СПОСОБЫ И КОМПОЗИЦИИ ДЛЯ УЛУЧШЕНИЯ ПРИЗНАКОВ РАСТЕНИЙ Российский патент 2023 года по МПК C12N1/20 C12N15/63 C05F11/08 A01H3/00 

ПЕРЕКРЕСТНЫЕ ССЫЛКИ

[0001] По настоящей заявке испрашивается приоритет предварительной патентной заявки США № 62/445570, зарегистрированной 12 января 2017 года; предварительной патентной заявки США № 62/445557, зарегистрированной 12 января 2017 года; предварительной патентной заявки США № 62/447889, зарегистрированной 18 января 2017 года; предварительной патентной заявки США № 62/467032, зарегистрированной 3 марта 2017 года; предварительной патентной заявки США № 62/566199, зарегистрированной 29 сентября 2017 года и предварительной патентной заявки США № 62/577147, зарегистрированной 25 октября 2017 года, которые включены в настоящий документ в качестве ссылки.

ИНФОРМАЦИЯ ОТНОСИТЕЛЬНО СПИСКА ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

[0002] Настоящая заявка содержит список последовательностей, который подан в электронном виде в формате ASCII и, таким образом, полностью включен в качестве ссылки. Указанная копия ASCII, созданная 3 января 2018 года, названа 47736-707_601_SL.txt, и ее размер составляет ≈599 кбайт.

ЗАЯВЛЕНИЕ О ФИНАНСИРУЕМОМ ИЗ ФЕДЕРАЛЬНОГО БЮДЖЕТА ИССЛЕДОВАНИИ

[0003] Настоящее изобретение осуществлено с поддержкой правительства Соединенных Штатов Америки в виде грана SBIR 1520545, выделенного национальным научным фондом (National Science Foundation). Правительство США обладает определенными правами на описываемый объект изобретения.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ, ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ ИЗОБРЕТЕНИЮ

[0004] Растения связаны с микробиомом общим метаболомом. Многомерная зависимость между конкретным признаком сельскохозяйственной культуры и лежащим в его основе метаболоме характеризуется рельефом с множеством локальных максимумов. Оптимизация от меньшего локального максимума к другому, представляющему улучшенный признак, посредством изменения влияния микробиома на метаболом может являться желательным по целому ряду причин, например, для оптимизации сельскохозяйственных культур. Для удовлетворения потребностей растущего мирового населения необходимы экономически, экологически и социально устойчивые подходы к сельскому хозяйству и производству пищевых продуктов. Продовольственная и сельскохозяйственная организация ООН прогнозирует, что для удовлетворения потребностей растущего населения к 2050 году общее производство пищевых продуктов должно увеличиться на 70%, задача, которая осложняется многочисленными факторами, включая уменьшение ресурсов пресной воды, увеличивающуюся конкуренцию за пахотные земли, растущие цены на энергоносители, растущие затраты на производство и подобные требования для адаптации культур к давлению более засушливого, жаркого и более экстремального глобального климата.

[0005] Одной из представляющих интерес областей является улучшение фиксации азота. Газообразный азот (N₂) является основным компонентом атмосферы Земли. Кроме того, элементарный азот (N) является важным компонентом множества химических соединений, составляющих живые организмы. Однако многие организмы не могут непосредственно использовать N₂ для синтеза химических соединений, используемых в физиологических процессах, таких как рост и воспроизводство. Для использования N₂ необходимо, чтобы N₂ был комбинирован с водородом. Комбинирование водорода с N₂ обозначают как фиксация азота. Фиксация азота, проводимая химически или биологически, требует затрат большого количества энергии. В биологических системах реакцию, которая приводит к фиксации азота, катализирует фермент, известный как нитрогеназа. Важной целью исследований фиксации азота является расширение этого фенотипа на небобовые растения, конкретно на важные агротехнические травы, такие как пшеница, рис и кукуруза. Несмотря на большой прогресс в понимании развития азотфиксирующего симбиоза между клубеньковыми бактериями и бобовыми, путь для использования этого знания для индукции азотфиксирующих клубеньков у небобовых культур все еще не ясен. Между тем, проблема обеспечения достаточных дополнительных источников азота, такого как в удобрениях, будет продолжать расти вместе с растущей необходимостью в увеличении производства пищевых продуктов.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0006] По одному из аспектов изобретения предоставлена бактериальная композиция, содержащая по меньшей мере один генно-инженерный бактериальный штамм, который фиксирует атмосферный азот в сельскохозяйственной системе, в которую в качестве удобрения внесено более 9,1 кг азота на акр.

[0007] По другому аспекту изобретения предоставлена бактериальная композиция, которая содержит по меньшей мере один бактериальный штамм, выведенный для фиксации атмосферного азота в сельскохозяйственной системе, в которую в качестве удобрения внесено более 9,1 кг азота на акр.

[0008] По дополнительному аспекту изобретения предоставлена бактериальная композиция, которая содержит по меньшей мере один генно-инженерный бактериальный штамм, который фиксирует атмосферный азот, где этот по меньшей мере один генно-инженерный бактериальный штамм содержит экзогенно добавленную ДНК, где указанная экзогенно добавленная ДНК по меньшей мере на 80% идентична с соответствующим нативным бактериальным штаммом.

[0009] По дополнительному аспекту изобретения предоставлен семенной состав, содержащий семена растения, инокулированного бактериальной композицией.

[0010] Другой аспекту изобретения предоставлен способ выращивания сельскохозяйственной культуры с использованием множества семян с семенным составом, инокулированным бактериальной композицией.

[0011] По дополнительному аспекту изобретения предоставлен способ нанесения бактериальной композиции на поле.

[0012] По дополнительному аспекту изобретения предоставлена композиция удобрения, содержащая бактериальную композицию.

[0013] По другому аспекту изобретения предоставлен способ поддержания уровней азота в почве. Способ включает высаживание в почву поля сельскохозяйственной культуры, инокулированной генно-инженерными бактериями, которые фиксируют атмосферный азот. Способ также включает сбор урожая указанной сельскохозяйственной культуры, где между посадкой и сбором урожая в указанную почву указанного поля вносят не более 90% дозы азота, необходимой для получения указанной сельскохозяйственной культуры.

[0014] По дополнительному аспекту изобретения предоставлен способ доставки пробиотической добавки в сельскохозяйственную культуру. Способ включает покрытие семян сельскохозяйственной культуры покрытием для семян, пропиткой для семян или протравкой для семян. Указанные покрытие для семян, протравка для семян или пропитка для семян содержат живых представителей указанного пробиотика. Кроме того, способ включает внесение в почву поля указанных семян сельскохозяйственной культуры.

[0015] В дополнительном аспекте изобретения генно-инженерный бактериальный штамм представляет собой генно-инженерный штамм грамположительной бактерии. В определенных случаях генно-инженерный штамм грамположительной бактерии обладает измененным уровнем экспрессии регулятора кластера Nif. В определенных случаях генно-инженерный штамм грамположительной бактерии экспрессирует сниженное количество отрицательного регулятора кластера Nif. В определенных случаях генно-инженерный бактериальный штамм экспрессирует сниженное количество GlnR. В определенных случаях в геноме генно-инженерного бактериального штамма закодирован полипептид по меньшей мере на 75% идентичный с последовательностью из базы данных NifH лаборатории Дж. Зера (Zehr lab). В определенных случаях в геноме генно-инженерного бактериального штамма закодирован полипептид по меньшей мере на 85% идентичный с последовательностью из базы данных NifH лаборатории Дж. Зера. В определенных случаях в геноме генно-инженерного бактериального штамма закодирован полипептид по меньшей мере на 75% идентичный с последовательностью из базы данных NifH лаборатории Д. Бакли (Buckley lab). В определенных случаях в геноме генно-инженерного бактериального штамма закодирован полипептид по меньшей мере на 85% идентичный с последовательностью из базы данных NifH лаборатории Д. Бакли.

[0016] По другому аспекту изобретения предоставлен способ увеличения фиксации азота у небобового растения. Способ включает нанесение на растение множества не являющихся межродовыми бактерий, где указанное множество включает не являющихся межродовыми бактерий, которые (i) обладают средней колонизирующей способностью на единицу ткани корня растения по меньшей мере приблизительно 1,0 × 10⁴ бактериальных клеток на грамм сырой массы ткани корня растения и (ii) продуцируют фиксированный N в количестве по меньшей мере приблизительно 1 × 10^-17 ммоль N на бактериальную клетку в час. Кроме того, множество не являющихся межродовыми бактерий, in planta, продуцирует в растении 1% или более фиксированного азота. Кроме того, каждый представитель множества не являющихся межродовыми бактерий несет по меньшей мере одну генетическую вариацию, внесенную по меньшей мере в один ген или некодирующий полинуклеотид генетической регуляторной сети фиксации или ассимиляции азота так, что не являющиеся межродовыми бактерии становятся способны к фиксации атмосферного азота в присутствии экзогенного азота.

[0017] По дополнительному аспекту изобретения предоставлен способ увеличения фиксации азота у небобового растения. Способ включает нанесение на растение множества не являющихся межродовыми бактерий, где указанное множество включает не являющихся межродовыми бактерий, которые (i) обладают средней колонизирующей способностью на единицу ткани корня растения по меньшей мере приблизительно 1,0 × 10⁴ бактериальных клеток на грамм сырой массы ткани корня растения и/или (ii) продуцируют фиксированный N в количестве по меньшей мере приблизительно 1 × 10^-17 ммоль N на бактериальную клетку в час. Кроме того, множество не являющихся межродовыми бактерий, in planta, продуцирует в растении 1% или более фиксированного азота. Кроме того, каждый представитель множества не являющихся межродовыми бактерий несет по меньшей мере одну генетическую вариацию, внесенную по меньшей мере в один ген или некодирующий полинуклеотид генетической регуляторной сети фиксации или ассимиляции азота так, что не являющиеся межродовыми бактерии становятся способны к фиксации атмосферного азота в присутствии экзогенного азота.

[0018] По дополнительному аспекту изобретения предоставлен способ выведения штаммов микроорганизмов для улучшения конкретных признаков агротехнического значения. Способ включает предоставление множества штаммов микроорганизмов, обладающих способностью к колонизации требуемой сельскохозяйственной культуры. Способ также включает улучшение регуляторных сетей, влияющих на признак, посредством внутригеномной перестановки. Кроме того, способ включает оценку штаммов микроорганизмов во множестве штаммов микроорганизмов для определения меры признака. Кроме того, способ включает отбор из множества штаммов микроорганизмов одного или нескольких штаммов микроорганизмов, которые обеспечивают улучшение признака в случае требуемой сельскохозяйственной культуры.

[0019] По другому аспекту изобретения предоставлен способ выведения штаммов микроорганизмов с улучшением конкретных признаков агротехнического значения. Способ включает предоставление множества штаммов микроорганизмов, обладающих способностью к колонизации требуемой сельскохозяйственной культуры. Способ также включает внесение генетического разнообразия во множество штаммов микроорганизмов. Кроме того, способ включает оценку штаммов микроорганизмов во множестве штаммов микроорганизмов для определения меры признака. Кроме того, способ включает отбор из множества штаммов микроорганизмов одного или нескольких штаммов микроорганизмов, которые обеспечивают улучшение признака в случае требуемой сельскохозяйственной культуры.

[0020] По другому аспекту изобретения предоставлен способ увеличения у небобового растения количества получаемого из атмосферы азота. Способ включает воздействие на указанное небобовое растение подвергнутыми генетической инженерии не являющимися межродовыми микроорганизмами, где указанные подвергнутые генетической инженерии не являющиеся межродовыми микроорганизмы несут по меньшей мере одну генетическую вариацию, внесенную в генетическую регуляторную сеть фиксации азота, или по меньшей мере одну генетическую вариацию, внесенную в генетическую регуляторную сеть ассимиляции азота.

[0021] По дополнительному аспекту изобретения предоставлен способ увеличения у растения кукурузы количества получаемого из атмосферы азота. Способ включает воздействие на указанное растение кукурузы подвергнутыми генетической инженерии не являющимися межродовыми микроорганизмами, несущими генно-инженерные генетические вариации по меньшей мере в двух генах, выбранных из группы, состоящей из nifL, glnB, glnE и amtB.

[0022] По другому аспекту изобретения предоставлен способ увеличения у растения кукурузы количества получаемого из атмосферы азота. Способ включает воздействие на указанное растение кукурузы подвергнутыми генетической инженерии не являющимися межродовыми микроорганизмами, несущими по меньшей мере одну генетическую вариацию, внесенную в генетическую регуляторную сеть фиксации азота, и по меньшей мере одну генетическую вариацию, внесенную в генетическую регуляторную сеть ассимиляции азота, где указанные подвергнутые генетической инженерии не являющиеся межродовыми микроорганизмы, in planta, продуцируют у указанного растения кукурузы по меньшей мере 5% фиксированного азота, как измеряют посредством разведения ¹⁵N в сельскохозяйственных культурах, выращиваемых в полях, обрабатываемых удобрением, содержащим 1,2% ¹⁵N.

[0023] По дополнительному аспекту изобретения предоставлен способ увеличения фиксации азота у небобового растения. Способ включает нанесение на растение множества не являющихся межродовыми бактерий, где указанное множество включает не являющихся межродовыми бактерий, которые (i) обладают средней колонизирующей способностью на единицу ткани корня растения по меньшей мере приблизительно 1,0 × 10⁴ бактериальных клеток на грамм сырой массы ткани корня растения и (ii) продуцируют фиксированный N в количестве по меньшей мере приблизительно 1 × 10^-17 ммоль N на бактериальную клетку в час. Кроме того, произведение (i) средней колонизирующей способности на единицу ткани корня растения и (ii) продуцируемого фиксированного N на бактериальную клетку в час составляет по меньшей мере приблизительно 2,5 × 10^-8 ммоль N на грамм сырой массы ткани корня растения в час. Кроме того, множество не являющихся межродовыми бактерий, in planta, продуцирует в растении 1% или более фиксированного азота. Кроме того, каждый представитель множества не являющихся межродовыми бактерий несет по меньшей мере одну генетическую вариацию, внесенную по меньшей мере в один ген или некодирующий полинуклеотид генетической регуляторной сети фиксации или ассимиляции азота так, что не являющиеся межродовыми бактерии становятся способны к фиксации атмосферного азота в присутствии экзогенного азота.

[0024] По другому аспекту изобретения предоставлен способ увеличения фиксации азота у небобового растения. Способ включает нанесение на растение множества бактерий, где указанное множество включает бактерии, которые (i) обладают средней колонизирующей способностью на единицу ткани корня растения по меньшей мере приблизительно 1,0 × 10⁴ бактериальных клеток на грамм сырой массы ткани корня растения и/или (ii) продуцируют фиксированный N в количестве по меньшей мере приблизительно 1 × 10^-17 ммоль N на бактериальную клетку в час. Кроме того, множество бактерий, in planta, продуцирует в растении 1% или более фиксированного азота.

[0025] По дополнительному аспекту изобретения предоставлен не являющаяся межродовой популяция бактерий, способная к увеличению фиксации азота у небобового растения, содержащая множество не являющихся межродовыми бактерий, которые (i) обладают средней колонизирующей способностью на единицу ткани корня растения по меньшей мере приблизительно 1,0 × 10⁴ бактериальных клеток на грамм сырой массы ткани корня растения и/или (ii) продуцируют фиксированный N в количестве по меньшей мере приблизительно 1 × 10^-17 ммоль N на бактериальную клетку в час. Кроме того, множество не являющихся межродовыми бактерий, in planta, продуцирует в растении, выращиваемого в присутствии множества не являющихся межродовыми бактерий, 1% или более фиксированного азота. Кроме того, каждый представитель множества не являющихся межродовыми бактерий несет по меньшей мере одну генетическую вариацию, внесенную по меньшей мере в один ген или некодирующий полинуклеотид генетической регуляторной сети фиксации или ассимиляции азота так, что не являющиеся межродовыми бактерии становятся способны к фиксации атмосферного азота в присутствии экзогенного азота.

[0026] По дополнительному аспекту изобретения предоставлена популяция бактерий, способная к увеличению фиксации азота у небобового растения, где популяция бактерий содержит множество бактерий, которые (i) обладают средней колонизирующей способностью на единицу ткани корня растения по меньшей мере приблизительно 1,0 × 10⁴ бактериальных клеток на грамм сырой массы ткани корня растения; и/или (ii) продуцируют фиксированный N в количестве по меньшей мере приблизительно 1 × 10^-17 ммоль N на бактериальную клетку в час. Кроме того, множество бактерий, in planta, продуцирует в растении 1% или более фиксированного азота.

[0027] В другом аспекте изобретения предоставлены бактерии, которые (i) обладают средней колонизирующей способностью на единицу ткани корня растения по меньшей мере приблизительно 1,0 × 10⁴ бактериальных клеток на грамм сырой массы ткани корня растения и/или (ii) продуцируют фиксированный N в количестве по меньшей мере приблизительно 1 × 10^-17 ммоль N на бактериальную клетку в час.

[0028] В дополнительном аспекте изобретения предоставлены не являющиеся межродовыми бактерии, которые несут по меньшей мере одну генетическую вариацию, внесенную по меньшей мере в один ген или некодирующий полинуклеотид генетической регуляторной сети фиксации или ассимиляции азота так, что не являющиеся межродовыми бактерии способны к фиксации атмосферного азота в присутствии экзогенного азота, и где указанные бактерии (i) обладают средней колонизирующей способностью на единицу ткани корня растения по меньшей мере приблизительно 1,0 × 10⁴ бактериальных клеток на грамм сырой массы ткани корня растения и/или (ii) продуцируют фиксированный N в количестве по меньшей мере приблизительно 1 × 10^-17 ммоль N на бактериальную клетку в час.

[0029] В дополнительном аспекте изобретения предоставлен способ увеличения фиксации азота в растении, включающий введение в растение эффективного количества композиции, которая содержит очищенную популяцию бактерий, которая содержит бактерии с последовательностью нуклеиновой кислоты 16S, которая по меньшей мере приблизительно на 97% идентична последовательности нуклеиновой кислоты, выбранной из SEQ ID NO: 85, 96, 111, 121, 122, 123, 124, 136, 149, 157, 167, 261, 262, 269, 277-283; очищенную популяцию бактерий, которая содержит бактерии с последовательностью нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере приблизительно на 90% идентична последовательности нуклеиновой кислоты, выбранной из SEQ ID NO: 86-95, 97-110, 112-120, 125-135, 137-148, 150-156, 158-166, 168-176, 263-268, 270-274, 275, 276, 284-295; и/или очищенную популяцию бактерий, которая содержит бактерии с последовательностью нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере приблизительно на 90% идентична последовательности нуклеиновой кислоты, выбранной из SEQ ID NO: 177-260, 296-303; и где растение, которому вводят эффективное количество композиции, демонстрирует увеличение фиксации азота по сравнению с растением без введения композиции.

[0030] По дополнительному аспекту изобретения предоставлены выделенные бактерии, содержащие последовательность нуклеиновой кислоты 16S, которая по меньшей мере приблизительно на 97% идентична последовательности нуклеиновой кислоты, выбранной из SEQ ID NO: 85, 96, 111, 121, 122, 123, 124, 136, 149, 157, 167, 261, 262, 269, 277-283; последовательность нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере приблизительно на 90% идентична последовательности нуклеиновой кислоты, выбранной из SEQ ID NO: 86-95, 97-110, 112-120, 125-135, 137-148, 150-156, 158-166, 168-176, 263-268, 270-274, 275, 276, 284-295; и/или последовательность нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере приблизительно на 90% идентична последовательности нуклеиновой кислоты, выбранной из SEQ ID NO: 177-260, 296-303.

[0031] По другому аспекту изобретения предоставлен способ детекции последовательности с неприродным соединением, включающий: амплификацию нуклеотидной последовательности, которая по меньшей мере приблизительно на 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична последовательности с SEQ ID NO: 372-405.

[0032] По дополнительному аспекту изобретения предоставлен способ детекции последовательности с неприродным соединением, включающий: амплификацию нуклеотидной последовательности, которая по меньшей мере приблизительно на 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична последовательности фрагмента по меньшей мере с 10 последовательными парами оснований, содержащегося в SEQ ID NO: 372-405, где указанный фрагмент с последовательными парами оснований состоит из нуклеотидов на пересечении: расположенной выше последовательности, содержащей SEQ ID NO: 304-337, и расположенной ниже последовательности, содержащей SEQ ID NO: 338-371.

[0033] По дополнительному аспекту изобретения предоставлена последовательность с неприродным соединением, содержащая нуклеотидную последовательность, которая по меньшей мере приблизительно на 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична последовательности с SEQ ID NO: 372-405.

[0034] По дополнительному аспекту изобретения предоставлена последовательность с неприродным соединением, содержащая нуклеотидную последовательность, которая по меньшей мере приблизительно на 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична последовательности фрагмента по меньшей мере с 10 последовательными парами оснований, содержащегося в SEQ ID NO: 372-405, где указанный фрагмент с последовательными парами оснований состоит из нуклеотидов на пересечении: расположенной выше последовательности, содержащей SEQ ID NO: 304-337, и расположенной ниже последовательности, содержащей SEQ ID NO: 338-371.

[0035] По дополнительному аспекту изобретения предоставлена бактериальная композиция, содержащая по меньшей мере один реконструированный штамм бактерий который фиксирует атмосферный азот, по меньшей мере один реконструированный штамм бактерий, содержащий экзогенно добавленную ДНК, где указанная экзогенно добавленная ДНК, по меньшей мере на 80% идентична с соответствующим нативным штаммом бактерий.

[0036] По дополнительному аспекту изобретения предоставлен способ поддержания уровней азота в почве. Способ включает высаживание в почву поля сельскохозяйственной культуры, инокулированной реконструированными бактериями, которые фиксируют атмосферный азот. Способ также включает сбор урожая указанной сельскохозяйственной культуры, где между посадкой и сбором урожая в указанную почву указанного поля вносят не более 90% дозы азота, необходимой для получения указанной сельскохозяйственной культуры.

[0037] По другому аспекту изобретения предоставлен способ доставки пробиотической добавки в сельскохозяйственную культуру. Способ включает покрытие семян сельскохозяйственной культуры покрытием для семян, пропиткой для семян или протравкой для семян, где указанные покрытие для семян, протравка для семян или пропитка для семян содержат живых представителей указанного пробиотика. Способ также включает внесение указанных семян сельскохозяйственной культуры в почву поля.

[0038] По дополнительному аспекту изобретения предоставлен способ увеличения у небобового растения количества получаемого из атмосферы азота. Способ включает воздействие на указанное небобовое растение реконструированными не являющимися межродовыми микроорганизмами, где указанные реконструированные не являющиеся межродовыми микроорганизмы несут по меньшей мере одну генетическую вариацию, внесенную в генетическую регуляторную сеть фиксации азота, или по меньшей мере одну генетическую вариацию, внесенную в генетическую регуляторную сеть ассимиляции азота.

[0039] По дополнительному аспекту изобретения предоставлен способ увеличения у растения кукурузы количества получаемого из атмосферы азота. Способ включает воздействие на указанное растение кукурузы реконструированными не являющимися межродовыми микроорганизмами, несущими реконструированные генетические вариации по меньшей мере в двух генах, выбранных из группы, состоящей из nifL, glnB, glnE и amtB.

[0040] По другому аспекту изобретения предоставлен способ увеличения у растения кукурузы количества получаемого из атмосферы азота. Способ включает воздействие на указанное растение кукурузы реконструированными не являющимися межродовыми микроорганизмами, несущими по меньшей мере одну генетическую вариацию, внесенную в генетическую регуляторную сеть фиксации азота, и по меньшей мере одну генетическую вариацию, внесенную в генетическую регуляторную сеть ассимиляции азота, где указанные реконструированные не являющиеся межродовыми микроорганизмы, in planta, продуцируют у указанного растения кукурузы по меньшей мере 5% фиксированного азота, как измеряют посредством разведения ¹⁵N в сельскохозяйственных культурах, выращиваем в полях, обрабатываемых удобрением, содержащим 1,2% ¹⁵N.

[0041] Дополнительные аспекты изобретения относятся к роду микроорганизмов, который подвергали эволюции и оптимизировали для фиксации азота у небобовых сельскохозяйственных культур in planta. В частности, описаны способы увеличения фиксации азота у небобового растения. Способы могут включать воздействие на растение множеством бактерий. Каждый представитель множества несет одну или несколько генетических вариаций, вносимых в один или несколько генов или некодирующих полинуклеотидов генетической регуляторной сети фиксации или ассимиляции азота бактерий так, что бактерии становятся способны к фиксации атмосферного азота в присутствии экзогенного азота. Бактерии не являются межродовыми микроорганизмами. Кроме того, бактерии, in planta, продуцируют в растении 1% или более фиксированного азота.

[0042] Дополнительные аспекты изобретения относятся к полезным выделенным микроорганизмам и композициям микроорганизмов. В частности, предоставлены выделенные и биологически чистые микроорганизмы, которые, в числе прочего, применимы при увеличении фиксации азота в сельскохозяйственной культуре. Описанные микроорганизмы можно использовать в их выделенном и биологически чистом состояниях, а также формулировать в композиции. Кроме того, в описании предоставлены композиции микроорганизмов, содержащие по меньшей мере два представителя описанных микроорганизмов, а также способы использования указанных композиций микроорганизмов.

ВКЛЮЧЕНИЕ В КАЧЕСТВЕ ССЫЛКИ

[0043] Все публикации, патенты и патентные заявки, указываемые в настоящем описании, включены в настоящий документ в качестве ссылки в той же степени, как если бы каждые конкретные публикация, патент или патентная заявка были конкретно и отдельно указаны для включения в качестве ссылки.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

[0044] Новые признаки изобретения подробно описаны в прилагаемой формуле изобретения. Лучшее понимание признаков и преимуществ настоящего изобретения можно получить при обращении к приводимому ниже подробному описанию, в котором приведены иллюстративные варианты осуществления, в которых использованы основы изобретения, и к сопровождающим фигурам, в которых:

[0045] На фигурах 1A-B представлено обогащение и выделение азотфиксирующих бактерий. (A) Для выделения единичных колоний азотфиксирующих бактерий использовали планшеты с агаром Nfb. (B) Полутвердый агар Nfb залитый в пробирку Balch. Стрелка указывает на пелликулу обогащенных азотфиксирующих бактерий.

[0046] На фигуре 2 представлен иллюстративный скрининг nifH посредством ПЦР. В этом скрининге положительные полосы наблюдали при ≈350 п.н. для двух колоний. Более низко расположенные полосы представляют собой димеры праймеров.

[0047] На фигуре 3 приведен пример скрининга посредством ПЦР колоний после мутагенеза с отбором CRISPR-Cas. Колонии CI006 подвергали скринингу с праймерами, специфичными для локуса nifL. Ожидаемый продукт ПЦР дикого типа составляет ≈2,2 т.п.н., тогда как ожидаемый мутант составляет ≈1,1 т.п.н. Семь из десяти подвергнутых скринингу колоний однозначно продемонстрировали требуемую делецию.

[0048] На фигурах 4A-D приведены фенотипы различных штаммов in vitro. Анализ восстановления ацетилена (ARA) активность мутантов штамма CI010 (фигура 4A) и мутантов штамма CI006 (фигура 4B), выращиваемых в среде для фиксации азота, дополненной глутамином в концентрации от 0 до 10 мМ. Активность дополнительных штаммов в ARA приведена на фигуре 4C, а профиль выделения двумя штаммами аммония с течением времени представлен на фигуре 4D.

[0049] На фигуре 5 приведен профиль экспрессии в культуре 9 различных генов у штаммов CI006, вовлеченных в диазатрофную фиксацию азота. Цифры представляют количества каждого транскрипта. Приведены различные условия (0, 1, 10 мМ глутамин и 0%, 10%, 20% атмосферный воздух в N₂).

[0050] На фигуре 6 приведена колонизация CI006 корней кукурузы. Всходы кукурузы инокулировали CI006, несущими экспрессирующую RFP плазмиду. После двух недель роста и сохранения плазмиды при поливе соответствующим антибиотиком, корни собирали и проводили визуализацию посредством флуоресцентной микроскопии. Можно наблюдать колонизацию межклеточного пространства корней.

[0051] На фигуре 7 приведен азот, получаемый на уровне микроорганизмов у штамма дикого типа (CI050) и оптимизированного штамма (CM002).

[0052] На фигурах 8 представлена экспериментальная установка для анализа массы плодов Micro-Tom.

[0053] На фигуре 9 представлен скрининг 10 штаммов на увеличение массы плода растения в Micro-Tom. Представлены результаты шести повторений. Для столбца 3, p=0,07. Для столбца 7, p=0,05.

[0054] На фигурах 10A-C приведены дополнительные результаты для активности микроорганизмов-кандидатов и других мутантов-кандидатов, выращиваемых в средах для фиксации азота, дополненной глутамином в концентрации от 0 до 10 мМ, в ARA.

[0055] На фигуре 11 приведен двойной мутант, который демонстрирует более высокое выделение аммиака, чем одиночный мутант, из которого он получен.

[0056] На фигуре 12 приведен NDFA, получаемый в эксперименте по захвату газообразного ¹⁵N (с обратной экстраполяцией с использованием суток воздействия) для определения NDFA в растениях кукурузы в условиях добавления удобрения.

[0057] На фигуре 13 приведено значение NDFA, получаемое в эксперименте по захвату газообразного ¹⁵N (с обратной экстраполяцией с использованием суток воздействия) для определения NDFA в растениях Setaria в условиях добавления удобрения.

[0058] На фигуре 14A приведена степень включения газообразного ¹⁵N. Растения, инокулированные эволюционировавшим штаммом, по сравнению с неинокулированными растениями демонстрировали увеличение включения газообразного ¹⁵N.

[0059] На фигуре 14B приведены 4 недели после посадки, до 7% азота в растениях, инокулированных эволюционировавшим штаммом, происходит из фиксированного микроорганизмами азота.

[0060] На фигуре 14C показано увеличение площади листа (и других измерений биомассы, данные не показаны) у растений, инокулированных эволюционировавшим штаммом по сравнению с неинокулированными растениями или инокулированными растениями дикого типа.

[0061] На фигуре 15A приведены эволюционировавшие штаммы, которые демонстрируют значимо более высокую продукцию nifH в ткани корня, как определяют посредством транскриптомного исследования in planta.

[0062] На фигуре 15B показано, что уровень фиксированного азота, выявляемый в ткани растения, коррелирует с уровнем колонизации данного конкретного растения оптимизированным по HoME штаммом.

[0063] На фигуре 16A приведена карта структур почв различных полевых почв, тестируемых для колонизации. Почвы, которые исходно являлись источником незначительного количества микроорганизмов, указаны звездами.

[0064] На фигуре 16B приведен уровень колонизации штамма 1 и штамма 5, которые тестируют в четырех различных типах почв (окружности). Оба штамма продемонстрировали относительно устойчивый профиль колонизации в различных типах почв.

[0065] На фигуре 16C приведена колонизация штамма 1, протестированная в полевых испытаниях в течение вегетационного периода. Штамм 1 сохранялся в ткани кукурузы до 12 недели после посадки и начинал демонстрировать снижение колонизации после этого времени.

[0040] На фигуре 17A приведена схема выведения микроорганизмов по вариантам осуществления.

[0041] На фигуре 17B приведен расширенный вид определения состава микробиома, как приведено на фигуре 17A.

[0042] На фигуре 17C приведено получение образцов корней, используемых в примере 7.

[0043] На фигуре 18 приведена линия модифицированных штаммов, полученных из штамма CI006.

[0044] На фигуре 19 приведена линия модифицированных штаммов, полученных из штамма CI019.

[0045] На фигуре 20 приведена тепловая карта количества фунтов азота, доставляемых на акре/сезон микроорганизмами по настоящему изобретению, зарегистрированная как функция микроорганизмов на грамм сырой массы на ммоль азота/микроорганизм/час. Ниже тонкой линии, пересекающей более крупное изображение, находятся микроорганизмы, доставляющие менее одного фунта азота на акре/сезон, а выше линии находятся микроорганизмы, доставляющие более одного фунта азота на акре/сезон. В таблице ниже тепловой карты приведены точные значения ммоль N, продуцируемые микроорганизмом в час (ммоль N/микроорганизм/час) вместе с точными значениями КОЕ на грамм сырой массы (КОЕ/г св.масс.) для каждого микроорганизма, приведенного на тепловой карте. Микроорганизмы, используемые для тепловой карты, анализировали на продукцию N в кукурузе. Для штаммов дикого типа CI006 и CI019, данные по колонизации корня кукурузы получали с одного полевого участка. Для оставшихся штаммов, колонизацию полагали такой же, как уровень в поле у дикого типа. Активность фиксации N определяли с использованием анализа ARA in vitro с 5 мМ глутамином.

[0046] На фигуре 21 приведена урожайность растений под воздействием штамма CI006. Область кругов соответствует относительной урожайности, тогда как затенение соответствует конкретному показателю MRTN. Ось x представляет собой значение p, а ось y представляет собой вероятность выигрыша.

[0047] На фигуре 22 приведена урожайность растений под воздействием штамма CM029. Область кругов соответствует относительной урожайности, тогда как затенение соответствует конкретному показателю MRTN. Ось x представляет собой значение p, а ось y представляет собой вероятность выигрыша.

[0048] На фигуре 23 приведена урожайность растений под воздействием штамма CM038. Область кругов соответствует относительной урожайности, тогда как затенение соответствует конкретному показателю MRTN. Ось x представляет собой значение p, а ось y представляет собой вероятность выигрыша.

[0049] На фигуре 24 приведена урожайность растений под воздействием штамма CI019. Область кругов соответствует относительной урожайности, тогда как затенение соответствует конкретному показателю MRTN. Ось x представляет собой значение p, а ось y представляет собой вероятность выигрыша.

[0050] На фигуре 25 приведена урожайность растений под воздействием штамма CM081. Область кругов соответствует относительной урожайности, тогда как затенение соответствует конкретному показателю MRTN. Ось x представляет собой значение p, а ось y представляет собой вероятность выигрыша.

[0051] На фигуре 26 приведена урожайность растений под воздействием штаммов CM029 и CM081. Область кругов соответствует относительной урожайности, тогда как затенение соответствует конкретному показателю MRTN. Ось x представляет собой значение p, а ось y представляет собой вероятность выигрыша.

[0052] На фигуре 27 приведена урожайность растений в виде совокупных прироста/потери в бушелях. Область кругов соответствует относительной урожайности, тогда как затенение соответствует конкретному показателю MRTN. Ось x представляет собой значение p, а ось y представляет собой вероятность выигрыша.

[0053] На фигурах 28A-28E проиллюстрированы производные микроорганизмы, которые фиксируют и выделяют азот in vitro в условиях, сходных с высоконитратными сельскохозяйственными почвами. На фигуре 28A проиллюстрирована регуляторная сеть, контролирующая фиксацию и ассимиляцию азота у PBC6.1, включающая ключевые узлы NifL, NifA, GS, GlnE, изображенные в виде двухдоменого АТазного-AR фермента и AmtB. На фигуре 28B проиллюстрирован геном изолята PBC6.1 Kosakonia sacchari. Три траектории, описывающие геном, соответствуют данным транскрипции PBC6.1, PBC6.38 и дифференциальной экспрессии у штаммов, соответственно. На фигуре 28C проиллюстрирован кластер генов фиксации азота и данные по транскрипции увеличены для демонстрации более мелких подробностей. На фигуре 28D проиллюстрирована нитрогеназная активность при варьирующих концентрациях экзогенного азота, определенная анализом восстановления ацетилена. Штамм дикого типа демонстрирует подавление нитрогеназной активности по мере увеличения концентраций глутамина, тогда как производные штаммы демонстрируют различные степени устойчивости. Величины ошибок представляют собой стандартную ошибку среднего по меньшей мере трех биологических повторений. На фигуре 28E проиллюстрирован временное выделение аммиака производными штаммами, наблюдаемое при мМ концентрациях. По наблюдениям, штаммы дикого типа не выделяют фиксированный азот, и в средах накапливается незначительное количество аммиака. Величины ошибок представляют собой стандартную ошибку среднего.

[0054] На фигурах 29A-29C проиллюстрированы эксперименты в теплице, демонстрирующие фиксация азота микроорганизмами в кукурузе. На фигуре 29A проиллюстрирована колонизация микроорганизмами через шесть недель после инокуляция растений кукурузы штаммами, производными PBC6.1. Величины ошибок представляют собой стандартную ошибку среднего по меньшей мере восьми биологических повторений. На фигуре 29B проиллюстрирована транскрипция nifH in planta, определяемая посредством выделения тотальной РНК из корней и последующего анализа Nanostring. Только производные штаммы демонстрируют транскрипцию nifH в условиях корней. Величины ошибок представляют собой стандартную ошибку среднего по меньшей мере 3 биологических повторений. На фигуре 29C проиллюстрирована фиксация азота микроорганизмами, определяемая посредством разведения изотопного индикатора в тканях растений. Производные микроорганизмы демонстрируют значительный перенос фиксированного азота в растение. Величины ошибок представляют собой стандартную ошибку среднего по меньшей мере десяти биологических повторений.

[0055] На фигуре 30 проиллюстрирована колонизация PBC6.1 почти до 21% количества ассоциированной с корнями микробиоты в корнях кукурузы. Количественные данные основанные на секвенирование ампликонов 16S ризосферы и эндосферы растений кукурузы, инокулированных PBC6.1 и выращиваемых в тепличных условиях.

[0056] На фигуре 31 проиллюстрированы транскрипционные уровни nifA в штаммах, производных PBC6.1, коррелируемые с уровнями восстановления ацетилена. Анализ ARA проводили, как описано в разделе способов, после чего отбирали образец культуры и подвергали анализу кПЦР с определением уровней транскрипта nifA. Величины ошибок в каждом измерении представляют собой стандартную ошибку среднего по меньшей мере трех биологических повторений.

[0057] На фигуре 32 проиллюстрированы результаты тестового полевого эксперимента лета 2017 года. Полученные результаты урожайности демонстрируют, что микроорганизмы по изобретению могут служить в качестве потенциального заменителя удобрений. Например, использование микроорганизма по изобретению (т.е., 6-403) приводило к более высокому урожаю, чем у штамма дикого типа (WT) и к более высокому урожаю, чем у необработанного контроля (UTC). При обработке "-25 фунтов N" используют на 25 фунтов N на акр меньше, чем при стандартной сельскохозяйственной практике в этом регионе. Обработка UTC "100% N" предназначена для обозначения стандартной сельскохозяйственной практики в этом регионе, при которой 100% стандартного использования N применяет сельхозпроизводитель. Микроорганизм "6-403" депонирован под идентификатором NCMA 201708004, и его можно найти в таблице A. Он представляет собой мутанта Kosakonia sacchari (также называемого CM037) и представляет собой мутантный штамм-потомок CI006 дикого типа.

[0058] На фигуре 33 проиллюстрированы результаты тестового полевого эксперимента лета 2017 года. Полученные результаты урожайности демонстрируют, что микроорганизмы по изобретению в различных регионах действуют единообразно. Кроме того, результаты урожайности демонстрируют, что микроорганизмы по изобретению хорошо функционируют как в среде с недостаточным содержанием азота, так и в среде с достаточным содержанием азота. Микроорганизм "6-881" (также известный как CM094, PBC6.94) и являющийся мутантным потомком штамма Kosakonia sacchari CI006 дикого типа, депонирован под идентификатором NCMA 201708002, и его можно найти в таблице A. Микроорганизм "137-1034", который является мутантным потомком штамма Klebsiella variicola CI137 дикого типа, депонирован под идентификатором NCMA 201712001, и его можно найти в таблице A. Микроорганизм "137-1036", который является мутантным потомком штамма Klebsiella variicola CI137 дикого типа, депонирован под идентификатором NCMA 201712002, и его можно найти в таблице A. Микроорганизм "6-404" (также известный как CM38, PBC6.38), и который является мутантным потомком штамма Kosakonia sacchari CI006 дикого типа, депонирован под идентификатором NCMA 201708003, и его можно найти в таблице A. Условия "недостатка питания" соответствует условиям с 0% азота. Условия с "достаточным содержанием удобрения" соответствует условиям со 100% азота.

[0059] На фигуре 34 приведена линия модифицированных штаммов, полученных из штамма CI006 (также обозначаемого "6", дикий тип Kosakonia sacchari).

[0060] На фигуре 35 приведена линия модифицированных штаммов, полученных из штамма CI019 (также обозначаемого "19", дикий тип Rahnella aquatilis).

[0061] На фигуре 36 приведена линия модифицированных штаммов, полученных из штамма CI137 (также обозначаемого "137", дикий тип Klebsiella variicola).

[0062] На фигуре 37 приведена линия модифицированных штаммов, полученных из штамма 1021 (дикий тип Kosakonia pseudosacchari).

[0063] На фигуре 38 приведена линия модифицированных штаммов, полученных из штамма 910 (дикий тип Kluyvera intermedia).

[0064] На фигуре 39 приведена линия модифицированных штаммов, полученных из штамма 63 (дикий тип Rahnella aquatilis).

[0065] На фигуре 40 приведена тепловая карта количества фунтов азота, доставляемых на акре/сезон микроорганизмами по настоящему изобретению, зарегистрированная как функция микроорганизмов на грамм сырой массы на ммоль азота/микроорганизм/час. Ниже тонкой линии, пересекающей более крупное изображение, находятся микроорганизмы, доставляющие менее одного фунта азота на акре/сезон, а выше линии находятся микроорганизмы, доставляющие более одного фунта азота на акре/сезон. В таблица C в примере 12 приведены точные значения ммоль N, продуцируемых микроорганизмом в час (ммоль N/микроорганизм/час) вместе с точными значениями КОЕ на грамм сырой массы (КОЕ/г св.масс.) для каждого микроорганизма, приведенного на тепловой карте. Данные на фигуре 40 получают для штаммов микроорганизмов, оцениваемых на продукцию N в кукурузе в полевых условиях. Каждая точка представляет собой количество фунтов N/акр, продуцируемых микроорганизмом, с использованием данных по колонизации корня кукурузы с одного полевого участка. Активность фиксации N определяли с использованием анализа ARA in vitro с 5 мМ N в форме глутамина или фосфата аммония.

[0066] На фигуре 41 приведена тепловая карта количества фунтов азота, доставляемых на акре/сезон микроорганизмами по настоящему изобретению, зарегистрированная как функция микроорганизмов на грамм сырой массы на ммоль азота/микроорганизм/час. Ниже тонкой линии, пересекающей более крупное изображение, находятся микроорганизмы, доставляющие менее одного фунта азота на акре/сезон, а выше линии находятся микроорганизмы, доставляющие более одного фунта азота на акре/сезон. В таблица D в примере 12 приведены точные значения ммоль N, продуцируемых микроорганизмом в час (ммоль N/микроорганизм/час) вместе с точными значениями КОЕ на грамм сырой массы (КОЕ/г св.масс.) для каждого микроорганизма, приведенного на тепловой карте. Данные на фигуре 41 получают для штаммов микроорганизмов, оцениваемых на продукцию N в кукурузе в лабораторных и тепличных условиях. Каждая точка представляет собой количество фунтов N/акр, продуцируемое одним штаммом. Белые точки представляют штаммы, для которых данные по колонизации корня кукурузы получали в тепличных условиях. Черные точки представляют мутантные штаммы, для которых уровни колонизации корней кукурузы получают на основании средних полевых уровней колонизации корней кукурузы родительского штамма дикого типа. Заштрихованные точки представляют родительские штаммы дикого типа с их средними полевыми уровнями колонизации корней кукурузы. Во всех случаях активность фиксации N определяли посредством анализа ARA in vitro с 5 мМ N в форме глутамина или фосфата аммония.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0067] Хотя в настоящем документе представлены и описаны различные варианты осуществления изобретения, специалистам в данной области очевидно, что такие варианты осуществления предоставлены только в качестве примера. Специалисты в данной области могут проводить многочисленные вариации, изменения и замены без отклонения от изобретения. Следует понимать, что вместо вариантов осуществления изобретения, описываемых в настоящем документе, можно использовать различные альтернативы.

