immunosorbent assay - твердофазный иммуноферментный анализ). Кроме того, используя часть отобранных образцов крови, уровни глюкозы в крови в зависимости от времени измеряли с помощью устройства, контролирующего уровень глюкозы в крови.

В результате, как можно видеть ниже в Таблице 5, аналоги инсулина, слитые с ABD, демонстрировали значимо увеличенные периоды полувыведения, по сравнению с нативным инсулином, как известно, имеющим период полувыведения 5 минут. Аналог 11, полученный посредством замены только в положении 22 В-цепи инсулина, демонстрировал период полувыведения 7,2 часов, и аналог 4, демонстрирующий самое большое увеличение периода полувыведения, по оценке имел период полувыведения 9,9 часов.

Анализировали время, на протяжении которого уровни глюкозы в крови у нормальных животных сохранялись на пониженных уровнях. В результате, было показано, что аналоги 5, 6 и 8 имели увеличенные периоды полувыведения, но поддерживали уровни глюкозы в крови на протяжении короткого периода времени. По сравнению с данными аналогами, аналог 4 обладал наилучшей способностью снижать уровни глюкозы в крови и сохранял свою эффективность на протяжении самого длительного периода времени (Фиг. 7).

Несмотря на то, что настоящее изобретение подробно описано со ссылкой на конкретные признаки, специалистам в данной области будет очевидно, что данное описание предназначено исключительно для предпочтительного воплощения и не ограничивает объем настоящего изобретения. Таким образом, существенный объем настоящего изобретения будет определяться прилагаемой формулой изобретения и ее эквивалентами.

Промышленная применимость

Аналог инсулина или производное аналога инсулина согласно настоящему изобретению обладает преимуществами, по сравнению с традиционным инсулином, аналогами инсулина или другими производными инсулина, заключающимися в том, что он имеет значимо увеличенный период полувыведения in vivo и повышенную стабильность, таким образом, что он может оказывать длительный эффект, даже когда его инъецируют один раз. Таким образом, он может обеспечивать удобство пациентам с диабетом, которые самостоятельно вводят инсулин посредством инъекции.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> DAEWOONG PHARMACEUTICAL CO., LTD.

<120> АНАЛОГИ ИНСУЛИНА ДЛИТЕЛЬНОГО ДЕЙСТВИЯ И ИХ ПРОИЗВОДНЫЕ

<130> P17-B266

<160> 13

<170>KoPatentIn 3.0

<210> 1

<211> 22

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223>Меткаслияния

<400> 1

Met AlaThrThrSerThrGlyAsnSerAla His HisHisHisHisHis

1 5 10 15

SerSerGlySerAlaArg

20

<210> 2

<211> 30

<212>Белок

<213> homo sapiens

<400> 2

Phe Val AsnGln His LeuCysGlySer His Leu Val GluAlaLeu Tyr

1 5 10 15

Leu Val CysGlyGlu Lys GlyPhePhe Tyr Thr Pro Lys Thr

20 25 30

<210> 3

<211> 35

<212>Белок

<213> homo sapiens

<400> 3

ArgArgGluAlaGlu Asp LeuGln Val GlyGln Val GluLeuGlyGly

1 5 10 15

Gly Pro GlyAlaGlySerLeuGln Pro LeuAlaLeuGluGlySerLeu

20 25 30

GlnAlaArg

35

<210> 4

<211> 21

<212>Белок

<213> homo sapiens

<400> 4

Gly Ile Val GluGlnCysCysThrSer Ile CysSerLeu Tyr GlnLeu

1 5 10 15

GluAsn Tyr CysAsn

20

<210> 5

<211> 10

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Линкер

<400> 5

GlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySer

1 5 10

<210> 6

<211> 46

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Альбумин-связывающий домен

<400> 6

LeuAlaGluAla Lys GluAlaAlaAsnAlaGluLeu Asp Ser Tyr Gly

1 5 10 15

Val Ser Asp Phe Tyr Lys LysLeu Ile Asp Lys Ala Lys Thr Val Glu

20 25 30

Gly Val GluAlaLeu Lys Asp Ala Ile LeuAlaAlaLeu Pro

35 40 45

<210> 7

<211> 46

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Сконструированный альбумин-связывающий полипептид

<400> 7

LeuAlaGluAla Lys GluAlaAlaAsnAlaGluLeu Asp Ser Tyr Gly

1 5 10 15

Val Ser Asp Phe Tyr Lys LysLeu Ile Asp Lys Ala Lys Thr Val Glu

20 25 30

Gly Val GluAlaLeu Lys Asp Glu Ile LeuAlaAlaLeu Pro

35 40 45

<210> 8

<211> 46

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Сконструированный альбумин-связывающий полипептид