[0068] Повышенное использование удобрений сопряжено с экологическими проблемами и, вероятно, не представляется возможным для многих экономически напряженных регионов земного шара. Кроме того, многие промышленные предприятия в области микроорганизмов сфокусированы на создании межродовых микроорганизмов. Однако на подвергнутые инженерии микроорганизмы, которые характеризуют/классифицируют как межродовые, накладывается тяжелое регуляторное обременение. Эти межродовые микроорганизмы сталкиваются не только с более высоким регуляторным обременением, что затрудняет широкое распространение и внедрение, но также с большим вниманием общественности.

[0069] В настоящее время на рынке отсутствуют подвергнутые инженерии микроорганизмы, не являющиеся межродовыми и способные усиливать фиксацию азота у небобовых культур. Это отсутствие такого микроорганизма представляет собой недостающий элемент, помогающий создать действительно экологически чистую и более устойчивую сельскохозяйственную систему XXI века.

[0070] Настоящее изобретение решает указанные выше проблемы и предоставляет не являющийся межродовым микроорганизм, который был сконструирован для легкой фиксации азота в сельскохозяйственных культурах. Эти микроорганизмы не характеризуют/классифицируют как межродовые микроорганизмы и, следовательно, они не будут сталкиваться с их серьезным регулирующим обременением. Кроме того, исследованные не являющиеся межродовыми микроорганизмы могут поспособствовать сельхозпроизводителям XXI века стать менее зависимыми от использования постоянно растущего количества экзогенных азотных удобрений.

Определения

[0071] Термины "полинуклеотид", "нуклеотид", "нуклеотидная последовательность", "нуклеиновая кислота" и "олигонуклеотид" используют взаимозаменяемо. Они относятся к полимерной форме нуклеотидов любой длины, представляющих собой дезоксирибонуклеотиды, или рибонуклеотиды, или их аналоги. Полинуклеотиды могут обладать любой трехмерной структурой и могут выполнять любую функцию, известную или неизвестную. Неограничивающими примерами полинуклеотидов является следующее: кодирующие или некодирующие области гена или фрагмента гена, локусы (локус), определяемые на основе анализа сцепления, экзоны, интроны, информационная РНК (иРНК), транспортная РНК (тРНК), рибосомальная РНК (рРНК), малая интерферирующая РНК (миРНК), короткошпилечная РНК (кшРНК), микро-РНК (мкРНК), рибозимы, кДНК, рекомбинантные полинуклеотиды, разветвленные полинуклеотиды, плазмиды, векторы, выделенная ДНК любой последовательности, выделенная РНК любой последовательности, зонды и праймеры нуклеиновой кислоты. Полинуклеотид может содержать один или несколько модифицированных нуклеотидов, таких как метилированные нуклеотиды и аналоги нуклеотидов. Если они присутствуют, модификации структуры нуклеотида можно обеспечивать до или после сборки полимера. Последовательности нуклеотидов могут прерываться ненуклеотидными компонентами. Полинуклеотид можно дополнительно модифицировать после полимеризации, например, посредством конъюгации с меченым компонентом.

[0072] "Гибридизация" относится к реакции, в которой реагируют один или несколько полинуклеотидов с формированием комплекса, который стабилизирован вследствие образования водородных связей между основаниями нуклеотидных остатков. Образование водородных связей может происходить при спаривании оснований по Уотсону-Крику, связывании по Хугстину или любым другим специфичным для последовательностей способом. Комплекс может содержать две цепи, формирующие дуплексную структуру, три или более цепи, формирующие мультицепочечный комплекс, одну самогибридизующуюся цепь или любую комбинацию из них. Реакция гибридизации может представлять собой этап в более сложном процессе, таком как инициация ПЦР или ферментативное расщепление полинуклеотида эндонуклеазой. Вторая последовательность, которая комплементарна первой последовательности обозначают как последовательность, "комплементарную" первой последовательности. Термин "гибридизующийся" в применении к полинуклеотиду относится к способности полинуклеотида к формированию комплекса, который стабилизирован вследствие образования водородных связей между основаниями нуклеотидных остатков в реакции гибридизации.

[0073] "Комплементарность" относится к способности нуклеиновой кислоты к формированию водородной связи(-ей) с другой последовательностью нуклеиновой кислоты посредством традиционного спаривания по Уотсону-Крику или других нетрадиционных типов спаривания. Процент комплементарности означает процент остатков в молекуле нуклеиновой кислоты, которые могут формировать водородные связи (например, посредством спаривания оснований по Уотсону-Крику) со второй последовательностью нуклеиновой кислоты (например, 5, 6, 7, 8, 9, 10 из 10 представляют собой комплементарность 50%, 60%, 70%, 80%, 90% и 100%, соответственно). "Идеальная комплементарность" означает, что се последовательные остатки последовательности нуклеиновой кислоты формируют водородные связи с таким же количеством последовательных остатков во второй последовательности нуклеиновой кислоты. Как используют в настоящем документе, "в значительной степени комплементарные" относится к степени комплементарности, которая составляет по меньшей мере 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% или 100% на области 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50 или более нуклеотидов, или относится к двум нуклеиновым кислотам, которые гибридизуются в жестких условиях. Идентичность последовательностей, например, для целей оценки процента комплементарности, можно определять любым подходящим алгоритмом выравнивания, включая в качестве неограничивающих примеров алгоритм Нидлмана-Вунша (см. например, средство выравнивания EMBOSS Needle, доступное на www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/nucleotide.html, необязательно с установками по умолчанию), алгоритм BLAST (см. например, средство выравнивания BLAST, доступное на blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi, необязательно с настройками по умолчанию) или алгоритм Смита-Уотермана (см. например, средство выравнивания EMBOSS Water, доступное на www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_water/nucleotide.html, необязательно с настройками по умолчанию). Оптимальное выравнивание можно оценивать с использованием любых подходящих параметров выбранного алгоритма, включая параметры по умолчанию.

[0074] Как правило, "жесткие условия" гибридизации относятся к условиям, в которых нуклеиновая кислота, комплементарная последовательности-мишени, преимущественно гибридизуется с последовательностью-мишенью, и по существу не гибридизуется с не являющимися мишенями последовательностями. Как правило, жесткие условия зависят от последовательности и варьируют в зависимости от ряда факторов. Как правило, чем длиннее является последовательность, тем выше является температура при которой последовательность специфически гибридизуется с ее последовательностью-мишенью. Неограничивающие примеры жестких условий подробно описаны в Tijssen (1993), Laboratory Techniques In Biochemistry And Molecular Biology-Hybridization With Nucleic Acid Probes Part I, Second Chapter "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assay", Elsevier, N.Y.

[0075] Как используют в настоящем документе, "экспрессия" относится к процессу, посредством которого полинуклеотид транскрибируется с матрицы ДНК (например в иРНК или другой транскрипт РНК), и/или к процессу, посредством которого затем происходит трансляция транскрибируемой иРНК в пептиды, полипептиды или белки. Транскрипты и кодируемые полипептиды в совокупности можно обозначить как "продукт гена". Если полинуклеотид получен с геномной ДНК, экспрессия может включать сплайсинг иРНК в эукариотической клетке.

[0076] Термины "полипептид", "пептид" и "белок" в настоящем документе используют взаимозаменяемо для обозначения полимеров аминокислот любой длины. Полимер может быть линейным или разветвленным, он может содержать модифицированные аминокислоты, и он может прерываться не являющимися аминокислотами участками. Термины также включает модифицированный полимер из аминокислот; например, посредством формирования дисульфидной связи, гликозилирования, липидизации, ацетилирования, фосфорилирования или любой другой манипуляции, такой как конъюгация с меченым компонентом. Как используют в настоящем документе термин "аминокислота" включает природные и/или неприродные или синтетические аминокислоты, включая глицин и D или L оптические изомеры, и аналоги аминокислот и пептидомиметики.

[0077] Как используют в настоящем документе, термин "приблизительно" используют как синоним термина "примерно". Для иллюстрации, использование термина "приблизительно" в отношении количества означает, что значения немного выходят за указанные значения, например, плюс или минус от 0,1% до 10%.

[0078] Термин "биологически чистая культура" или "по существу чистая культура" относится к культуре вида бактерий, описываемого в настоящем документе, не содержащей других видов бактерий в количествах, достаточных для препятствия репликации культуры, или детектируемых стандартными бактериологическими методами.

[0079] "Продуктивность растений" в основном относится к любому показателю роста или развития растения, который является причиной, по которой это растение выращивают. Для продовольственных культур, таких как зерновые или овощи, "продуктивность растений" может относиться к урожаю зерновых или плодов, собираемых у конкретной сельскохозяйственной культуры. Как используют в настоящем документе, улучшенная продуктивность растений в широком смысле относится к улучшению урожая зерна, плодов, цветов или других частей растений, собираемых с различными целями, улучшению роста частей растений, включая стебли, листья и корни, к стимуляции роста растений, подержанию высокого содержания хлорофилла в листьях, увеличению количества плодов или семян, увеличению массы единичного плода или семени, уменьшению выброса NO₂ вследствие сниженного использования азотных удобрений и подобным улучшениям роста и развития растений.

[0080] Микроорганизмы в продовольственных культурах и около них могут влиять на признаки этих культур. Признаки растений, на которые могут влиять микроорганизмы включают: урожайность (например, продукция зерна, производство биомассы, развитие плодов, строение цветов); питание (например, потребление азота, фосфора, калия, железа, питательных микроэлементов); способность к контролю абиотического стресса (например, засухоустойчивость, солеустойчивость, жароустойчивость) и способность к контролю биотического стресса (например, сельскохозяйственных вредителей, сорняков, насекомых, грибов и бактерий). Стратегии изменения признаков сельскохозяйственных культур включают: увеличение концентраций ключевых метаболитов; изменение временной динамики воздействия микроорганизмов на ключевые метаболиты; связывание продукции/разрушения метаболитов микроорганизмами с новыми параметрами окружающей среды; сокращение нежелательных метаболитов и улучшение баланса метаболитов или обуславливающих белков.

[0081] Как используют в настоящем документе, "регуляторная последовательность" относится к оператору, промотору, сайленсеру или терминатору.

[0082] Как используют в настоящем документе, "in planta" означает в растении, где растение дополнительно включает части, ткани, листья, корни, стебли, семена, семязачатки, пыльцу, цветы, плоды растения и т.д.

[0083] В определенных вариантах осуществления природные или эндогенные регуляторные последовательности генов по настоящему изобретению заменяют одной или несколькими внутриродовыми регуляторными последовательностями.

[0084] Как используют в настоящем документе, "вводимый" относится к введению посредством современной биотехнологии, а не к природному введению.

[0085] В определенных вариантах осуществления бактерии по настоящему изобретению модифицированы так, что они не являются природными бактериями.

[0086] В определенных вариантах осуществления бактерии по настоящему изобретению присутствуют в растении в количестве по меньшей мере 10³ КОЕ, 10⁴ КОЕ, 10⁵ КОЕ, 10⁶ КОЕ, 10⁷ КОЕ, 10⁸ КОЕ, 10⁹ КОЕ, 10¹⁰ КОЕ, 10¹¹ КОЕ или 10¹² КОЕ на грамм сырой или сухой массы растения. В определенных вариантах осуществления бактерии по настоящему изобретению присутствуют в растении в количестве по меньшей мере приблизительно 10³ КОЕ, приблизительно 10⁴ КОЕ, приблизительно 10⁵ КОЕ, приблизительно 10⁶ КОЕ, приблизительно 10⁷ КОЕ, приблизительно 10⁸ КОЕ, приблизительно 10⁹ КОЕ, приблизительно 10¹⁰ КОЕ, приблизительно 10¹¹ КОЕ или приблизительно 10¹² КОЕ на грамм сырой или сухой массы растения. В определенных вариантах осуществления бактерии по настоящему изобретению присутствуют в растении в количестве по меньшей мере от 10³ до 10⁹, от 10³ до 10⁷, от 10³ до 10⁵, от 10⁵ до 10⁹, от 10⁵ до 10⁷, от 10⁶ до 10¹⁰, от 10⁶ до 10⁷ КОЕ на грамм сырой или сухой массы растения.

[0087] Удобрения и экзогенный азот по настоящему изобретению могут включать следующие азотсодержащие молекулы: аммоний, нитрат, нитрит, аммиак, глутамин и т.д. Источники азота по настоящему изобретению могут включать безводный аммиак, сульфат аммония, мочевину, фосфат диаммония, формальдегидмочевину, фосфат моноаммония, нитрат аммония, жидкие азотные удобрения, нитрат кальция, нитрат калия, нитрат натрия и т.д.

[0088] Как используют в настоящем документе, "экзогенный азот" относится к неатмосферному азоту, легкодоступному в почве, поле или среде для выращивания, который присутствует в условиях без ограничения азота, включая аммиак, аммоний, нитрат, нитрит, мочевина, мочевая кислота, аммонийные кислоты и т.д.

[0089] Как используют в настоящем документе, "условия без ограничения азота" относится к неатмосферному азоту, доступному в почве, поле, средах в концентрациях, больших чем приблизительно 4 мМ азот, как описано в Kant et al. (2010. J. Exp. Biol. 62(4):1499-1509), включенной в настоящий документ в качестве ссылки.

[0090] Как используют в настоящем документе, "межродовой микроорганизм" представляет собой микроорганизм, который сформирован посредством преднамеренной комбинации генетического материала, исходно выделенного из организмов различных таксономических родов. Взаимозаменяемо с "межродовым микроорганизмом" можно использовать "межродовой мутант". Иллюстративный "межродовой микроорганизм" включает микроорганизм, содержащий мобильный генетический элемент, который впервые идентифицирован в микроорганизме, принадлежащем роду, отличного от микроорганизма-реципиента. Дополнительное объяснение в числе прочего можно найти в 40 C.F.R. 725.3.

[0091] В различных аспектах микроорганизмы, исследованные в настоящем документе, представляют собой "не являющиеся межродовыми", что означает, что организмы микроорганизмы не являются межродовыми.

[0092] Как используют в настоящем документе, "внутриродовой микроорганизм" представляет собой микроорганизм, который сформирован посредством преднамеренной комбинации генетического материала, исходно выделенного из организмов одного и того же таксономического рода. Взаимозаменяемо с "внутриродовым микроорганизмом" можно использовать "внутриродовой мутант".

[0093] Как используют в настоящем документе, "вводимый генетический материал" означает генетический материал, который добавляют в геном реципиента и который остается в геноме реципиента в качестве компонента.

[0094] В определенных вариантах осуществления генетическая регуляторная сеть фиксации и ассимиляции азота содержит полинуклеотиды, кодирующие гены, и некодирующие последовательности, которые направляют, модулируют и/или регулируют фиксацию и/или ассимиляцию азота микроорганизмами и может содержать полинуклеотидные последовательности кластера nif (например, nifA, nifB, nifC,…nifZ), полинуклеотиды, кодирующие регулирующий метаболизм азота белок C, полинуклеотиды, кодирующие регулирующий метаболизм азота белок B, полинуклеотидные последовательности кластера gln (например, glnA и glnD), draT и переносчики/пермеазы аммония. В определенных случаях кластер Nif может содержать NifB, NifH, NifD, NifK, NifE, NifN, NifX, hesa и NifV. В определенных случаях кластер Nif может содержать подмножество NifB, NifH, NifD, NifK, NifE, NifN, NifX, hesa и NifV.

[0095] В определенных вариантах осуществления удобрение по настоящему изобретению содержит по меньшей мере 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% азота по массе.

[0096] В определенных вариантах осуществления удобрение по настоящему изобретению содержит по меньшей мере приблизительно 5%, приблизительно 6%, приблизительно 7%, приблизительно 8%, приблизительно 9%, приблизительно 10%, приблизительно 11%, приблизительно 12%, приблизительно 13%, приблизительно 14%, приблизительно 15%, приблизительно 16%, приблизительно 17%, приблизительно 18%, приблизительно 19%, приблизительно 20%, приблизительно 21%, приблизительно 22%, приблизительно 23%, приблизительно 24%, приблизительно 25%, приблизительно 26%, приблизительно 27%, приблизительно 28%, приблизительно 29%, приблизительно 30%, приблизительно 31%, приблизительно 32%, приблизительно 33%, приблизительно 34%, приблизительно 35%, приблизительно 36%, приблизительно 37%, приблизительно 38%, приблизительно 39%, приблизительно 40%, приблизительно 41%, приблизительно 42%, приблизительно 43%, приблизительно 44%, приблизительно 45%, приблизительно 46%, приблизительно 47%, приблизительно 48%, приблизительно 49%, приблизительно 50%, приблизительно 51%, приблизительно 52%, приблизительно 53%, приблизительно 54%, приблизительно 55%, приблизительно 56%, приблизительно 57%, приблизительно 58%, приблизительно 59%, приблизительно 60%, приблизительно 61%, приблизительно 62%, приблизительно 63%, приблизительно 64%, приблизительно 65%, приблизительно 66%, приблизительно 67%, приблизительно 68%, приблизительно 69%, приблизительно 70%, приблизительно 71%, приблизительно 72%, приблизительно 73%, приблизительно 74%, приблизительно 75%, приблизительно 76%, приблизительно 77%, приблизительно 78%, приблизительно 79%, приблизительно 80%, приблизительно 81%, приблизительно 82%, приблизительно 83%, приблизительно 84%, приблизительно 85%, приблизительно 86%, приблизительно 87%, приблизительно 88%, приблизительно 89%, приблизительно 90%, приблизительно 91%, приблизительно 92%, приблизительно 93%, приблизительно 94%, приблизительно 95%, приблизительно 96%, приблизительно 97%, приблизительно 98% или приблизительно 99% азота по массе.

[0097] В определенных вариантах осуществления удобрение по настоящему изобретению содержит приблизительно от 5% до 50%, приблизительно от 5% до 75%, приблизительно от 10% до 50%, приблизительно от 10% до 75%, приблизительно от 15% до 50%, приблизительно от 15% до 75%, приблизительно от 20% до 50%, приблизительно от 20% до 75%, приблизительно от 25% до 50%, приблизительно от 25% до 75%, приблизительно от 30% до 50%, приблизительно от 30% до 75%, приблизительно от 35% до 50%, приблизительно от 35% до 75%, приблизительно от 40% до 50%, приблизительно от 40% до 75%, приблизительно от 45% до 50%, приблизительно от 45% до 75% или приблизительно от 50% до 75% азота по массе.

[0098] В определенных вариантах осуществления увеличение фиксации азота и/или продукцию 1% или более азота в растении определяют относительно контрольных растений, которые не подвергали действию бактерий по настоящему изобретению. Все увеличения или уменьшения количеств бактерий определяют относительно контрольных растений. Все увеличения или уменьшения в растениях измеряют относительно контрольных растений.

[0099] Как используют в настоящем документе, "конститутивный промотор" представляет собой промотор, который является активным в большинстве условий и/или в течение большинства стадий развития. Существует несколько преимуществ использования в экспрессирующих векторах, используемых в биотехнологии, конститутивных промоторов, например: высокий уровень продукции белков, используемых для отбора трансгенных клеток или организмов; высокий уровень экспрессии репортерных белков или селективных маркеров, обеспечивая простые детекцию и количественный анализ; высокий уровень продукции фактора транскрипции, который является частью системы регуляции транскрипции; продукция соединений, у которых необходима повсеместная активность в организме; и продукция соединений, которые необходимы на всех стадиях развития. Неограничивающие иллюстративные конститутивные промоторы включают промотор 35S CaMV, промоторы опинов, промотор убиквитина, промотор алкогольдегидрогеназы и т.д.

[0100] Как используют в настоящем документе, "неконститутивный промотор" представляет собой промотор, который активен в определенных условиях, в определенных типах клеток и/или в течение определенных стадиях развития. Например, тканеспецифичные, тканепредпочтительные, специфичные для типов клеток, предпочтительные для типов клеток, индуцибельные промоторы и промоторы под контролем развития являются неконститутивными промоторы. Примеры промоторов под контролем развития включают промоторы, которые предпочтительно инициируют транскрипцию в определенных тканях.

[0101] Как используют в настоящем документе, "индуцибельный" или "реперссируемый" промотор представляет собой промотор, который находится под контролем химических веществ или факторов окружающей среды. Примеры условий окружающей среды, который могут влиять на транскрипцию под действием индуцибельных промоторов, включают анаэробные условия, определенные химические вещества, наличие света, кислые или основные условия и т.д.

[0102] Как используют в настоящем документе, "тканеспецифический" промотор представляет собой промотор, который инициирует транскрипцию только в определенных тканях. В отличие от конститутивной экспрессии генов, тканеспецифическая экспрессия является результатом нескольких взаимодействующих уровне регуляции генов. Таким образом, в данной области для достижения эффективной и надежной экспрессии трансгенов в конкретных тканях иногда предпочтительно использовать промоторы гомологичных или близкородственных видов. Это является одной из основных причин находимого как в научной, так и в патентной литературе большого количества тканеспецифичных промоторов, выделенных из конкретных тканей.

[0103] Как используют в настоящем документе, термин "функционально связанные" относится к ассоциации последовательностей нуклеиновых кислот в одном фрагменте нуклеиновой кислоты так, что функцию одной регулирует другая. Например, промотор функционально связан с кодирующей последовательностью, когда он может регулировать экспрессию этой кодирующей последовательности (т.е., эта кодирующая последовательность находится под транскрипционным контролем промотора). Кодирующие последовательности могут быть функционально связаны с регуляторными последовательностями в смысловой или антисмысловой ориентации. В другом примере комплементарные области РНК по изобретению могут быть функционально связаны, непосредственно или опосредовано, со стороны 5'-конца от иРНК-мишени, или со стороны 3'-конца от иРНК-мишени, или с иРНК-мишенью, или первая комплементарная область находится со стороны 5'-конца, а ее комплементарная область находится со стороны 3'-конца от иРНК-мишени.

[0104] В определенных аспектах "нанесение на растение множества не являющихся межродовыми бактерий" включает любые средства, которыми растение (включая части растения, такие как семена, корень, стебель, ткань и т.д.) приводят в контакт (т.е., производят воздействие) с указанными бактериями на любом этапе жизненного цикла растения. Таким образом, "нанесение на растение множества не являющихся межродовыми бактерий" включает любые из приводимых ниже средств воздействия на растение (включая части растения, такие как семена, корень, стебель, ткань и т.д.) указанными бактериями: распыление на растение, капание на растение, нанесение в виде покрытия семян, внесение в поле, на которое затем высаживают семена, внесение в поле, на которое уже высажены семена, внесение в поле со взрослыми растениями и т.д.

[0105] Как используют в настоящем документе "MRTN" представляет собой сокращение для максимального возврата азота, и его используют в качестве экспериментального показателя в примерах. MRTN разработан в государственном университете штата Айова, а информацию можно найти на странице: http://cnrc.agron.iastate.edu/ MRTN представляет собой уровень азота, при котором чистая экономическая отдача при применении азота является максимальной. Подход к расчету MRTN является региональным подходом к разработке рекомендаций по уровням азота в кукурузе в конкретных штатах. Данные исследований уровня азота оценивали для Иллинойса, Айовы, Мичигана, Миннесоты, Огайо и Висконсина, где было доступно достаточное количество исследований для посадок кукурузы после сои и посадок кукурузы после кукурузы. Исследования проводили с использованием весеннего междурядного или разделенного предпосевного/междурядного внесения азота, и участки не подвергали ирригации за исключением участков, которые указаны для ирригируемых песков в Висконсине. MRTN разработан в государственном университете штата Айова ввиду явных различий способов определения предполагаемых уровней азота, необходимых для производства кукурузы, неправильных предположений относительно рекомендаций по уровню азота и опасений об уровнях внесения. Рассчитывая MRTN, практикующие специалисты могут определить следующее: (1) уровень азота, при котором чистая экономическая отдача при применении азота является максимальной, (2) экономически оптимальный уровень азота, который является точкой, где последнее увеличение уровня азота обеспечивает увеличение урожайности, достаточное для оплаты дополнительного азота, (3) значение увеличения зерен кукурузы, связанное с применением азота, и максимальный урожай, который является урожаем, при котором внесение большего количества азота не приводит к увеличению урожая кукурузы. Таким образом, расчеты MRTN предоставляют практикующим специалистам средства для максимизации посевов кукурузы в разных регионах при максимальной финансовой выгоде от применения азота.

[0106] Термин ммоль представляет собой сокращение для миллимоля, который представляет собой тысячную часть (10^-3) моля, сокращенного в настоящем документе как моль.

[0107] Как используют в настоящем документе термины "микроорганизм" или "микроб" следует понимать широко. Эти термины, используемые взаимозаменяемо, в качестве неограничивающих примеров включают два домена прокариот, бактерии и археи. Термин также может включать эукариотические грибы и простейших.

[0108] Термин "консорциумы микроорганизмов" или "консорциум микроорганизмов" относится к подмножеству сообщества микроорганизмов конкретных видов микроорганизмов или штаммам видов, которое можно описать, как выполняющее общую функцию, или можно описать, как участвующее, или приводящее, или коррелирующее с требуемым параметром, таким как представляющий интерес фенотипический признак.

[0109] Термин "сообщество микроорганизмов" означает группу микроорганизмов, содержащую два или более видов или штаммов. В отличие от консорциумов микроорганизмов, сообщество микроорганизмов не должно выполнять общую функцию, или не должно участвовать, или приводить, или коррелировать с требуемым параметром, таким как представляющий интерес фенотипический признак.

[0110] Как используют в настоящем документе, "изолят", "выделенный", "выделенный микроорганизм" и подобные термины предназначены для обозначения того, что один или несколько микроорганизмов отделены по меньшей мере от одного из веществ, с которыми они ассоциированы в конкретной среде (например, почве, воде, ткани растения и т.д.). Таким образом, "выделенный микроорганизм" не находится в его природном окружении; точнее, что различными описанным в настоящем документе способами, микроорганизм удален из своего природного состояния и помещен в не встречающееся в природе состояние существования. Таким образом, выделенный штамм или выделенный микроорганизм может находиться, например, в виде биологически чистой культуры или в виде спор (или других форм штамма). В определенных аспектах выделенный микроорганизм может находиться в ассоциации с приемлемым носителем, который может являться приемлемым в сельском хозяйстве носителем.

[0111] В определенных аспектах изобретения выделенные микроорганизмы существуют в виде "выделенных и биологически чистых культур". Специалисту в данной области следует понимать, что выделенная и биологически чистая культура конкретного микроорганизма означает, что указанная культура по существу очищена от других живых организмов и содержит только конкретный рассматриваемый микроорганизм. Культура может содержать варьирующие концентрации указанного микроорганизма. В настоящем описании отмечено, что выделенные и биологически чистые микроорганизмы часто "необязательно отличаются от менее чистых или загрязненных материалов". См., например, In re Bergstrom, 427 F.2d 1394, (CCPA 1970) (где описаны очищенные простагландины), также см., In re Bergy, 596 F.2d 952 (CCPA 1979) (где описаны очищенные микроорганизмы), также см., Parke-Davis & Co. v. H.K. Mulford & Co., 189 F. 95 (S.D.N.Y. 1911) (Learned Hand, описывающий очищенный адреналин), частично подтверждено, частично рассмотрено, 196 F. 496 (2d Cir. 1912), каждый из которых включен в настоящий документ в качестве ссылки. Кроме того, в определенных аспектах, в описании предусмотрены определенные количественные меры для ограничений концентрации или чистоты, которые необходимо выявить в выделенной и биологически чистой культуре микроорганизмов. Наличие этих значений чистоты в определенных вариантах осуществления является дополнительным признаком, который отличает предоставляемые по настоящему описанию микроорганизмы от тех микроорганизмов, которые существуют в природном состоянии. См., например, Merck & Co. v. Olin Mathieson Chemical Corp., 253 F.2d 156 (4^th Cir. 1958) (где описаны ограничения чистоты для витамина B12, продуцируемого микроорганизмами), включенную в настоящий документ в качестве ссылки.

[0112] Как используют в настоящем документе, "отдельные изоляты" следует понимать, как означающие композицию или культуру, содержащую преобладающие количества одного рода, вида или штамма микроорганизма после отделения от одного или нескольких других микроорганизмов.

[0113] Микроорганизмы по настоящему изобретению могут включать споры и/или вегетативные клетки. В определенных вариантах осуществления микроорганизмы по настоящему изобретению включают микроорганизмы в жизнеспособном, но не культивируемом (VBNC) состоянии. Как используют в настоящем документе, "спора" или "споры" относятся к структурам, продуцируемым бактериями и грибами, которые адаптированы для выживания и рассеивания. Как правило, споры характеризуют как покоящиеся структуры; однако споры способны к дифференцировке в процессе прорастания. Прорастание представляет собой дифференцировку спор в вегетативные клетки, которые способны к метаболической активности, росу и репродукции. Прорастание одной споры приводит к образованию одной грибковой или бактериальной вегетативной клетки. Споры грибов представляют собой единицы бесполой репродукция и в определенных случаях представляют собой необходимые структуры в жизненных циклах грибов. Бактериальные споры представляют собой структуры для условий выживания, которые, как правило, могут не способствовать выживанию или росту вегетативных клеток.

[0114] Как используют в настоящем документе, "композиция микроорганизмов" относится к композиции, содержащий один или несколько микроорганизмы по настоящему изобретению. В определенных вариантах осуществления композицию микроорганизмов вводят в растения (включая различные части растения) и/или на сельскохозяйственные поля.

[0115] Как используют в настоящем документе, "носитель", "приемлемый носитель" или "приемлемый в сельском хозяйстве носитель" относится к разбавителю, адъюванту, эксципиенту или носителю с которым микроорганизм можно вводить, который не оказывает вредного воздействия намикроорганизм.

Регуляция фиксации азота

[0116] В определенных случаях путь фиксации азота может действовать в качестве мишени генетической инженерии и оптимизации. Одним из признаков, которые могут являться мишенью для регуляции способами, описываемыми в настоящем документе, является фиксация азота. Азотные удобрения являются наибольшими эксплуатационными расходами на фермах и основным движущим фактором более высоких урожаев пропашных культур, таких как кукуруза и пшеница. В настоящем документе описаны продукты жизнедеятельности микроорганизмов, которые могут доставлять возобновляемые формы азота в небобовые сельскохозяйственные культуры. Хотя у некоторых эндофитов присутствуют генетические факторы, необходимые для фиксации азота в чистой культуре, основной технической проблемой является то, что эндофиты злаков и трав дикого типа прекращают фиксацию азота на удобряемых полях. Применение химических удобрений и остаточные уровни азота в полевых почвах подают микроорганизму сигнал выключения биохимического пути фиксации азота.

[0117] Для разработки микроорганизма, способного к фиксации и переноса азота в кукурузу в присутствии удобрения выгодными могут являться изменения на транскрипционном и посттрансляционном уровнях компонентов регуляторной сети фиксации азота. С этой целью в настоящем документе описана технология эволюции хозяина-микроорганизма (HoME), позволяющая обеспечить направленную эволюцию регуляторных сетей и получать новые фенотипы. Также в настоящем документе описаны уникальные, проприетарные библиотеки азотфиксирующих эндофитов, выделенных из кукурузы, совместно с обширными "омиксными" данными о взаимодействии микроорганизмов и растения-хозяина в различных условиях окружающей среды, таких как недостаток и избыток азота. В определенных вариантах осуществления эта технология обеспечивает направленную эволюцию генетической регуляторной сети эндофитов в направлении получения микроорганизмов, которые активно фиксируют азот даже в присутствии удобрения в полевых условиях. Также в настоящем документе описана оценка промышленного потенциала получаемых микроорганизмов, которые колонизирует ткани корня кукурузы и продуцируют азот у удобряемых растений, и оценка совместимости эндофитов со стандартными технологиями составления и различными почвами для определения возможности интеграции микроорганизмов в современные стратегии контроля азота

[0118] Для использования элементарного азота (N) для химического синтеза живые формы комбинируют газообразный азот (N₂), доступный в атмосфере, с водородом в процессе, известном как фиксация азота. Вследствие энергоемкого характера биологической фиксации азота диазотрофы (бактерии и археи, которые фиксируют атмосферный газообразный азот) в процессе эволюции сформировали развитую и жесткую регуляцию кластера генов nif в ответ на кислород окружающей среды и доступный азот. Гены Nif кодируют ферменты, вовлеченные в фиксацию азота (такие как нитрогеназный комплекс), и белки, которые регулируют фиксацию азота. В Shamseldin (2013. Global J. Biotechnol. Biochem. 8(4):84-94) приведено подробное описание генов nif и их продуктов, и она включена в настоящий документ в качестве ссылки. В настоящем документе описаны способы получения растения с улучшенным признаком, включающие выделение бактерий из первого растения, внесение генетической вариации в ген выделенных бактерий для увеличения фиксации азота, воздействие вариантов бактерий на второе растение, выделение бактерий из второго растения с улучшенным признаком относительно первого растения и повторение этапов с бактериями, выделенными из второго растения.

[0119] У Proteobacteria регуляция фиксации азота сконцентрирована вокруг зависимого от фактора σ⁵⁴ связывающего энхансеры белка NifA, положительного регулятора транскрипции кластера nif. Внутриклеточные уровни активного NifA контролируют два ключевых фактора: транскрипция оперона nifLA и ингибирование активности NifA белок-белковым взаимодействием с NifL. Оба эти процесса реагируют на внутриклеточные уровни глутамина посредством сигнального каскада белков PII. Этот каскад опосредован GlnD, который непосредственно определяет уровень глутамина и катализирует уридилирование или деуридилирование двух регуляторных белков PII, GlnB и GlnK, в ответ на отсутствие или наличие связанного глутамина, соответственно. В условиях избытка азота немодифицированный GlnB передает сигнал к деактивации промотора nifLA. Однако в условиях ограничения азота происходит посттрансляционная модификация GlnB, что ингибирует его активность и приводит к транскрипции оперона nifLA. Таким образом, существует жесткий контроль транскрипции nifLA в ответ на азот окружающей среды посредством сигнального каскада белков PII. На посттрансляционном уровне регуляции NifA GlnK ингибирует взаимодействие NifL/NifA в зависимости от общего уровня свободного GlnK в клетке.

[0120] Транскрипция NifA происходит с оперона nifLA, промотор которого активирует фосфорилированный NtrC, другой зависимый от фактора σ⁵⁴ регулятор. Состояние фосфорилирования NtrC опосредовано гистидинкиназой NtrB, которая взаимодействует с деуридилированным GlnB, но не с уридилированным GlnB. В условиях избытка азота высокий внутриклеточный уровень глутамина приводит к деуридилированию GlnB, который затем взаимодействует с NtrB с деактивацией ее фосфорилазной активности и активацией ее фосфатазной активности, что приводит к дефосфорилированию NtrC и деактивации промотора nifLA. Однако в условиях ограничения азота низкий уровень внутриклеточного глутамина приводит к уридилированию GlnB, что ингибирует его взаимодействие с NtrB и обеспечивает фосфорилирование NtrC и транскрипцию оперона nifLA. Таким образом, существует жесткий контроль экспрессии nifLA в ответ на азот окружающей среды посредством сигнального каскада белков PII. Все из nifA, ntrB, ntrC и glnB представляют собой гены, которые можно подвергать мутированию в способах, описываемых в настоящем документе. Эти процессы также могут реагировать на внутриклеточные или внеклеточные уровни аммиака, мочевины или нитратов.

[0121] Также существует посттрансляционная регуляция активности NifA в ответ на азот окружающей среды, как правило, посредством опосредованного NifL ингибирования активности NifA. Как правило, взаимодействие на взаимодействие NifL и NifA влияет сигнальный каскад белков PII посредством GlnK, хотя характер взаимодействий между GlnK и NifL/NifA у диазотрофов значительно варьирует. У Klebsiella pneumoniae обе формы GlnK ингибируют взаимодействие NifL/NifA, и взаимодействие между GlnK и NifL/NifA определяют по общему уровню свободного GlnK в клетке. В условиях избытка азота деуридилированный GlnK взаимодействует с переносчиком аммиака AmtB, который служит для блокировки захвата аммиака посредством AmtB и изоляции GlnK на мембране, обеспечивая ингибирование NifA посредством NifL. С другой стороны, у Azotobacter vinelandii, для взаимодействия NifL/NifA и ингибирования NifA необходимо взаимодействие с деуридилированным GlnK, тогда как уридилирование GlnK ингибирует это взаимодействие с NifL. У диазотрофов с отсутствием гена nifL существуют данные о том, что ингибирование активности NifA происходит непосредственно при взаимодействии с деуридилированными формами GlnK и GlnB в условиях избытка азота. У некоторых бактерий кластер nif может находиться под регуляторным воздействием glnR, и дополнительно в определенных случаях это может включать отрицательную регуляцию. Независимо от механизма посттрансляционное ингибирование NifA является важным регулятором кластера nif у большинства известных диазотрофов. Дополнительно, гены, которые можно подвергать мутированию в способах, описываемых в настоящем документе, представляют собой nifL, amtB, glnK и glnR.

[0122] В дополнение к регуляции транскрипции кластера генов nif многие диазотрофы в процессе эволюции сформировали механизм прямой посттрансляционной модификации и ингибирования самого фермента нитрогеназы, известный как выключение нитрогеназы. Он опосредован АДФ-рибозилированием белка Fe (NifH) в условиях избытка азота, что нарушает его взаимодействие с белковым комплексом MoFe (NifDK) и устраняет нитрогеназную активность. DraT катализирует АДФ-рибозилирование белка Fe и выключение нитрогеназы, тогда как DraG катализирует удаление АДФ-рибозы и реактивацию нитрогеназы. Как и в случае транскрипции nifLA и ингибирования NifA, выключение нитрогеназы также регулирует сигнальный каскад белков PII. В условиях избытка азота деуридилированный GlnB взаимодействует с DraT и активирует его, тогда как деуридилированный GlnK взаимодействует с DraG и AmtB с формированием комплекса, изолируя DraG на мембране. В условиях ограничения азота уридилированные формы GlnB и GlnK не взаимодействуют с DraT и DraG, соответственно, что приводит к инактивации DraT и диффузии DraG к белку Fe, где он удаляет АДФ-рибозу и активирует нитрогеназу. В способах, описываемых в настоящем документе, также предусмотрено внесение генетических вариаций в гены nifH, nifD, nifK и draT.

[0123] Хотя некоторые эндофиты обладают способностью к фиксации азота in vitro, часто эти генетические факторы в полевых условиях подавлены высокими уровнями экзогенных химических удобрений. Для облегчения фиксации азота в полевых условиях можно разделить определение уровня экзогенного азота и экспрессию фермента нитрогеназы. Улучшение суммарной нитрогеназной активности по времени дополнительно способствует увеличению продукции азота для использования сельскохозяйственной культурой. Конкретные мишени генетической вариации для облегчения фиксации азота в полевых условиях способами, описываемыми в настоящем документе, включают один или несколько генов, выбранных из группы, состоящей из nifA, nifL, ntrB, ntrC, glnA, glnB, glnK, draT, amtB, glnD, glnE, nifJ, nifH, nifD, nifK, nifY, nifE, nifN, nifU, nifS, nifV, nifW, nifZ, nifM, nifF, nifB и nifQ.

[0124] Дополнительной мишенью генетической вариации для облегчения фиксации азота в полевых условиях способами, описываемыми в настоящем документе, является белок NifA. Как правило, белок NifA является активатором экспрессии генов фиксации азота. Увеличение продукции NifA (конститутивно или в условиях высокого содержания аммиака) преодолевает природный путь определения уровня аммиака. Кроме того, снижение продукции белков NifL, известного ингибитора NifA, также приводит к увеличению уровня свободного активного NifA. Кроме того, к повышению общего уровня белков NifA также приводит увеличение уровня транскрипции оперона nifAL (конститутивно или в условиях высокого содержания аммиака). Повышенного уровня экспрессии nifAL достигают, изменяя сам промотор или снижая экспрессию NtrB (часть сигнального каскада ntrB и ntrC, который исходно может приводить к выключению оперона nifAL в условиях высокого содержания азота). Высокий уровень NifA, достигаемый этими или любыми другими способами, описываемыми в настоящем документе, увеличивает активность фиксации азота эндофитами.

[0125] Другой мишенью генетической вариации для облегчения фиксации азота в полевых условиях способами, описываемыми в настоящем документе, является сигнальный каскад PII GlnD/GlnB/GlnK. Внутриклеточный уровень глутамина определяет сигнальный каскад PII GlnD/GlnB/GlnK. Мутации активного центра GlnD, устраняющие активность удаления уридилата GlnD, разрывают каскад определения уровня азота. Кроме того, уменьшение концентрации GlnB замыкает каскад определения уровня глутамина. Эти мутации "обманом" приводят клетки к определению условий ограничения азота, таким образом, увеличивая уровень активности фиксации азота. Эти процессы также могут реагировать на внутриклеточные или внеклеточные уровни аммиака, мочевины или нитратов.

[0126] Также мишенью генетической вариации для облегчения фиксации азота в полевых условиях способами, описываемыми в настоящем документе, является белок amtB. Захват аммиака из окружающей среды можно уменьшать, снижая уровень экспрессии белка amtB. Без внутриклеточного аммиака эндофит неспособен к определению высокого уровня аммиака, что предотвращает отрицательную регуляцию генов фиксации азота. Любой аммиак, попадающий во внутриклеточный компартмент, преобразуется в глутамин. Внутриклеточный уровень глутамина является основным средством определения уровня азота. Снижение внутриклеточного уровня глутамина предотвращает определение клетками высоких уровней аммиака в окружающей среде. Это можно осуществлять, увеличивая уровень экспрессии глутаминазы, фермента, который преобразует глутамин в глутаминат. Кроме того, уровень внутриклеточного глутамина также можно уменьшать, снижая уровень глутаминсинтетазы (фермента, преобразующего аммиак в глутамин). Диазотрофы быстро ассимилируют фиксированный аммиак в глутамин и глутаминат для использования в клеточных процессах. Нарушение ассимиляции аммиака может обеспечить выведение фиксированного азота на экспорт из клетки в виде аммиака. Фиксированный аммиак преимущественно ассимилируется в глутамин глутаминсинтетазой (GS), кодируемой glnA, а затем в глутаминат глутаминоксоглутаратаминотрансферазой (GOGAT). В определенных примерах, glnS кодирует глутаминсинтетазу. GS посттрансляционно регулирует аденилилтрансфераза GS (GlnE), бифункциональный фермент, кодируемый glnE, который катализирует аденилирование и деаденилирование GS вследствие активности его аденилилтрансферазного (AT) и аденилилудаляющего (AR) доменов, соответственно. В условиях ограничения азота экспрессирован glnA и AR домен GlnE деаденилирует GS, обеспечивая ее активность. В условиях избытка азота экспрессия glnA выключена и глутамин аллостерически активирует AT домен GlnE, что вызывает аденилирование и деактивацию GS.

[0127] Кроме того, мишенью генетической вариации для облегчения фиксации азота в полевых условиях способами, описываемыми в настоящем документе, также может являться ген draT. После продукции клеткой ферментов фиксации азота другим уровнем, на котором клетка отрицательно регулирует активность фиксации в условиях высокого содержания азота, является выключение нитрогеназы. Это выключение можно устранить снижая уровень экспрессии DraT.

[0128] Способы придания микроорганизмам новых фенотипов можно проводить на транскрипционном, трансляционном и посттрансляционном уровнях. Транскрипционный уровень включает изменения в промоторе (такие как изменение аффинности к фактору сигма или участков связывания факторов транскрипции, включая делецию всего или части промотора) или изменение терминаторов и аттенюаторов транскрипции. Трансляционный уровень включает изменение в участках связывания рибосом и изменение сигналов деградации иРНК. Посттрансляционный уровень включает мутации активных центров ферментов и изменения белок-белковых взаимодействий. Эти изменения можно осуществлять множеством способов. Снижение уровня экспрессии (или полное устранение) можно осуществлять посредством замены природного участка связывания рибосомы (RBS) или промотора другими с меньшей силой/эффективностью. Участки старта ATG можно заменять на старт-кодоны GTG, TTG или CTG, что приводит к снижению трансляционной активности кодирующей области. Полного устранения экспрессии можно добиваться посредством нокаута (делеции) кодирующей области гена. Сдвиг открытой рамки считывания (ORF) с большой вероятностью приводит к преждевременному стоп-кодону в ORF, таким образом, приводя к получению нефункционального укороченного продукта. Подобным образом, вставка в рамку стоп-кодонов также приводит к получению нефункционального укороченного продукта. Для снижения эффективной концентрации конкретного гена также можно проводить добавление метки разрушения на N- или C-конец.

[0129] И наоборот, определенного уровня экспрессии генов, описываемых в настоящем документе, можно достигать с использованием более сильных промоторов. Для обеспечения высокой активности промотора в условиях высокого уровня азота (или в любых других условиях) можно получать профиль транскрипции всего генома в условиях высокого уровня азота, и из этого массива данных можно выбирать активные промоторы с желаемым уровнем транскрипции для замены слабого промотора. Для улучшения эффективности инициации трансляции слабые старт-кодоны можно заменять старт-кодоном ATG. Также можно заменять слабые участки связывания рибосом (RBS) другими RBS с улучшенной эффективностью инициации трансляции. Кроме того, для изменения активности фермента также можно проводить сайт-специфический мутагенез.

[0130] Увеличение уровня фиксации азота, которое происходит в растении, может приводить к уменьшению количества необходимых химических удобрений для получения сельскохозяйственных культур и уменьшению эмиссии парниковых газов (например, оксида одновалентного азота).

Получение популяций бактерий

Выделение бактерий

[0131] Микроорганизмы, пригодные в способах и композициях, описываемых в настоящем документе, можно получать посредством выделения микроорганизмов с поверхностей или из тканей природных растений. Микроорганизмы можно получать посредством размалывания семян с выделением микроорганизмов. Микроорганизмы можно получать посредством посадки семян в различные образцы почв и выделения микроорганизмов из тканей. Кроме того, микроорганизмы можно получать посредством инокуляции растений экзогенными микроорганизмами и определения того, какие микроорганизмы остаются в тканях растений. Неограничивающие примеры тканей растений могут включать семена, всходы, листья, срезы, растение, луковицы или клубни.

[0132] Способ получения микроорганизмов может представлять собой способ выделения бактерий из почв. Бактерии можно собирать из почв различного типа. В определенном примере почву можно характеризовать такими свойствами, как высокая или низкая плодородность, уровни влажности, уровни минералов и различные практические способы выращивания растений. Например, почва может быть включена в ротацию сельскохозяйственных культур, когда в одну и ту же почву в последовательные сезоны посадки высаживают различные сельскохозяйственные культуры. Последовательное выращивание различных сельскохозяйственных культур на одной и той же почве может предотвратить непропорциональное истощение определенных минералов. Бактерии можно выделять из растений, растущих в выбранных почвах. Проростки растений можно собирать на 2-6 неделях роста. Например, на один цикл сбора можно собрать по меньшей мере 400 изолятов. Типы почв и растений выявляют фенотипы растений, а также условия, которые обеспечивают последующее обогащение определенных фенотипов.

[0133] Микроорганизмы можно выделять из тканей растений для оценки признаков микроорганизмов. Для выделения различных типов ассоциативных микроорганизмов, таких как ризосферные бактерии, эпифиты или эндофиты, параметры обработки образцов тканей можно варьировать. Для обогащения бактериями, осуществляющими фиксацию азота, изоляты можно культивировать в не содержащих азота средах. Альтернативно, микроорганизмы можно получать из всемирных банков штаммов.

[0134] для оценки признаков микроорганизмов анализы проводят в полевых условиях. В определенных вариантах осуществления ткань растения можно обрабатывать для скрининга посредством высокопроизводительной обработки ДНК и РНК. Кроме того, для оценки таких характеристик растений, как колонизация можно использовать неинвазивные измерения. Измерения на микроорганизмах дикого типа можно проводить поочередно от растения к растению. Измерения на микроорганизмах дикого типа также можно проводить в полевых условиях с использованием способов средней производительности. Измерения можно проводить последовательно в течение времени. Можно использовать модельную растительную систему, включая в качестве неограничивающих примеров Setaria.

[0135] Микроорганизмы в растительной системе можно скринировать посредством транскрипционного профилирования микроорганизма в растительной системе. Примерами скрининга посредством транскрипционного профилирования являются использование способов количественной полимеразной цепной реакции (кПЦР), молекулярных штрих-кодов для детекции транскрипов, секвенирования нового поколения и мечения микроорганизмов флуоресцентными метками. Для оценки колонизации в теплице можно измерять факторы воздействия, включая в качестве неограничивающих примеров микробиом, абиотические факторы, почвенные условия, кислород, влажность, температуру, условия инокуляции и локализацию корней. Фиксацию азота у бактерий можно оценивать, определяя газообразный ¹⁵N/¹⁵N в удобрении (разведение) с использованием IRMS или NanoSIMS, как описано в настоящем документе. NanoSIMS представляет собой масс-спектрометрию вторичных ионов с высоким разрешением. Способ NanoSIMS представляет собой путь для исследования химической активности биологических образцов. Катализ восстановления реакций окисления, которые управляют метаболизмом микроорганизмов, может быть исследован на клеточном, субклеточном, молекулярном и элементном уровнях. NanoSIMS может обеспечивать высокое пространственное разрешение более 0,1 мкм. Посредством NanoSIMS можно детектировать использование изотопных индикаторов, таких как ¹³C, ¹⁵N и ¹⁸O. Таким образом, NanoSIMS можно использовать для определения химической активности азот в клетке.

[0136] Для анализа растений можно использовать автоматизированные теплицы. Параметры растений в ответ на воздействие микроорганизмов в качестве неограничивающих примеров включают определение биомассы, анализ хлоропластов, CCD-камеру, измерения волюметрической томографии.

[0137] Одним из способов обогащения популяции микроорганизмов является соответствие генотипу. Например, анализ полимеразной цепной реакцией (ПЦР) с направленным праймером или специфическим праймером. Для идентификации диазотрофов можно использовать праймеры, сконструированные для гена nifH, так как диазотрофы в процессе фиксации азота экспрессируют ген nifH. Популяцию микроорганизмов также можно обогащать посредством одноклеточных независимых от культивирования подходов и подходов к выделению на основе хемотаксиса. Альтернативно, направленное выделение микроорганизмов можно проводить посредством культивирования микроорганизмов на селективных средах. Для заранее спланированных подходов к обогащению популяций микроорганизмов требуемыми признаками можно руководствоваться биоинформатическими данными, и они описаны в настоящем документе.

Обогащение микроорганизмами со способностями к фиксации азота с использованием биоинформатики

[0138] Для идентификации и выделения способствующих росту растений ризобактерий (PGPR), которые выбирают на основе их способности к осуществлению фиксации азота можно использовать биоинформатические способы. Микроорганизмы с высокой способностью к фиксации азота могут способствовать благоприятным признакам в растениях. Биоинформатические способы анализа для идентификации PGPR в качестве неограничивающих примеров включают геномику, метагеномику, направленное выделение, секвенирование генов, секвенирование транскриптома и моделирование.

[0139] Геномный анализ можно использовать для идентификации PGPR и подтверждения присутствия мутаций способами секвенирования нового поколения, как описано в настоящем документе, и контроля версий микроорганизмов.

[0140] Метагеномику можно использовать для идентификации и выделения PGPR с использованием алгоритма прогнозирования для колонизации. Метаданные также можно использовать для идентификации присутствия подвергнутого генетической инженерии штамма в образцах из окружающей среды и теплицы.

[0141] Секвенирование транскриптома можно использовать для прогнозирования генотипов, приводящих к фенотипам PGPR. Кроме того, транскриптомные данные используют для идентификации промоторов для изменения экспрессии генов. Транскриптомные данные можно анализировать в сочетании с полногеномной последовательностью (WGS) с получением моделей метаболизма и генных регуляторных сетей.

Окультуривание микроорганизмов

[0142] Микроорганизмы, выделенные в природе, можно подвергать процессу окультуривания, где микроорганизмы преобразуют в форму, которая является генетически отслеживаемой и идентифицируемой. Одним из способов окультуривания микроорганизма является конструирование в нем свойства устойчивости к антибиотикам. Процесс конструирования устойчивости к антибиотикам может начинаться с определения устойчивости штамма микроорганизмов дикого типа к антибиотикам. Если бактерии чувствительны к антибиотику, то антибиотик может являться хорошим кандидатом для конструирования устойчивости к антибиотикам. Затем в геном микроорганизма рекомбинантными способами можно вводить ген устойчивости к антибиотику или противоселективный суицидный вектор. Противоселективный суицидный вектор может состоять из делеции представляющего интерес ген, селективного маркера и противоселективного маркера sacB. Противоселекцию можно использовать для замены нативных последовательностей ДНК микроорганизмов генами устойчивости к антибиотикам. Для одновременной оценки нескольких микроорганизмов, позволяя параллельное окультуривание, можно использовать способ средней производительности. Альтернативные способы окультуривания включают использования направленных нуклеаз для предотвращения выпетливания последовательностей суицидного вектора или получения промежуточных последовательностей векторов.

[0143] ДНК-содержащие векторы можно вводить в бактерии различными способами, включая электропорацию и химическую трансформацию. Для трансформации можно использовать стандартную библиотеку векторов. Примером способа редактирования генов является CRISPR с предшествующим тестированием Cas9 для гарантии активности Cas9 в микроорганизмах.

Нетрансгенная инженерия микроорганизмов

[0144] Популяцию микроорганизмов с благоприятными свойствами можно получать посредством направленной эволюции. Направленная эволюция представляет собой подход, где имитируют процесс природного отбора для эволюции белков или нуклеиновых кислот в направлении определенной пользователем цели. Примером направленной эволюции является способ, когда в популяцию микроорганизмов вносят случайные мутации, выбирают микроорганизмы с наиболее благоприятными свойствами и продолжают выращивание отобранных микроорганизмов. Наиболее благоприятные свойства у способствующих росту ризобактерий (PGPRs) могут присутствовать в фиксации азота. Способ направленной эволюции может являться повторяющимся и адаптивным на основе процесса отбора после каждого повторения.

[0145] Можно получать способствующие росту растений ризобактерии (PGPR) с высокой способностью к фиксации азота. Эволюцию PGPR можно проводить посредством внесения генетической вариации. Генетическую вариацию можно вносить посредством мутагенеза с использованием полимеразной цепной реакции, сайт-специфического мутагенеза, насыщающего мутагенеза, мутагенеза с перестановкой фрагментов, гомологичной рекомбинации, систем CRISPR/Cas9, химического мутагенеза и их сочетаний. Посредством этих подходов можно вносить случайные мутации в популяцию микроорганизмов. Например, мутантов можно получать с использованием синтетической ДНК или РНК посредством сайт-специфического мутагенеза. Мутантов можно получать с использованием средств, содержащихся в плазмидах, которые позже исправляют. Представляющие интерес гены можно идентифицировать с использованием библиотек других видов с улучшенными свойствами, включая в качестве неограничивающих примеров улучшенные свойства PGPR, улучшенную колонизацию злаковых, увеличенную чувствительность к кислороду, увеличенную фиксацию азота и увеличенное выведение аммиака. Внутриродовые гены можно конструировать на основе этих библиотек с использованием программного обеспечения, такого как программное обеспечение Geneious или Platypus design. Мутации можно конструировать с помощью машинного обучения. Мутации можно конструировать с помощью модели метаболизма. Автоматизированное конструирование мутаций можно проводить с использованием средств, подобных Platypus, и они будут формировать РНК для Cas-направленного мутагенеза.

[0146] Внутриродовые гены можно переносить в микроорганизм-хозяин. Кроме того, в микроорганизм также можно переносить репортерные системы. Репортерные системы характеризуют промоторы, определяют успешность трансформации, обеспечивают скрининг мутантов и действуют в качестве средств отрицательного отбора.

[0147] Микроорганизмы, несущие мутацию, можно культивировать посредством серийных пересевов. Колония микроорганизмов содержит один вариант микроорганизма. Колонии микроорганизмов подвергают скринингу с помощью автоматизированного сборщик колоний и жидкостного манипулятора. Мутанты с дупликацией гена и увеличенным количеством копий экспрессируют более высокий генотип требуемого признака.

Отбор способствующих росту растений микроорганизмов на основе фиксации азота

[0148] Колонии микроорганизмов можно скринировать с использованием различных анализов оценки фиксация азота. Одним из способов определения фиксации азота является анализ с применением одного фермента, в котором определяют выведение азота. Альтернативный способ представляют собой анализ восстановления ацетилена (ARA) с непрерывным получением образцов в течение времени. ARA можно проводить в высокопроизводительных планшетах из массивов микропробирок. ARA можно проводить для живых растений и тканей растений. Составы сред и концентрацию кислорода в средах при анализах ARA можно варьировать. Другим способом скрининга вариантов микроорганизмов является использование биосенсоров. Для исследования активности микроорганизмов можно использовать NanoSIMS и микроспектроскопию Raman. В определенных случаях бактерии также можно культивировать и наращивать способами ферментации в биореакторах. Биореакторы конструируют для увеличения устойчивости роста бактерий и снижения чувствительности бактерий к кислороду. Для оценки чувствительности к кислороду, потребности в питательных веществах, фиксации азота и выведения азота используют среду для микроферментеров на основе высокопроизводительных планшетов. Бактерии также можно совместно культивировать с конкурирующими или благоприятными микроорганизмами для определения скрытых путей. Проточную цитометрию можно использовать для скрининга бактерий, которые продуцируют высокие уровни азота с использованием химических, колориметрических или флуоресцентных индикаторов. Бактерии можно культивировать в присутствии или отсутствии источника азота. Например, бактерии можно культивировать с глутамином, аммиаком, мочевиной или нитратами.

Выведение микроорганизмов

[0149] Выведение микроорганизмов представляет собой способ систематической идентификации и улучшения роли видов в микробиоме сельскохозяйственной культуры. Способ включает три этапа: 1) отбор видов-кандидатов посредством картирования взаимодействий растение-микроорганизм и прогноза регуляторной сети, сцепленной с конкретным фенотипом, 2) практическое и прогнозируемое улучшение фенотипов микроорганизмов посредством внутривидового скрещивания регуляторных сетей и кластеров генов и 3) скрининг и отбор новых генотипов микроорганизмов, которые обеспечивают требуемые фенотипы сельскохозяйственных культур. Для систематического анализа улучшения штаммов получена модель, в которой сцеплена динамика колонизации сообщества микроорганизмов с генетической активностью ключевых видов. Модель используют для прогноза выведения генетических мишеней и увеличения частоты отбора улучшений кодируемых микробиомом свойств агротехнического значения. Для графического представления варианта осуществления процесса см., фигуру 17A. Конкретно, на фигуре 17A приведена схема выведения микроорганизмов по вариантам осуществления. Как проиллюстрировано на фигуре 17A, рациональное улучшение микробиома сельскохозяйственной культуры можно использовать для увеличения биоразнообразия почв, настройки воздействия ключевых видов и/или изменения сроков и экспрессии важных метаболических путей. С этой целью авторы изобретения разработали конвейер выведения микроорганизмов для идентификации и улучшения роли штаммов в микробиоме сельскохозяйственной культуры. Способ включает три этапы: 1) отбор видов-кандидатов посредством картирования взаимодействий растение-микроорганизм и прогноза регуляторной сети, сцепленной с конкретным фенотипом, 2) практическое и прогнозируемое улучшение фенотипов микроорганизмов посредством внутривидового скрещивания регуляторных сетей и кластеров генов и 3) скрининг и отбор новых генотипов микроорганизмов, которые обеспечивают требуемые фенотипы сельскохозяйственных культур. Для систематического анализа улучшения штаммов авторы изобретения используют модель, в которой сцеплена динамика колонизации сообщества микроорганизмов с генетической активностью ключевых видов. Этот процесс представляет собой методологию для выведения и отбора улучшений кодируемых микробиомом свойств агротехнического значения.

[0150] Получения бактерий для улучшения признаков растений (например, фиксации азота) можно достигать посредством серийного пересева. Получение этих бактерий в дополнение к идентификации бактерий и/или композиций, способных к обеспечению одного или нескольких улучшенных признаков в одном или нескольких растениях, можно проводить посредством отбора растений с конкретным улучшенным признаком, на который влияет микробная флора. Один из способов получения бактерий для улучшения признака растения включает этапы: (a) выделения бактерий из ткани или почвы первого растения; (b) внесение генетической вариации в одну или несколько бактерий с получением одного или нескольких вариантов бактерий; (c) воздействие вариантами бактерий на множество растений; (d) выделение бактерий из ткани или почвы одного из множества растений, где растение, из которого выделяют бактерии, обладает улучшенным признаком относительно других растений в множестве растений; и (e) повторение этапов (b)-(d) с бактериями, выделяемыми из растения с улучшенным признаком (этап (d)). Этапы (b)-(d) можно повторять любое количество раз (например, однократно, дважды, три раза, четыре раза, пять раз, десять раз или более) до достижения улучшенным признаком растения желаемого уровня. Кроме того, множество растений может представлять собой более двух растений, например, от 10 до 20 растений или 20 или более, 50 или более, 100 или более, 300 или более, 500 или более или 1000 или более растений.

[0151] В дополнение к получению растения с улучшенным признаком, получают популяцию бактерий, содержащую бактерии, несущие одну или несколько генетических вариаций, вносимых в один или несколько генов (например, генов, регулирующих фиксацию азота). Повторяя описанные выше этапы, можно получать популяцию бактерий, которая содержит наиболее подходящих представителей популяции, которая коррелирует с представляющим интерес признаком растения. Бактерии в этой популяции можно идентифицировать и определить их благоприятные свойства, например, посредством генетического и/или фенотипического анализа. Генетический анализ можно проводить у выделенных на этапе (a) бактерий. Фенотипическую и/или генотипическую информацию можно получать с использованием способов, включающих: высокопроизводительный скрининг химических компонентов растительного происхождения, способы секвенирования, включающие высокопроизводительное секвенирование генетического материала, способы дифференциального дисплея (включая ДДОТ-ПЦР и ДД-ПЦР), способы с микропанелями нуклеиновых кислот, РНК-сек (секвенирование методом дробовика всего генома) и кПЦР-РВ (количественную ПЦР с детекцией в реальном времени). Полученную информацию можно использовать для получения профилирующей популяцию информации об идентификационных характеристиках и активности присутствующих бактерий, например, филогенетического анализа или основанного на микропанелях скрининга нуклеиновых кислот, кодирующих компоненты оперонов рРНК или других таксономически информативных локусов. Примеры таксономически информативных локусов включают ген 16S рРНК, ген 23S рРНК, ген 5S рРНК, ген 5.8S рРНК, ген 12S рРНК, ген 18S рРНК, ген 28S рРНК, ген gyrB, ген rpoB, ген fusA, ген recA, ген coxl, ген nifD. Примеры способов таксономического профилирования для определения таксонов, присутствующих в популяции описаны в US 20140155283. Идентификация бактерий может включать характеризующую активность одного или нескольких генов или оного или нескольких путей передачи сигнала, например, генов, ассоциированных с путем фиксации азота. также в бактериальных популяциях могут присутствовать синергические взаимодействия (когда два компонента при их комбинации увеличивают требуемое действие более чем аддитивно) между различными видами бактерий.

Генетическая вариация - локализация и источники альтераций генома

[0152] Генетическая вариация может представлять собой ген, выбранный из группы, состоящей из: nifA, nifL, ntrB, ntrC, glnA, glnB, glnK, draT, amtB, glnD, glnE, nifJ, nifH, nifD, nifK, nifY, nifE, nifN, nifU, nifS, nifV, nifW, nifZ, nifM, nifF, nifB и nifQ. Генетическая вариация может представлять собой вариацию в гене, кодирующем белок с функциональностью, выбранной из группы, состоящей из: глутаминсинтетазы, глутаминазы, аденилаттрансферазы глутаминсинтетазы, активатора транскрипции, антиактиватора транскрипции, пируват:флаводоксин-оксидоредуктазы, флаводоксина или АДФ-D-рибозилтрансферазы НАД⁺:динитрогеназоредуктазы. Генетическая вариация может представлять собой мутацию, которая приводит к одному или нескольким из: повышенной экспрессии или активности NifA или глутаминазы; сниженной экспрессии или активности NifL, NtrB, глутаминсинтетазы, GlnB, GlnK, DraT, AmtB; сниженной активности удаления аденилата GlnE или сниженной активности удаления уридилата GlnD. Внесение генетической вариации может включать вставку и/или делецию одного или нескольких нуклеотидов в намеченном участке, например, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 25, 50, 100, 250, 500 или более нуклеотидов. Генетическая вариация, вносимая в одну или несколько бактерий способами, описываемыми в настоящем документе, может представлять собой нокаут-мутацию (например, делецию промотора, вставку или делецию с получением преждевременного стоп-кодона, делецию всего гена), или она может представлять собой удаление или устранение активности белкового домена (например, точечную мутацию влияющую на активный центр, или делецию части гена, кодирующей значимую часть белкового продукта), или она может представлять собой изменение или удаление регуляторной последовательности гена-мишени. Также можно вставлять одну или несколько регуляторных последовательностей, включая гетерологичные регуляторные последовательности и регуляторные последовательности, выявленные в геноме вида или рода бактерий, соответствующих бактериям, у которых проводят генетическую вариацию. Кроме того, регуляторные последовательности можно выбирать на основе уровня экспрессии гена в культуре бактерий или в ткани растения. Генетическая вариация может представлять собой предопределенную генетическую вариацию, которую конкретно вводят в намеченный участок. Генетическая вариация может представлять собой случайную мутацию в намеченном участке. Генетическая вариация может представлять собой вставку или делецию одного или нескольких нуклеотидов. В некоторых случаях в одну или несколько выделенных бактерий перед воздействием бактерий на растения для оценки улучшения признака вносят множество различных генетических вариаций (например, 2, 3, 4, 5, 10 или более). Множество генетических вариаций может являться любым из описанных выше типов, одним и тем же или различными типами и любой их комбинацией. В некоторых случаях последовательно проводят множество различных генетических вариаций, проводя первую генетическую вариацию после первого этапа выделения, вторую генетическую вариацию после второго этапа выделения, и т.д. так, чтобы накопить множество генетических вариаций в бактериях постепенно обеспечивая улучшенные признаки у ассоциированных растений.

Генетическая вариация - способы внесения альтераций генома

[0153] В основном термин "генетическая вариация" относится к любому изменению, вносимому в полинуклеотидную последовательность относительно эталонного полинуклеотида, такого как эталонный геном или его часть, или эталонный ген или его часть. Генетическую вариацию можно обозначать как "мутацию", а последовательность или организм, содержащие генетическую вариацию можно обозначать как "генетический вариант" или "мутант". Генетические вариации могут обладать рядом эффектов, таким как повышение или снижение определенного вида биологической активности, включение экспрессии гена, метаболизма и клеточной сигнализации. Генетические вариации можно конкретно вносить в намеченный участок или вносить случайным образом. Для внесения генетических вариаций доступен ряд средств и способов молекулярной биологии. Например, генетическую вариацию можно вносить посредством мутагенеза при полимеразной цепной реакции, сайт-специфического мутагенеза, насыщающего мутагенеза, мутагенеза с перестановкой фрагментов, гомологичной рекомбинации, рекомбинационной инженерии, опосредованной лямбда красным рекомбинация, систем CRISPR/Cas9, химического мутагенеза и их сочетаний. Химические способы внесения генетических вариаций включают воздействие на ДНК химическим мутагеном, например, этилметансульфонатом (EMS), метилметансульфонатом (MMS), N-нитрозомочевиной (EN U), N-метил-N-нитро-N'-нитрозогуанидином, 4-нитрохинолин-N-оксидом, диэтилсульфатом, бензопиреном, циклофосфамидом, блеомицином, триэтилмеламином, мономерным акриламидом, азотистым ипритом, винкристином, диэпоксиалканами (например, диэпоксибутаном), ICR-170, формальдегидом, гидрохлоридом прокарбазина, этиленоксидом, диметилнитрозамином, 7,12 диметилбенз(a)антраценом, хлорамбуцилом, гексаметилфосфамидом, бисульфаном и т.п. Индуцирующие мутации посредством облучения средства включают ультрафиолетовое облучение, γ-облучение, рентгеновские лучи и бомбардировку быстрыми нейтронами. Также генетические вариации можно вносить в нуклеиновые кислоты, например, с использованием триметилпсоралена с ультрафиолетовым облучением. Другим подходящим способом получения генетической вариации является случайная или направленная вставка мобильного элемента ДНК, например, транспозона. Генетические вариации можно вносить в нуклеиновую кислоту при амплификации в бесклеточной системе in vitro, например, с использованием способа полимеразной цепной реакции (ПЦР), такого как ПЦР со сниженной точностью. Генетические вариации можно вносить в нуклеиновые кислоты in vitro с использованием способы перестановки ДНК (например, перестановки экзонов, обмены доменов и т.п.). Генетические вариации также можно вносить в нуклеиновые кислоты как результат недостаточности в клетке ферментов репарации ДНК, например, полагают, что присутствие в клетке мутантного гена, кодирующего мутантный фермент репарации ДНК, приведет к получению высокой частоты мутаций (т.е., приблизительно от 1 мутации/100 генов до 1 мутации/10000 генов) в геноме клетки. Примеры генов, кодирующих ферменты репарации ДНК в качестве неограничивающих примеров включают Mut H, Mut S, Mut L, и Mut U и их гомологи у других видов (например, от MSH1 до MSH6, от PMS1 до PMS2, MLH1, GTBP, ERCC-1 и т.п.). Примеры описаний различных способов внесения генетических вариации приведены, например, в Stemple (2004) Nature 5:1-7; Chiang et al. (1993) PCR Methods Appl 2(3): 210-217; Stemmer (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:10747-10751 и в патентах США №№ 6033861 и 6773900.

[0154] Генетические вариации, вносимые в микроорганизмы, можно классифицировать как трансгенные, цисгенные, внутригеномные, внутриродовые, межродовые, синтетические, эволюционировавшие, полученные посредством перестановки или SNP.

[0155] Для обеспечения улучшений описанных выше свойств генетическую вариацию можно вносить во множество метаболических путей в микроорганизмах. Характерные пути включают пути захвата серы, биосинтез гликогена, путь регуляции глутамина, путь захвата молибдена, путь фиксации азота, ассимиляцию аммиака, экскрецию или секрецию аммиака, захват азота, биосинтез глутамина, анаэробное окисление аммония, растворение фосфата, транспорт органических кислот, продукцию органических кислот, продукцию агглютитинов, гены захвата свободных реакционноспособных радикалов кислорода, биосинтез индолуксусной кислоты, биосинтез трегалозы, ферменты или пути разрушения клеточной стенки растений, гены крепления корней, секрецию экзополисахаридов, путь синтеза глутаминатсинтазы, пути захвата железа, пути сидерофора, хитиназный путь, ACC-дезаминазу, биосинтез глутатиона, гены передачи сигнала посредством фосфатов, путь гашения, пути цитохромов, путь гемоглобина, путь бактериального гемоглобин-подобного белка, малых-РНК rsmZ, биосинтез ризобиотоксина, белок адгезии lapA, путь чувства кворума AHL, биосинтез феназина, биосинтез циклического липопептида и продукцию антибиотиков.

[0156] Для внесения требуемых мутаций можно использовать системы CRISPR/Cas9 (короткие палиндромные повторы, регулярно расположенные группами)/ассоциированные с CRISPR (Cas). CRISPR/Cas9 обеспечивают бактериям и археям приобретенный иммунитет против вирусов и плазмид посредством использования CRISPR РНК (кпРНК), направляя сайленсинг внедряющихся нуклеиновых кислот. Белок Cas9 (или его функциональный эквивалент и/или вариант, т.е., подобный Cas9 белок) в природных условиях обладает ДНК-эндонуклеазной активностью, которая зависит от ассоциации белка с двумя природными или синтетическими молекулами РНК, называемыми кпРНК и транскпРНК (также называемыми направляющими РНК). В некоторых случаях, две молекулы ковалентно связаны с формированием одной молекулы (также называемой одиночной направляющей РНК ("онРНК"). Таким образом, белок Cas9 или подобный Cas9 белок ассоциируют с направленной к ДНК РНК (где этот термин включает конфигурацию с двумя направляющими молекулами РНК и конфигурацию с одиночной направляющей молекулой РНК), которая активирует Cas9 или подобный Cas9 белок и направляет белок к последовательности нуклеиновой кислоты-мишени. Если Cas9 или подобный Cas9 белок сохраняют свою ферментативную функцию, они расщепляют ДНК-мишень с образованием двухцепочечного разрыва, что может приводить к изменению генома (т.е., редактированию: делеции, вставке (когда присутствует полинуклеотид-донор), замене и т.д.), таким образом, изменяя экспрессию генов. Определенные варианты Cas9 (которые включены в термин подобные Cas9) изменяют так, чтобы они обладали сниженной активностью расщепления ДНК (в некоторых случаях они расщепляют одну цепь вместо обеих цепей ДНК-мишени, тогда как в других случаях их активность сильно снижают до отсутствия активности расщепления ДНК). Дополнительные иллюстративные описания систем CRISPR для внесения генетических вариаций можно найти, например, в US 8795965.

[0157] В качестве способа циклической амплификации в мутагенезе при полимеразной цепной реакции (ПЦР) для внесения желаемых мутаций используют мутагенные праймеры. ПЦР проводят в виде циклов денатурации, отжига и достройки. После амплификации посредством ПЦР отбор мутантной ДНК и удаление исходной плазмидной ДНК можно проводить посредством: 1) замены dCTP в течение ПЦР гидроксиметилированным dCTP, с последующим расщепление рестрикционными ферментами с удалением только негидроксиметилированной исходной ДНК; 2) одновременного мутагенеза гена устойчивости к антибиотикам и исследуемого гена, изменяя у плазмиды устойчивость к антибиотикам на устойчивость к другим антибиотикам, где устойчивость к новым антибиотикам затем облегчает отбор требуемой мутации; 3) расщепление исходной метилированной матричной ДНК после внесения требуемой мутации рестрикционным ферментом DpnI, который расщепляет только метилированную ДНК, посредством чего происходит выделение мутантных неметилированных цепей; или 4) получения кольцевых молекул мутантных продуктов ПЦР в дополнительной реакции лигирования с увеличением эффективности трансформации мутантной ДНК. Дополнительное описание иллюстративных способов можно найти, например, в US 7132265, US 6713285, US 6673610, US 6391548, US 5789166, US 5780270, US 5354670, US 5071743 и US 20100267147.

[0158] В олигонуклеотид-специфическом мутагенезе, также называемом сайт-специфическим мутагенезом, как правило, используют синтетический праймер ДНК. Этот синтетический праймер содержит требуемую мутацию и комплементарен матричной ДНК вокруг участка мутации так, что он может гибридизоваться с ДНК в представляющем интерес гене. Мутация может представлять собой однонуклеотидную замену (точечную мутацию), замену нескольких нуклеотидов, делецию или вставку или их комбинацию. Затем одноцепочечный праймер достраивают с использованием ДНК-полимеразы, которая копирует остальную часть гена. Копированный таким образом ген содержит мутантный участок, и его затем можно вносить в клетку-хозяина в виде вектора и клонировать. В заключение мутантов можно отбирать посредством секвенирования ДНК для проверки того, что они содержат требуемую мутацию.

[0159] Генетические вариации можно вносить с использованием ПЦР со сниженной точностью. В этом способе представляющий интерес ген амплифицируют с использованием ДНК-полимеразы в условиях недостаточности точности репликации последовательности. Результатом является то, что продукты амплификации содержат по меньшей мере одну ошибку в последовательности. Когда ген амплифицируют и полученный продукт(ы) реакции содержит одно или несколько изменений последовательности по сравнению с матричной молекулой, полученные продукты являются мутантными по сравнению с матрицей. Другим способом внесения случайных мутаций является воздействие на клетки химическим мутагеном, таким как нитрозогуанидин или этилметансульфонат (Nestmann, Mutat Res 1975 June; 28(3):323-30), а затем у хозяина выделяют вектор, содержащий ген.

[0160] Другим способом случайного мутагенеза является насыщающий мутагенез, в котором стараются получить все или почти все возможные мутации в конкретном участке или небольшой области гена. В широком смысле насыщающий мутагенез состоит из мутагенеза полного набора мутагенных кассет (где длина каждой кассеты составляет, например, 1-500 оснований) в определенной полинуклеотидной последовательности для мутагенеза (где длина последовательности для мутагенеза составляет, например, от 15 до 100000 оснований). Таким образом, в каждую подвергаемую мутагенезу кассету вносят группу мутаций (например, в диапазоне от 1 до 100 мутаций). Группа мутаций, вносимых в одну кассету, может отличаться от второй группы мутаций, вносимых во вторую кассету в течение одного раунда насыщающего мутагенеза, или являться такой же. Примерами таких групп являются делеции, добавления, группы конкретных кодонов и группы конкретных нуклеотидных кассет.

[0161] Мутагенез с перестановкой фрагментов, также называемый перестановкой ДНК, является способом быстрой репродукции благоприятных мутаций. В примере способ перестановки, используют ДНКазу для фрагментации набора исходных генов на части длиной, например, приблизительно 50-100 п.н. После этого проводят полимеразную цепную реакцию (ПЦР) без праймеры - фрагменты ДНК с достаточным перекрыванием гомологичных последовательностей отжигаются друг с другом и затем их достраивает ДНК-полимераза. После достижения некоторыми молекулами ДНК размера исходных генов, проводят несколько циклов этой достройки посредством ПЦР. Затем эти гены можно амплифицировать посредством другой ПЦР, в этот раз с добавлением праймеров, которые сконструированы так, чтобы они были комплементарны концам цепей. Праймеры могут содержать дополнительные последовательности, добавляемые на их 5'-концы, такие как последовательности участков распознавания рестрикционных ферментов, необходимые для лигирования в клонирующий вектор. Дополнительные примеры способов перестановок приведены в US 20050266541.

[0162] Мутагенез посредством гомологичной рекомбинации включает рекомбинацию экзогенного фрагмента ДНК и полинуклеотидной последовательности-мишени. После образования двухцепочечных разрывов происходит удаление участков ДНК на 5'-концах разрывов в процессе, называемом резекцией. На последующем этапе внедрения цепи выступающий 3'-конец разорванной молекулы ДНК затем "внедряется" в сходную или идентичную молекулу ДНК, которая не подвергалась разрыву. Способ можно использовать для удаления генов, удаления экзонов, добавления генов и внесения точечных мутаций. Мутагенез посредством гомологичной рекомбинации может являться постоянным или условным. Как правило, также предоставляют матрицу рекомбинации. Матрица рекомбинации может представлять собой компонент другого вектора, содержащийся в отдельном векторе, или ее предоставляют в виде отдельного полинуклеотида. В определенных вариантах осуществления матрицу рекомбинации конструируют так, чтобы она служила в качестве матрицы в гомологичной рекомбинации, например, в пределах или рядом с последовательностью-мишенью, разрезаемой или расщепляемой сайт-специфической нуклеазой. Длина матричного полинуклеотида может являться любой подходящей длиной, например, длина может составлять приблизительно или более чем приблизительно 10, 15, 20, 25, 50, 75, 100, 150, 200, 500, 1000 или более нуклеотидов. В определенных вариантах осуществления матричный полинуклеотид комплементарен части полинуклеотида, содержащего последовательность-мишень. При оптимальном выравнивании матричныый полинуклеотид может перекрываться с одним или несколькими нуклеотидами последовательности-мишени (например, приблизительно или более чем приблизительно с 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100 или более нуклеотидами). В определенных вариантах осуществления, когда матричная последовательность и полинуклеотид, содержащий последовательность-мишень, оптимально выровнены, ближайший нуклеотид матричного полинуклеотида находится в пределах приблизительно 1, 5, 10, 15, 20, 25, 50, 75, 100, 200, 300, 400, 500, 1000, 5000, 10000 или более нуклеотидов от последовательности-мишени. Неограничивающие примеры сайт-специфических нуклеаз, пригодных в способах гомологичной рекомбинации, включают нуклеазы с цинковыми пальцами, нуклеазы CRISPR, нуклеазы TALE и мегануклеазу. Для дополнительного описания использования таких нуклеаз, см. например, US 8795965 и US 20140301990.

[0163] Для получения генетических вариаций можно использовать мутагены, посредством которых преимущественно получают точечные мутации и короткие делеции, вставки, трансверсии и/или транзиции, включая химические мутагены или облучение. В качестве неограничивающих примеров мутагены включают этилметансульфонат, метилметансульфонат, N-этил-N-нитрозомочевину, триэтилмеламин, N-метил-N-нитрозомочевину, прокарбазин, хлорамбуцил, циклофосфамид, диэтилсульфат, мономерный акриламид, мелфалан, азотистый иприт, винкристин, диметилнитрозамин, N-метил-N'-нитронитрозогуанидин, нитрозогуанидин, 2-аминопурин, 7,12-диметилбенз(a)антрацен, этиленоксид, гексаметилфосфамид, бисульфан, диэпоксиалканы (диэпоксиоктан, диэпоксибутан и т.п.), дигидрохлорид 2-метокси-6-хлор-9[3-(этил-2-хлорэтил)аминопропиламино]акридина и формальдегид.

[0164] Внесение генетической вариации может представлять собой незавершенный процесс так, что определенные бактерии в обрабатываемой популяции бактерий несут требуемую мутацию, тогда как другие нет. В определенных случаях для обогащения бактериями, несущими требуемую генетическую вариацию необходимо применять селекционное давление. Как правило, отбор успешных генетических вариантов включает отбор по или против определенной функциональности, придаваемой или устраняемой генетической вариацией, так как в случае вставки гена устойчивости к антибиотикам или устранения метаболической активности, обеспечивающей возможность преобразования нелетального соединения в летальный метаболит. Также селекционное давление можно применять на основе самой полинуклеотидной последовательности так, что необходимо внести только требуемую генетическую вариацию (например, также без необходимости селективного маркера). В этом случае, селекционное давление может включать расщепление геномов без генетической вариации, вносимой в участок-мишень так, что отбор эффективно направлен против эталонной последовательности в которую необходимо внести генетическую вариацию. Как правило, расщепление происходит в пределах 100 нуклеотидов от участка-мишени (например, в пределах 75, 50, 25, 10 или менее нуклеотидов от участка-мишени, включая расщепление в участке-мишени или в его пределах). Расщепление может направлять сайт-специфическая нуклеаза, выбранная из группы, состоящей из нуклеазы с цинковыми пальцами, нуклеазы CRISPR, нуклеазы TALE (TALEN) или мегануклеазы. Такой процесс аналогичен процессам увеличения гомологичной рекомбинации в участке-мишени, за исключением того, что не предоставлена матрица для гомологичной рекомбинации. В результате в бактериях без требуемой генетической вариации с большей вероятностью проходит расщепление, которое в отсутствии восстановления приводит к гибели клеток. Затем бактерии, выжившие в отборе, можно выделять для применения в воздействии на растения для оценки придаваемого улучшенного признака.

[0165] Для направления расщепления в участке-мишени можно использовать нуклеазу CRISPR. Используя Cas9 для уничтожения немутантных клеток, можно обеспечивать улучшенный отбор мутантных микроорганизмов. Затем растениям инокулируют мутантные микроорганизмы для подтверждения симбиоза и обеспечения эволюционного давления с отбором эффективных симбионтов. Затем микроорганизмы можно повторно выделять из тканей растений. В системах с нуклеазами CRISPR, применяемых для отбора относительно отсутствия вариантов, можно использовать элементы, сходные с описанными выше в отношении внесения генетических вариаций элементами, за исключением того, что не предоставляют матрицу для гомологичной рекомбинации. Таким образом, расщепление, направленное на участок-мишень увеличивает гибель подвергшихся ему клеток.

[0166] Доступны другие варианты специфически индуцируемого расщепления в участке-мишени, такие как нуклеазы с цинковыми пальцами, системы нуклеазы TALE (TALEN) и мегануклеаза. Нуклеазы с цинковыми пальцами (ZFN) представляют собой искусственные эндонуклеазы ДНК, получаемые посредством слияния связывающего ДНК домена цинковых пальцев с доменом расщепления ДНК. ZFN можно конструировать для расщепления требуемых последовательностей ДНК и это позволяет нуклеазам с цинковыми пальцами расщеплять уникальные последовательности-мишени. При введении в клетку ZFN можно использовать для редактирования ДНК-мишени в клетке (например, генома клетки) посредством индукции двухцепочечных разрывов. Подобные активаторам транскрипции эффекторные нуклеазы (TALEN) представляют собой искусственные эндонуклеазы ДНК, получаемые посредством слияния эффекторного ДНК-связывающего домена TAL (подобного активаторам транскрипции) с доменом расщепления ДНК. TALEN можно быстро конструировать для связывания практически любой требуемой последовательности ДНК и при введении в клетку, TALEN можно использовать для редактирования ДНК-мишени в клетке (например, генома клетки) посредством внесения двухцепочечных разрывов. Мегануклеазы (хоминг-эндонуклеаза) представляют собой эндодезоксирибонуклеазы, характеризууемые большим участком распознавания (двухцепочечных последовательностей ДНК длиной от 12 до 40 пар оснований). Мегануклеазы можно использовать для замещения, удаления или модификации последовательностей узконаправленным способом. Модифицируя узнаваемые ими последовательности посредством белковой инженерии, можно изменять последовательность-мишень. Мегануклеазы можно использовать для модификации всех типов геномов, бактерий, растений или животных и, как правило, их группируют в четыре семейства: семейство LAGLIDADG (SEQ ID NO:1), семейство GIY-YIG, семейство His-Cyst box и семейство HNH. Иллюстративные хоминг-эндонуклеазы включают I-SceI, I-CeuI, PI-PspI, PI-Sce, I-SceIV, I-CsmI, I-PanI, I-SceII, I-PpoI, I-SceIII, I-CreI, I-TevI, I-TevII и I-TevIII.