<400> 8

LeuAlaGluAla Lys GluAlaAlaAsnAlaGluLeu Asp Ser Tyr Gly

1 5 10 15

Val Ser Asp Phe Tyr Lys LysLeu Ile Asp Lys Ala Lys Thr Val Glu

20 25 30

Gly Val GluAlaLeu Lys GluAla Ile LeuAlaAlaLeu Pro

35 40 45

<210> 9

<211> 46

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Сконструированный альбумин-связывающий полипептид

<400> 9

LeuAlaGluAla Lys GluAlaAlaAsnAlaGluLeu Asp Ser Tyr Gly

1 5 10 15

Val Ser Asp Phe Tyr Lys LysLeu Ile Asp Lys Ala Lys Thr Val Glu

20 25 30

Gly Val GluAlaLeu Lys GluGlu Ile LeuAlaAlaLeu Pro

35 40 45

<210> 10

<211> 46

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Сконструированный альбумин-связывающий полипептид

<400> 10

LeuAlaGluAla Lys GluAlaAlaAsnAlaGluLeu Asp Ser Tyr Gly

1 5 10 15

Val Ser Asp Phe Tyr Lys LysLeu Ile Glu Lys Ala Lys Thr Val Glu

20 25 30

Gly Val GluAlaLeu Lys Asp Ala Ile LeuAlaAlaLeu Pro

35 40 45

<210> 11

<211> 46

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Сконструированный альбумин-связывающий полипептид

<400> 11

LeuAlaGluAla Lys GluAlaAlaAsnAlaGluLeu Asp Ser Tyr Gly

1 5 10 15

Val Ser Asp Phe Tyr Lys LysLeu Ile Glu Lys Ala Lys Thr Val Glu

20 25 30

Gly Val GluAlaLeu Lys Asp Glu Ile LeuAlaAlaLeu Pro

35 40 45

<210> 12

<211> 46

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Сконструированный альбумин-связывающий полипептид

<400> 12

LeuAlaGluAla Lys GluAlaAlaAsnAlaGluLeu Asp Ser Tyr Gly

1 5 10 15

Val Ser Asp Phe Tyr Lys LysLeu Ile Glu Lys Ala Lys Thr Val Glu

20 25 30

Gly Val GluAlaLeu Lys GluAla Ile LeuAlaAlaLeu Pro

35 40 45

<210> 13

<211> 46

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Сконструированный альбумин-связывающий полипептид

<400> 13

LeuAlaGluAla Lys GluAlaAlaAsnAlaGluLeu Asp Ser Tyr Gly

1 5 10 15

Val Ser Asp Phe Tyr Lys LysLeu Ile Glu Lys Ala Lys Thr Val Glu

20 25 30

Gly Val GluAlaLeu Lys GluGlu Ile LeuAlaAlaLeu Pro

35 40 45

<---

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к рекомбинантному получению производных аналогов инсулина, и может быть использовано в медицине для лечения диабета. Изобретение обеспечивает получение производных аналогов инсулина, которые имеют значимо увеличенный период полувыведения in vivo, и, таким образом, могут обеспечивать удобство пациентам с диабетом, которые самостоятельно вводят инсулин посредством инъекции. 4 н. и 10 з.п. ф-лы, 7 ил., 5 табл., 10 пр.

1. Производное аналога инсулина длительного действия, в котором альбумин-связывающий домен слит с аналогом инсулина посредством линкера,

где указанный аналог инсулина содержит А-цепь инсулина или ее вариант, вариант В-цепи инсулина и С-цепь инсулина, где А-цепь инсулина или ее вариант

i) представлены SEQ ID NO: 4;

ii) представлены аминокислотной последовательностью, содержащей замену треонина (Thr) на аспарагиновую кислоту (Asp) в положении аминокислоты 8 в SEQ ID NO: 4; или

iii) представлены аминокислотной последовательностью, содержащей замену тирозина (Tyr) на глутаминовую кислоту (Glu) в положении аминокислоты 14 в SEQ ID NO: 4;

где вариант В-цепи инсулина, представленный аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 2, аргинин (Arg) в положении аминокислоты 22 В-цепи инсулина заменен лизином (Lys) в нативном инсулине,

где линкер представляет собой полипептидный линкер (GGGGS)_n (где n представляет собой целое число, находящееся в интервале от 1 до 6),

где производное аналога инсулина длительного действия содержит вариант В-цепи инсулина, С-цепь инсулина, А-цепь инсулина или ее вариант, линкер и альбумин-связывающий домен в этом порядке.

2. Производное аналога инсулина длительного действия по п. 1, где аналог инсулина демонстрирует устойчивость к расщеплению ферментом клострипаином.

3. Производное аналога инсулина длительного действия по п. 1, где аналог инсулина имеет увеличенный in vivo период полувыведения по сравнению с нативным инсулином.

4. Производное аналога инсулина длительного действия по п. 1, в котором альбумин-связывающий домен содержит альбумин-связывающий мотив, представленный следующей аминокислотной последовательностью:

GVSDFYKKLIX_aKAKTVEGVEALKX_bX_cI,

где

X_a независимо выбран из D и Е,

X_b независимо выбран из D и Е, и

X_c независимо выбран из А и Е.