Генетическая вариация - Способы идентификации

[0167] Микроорганизмы по настоящему изобретению можно идентифицировать по одной или нескольким генетическим модификациям или альтерациям, которые внесены в указанный микроорганизм. Одним из способов, которым можно идентифицировать указанные генетические модификацию или альтерацию, является сравнение с SEQ ID NO, которая содержит часть геномной последовательности микроорганизма, достаточную для идентификации генетической модификации или альтерации.

[0168] Кроме того, в случае микроорганизмов, которые не должны нести генетических модификаций или альтераций (например, дикого типа), вносимых в их геномы, по описанию можно использовать последовательности нуклеиновых кислот 16S для идентификации указанных микроорганизмов. Последовательность нуклеиновой кислоты 16S представляет собой пример "молекулярного маркера" или "генетического маркера", который обозначает индикатор, который используют в способах визуализации различий характеристик последовательностей нуклеиновых кислот. Примерами других таких индикаторов являются метки полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ), метки полиморфизма длин амплифицированных фрагментов (AFLP), однонуклеотидные полиморфизмы (SNP), мутации вставок, микросателлитные метки (SSR), характеризуемые последовательностями амплифицированные области (SCAR), метки рестрикционных полиморфизмов амплифицированных последовательностей (CAPS) или метки изоферментов или комбинации меток, описываемых в настоящем разделе, что определяет конкретное генетическое и хромосомное положение. Метки дополнительно включают полинуклеотидные последовательности, кодирующие 16S или 18S рРНК, и внутренние транскрибируемые спейсерные (ITS) последовательности, которые представляют собой последовательности, находящиеся между генами малой субъединицы и большой субъединицы рРНК, которые оказались особенно пригодными при определении сходства или различий при сравнении друг с другом. Кроме того, для идентификации микроорганизмов, описываемых в настоящем документе, по описанию использованы уникальные последовательности, выявленные в представляющих интерес генах (например, nif H,D,K,L,A, glnE, amtB и т.д.).

[0169] Первичная структура большой субъединицы рРНК 16S содержит конкретную комбинацию консервативных, вариабельных и гипервариабельных областей, которые эволюционируют с разными скоростями и позволяют различать как очень древние линии, такие как домены, так и более современные линии, такие как роды. Вторичная структура субъединицы 16S содержит приблизительно 50 спиралей, что приводит к спариванию оснований приблизительно 67% остатков. Эти высококонсервативные вторичные структурные признаки имеют большую функциональную важность, и их можно использовать для обеспечения позиционной гомологии при множественном выравнивании последовательностей и филогенетическом анализе. За последние несколько десятилетий ген 16S рРНК стал наиболее секвенированным таксономическим маркером, и он является краеугольным камнем современной систематической классификации бактерий и архей. (Yarza et al. 2014. Nature Rev. Micro. 12:635-45).

[0170] Таким образом, В определенных аспектах по описанию предусмотрена последовательность, которая по меньшей мере приблизительно на 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична по последовательности с любой последовательностью в таблицах E, F, G или H.

[0171] Таким образом, В определенных аспектах по описанию предусмотрен микроорганизм, который содержит последовательность, которая по меньшей мере приблизительно на 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична по последовательности с SEQ ID NO: 62-303. Эти последовательности и ассоциированные с ними описания можно найти в таблицах F, G и H.

[0172] В определенных аспектах по описанию предусмотрен микроорганизм, который содержит последовательность нуклеиновой кислоты 16S, которая по меньшей мере приблизительно на 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична по последовательности с SEQ ID NO: 85, 96, 111, 121, 122, 123, 124, 136, 149, 157, 167, 261, 262, 269, 277-283. Эти последовательности и ассоциированные с ними описания можно найти в таблицах G и H.

[0173] В определенных аспектах по описанию предусмотрен микроорганизм, который содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере приблизительно на 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична по последовательности с SEQ ID NO: 86-95, 97-110, 112-120, 125-135, 137-148, 150-156, 158-166, 168-176, 263-268, 270-274, 275, 276, 284-295. Эти последовательности и ассоциированные с ними описания можно найти в таблицах G и H.

[0174] В определенных аспектах по описанию предусмотрен микроорганизм, который содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере приблизительно на 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична по последовательности с SEQ ID NO: 177-260, 296-303. Эти последовательности и ассоциированные с ними описания можно найти в таблицах G и H.

[0175] В определенных аспектах по описанию предусмотрен микроорганизм, или праймер, или зонд, или последовательность с неприродным соединением, которые содержат, последовательность нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере приблизительно на 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична по последовательности с SEQ ID NO: 304-424. Эти последовательности и ассоциированные с ними описания можно найти в таблице E.

[0176] В определенных аспектах по описанию предусмотрен микроорганизм, который содержит последовательность с неприродным соединением, которая по меньшей мере приблизительно на 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична последовательности с SEQ ID NO: 372-405. Эти последовательности и ассоциированные с ними описания можно найти в таблице E.

[0177] В определенных аспектах по описанию предусмотрен микроорганизм, который содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере приблизительно на 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична по последовательности с SEQ ID NO: 77, 78, 81, 82 или 83. Эти последовательности и ассоциированные с ними описания можно найти в таблицах F и H.

Генетическая вариация - Способы детекции: праймеры, зонды и анализы

[0178] В настоящем описании указаны праймеры, зонды и анализы, которые пригодны для детекции микроорганизмов, исследуемых в настоящем документе. В определенных аспектах по описанию предусмотрены способы детекции родительских штаммов дикого типа. В других аспектах по описанию предусмотрены способы детекции не являющихся межродовыми подвергнутых генетической инженерии микроорганизмов, полученных из штаммов дикого типа. В определенных аспектах настоящее изобретение относится к способам идентификации не являющихся межродовыми генетических альтераций в микроорганизме.

[0179] В определенных аспектах геноинженерные способы по настоящему изобретению приводят к получению в не являющихся межродовыми микроорганизмах последовательностей с неприродным "соединением" нуклеотидов. Эти неприродные соединения нуклеотидов можно использовать в качестве разновидности диагностики, что является показателем присутствия в микроорганизме, исследуемом в настоящем документе, конкретной генетической альтерации.

[0180] Способами по настоящему изобретению можно детектировать эти неприродные соединения нуклеотидов посредством использования специализированных способов количественной ПЦР, включая уникальным образом сконструированные праймеры и зонды. В определенных аспектах зонды по изобретению связываются с последовательностями с неприродным соединением нуклеотидов. В определенных аспектах используют традиционную ПЦР. В других аспектах используют ПЦР с детекцией в реальном времени. В определенных аспектах используют количественную ПЦР (кПЦР).

[0181] Таким образом, описание может включать использование двух общих способов детекции продуктов ПЦР с детекцией в реальном времени: (1) неспецифические флуоресцентные красители, которые интеркалируют любую двухцепочечную ДНК, и (2) специфичные для последовательности зонды ДНК, состоящие из олигонуклеотидов, меченных флуоресцентным репортером, который обеспечивает детекцию только после гибридизации зонда с его комплементарной последовательностью. В определенных аспектах посредством указанных праймеров можно амплифицировать и, таким образом, можно детектировать посредством неспецифического красителя или посредством использования специфического зонда для гибридизации, только неприродное соединение нуклеотидов. В других аспектах праймеры по изобретению выбирают так, что праймеры фланкируют любую из сторон последовательности с соединением так, что если реакция амплификации происходит, то присутствует указанная последовательность с соединением.

[0182] Аспекты по изобретению включают сами молекулы с последовательностями с неприродным соединением нуклеотидов, вместе с другими нуклеотидными молекулами, которые способны к связыванию с указанными последовательностями с неприродным соединением нуклеотидов в условиях гибридизации от умеренных до строгих. В определенных аспектах молекулы нуклеотидов, которые способны к связыванию с указанными последовательностями с неприродным соединением нуклеотидов в условиях от умеренных до строгих, обозначают как "нуклеотидные зонды".

[0183] В определенных аспектах геномную ДНК можно выделять из образцов и использовать для количественного определения присутствия микроорганизмов по изобретению с использованием кПЦР. Праймеры, используемые в реакции кПЦР, могут представлять собой праймеры, сконструированные посредством Primer Blast (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/) для амплификации уникальных областей генома дикого типа или уникальных областей подвергнутых генетической инженерии не являющихся межродовыми мутантных штаммов. Реакцию кПЦР можно проводить с использованием набора SYBR GreenER qPCR SuperMix Universal (Thermo Fisher P/N 11762100) с использованием только прямого и обратного праймеров для амплификации; альтернативно, можно использовать Kapa Probe Force kit (Kapa Biosystems P/N KK4301) с праймерами для амплификации и зондом TaqMan, содержащим метку красителя FAM на 5'-конце, внутренний гаситель ZEN, и связывающим малую бороздку средством и флуоресцентным гасителем на 3'-конец (Integrated DNA Technologies).

[0184] Определенные последовательности праймеров, зондов и последовательности с неприродными соединениями приведены в таблице E. Эффективность реакции кПЦР можно определять с использованием стандартной кривой, получаемой на основе известного количества гДНК из генома-мишени. Данные можно нормализовать на количество копий генома на г сырой массы с использованием массы ткани и объема выделения.

[0185] Количественная полимеразная цепная реакция (кПЦР) представляет собой способ количественной, с детекцией в реальном времени, амплификации одной или нескольких последовательностей нуклеиновых кислот. Количественное определение в реальном времени в анализе ПЦР обеспечивает определение количества нуклеиновых кислот, получаемых на этапах амплификации ПЦР, сравнивая амплификацию представляющих интерес нуклеиновых кислот и соответствующей контрольной последовательности нуклеиновой кислоты, которая может действовать в качестве калибровочного стандарта.

[0186] Часто в анализах кПЦР используют зонды TaqMan, которые для количественного определения последовательностей-мишеней нуклеиновых кислот требуют увеличенной специфичности. Зонды TaqMan содержат олигонуклеотидный зонд с флуорофором, связанным с 5'-концом и гасителем связанным с 3'-концом зонда. Когда зонды TaqMan остаются как есть, с 5' и 3'-концами зонда в тесном контакте друг с другом, гаситель предотвращает передачу флуоресцентного сигнала с флуорофора. Зонды TaqMan сконструированы для отжига в области нуклеиновой кислоты, амплифицируемой посредством конкретного набора праймеров. Так как полимераза Taq продлевает праймер и синтезирует формируемую цепь, 5'-3' экзонуклеазная активность Taq полимеразы разрушает зонд, который отжегся с матрицей. Это разрушение зонда высвобождает флуорофор, таким образом, нарушая тесный контакт с гасителем и обеспечивая флуоресценцию флуорофора. Флуоресценция, детектируемая при анализе кПЦР, прямо пропорциональна высвобождаемому флуорофору и количеству матрицы ДНК присутствующей в реакции.

[0187] Свойства кПЦР позволяют практику исключать трудоемкий этап постамплификации препарата гель-электрофореза, который, как правило, необходим для наблюдения за амплифицированными продуктами традиционных анализов ПЦР. Преимущества кПЦР по сравнению с обычной ПЦР являются значительными и включают увеличенную скорость, простоту использования, воспроизводимость и количественные характеристики.

Улучшение свойств

[0188] Способы по настоящему изобретению можно использовать для придания или улучшения одного или нескольких из ряда требуемых признаков. Примеры признаков, которые можно придавать или улучшать, включают: биомассу корня, длину корня, рост, высоту побега, количество листьев, эффективность использования воды, общую биомассу, урожайность, размер плодов, размер семян, уровень фотосинтеза, засухостойкость, жароустойчивость, солеустойчивость, устойчивость к стрессу, вызванному нематодами, устойчивость к грибковому патогену, устойчивость к бактериальному патогену, устойчивость к вирусному патогену, уровень метаболита и экспрессия протеома. Требуемые признаки, включая рост, общую биомассу, биомассу корня и/или побега, пророст семян, жизнеспособность всходов, эффективность фотосинтеза, интенсивность транскрипции, количество или массу семян/плодов, урожай семян или плодов растения, содержание хлорофилла в листьях, скорость фотосинтеза, длина корня или любое их сочетание, можно использовать для определения роста и сравнения со скоростью роста эталонных сельскохозяйственных растений (например, растения без улучшенных признаков), выращиваемых в идентичных условиях.

[0189] Предпочтительный придаваемый или улучшаемый признак, как описано в настоящем документе, представляет собой фиксацию азота. В некоторых случаях, растения, получаемые способами, описываемыми в настоящем документе, демонстрируют отличия по признаку, которые представляют собой превышение по меньшей мере приблизительно на 5%, например, по меньшей мере приблизительно на 5%, по меньшей мере приблизительно на 8%, по меньшей мере приблизительно на 10%, по меньшей мере приблизительно на 15%, по меньшей мере приблизительно на 20%, по меньшей мере приблизительно на 25%, по меньшей мере приблизительно на 30%, по меньшей мере приблизительно на 40%, по меньшей мере приблизительно на 50%, по меньшей мере приблизительно на 60%, по меньшей мере приблизительно на 75%, по меньшей мере приблизительно на 80%, по меньшей мере приблизительно на 80%, по меньшей мере приблизительно на 90%, или по меньшей мере на 100%, по меньшей мере приблизительно на 200%, по меньшей мере приблизительно на 300%, по меньшей мере приблизительно на 400% или более по сравнению с эталонным сельскохозяйственным растением, выращиваемым в почве в тех же условиях. В дополнительных примерах растение, получаемое в способах, описываемых в настоящем документе, демонстрирует различия по признаку, которые по меньшей мере приблизительно на 5% больше, например, по меньшей мере приблизительно 5%, по меньшей мере приблизительно 8%, по меньшей мере приблизительно 10%, по меньшей мере приблизительно 15%, по меньшей мере приблизительно 20%, по меньшей мере приблизительно 25%, по меньшей мере приблизительно 30%, по меньшей мере приблизительно 40%, по меньшей мере приблизительно 50%, по меньшей мере приблизительно 60%, по меньшей мере приблизительно 75%, по меньшей мере приблизительно 80%, по меньшей мере приблизительно 80%, по меньшей мере приблизительно 90%, или по меньшей мере 100%, по меньшей мере приблизительно 200%, по меньшей мере приблизительно 300%, по меньшей мере приблизительно 400% или более чем у эталонного сельскохозяйственного растения, выращиваемого в сходных условиях в почве.

[0190] Улучшаемый признак можно оценивать в условиях, включающих воздействие одного или нескольких биотических или абиотических стрессовых факторов. Примеры стрессовых факторов включают абиотические стрессовые воздействия (такие как тепловой стресс, солевой стресс, вызываемый засухой стресс, холодовой стресс и стресс, вызванный недостаточностью питательных веществ) и биотические стрессовые воздействия (такие как стресс, вызываемый нематодами, стресс, вызываемый растительноядными насекомыми, стресс, вызываемый грибковыми патогенами, стресс, вызываемый бактериальными патогенами и стресс, вызываемый вирусными патогенами).

[0191] Признак, улучшаемый способами и композициями по настоящему изобретению, может представлять собой фиксацию азота, в том числе и в растении, ранее не способном к фиксации азота. В некоторых случаях бактерии, выделяемые способом, описываемым в настоящем документе, продуцируют 1% или более (например, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20% или более) азота растения, что может представлять собой увеличение способности к фиксации азота по меньшей мере в 2 раза (например, в 3 раза, в 4 раза, в 5 раз, в 6 раз, в 7 раз, в 8 раз, в 9 раз, в 10 раз, в 20 раз, в 50 раз, в 100 раз, в 1000 раз или более) по сравнению с бактериями, выделяемыми из первого растения до внесения какой-либо генетической вариации. В некоторых случаях бактерии продуцируют 5% или более азота растения. Желаемого уровня фиксации азота можно достигать после однократного или многократного повторения этапов внесения генетических вариаций, воздействия на множество растений и выделение бактерий из растений с улучшенным признаком (например, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 25 или более раз). В некоторых случаях, увеличенных уровней фиксации азота достигают в присутствии удобрения, дополненного глутамином, аммиаком или другим химическим источником азота. Известны способы оценки степени фиксации азота, примеры которых описаны в настоящем документе.

[0192] Выведение микроорганизмов представляет собой способ для систематической идентификации и улучшения роли видов в микробиоме сельскохозяйственной культуры. Способ включает три этапа: 1) отбор видов-кандидатов посредством картирования взаимодействий растение-микроорганизм и прогноза регуляторной сети, сцепленной с конкретным фенотипом, 2) практическое и прогнозируемое улучшение фенотипов микроорганизмов посредством внутривидового скрещивания регуляторных сетей и кластеров генов и 3) скрининг и отбор новых генотипов микроорганизмов, которые обеспечивают требуемые фенотипы сельскохозяйственных культур. Для систематического анализа улучшения штаммов получена модель, в которой сцеплена динамика колонизации сообщества микроорганизмов с генетической активностью ключевых видов. Модель используют для прогноза выведения генетических мишеней и увеличения частоты отбора улучшений кодируемых микробиомом свойств агротехнического значения.

Определение азота, доставляемого в значимых с сельскохозяйственной точки зрения полевых условиях

[0193] В полевых условиях доставляемое количество азота можно определять, как функцию колонизации умноженной на активность.

[0194] Приведенное выше уравнение требует (1) средней колонизации на единицу ткани растения и (2) активность в виде количества фиксированного азота или количества аммиака, экскретируемого каждой клеткой микроорганизма. Для преобразования в фунты азота на акр отслеживают физиологию роста кукурузы во времени, например, размер растения и ассоциированной корневой системы на всех стадиях созревания.

[0195] Фунты азота, доставляемые в сельскохозяйственную культуру на акр/сезон можно рассчитать по следующему уравнению:

[0196] Ткань растения(t) представляет собой сырую массу ткани растения кукурузы в течение времени роста (t). Значения для обоснованного проведения расчета подробно описаны в публикации под названием Roots, Growth and Nutrient Uptake (Mengel. Dept. of Agronomy Pub.# AGRY-95-08 (Rev. May-95. p. 1-8).

[0197] Колонизация (t) представляет собой количество представляющих интерес микроорганизмов, выявленное в ткани растения на грамм сырой массы ткани растения, в любое конкретное время, t, в течение сезона роста. В случае, когда доступна только одна временная точка, эту одну временную точку нормализуют как пиковый уровень колонизации за сезон, а уровень колонизации в оставшихся временных точках, таким образом, корректируют.

[0198] Активность(t) представляет собой скорость, с которой представляющие интерес микроорганизмы фиксируют N в единицу времени, в любое конкретное время, t, в течение сезона роста. В вариантах осуществления, описываемых в настоящем документе, этот уровень активности аппроксимируют посредством анализа восстановления ацетилена in vitro (ARA) в средах ARA в присутствии 5 мМ глутамина или анализа экскреции аммония в средах ARA media в присутствии 5 мМ ионов аммония.

[0199] Затем доставляемое количество азота рассчитывают посредством численного интегрирования указанной выше функции. В случаях, когда значения переменных, описанных выше, дискретно определяют в указанных временных точках, значения между этими временными точками аппроксимируют, проводя линейную интерполяцию.

Фиксация азота

[0200] В настоящем документе описаны способы увеличения фиксации азота в растении, включающие воздействие на растение бактериями, несущими одну или несколько генетических вариаций, вводимых в один или несколько генов, регулирующих фиксацию азота, где бактерии продуцируют в растении 1% или более азота (например, 2%, 5%, 10% или более), что может представлять собой по меньшей мере в 2 раза большую способность к фиксации азота по сравнению с растением в отсутствие бактерий. Бактерии могут продуцировать азот в присутствии удобрения, дополненного глутамином, мочевиной, нитратами или аммиаком. Генетические вариации могут представлять собой любые генетические вариации, описываемые в настоящем документе, включая примеры, приводимые выше, в любом количестве и в любой комбинации. Генетическую вариацию можно вносить в ген, выбранный из группы, состоящей из nifA, nifL, ntrB, ntrC, глутаминсинтетазы, glnA, glnB, glnK, draT, amtB, глутаминазу, glnD, glnE, nifJ, nifH, nifD, nifK, nifY, nifE, nifN, nifU, nifS, nifV, nifW, nifZ, nifM, nifF, nifB и nifQ. Генетическая вариация может представлять собой мутацию, которая приводит к одному или нескольким из: повышенной экспрессии или активности NifA или глутаминазы; сниженной экспрессии или активности NifL, NtrB, глутаминсинтетазы, GlnB, GlnK, DraT, AmtB; сниженной активности удаления аденилата GlnE или сниженной активности удаления уридилата GlnD. Генетическая вариация, вносимая в одну или несколько бактерий способами, описываемыми в настоящем документе, может представлять собой нокаут-мутацию, или она может удалять регуляторную последовательность гена-мишени, или она может включать вставку гетерологичной регуляторной последовательности, например, вставку регуляторной последовательности, выявленной в геноме бактерий того же вида или рода. Регуляторную последовательность можно выбирать на основе уровня экспрессии гена в культуре бактерий или в ткани растения. Генетическую вариацию можно получать посредством химического мутагенеза. Растения, выращиваемые на этапе (c), можно подвергать воздействию биотических или абиотических стрессовых факторов.

[0201] Количественно фиксацию азота, происходящую в растениях, описываемых в настоящем документе, можно измерять различными способами, например, посредством анализа восстановления ацетилена (AR). Анализ восстановления ацетилена можно проводить in vitro или in vivo. Доказательство того, что конкретная бактерия предоставляет растению фиксированный азот, может включать: 1) общий N растения после инокуляции значимо увеличивается, предпочтительно с сопутствующим возрастанием концентрации N в растении; 2) симптомы недостаточности азота в условиях ограничения в N после инокуляции ослабляются (что должно включать возрастание сухой массы); 3) документацию фиксации N₂ с использованием подхода с ¹⁵N (который может представлять собой эксперименты с разведением изотопа, анализы восстановления ¹⁵N₂ или анализы распространенности ¹⁵N в природе); 4) встраивание фиксированного N в растение белок или метаболит и 5) отсутствие всех этих эффектов у растений без проведенной инокуляции или у растений, инокулированных мутантом инокулируемого штамма.

[0202] Регуляторный каскад фиксации азота дикого типа можно представить как цифровую логическую схему, где входящие O₂ и NH₄⁺ проходят через логический вентиль ИЛИ-НЕ, выход которого в дополнение к АТФ поступает в логический вентиль И. В определенных вариантах осуществления способы, описываемые в настоящем документе, нарушают действие NH₄⁺ на эту схему в нескольких точках регуляторного каскада так, что микроорганизмы могут продуцировать азота даже на удобряемых полях. Однако способы, описываемые в настоящем документе, также предусматривают изменение влияния АТФ или O₂ на схему или изменение схемы с использованием других регуляторных каскадов в клетке или изменение генетических схем, отличных от фиксации азота. Можно перестраивать генные кластеры с получением функциональных продуктов под контролем гетерологичной системы регуляции. Удаляя природные регуляторные элементы вне и в кодирующих последовательностях кластеров генов и заменяя их альтернативными системами регуляции, функциональные продукты сложных генетических оперонов и других кластеров генов можно контролировать и/или помещать в гетерологичные клетки, включая клетки других видов, отличных от видов, из которых получены природные гены. После перестройки синтетические кластеры генов можно контролировать посредством генетических схем или других индуцибельных систем регуляции, таким образом, контролируя экспрессию продуктов необходимым образом. Экспрессирующие кассеты можно конструировать так, чтобы они действовали в качестве логических вентилей, генераторов импульсов, осцилляторов, переключателей или устройств памяти. Контролирующую экспрессирующую кассету можно лигировать с промотором так, чтобы экспрессирующая кассета функционировала в качестве датчика состояний окружающей среды, такого как датчик кислорода, температуры, прикосновения, осмотического стресса, поверхностного напряжения или окислительно-восстановительного потенциала.

[0203] В качестве примера из кластера генов nif можно удалять гены nifL, nifA, nifT и nifX. Синтетические гены можно конструировать посредством рандомизации кодонов ДНК, кодирующей каждую аминокислотную последовательность. Отбор кодонов проводят, устанавливая, чтобы частота использования кодонов как можно больше отличалась от частоты использования кодонов в природном гене. Предлагаемые последовательности сканируют на наличие любых нежелательных свойств, таких как участки распознавания рестрикционных ферментов, участки распознавания транспозонов, повторяющиеся последовательности, промоторы сигма 54 и сигма 70, скрытые участки связывания рибосом и ро-независимые терминаторы. Синтетические участки связывания рибосом выбирают так, чтобы они соответствовали силе каждого соответствующего природного участка связывания рибосомы, например, конструируя плазмиду с флуоресцентным репортером, в которой 150 п.н., окружающих старт-кодон гена (от -60 до +90) слиты с геном флуоресцентного маркера. Этот химерный ген можно экспрессировать под контролем промотора Ptac, а флуоресценцию измерять посредством проточной цитометрии. Для получения синтетических участков связывания рибосом получают библиотеку репортерных плазмид с использованием 150 п.н. (от -60 до +90) синтетической экспрессирующей кассеты. В кратком изложении синтетическая экспрессирующая кассета может состоять из случайного ДНК-спейсера, вырожденной последовательности, кодирующей библиотеку RBS и кодирующей последовательности каждого синтетического гена. Подвергают скринингу множество клонов для идентификации синтетического участка связывания рибосомы, который наилучшим образом соответствует природному участку связывания рибосомы. Таким образом, конструируют синтетические опероны, которые состоят из таких же генов, что природные опероны, и тестируют на функциональную комплементацию. Дополнительное иллюстративное описание синтетических оперонов приведено в US20140329326.

Виды бактерий

[0204] Микроорганизмы пригодные в способах и композициях, описываемых в настоящем документе, можно получать из любого источника. В определенных случаях микроорганизмы могут представлять собой бактерии, археи, простейшие или грибы. Микроорганизмы по настоящему описанию могут представлять собой фиксирующие азот микроорганизмы, например, фиксирующие азот бактерии, фиксирующие азот археи, фиксирующие азот грибы, фиксирующие азот дрожжи или фиксирующие азот простейшие. Микроорганизмы, пригодные в способах и композициях, описываемых в настоящем документе, могут представлять формирующие споры микроорганизмы, например, формирующие споры бактерии. В определенных случаях бактерии, пригодные в способах и композициях, описываемых в настоящем документе, могут являться грамположительными бактериями или грамотрицательными бактериями. В определенных случаях бактерии могут представлять собой формирующие эндоспору бактерии Firmicute phylum. В определенных случаях бактерии могут представлять собой диазатроф. В определенных случаях бактерии могут не являться диазатрофом.

[0205] Способы и композиции по настоящему описанию можно использовать с использованием архей, таких как, например, Methanothermobacter thermoautotrophicus.

[0206] В определенных случаях бактерии, которые могут являться пригодными, в качестве неограничивающих примеров включают Agrobacterium radiobacter, Bacillus acidocaldarius, Bacillus acidoterrestris, Bacillus agri, Bacillus aizawai, Bacillus albolactis, Bacillus alcalophilus, Bacillus alvei, Bacillus aminoglucosidicus, Bacillus aminovorans, Bacillus amylolyticus (также известную как Paenibacillus amylolyticus) Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus aneurinolyticus, Bacillus atrophaeus, Bacillus azotoformans, Bacillus badius, Bacillus cereus (synonyms: Bacillus endorhythmos, Bacillus medusa), Bacillus chitinosporus, Bacillus circulans, Bacillus coagulans, Bacillus endoparasiticus Bacillus fastidiosus, Bacillus firmus, Bacillus kurstaki, Bacillus lacticola, Bacillus lactimorbus, Bacillus lactis, Bacillus laterosporus (также известную как Brevibacillus laterosporus), Bacillus lautus, Bacillus lentimorbus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus maroccanus, Bacillus megaterium, Bacillus metiens, Bacillus mycoides, Bacillus natto, Bacillus nematocida, Bacillus nigrificans, Bacillus nigrum, Bacillus pantothenticus, Bacillus popillae, Bacillus psychrosaccharolyticus, Bacillus pumilus, Bacillus siamensis, Bacillus smithii, Bacillus sphaericus, Bacillus subtilis, Bacillus thuringiensis, Bacillus uniflagellatus, Bradyrhizobium japonicum, Brevibacillus brevis Brevibacillus laterosporus (ранее Bacillus laterosporus), Chromobacterium subtsugae, Delftia acidovorans, Lactobacillus acidophilus, Lysobacter antibioticus, Lysobacter enzymogenes, Paenibacillus alvei, Paenibacillus polymyxa, Paenibacillus popilliae (ранее Bacillus popilliae), Pantoea agglomerans, Pasteuria penetrans (ранее Bacillus penetrans), Pasteuria usgae, Pectobacterium carotovorum (ранее Erwinia carotovora), Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas aureofaciens, Pseudomonas cepacia (ранее known as Burkholderia cepacia), Pseudomonas chlororaphis, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas proradix, Pseudomonas putida, Pseudomonas syringae, Serratia entomophila, Serratia marcescens, Streptomyces colombiensis, Streptomyces galbus, Streptomyces goshikiensis, Streptomyces griseoviridis, Streptomyces lavendulae, Streptomyces prasinus, Streptomyces saraceticus, Streptomyces venezuelae, Xanthomonas campestris, Xenorhabdus luminescens, Xenorhabdus nematophila, Rhodococcus globerulus AQ719 (№ доступа NRRL B-21663), вид Bacillus AQ175 (№ доступа ATCC 55608), вид Bacillus AQ 177 (№ доступа ATCC 55609), вид Bacillus (№ доступа ATCC 53522) и штамм вида Streptomyces № доступа NRRL B-30145. В определенных случаях бактерия также может представлять собой Azotobacter chroococcum, Methanosarcina barkeri, Klesiella pneumoniae, Azotobacter vinelandii, Rhodobacter spharoides, Rhodobacter capsulatus, Rhodobcter palustris, Rhodosporillum rubrum, Rhizobium leguminosarum или Rhizobium etli.

[0207] В определенных случаях бактерия может представлять собой бактерию вида Clostridium, например, Clostridium pasteurianum, Clostridium beijerinckii, Clostridium perfringens, Clostridium tetani, Clostridium acetobutylicum.

[0208] В определенных случаях бактерии, используемые в способах и композициях по настоящему изобретению, могут представлять собой цианобактерии. Примеры родов цианобактерий включают Anabaena (например, вид Anagaena PCC7120), Nostoc (например, Nostoc punctiforme) или Synechocystis (например, вид Synechocystis PCC6803).

[0209] В определенных случаях бактерии, используемые в способах и композициях по настоящему изобретению, могут принадлежать к таксономической группе Chlorobi, например, Chlorobium tepidum.

[0210] В определенных случаях микроорганизмы, используемые в способах и композициях по настоящему изобретению, могут содержать ген, гомологичный известному гену NifH. Последовательности известных генов NifH можно найти, например, в базе данных лаборатории Дж. Зера NifH, (https://wwwzehr.pmc.ucsc.edu/nifH_Database_Public/, 4 апреля 2014 года), или базе данных лаборатории Д. Бакли NifH (http://www.css.cornell.edu/faculty/buckley/nifh.htm, и Gaby, John Christian, и Daniel H. Buckley. "A comprehensive aligned nifH gene database: a multipurpose tool for studies of nitrogen-fixing bacteria". Database 2014 (2014): bau001.). В определенных случаях микроорганизмы, используемые в способах и композициях по настоящему изобретению, могут содержать последовательность, которая кодирует полипептид по меньшей мере на 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 96%, 98%, 99% или более 99% идентичный по последовательности с последовательностью из базы данных NifH лаборатории Дж. Зера, (https://wwwzehr.pmc.ucsc.edu/nifH_Database_Public/, 4 апреля 2014 года). В определенных случаях микроорганизмы, используемые в способах и композициях по настоящему изобретению, могут содержать последовательность, которая кодирует полипептид по меньшей мере на 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 96%, 98%, 99% или более 99% идентичный по последовательности с последовательностью из базы данных NifH лаборатории Д. Бакли, (Gaby, John Christian, и Daniel H. Buckley. "A comprehensive aligned nifH gene database: a multipurpose tool for studies of nitrogen-fixing bacteria". Database 2014 (2014): bau001.).

[0211] Микроорганизмы, пригодные в способах и композициях, описываемых в настоящем документе, можно получать посредством выделения микроорганизмов с поверхностей или из тканей природных растений; измельчения семян с выделением микроорганизмов; высаживания семян в различные образцы почв и выделения микроорганизмов из тканей; или инокуляции растений экзогенными микроорганизмами и определения того, какие микроорганизмы обнаруживаются в тканях растений. Неограничивающие примеры тканей растений включают семена, всходы, листья, срезы, растения, луковицы или клубни. В некоторых случаях бактерии выделяют из семян. Параметры обработки образцов могут варьировать для выделения различных типов ассоциированных микроорганизмов, таких как ризосферные микроорганизмы, эпифиты или эндофиты. Вместо начального выделения из первого растения бактерии также можно получать из хранилищ, таких как коллекции природных штаммов. Микроорганизмы можно генотипировать и фенотипировать посредством секвенирование геномов выделенных микроорганизмов; профилирования составов сообществ in planta; характеристики функциональности транскриптомов сообществ или выделенных микроорганизмов; или скрининга свойств микроорганизмов с использованием селективных или фенотипических сред (например, фенотипы с фиксацией азота или растворением фосфатов). Выбранные штаммы или популяции кандидатов можно получать из данных секвенирования; данных фенотипирования; данных о растении (например, данных о геноме, фенотипе и/или урожае); данных о почве (например, pH, содержание N/P/K и/или биотическое сообщество основной почвы) или любой комбинации из них.

[0212] Бактерии и способы получения бактерий, описываемые в настоящем документе, можно применять для бактерий, способных к эффективному самостоятельному размножению на поверхностях листьев, поверхностях корней или внутри тканей растений, не вызывая разрушительной защитной реакции растений, или для бактерий, которые устойчивы к защитным реакциям растений. Бактерии, описываемые в настоящем документе, можно выделять посредством культивирования экстракта ткани растения или смыва поверхности листа в среде без добавления азота. Однако бактерии могут являться некультивируемыми, т.е. об их культивируемости может быть неизвестно, или их может быть трудно культивировать известными в данной области стандартными способами. Бактерии, описываемые в настоящем документе, могут являться эндофитными или эпифитными или бактериями, обитающими в ризосфере растения (ризосферные бактерии). Бактерии, получаемые после однократного или многократного повторения этапов внесения генетической вариации, воздействия на множество растений и выделения бактерий из растений с улучшенным признаком (например, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 25 или более раз) могут являться эндофитными, эпифитными или ризосферными. Эндофиты представляют собой организмы, которые проникают внутрь растений, не вызывая симптомов заболеваний или не вызывая формирования симбиотических структур, и представляют собой агротехнический интерес, так как они могут усиливать рост растений и улучшать питание растений (например, посредством фиксации азота). Бактерии могут представлять собой передающиеся с семенами эндофиты. Передающиеся с семенами эндофиты включают бактерии, ассоциированные с семенами трав или других растений или получаемые из них, такие как передающиеся с семенами бактериальные эндофиты, выявляемые в созревших, сухих, неповрежденных (например, без трещин, без видимой грибковой инфекции или без преждевременного пророста) семян. Передающиеся с семенами бактериальные эндофиты могут быть ассоциированы или их можно получать с поверхности семян; альтернативно или кроме того, они могут быть ассоциированы или их можно получать из внутреннего компартмента семян (например, семян со стерилизованной поверхностью). В определенных случаях передающиеся с семенами бактериальные эндофиты способны к репликации в тканях растений, например, внутри семян. В определенных случаях передающиеся с семенами бактериальные эндофиты также способны переживать обезвоживание.

[0213] Бактерии, выделяемые способами по изобретению или используемые в способах или композициях по изобретению, могут включать множество бактерий различных таксонов в комбинации. В качестве примера бактерии могут включать Proteobacteria (такие как Pseudomonas, Enterobacter, Stenotrophomonas, Burkholderia, Rhizobium, Herbaspirillum, Pantoea, Serratia, Rahnella, Azospirillum, Azorhizobium, Azotobacter, Duganella, Delftia, Bradyrhizobiun, Sinorhizobium и Halomonas), Firmicutes (такие как Bacillus, Paenibacillus, Lactobacillus, Mycoplasma и Acetabacterium) и Actinobacteria (такие как Streptomyces, Rhodacoccus, Microbacterium и Curtobacterium). Бактерии, используемые в способах и композиции по настоящему описанию, могут включать фиксирующие азот бактериальные консорциумы из двух или более видов. В определенных случаях один или несколько видов бактерий бактериальных консорциумов могут быть способными к фиксации азота. В определенных случаях один или несколько видов бактериальных консорциумов могут облегчать или увеличивать способность других бактерии фиксировать азот. Бактерии, которые фиксируют азот, и бактерии, которые увеличивают способность других бактерий фиксировать азот, могут являться одними и теми же или различными. В определенных примерах штамм бактерий может быть способным фиксировать азот при нахождении в комбинации с другим штаммом бактерий или в определенных бактериальных консорциумах, но могут являться неспособными к фиксации азота в монокультуре. Примеры родов бактерий, которые можно найти в фиксирующих азот бактериальных консорциумам в качестве неограничивающих примеров включают Herbaspirillum, Azospirillum, Enterobacter и Bacillus.

[0214] Бактерии, которые можно получать способами, описываемыми в настоящем документе, включают вид Azotobacter, вид Bradyrhizobium, вид Klebsiella и вид Sinorhizobium. В определенных случаях бактерии можно выбирать из группы, состоящей из: Azotobacter vinelandii, Bradyrhizobium japonicum, Klebsiella pneumoniae и Sinorhizobium meliloti. В определенных случаях бактерии могут представлять собой бактерии рода Enterobacter или Rahnella. В определенных случаях бактерии могут представлять собой бактерии рода Frankia или Clostridium. Примеры бактерий рода Clostridium в качестве неограничивающих примеров включают Clostridium acetobutilicum, Clostridium pasteurianum, Clostridium beijerinckii, Clostridium perfringens и Clostridium tetani. В определенных случаях бактерии могут представлять собой бактерии рода Paenibacillus, например, Paenibacillus azotofixans, Paenibacillus borealis, Paenibacillus durus, Paenibacillus macerans, Paenibacillus polymyxa, Paenibacillus alvei, Paenibacillus amylolyticus, Paenibacillus campinasensis, Paenibacillus chibensis, Paenibacillus glucanolyticus, Paenibacillus illinoisensis, Paenibacillus larvae subsp. Larvae, Paenibacillus larvae subsp. Pulvifaciens, Paenibacillus lautus, Paenibacillus macerans, Paenibacillus macquariensis, Paenibacillus macquariensis, Paenibacillus pabuli, Paenibacillus peoriae или Paenibacillus polymyxa.

[0215] В определенных примерах бактерии, выделенные способами по изобретению, могут являться представителями одного или нескольких из следующих таксонов: Achromobacter, Acidithiobacillus, Acidovorax, Acidovoraz, Acinetobacter, Actinoplanes, Adlercreutzia, Aerococcus, Aeromonas, Afipia, Agromyces, Ancylobacter, Arthrobacter, Atopostipes, Azospirillum, Bacillus, Bdellovibrio, Beijerinckia, Bosea, Bradyrhizobium, Brevibacillus, Brevundimonas, Burkholderia, Candidatus Haloredivivus, Caulobacter, Cellulomonas, Cellvibrio, Chryseobacterium, Citrobacter, Clostridium, Coraliomargarita, Corynebacterium, Cupriavidus, Curtobacterium, Curvibacter, Deinococcus, Delftia, Desemzia, Devosia, Dokdonella, Dyella, Enhydrobacter, Enterobacter, Enterococcus, Erwinia, Escherichia, Escherichia/Shigella, Exiguobacterium, Ferroglobus, Filimonas, Finegoldia, Flavisolibacter, Flavobacterium, Frigoribacterium, Gluconacetobacter, Hafnia, Halobaculum, Halomonas, Halosimplex, Herbaspirillum, Hymenobacter, Klebsiella, Kocuria, Kosakonia, Lactobacillus, Leclercia, Lentzea, Luteibacter, Luteimonas, Massilia, Mesorhizobium, Methylobacterium, Microbacterium, Micrococcus, Microvirga, Mycobacterium, Neisseria, Nocardia, Oceanibaculum, Ochrobactrum, Okibacterium, Oligotropha, Oryzihumus, Oxalophagus, Paenibacillus, Panteoa, Pantoea, Pelomonas, Perlucidibaca, Plantibacter, Polynucleobacter, Propionibacterium, Propioniciclava, Pseudoclavibacter, Pseudomonas, Pseudonocardia, Pseudoxanthomonas, Psychrobacter, Rahnella, Ralstonia, Rheinheimera, Rhizobium, Rhodococcus, Rhodopseudomonas, Roseateles, Ruminococcus, Sebaldella, Sediminibacillus, Sediminibacterium, Serratia, Shigella, Shinella, Sinorhizobium, Sinosporangium, Sphingobacterium, Sphingomonas, Sphingopyxis, Sphingosinicella, Staphylococcus, 25 Stenotrophomonas, Strenotrophomonas, Streptococcus, Streptomyces, Stygiolobus, Sulfurisphaera, Tatumella, Tepidimonas, Thermomonas, Thiobacillus, Variovorax, родов WPS-2 неопределенного положения, Xanthomonas и Zimmermannella.

[0216] В определенных случаях используют виды бактерий, выбранные по меньшей мере из одного из следующих родов: Enterobacter, Klebsiella, Kosakonia и Rahnella. В определенных случаях используют комбинацию видов бактерий следующих родов: Enterobacter, Klebsiella, Kosakonia и Rahnella. В определенных случаях используемые виды могут представлять собой один или несколько из: Enterobacter sacchari, Klebsiella variicola, Kosakonia sacchari и Rahnella aquatilis.

[0217] В определенных случаях грамположительный микроорганизм может содержать нитрогеназную систему с молибденом-железом, содержащую: nifH, nifD, nifK, nifB, nifE, nifN, nifX, hesA, nifV, nifW, nifU, nifS, nifI1 и nifI₂. В определенных случаях грамположительный микроорганизм может содержать нитрогеназную систему с ванадием, содержащую: vnfDG, vnfK, vnfE, vnfN, vupC, vupB, vupA, vnfV, vnfR1, vnfH, vnfR2, vnfA (регулятор транскрипции). В определенных случаях грамположительный микроорганизм may have an iron-only нитрогеназа система comprising: anfK, anfG, anfD, anfH, anfA (регулятор транскрипции). В определенных случаях грамположительный микроорганизм может содержать нитрогеназную систему, содержащую glnB и glnK (белки, передающие сигнал от азота). Определенные примеры ферментов, вовлеченных в метаболизм азота в грамположительных микроорганизмах включают glnA (глутаминсинтетазу), gdh (глутаминатдегидрогеназу), bdh (3-гидроксибутиратдегидрогеназу), глутаминазу, gltAB/gltB/gltS (глутаминатсинтазу), asnA/asnB (аспартатаммиаклигазу/аспарагинсинтетазу) и ansA/ansZ (аспарагиназу). Определенные примеры белков, вовлеченных в транспорт азота у грамположительных микроорганизмов, включают amtB (транспортер аммония), glnK (регулятор транспорта аммония), glnPHQ/glnQHMP (АТФ-зависимые транспортеры глутамина/глутамината), glnT/alsT/yrbD/yflA (глутаминоподобные протонные совместные переносчики) и gltP/gltT/yhcl/nqt (глутаминоподобные протонные совместные переносчики).

[0218] Примеры грамположительных микроорганизмов, которые могут представлять особый интерес, включают Paenibacillus polymixa, Paenibacillus riograndensis, вид Paenibacillus, вид Frankia, вид Heliobacterium, Heliobacterium chlorum, вид Heliobacillus, вид Heliophilum, вид Heliorestis, Clostridium acetobutylicum, вид Clostridium, Mycobacterium flaum, вид Mycobacterium, вид Arthrobacter, вид Agromyces, Corynebacterium autitrophicum, вид Corynebacterium, вид Micromonspora, вид Propionibacteria, вид Streptomyces и вид Microbacterium.

[0219] Определенные примеры генетических альтераций, которые можно проводить в грамположительных микроорганизмах, включают: делецию glnR с удалением отрицательной регуляции BNF в присутствии азота окружающей среды, вставку различных промоторов непосредственно выше кластера nif с устранением регуляции посредством GlnR в ответ на азот окружающей среды, мутацию glnA со снижением уровня ассимиляции аммония по пути GS-GOGAT, делецию amtB с уменьшением потребления аммоний из среды, мутацию glnA так, что он конститутивно находится в состоянии ингибирования по типу обратной связи (FBI-GS), с уменьшением ассимиляции аммония по пути GS-GOGAT.

[0220] В определенных случаях основным регулятором метаболизма и фиксации N в видах Paenibacillus является glnR. В определенных случаях геном видов Paenibacillus может не содержать ген для продукции glnR. В определенных случаях геном вида Paenibacillus может не содержать ген для продукции glnE или glnD. В определенных случаях геном видов Paenibacillus может содержать ген для продукции glnB или glnK. Например, вид Paenibacillus WLY78 не содержит гена для glnB или его гомолога, выявленного у архебактерии Methanococcus maripaludis, nifI1 и nifI₂. В определенных случаях геномы видов Paenibacillus могут варьировать. Например, у Paenibacillus polymixa E681 отсутствуют glnK и gdh, присутствует несколько переносчиков соединений азота, но по-видимому, только amtB находится под контролем GlnR. В другом примере вид Paenibacillus JDR2 содержит glnK, gdh и большинство других центральных генов метаболизма азота, содержит множество менее крупных переносчиков соединений азота, но не содержит glnPHQ под контролем GlnR. Paenibacillus riograndensis SBR5 содержит стандартный оперон glnRA, ген fdx, основной оперон nif, вторичный оперон nif и оперон anf (кодирующий содержащую только железо нитрогеназу). Выше каждого из этих оперонов выявлены предполагаемые участки glnR/tnrA. GlnR может регулировать все указанные выше опероны, за исключением оперона anf. GlnR может связываться с каждой из этих регуляторных последовательностей в виде димера.

[0221] Фиксирующие N штаммы Paenibacillus могут попадать в две подгруппы: подгруппу I, которая содержит только минимальный кластер генов nif, и подгруппу II, содержащую минимальный кластер и неохарактеризованный ген между nifX и hesA, и часто в других кластерах происходит дупликация определенных генов nif, таких как nifH, nifHDK, nifBEN, или кластеры, кодирующие гены нитрогеназы с ванадием (vnf) или содержащей только железо нитрогеназы).

[0222] В определенных случаях геном видов Paenibacillus может не содержать гена для продукции glnB или glnK. В определенных случаях геном видов Paenibacillus может содержать минимальный кластер nif с 9 генами, транскрибируемыми с промотора sigma-70. В определенных случаях кластер nif Paenibacillus могут отрицательно регулировать азот или кислород. В определенных случаях геном видов Paenibacillus может не содержать гена для продукции sigma-54. Например, вид Paenibacillus WLY78 не содержит гена sigma-54. В определенных случаях кластер nif могут регулировать glnR и/или TnrA. В определенных случаях активность кластера nif можно определять изменяя активность glnR и/или TnrA.

[0223] У Bacilli глутаминсинтетаза (GS) ингибирована по типу обратной связи высокими концентрациями внутриклеточного глутамина, вызывая сдвиг в подтверждении (обозначаемый как FBI-GS). Кластеры Nif содержат выраженные участки связывания для регуляторов GlnR и TnrA у различных видов Bacilli. GlnR связывает и подавляет экспрессию гена в присутствии избытка внутриклеточного глутамина и АМФ. Ролью GlnR может являться предотвращения притока и внутриклеточной продукции глутамина и аммония в условиях высокой доступности азота. TnrA может связывать и/или активировать (или подавлять) экспрессию генов в присутствии лимитирующего внутриклеточного глутамина и/или в присутствии FBI-GS. В определенных случаях активность кластера nif Bacilli можно изменять, изменяя активность GlnR.

[0224] Ингибированная по типу обратной связи глутаминсинтетаза (FBI-GS) может связывать GlnR и стабилизировать связывание GlnR с распознаваемыми последовательностями. Несколько видов бактерий содержат участок связывания GlnR/TnrA выше кластера nif. Изменение связывания FBI-GS и GlnR могут изменять активность пути nif.

Источники микроорганизмов

[0225] Бактерии (или любой микроорганизм по описанию) можно получать из любой обычной наземной окружающей среды, включая ее почвы, растения, грибы, животные (включая беспозвоночных) и другую биоту, включая осадки, воду и биоту озер и рек; из морской окружающей среды, ее биоты и осадков (например, морской воды, морского ила, морских растений, морских беспозвоночных (например, губок), морских позвоночных (например, рыб)); земной и морской геосферы (рыхлые поверхностные отложения и камни, например, раздробленные подпочвенные камни, песок и глины); криосферы и ее талых вод; атмосферы (например, отфильтрованной взвешенной пыли, облачных и дождевых капель); городской, промышленной и других техногенных окружающих сред (например, накопленные органический и минеральный материал на бетоне, желобах обочин, поверхностях крыш и дорожных покрытиях).

[0226] Растения, из которых получают бактерии (или любой микроорганизм по описанию), могут представлять собой растение с одним или несколькими требуемыми признаками, например, растения, которые в природе растут в конкретной окружающей среде или в определенных представляющих интерес условиях. В качестве примера, определенное растение может в природе расти в песчаном грунте или песке с высокой минерализацией, или при экстремальных температурах, или с малым количеством воды, или оно может быть устойчивым к определенным вредителям или заболеваниям, присутствующим в окружающей среда, и желательным может являться выращивание коммерческой сельскохозяйственной культуры в таких условиях, в частности, например, если они представляют собой единственные доступные в конкретном географическом положении условия. В качестве дополнительного примера бактерии можно выделять из коммерческой сельскохозяйственной культуры, выращиваемой в таких средах или более конкретно, из конкретной сельскохозяйственной культуры, в которой среди сельскохозяйственных культур, выращиваемых в любой конкретной окружающей среде, наилучшим образом представлен представляющий интерес признак: например, наиболее быстрорастущие растения среди сельскохозяйственных культур, выращиваемых в почвах с ограниченным уровнем солей, или наименее повреждаемые растения среди сельскохозяйственных культур, подвергшихся сильному повреждению насекомыми или эпидемическим заболеванием, или растения с требуемыми количествами определенных метаболитов и других соединений, включая содержание волокон, содержание масел и т.п., или растения, демонстрирующие требуемые цвета, вкус или запах. Бактерии можно выделять из представляющего интерес растения или любого материала, находящегося в исследуемой окружающей среде, включая грибы и другую животную и растительную биоту, почву, воду, осадки и друг составляющие окружающей среды, как указано ранее.

[0227] Бактерии (или любой микроорганизм по описанию) можно выделять из ткани растения. Это выделение можно проводить из любой подходящий ткани растения, включая например, корень, стебель и листья и репродуктивные ткани растения. В качестве примера, общепринятые способы выделения из растений, как правило, включают вырезание в стерильных условиях материала исследуемого растения (например, участки корня или стебля, листья), стерилизация поверхности подходящим раствором (например, 2% гипохлоритом натрия) с последующим помещением материала растения на питательную среду для роста микроорганизмов. Альтернативно, материал растения со стерилизованной поверхностью можно измельчать в стерильную жидкость (как правило, воду) и жидкую суспензию, содержащую небольшие части измельченного материала растения наносить на поверхность подходящей твердой агарозной среды или сред, которые могут являться селективными или нет (например, содержать только фитиновую кислоту в качестве источника фосфора). Этот подход особенно пригоден для бактерий, которые формируют изолированные колонии и которые можно индивидуально перенести на отдельные планшеты с питательной средой, и дополнительно очищать до одного вида хорошо известными способами. Альтернативно, образцы корней или листьев растение можно не подвергать поверхностной стерилизации, а только аккуратно промыть, таким образом, включая в процесс выделения обитающие на поверхности эпифитные микроорганизмы, или эпифитные микроорганизмы можно выделять отдельно, прикладывая и убирая части корней, стеблей или листьев растений на поверхности агарозной среда, а затем выделяя отдельные колонии, как описано выше. Этот подход особенно пригоден, например, для бактерий. Альтернативно, корни можно обрабатывать без отмывания небольших количеств почвы, налипших на корни, таким образом, включая микроорганизмы, которые колонизирует ризосферу растения. В других случаях можно отбирать почву, налипшую на корни, разбавлять и наносить на агар с подходящими селективными и неселективными средами с получением отдельных колоний ризосферных бактерий.

БУДАПЕШТСКИЙ ДОГОВОР О МЕЖДУНАРОДНОМ ПРИЗНАНИИ ДЕПОНИРОВАНИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ ДЛЯ ЦЕЛЕЙ ПАТЕНТНОЙ ПРОЦЕДУРЫ

[0228] Депозиты микроорганизмов по настоящему изобретению сделаны в соответствии с положениями будапештского договора о международном признании депонирования микроорганизмов для целей патентной процедуры (будапештского договора).

[0229] Авторы утверждают, что в соответствии с 37 C.F.R. 1.808(a) (2) "все ограничения, наложенные вкладчиком на доступность публике депонированного материала, будут безвозвратно сняты при выдаче патента". Это утверждение подпадает под действие пункта (b) данного раздела (т.е. 37 C.F.R. 1.808 (b)).

[0230] Биологически чистые культуры Rahnella aquatilis и Enterobacter sacchari депонированы 14 июля 2015 года в американскую коллекцию типовых культур (ATCC; International Depositary Authority), 10801 University Blvd., Manassas, VA 20110, USA, и им присвоены номера ATTC Patent Deposit Designation PTA-122293 и PTA-122294, соответственно. Соответствующая информация о депозите приведена ниже в таблице A.

[0231] Enterobacter sacchari в настоящее время переклассифицирована как Kosakonia sacchari, это название для этого организма можно использовать взаимозаменяемо на всем протяжении описания.

[0232] Многие микроорганизмы по настоящему изобретению получены из двух штаммов дикого типа, как представлено на фигуре 18 и фигуре 19. Штамм CI006 представляет собой вид бактерий, ранее классифицированный в роде Enterobacter (см. указанную выше переклассификацию в Kosakonia), и на фигуре 19 приведена линия мутантов, которые получены из CI006. Штамм CI019 представляет собой вид бактерий, классифицированный в роде Rahnella, и на фигуре 19 приведена линия мутантов, которые получены из CI019. В отношении фигуры 18 и фигуры 19, следует отметить, что штаммы, содержащие CM в названии, представляют собой мутанты штаммов, изображенные непосредственно слева от указанного штамма CM. Информация из депозита для CI006 Kosakonia дикого типа (WT) и CI019 Rahnella WT приведена ниже в таблице A.

[0233] Некоторые микроорганизмы, описанные в настоящей заявке, депонированы 06 января 2017 года или 11 августа 2017 года в Bigelow National Center for Marine Algae and Microbiota (NCMA), находящегося по адресу 60 Bigelow Drive, East Boothbay, Maine 04544, USA. Как указано выше, все депозиты сделаны в соответствии с условиями будапештского договора о международном признании депонирования микроорганизмов для целей патентной процедуры. Номера доступа Bigelow National Center for Marine Algae and Microbiota и даты депозита для указанных выше депозитов по будапештскому договору приведены в таблице A.

[0234] Биологически чистые культуры Kosakonia sacchari (WT), Rahnella aquatilis (WT) и варианта штамма Kosakonia sacchari депонированы 06 января 2017 года в Bigelow National Center for Marine Algae and Microbiota (NCMA), находящийся по адресу 60 Bigelow Drive, East Boothbay, Maine 04544, USA, и им присвоены номера NCMA Patent Deposit Designation 201701001, 201701003 и 201701002, соответственно. Соответствующая информация о депозите приведена ниже в таблице A.

[0235] Биологически чистые культуры вариантов штаммов Kosakonia sacchari депонированы 11 августа 2017 года в Bigelow National Center for Marine Algae and Microbiota (NCMA), находящийся по адресу 60 Bigelow Drive, East Boothbay, Maine 04544, USA, и им присвоены номера NCMA Patent Deposit Designation 201708004, 201708003 и 201708002, соответственно. Соответствующая информация о депозите приведена ниже в таблице A.

[0236] Биологически чистая культура Klebsiella variicola (WT) депонирована 11 августа 2017 года в Bigelow National Center for Marine Algae and Microbiota (NCMA), находящийся по адресу 60 Bigelow Drive, East Boothbay, Maine 04544, USA, и ей присвоен номер NCMA Patent Deposit Designation 201708001. Биологически чистые культуры двух вариантов Klebsiella variicola депонированы 20 декабря 2017 года в Bigelow National Center for Marine Algae and Microbiota (NCMA), находящийся по адресу 60 Bigelow Drive, East Boothbay, Maine 04544, USA, и им присвоены номера NCMA Patent Deposit Designation 201712001 и 201712002, соответственно. Соответствующая информация о депозите приведена ниже в таблице A.

Таблица A: Микроорганизмы, депонированные в соответствии с будапештским договором

Depository Основное обозначение штамма (у некоторых штаммов есть несколько обозначений) Таксономия Номер доступа Дата депозита ATCC Rahnella aquatilis PTA-122293 14 июля 2015 года ATCC Enterobacter sacchari (таксономически переклассифицирована после депозита как Kosakonia sacchari) PTA-122294 14 июля 2015 года NCMA CI006, PBC6.1, 6 Kosakonia sacchari (WT) 201701001 06 января 2017 года NCMA CI019, 19 Rahnella aquatilis (WT) 201701003 06 января 2017 года NCMA CM029, 6-412 Kosakonia sacchari 201701002 06 января 2017 года NCMA 6-403 CM037 Kosakonia sacchari 201708004 11 августа 2017 года NCMA 6-404, CM³8, PBC6.38 Kosakonia sacchari 201708003 11 августа 2017 года NCMA CM094, 6-881, PBC6.94 Kosakonia sacchari 201708002 11 августа 2017 года NCMA CI137, 137, PB137 Klebsiella variicola (WT) 201708001 11 августа 2017 года NCMA 137-1034 Klebsiella variicola 201712001 20 декабря 2017 года NCMA 137-1036 Klebsiella variicola 201712002 20 декабря 2017 года

Выделенные и биологически чистые микроорганизмы

[0237] Настоящее изобретение в определенных вариантах осуществления относится к выделенным и биологически чистым микроорганизмам, которые в числе прочего имеют применения в сельском хозяйстве. Микроорганизмы по изобретению можно использовать в их выделенном и биологически чистом состояниях, а также сформулированными в композиции (для описания иллюстративных композиций см. раздел ниже). Кроме того, по изобретению предоставлены композиции микроорганизмов, содержащие по меньшей мере два представителя описанных выделенных и биологически чистых микроорганизмов, а также способы использования указанных композиций микроорганизмов. Кроме того, по изобретению предусмотрены способы модуляции фиксации азота в растениях посредством использование описанных выделенных и биологически чистых микроорганизмов.

[0238] В определенных аспектах выделенные и биологически чистые микроорганизмы по изобретению представляют собой микроорганизмы из таблицы A. В других аспектах выделенные и биологически чистые микроорганизмы по изобретению получают из микроорганизмов из таблицы A. Например, по настоящему документу предоставлены штамм, потомок, мутант или производное микроорганизма из таблицы A. По изобретению предусмотрены все возможные комбинации микроорганизмов, перечисленных в таблице A, где указанные комбинации иногда формируют консорциумы микроорганизмов. Микроорганизмы из таблицы A, индивидуально или в любой комбинации, можно комбинировать с любым растением, активным веществом (синтетическим, органическим и т.д.), адъювантом, носителем, добавков или биологическим компонентом, указанных в описании.

Композиции

[0239] Композиции, содержащие бактерии или популяции бактерий, полученных способами, описываемыми в настоящем документе, и/или обладающих характеристиками, как описано в настоящем документе, могут находиться в форме жидкости, пены или сухого продукта. Композиции, содержащие бактерии или популяции бактерий, полученных способами, описываемыми в настоящем документе, и/или обладающих характеристиками, как описано в настоящем документе, также можно использовать для улучшения свойств растений. В определенных примерах композиция, содержащая популяции бактерий, может находиться в форме a сухого порошка, взвеси порошка и воды или жидкой пропитки для семян. Композиции, содержащие популяции бактерий можно наносить на поверхность семян, и она может находиться в жидкой форме.

[0240] Композиция можно производить в биореакторах, таких как реакторы с непрерывно перемешиваемым резервуаром, реакторы периодического действия и на ферме. В определенных примерах композиции можно хранить в контейнере, таком как канистра или в миниобъеме. В определенных примерах композиции можно хранить в любом объекте, выбранном из группы, состоящей из бутылки, фляги, ампулы, упаковки, сосуда, мешка, коробки, ящика, обертки, картонной коробки, контейнера, накопитель, контейнер для перевозок, кузов грузового автомобиля и/или корпус.

[0241] Композиции также можно использовать для улучшения свойств растений. В определенных примерах одну или несколько композиций можно наносить на семена. В определенных примерах одну или несколько композиций можно наносить на проросток. В определенных примерах одну или несколько композиций можно наносить на поверхность семян. В определенных примерах одну или несколько композиций можно наносить в виде слоя на поверхности семян. В определенных примерах композиция, которую наносят на семена может находиться в жидкой форме, в форме сухого продукта, в форме пены, в форме взвеси порошка и воды, или в жидкой пропитки для семян. В определенных примерах одну или несколько композиций можно наносить на семена и/или проростки посредством распыления, погружения, покрытия, инкапсуляции и/или опыления семян и/или проростков одной или несколькими композициями. В определенных примерах на семена и/или проростки растений можно наносить несколько бактерий или популяции бактерий. В определенных примерах можно выбирать по меньшей мере два, по меньшей мере три, по меньшей мере четыре, по меньшей мере пять, по меньшей мере шесть, по меньшей мере семь, по меньшей мере восемь, по меньшей мере девять, по меньшей мере десять, или более чем десять бактерии комбинации бактерий из одного из следующих родов: Acidovorax, Agrobacterium, Bacillus, Burkholderia, Chryseobacterium, Curtobacterium, Enterobacter, Escherichia, Methylobacterium, Paenibacillus, Pantoea, Pseudomonas, Ralstonia, Saccharibacillus, Sphingomonas и Stenotrophomonas.

[0242] В определенных примерах по меньшей мере два, по меньшей мере три, по меньшей мере четыре, по меньшей мере пять, по меньшей мере шесть, по меньшей мере семь, по меньшей мере восемь, по меньшей мере девять, по меньшей мере десять или более чем десять бактерий и популяций бактерий эндофитной комбинации выбраны из одного из следующих семейств: Bacillaceae, Burkholderiaceae, Comamonadaceae, Enterobacteriaceae, Flavobacteriaceae, Methylobacteriaceae, Microbacteriaceae, Paenibacillileae, Pseudomonnaceae, Rhizobiaceae, Sphingomonadaceae, Xanthomonadaceae, Cladosporiaceae, Gnomoniaceae, Incertae sedis, Lasiosphaeriaceae, Netriaceae и Pleosporaceae.

[0243] В определенных примерах по меньшей мере два, по меньшей мере три, по меньшей мере четыре, по меньшей мере пять, по меньшей мере шесть, по меньшей мере семь, по меньшей мере восемь, по меньшей мере девять, по меньшей мере десять или более десяти бактерий и популяций бактерий эндофитной комбинации выбраны из одного из следующих семейств: Bacillaceae, Burkholderiaceae, Comamonadaceae, Enterobacteriaceae, Flavobacteriaceae, Methylobacteriaceae, Microbacteriaceae, Paenibacillileae, Pseudomonnaceae, Rhizobiaceae, Sphingomonadaceae, Xanthomonadaceae, Cladosporiaceae, Gnomoniaceae, Incertae sedis, Lasiosphaeriaceae, Netriaceae, Pleosporaceae.

[0244] Примеры композиций могут включать покрытия семян для коммерчески важных сельскохозяйственных культур, например, сорго, канолы, томата, клубники, ячменя, риса, кукурузы и пшеницы. Примеры композиций также могут включать покрытия семян кукурузы, сои, канолы, сорго, картофеля, риса, овощей, злаковых и семена масличных культур. Семена, как предоставлено по настоящему документу, могут представлять собой генетически модифицированные организмы (GMO), не GMO, органические формы или общепринятые формы. В определенных примерах композиции можно распылять на надземные части растений или наносить на корни, внося их в борозды, в которые сажают семена растений, поливая почву или опуская корни в суспензию композиции. В определенных примерах композиции можно обезвоживать подходящим способом, который сохраняет жизнеспособность клеток и способность к искусственному заселению и колонизации растений-хозяев. Виды бактерий могут присутствовать в композициях в концентрации от 10⁸ до 10¹⁰ КОЕ/мл. В определенных примерах композиции можно дополнять ионами металлов-микроэлементов, такими как ионы молибдена, ионы железа, ионы марганца или комбинации этих ионов. Концентрации ионов в примерах композиций, описываемых в настоящем документе, могут составлять приблизительно от 0,1 мМ до приблизительно 50 мМ. Определенные примеры композиций также можно формулировать c носителем, таким как бета-глюкан, карбоксилметилцеллюлоза (CMC), бактериальное внеклеточное полимерное вещество (EPS), сахар, молоко животного или другие подходящие носители. В определенных примерах в качестве носителя можно использовать торф или посадочные материалы или биополимеры, в которых композицию помещают в биополимер. Композиции, содержащие бактериальные популяции, описываемые в настоящем документе, могут улучшать признаки растений, например, стимулировать рост растений, поддерживать высокое содержание хлорофилла в листьях, увеличивать количества плодов или семян и увеличивать массу единичного плода или семени.

[0245] Композиции, содержащие бактериальные популяции, описываемые в настоящем документе, можно наносить на поверхность семян. Таким образом, предусмотрены композиции, содержащие семена, покрытые одним или несколькими видами бактерий, описанных в настоящем документе. Покрытие семян можно формулировать, смешивая популяцию бактерий с пористым, химически инертным гранулярным носителем. Альтернативно, композиции можно вносить непосредственно в борозды, в которые высаживают семена или распылять на листья растений или наносить посредством погружения корней в суспензию композиции. Можно использовать эффективное количество композиции для заполнения области грунта рядом с корнями растения с ростом жизнеспособных бактерий или заселения листьев растения с ростом жизнеспособных бактерий. Как правило, эффективное количество представляет собой количество, достаточное для получения растений с улучшенными признаками (например, с желаемым уровнем фиксации азота).

[0246] Бактериальные композиции, описываемые в настоящем документе, можно формулировать с использованием приемлемого в сельском хозяйстве носителя. Состав, пригодный для этих вариантов осуществления, может содержать по меньшей мере одного представителя, выбранного из группы, состоящей из придающего клейкость средства, стабилизатора микроорганизмов, фунгицида, антибактериального средства, консерванта, стабилизатора, поверхностно-активного вещества, противокомплексного средства, гербицида, нематоцида, инсектицида, регулятора роста растения, удобрения, родентицида, поглотителя влаги бактерицида, питательного вещества или любой их комбинации. В определенных примерах композиции могут быть пригодными для длительного хранения. Например, любая из композиций, описываемых в настоящем документе, может содержать приемлемый в сельском хозяйстве носитель (например, один или несколько из удобрений, таких как неприродное удобрение, обеспечивающих прилипание средств, таких как неприродное обеспечивающее прилипание средство, и пестицидов, таких как неприродный пестицид). Неприродное обеспечивающее прилипание средство может представлять собой, например, полимер, сополимер или синтетический воск. Например, любой из покрытых семян, всходов или растений, описываемых в настоящем документе, может содержать в покрытии семян такой приемлемый в сельском хозяйстве носитель. В любых из композиций или способов, описываемых в настоящем документе, приемлемый в сельском хозяйстве носитель может представлять собой или может содержать неприродное соединение (например, неприродное удобрение, неприродное обеспечивающее прилипание средство, такое как полимер, сополимер или синтетический воск, или неприродный пестицид). Неограничивающие примеры приемлемых в сельском хозяйстве носителей описаны ниже. В данной области известны дополнительные примеры приемлемых в сельском хозяйстве носителей.

[0247] В определенных случаях бактерии смешивают с приемлемым в сельском хозяйстве носителем. Носитель может представлять собой твердый носитель или жидкий носитель, и находиться в различных формах, включая микросферы, порошки, эмульсии и т.п. Носитель может представлять собой любой один или несколько из ряда носителей, которые обеспечивают ряд таких свойств, как увеличенная стабильность, смачиваемость или диспергируемость. В композиции можно включать средства для смачивания, такие как природные или синтетические поверхностно-активные вещества, которые могут быть неионными или ионными поверхностно-активными вещества, или их сочетание. Также для формулирования композиций, которые содержат выделенные бактерии, можно использовать эмульсии вода-в-масле (см., например, патент США № 7485451). Подходящие составы, которые можно получать, включают смачиваемые порошки, гранулы, гели, агарозные пластинки или шарики, загустители и т.п., микроинкапсулированные частицы и т.п., жидкости, такие как водные жидкости, водные суспензии, эмульсии вода-в-масле и т.д. Состав может содержать зерновые или бобовые продукты, например, молотые зерна или бобы, бульон или муку тонкого помола, получаемые из зерен или бобов, крахмал, сахар или масло.

[0248] В определенных вариантах осуществления сельскохозяйственный носитель может представлять собой почву или среду для выращивания растений. Другие сельскохозяйственные носители, которые можно использовать, включают воду, удобрения, растительные масла, увлажнители или их сочетания. Альтернативно, сельскохозяйственный носитель может быть твердым, таким как диатомовая земля, глина, диоксид кремния, альгинат, глинистый грунт, бентонит, вермикулит, семенные коробочки, другое растительные и животные продукты или их комбинации, включая гранулы, осадки или суспензии. В качестве носителей также предусмотрены смеси любых указанных выше ингредиентов, в качестве неограничивающих примеров такие как песта (мука тонкого помола и каолиновая глина), шарики на основе агара или муки тонкого помола в глине, песке или глинистый грунт и т.д. Составы могут содержать источники пищи для бактерий, такие как ячмень, рис или другие биологические материалы, такие как семена, части растений, выжимки сахарного тростника, шелуха или плодоножки после обработки зерна, измельченный растительный материал или древесину из отходов строительных участков, опилки или мелкие волокна после переработки бумаги, ткани или дерева.

[0249] Для помощи в стимуляции роста или обеспечения питательных веществ для семян, всходов или растений можно использовать, например, удобрение. Неограничивающие примеры удобрений включают азот, фосфор, калий, кальций, серу, магний, бор, хлорид, марганец, железо, цинк, медь, молибден и селен (или их соли). Дополнительные примеры удобрений, включают одну или несколько аминокислот, соли, углеводы, витамины, глюкозу, NaCl, дрожжевой экстракт, NH₄H₂PO₄, (NH₄)₂SO₄, глицерин, валин, L-лейцин, молочную кислоту, пропионовую кислоту, янтарную кислоту, яблочную кислоту, лимонную кислоту, тартрат KH, ксилозу, ликсозу и лецитин. В одном из вариантов осуществления состав может содержать придающее клейкость средство или клеящее средство (обозначаемое как адгезивное средство), помогающее связывать другие активные средства с веществом (например, с поверхностью семян). Такие средства пригодны для комбинации бактерий с носителями, которые могут содержать другие соединения (например, контрольные средства, которые являются небиологическими), с получением покрывающей композиции. Такие композиции помогают получать покрытия вокруг растения или семян с поддержанием контакта микроорганизмов и других средств с растением или частью растения. В одном из вариантов осуществления адгезивы выбраны из группы, состоящей из: альгината, камедей, различных видов крахмала, лецитинов, формононетина, поливинилового спирта, щелочного формононетината, гесперетина, поливинилацетата, цефалинов, гуммиарабика, ксантановой камеди, минерального масла, полиэтиленгликоля (ПЭГ), поливинилпирролидона (ПВП), арабино-галактана, метилцеллюлозы, ПЭГ 400, хитозана, полиакриламида, полиакрилата, аолиакрилонитрила, глицерина, триэтиленгликоля, винилацетата, геллановой камеди, полистирола, поливинила, карбоксиметилцеллюлозы, камеди гхатти и полиоксиэтилен-полиоксибутиленовых блок-сополимеров.

[0250] В определенных вариантах осуществления адгезивы могут представлять собой, например, воск, такой как карнаубский воск, пчелиный воск, китайский воск, шеллачный воск, спермацетовый воск, канделильский воск, гидрированное касторовое масло, орикурийский воск и воск рисовых отрубей, полисахарид (например, крахмал, декстрины, мальтодекстрины, альгинат и хитозаны), жир, масло, белок (например, желатин и зеины), гуммиарабик и шеллаки. Адгезивные средства могут представлять собой неприродные соединения, например, полимеры, сополимеры и воска. Например, неограничивающие примеры полимеров, которые можно использовать в качестве адгезивного средства, включают: поливинилацетаты, сополимеры поливинилацетатов, сополимеры этилена и винилацетата (EVA), поливиниловые спирты, сополимеры поливиниловых спиртов, соединения целлюлозы (например, различные виды этилцеллюлозы, метилцеллюлозы, гидроксиметилцеллюлозы, гидроксипропилцеллюлозы и карбоксиметилцеллюлозы), поливинилпирролидоны, винилхлорид, сополимеры винилиденхлорида, лигносульфонаты кальция, акриловые сополимеры, поливинилакрилаты, полиэтиленоксид, ациламидные полимеры и сополимеры, полигидроксиэтилакрилат, мономерные метилакриламиды и полихлоропрен.

[0251] В определенных примерах одно или несколько из адгезивных средств, противогрибковых средств, средств регуляции роста и пестицидов (например, инсектицидов) представляют собой неприродные соединения (например, в любой комбинации). Дополнительные примеры приемлемых в сельском хозяйстве носителей включают дисперсанты (например, поливинилпирролидон/винилацетат PVPIVA S-630), поверхностно-активные вещества, связывающие средства и наполнители.

[0252] Состав также может содержать поверхностно-активное вещество. Неограничивающие примеры поверхностно-активных веществ включают смеси азотных удобрений и поверхностно-активных веществ, такие как Prefer 28 (Cenex), Surf-N (US), Inhance (Brandt), P-28 (Wilfarm) и Patrol (Helena); этерифицированные масла семян включают Sun-It II (AmCy), MSO (UAP), Scoil (Agsco), Hasten (Wilfarm) и Mes-100 (Drexel); и органо-силиконовые поверхностно-активные вещества включают Silwet L77 (UAP), Silikin (Terra), Dyne-Amic (Helena), Kinetic (Helena), Sylgard 309 (Wilbur-Ellis) и Century (Precision). В одном из вариантов осуществления поверхностно-активное вещество присутствует в концентрации от 0,01% об./об. до 10% об./об. В другом варианте осуществления поверхностно-активное вещество присутствует в концентрации от 0,1% об./об. до 1% об./об.

[0253] В определенных случаях состав содержит стабилизатор микроорганизмов. Такое средство может включать поглотитель влаги, который может включать любое соединение или смесь соединений, которые можно классифицировать как поглотитель влаги вне зависимости от того используют ли соединение или соединения в таких концентрациях, что они фактически проявляют высушивающее действие на жидкое инокулируемое средство. Такие поглотители влаги в идеале совместимы с используемыми популяциями бактерий и должны поддерживать способность популяции микроорганизмов переживать нанесение на семена и переживать обезвоживание. Примеры подходящих поглотителей влаги включают одно или несколько из трегалозы, сахарозы, глицерина и метиленгликоля. Другие подходящие поглотители влаги в качестве неограничивающих примеров включают невосстанавливающие сахара и сахарные спирты (например, маннит или сорбит). Количество поглотителя влаги, вводимое в состав, может находиться в диапазоне приблизительно от 5% до приблизительно 50% по массе/объему, например, приблизительно от 10% до приблизительно 40%, приблизительно от 15% до приблизительно 35% или приблизительно от 20% до приблизительно 30%. В определенных случаях предпочтительно, чтобы состав содержал такие средства, как фунгицид, антибактериальное средство, гербицид, нематоцид, инсектицид, регулятор роста растения, родентицид, бактерицидное средство или питательное вещество. В определенных примерах средства могут включать защитные средства, которые обеспечивают защиту против патогенных микроорганизмов на поверхности семян. В определенных примерах защитные средства могут обеспечивать определенный уровень контроля почвенных патогенных микроорганизмов. В определенных примерах защитные средства могут быть эффективными преимущественно на поверхности семян.

[0254] В определенных примерах фунгицид может включать соединение или химическое или биологическое средство, которое может ингибировать рост гриба или уничтожать гриб. В определенных примерах фунгицид может включать соединения, которые могут являться фунгистатическими или фунгицидными. В определенных примерах фунгицид может представлять собой защитное средство или средства, которые эффективны преимущественно на поверхности семян, обеспечивая защиту против патогенных микроорганизмов на поверхности семян и обеспечивая определенный уровень контроля почвенных патогенных микроорганизмов. Неограничивающие примеры защитных фунгицидов включают каптан, манеб, тирам или флудиоксонил.

[0255] В определенных примерах фунгицид может представлять собой системный фунгицид, который может всасываться в растущий проросток и ингибировать или уничтожать гриб внутри тканей растений-хозяев. Системные фунгициды, используемые для пропитки семян в качестве неограничивающих примеров включают следующее: азоксистробин, карбоксин, мефеноксам, металаксил, тиабендазол, трифлоксистробин и различные триазоловые фунгициды, включающие дифеноконазол, ипконазол, тебуконазол и тритиконазол. Мефеноксам и металаксил преимущественно используют для воздействия на грибы водяной плесени Pythium и Phytophthora. Определенные фунгициды являются более предпочтительными, чем другие в зависимости от вида растения вследствие незначительных различий в чувствительности патогенных видов грибов или вследствие различий распределения фунгицидов или чувствительности растений. В определенных примерах фунгицид может представлять собой биологическое средство контроля, такое как бактерия или гриб. Такие организмы могут являться паразитами патогенных грибов или секретировать токсины или другие вещества, которые могут уничтожать или иным образом предотвращать рост грибов. В составе для семян в качестве контрольного средства можно использовать любой тип фунгицида, особенно фунгициды, которые широко используются у растений.

[0256] В определенных примерах композиция покрытия для семян содержит средство для контроля, которое обладает антибактериальными свойствами. В одном из вариантов осуществления средство для контроля с антибактериальными свойствами выбрано из соединений, описываемых в других разделах настоящего документа. В другом варианте осуществления соединение представляет собой стрептомицин, окситетрациклин, оксолиновая кислота или гентамицин. Другие примеры антибактериальных соединений, которые можно использовать в качестве части композиции покрытия для семян включают соединения на основе дихлорофена и гемиформаля бензилового спирта (Proxel®, производимый ICI, или Acticide® RS, производимый Thor Chemie, и Kathon® MK 25, производимый Rohm & Haas) и производные изотиазолинона, такие как алкилизотиазолиноны и бензизотиазолиноны (Acticide® MBS, производимые Thor Chemie).

[0257] В определенных примерах регулятор роста выбран из группы, состоящей из: абсцизовой кислотаы, амидохлора, анцимидола, 6-бензиламинопурина, брассинолида, бутралина, хлормеквата (хлорида хлормекват), холинхлорида, цикланилида, даминозида, дикегулака, диметипина, 2,6-диметилпуридина, этефона, флуметралина, флурпримидола, флутиацета, форхлорфенурона, гибберелловой кислоты, инабенфида, индол-3-уксусной кислоты, малеиновог гидразида, мефлуидида, мепиквата (хлорида мепиквата), нафталинуксусной кислоты, N-6-бензиладенина, паклобутразола, фосфотритиоата прогексадиона, 2,3,5-три-йодобензойной кислоты, тринексапакэтила и униконазола. Дополнительные неограничивающие примеры регуляторов роста включают брассиностероиды, цитокинины (например, кинетин и зеатин), ауксины (например, индолилуксусную кислоту и индолилацетиласпартат), флавоноиды и изофлавоноиды (например, формононетин и диосметин), фитоауксины (например, глицеоллин) и индуцируемые фитоалексинами олигосахариды (например, пектин, хитин, хитозан, полигалактуроновая кислота и олигогалактуроновая кислота) и гибеллерины. Такие средства в идеале совместимы с сельскохозяйственными семенами или всходами, на которые наносят состав (например, он не должен быть вреден для роста или здоровья растений). Кроме того, в идеале средство представляет собой средство, которое не представляет угрозу безопасности применения для человека, животного или промышленного (например, отсутствие угроз безопасности или соединение является в достаточной степени нестабильным так, что потребляемый растительный продукт, получаемый из растения, содержит незначительные количества этого соединения).

[0258] Определенные примеры антагонистичных нематодам средств биоконтроля, включают ARF18; 30 видов Arthrobotrys; виды Chaetomium; виды Cylindrocarpon; виды Exophilia; виды Fusarium; виды Gliocladium; виды Hirsutella; виды Lecanicillium; виды Monacrosporium; виды Myrothecium; виды Neocosmospora; виды Paecilomyces; виды Pochonia; виды Stagonospora; везикулярно-арбускулярные микоризные грибы, виды Burkholderia; виды Pasteuria, виды Brevibacillus; виды Pseudomonas и Rhizobacteria. Особенно предпочтительные антагонистичные нематодам средства биоконтроля включают ARF18, Arthrobotrys oligospora, Arthrobotrys dactyloides, Chaetomium globosum, Cylindrocarpon heteronema, Exophilia jeanselmei, Exophilia pisciphila, Fusarium aspergilus, Fusarium solani, Gliocladium catenulatum, Gliocladium roseum, Gliocladium vixens, Hirsutella rhossiliensis, Hirsutella minnesotensis, Lecanicillium lecanii, Monacrosporium drechsleri, Monacrosporium gephyropagum, Myrotehcium verrucaria, Neocosmospora vasinfecta, Paecilomyces lilacinus, Pochonia chlamydosporia, Stagonospora heteroderae, Stagonospora phaseoli, везикулярно-арбускулярные микоризные грибы, Burkholderia cepacia, Pasteuria penetrans, Pasteuria thornei, Pasteuria nishizawae, Pasteuria ramosa, Pastrueia usage, штамм G4 Brevibacillus laterosporus, Pseudomonas fluorescens и Rhizobacteria.

[0259] Определенные примеры питательных вещества можно выбрать из группы, состоящей из азотных удобрений, включающих в качестве неограничивающих примеров мочевину, нитрат аммония, сульфат аммония, безнапорные азотные растворы, водный аммиак, безводный аммиак, тиосульфат аммония, покрытую серой мочевину, мочевины-формальдегидов, IBDU, покрытую полимерами мочевину, нитрат кальция, уреаформ и метиленмочевину, фосфорные удобрения, такие как дифосфат аммония, монофосфат аммония, полифосфат аммония, концентрированный суперфосфат и тройной суперфосфат, и калийные удобрения, такие как хлорид калия, сульфат калия, сульфат калия-магния, нитрат калия. Такие композиции в композиции для покрытия семян могут находиться в виде свободных солей или ионов. Альтернативно, питательные вещества/удобрения можно формировать в виде комплексных или хелатированных соединений с обеспечением длительного высвобождения в течение продолжительного периода.

[0260] Определенные примеры родентицидов можно выбирать из группы веществ, состоящей из 2-изовалерилиндан-1,3-диона, 4-(хиноксалин-2-иламино)бензолсульфонамида, альфа-хлоргидрина, фосфида алюминия, альфа-нафтилтиомочевины, оксида мышьяка, карбоната бария, бистиосеми, бродифакума, бромадиолона, брометалина, цианида кальций, хлоралозы, хлорофацинона, холекальциферола, кумахлора, кумафурила, куматетралила, кримидина, дифенакума, дифетиалона, дифацинона, эргокальциферола, флокумафена, фторацетамида, флупропадина, гидрохлорида флупропадина, цианида водорода, йодометана, линдана, фосфида магния, метилбромида, норбормида, фосацетима, фосфина, фосфора, пиндона, арсенита калия, пиринурона, скиллирозида, арсенита натрия, цианида натрий, фторацетата натрия, стрихнина, сульфата талия, варфарина и фосфида цинка.

[0261] В жидкой форме, например, в растворе или суспензии, бактериальные популяции можно смешивать или суспендировать в воде или в водных растворах. Подходящие жидкие разбавители или носители включают воду, водные растворы, нефтяные дистилляты или другие жидкие носители.

[0262] Твердые композиции можно получать посредство диспергирования бактериальных популяций в соответствующим образом измельченном твердом носителе и на нем, таком как торф, пшеница, отруби, вермикулит, глина, тальк, бентонит, диатомовая земля, фуллерова глина, пастеризованная почва и т.п. Когда такие составы используют в качестве смачиваемых порошков, можно использовать биологически совместимые диспергирующие средства, такие как неионные, анионные, амфотерные или катионные диспергирующие средства и эмульгаторы.

[0263] Твердые носители, используемые в составе включают, например, минеральные носители, такие как каолиновая глина, пирофиллит, бентонит, монтмориллонит, диатомовая земля, кислая белая земля, вермикулит и перлит, и неорганические соли, такие как сульфат аммония, фосфат аммония, нитрат аммония, мочевина, хлорид аммония и карбонат кальция. Также можно использовать органические тонкодисперсные порошки, такие как пшеничная мука, пшеничные отруби и рисов отруби. Жидкие носители включают растительные масла, такие как соевое масло и хлопковое масло, глицерин, этиленгликоль, полиэтиленгликоль, пропиленгликоль, полипропиленгликоль и т.д.

Применение популяций бактерий для сельскохозяйственных культур

[0264] Композицию бактерий или популяцию бактерий, описываемые в настоящем документе, можно наносить в борозду, в форме талька или в виде пропитки для семян. Композицию можно наносить на упаковку семян в целом, миниобъеме, в мешке или в тальке.