5. Производное аналога инсулина длительного действия по п. 4, в котором альбумин-связывающий домен содержит следующую аминокислотную последовательность:

LAX₃AKX₆X₇ANX₁₀ELDX₁₄Y-[BM]-LX₄₃X₄₄LP,

где

[ВМ] представляет собой альбумин-связывающий мотив, как определено в п. 4,

Х₃ независимо выбран из С, Е, Q и S;

Х₆ независимо выбран из С, Е и S;

X₇ независимо выбран из А и S;

Х₁₀ независимо выбран из A, R и S;

X₁₄ независимо выбран из А, С, K и S;

Х₄₃ независимо выбран из А и K; и

Х₄₄ независимо выбран из А, Е и S.

6. Производное аналога инсулина длительного действия по п. 5, в котором альбумин-связывающий домен представлен аминокислотными последовательностями, выбранными из группы, состоящей из SEQ ID NO: 6-13.

7. Производное аналога инсулина длительного действия по п. 6, в котором альбумин-связывающий домен представлен аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 6.

8. Производное аналога инсулина длительного действия по п. 1, в котором полипептидный линкер представлен аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 5.

9. Рекомбинантный вектор для экспрессии производного аналога инсулина длительного действия по п. 1, который содержит следующее, по порядку:

полинуклеотид, кодирующий аналог инсулина; полинуклеотид, кодирующий линкер; и

полинуклеотид, кодирующий альбумин-связывающий домен,

где указанный аналог инсулина содержит А-цепь инсулина или ее вариант, вариант В-цепи инсулина и С-цепь инсулина, где А-цепь инсулина или ее вариант

i) представлены SEQ ID NO: 4;

ii) представлены аминокислотной последовательностью, содержащей замену треонина (Thr) на аспарагиновую кислоту (Asp) в положении аминокислоты 8 в SEQ ID NO: 4; или

iii) представлены аминокислотной последовательностью, содержащей замену тирозина (Tyr) на глутаминовую кислоту (Glu) в положении аминокислоты 14 в SEQ ID NO: 4;

где вариант В-цепи инсулина, представленный аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 2, аргинин (Arg) в положении аминокислоты 22 В-цепи инсулина заменен лизином (Lys) в нативном инсулине,

где линкер представляет собой полипептидный линкер (GGGGS)_n (где n представляет собой целое число, находящееся в интервале от 1 до 6),

где производное аналога инсулина содержит вариант В-цепи инсулина, С-цепь инсулина, А-цепь инсулина или ее вариант, линкер и альбумин-связывающий домен в этом порядке,

где альбумин-связывающий мотив содержит альбумин-связывающий мотив, представленный следующей аминокислотной последовательностью:

GVSDFYKKLIX_aKAKTVEGVEALKX_bX_cI,

где

Х_а независимо выбран из D и Е,

X_b независимо выбран из D и Е, и

Х_с независимо выбран из А и Е.

10. Рекомбинантный вектор по п. 9, в котором альбумин-связывающий домен содержит следующую аминокислотную последовательность:

LAX₃AKX₆X₇ANX₁₀ELDX₁₄Y-[BM]-LX₄₃X₄₄LP,

где

[ВМ] представляет собой альбумин-связывающий мотив, как определено в п. 9,

Х₃ независимо выбран из С, Е, Q и S;

Х₆ независимо выбран из С, Е и S;

Х₇ независимо выбран из А и S;

Х₁₀ независимо выбран из A, R и S;

Х₁₄ независимо выбран из А, С, K и S;

Х₄₃ независимо выбран из А и K; и

Х₄₄ независимо выбран из А, Е и S.

11. Рекомбинантный вектор по п. 10, в котором альбумин-связывающий домен представлен аминокислотными последовательностями, выбранными из группы, состоящей из SEQ ID NO: 6-13.

12. Рекомбинантный вектор по п. 11, в котором альбумин-связывающий домен представлен аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 6.

13. Рекомбинантный микроорганизм для экспрессии производного аналога инсулина длительного действия, имеющий введенный в него рекомбинантный вектор по п. 9, причем рекомбинантный микроорганизм представляет собой Е. coli.

14. Способ получения активной формы производного аналога инсулина длительного действия, имеющего увеличенный период полувыведения in vivo, причем способ включает следующие стадии:

(a) культивирование рекомбинантного микроорганизма по п. 13;

(b) лизис культивируемого рекомбинантного микроорганизма с получением, таким образом, производного аналога инсулина длительного действия;

(c) индукция повторного сворачивания полученного производного аналога инсулина длительного действия с получением, таким образом, препроформы производного аналога инсулина;

(d) превращение препроформы производного аналога инсулина в активную форму посредством обработки клострипаином и СрВ в присутствии восстанавливающего агента; и

(e) очистка активной формы производного аналога инсулина длительного действия.