[0265] Сельхозпроизводитель может высаживать обработанные семена и выращивать сельскохозяйственную культуру общепринятыми способами, двумя рядами или способами, не требующими обработки почвы. Семена можно распределять с использованием контрольного бункера или отдельного бункера. Семена также можно распределять с помощью сжатого воздуха или вручную. Посев семян можно проводить с использованием технологий с переменной скоростью. Кроме того, с использованием технологий с переменной скоростью может проводить нанесение бактерий или популяций бактерий, описываемых в настоящем документе. В определенных примерах бактерии можно наносить на семена кукурузы, сои, канолы, сорго, картофеля, риса, овощей, злаков, псевдозерновых и семена масличных культур. Примеры злаков могут включать ячмень, фонио, овес, траву пальмера, рожь, жемчужное просо, сорго, полбу, тэфф, тритикале и пшеницу. Примеры псевдозерновых могут включать грецкий орех, гречиху, полевой хвощ, чиа, лен, зерновой амарант, ганзу, киноа и кунжут. В определенных примерах семена могут являться генетически модифицированными организмами (GMO), не GMO, органическими или общепринятыми.

[0266] Кроме обработки сельскохозяйственных культур можно использовать добавки, такие как микроудобрение, PGR, гербицид, инсектицид и фунгицид. Примеры добавок включают защитные средства для сельскохозяйственных культур, такие как инсектициды, нематоциды, фунгициды, укрепляющие средства, такие как красители, полимеры, пеллетирование, примирование, и дезинфицирующие средства и другие средства, такие как инокулятор, PGR, смягчитель и питательные микроэлементы. PGR могут представлять собой природные или синтетические гормоны растений, которые влияют на рост корня, цветение или удлинение стебля. PGR могут включать ауксины, гиббереллины, цитокины, этилен и абсцизовую кислоту (ABA).

[0267] Композицию можно наносить в борозду в комбинации с жидким удобрением. В определенных примерах жидкое удобрение можно содержать в резервуарах. Удобрения NPK содержат макробиогенные вещества с натрием, фосфором и калием.

[0268] Композиция может улучшать свойства растений, например, способствуя росту растений, поддерживая высокое содержание хлорофилла в листьях, увеличивая количества плодов или семян и увеличивая массу единичных плодов или семян. Способы по настоящему изобретению можно использовать для добавления или улучшения одного или нескольких из ряда требуемых свойств. Примеры свойств которые можно добавлять или улучшать включают: биомассу корня, длина корня, высоту, высоту побега, количество листьев, эффективность использования воды, общую биомассу, урожайность, размер плода, размер зерен, интенсивность фотосинтеза, засухоустойчивость, жароустойчивость, солеустойчивость, устойчивость к стрессу с низким содержанием азота, эффективность использования азота, устойчивость к воздействию нематод, устойчивость к грибковым патогенным микроорганизмам, устойчивость к бактериальным патогенным микроорганизмам, устойчивость к вирусным патогенным микроорганизмам, уровень метаболитов, модуляцию уровня метаболитов, экспрессию протеома. Требуемые свойства, включая высоту, общую биомассу, биомассу корня и/или побега, прорастание семян, жизнеспособность проростков, эффективность фотосинтеза, интенсивность транспирации, количество или масса семян/плодов, урожайность зерна или плодов у растения, содержание хлорофилла в листьях, интенсивность фотосинтеза, длина корня или любое их сочетание можно использовать для определения роста и сравнивать со скоростью роста эталонных сельскохозяйственных растений (например, растений без добавления и/или улучшения свойств), выращиваемых в идентичных условиях. В определенных примерах требуемые свойства, включая высоту, общую биомассу, биомассу корней и/или побегов, прорастание семян, жизнеспособность проростков, эффективность фотосинтеза, интенсивность транспирации, количество или масса семян/плодов, урожайность зерна или плодов у растения, содержание хлорофилла в листьях, интенсивность фотосинтеза, длину корня или любое их сочетание можно использовать для определения роста и сравнения с скоростью роста эталонного сельскохозяйственного растения (например, растения без добавления и/или улучшения свойств), выращиваемых в сходных условиях.

[0269] Агротехнические признаки растения-хозяина в качестве неограничивающих примеров могут включать следующие: измененное содержание масла, измененное содержание белка, измененный состав углеводов семян, измененный состав масла семян и измененный состав белка семян, химическую устойчивость, устойчивость к холоду, замедленное старение, устойчивость к болезням, устойчивость к засухе, массу початка, улучшение роста, улучшение жизнеспособности, теплоустойчивость, устойчивость к гербицидам, устойчивость к травоядным животным, улучшенную фиксацию азота, улучшенное использование азота, улучшенную архитектуру корней, улучшенную эффективность использования воды, увеличенную биомассу, увеличенную длину корней, увеличенную массу семян, увеличенный рост побегов, увеличенную урожайность, увеличенный урожай при условиях с ограничением количества воды, массу зерен, содержание влаги в зернах, толерантность к металлам, количество початков, количество зерен в початке, количество стручков, улучшение питания, устойчивость к патогенным микроорганизмам, устойчивость к вредителям, улучшение способности к фотосинтезу, устойчивость к засолению, сохранение зеленого цвета, улучшение мощности, увеличенную сухую массу зрелых семян, увеличенную сырую массу зрелых семян, увеличенное количество зрелых семян на растение, увеличенное содержание хлорофилла, увеличенное количество стручков на растение, увеличенную длину стручков на растении, уменьшенное количество увядших листьев на растении, уменьшенное количество сильно увядших листьев на растении и увеличенное количество не увядших листьев на растение, детектируемаое изменение уровня метаболита, детектируемое изменение уровня транскрипта и детектируемое изменение протеома по сравнению с растением изолинии, выращенным из семян без указанного состава препарата для обработки семян.

[0270] В определенных случаях растения инокулируют бактериями или популяциями бактерий, которые выделены у того же вида растения в виде составляющей инокулируемого растения. Например, бактерия или популяция бактерий, которую в норме выявляют у одного сорта Zea mays (кукурузы), ассоциирована с составляющим растения другого сорта Zea mays, у которого в его природном состоянии существует недостаток указанных бактерий и популяций бактерий. В одном варианте осуществления бактерии и популяции бактерий получают у растения родственного вида в качестве составляющей инокулированного растения. Например, бактерии и популяции бактерий, которые обычно выявляют у Zea diploperennis, Iltis et al., (Diploperennial teosinte), используют для Zea mays (кукурузы) или наоборот. В определенных случаях растения инокулируют бактериями и популяциями бактерий, которые гетерологичны по отношению к элементу растения инокулируемого растения. В одном варианте осуществления бактерии и популяции бактерий получают у растения другого вида. Например, бактерии и популяции бактерий, которые обычно выявляют у двудольных растений, применяют для однодольных растений (например, инокулируют кукурузу бактериями и популяциями бактерий, полученными из бобов сои) или наоборот. В других случаях бактерии и популяции бактерий, которые для инокуляции в растение, получают у родственных видов растения, подвергаемого инокуляции. В одном варианте осуществления бактерии и популяции бактерий получают у родственного таксона, например, у родственных видов. Растение другого вида может являться сельскохозяйственным растением. В другом варианте осуществления бактерии и популяции бактерий являются частью разработанной композиции, инокулируемой в любой элемент растения-хозяина.

[0271] В определенных примерах бактерии или популяция бактерий являются экзогенными, где бактерии и популяция бактерий выделяют у растения, отличного от инокулируемого растения. Например, в одном из вариантов осуществления бактерии или популяция бактерий можно выделять из другого растения того же вида, что и инокулируемое растение. В определенных случаях бактерии или популяция бактерий можно выделять у видов, родственных инокулируемому растению.

[0272] В определенных примерах бактерии и популяции бактерий, описанные здесь, способны перемещаться от одного типа ткани к другому. Например, выявление и выделение бактерий и популяций бактерий по настоящему изобретению в зрелых тканях растений после нанесения покрытия на внешнюю поверхность семян демонстрирует их способность перемещаться из снаружи семян в вегетативные ткани созревающего растения. Таким ообразом, в одном из вариантов осуществления популяция бактерий и популяций бактерий способна перемещаться снаружи семян в вегетативные ткани растения. В одном из вариантов осуществления бактерии и популяции бактерий, которые наносят на семена растения, при прорастании семени в вегетативное состояние способны к локализации в других тканях растения. Например, бактерии и популяции бактерий могут быть способными к локализации в любой из тканей растения, в том числе: корне, добавочном корне, зародышевом корне, корневом волоске, побеге, листе, цветке, почке, метелке, меристеме, пыльце, пестике, завязи, тычинке, плоде, подземном побеге, корневом побеге, клубеньке, клубне, трихоме, защитных клетках, гидатоде, лепестке, чашелистике, оболочке зерна, оси колоса, сосудистом камбии, флоэме и ксилеме. В одном из вариантов осуществления бактерии и популяции бактерий способны к локализации в корне и/или корневых волосках растения. В другом варианте осуществления бактерии и популяции бактерий способны к локализации в фотосинтезирующих тканях, например листьях и побегах растения. В других случаях бактерии и популяции бактерий локализованы в сосудистых тканях растения, например, в ксилеме и флоэме. В еще одном из вариантов осуществления бактерии и популяции бактерий способны к локализации в репродуктивных тканях (цветке, пыльце, пестике, завязи, тычинке, плоде) растения. В другом варианте осуществления бактерии и популяции бактерий способны к локализации в корне, побегах, листьях и репродуктивных тканях растения. В еще одном из вариантов осуществления бактерии и популяции бактерий колонизируют плод или семенную ткань растения. В еще одном из вариантов осуществления бактерии и популяции бактерий способны колонизировать растение таким образом, что они находятся на поверхности растения (то есть их присутствие детектируют на внешней стороне растения или в эписфере растения). В других вариантах осуществления бактерии и популяции бактерий способны к локализации по существу во всем растении или во всех тканях растения. В определенных вариантах осуществления бактерии и популяции бактерий не локализованы в корне растения. В других случаях бактерии и популяции бактерий не локализованы в фотосинтезирующих тканях растения.

[0273] Эффективность композиций также можно оценивать определяя относительную зрелость сельскохозяйственной культуры или тепловые единицы сельскохозяйственной культуры (CHU). Например, популяцию бактерий можно наносить на кукурузу, и рост кукурузы можно оценивать в соответствии с относительной зрелость зерна кукурузы или по времени за которое зерно кукурузы достигает максимальной массы. Также для прогноза созревания кукурузы можно использовать тепловые единицы сельскохозяйственных культур (CHU). CHU определяют количество накопленной теплоты посредством определения суточного максимума температур при росте сельскохозяйственной культуры.

[0274] В примерах бактерии могут локализоваться в любой из тканей растения, в том числе: корне, добавочном корне, зародышевом корне, корневом волоске, побеге, листе, цветке, почке, метелке, меристеме, пыльце, пестике, завязи, тычинке, плоде, подземном побеге, корневом побеге, клубеньке, клубне, трихоме, защитных клетках, гидатоде, лепестке, чашелистике, оболочке зерна, оси колоса, сосудистом камбии, флоэме и ксилеме. В другом варианте осуществления бактерия или популяция бактерий способны к локализации в фотосинтезирующих тканях, например листьях и побегах растения. В других случаях бактерии и популяции бактерий локализуются в сосудистых тканях растения, например, в ксилеме и флоэме. В другом варианте осуществления бактерия или популяция бактерий способны к локализации в репродуктивных тканях (цветке, пыльце, пестике, завязи, тычинке или плоде) растения. В другом варианте осуществления бактерии и популяции бактерий способны к локализации в корне, побегах, листьях и репродуктивных тканях растения. В другом варианте осуществления бактерии или популяция бактерий колонизируют плод или семенную ткань растения. В еще одном варианте осуществления бактерии или популяция бактерий способны колонизировать растение так, что они находятся на поверхности растения. В другом варианте осуществления бактерии или популяция бактерий способны к локализации по существу во всем растении или во всех тканях растения. В определенных вариантах осуществления бактерии или популяция бактерий не локализованы в корне растения. В других случаях бактерии и популяции бактерий не локализованы в фотосинтезирующих тканях растения.

[0275] Эффективность бактериальных композиций, наносимых на сельскохозяйственные культуры можно оценивать, определяя различные свойства роста сельскохозяйственной культуры, включая в качестве неограничивающих примеров норму высева, мощность посева, силу корня, засухоустойчивость, высоту растения, сухую и тестовую массу.

Виды растений

[0276] Способы и бактерии, описываемые в настоящем документе, подходят для любого из множества растений, таких как растения родов Hordeum, Oryza, Zea и Triticeae. Другие неограничивающие примеры подходящих растений включают мхи, лишайники и водоросли. В некоторых случаях растения имеют экономическое, социальное и/или природоохранное значение, являясь продовольственными культурами, волокнистыми сельскохозяйственными культурами, масличными культурами, растениями, используемыми в лесной или целлюлозно-бумажной промышленности, сырьем для получения биотоплива и/или декоративными растениями. В определенных примерах растения можно использовать для продукции экономически значимых продуктов, таких как зерно, мука тонкого помола, крахмал, сироп, мука грубого помола, масло, пленка, упаковка, биологические добавки, волокнистая масса, корм для животных, корм для рыб, материал основы для промышленных химикатов, хлебопродукты, обработанный пищевой продукт для человека, сахар, спирт и/или белок. Неограничивающие примеры сельскохозяйственных культур включают кукурузу, рис, пшеницу, ячмень, сорго, просо, овес, рожь тритикале, гречиху, сахарную кукурузу, сахарный тростник, репчатый лук, томаты, клубнику и спаржу.

[0277] В определенных примерах растения, которые можно получать или улучшать способами и композициями, описываемыми в настоящем документе, может включать растения, которые являются важными или представляют интерес для сельского хозяйства, садоводства, биомассы для получения молекул биотоплива и других химических веществ, и/или для лесоводства. Определенные примеры этих растений могут включать ананас, банан, кокос, лилии, травяной горох и травы; и двудольные растения, такие как, например, горох, люцерна, физалис, дыня, нут, цикорий, клевер, кочанную капусту, чечевицу, сою, табак, картофель, батат, редис, огородную капусту, рапс, яблоневые деревья, виноград, хлопок, подсолнечник, арабидопсис, канолу, цитрусовые (включая апельсин, мандарин, кумкват, лимон, лайм, грейпфрут, тангерин, танжело, цитрон и помело), перец, фасоль и латук, Panicum virgatum (кисть), Sorghum bicolor (сорго, Судан), Miscanthus giganteus (мискантус), вид Saccharum (сахарный тростник), Populus balsamifera (тополь), Zea mays (кукуруза), Glycine max (соя), Brassica napus (канола), Triticum aestivum (пшеница), Gossypium hirsutum (хлопок), Oryza sativa (рис), Helianthus annuus (подсолнечник), Medicago sativa (люцерна), Beta vulgaris (сахарная свекла), Pennisetum glaucum (просо американское), виды Panicum виды Sorghum, виды Miscanthus, виды Saccharum, виды Erianthus, виды Populus, Secale cereale (рожь), виды Salix (верба), виды Eucalyptus (эвкалипт), виды Triticosecale (пшеница - 25 пшеница X рожь), Bamboo, Carthamus tinctorius (сафлор), Jatropha curcas (ятрофа), Ricinus communis (клещевина), Elaeis guineensis (масличная пальма), Phoenix dactylifera (финиковая пальма), Archontophoenix cunninghamiana (королевская пальма), Syagrus romanzoffiana (арекаструм), Linum usitatissimum (лен), Brassica juncea, Manihot esculenta (маниок), Lycopersicon esculentum (томат), Lactuca saliva (латук), Musa paradisiaca (банан), Solanum tuberosum (картофель), Brassica oleracea (брокколи, цветная капуста, брюссельская капуста), Camellia sinensis (чай), Fragaria ananassa (клубника), Theobroma cacao (какао), Coffea arabica (кофе), Vitis vinifera (виноград), Ananas comosus (ананас), Capsicum annum (острый и сладкий перец), Allium cepa (лук), Cucumis melo (дыня), Cucumis sativus (огурец), Cucurbita maxima (тыква), Cucurbita moschata (тыква), Spinacea oleracea (шпинат), Citrullus lanatus (арбуз), Abelmoschus esculentus (окра), Solanum melongena (баклажан), Papaver somniferum (опиумный мак), Papaver orientale, Taxus baccata, Taxus brevifolia, Artemisia annua, Cannabis saliva, Camptotheca acuminate, Catharanthus roseus, Vinca rosea, Cinchona officinalis, Coichicum autumnale, Veratrum californica, Digitalis lanata, Digitalis purpurea, виды Dioscorea 5, Andrographis paniculata, Atropa belladonna, Datura stomonium, виды Berberis, виды Cephalotaxus, Ephedra sinica, виды Ephedra, Erythroxylum coca, Galanthus wornorii, виды Scopolia, Lycopodium serratum (Huperzia serrata), виды Lycopodium, Rauwolfia serpentina, виды Rauwolfia, Sanguinaria canadensis, виды Hyoscyamus, Calendula officinalis, Chrysanthemum parthenium, Coleus forskohlii, Tanacetum parthenium, Parthenium argentatum (гваюла), виды Hevea (каучук), Mentha spicata (мята), Mentha piperita (мята), Bixa orellana, виды Alstroemeria, виды Rosa (роза), Dianthus caryophyllus (гвоздика), виды Petunia (петуния), Poinsettia pulcherrima (пуанзеция), Nicotiana tabacum (табак), Lupinus albus (люпин), Uniola paniculata (овес), Hordeum vulgare (ячмень) и виды Lolium (рожь).

[0278] В определенных примерах можно использовать однодольное растение. Однодольные растения принадлежат к порядкам Alismatales, Arales, Arecales, Bromeliales, Commelinales, Cyclanthales, Cyperales, Eriocaulales, Hydrocharitales, Juncales, Lilliales, Najadales, Orchidales, Pandanales, Poales, Restionales, Triuridales, Typhales, и Zingiberales. Растения, принадлежащие к классу Gymnospermae, представляют собой Cycadales, Ginkgoales, Gnetales и Pinales. В определенных примерах однодольное растение можно выбирать из группы, состоящей из кукурузы, риса, пшеницы, ячменя и сахарного тростника.

[0279] В определенных примерах можно использовать двудольное растение, включая растения, принадлежащие порядкам Aristochiales, Asterales, Batales, Campanulales, Capparales, Caryophyllales, Casuarinales, Celastrales, Cornales, Diapensales, Dilleniales, Dipsacales, Ebenales, Ericales, Eucomiales, Euphorbiales, Fabales, Fagales, Gentianales, Geraniales, Haloragales, Hamamelidales, Middles, Juglandales, Lamiales, Laurales, Lecythidales, Leitneriales, Magniolales, Malvales, Myricales, Myrtales, Nymphaeales, Papeverales, Piperales, Plantaginales, Plumb aginales, Podostemales, Polemoniales, Polygalales, Polygonales, Primulales, Proteales, Rafflesiales, Ranunculales, Rhamnales, Rosales, Rubiales, Salicales, Santales, Sapindales, Sarraceniaceae, Scrophulariales, Theales, Trochodendrales, Umbellales, Urticales и Violates. В определенных примерах двудольное растение можно выбирать из группы, состоящей из хлопка, сои, перца и томата.

[0280] В некоторых случаях улучшаемое растение трудно поддается экспериментальным условиям. Например, может пройти слишком много времени для достаточного роста сельскохозяйственной культуры, чтобы практически последовательно оценить улучшенный признак в нескольких повторениях. Таким образом, первое растение, из которого исходно выделяют бактерии, и/или множество растений, для которых применяют генетически модифицированные бактерии, могут представлять собой модельные растения, такие как растение, более поддающиеся анализу в требуемых условиях. Неограничивающие примеры модельных растений включают Setaria, Brachypodium и Arabidopsis. Способность бактерий, выделяемых способом по настоящему изобретению с использованием модельного растения, затем для подтверждения приобретения улучшенного признака можно применять для растений другого типа (например, сельскохозяйственной культуры).

[0281] Признаки, которые можно улучшать способами, описываемыми в настоящем документе, включают любые наблюдаемые характеристики растения, включая, например, скорость роста, рост, массу, цвет, вкус, запах, изменения продукции растением одного или нескольких соединений (включая например, метаболиты, белки, лекарственные средства, углеводы, масла и любые другие соединения). Также предусмотрен отбор растений на основе генотипической информации (например, включая профиль экспрессии генов растения в ответ на бактерии или идентификацию присутствия генетических маркеров, таких как генетические маркеры, ассоциированные с увеличенной фиксацией азота). Растения в противоположность присутствию определенного свойства или признака (таких как требуемые свойство или признак) также можно выбирать на основе отсутствия, подавления или ингибирования определенного свойства или признака (таких как нежелательные свойство или признак).

Концентрации и уровни применения сельскохозяйственных композиций

[0282] Как указано выше, сельскохозяйственные композиции по настоящему изобретению, которые содержат указанные микроорганизмы, можно наносить на растения множеством способов. В двух конкретных аспектах по изобретению предусмотрена обработка в бороздах или пропитка для семян.

[0283] Для варианты осуществления с пропиткой для семян микроорганизмы по изобретению могут находиться на семенах во множестве концентраций. Например, микроорганизмы в пропитке для семян могут присутствовать с концентрацией КОЕ на семя: 1×10¹, 1×10², 1×10³, 1×10⁴, 1×10⁵, 1×10⁶, 1×10⁷, 1×10⁸, 1×10⁹, 1×10¹⁰ или более. В конкретных аспектах пропитка для семян композиции содержат приблизительно от 1×10⁴ до приблизительно 1×10⁸ КОЕ на семя. В других конкретных аспектах композиция пропитки для семян содержит приблизительно от 1×10⁵ до приблизительно 1×10⁷ КОЕ на семя. В других аспектах композиция пропитки для семян содержат приблизительно 1×10⁶ КОЕ на семя.

[0284] В Соединенных Штатах Америки приблизительно 10% площади посева кукурузы засажено при плотности семян более чем приблизительно 36000 семян на акр; 1/3 площади посева кукурузы засажено при плотности семян приблизительно от 33000 до 36000 семян на акр; 1/3 площади посева кукурузы засажено при плотности семян приблизительно от 30000 до 33000 семян на акр, и оставшаяся часть площади является переменной. См., "Corn Seeding Rate Considerations", написанную Steve Butzen, доступную на https://www.pioneer.com/home/site/us/agronomy/library/corn-seeding-rate-considerations/

[0285] В таблице B ниже использованы различные концентрации КОЕ на семя в предусмотренном варианте осуществления пропитки для семян (поперечные ряды) и различные плотности посадки посевных площадей (1 колонка: 15K-41K) с расчетом общего количества КОЕ на акр, которое можно использовать в различных сельскохозяйственных условиях (т.е. концентрация пропитки для семян на семя × плотность посадки семян на акр). Таким образом, если использовать пропитка для семян с 1×10⁶ КОЕ на семя и высаживать 30000 семян на акр, то общее содержание КОЕ на акр будет составлять 3×10¹⁰ (т.е. 30K × 1×10⁶).

Таблица B: Расчет общего количества КОЕ на акр для вариантов осуществления пропитки для семян

Популяция кукурузы (т.е. семян на акр) 1,00E+02 1,00E+03 1,00E+04 1,00E+05 1,00E+06 1,00E+07 1,00E+08 1,00E+09 15000 1,50E+06 1,50E+07 1,50E+08 1,50E+09 1,50E+10 1,50E+11 1,50E+12 1,50E+13 16000 1,60E+06 1,60E+07 1,60E+08 1,60E+09 1,60E+10 1,60E+11 1,60E+12 1,60E+13 17000 1,70E+06 1,70E+07 1,70E+08 1,70E+09 1,70E+10 1,70E+11 1,70E+12 1,70E+13 18000 1,80E+06 1,80E+07 1,80E+08 1,80E+09 1,80E+10 1,80E+11 1,80E+12 1,80E+13 19000 1,90E+06 1,90E+07 1,90E+08 1,90E+09 1,90E+10 1,90E+11 1,90E+12 1,90E+13 20000 2,00E+06 2,00E+07 2,00E+08 2,00E+09 2,00E+10 2,00E+11 2,00E+12 2,00E+13 21000 2,10E+06 2,10E+07 2,10E+08 2,10E+09 2,10E+10 2,10E+11 2,10E+12 2,10E+13 22000 2,20E+06 2,20E+07 2,20E+08 2,20E+09 2,20E+10 2,20E+11 2,20E+12 2,20E+13 23000 2,30E+06 2,30E+07 2,30E+08 2,30E+09 2,30E+10 2,30E+11 2,30E+12 2,30E+13 24000 2,40E+06 2,40E+07 2,40E+08 2,40E+09 2,40E+10 2,40E+11 2,40E+12 2,40E+13 25000 2,50E+06 2,50E+07 2,50E+08 2,50E+09 2,50E+10 2,50E+11 2,50E+12 2,50E+13 26000 2,60E+06 2,60E+07 2,60E+08 2,60E+09 2,60E+10 2,60E+11 2,60E+12 2,60E+13 27000 2,70E+06 2,70E+07 2,70E+08 2,70E+09 2,70E+10 2,70E+11 2,70E+12 2,70E+13 28000 2,80E+06 2,80E+07 2,80E+08 2,80E+09 2,80E+10 2,80E+11 2,80E+12 2,80E+13 29000 2,90E+06 2,90E+07 2,90E+08 2,90E+09 2,90E+10 2,90E+11 2,90E+12 2,90E+13 30000 3,00E+06 3,00E+07 3,00E+08 3,00E+09 3,00E+10 3,00E+11 3,00E+12 3,00E+13 31000 3,10E+06 3,10E+07 3,10E+08 3,10E+09 3,10E+10 3,10E+11 3,10E+12 3,10E+13 32000 3,20E+06 3,20E+07 3,20E+08 3,20E+09 3,20E+10 3,20E+11 3,20E+12 3,20E+13 33000 3,30E+06 3,30E+07 3,30E+08 3,30E+09 3,30E+10 3,30E+11 3,30E+12 3,30E+13 34000 3,40E+06 3,40E+07 3,40E+08 3,40E+09 3,40E+10 3,40E+11 3,40E+12 3,40E+13 35000 3,50E+06 3,50E+07 3,50E+08 3,50E+09 3,50E+10 3,50E+11 3,50E+12 3,50E+13 36000 3,60E+06 3,60E+07 3,60E+08 3,60E+09 3,60E+10 3,60E+11 3,60E+12 3,60E+13 37000 3,70E+06 3,70E+07 3,70E+08 3,70E+09 3,70E+10 3,70E+11 3,70E+12 3,70E+13 38000 3,80E+06 3,80E+07 3,80E+08 3,80E+09 3,80E+10 3,80E+11 3,80E+12 3,80E+13 39000 3,90E+06 3,90E+07 3,90E+08 3,90E+09 3,90E+10 3,90E+11 3,90E+12 3,90E+13 40000 4,00E+06 4,00E+07 4,00E+08 4,00E+09 4,00E+10 4,00E+11 4,00E+12 4,00E+13 41000 4,10E+06 4,10E+07 4,10E+08 4,10E+09 4,10E+10 4,10E+11 4,10E+12 4,10E+13

[0286] Для вариантов осуществления обработки в борозде микроорганизмы по изобретению можно наносить с концентрацией КОЕ на акр: 1×10⁶, 3,20×10¹⁰, 1,60×10¹¹, 3,20×10¹¹, 8,0×10¹¹, 1,6×10¹², 3,20×10¹² или более. Таким образом, в определенных аспектах жидкие композиции для обработки в борозде можно наносить с концентрацией приблизительно от 1×10⁶ до приблизительно 3×10¹² КОЕ на акр.

[0287] В определенных аспектах композиции для обработки в борозде содержатся в жидком составе. В вариантах осуществления для обработке жидкостью в борозде микроорганизмы могут находиться в концентрации КОЕ в миллилитре: 1×10¹, 1×10², 1×10³, 1×10⁴, 1×10⁵, 1×10⁶, 1×10⁷, 1×10⁸, 1×10⁹, 1×10¹⁰, 1×10¹¹, 1×10¹², 1×10¹³ или более. В определенных аспектах жидкие композиции для обработке в борозде содержат микроорганизмы в концентрации приблизительно от 1×10⁶ до приблизительно 1×10¹¹ КОЕ в миллилитре. В других аспектах жидкие композиции для обработке в борозде содержат микроорганизмы в концентрации приблизительно от 1×10⁷ до приблизительно 1×10¹⁰ КОЕ в миллилитре. В других аспектах жидкие композиции для обработке в борозде содержат микроорганизмы в концентрации приблизительно от 1×10⁸ до приблизительно 1×10⁹ КОЕ в миллилитре. В других аспектах жидкие композиции для обработке в борозде содержат микроорганизмы в концентрации приблизительно до 1×10¹³ КОЕ в миллилитре.

ПРИМЕРЫ

[0288] В примерах, предоставляемых в настоящем документе, описаны способы выделения бактерий, анализа бактерий и растений и улучшения признаков растений. Примеры приведены исключительно с иллюстративными целями, и их не следует рассматривать, как каким-либо образом ограничивающие.

Пример 1: Выделение микроорганизмов из ткани растения

[0289] В различных сельскохозяйственных районах центральной Калифорнии получали верхние слои почвы. Получали двадцать почв с различными структурными характеристиками, включая плотную глину, торфяной суглинок, илистую глину и суглинок. Семена различных полевых кукурузы, сахарной кукурузы, старой негибридной кукурузу и томата высаживали в каждую почву, как представлено в таблице 1.

Тип сельскохозяйственной культуры Полевая кукуруза Сахарная кукуруза Старая негибридная кукуруза Томат Сорта Mo17 Ferry-Morse "Golden Cross Bantam T-51" Victory Seeds "Moseby Prolific" Ferry-Morse Roma VF B73 Ferry-Morse "Silver Queen Hybrid" Victory Seeds "Reid's Yellow Dent" Stover Roma DKC 66-40 Ferry-Morse "Sugar Dots" Victory Seeds "Hickory King" Totally Tomatoes "Micro Tom Hybrid" DKC 67-07 Heinz 1015 DKC 70-01 Heinz 2401 Heinz 3402 Heinz 5508 Heinz 5608 Heinz 8504

Таблица 1: Типы и сорта сельскохозяйственных культур, высаживаемых в почвы с различными характеристиками

[0290] Растения выкорчевывали через 2-4 недели роста и избыток почвы на поверхностях корней удаляли деионизированной водой. После удаления почвы у растений стерилизовали поверхность побелкой и интенсивно промывали в стерильной воде. Из растения вырезали 1 см участка очищенного корня и помещали в фосфатно-солевой буфер, содержащий 3 мм стальные гранулы. Посредством интенсивного перемешивания раствора на Qiagen TissueLyser II получали взвесь.

[0291] Взвесь корня и солевого раствора разбавляли и инокулировали на различные типы сред для выращивания для выделения ризосферных, эндофитных, эпифитных и других ассоциированных с растениями микроорганизмов. Для получения единичных колоний использовали агарозные среды R2A и Nfb, а для получения популяций фиксирующих азот бактерий использовали полутвердые скошенные среды Nfb. Через 2-4 недели инкубации в полутвердых скошенных средах Nfb популяции микроорганизмов собирали и штрихами наносили на агар R2A для получения единичных колоний, как показано на фигуре 1A-B. Единичные колонии ресуспендировали в смеси R2A и глицерина, подвергали анализу ПЦР и замораживали при -80°C для дальнейшего анализа. Получали приблизительно 1000 единичных колоний и обозначали как "выделенные микроорганизмы".

[0292] Затем изоляты подвергали скринингу колоний посредством ПЦР с детекцией присутствия генов nifH для идентификации диазотрофов. Для анализа присутствия кластера nif в каждом изоляте использовали ранее описанный набор праймеров Ueda 19F/388R, для которого показано, что посредством него при скринингах детектируют более 90% диазотрофов (Ueda et al. 1995; J. Bacteriol. 177: 1414-1417). Накалывали единичные колонии выделенных изолятов, ресуспендировали в PBS и использовали в качестве матрицы для ПЦР колоний, как представлено на фигуре 2. Колонии изолятов, для которых получали положительные полосы при ПЦР повторно высевали штрихом, и дважды повторяли ПЦР колоний и повторное высевание штрихом для предотвращения ложно-положительной идентификации диазотрофов. Затем выделенные изоляты обозначали как "микроорганизмы-кандидаты".

Пример 2: Характеристика выделенных микроорганизмов

Секвенирование, анализ и филогенетическая характеристика

[0293] Для получения предварительных филогенетических идентификационных характеристик выделенных микроорганизмов и микроорганизмов-кандидатов использовали секвенирование 16S рДНК с набором праймеров 515f-806r (см. например, Vernon et al.; BMC Microbiol. 2002 Dec 23;2:39.). Микроорганизмы содержали различные рода, включая: Enterobacter, Burkholderia, Klebsiella, Bradyrhizobium, Rahnella, Xanthomonas, Raoultella, Pantoea, Pseudomonas, Brevundimonas, Agrobacterium и Paenibacillus, как представлено в таблице 2.

Род Изоляты Род Изоляты Achromobacter 7 Paenibacillus 1 Agrobacterium 117 Paenisporosarcina 3 Agromyces 1 Pantoea 14 Alicyclobacillus 1 Pedobacter 16 Asticcacaulis 6 Pimelobacter 2 Bacillus 131 Pseudomonas 212 Bradyrhizobium 2 Rhizobium 4 Brevibacillus 2 Rhodoferax 1 Burkholderia 2 Sphingobacterium 13 Caulobacter 17 Sphingobium 23 Chryseobacterium 42 Sphingomonas 3 Comamonas 1 Sphingopyxis 1 Dyadobacter 2 Stenotrophomonas 59 Flavobacterium 46 Streptococcus 3 Halomonas 3 Variovorax 37 Leptothrix 3 Xylanimicrobium 1 Lysobacter 2 неидентифицированный 75 Neisseria 13

Таблица 2: Разнообразие микроорганизмов, выделяемых из растений томата, как определено посредством глубокого секвенирования 16S рДНК.

[0294] Затем геномы 39 микроорганизмов-кандидатов секвенировали с использованием платформы Illumina Miseq. Геномную ДНК из чистых культур выделяли с использованием мини-набора для ДНК QIAmp (QIAGEN), а библиотеки тотальной ДНК для секвенирования получали у независимого поставщика (SeqMatic, Hayward). Затем проводили сборку генома посредством конвейера A5 (Tritt et al., 2012; PLoS One 7(9):e42304). Проводили идентификацию и аннотацию генов, и гены, связанные с регуляцией и проявлением фиксации азота отмечали в качестве мишеней мутагенеза.

Транскриптомное профилирование микроорганизмов-кандидатов

[0295] Для идентификации промоторов, которые активны в присутствии азота окружающей среды, проводили транскриптомное профилирование штамма CI010. Штамм CI010 культивировали в определенной среде без азота, дополненной 10 мМ глутамином. Из этих культур выделяли тотальную РНК (набор QIAGEN RNeasy) и подвергали секвенированию RNAseq посредством HiSeq Illumina (SeqMatic, Fremont CA). Прочтения секвенирования картировали на данные генома CI010 с использованием Geneious и идентифицировали высокоэкспрессированные гены под контролем проксимальных промоторов транскрипции.

[0296] В таблицах 3A-C перечислены гены и их относительные уровни экспрессии, определяемые посредством секвенирования RNAseq тотальной РНК. Последовательности проксимальных промоторов регистрировали для применения в мутагенезе метаболических путей nif, метаболических путей, связанных с утилизацией азота, или других генов с требуемым уровнем экспрессии.

Таблица 3A

Название Минимум Максимум Длина Направление CDS липопротеина муреина 2929898 2930134 237 прямое CDS мембранного белка 5217517 5217843 327 прямое CDS цинк/кадмий-связывающего белка 3479979 3480626 648 прямое CDS белок-носителя ацилов 4563344 4563580 237 обратное CDS ompX 4251002 4251514 513 прямое CDS ДНК-связывающего белка HU-бета 375,156 375,428 273 прямое CDS sspA 629,998 630,636 639 обратное CDS tatE 3199435 3199638 204 обратное CDS репрессора LexA 1850457 1851065 609 прямое CDS hisS <3999979 4001223 >1245 прямое

Таблица 3B

Название абсолютная надежность дифференциальной экспрессии Отношение дифференциальной экспрессии RNAseq_nifL - Общее количество прочтений RNAseq_nifL - Общее количество транскриптов RNAseq_WT - Общее количество прочтений RNAseq_WT - Общее количество транскриптов CDS липопротеина муреина 1000 -1,8 12950,5 10078,9 5151,5 4106,8 CDS мембранного белка 1000 -1,3 9522,5 5371,3 5400 3120 CDS цинк/кадмий-связывающего белка 3,3 1,1 6461 1839,1 5318 1550,6 CDS белок-носителя ацилов 25,6 1,6 1230,5 957,6 1473,5 1174,7 CDS ompX 1,7 1,1 2042 734,2 1687,5 621,5 CDS ДНК-связывающего белка HU-бета 6,9 -1,3 1305 881,7 725 501,8 CDS sspA 0,2 1 654 188,8 504,5 149,2 CDS tatE 1,4 1,3 131 118,4 125 115,8 CDS репрессора LexA 0,1 -1,1 248 75,1 164 50,9 CDS hisS 0 -1,1 467 69,2 325 49,3

Таблица 3С

Таблица штаммов

Сорт Первое указание Текущее название Универсальное название Линия Описание мутантной ДНК Генотип Мутация гена 1 Мутация гена 2 1 Текст заявки CI006 CI006 Штамм, выделенный из родов Enterobacter Нет WT 2 Текст заявки CI008 CI008 Штамм, выделенный из родов Burkholderia Нет WT 3 Текст заявки CI010 CI010 Штамм, выделенный из родов Klebsiella Нет WT 4 Текст заявки CI019 CI019 Штамм, выделенный из родов Rahnella Нет WT 5 Текст заявки CI028 CI028 Штамм, выделенный из родов Enterobacter Нет WT 6 Текст заявки CI050 CI050 Штамм, выделенный из родов Klebsiella Нет WT 7 Текст заявки CM002 CM002 Мутант CI050 Разрушение гена nifL экспрессирующей кассетой устойчивости к канамицину (KanR), кодирующей встроенный ген aph1 аминогликозид-O-фосфотрансферазы. ΔnifL::KanR SEQ ID NO:33 8 Текст заявки CM011 CM011 Мутант CI019 Разрушение гена nifL экспрессирующей кассетой устойчивости к спектиномицину (SpecR), кодирующей встроенный ген aadA стрептомицин-3''-O-аденилаттрансферазы. ΔnifL::SpecR SEQ ID NO:34 9 Текст заявки CM013 CM013 Мутант CI006 Разрушение гена nifL экспрессирующей кассетой устойчивости к канамицину (KanR), кодирующей встроенный ген aph1 аминогликозид-O-фосфотрансферазы. ΔnifL::KanR SEQ ID NO:35 10 фигура 4A CM004 CM004 Мутант CI010 Разрушение гена amtB экспрессирующей кассетой устойчивости к канамицину (KanR), кодирующей встроенный ген aph1 аминогликозид-O-фосфотрансферазы. ΔamtB::KanR SEQ ID NO:36 11 фигура 4A CM005 CM005 Мутант CI010 Разрушение гена nifL экспрессирующей кассетой устойчивости к канамицину (KanR), кодирующей встроенный ген aph1 аминогликозид-O-фосфотрансферазы. ΔnifL::KanR SEQ ID NO:37 12 фигура 4B CM015 CM015 Мутант CI006 Разрушение гена nifL встроенным фрагментом области выше гена ompX (Prm5). ΔnifL::Prm5 SEQ ID NO:38 13 фигура 4B CM021 CM021 Мутант CI006 Разрушение гена nifL встроенным фрагментом области выше неаннотированного гена и первых 73 п.н. этого гена (Prm2). ΔnifL::Prm2 SEQ ID NO:39 14 фигура 4B CM023 CM023 Мутант CI006 Разрушение гена nifL встроенным фрагментом области выше гена acpP и первых 121 п.н. гена acpP (Prm4). ΔnifL::Prm4 SEQ ID NO:40 15 фигура 10A CM014 CM014 Мутант CI006 Разрушение гена nifL встроенным фрагментом области выше гена lpp и первых 29 п.н. гена lpp (Prm1). ΔnifL::Prm1 SEQ ID NO:41 16 фигура 10A CM016 CM016 Мутант CI006 Разрушение гена nifL встроенным фрагментом области выше гена lexA 3 и первых 21 п.н. гена lexA 3 (Prm9). ΔnifL::Prm9 SEQ ID NO:42 17 фигура 10A CM022 CM022 Мутант CI006 Разрушение гена nifL встроенным фрагментом области выше гена mntP 1 и первых 53 п.н. гена mntP 1 (Prm3). ΔnifL::Prm3 SEQ ID NO:43 18 фигура 10A CM024 CM024 Мутант CI006 Разрушение гена nifL встроенным фрагментом области выше гена sspA (Prm7). ΔnifL::Prm7 SEQ ID NO:44 19 фигура 10A CM025 CM025 Мутант CI006 Разрушение гена nifL встроенным фрагментом области выше гена hisS и первых 52 п.н. гена hisS (Prm10). ΔnifL::Prm10 SEQ ID NO:45 20 фигура 10B CM006 CM006 Мутант CI010 Разрушение гена glnB экспрессирующей кассетой устойчивости к канамицину (KanR), кодирующей встроенный ген aph1 аминогликозид-O-фосфотрансферазы. ΔglnB::KanR SEQ ID NO:46 21 фигура 10C CI028 nifL:KanR CM017 Мутант CI028 Разрушение гена nifL экспрессирующей кассетой устойчивости к канамицину (KanR), кодирующей встроенный ген aph1 аминогликозид-O-фосфотрансферазы. ΔnifL::KanR SEQ ID NO:47 22 фигура 10C CI019 nifL:SpecR CM011 Мутант CI019 Разрушение гена nifL экспрессирующей кассетой устойчивости к спектиномицину (SpecR), кодирующей встроенный ген aadA стрептомицин-3''-O-аденилаттрансферазы. ΔnifL::SpecR SEQ ID NO:48 23 фигура 10C CI006 nifL:KanR CM013 Мутант CI006 Разрушение гена nifL экспрессирующей кассетой устойчивости к канамицину (KanR), кодирующей встроенный ген aph1 аминогликозид-O-фосфотрансферазы. ΔnifL::KanR SEQ ID NO:49 24 фигура 10C CI010 nifL:KanR CM005 Мутант CI010 Разрушение гена nifL экспрессирующей кассетой устойчивости к канамицину (KanR), кодирующей встроенный ген aph1 аминогликозид-O-фосфотрансферазы. ΔnifL::KanR SEQ ID NO:50 25 фигура 4C Штамм 2 CI006 Штамм, выделенный из родов Enterobacter Нет WT 26 фигура 4C Штамм 4 CI010 Штамм, выделенный из родов Klebsiella Нет WT 27 фигура 4C Штамм 1 CI019 Штамм, выделенный из родов Rahnella Нет WT 28 фигура 4C Штамм 3 CI028 Штамм, выделенный из родов Enterobacter Нет WT 29 фигура 4B Штамм 2 CI006 Штамм, выделенный из родов Enterobacter Нет WT 30 фигура 4B High CM014 Мутант CI006 Разрушение гена nifL встроенным фрагментом области выше гена lpp и первых 29 п.н. гена lpp (Prm1) ΔnifL::Prm1 SEQ ID NO:51 31 фигура 4B Med CM015 Мутант CI006 Разрушение гена nifL встроенным фрагментом области выше гена ompX (Prm5). ΔnifL::Prm5 SEQ ID NO:52 32 фигура 4B Low CM023 Мутант CI006 Разрушение гена nifL встроенным фрагментом области выше гена acpP и первых 121 п.н. гена acpP (Prm4). ΔnifL::Prm4 SEQ ID NO:53 33 фигура 4D Штамм 2 CI006 Штамм, выделенный из родов Enterobacter Нет WT 34 фигура 4D Эволюционировавший CM029 Мутант CI006 Разрушение гена nifL встроенным фрагментом области выше гена ompX (Prm5) и делеция 1287 п.н. после старт-кодона гена glnE, содержащего аденилилудаляющий домен аденилаттрансферазы глутаминатаммиаклигазы (ΔglnE-AR_KO1). ΔnifL::Prm5 ΔglnE-AR_KO1 SEQ ID NO:54 SEQ ID NO:61 35 фигура 14C Дикий тип CI006 Штамм, выделенный из родов Enterobacter Нет WT 36 фигура 14C Эволюционировавший CM014 Мутант CI006 Разрушение гена nifL встроенным фрагментом области выше гена lpp и первых 29 п.н. гена lpp (Prm1) ΔnifL::Prm1 SEQ ID NO:55 37 фигура 14B Дикий тип CI019 Штамм, выделенный из родов Rahnella Нет WT 38 фигура 14B Эволюционировавший CM011 Мутант CI019 Разрушение гена nifL экспрессирующей кассетой устойчивости к спектиномицину (SpecR), кодирующей встроенный ген aadA стрептомицин-3''-O-аденилаттрансферазы. ΔnifL::SpecR SEQ ID NO:56 39 фигура 14A Эволюционировавший CM011 Мутант CI019 Разрушение гена nifL экспрессирующей кассетой устойчивости к спектиномицину (SpecR), кодирующей встроенный ген aadA стрептомицин-3''-O-аденилаттрансферазы. ΔnifL::SpecR SEQ ID NO:57 40 фигура 15A Дикий тип CI006 Штамм, выделенный из родов Enterobacter Нет WT 41 фигура 15A Эволюционировавший CM013 Мутант CI006 Разрушение гена nifL экспрессирующей кассетой устойчивости к канамицину (KanR), кодирующей встроенный ген aph1 аминогликозид-O-фосфотрансферазы. ΔnifL::KanR SEQ ID NO:58 42 фигура 15B Без названия CM011 Мутант CI019 Разрушение гена nifL экспрессирующей кассетой устойчивости к спектиномицину (SpecR), кодирующей встроенный ген aadA стрептомицин-3''-O-аденилаттрансферазы. ΔnifL::SpecR SEQ ID NO:59 43 фигура 16B Штамм 5 CI008 Штамм, выделенный из родов Burkholderia Нет WT 44 фигура 16B Штамм 1 CM011 Мутант CI019 Разрушение гена nifL экспрессирующей кассетой устойчивости к спектиномицину (SpecR), кодирующей встроенный ген aadA стрептомицин-3''-O-аденилаттрансферазы. ΔnifL::SpecR SEQ ID NO:60

Таблица последовательностей штаммов

SEQ ID NO: Последовательность 33 ATGAGCCATATTCAACGGGAAACGTCTTGCTCCAGGCCGCGATTAAATTCCAACATGGATGCTGATTTATATGGGTATAAATGGGCTCGCGATAATGTCGGGCAATCAGGTGCGACAATCTATCGATTGTATGGGAAGCCCGATGCGCCAGAGTTGTTTCTGAAACATGGCAAAGGTAGCGTTGCCAATGATGTTACAGATGAGATGGTCAGACTAAACTGGCTGACGGAATTTATGCCTCTTCCGACCATCAAGCATTTTATCCGTACTCCTGATGATGCATGGTTACTCACCACTGCGATCCCCGGGAAAACAGCATTCCAGGTATTAGAAGAATATCCTGATTCAGGTGAAAATATTGTTGATGCGCTGGCAGTGTTCCTGCGCCGGTTGCATTCGATTCCTGTTTGTAATTGTCCTTTTAACAGCGATCGCGTATTTCGTCTCGCTCAGGCGCAATCACGAATGAATAACGGTTTGGTTGATGCGAGTGATTTTGATGACGAGCGTAATGGCTGGCCTGTTGAACAAGTCTGGAAAGAAATGCATAAGCTTTTGCCATTCTCACCGGATTCAGTCGTCACTCATGGTGATTTCTCACTTGATAACCTTATTTTTGACGAGGGGAAATTAATAGGTTGTATTGATGTTGGACGAGTCGGAATCGCAGACCGATACCAGGATCTTGCCATCCTATGGAACTGCCTCGGTGAGTTTTCTCCTTCATTACAGAAACGGCTTTTTCAAAAATATGGTATTGATAATCCTGATATGAATAAATTGCAGTTTCATTTGATGCTCGATGAGTTTTTCTAATAAGCCTGCCTGGTTCTGCGTTTCCCGCTCTTTAATACCCTGACCGGAGGTGAGCAATGA 34 ATGAGCATCACGGCGTTATCAGCATCATTTCCTGAGGGGAATATCGCCAGCCGCTTGTCGCTGCAACATCCTTCACTGTTTTATACCGTGGTTGAACAATCTTCGGTGGCGAGCGTGTTGAGTCATCCTGACTAGCTGAGATGAGGGCTCGCCCCCTCGTCCCGACACTTCCAGATCGCCATAGCGCACAGCGCCTCGAGCGGTGGTAACGGCGCAGTGGCGGTTTTCATGGCTTGTTATGACTGTTTTTTTGGGGTACAGTCTATGCCTCGGGCATCCAAGCAGCAAGCGCGTTACGCCGTGGGTCGATGTTTGATGTTATGGAGCAGCAACGATGTTACGCAGCAGGGCAGTCGCCCTAAAACAAAGTTAAACATCATGAGGGAAGCGGTGATCGCCGAAGTATCGACTCAACTATCAGAGGTAGTTGGCGTCATCGAGCGCCATCTCGAACCGACGTTGCTGGCCGTACATTTGTACGGCTCCGCAGTGGATGGCGGCCTGAAGCCACACAGTGATATTGATTTGCTGGTTACGGTGACCGTAAGGCTTGATGAAACAACGCGGCGAGCTTTGATCAACGACCTTTTGGAAACTTCGGCTTCCCCTGGAGAGAGCGAGATTCTCCGCGCTGTAGAAGTCACCATTGTTGTGCACGACGACATCATTCCGTGGCGTTATCCAGCTAAGCGCGAACTGCAATTTGGAGAATGGCAGCGCAATGACATTCTTGCAGGTATCTTCGAGCCAGCCACGATCGACATTGATCTGGCTATCTTGCTGACAAAAGCAAGAGAACATAGCGTTGCCTTGGTAGGTCCAGCGGCGGAGGAACTCTTTGATCCGGTTCCTGAACAGGATCTATTTGAGGCGCTAAATGAAACCTTAACGCTATGGAACTCGCCGCCCGACTGGGCTGGCGATGAGCGAAATGTAGTGCTTACGTTGTCCCGCATTTGGTACAGCGCAGTAACCGGCAAAATCGCGCCGAAGGATGTCGCTGCCGACTGGGCAATGGAGCGCCTGCCGGCCCAGTATCAGCCCGTCATACTTGAAGCTAGACAGGCTTATCTTGGACAAGAAGAAGATCGCTTGGCCTCGCGCGCAGATCAGTTGGAAGAATTTGTCCACTACGTGAAAGGCGAGATCACCAAGGTAGTCGGCAAATAATGTCTAACAATTCGTTCAAGCCGACGCCGCTTCGCGGCGCGGCTTAACTCAAGCGTTAGATGCACTAAGCACATAATTGCTCACAGCCAAACTATCAGGTCAAGTCTGCTTTTATTATTTTTAAGCGTGCATAATAAGCCCTACACAAATGGTACCCGACCGGTGGTGAATTTAATCTCGCTGACGTGTAGACATTCCCTTATCCAGACGCTGATCGCCCATCATCGCGGTTCTTTAGATCTCTCGGTCCGCCCTGATGGCGGCACCTTGCTGACGTTACGCCTGCCGGTACAGCAGGTTATCACCGGAGGCTTAAAATGA 35 CTGATCCTTCAACTCAGCAAAAGTTCGATTTATTCAACAAAGCCACGTTGTGTCTCAAAATCTCTGATGTTACATTGCACAAGATAAAAATATATCATCATGAACAATAAAACTGTCTGCTTACATAAACAGTAATACAAGGGGTGTTATGAGCCATATTCAACGGGAAACGTCTTGCTCCAGGCCGCGATTAAATTCCAACATGGATGCTGATTTATATGGGTATAAATGGGCTCGCGATAATGTCGGGCAATCAGGTGCGACAATCTATCGATTGTATGGGAAGCCCGATGCGCCAGAGTTGTTTCTGAAACATGGCAAAGGTAGCGTTGCCAATGATGTTACAGATGAGATGGTCAGACTAAACTGGCTGACGGAATTTATGCCTCTTCCGACCATCAAGCATTTTATCCGTACTCCTGATGATGCATGGTTACTCACCACTGCGATCCCCGGGAAAACAGCATTCCAGGTATTAGAAGAATATCCTGATTCAGGTGAAAATATTGTTGATGCGCTGGCAGTGTTCCTGCGCCGGTTGCATTCGATTCCTGTTTGTAATTGTCCTTTTAACAGCGATCGCGTATTTCGTCTCGCTCAGGCGCAATCACGAATGAATAACGGTTTGGTTGATGCGAGTGATTTTGATGACGAGCGTAATGGCTGGCCTGTTGAACAAGTCTGGAAAGAAATGCATAAGCTTTTGCCATTCTCACCGGATTCAGTCGTCACTCATGGTGATTTCTCACTTGATAACCTTATTTTTGACGAGGGGAAATTAATAGGTTGTATTGATGTTGGACGAGTCGGAATCGCAGACCGATACCAGGATCTTGCCATCCTATGGAACTGCCTCGGTGAGTTTTCTCCTTCATTACAGAAACGGCTTTTTCAAAAATATGGTATTGATAATCCTGATATGAATAAATTGCAGTTTCATTTGATGCTCGATGAGTTTTTCTAATAAGCCTTGACCCTACGATTCCCGCTATTTCATTCACTGACCGGAGGTTCAAAATGA 36 ATGAAGATAGCAACAATGAAAACAGGTCTGGGAGCGTTGGCTCTTCTTCCCTGATCCTTCAACTCAGCAAAAGTTCGATTTATTCAACAAAGCCACGTTGTGTCTCAAAATCTCTGATGTTACATTGCACAAGATAAAAATATATCATCATGAACAATAAAACTGTCTGCTTACATAAACAGTAATACAAGGGGTGTTATGAGCCATATTCAACGGGAAACGTCTTGCTCCCGTCCGCGCTTAAACTCCAACATGGACGCTGATTTATATGGGTATAAATGGGCTCGCGATAATGTCGGGCAATCAGGTGCGACAATCTATCGCTTGTATGGGAAGCCCGATGCGCCAGAGTTGTTTCTGAAACATGGCAAAGGTAGCGTTGCCAATGATGTTACAGATGAGATGGTCCGTCTCAACTGGCTGACGGAGTTTATGCCTCTCCCGACCATCAAGCATTTTATCCGTACTCCTGATGATGCGTGGTTACTCACCACCGCGATTCCTGGGAAAACAGCCTTCCAGGTATTAGAAGAATATCCTGATTCAGGTGAAAATATTGTTGATGCGCTGGCCGTGTTCCTGCGCCGGTTACATTCGATTCCTGTTTGTAATTGTCCTTTTAACAGCGATCGTGTATTTCGTCTTGCTCAGGCGCAATCACGCATGAATAACGGTTTGGTTGATGCGAGTGATTTTGATGACGAGCGTAATGGCTGGCCTGTTGAACAAGTCTGGAAAGAAATGCACAAGCTCTTGCCATTCTCACCGGATTCAGTCGTCACTCATGGTGATTTCTCACTTGATAACCTTATTTTTGACGAGGGGAAATTAATAGGTTGTATTGATGTTGGACGGGTCGGAATCGCAGACCGTTACCAGGACCTTGCCATTCTTTGGAACTGCCTCGGTGAGTTTTCTCCTTCATTACAGAAACGGCTTTTTCAAAAATATGGTATTGATAATCCTGATATGAATAAATTGCAGTTTCATTTGATGCTCGATGAGTTTTTCTAATAAGCCTGTGAAGGGCTGGACGTAAACAGCCACGGCGAAAACGCCTACAACGCCTGA 37 ATGACCCTGAATATGATGCTCGATAACGCCGTACCCGAGGCGATTGCCGGCTGATCCTTCAACTCAGCAAAAGTTCGATTTATTCAACAAAGCCACGTTGTGTCTCAAAATCTCTGATGTTACATTGCACAAGATAAAAATATATCATCATGAACAATAAAACTGTCTGCTTACATAAACAGTAATACAAGGGGTGTTATGAGCCATATTCAACGGGAAACGTCTTGCTCCCGTCCGCGCTTAAACTCCAACATGGACGCTGATTTATATGGGTATAAATGGGCTCGCGATAATGTCGGGCAATCAGGTGCGACAATCTATCGCTTGTATGGGAAGCCCGATGCGCCAGAGTTGTTTCTGAAACATGGCAAAGGTAGCGTTGCCAATGATGTTACAGATGAGATGGTCCGTCTCAACTGGCTGACGGAGTTTATGCCTCTCCCGACCATCAAGCATTTTATCCGTACTCCTGATGATGCGTGGTTACTCACCACCGCGATTCCTGGGAAAACAGCCTTCCAGGTATTAGAAGAATATCCTGATTCAGGTGAAAATATTGTTGATGCGCTGGCCGTGTTCCTGCGCCGGTTACATTCGATTCCTGTTTGTAATTGTCCTTTTAACAGCGATCGTGTATTTCGTCTTGCTCAGGCGCAATCACGCATGAATAACGGTTTGGTTGATGCGAGTGATTTTGATGACGAGCGTAATGGCTGGCCTGTTGAACAAGTCTGGAAAGAAATGCACAAGCTCTTGCCATTCTCACCGGATTCAGTCGTCACTCATGGTGATTTCTCACTTGATAACCTTATTTTTGACGAGGGGAAATTAATAGGTTGTATTGATGTTGGACGGGTCGGAATCGCAGACCGTTACCAGGACCTTGCCATTCTTTGGAACTGCCTCGGTGAGTTTTCTCCTTCATTACAGAAACGGCTTTTTCAAAAATATGGTATTGATAATCCTGATATGAATAAATTGCAGTTTCATTTGATGCTCGATGAGTTTTTCTAATAAGCCTTGGTTCTGCGTTTCCCGCTCTTTAATACCCTGACCGGAGGTGAGCAATGA 38 ATGACCCTGAATATGATGATGGATGCCGGCGGACATCATCGCGACAAACAATATTAATACCGGCAACCACACCGGCAATTTACGAGACTGCGCAGGCATCCTTTCTCCCGTCAATTTCTGTCAAATAAAGTAAAAGAGGCAGTCTACTTGAATTACCCCCGGCTGGTTGAGCGTTTGTTGAAAAAAAGTAACTGAAAAATCCGTAGAATAGCGCCACTCTGATGGTTAATTAACCTATTCAATTAAGAATTATCTGGATGAATGTGCCATTAAATGCGCAGCATAATGGTGCGTTGTGCGGGAAAACTGCTTTTTTTTGAAAGGGTTGGTCAGTAGCGGAAACAACTCACTTCACACCCCGAAGGGGGAAGTTGCCTGACCCTACGATTCCCGCTATTTCATTCACTGACCGGAGGTTCAAAATGA 39 ATGACCCTGAATATGATGATGGATGCCGGCTCACCACGGCGATAACCATAGGTTTTCGGCGTGGCCACATCCATGGTGAATCCCACTTTTTCCAGCACGCGCGCCACTTCATCGGGTCTTAAATACATAGATTTTCCTCGTCATCTTTCCAAAGCCTCGCCACCTTACATGACTGAGCATGGACCGTGACTCAGAAAATTCCACAAACGAACCTGAAAGGCGTGATTGCCGTCTGGCCTTAAAAATTATGGTCTAAACTAAAATTTACATCGAAAACGAGGGAGGATCCTATGTTTAACAAACCGAATCGCCGTGACGTAGATGAAGGTGTTGAGGATATTAACCACGATGTTAACCAGCTCGAACTCACTTCACACCCCGAAGGGGGAAGTTGCCTGACCCTACGATTCCCGCTATTTCATTCACTGACCGGAGGTTCAAAATGA 40 ATGACCCTGAATATGATGATGGATGCCGGCTGACGAGGCAGGTTACATCACTGGTGAAACCCTGCACGTCAATGGCGGAATGTATATGGTTTAACCACGATGAAAATTATTTGCGTTATTAGGGCGAAAGGCCTCAAAATAGCGTAAAATCGTGGTAAGAACTGCCGGGATTTAGTTGCAAATTTTTCAACATTTTATACACTACGAAAACCATCGCGAAAGCGAGTTTTGATAGGAAATTTAAGAGTATGAGCACTATCGAAGAACGCGTTAAGAAAATTATCGGCGAACAGCTGGGCGTTAAGCAGGAAGAAGTTACCAACAATGCTTCCTTCGTTGAAGACCTGGGCGCTGATTCTCTTGACACCGAACTCACTTCACACCCCGAAGGGGGAAGTTGCCTGACCCTACGATTCCCGCTATTTCATTCACTGACCGGAGGTTCAAAATGA 41 ATGACCCTGAATATGATGATGGATGCCGGCCGTCCTGTAATAATAACCGGACAATTCGGACTGATTAAAAAAGCGCCCTTGTGGCGCTTTTTTTATATTCCCGCCTCCATTTAAAATAAAAAATCCAATCGGATTTCACTATTTAAACTGGCCATTATCTAAGATGAATCCGATGGAAGCTCGCTGTTTTAACACGCGTTTTTTAACCTTTTATTGAAAGTCGGTGCTTCTTTGAGCGAACGATCAAATTTAAGTGGATTCCCATCAAAAAAATATTCTCAACCTAAAAAAGTTTGTGTAATACTTGTAACGCTACATGGAGATTAACTCAATCTAGAGGGTATTAATAATGAATCGTACTAAACTGGTACTGGGCGCAACTCACTTCACACCCCGAAGGGGGAAGTTGCCTGACCCTACGATTCCCGCTATTTCATTCACTGACCGGAGGTTCAAAATGA 42 ATGACCCTGAATATGATGATGGATGCCGGCATATTGACACCATGACGCGCGTAATGCTGATTGGTTCTGTGACGCTGGTAATGATTGTCGAAATTCTGAACAGTGCCATCGAAGCCGTAGTAGACCGTATTGGTGCAGAATTCCATGAACTTTCCGGGCGGGCGAAGGATATGGGGTCGGCGGCGGTGCTGATGTCCATCCTGCTGGCGATGTTTACCTGGATCGCATTACTCTGGTCACATTTTCGATAACGCTTCCAGAATTCGATAACGCCCTGGTTTTTTGCTTAAATTTGGTTCCAAAATCGCCTTTAGCTGTATATACTCACAGCATAACTGTATATACACCCAGGGGGCGGGATGAAAGCATTAACGGCCAGGAACTCACTTCACACCCCGAAGGGGGAAGTTGCCTGACCCTACGATTCCCGCTATTTCATTCACTGACCGGAGGTTCAAAATGA 43 ATGACCCTGAATATGATGATGGATGCCGGCATCATATTGCGCTCCCTGGTTATCATTTGTTACTAAATGAAATGTTATAATATAACAATTATAAATACCACATCGCTTTCAATTCACCAGCCAAATGAGAGGAGCGCCGTCTGACATAGCCAGCGCTATAAAACATAGCATTATCTATATGTTTATGATTAATAACTGATTTTTGCGTTTTGGATTTGGCTGTGGCATCCTTGCCGCTCTTTTCGCAGCGTCTGCGTTTTTGCCCTCCGGTCAGGGCATTTAAGGGTCAGCAATGAGTTTTTACGCAATTACGATTCTTGCCTTCGGCATGTCGATGGATGCTTTAACTCACTTCACACCCCGAAGGGGGAAGTTGCCTGACCCTACGATTCCCGCTATTTCATTCACTGACCGGAGGTTCAAAATGA 44 ATGACCCTGAATATGATGATGGATGCCGGCCGCGTCAGGTTGAACGTAAAAAAGTCGGTCTGCGCAAAGCACGTCGTCGTCCGCAGTTCTCCAAACGTTAATTGGTTTCTGCTTCGGCAGAACGATTGGCGAAAAAACCCGGTGCGAACCGGGTTTTTTTATGGATAAAGATCGTGTTATCCACAGCAATCCATTGATTATCTCTTCTTTTTCAGCATTTCCAGAATCCCCTCACCACAAAGCCCGCAAAATCTGGTAAACTATCATCCAATTTTCTGCCCAAATGGCTGGGATTGTTCATTTTTTGTTTGCCTTACAACGAGAGTGACAGTACGCGCGGGTAGTTAACTCAACATCTGACCGGTCGATAACTCACTTCACACCCCGAAGGGGGAAGTTGCCTGACCCTACGATTCCCGCTATTTCATTCACTGACCGGAGGTTCAAAATGA 45 ATGACCCTGAATATGATGATGGATGCCGGCCCTGTATGAAGATGGCGTGCGCAAAGATCGCCTGGATAACAGCGATATGATTAGCCAGCTTGAAGCCCGCATTCGCGCGAAAGCGTCAATGCTGGACGAAGCGCGTCGTATCGATGTGCAACAGGTAGAAAAATAAGGTTGCTGGGAAGCGGCAGGCTTCCCGTGTATGATGAACCCGCCCGGCGCGACCCGTTGTTCGTCGCGGCCCCGAGGGTTCATTTTTTGTATTAATAAAGAGAATAAACGTGGCAAAAAATATTCAAGCCATTCGCGGCATGAACGATTATCTGCCTGGCGAACTCACTTCACACCCCGAAGGGGGAAGTTGCCTGACCCTACGATTCCCGCTATTTCATTCACTGACCGGAGGTTCAAAATGA 46 ATGAAAAAGATTGATGCGATTATTAAACCTTTCAAACTGGATGACGTGCGCTGATCCTTCAACTCAGCAAAAGTTCGATTTATTCAACAAAGCCACGTTGTGTCTCAAAATCTCTGATGTTACATTGCACAAGATAAAAATATATCATCATGAACAATAAAACTGTCTGCTTACATAAACAGTAATACAAGGGGTGTTATGAGCCATATTCAACGGGAAACGTCTTGCTCCCGTCCGCGCTTAAACTCCAACATGGACGCTGATTTATATGGGTATAAATGGGCTCGCGATAATGTCGGGCAATCAGGTGCGACAATCTATCGCTTGTATGGGAAGCCCGATGCGCCAGAGTTGTTTCTGAAACATGGCAAAGGTAGCGTTGCCAATGATGTTACAGATGAGATGGTCCGTCTCAACTGGCTGACGGAGTTTATGCCTCTCCCGACCATCAAGCATTTTATCCGTACTCCTGATGATGCGTGGTTACTCACCACCGCGATTCCTGGGAAAACAGCCTTCCAGGTATTAGAAGAATATCCTGATTCAGGTGAAAATATTGTTGATGCGCTGGCCGTGTTCCTGCGCCGGTTACATTCGATTCCTGTTTGTAATTGTCCTTTTAACAGCGATCGTGTATTTCGTCTTGCTCAGGCGCAATCACGCATGAATAACGGTTTGGTTGATGCGAGTGATTTTGATGACGAGCGTAATGGCTGGCCTGTTGAACAAGTCTGGAAAGAAATGCACAAGCTCTTGCCATTCTCACCGGATTCAGTCGTCACTCATGGTGATTTCTCACTTGATAACCTTATTTTTGACGAGGGGAAATTAATAGGTTGTATTGATGTTGGACGGGTCGGAATCGCAGACCGTTACCAGGACCTTGCCATTCTTTGGAACTGCCTCGGTGAGTTTTCTCCTTCATTACAGAAACGGCTTTTTCAAAAATATGGTATTGATAATCCTGATATGAATAAATTGCAGTTTCATTTGATGCTCGATGAGTTTTTCTAATAAGCCTCGCGCGTGATTCGTATCCGCACCGGCGAAGAAGACGACGCGGCGATTTAA 47 ATGACCATGAACCTGATGACGGATGTCGTCTCAGCCACCGGGATCGCCGGGTTGCTTTCACGACAACACCCGACGCTGTTTTTTACACTAATTGAACAGGCCCCCGTGGCGATCACGCTGACGGATACCGCTGCCCGCATTGTCTATGCCAACCCGGGCGTGTTGAGTCATCCTGACTAGCTGAGATGAGGGCTCGCCTGATCCTTCAACTCAGCAAAAGTTCGATTTATTCAACAAAGCCACGTTGTGTCTCAAAATCTCTGATGTTACATTGCACAAGATAAAAATATATCATCATGAACAATAAAACTGTCTGCTTACATAAACAGTAATACAAGGGGTGTTATGAGCCATATTCAACGGGAAACGTCTTGCTCCAGGCCGCGATTAAATTCCAACATGGATGCTGATTTATATGGGTATAAATGGGCTCGCGATAATGTCGGGCAATCAGGTGCGACAATCTATCGATTGTATGGGAAGCCCGATGCGCCAGAGTTGTTTCTGAAACATGGCAAAGGTAGCGTTGCCAATGATGTTACAGATGAGATGGTCAGACTAAACTGGCTGACGGAATTTATGCCTCTTCCGACCATCAAGCATTTTATCCGTACTCCTGATGATGCATGGTTACTCACCACTGCGATCCCCGGGAAAACAGCATTCCAGGTATTAGAAGAATATCCTGATTCAGGTGAAAATATTGTTGATGCGCTGGCAGTGTTCCTGCGCCGGTTGCATTCGATTCCTGTTTGTAATTGTCCTTTTAACAGCGATCGCGTATTTCGTCTCGCTCAGGCGCAATCACGAATGAATAACGGTTTGGTTGATGCGAGTGATTTTGATGACGAGCGTAATGGCTGGCCTGTTGAACAAGTCTGGAAAGAAATGCATAAGCTTTTGCCATTCTCACCGGATTCAGTCGTCACTCATGGTGATTTCTCACTTGATAACCTTATTTTTGACGAGGGGAAATTAATAGGTTGTATTGATGTTGGACGAGTCGGAATCGCAGACCGATACCAGGATCTTGCCATCCTATGGAACTGCCTCGGTGAGTTTTCTCCTTCATTACAGAAACGGCTTTTTCAAAAATATGGTATTGATAATCCTGATATGAATAAATTGCAGTTTCATTTGATGCTCGATGAGTTTTTCTAATAAGCCTGACCGGTGGTGAATTTAATCTCGCTGACGTGTAGACATTCATCGATCTGCATCCACGGTCCGGCGGCGGTACCTGCCTGACGCTACGTTTACCGCTCTTTTATGAACTGACCGGAGGCCCAAGATGA 48 ATGAGCATCACGGCGTTATCAGCATCATTTCCTGAGGGGAATATCGCCAGCCGCTTGTCGCTGCAACATCCTTCACTGTTTTATACCGTGGTTGAACAATCTTCGGTGGCGAGCGTGTTGAGTCATCCTGACTAGCTGAGATGAGGGCTCGCCCCCTCGTCCCGACACTTCCAGATCGCCATAGCGCACAGCGCCTCGAGCGGTGGTAACGGCGCAGTGGCGGTTTTCATGGCTTGTTATGACTGTTTTTTTGGGGTACAGTCTATGCCTCGGGCATCCAAGCAGCAAGCGCGTTACGCCGTGGGTCGATGTTTGATGTTATGGAGCAGCAACGATGTTACGCAGCAGGGCAGTCGCCCTAAAACAAAGTTAAACATCATGAGGGAAGCGGTGATCGCCGAAGTATCGACTCAACTATCAGAGGTAGTTGGCGTCATCGAGCGCCATCTCGAACCGACGTTGCTGGCCGTACATTTGTACGGCTCCGCAGTGGATGGCGGCCTGAAGCCACACAGTGATATTGATTTGCTGGTTACGGTGACCGTAAGGCTTGATGAAACAACGCGGCGAGCTTTGATCAACGACCTTTTGGAAACTTCGGCTTCCCCTGGAGAGAGCGAGATTCTCCGCGCTGTAGAAGTCACCATTGTTGTGCACGACGACATCATTCCGTGGCGTTATCCAGCTAAGCGCGAACTGCAATTTGGAGAATGGCAGCGCAATGACATTCTTGCAGGTATCTTCGAGCCAGCCACGATCGACATTGATCTGGCTATCTTGCTGACAAAAGCAAGAGAACATAGCGTTGCCTTGGTAGGTCCAGCGGCGGAGGAACTCTTTGATCCGGTTCCTGAACAGGATCTATTTGAGGCGCTAAATGAAACCTTAACGCTATGGAACTCGCCGCCCGACTGGGCTGGCGATGAGCGAAATGTAGTGCTTACGTTGTCCCGCATTTGGTACAGCGCAGTAACCGGCAAAATCGCGCCGAAGGATGTCGCTGCCGACTGGGCAATGGAGCGCCTGCCGGCCCAGTATCAGCCCGTCATACTTGAAGCTAGACAGGCTTATCTTGGACAAGAAGAAGATCGCTTGGCCTCGCGCGCAGATCAGTTGGAAGAATTTGTCCACTACGTGAAAGGCGAGATCACCAAGGTAGTCGGCAAATAATGTCTAACAATTCGTTCAAGCCGACGCCGCTTCGCGGCGCGGCTTAACTCAAGCGTTAGATGCACTAAGCACATAATTGCTCACAGCCAAACTATCAGGTCAAGTCTGCTTTTATTATTTTTAAGCGTGCATAATAAGCCCTACACAAATGGTACCCGACCGGTGGTGAATTTAATCTCGCTGACGTGTAGACATTCCCTTATCCAGACGCTGATCGCCCATCATCGCGGTTCTTTAGATCTCTCGGTCCGCCCTGATGGCGGCACCTTGCTGACGTTACGCCTGCCGGTACAGCAGGTTATCACCGGAGGCTTAAAATGA 49 CTGATCCTTCAACTCAGCAAAAGTTCGATTTATTCAACAAAGCCACGTTGTGTCTCAAAATCTCTGATGTTACATTGCACAAGATAAAAATATATCATCATGAACAATAAAACTGTCTGCTTACATAAACAGTAATACAAGGGGTGTTATGAGCCATATTCAACGGGAAACGTCTTGCTCCAGGCCGCGATTAAATTCCAACATGGATGCTGATTTATATGGGTATAAATGGGCTCGCGATAATGTCGGGCAATCAGGTGCGACAATCTATCGATTGTATGGGAAGCCCGATGCGCCAGAGTTGTTTCTGAAACATGGCAAAGGTAGCGTTGCCAATGATGTTACAGATGAGATGGTCAGACTAAACTGGCTGACGGAATTTATGCCTCTTCCGACCATCAAGCATTTTATCCGTACTCCTGATGATGCATGGTTACTCACCACTGCGATCCCCGGGAAAACAGCATTCCAGGTATTAGAAGAATATCCTGATTCAGGTGAAAATATTGTTGATGCGCTGGCAGTGTTCCTGCGCCGGTTGCATTCGATTCCTGTTTGTAATTGTCCTTTTAACAGCGATCGCGTATTTCGTCTCGCTCAGGCGCAATCACGAATGAATAACGGTTTGGTTGATGCGAGTGATTTTGATGACGAGCGTAATGGCTGGCCTGTTGAACAAGTCTGGAAAGAAATGCATAAGCTTTTGCCATTCTCACCGGATTCAGTCGTCACTCATGGTGATTTCTCACTTGATAACCTTATTTTTGACGAGGGGAAATTAATAGGTTGTATTGATGTTGGACGAGTCGGAATCGCAGACCGATACCAGGATCTTGCCATCCTATGGAACTGCCTCGGTGAGTTTTCTCCTTCATTACAGAAACGGCTTTTTCAAAAATATGGTATTGATAATCCTGATATGAATAAATTGCAGTTTCATTTGATGCTCGATGAGTTTTTCTAATAAGCCTTGACCCTACGATTCCCGCTATTTCATTCACTGACCGGAGGTTCAAAATGA 50 ATGACCCTGAATATGATGCTCGATAACGCCGTACCCGAGGCGATTGCCGGCTGATCCTTCAACTCAGCAAAAGTTCGATTTATTCAACAAAGCCACGTTGTGTCTCAAAATCTCTGATGTTACATTGCACAAGATAAAAATATATCATCATGAACAATAAAACTGTCTGCTTACATAAACAGTAATACAAGGGGTGTTATGAGCCATATTCAACGGGAAACGTCTTGCTCCCGTCCGCGCTTAAACTCCAACATGGACGCTGATTTATATGGGTATAAATGGGCTCGCGATAATGTCGGGCAATCAGGTGCGACAATCTATCGCTTGTATGGGAAGCCCGATGCGCCAGAGTTGTTTCTGAAACATGGCAAAGGTAGCGTTGCCAATGATGTTACAGATGAGATGGTCCGTCTCAACTGGCTGACGGAGTTTATGCCTCTCCCGACCATCAAGCATTTTATCCGTACTCCTGATGATGCGTGGTTACTCACCACCGCGATTCCTGGGAAAACAGCCTTCCAGGTATTAGAAGAATATCCTGATTCAGGTGAAAATATTGTTGATGCGCTGGCCGTGTTCCTGCGCCGGTTACATTCGATTCCTGTTTGTAATTGTCCTTTTAACAGCGATCGTGTATTTCGTCTTGCTCAGGCGCAATCACGCATGAATAACGGTTTGGTTGATGCGAGTGATTTTGATGACGAGCGTAATGGCTGGCCTGTTGAACAAGTCTGGAAAGAAATGCACAAGCTCTTGCCATTCTCACCGGATTCAGTCGTCACTCATGGTGATTTCTCACTTGATAACCTTATTTTTGACGAGGGGAAATTAATAGGTTGTATTGATGTTGGACGGGTCGGAATCGCAGACCGTTACCAGGACCTTGCCATTCTTTGGAACTGCCTCGGTGAGTTTTCTCCTTCATTACAGAAACGGCTTTTTCAAAAATATGGTATTGATAATCCTGATATGAATAAATTGCAGTTTCATTTGATGCTCGATGAGTTTTTCTAATAAGCCTTGGTTCTGCGTTTCCCGCTCTTTAATACCCTGACCGGAGGTGAGCAATGA 51 ATGACCCTGAATATGATGATGGATGCCGGCCGTCCTGTAATAATAACCGGACAATTCGGACTGATTAAAAAAGCGCCCTTGTGGCGCTTTTTTTATATTCCCGCCTCCATTTAAAATAAAAAATCCAATCGGATTTCACTATTTAAACTGGCCATTATCTAAGATGAATCCGATGGAAGCTCGCTGTTTTAACACGCGTTTTTTAACCTTTTATTGAAAGTCGGTGCTTCTTTGAGCGAACGATCAAATTTAAGTGGATTCCCATCAAAAAAATATTCTCAACCTAAAAAAGTTTGTGTAATACTTGTAACGCTACATGGAGATTAACTCAATCTAGAGGGTATTAATAATGAATCGTACTAAACTGGTACTGGGCGCAACTCACTTCACACCCCGAAGGGGGAAGTTGCCTGACCCTACGATTCCCGCTATTTCATTCACTGACCGGAGGTTCAAAATGA 52 ATGACCCTGAATATGATGATGGATGCCGGCGGACATCATCGCGACAAACAATATTAATACCGGCAACCACACCGGCAATTTACGAGACTGCGCAGGCATCCTTTCTCCCGTCAATTTCTGTCAAATAAAGTAAAAGAGGCAGTCTACTTGAATTACCCCCGGCTGGTTGAGCGTTTGTTGAAAAAAAGTAACTGAAAAATCCGTAGAATAGCGCCACTCTGATGGTTAATTAACCTATTCAATTAAGAATTATCTGGATGAATGTGCCATTAAATGCGCAGCATAATGGTGCGTTGTGCGGGAAAACTGCTTTTTTTTGAAAGGGTTGGTCAGTAGCGGAAACAACTCACTTCACACCCCGAAGGGGGAAGTTGCCTGACCCTACGATTCCCGCTATTTCATTCACTGACCGGAGGTTCAAAATGA 53 ATGACCCTGAATATGATGATGGATGCCGGCTGACGAGGCAGGTTACATCACTGGTGAAACCCTGCACGTCAATGGCGGAATGTATATGGTTTAACCACGATGAAAATTATTTGCGTTATTAGGGCGAAAGGCCTCAAAATAGCGTAAAATCGTGGTAAGAACTGCCGGGATTTAGTTGCAAATTTTTCAACATTTTATACACTACGAAAACCATCGCGAAAGCGAGTTTTGATAGGAAATTTAAGAGTATGAGCACTATCGAAGAACGCGTTAAGAAAATTATCGGCGAACAGCTGGGCGTTAAGCAGGAAGAAGTTACCAACAATGCTTCCTTCGTTGAAGACCTGGGCGCTGATTCTCTTGACACCGAACTCACTTCACACCCCGAAGGGGGAAGTTGCCTGACCCTACGATTCCCGCTATTTCATTCACTGACCGGAGGTTCAAAATGA 54 ATGACCCTGAATATGATGATGGATGCCGGCGGACATCATCGCGACAAACAATATTAATACCGGCAACCACACCGGCAATTTACGAGACTGCGCAGGCATCCTTTCTCCCGTCAATTTCTGTCAAATAAAGTAAAAGAGGCAGTCTACTTGAATTACCCCCGGCTGGTTGAGCGTTTGTTGAAAAAAAGTAACTGAAAAATCCGTAGAATAGCGCCACTCTGATGGTTAATTAACCTATTCAATTAAGAATTATCTGGATGAATGTGCCATTAAATGCGCAGCATAATGGTGCGTTGTGCGGGAAAACTGCTTTTTTTTGAAAGGGTTGGTCAGTAGCGGAAACAACTCACTTCACACCCCGAAGGGGGAAGTTGCCTGACCCTACGATTCCCGCTATTTCATTCACTGACCGGAGGTTCAAAATGA 55 ATGACCCTGAATATGATGATGGATGCCGGCCGTCCTGTAATAATAACCGGACAATTCGGACTGATTAAAAAAGCGCCCTTGTGGCGCTTTTTTTATATTCCCGCCTCCATTTAAAATAAAAAATCCAATCGGATTTCACTATTTAAACTGGCCATTATCTAAGATGAATCCGATGGAAGCTCGCTGTTTTAACACGCGTTTTTTAACCTTTTATTGAAAGTCGGTGCTTCTTTGAGCGAACGATCAAATTTAAGTGGATTCCCATCAAAAAAATATTCTCAACCTAAAAAAGTTTGTGTAATACTTGTAACGCTACATGGAGATTAACTCAATCTAGAGGGTATTAATAATGAATCGTACTAAACTGGTACTGGGCGCAACTCACTTCACACCCCGAAGGGGGAAGTTGCCTGACCCTACGATTCCCGCTATTTCATTCACTGACCGGAGGTTCAAAATGA 56 ATGAGCATCACGGCGTTATCAGCATCATTTCCTGAGGGGAATATCGCCAGCCGCTTGTCGCTGCAACATCCTTCACTGTTTTATACCGTGGTTGAACAATCTTCGGTGGCGAGCGTGTTGAGTCATCCTGACTAGCTGAGATGAGGGCTCGCCCCCTCGTCCCGACACTTCCAGATCGCCATAGCGCACAGCGCCTCGAGCGGTGGTAACGGCGCAGTGGCGGTTTTCATGGCTTGTTATGACTGTTTTTTTGGGGTACAGTCTATGCCTCGGGCATCCAAGCAGCAAGCGCGTTACGCCGTGGGTCGATGTTTGATGTTATGGAGCAGCAACGATGTTACGCAGCAGGGCAGTCGCCCTAAAACAAAGTTAAACATCATGAGGGAAGCGGTGATCGCCGAAGTATCGACTCAACTATCAGAGGTAGTTGGCGTCATCGAGCGCCATCTCGAACCGACGTTGCTGGCCGTACATTTGTACGGCTCCGCAGTGGATGGCGGCCTGAAGCCACACAGTGATATTGATTTGCTGGTTACGGTGACCGTAAGGCTTGATGAAACAACGCGGCGAGCTTTGATCAACGACCTTTTGGAAACTTCGGCTTCCCCTGGAGAGAGCGAGATTCTCCGCGCTGTAGAAGTCACCATTGTTGTGCACGACGACATCATTCCGTGGCGTTATCCAGCTAAGCGCGAACTGCAATTTGGAGAATGGCAGCGCAATGACATTCTTGCAGGTATCTTCGAGCCAGCCACGATCGACATTGATCTGGCTATCTTGCTGACAAAAGCAAGAGAACATAGCGTTGCCTTGGTAGGTCCAGCGGCGGAGGAACTCTTTGATCCGGTTCCTGAACAGGATCTATTTGAGGCGCTAAATGAAACCTTAACGCTATGGAACTCGCCGCCCGACTGGGCTGGCGATGAGCGAAATGTAGTGCTTACGTTGTCCCGCATTTGGTACAGCGCAGTAACCGGCAAAATCGCGCCGAAGGATGTCGCTGCCGACTGGGCAATGGAGCGCCTGCCGGCCCAGTATCAGCCCGTCATACTTGAAGCTAGACAGGCTTATCTTGGACAAGAAGAAGATCGCTTGGCCTCGCGCGCAGATCAGTTGGAAGAATTTGTCCACTACGTGAAAGGCGAGATCACCAAGGTAGTCGGCAAATAATGTCTAACAATTCGTTCAAGCCGACGCCGCTTCGCGGCGCGGCTTAACTCAAGCGTTAGATGCACTAAGCACATAATTGCTCACAGCCAAACTATCAGGTCAAGTCTGCTTTTATTATTTTTAAGCGTGCATAATAAGCCCTACACAAATGGTACCCGACCGGTGGTGAATTTAATCTCGCTGACGTGTAGACATTCCCTTATCCAGACGCTGATCGCCCATCATCGCGGTTCTTTAGATCTCTCGGTCCGCCCTGATGGCGGCACCTTGCTGACGTTACGCCTGCCGGTACAGCAGGTTATCACCGGAGGCTTAAAATGA 57 ATGAGCATCACGGCGTTATCAGCATCATTTCCTGAGGGGAATATCGCCAGCCGCTTGTCGCTGCAACATCCTTCACTGTTTTATACCGTGGTTGAACAATCTTCGGTGGCGAGCGTGTTGAGTCATCCTGACTAGCTGAGATGAGGGCTCGCCCCCTCGTCCCGACACTTCCAGATCGCCATAGCGCACAGCGCCTCGAGCGGTGGTAACGGCGCAGTGGCGGTTTTCATGGCTTGTTATGACTGTTTTTTTGGGGTACAGTCTATGCCTCGGGCATCCAAGCAGCAAGCGCGTTACGCCGTGGGTCGATGTTTGATGTTATGGAGCAGCAACGATGTTACGCAGCAGGGCAGTCGCCCTAAAACAAAGTTAAACATCATGAGGGAAGCGGTGATCGCCGAAGTATCGACTCAACTATCAGAGGTAGTTGGCGTCATCGAGCGCCATCTCGAACCGACGTTGCTGGCCGTACATTTGTACGGCTCCGCAGTGGATGGCGGCCTGAAGCCACACAGTGATATTGATTTGCTGGTTACGGTGACCGTAAGGCTTGATGAAACAACGCGGCGAGCTTTGATCAACGACCTTTTGGAAACTTCGGCTTCCCCTGGAGAGAGCGAGATTCTCCGCGCTGTAGAAGTCACCATTGTTGTGCACGACGACATCATTCCGTGGCGTTATCCAGCTAAGCGCGAACTGCAATTTGGAGAATGGCAGCGCAATGACATTCTTGCAGGTATCTTCGAGCCAGCCACGATCGACATTGATCTGGCTATCTTGCTGACAAAAGCAAGAGAACATAGCGTTGCCTTGGTAGGTCCAGCGGCGGAGGAACTCTTTGATCCGGTTCCTGAACAGGATCTATTTGAGGCGCTAAATGAAACCTTAACGCTATGGAACTCGCCGCCCGACTGGGCTGGCGATGAGCGAAATGTAGTGCTTACGTTGTCCCGCATTTGGTACAGCGCAGTAACCGGCAAAATCGCGCCGAAGGATGTCGCTGCCGACTGGGCAATGGAGCGCCTGCCGGCCCAGTATCAGCCCGTCATACTTGAAGCTAGACAGGCTTATCTTGGACAAGAAGAAGATCGCTTGGCCTCGCGCGCAGATCAGTTGGAAGAATTTGTCCACTACGTGAAAGGCGAGATCACCAAGGTAGTCGGCAAATAATGTCTAACAATTCGTTCAAGCCGACGCCGCTTCGCGGCGCGGCTTAACTCAAGCGTTAGATGCACTAAGCACATAATTGCTCACAGCCAAACTATCAGGTCAAGTCTGCTTTTATTATTTTTAAGCGTGCATAATAAGCCCTACACAAATGGTACCCGACCGGTGGTGAATTTAATCTCGCTGACGTGTAGACATTCCCTTATCCAGACGCTGATCGCCCATCATCGCGGTTCTTTAGATCTCTCGGTCCGCCCTGATGGCGGCACCTTGCTGACGTTACGCCTGCCGGTACAGCAGGTTATCACCGGAGGCTTAAAATGA 58 CTGATCCTTCAACTCAGCAAAAGTTCGATTTATTCAACAAAGCCACGTTGTGTCTCAAAATCTCTGATGTTACATTGCACAAGATAAAAATATATCATCATGAACAATAAAACTGTCTGCTTACATAAACAGTAATACAAGGGGTGTTATGAGCCATATTCAACGGGAAACGTCTTGCTCCAGGCCGCGATTAAATTCCAACATGGATGCTGATTTATATGGGTATAAATGGGCTCGCGATAATGTCGGGCAATCAGGTGCGACAATCTATCGATTGTATGGGAAGCCCGATGCGCCAGAGTTGTTTCTGAAACATGGCAAAGGTAGCGTTGCCAATGATGTTACAGATGAGATGGTCAGACTAAACTGGCTGACGGAATTTATGCCTCTTCCGACCATCAAGCATTTTATCCGTACTCCTGATGATGCATGGTTACTCACCACTGCGATCCCCGGGAAAACAGCATTCCAGGTATTAGAAGAATATCCTGATTCAGGTGAAAATATTGTTGATGCGCTGGCAGTGTTCCTGCGCCGGTTGCATTCGATTCCTGTTTGTAATTGTCCTTTTAACAGCGATCGCGTATTTCGTCTCGCTCAGGCGCAATCACGAATGAATAACGGTTTGGTTGATGCGAGTGATTTTGATGACGAGCGTAATGGCTGGCCTGTTGAACAAGTCTGGAAAGAAATGCATAAGCTTTTGCCATTCTCACCGGATTCAGTCGTCACTCATGGTGATTTCTCACTTGATAACCTTATTTTTGACGAGGGGAAATTAATAGGTTGTATTGATGTTGGACGAGTCGGAATCGCAGACCGATACCAGGATCTTGCCATCCTATGGAACTGCCTCGGTGAGTTTTCTCCTTCATTACAGAAACGGCTTTTTCAAAAATATGGTATTGATAATCCTGATATGAATAAATTGCAGTTTCATTTGATGCTCGATGAGTTTTTCTAATAAGCCTTGACCCTACGATTCCCGCTATTTCATTCACTGACCGGAGGTTCAAAATGA 59 ATGAGCATCACGGCGTTATCAGCATCATTTCCTGAGGGGAATATCGCCAGCCGCTTGTCGCTGCAACATCCTTCACTGTTTTATACCGTGGTTGAACAATCTTCGGTGGCGAGCGTGTTGAGTCATCCTGACTAGCTGAGATGAGGGCTCGCCCCCTCGTCCCGACACTTCCAGATCGCCATAGCGCACAGCGCCTCGAGCGGTGGTAACGGCGCAGTGGCGGTTTTCATGGCTTGTTATGACTGTTTTTTTGGGGTACAGTCTATGCCTCGGGCATCCAAGCAGCAAGCGCGTTACGCCGTGGGTCGATGTTTGATGTTATGGAGCAGCAACGATGTTACGCAGCAGGGCAGTCGCCCTAAAACAAAGTTAAACATCATGAGGGAAGCGGTGATCGCCGAAGTATCGACTCAACTATCAGAGGTAGTTGGCGTCATCGAGCGCCATCTCGAACCGACGTTGCTGGCCGTACATTTGTACGGCTCCGCAGTGGATGGCGGCCTGAAGCCACACAGTGATATTGATTTGCTGGTTACGGTGACCGTAAGGCTTGATGAAACAACGCGGCGAGCTTTGATCAACGACCTTTTGGAAACTTCGGCTTCCCCTGGAGAGAGCGAGATTCTCCGCGCTGTAGAAGTCACCATTGTTGTGCACGACGACATCATTCCGTGGCGTTATCCAGCTAAGCGCGAACTGCAATTTGGAGAATGGCAGCGCAATGACATTCTTGCAGGTATCTTCGAGCCAGCCACGATCGACATTGATCTGGCTATCTTGCTGACAAAAGCAAGAGAACATAGCGTTGCCTTGGTAGGTCCAGCGGCGGAGGAACTCTTTGATCCGGTTCCTGAACAGGATCTATTTGAGGCGCTAAATGAAACCTTAACGCTATGGAACTCGCCGCCCGACTGGGCTGGCGATGAGCGAAATGTAGTGCTTACGTTGTCCCGCATTTGGTACAGCGCAGTAACCGGCAAAATCGCGCCGAAGGATGTCGCTGCCGACTGGGCAATGGAGCGCCTGCCGGCCCAGTATCAGCCCGTCATACTTGAAGCTAGACAGGCTTATCTTGGACAAGAAGAAGATCGCTTGGCCTCGCGCGCAGATCAGTTGGAAGAATTTGTCCACTACGTGAAAGGCGAGATCACCAAGGTAGTCGGCAAATAATGTCTAACAATTCGTTCAAGCCGACGCCGCTTCGCGGCGCGGCTTAACTCAAGCGTTAGATGCACTAAGCACATAATTGCTCACAGCCAAACTATCAGGTCAAGTCTGCTTTTATTATTTTTAAGCGTGCATAATAAGCCCTACACAAATGGTACCCGACCGGTGGTGAATTTAATCTCGCTGACGTGTAGACATTCCCTTATCCAGACGCTGATCGCCCATCATCGCGGTTCTTTAGATCTCTCGGTCCGCCCTGATGGCGGCACCTTGCTGACGTTACGCCTGCCGGTACAGCAGGTTATCACCGGAGGCTTAAAATGA 60 ATGAGCATCACGGCGTTATCAGCATCATTTCCTGAGGGGAATATCGCCAGCCGCTTGTCGCTGCAACATCCTTCACTGTTTTATACCGTGGTTGAACAATCTTCGGTGGCGAGCGTGTTGAGTCATCCTGACTAGCTGAGATGAGGGCTCGCCCCCTCGTCCCGACACTTCCAGATCGCCATAGCGCACAGCGCCTCGAGCGGTGGTAACGGCGCAGTGGCGGTTTTCATGGCTTGTTATGACTGTTTTTTTGGGGTACAGTCTATGCCTCGGGCATCCAAGCAGCAAGCGCGTTACGCCGTGGGTCGATGTTTGATGTTATGGAGCAGCAACGATGTTACGCAGCAGGGCAGTCGCCCTAAAACAAAGTTAAACATCATGAGGGAAGCGGTGATCGCCGAAGTATCGACTCAACTATCAGAGGTAGTTGGCGTCATCGAGCGCCATCTCGAACCGACGTTGCTGGCCGTACATTTGTACGGCTCCGCAGTGGATGGCGGCCTGAAGCCACACAGTGATATTGATTTGCTGGTTACGGTGACCGTAAGGCTTGATGAAACAACGCGGCGAGCTTTGATCAACGACCTTTTGGAAACTTCGGCTTCCCCTGGAGAGAGCGAGATTCTCCGCGCTGTAGAAGTCACCATTGTTGTGCACGACGACATCATTCCGTGGCGTTATCCAGCTAAGCGCGAACTGCAATTTGGAGAATGGCAGCGCAATGACATTCTTGCAGGTATCTTCGAGCCAGCCACGATCGACATTGATCTGGCTATCTTGCTGACAAAAGCAAGAGAACATAGCGTTGCCTTGGTAGGTCCAGCGGCGGAGGAACTCTTTGATCCGGTTCCTGAACAGGATCTATTTGAGGCGCTAAATGAAACCTTAACGCTATGGAACTCGCCGCCCGACTGGGCTGGCGATGAGCGAAATGTAGTGCTTACGTTGTCCCGCATTTGGTACAGCGCAGTAACCGGCAAAATCGCGCCGAAGGATGTCGCTGCCGACTGGGCAATGGAGCGCCTGCCGGCCCAGTATCAGCCCGTCATACTTGAAGCTAGACAGGCTTATCTTGGACAAGAAGAAGATCGCTTGGCCTCGCGCGCAGATCAGTTGGAAGAATTTGTCCACTACGTGAAAGGCGAGATCACCAAGGTAGTCGGCAAATAATGTCTAACAATTCGTTCAAGCCGACGCCGCTTCGCGGCGCGGCTTAACTCAAGCGTTAGATGCACTAAGCACATAATTGCTCACAGCCAAACTATCAGGTCAAGTCTGCTTTTATTATTTTTAAGCGTGCATAATAAGCCCTACACAAATGGTACCCGACCGGTGGTGAATTTAATCTCGCTGACGTGTAGACATTCCCTTATCCAGACGCTGATCGCCCATCATCGCGGTTCTTTAGATCTCTCGGTCCGCCCTGATGGCGGCACCTTGCTGACGTTACGCCTGCCGGTACAGCAGGTTATCACCGGAGGCTTAAAATGA 61 ATGTTTAACGATCTGATTGGCGATGATGAAACGGATTCGCCGGAAGATGCGCTTTCTGAGAGCTGGCGCGAATTGTGGCAGGATGCGTTGCAGGAGGAGGATTCCACGCCCGTGCTGGCGCATCTCTCAGAGGACGATCGCCGCCGCGTGGTGGCGCTGATTGCCGATTTTCGCAAAGAGTTGGATAAACGCACCATTGGCCCGCGAGGGCGGCAGGTACTCGATCACTTAATGCCGCATCTGCTCAGCGATGTATGCTCGCGCGACGATGCGCCAGTACCGCTGTCACGCCTGACGCCGCTGCTCACCGGAATTATTACCCGCACCACTTACCTTGAGCTGCTAAGTGAATTTCCCGGCGCACTGAAACACCTCATTTCCCTGTGTGCCGCGTCGCCGATGGTTGCCAGTCAGCTGGCGCGCTACCCGATCCTGCTTGATGAATTGCTCGACCCGAATACGCTCTATCAACCGACGGCGATGAATGCCTATCGCGATGAGCTGCGCCAATACCTGCTGCGCGTGCCGGAAGATGATGAAGAGCAACAGCTTGAGGCGCTGCGGCAGTTTAAGCAGGCGCAGTTGCTGCGCGTGGCGGCGGCGGATATTGCCGGTACGTTGCCAGTAATGAAAGTGAGCGATCACTTAACCTGGCTGGCGGAAGCGATTATTGATGCGGTGGTGCAGCAAGCCTGGGGGCAGATGGTGGCGCGTTATGGCCAGCCAACGCATCTGCACGATCGCGAAGGGCGCGGTTTTGCGGTGGTCGGTTATGGCAAGCTGGGCGGCTGGGAGCTGGGTTACAGCTCCGATCTGGATCTGGTATTCCTGCACGACTGCCCGATGGATGTGATGACCGATGGCGAGCGTGAAATCGATGGTCGCCAGTTCTATTTGCGTCTCGCGCAGCGCGTGATGCACCTGTTTAGCACGCGCACGTCGTCCGGCATCCTTTATGAAGTTGATGCGCGTCTGCGTCCATCTGGCGCTGCGGGGATGCTGGTCACTACTACGGAATCGTTCGCCGATTACCAGCAAAACGAAGCCTGGACGTGGGAACATCAGGCGCTGGCCCGTGCGCGCGTGGTGTACGGCGATCCGCAACTGACCGCCGAATTTGACGCCATTCGCCGCGATATTCTGATGACGCCTCGCGACGGCGCAACGCTGCAAACCGACGTGCGAGAAATGCGCGAGAAAATGCGTGCCCATCTTGGCAACAAGCATAAAGACCGCTTCGATCTGAAAGCCGATGAAGGCGGTATCACCGACATCGAGTTTATCGCCCAATATCTGGTGCTGCGCTTTGCCCATGACAAGCCGAAACTGACGCGCTGGTCGGATAATGTGCGCATTCTCGAAGGGCTGGCGCAAAACGGCATCATGGAGGAGCAGGAAGCGCAGGCATTGACGCTGGCGTACACCACATTGCGTGATGAGCTGCACCACCTGGCGCTGCAAGAGTTGCCGGGACATGTGGCGCTCTCCTGTTTTGTCGCCGAGCGTGCGCTTATTAAAACCAGCTGGGACAAGTGGCTGGTGGAACCGTGCGCCCCGGCGTAA

Оценка удобства манипуляций с генами

[0297] Микроорганизмы-кандидаты характеризовали на основе способности к трансформации и удобства манипуляций с генами. Во-первых, определяли оптимальное использование источника углерода посредством выращивания на небольшой панели соответствующей среды, а также кривую роста в средах без азота и в богатых средах. Во-вторых, определяли природную устойчивость к антибиотикам каждого штамма посредством метода реплик и выращивания в жидкой культуре, содержащей панель антибиотиков, используемых в качестве селективных маркеров мутагенеза. В-третьих, каждый штамм тестировали на его способность к трансформации посредством электропорации коллекции плазмид. Коллекция плазмид содержит комбинаторное расширение семи участки начала репликации, т.е. p15a, pSC101, CloDF, colA, RK2, pBBR1 и pRO1600 и четыре маркера устойчивости к антибиотикам, т.е. CmR, KmR, SpecR и TetR. Эту системную оценку совместимости участков начала репликации и маркеров устойчивости использовали для идентификации векторов для основанного на плазмидах мутагенеза микроорганизмов-кандидатов.

Пример 3: Мутагенез микроорганизмов-кандидатов

Опосредованный Red лямбда нокаут

[0298] Получали несколько мутантных микроорганизмов-кандидатов с использованием плазмиды pKD46 или ее производное, содержащие маркер устойчивости к канамицину (Datsenko et al. 2000; PNAS 97(12): 6640-6645). Нокаут-кассеты конструировали с гомологией 250 п.н., фланкирующей ген-мишень, и получали посредством ПЦР с достройкой перекрывающихся участков. Микроорганизмы-кандидаты трансформировали pKD46, культивировали в присутствии арабинозы для индукции механизм экспрессии Red лямбда, подготавливали для электропорация и трансформировали нокаут-кассетами с получением мутантных штаммов-кандидатов. Для получения тринадцати кандидатов, мутантных по регуляторным генам фиксации азота nifL, glnB и amtB, использовали четыре микроорганизма-кандидата и один лабораторный штамм, Klebsiella oxytoca M5A1, как представлено в таблице 4.

Штамм nifL glnB amtB M5A1 X X X CI006 X X X CI010 X X X CI019 X X CI028 X X

Таблица 4: Список одиночных нокаут-мутантов, полученных с использованием опосредованного Red лямбда мутагенеза

Олигонуклеотид-специфический мутагенез с отбором Cas9

[0299] Для локализации изменений генома в гене rpoB DH10B E. coli использовали олигонуклеотид-специфический мутагенез, а мутантов отбирали с использованием системы CRISPR-Cas. Проведено конструирование мутагенного олигонуклеотида (ss1283: "G*T*T*G*ATCAGACCGATGTTCGGACCTTCcaagGTTTCGATCGGACATACGCGACCGTAGTGGGTCGGGTGTACGTCTCGAACTTCAAAGCC" (SEQ ID NO:2), где * означает тиофосфатную связь) для придания устойчивости к рифампицину посредством мутации 4 п.н. в гене rpoB. В клетках, содержащих плазмиду, кодирующую Cas9, проводили индукцию экспрессии Cas9, подготавливали их для электропорации, а затем проводили электропорацию мутагенным олигонуклеотидом и плазмидой, кодирующей конститутивную экспрессию направляющей РНК (нРНК), которая направляет расщепление Cas9 последовательности rpoB WT. Подвергнутые электропорации клетки восстанавливали в неселективных средах в течение ночи для обеспечения достаточной сегрегации полученных мутантных хромосом. После высевания на селекционную среду для отбора кодирующей нРНК плазмиды, показано, что две из десяти подвергаемых скринингу колоний содержат требуемую мутацию, тогда как остальные, как показано, являются "ускользнувшими" мутантами, полученными вследствие протоспейсерной мутации в плазмиде с нРНК или потери плазмиды с Cas9.

Опосредованный Red лямбда мутагенез с отбором посредством Cas9

[0300] Получали мутанты микроорганизмов-кандидатов CI006 и CI010 с использованием опосредованного Red лямбда мутагенеза с отбором посредством CRISPR-Cas. Нокаут-кассеты содержали эндогенный промотор, идентифицированный посредством транскриптомного профилирования (как описано в примере 2 и приведено в таблицах 3A-C) и области гомологии ≈250 п.н., фланкирующие мишень делеции. CI006 и CI010 трансформировали плазмидами, кодирующими систему рекомбинации Red лямбда (гены exo, beta, gam) под контролем промотора, индуцируемого арабинозой, и Cas9 под контролем промотора, индуцируемого IPTG. У полученных трансформантов индуцировали системы рекомбинации Red и Cas9 и получали штаммы для электропорации. Затем в компетентные клетки трансформировали нокаут-кассеты и плазмиду с кодируемой селектирующей нРНК. После высевания на селективные среды с антибиотиками для плазмиды Cas9 и плазмиды с нРНК, 7 из 10 подвергнутых скринингу колоний продемонстрировали требуемую нокаут-мутация, как представлено на фигуре 3.

Пример 4: Фенотипирование молекул-кандидатов in vitro

[0301] У различных мутантов определяли влияние экзогенного азота на биосинтез и активность нитрогеназы. Для определения нитрогеназной активности в условиях чистой культуры использовали анализ восстановления ацетилена (ARA) (Temme et. al. 2012; 109(18): 7085-7090). Штаммы выращивали в герметически закрытых тестовых пробирках и восстановление ацетилена в этилен количественно определяли с использованием газового хроматографа Agilent 6890. Активность микроорганизмов-кандидатов и других мутантов-кандидатов, выращиваемых в средах для фиксации азота, дополненных глутамином в концентрации от 0 до 10 мМ, в ARA представлена на фигурах 4A-B и фигурах 10A-C.

[0302] В анаэробных условиях культивирования определяли диапазон концентраций глутамина и аммиака с количественным определением влияния на активность фиксации азота. В клетках дикого типа по мере роста концентрации глутамина активность быстро снижалась. Однако в ряду исходных нокаут-мутаций был подтвержден класс мутаций, обеспечивающих экспрессию генов фиксации азота в условиях концентрации глутамина, которые в ином случае подавляют эту активность у дикого типа. Как видно на фигуре 4C, этот профиль получали у четырех разных видов диазотрофов. Кроме того, перенастраивая регуляторную сеть с использованием идентифицированных генетических компонентов, уровень активности фиксации азота регулировали предсказуемым образом. Это можно наблюдать на фигуре 4B, на который проиллюстрированы штаммы CM023, CM021, CM015 и CI006. Штамм CM023 представляет собой слабо эволюционировавший штамм; штамм CM021 представляет собой сильно эволюционировавший штамм; штамм CM015 представляет собой средне эволюционировавший штамм; штамм CI006 представляет собой штамм дикого типа (штамм 2). Аммиак, выделяемый в супернатанты культур, тестировали с использованием ферментативного анализа (MEGAZYME). В анализе определяли количество расходуемого NADPH при оптической плотности 340 нм. Анализ проводили в бактериальных культурах, выращиваемых в не содержащей азот, анаэробной среде с исходной плотностью 10⁹ КОЕ/мл. Как видно на фигуре 4D, в панели из шести эволюционировавших штаммов, один из штаммов выделял до 100 мкМ аммиака в течение периода 48 часов. Кроме того, как видно на фигуре 11 двойной мутант демонстрировал большее выделение аммиака, чем одиночный мутант, из которого он получен. Это демонстрирует способность микроорганизмов продуцировать аммиак в количествах, превышающих их физиологические потребности.

Транскриптомное профилирование чистых культур

[0303] Транскрипционная активность CI006 определяли с использованием платформы Nanostring Elements. Клетки выращивали в не содержащей азот среде и через 4 часа инкубации собирали 10⁸ клеток. Выделяли тотальную РНК с использованием набора Qiagen RNeasy. Очищенную РНК отправляли в Core Diagnostics в Palo Alto, CA, для гибридизации с зондами и анализа Digital Analyzer, как представлено на фигуре 5.

Пример 5: Фенотипирование микроорганизмов-кандидатов in planta

Колонизация растений микроорганизмами-кандидатами

[0304] Колонизацию желательных растения-хозяев микроорганизмами-кандидатами количественно определяли посредством экспериментов с кратковременным ростом растений. Растения кукурузы инокулировали штаммами, экспрессирующими RFP с плазмиды или с интегрированной посредством Tn5 экспрессирующей RFP кассеты. Растения выращивали в стерилизованном песке и нестерильной торфяной среде, а инокуляцию проводили посредством нанесения 1 мл культуры клеток пипеткой непосредственно на появившийся колеоптиль растения через трое суток после пророста. Плазмиды сохраняли посредством полива растений раствором, содержащим соответствующий антибиотик. Через три недели, собирали корни растений, три раза промывали в стерильной воде для удаления видимой почвы и разделяли на два образца. Один образец корней анализировали посредством флуоресцентной микроскопии для определения профилей локализации микроорганизмов-кандидатов. Микроскопию проводили на 10 мм частях лучших интактных корней растений, как представлено на фигуре 6.

[0305] Разработан второй количественный способ оценки колонизации. Проводили количественной анализ ПЦР на препаратах тотальной ДНК из корней растений, инокулированных эндофитами. Семена кукурузы (Dekalb DKC-66-40) проращивали в предварительно автоклавированном песке в горшке 6,35 см на 6,35 см на 25,4 см. Через сутки после посадки проводили пропитку 1 мл ночной культуры эндофитов (среда SOB) непосредственно в участке расположения семян. 1 мл этой ночной культуры приблизительно эквивалентен приблизительно 10⁹ КОЕ, с разбросом в пределах 3 раз друг от друга в зависимости от используемого штамма. Каждый проросток удобряли 3 раза в неделю 50 мл модифицированного раствора Хогланда, дополненного 2,5 мМ или 0,25 мМ нитратом аммония. Через четыре недели после посадки собирали образцы корней для выделения ДНК. Остатки почвы смывали с использованием распыления воды под давлением. Затем эти образцы ткани гомогенизировали с использованием QIAGEN Tissuelyzer, и затем выделяли ДНК с использованием мини-набор для выделения ДНК QIAmp (QIAGEN) по рекомендованному протоколу. С этими выделенными образцами ДНК проводили анализ кПЦР с использованием устройства для ОТ-ПЦР Stratagene Mx3005P с использованием праймеров, которые сконструированы (с использованием Primer BLAST NCBI) специфичными к локусам, в каждом геноме эндофитов. Количественно определяли присутствие копий геномов эндофитов. Для дальнейшего подтверждения идентификации эндофитов проводили секвенирование продуктов амплификации ПЦР и подтверждали наличие правильной последовательности. Обобщенная информация о профилях колонизации штаммов CI006 и CI008 из числа микроорганизмов-кандидатов представлена в таблице 5. У штамма CI008 продемонстрирован уровень колонизации до 10⁷× КОЕ/г сырой массы корня.

Штамм Уровень колонизации (КОЕ/г сырой массы) CI006 1,45×10⁵ CI008 1,24×10⁷

Таблица 5: Колонизация кукурузы, определяемая посредством кПЦР

Профилирование РНК in planta

[0306] Биосинтез компонентов пути nif in planta оценивали, определяя транскрипцию генов nif. Тотальную РНК получали из тканей корней растений, инокулированных CI006 (способы посадки описаны ранее). Выделение РНК проводили с использованием мини-набора RNEasy по рекомендуемому протоколу (QIAGEN). Затем тотальную РНК этих тканей растений анализировали с использованием наборов Nanostring Elements (NanoString Technologies, Inc.) с использованием зондов, специфичных к генам nif в геноме штамма CI006. Данные по экспрессии генов nif in planta обобщены в таблице 6. Экспрессию генов nifH детектировали в инокулированных штаммом CM013 растениях, в то время как у инокулированных CI006 растений экспрессию nifH не детектировали. Штамм CM013 представляет собой производное штамма CI006, у которого ген nifL подвергнут нокауту.

[0307] Высокоэкспрессированные гены CM011, ранжированные по транскриптам в т.н. на миллион (TPM), определяли in planta в условиях добавления удобрений. Промоторы, контролирующие экспрессию некоторых из этих высокоэкспрессированных генов, использовали в качестве матриц для гомологичной рекомбинации в являющихся мишенями локусах фиксации и ассимиляции азота. Проводили выделение образцов РНК выращиваемых в теплице инокулированных CM011 растений, удаляли рРНК с использованием набора Ribo-Zero, секвенировали с использованием платформы Truseq Illumina и обратно картировали на геном CM011. Высокоэкспрессированные гены CM011 приведены в таблице 7.

Штаммы Относительная транскриптов CI006 9,4 CM013 103,25

Таблица 6: Экспрессия nifH in planta

Название гена Положение гена Направление Общее количество прочтений TPM (транскрипты в т.н. на миллион) CDS rpsH 18196-18588 обратное 4841,5 27206,4 CDS rplQ 11650-12039 обратное 4333 24536,2 CDS rpsJ 25013-25324 обратное 3423 24229 CDS rplV 21946-22278 обратное 3367,5 22333 CDS rpsN 18622-18927 обратное 2792 20150,1 CDS rplN 19820-20191 обратное 3317 19691,8 CDS rplF 17649-18182 обратное 4504,5 18628,9 CDS rpsD 13095-13715 обратное 5091,5 18106,6 CDS rpmF 8326-8493 прямое 1363,5 17923,8 CDS rplW 23429-23731 обратное 2252 16413,8 CDS rpsM 14153-14509 обратное 2269 14036,2 CDS rplR 17286-17639 обратное 2243,5 13996,1 CDS rplC 24350-24979 обратное 3985 13969,2 CDS rplK 25526-25954 обратное 2648,5 13634,1 CDS rplP 20807-21217 обратное 2423 13019,5 CDS rplX 19495-19809 обратное 1824 12787,8 CDS rpsQ 20362-20616 обратное 1460,5 12648,7 CDS bhsA 3 79720-79977 обратное 1464 12531,5 CDS rpmC 20616-20807 обратное 998,5 11485 CDS rpoA 12080-13069 обратное 4855 10830,2 CDS rplD 23728-24333 обратное 2916,5 10628,5 CDS bhsA 1 78883-79140 обратное 1068 9141,9 CDS rpsS 22293-22571 обратное 1138,5 9011,8 CDS rpmA 2210-2467 прямое 1028,5 8803,7 CDS rpmD 16585-16764 обратное 694,5 8520,8 CDS rplB 22586-23410 обратное 3132 8384 CDS rpsC 21230-21928 обратное 2574,5 8133,9 CDS rplE 18941-19480 обратное 1972,5 8066,9 CDS rplO 16147-16581 обратное 1551 7874,2 CDS белка-предшественника субъединицы транслоказы SecY 14808-16139 обратное 4657 7721,2 CDS rpsE 16771-17271 обратное 1671,5 7368 CDS rpsK 13746-14135 обратное 1223,5 6928,2 CDS tufA 27318-28229 обратное 2850 6901,3 CDS rpmI 38574-38771 прямое 615 6859,5 CDS rplU 1880-2191 прямое 935,5 6621,7 CDS rplT 38814-39170 прямое 1045 6464,4 CDS bhsA 2 79293-79550 обратное 754 6454,1 CDS rpmB 8391-8627 обратное 682 6355,1 CDS rplJ 23983-24480 обратное 1408 6243,9 CDS fusA 2 481-2595 обратное 5832 6089,6 CDS rpsA 25062-26771 обратное 4613 5957,6 CDS rpmJ 14658-14774 обратное 314 5926,9 CDS rpsR 52990-53217 прямое 603 5840,7 CDS rpsG 2692-3162 обратное 1243 5828,2 CDS rpsI 11354-11746 обратное 980,5 5509,8 CDS cspC 1 8091-8300 обратное 509 5352,8 CDS rpsF 52270-52662 прямое 916 5147,4 CDS rpsT 55208-55471 обратное 602 5035,9 CDS infC 38128-38478 прямое 755 4750,3 CDS cspG 30148-30360 прямое 446 4624,2

Таблица 7

Анализ ¹⁵N

[0308] В основном способе демонстрации фиксации используют изотоп азота ¹⁵N, который находится в атмосфере с установленным уровнем относительно ¹⁴N. Добавляя в каждое удобрение или атмосферу повышенные уровни ¹⁵N, можно наблюдать фиксацию или непосредственно в увеличенных количествах ¹⁵N, фиксируемого из атмосферы, дополненной газообразным ¹⁵N₂ (Yoshida 1980), или опосредовано посредством разведения обогащенного удобрения атмосферным газообразным N₂ в тканях растений (Iniguez 2004). Способ разведения позволяет наблюдать накопление фиксированного азота в течение роста растения, тогда как способ с газообразным ¹⁵N₂ ограничен определением фиксации, которая происходит в течение короткого интервала, в течение которого растение можно выращивать в ограниченной атмосфере (измерения скорости). Таким образом, способ с использованием газа лучше подходит для определения специфичности (так как любые повышенные уровни ¹⁵N₂ в растении, превышающие атмосферный уровень, можно однозначно соотнести с фиксацией), но им нельзя демонстрировать суммарную активность.

[0309] Для определения активности фиксация улучшенных штаммов относительно штаммов дикого типа и не подвергаемых инокуляции растений кукурузы проводили оба типа анализа, и у нескольких из улучшенных штаммов in planta наблюдали увеличенные уровни фиксация (фигура 12, фигура 14A и фигура 14B). Эти анализы являются важными для демонстрации того, что активность исследуемых штаммов in vitro соответствует результатам in vivo. Кроме того, эти анализы позволяют определять влияние удобрения на активность штамма, позволяя предполагать соответствующую функциональность в сельскохозяйственных условиях. Подобные результаты наблюдали, когда штаммами дикого типа и улучшенными штаммами инокулировали растения Setaria (фигура 13). Активность фиксации in planta, приведенная на фигурах 14A-14C, дополнительно подтверждена транскриптомными данными. Эволюционировавшие штаммы демонстрируют увеличенный уровень транскриптов nifH относительно вариантов дикого типа. Кроме того, обеспечиваемый микроорганизмами уровень азота in planta также коррелировал с уровнем колонизации растения в расчете на растение. Эти результаты (фигура 12, фигура 13, фигуры 14A-14C, фигура 15A и фигура 15B) поддерживают гипотезу о том, что вероятной причиной увеличения получаемого из атмосферы азота, наблюдаемого в тканях растений, является микроорганизм, вследствие улучшенной регуляции кластера генов nif. В дополнение к прямому определению фиксация определяли эффект инокуляции растений улучшенными штаммами в анализе биомассы растений в условиях недостатка азота. Хотя биомасса растения может быть связана со множеством возможных взаимодействий микроорганизмов с растением, можно ожидать, что добавление фиксированного азота может влиять на фенотип растения в условиях недостатка азота. Инокулированные растения выращивали в условиях полного отсутствия азота, наблюдали и значимое увеличение площади листьев, сырой и сухой массы побегов и сырой и сухой массы корней у инокулированных растений относительно необработанных контрольных растений (фигура 14C). Хотя эти различия нельзя приписать исключительно фиксации азота, они поддерживают вывод, что улучшенные штаммы активно предоставляют азот растениям. Выращивали растения кукурузы и Setaria и инокулировали как описано выше. Растениям посредством полива регулярно добавляли удобрение, содержавшее 1,2% ¹⁵N. Фиксацию азота микроорганизмами количественно определяли, определяя уровень ¹⁵N в ткани растения. На 4 неделе после посадки получали ткань четвертого листа и высушивали. Высушенные образцы листьев гомогенизировали с использованием гранул (QIAGEN Tissuelyzer) и разделяли на аликвоты в жестяные капсулы для IRMS (MBL Stable Isotope Laboratory at The Ecosystems Center, Woods Hole, MA). Рассчитывали азот, получаемый из атмосферы (NDFA), и продукция азота CI050 и CM002 приведена на фигуре 7.

Анализ продукции фитогормонов

[0310] Ранее для исследования влияния индол-3-уксусной кислоты на созревание плодов посредством анализа in vitro использовали сорт карликовых томатов (Solanum lycopersicum) "Micro-Tom" (Cohen 1996; J Am Soc Hortic Sci 121: 520-524). Для оценки продукции и секреции фитогормонов микроорганизмами-кандидатами разработан анализ планшетного скрининга с использованием незрелых плодов Micro-Tom. Получали двенадцатилуночные тестовые планшеты для тканевых культур, заполняя лунки агарозной средой, позволяя ей отвердевать и нанося на поверхность агара 10 мкл ночной культуры микроорганизмов, как представлено на фигуре 8. Лунки с агаром содержат увеличенные количества гибберелловой кислоты (GA), но в качестве положительного контроля и стандартнов не использовали ни одной культуры бактерий. В агар в участок нанесения бактериальной культуры стеблем вперед помещали цветы, срезанные с растущих растений Micro-Tom через сутки после начала цветения. За этими цветами наблюдали в течение 2-3 недель, после чего собирали и взвешивали плоды. Увеличение массы плода растения в нескольких повторениях свидетельствовал о продукции гормонов растений инокулируемыми микроорганизмами, как представлено на фигуре 9.

Пример 6: Циклическaя эволюция хозяин-микроорганизм

[0311] Растения кукурузы инокулировали CM013 и выращивали 4 недели приблизительно до стадии роста V5. Растения, демонстрирующие улучшенное накопление азота из микробных источников по результатам анализа ¹⁵N, выкорчевывали, и корни отмывали с использованием воды под давлением для удаления основной почвы. Производили срез корня массой 0,25 г и промывали в растворе PBS для удаления мелких частичек почвы и неприкрепившихся микроорганизмов. Образцы ткани гомогенизировали с использованием 3 мм стальных гранул в QIAGEN TissueLyser II. Гомогенат разбавляли и наносили в планшеты на агарозные среды SOB. Единичные колонии ресуспендировали в жидких средах и подвергали анализу ПЦР 16s рДНК и мутаций, уникальных для инокулируемого штамма. Процесс выделения микроорганизма, мутагенеза, инокуляции и повторного выделения можно повторять несколько раз с улучшением признаков микроорганизма, признаков растений и способности микроорганизмов к колонизации.

Пример 7: Совместимость в различных географических условиях

[0312] Способность улучшенных микроорганизмов к колонизации инокулированного растения является критичной для успешного существования растения в полевых условиях. Хотя описанные способы выделения разработаны для выбора из почвенных микроорганизмов, которые могут иметь тесную связь с сельскохозяйственными культурами, такими как кукуруза, многие штаммы не могут эффективно колонизировать в целому ряду генотипов растений, типов окружающей среды, типов почв или условий инокуляции. Так как колонизация представляет собой сложный процесс, требующий целого ряда взаимодействий между штаммом микроорганизмов и растением-хозяином, основным способом для выбора приоритетных штаммов для дальнейшей разработки стал скрининг на способность к колонизации. В ранних попытках оценки колонизации использовали флуоресцентно меченые штаммы, которая являлась эффективной, но отнимала много времени и не являлась масштабируемой относительно штаммов. Так как активность колонизации не поддается непосредственному улучшению, крайне важно отбирать потенциальных продуцирующих кандидатов из штаммов, которые являются природными колонизаторами.

[0313] Разработан анализ для тестирования на стабильную колонизацию штаммами дикого типа любого данного растения-хозяина с использованием кПЦР и праймеров, сконструированных так, чтобы они являлись специфичными для штамма в образце сообщества. Этот анализ предназначен для быстрого определения скорости колонизации микроорганизмов из образцов ткани кукурузы. Исходные тесты с использованием штаммов, оцениваемых как вероятные колонизаторы, с использованием флуоресцентной микроскопии и планшетных способов, продемонстрировали, что подход кПЦР может являться количественным и масштабируемым.

[0314] Типичный анализ проводят следующим образом: растения, в основном сорта кукурузы и пшеницы, выращивают в торфяной горшковой смеси в теплице в шести повторениях на штамм. Через четыре или пять суток после посадки 1 мл пропитки культур бактерий в ранней стационарной фазе, разбавленной до OD₅₉₀ 0,6-1,0 (приблизительно 5×10⁸ КОЕ/мл), пипетируют на восходящий колеоптиль. Растения поливают только водопроводной водой и оставляют рати в течение четырех недели с последующим забором образцов, во время которого растения выкорчевывают и корни тщательно промывают с удалением большинства остатков торфа. Вырезают образцы чистых корней и гомогенизируют с получением взвеси клеток дебриса растения и ассоциированных бактериальных клеток. Авторы разработали протокол высокопроизводительного выделения ДНК, который позволяет эффективно получать смесь ДНК растения и бактерий для использования в качестве матрицы для кПЦР. На основе экспериментом во резкому возрастанию количества бактериальных клеток, этим способом выделения ДНК получают количественный образец бактериальной ДНК относительно сырой массы корней. Каждый штамм оценивают с использованием штаммоспецифичных праймеров, сконструированных с использованием Primer BLAST (Ye 2012) и сравнивают с фоновой амплификацией у не подвергаемых инокуляции растений. Так как у некоторых праймеров у не подвергаемых инокуляции растений выявлена побочная амплификация, колонизацию определяют по наличию амплификации или повышенной амплификации соответствующего продукта по сравнению с фоновым уровнем.

[0315] Этот анализ использовали для определения совместимости продукта микроорганизмов в различных почвенных географических условиях. Качества полевых почв и полевые условия могут оказывать очень большое влияние на действие продукта микроорганизмов. pH почвы, способность к удержанию воды и конкурирующие микроорганизмы являются только малым количеством примеров факторов почвы, которые могут влиять на жизнеспособность инокулята и его способность к колонизации. Анализ колонизации проводили с использованием трех различных типов почв, образцы которых в качестве среды для выращивания растений получены с сельскохозяйственных полей в Калифорнии (фигура 16A). Для аппроксимации реальных сельскохозяйственных условий использовали промежуточную плотность инокуляции. В течение 3 недель штамм 5 колонизировал все растения на уровне от 10⁶ до 10⁷ КОЕ/г сырой массы. Через 7 недель роста растений, эволюционировавшая версия штамма 1 демонстрировала высокие уровни колонизации (10⁶ КОЕ/г сырой массы) во всех типах почв. (фигура 16B).

[0316] Кроме того, для оценки колонизации в сложных полевых условиях на поле площадью 1 акр в Сан-Луис-Обиспо в июне 2015 года начато испытание с оценкой влияния и колонизации семи штаммов дикого типа на два сорта полевой кукурузы. Агротехническое проектирование и проведение испытания выполняла по контракту полевая исследовательская организация, Pacific Ag Research. Для инокуляции, использовали тот же способ покрытия семян торфяной культуры, который был испытан в экспериментах по способам инокуляции. В течение вегетационного периода собирали образцы растений для оценки колонизации корня и внутренности стебля. Образцы собирали из трех повторных участков после каждой обработки через четыре и восемь недель после посадки, и из всех шести повторений после каждой обработки незадолго перед сбором через 16 недель. Дополнительные образцы собирали из всех шести повторных участков после обработок путем инокуляции штамма 1 и штамма 2, а также необработанных контролей, через 12 недель. Число клеток на грамм сырой масса отмытых корней оценивали также, как и в других анализах колонизации с использованием кПЦР и штаммоспецифичных праймеров. Два штамма, штамм 1 и штамм 2, продемонстрировали стабильную и повсеместную колонизацию корней, которая достигала максимума через 12 недель, а затем резко снижалась (фигура 16C). Хотя штамм 2, по видимому, присутствовал в количествах, на порядок меньших, чем штамм 1, выявлено, что он его количества от растению к растению являются более постоянными. По видимому, ни один из штаммов внутренность стебля эффективно не колонизирует. В поддержку данных кПЦР о колонизации, оба штамма успешно повторно выделяли из образцов корней с использованием планшетов и секвенирование 16S для идентификации изолятов соответствующей последовательности.

Пример 8: Выведение микроорганизмов

[0317] Примеры выведения микроорганизмов можно обобщить на схеме фигуры 17A. На фигуре 17A приведено выведение микроорганизмов, где сначала можно определить состав микробиома и идентифицировать представляющий интерес вид. Метаболизм микробиома можно картировать и связать с генетикой. Затем можно провести направленную генетическую вариацию способами, включающими в качестве неограничивающих примеров конъюгацию и рекомбинацию, химический мутагенез, адаптивную эволюцию и редактирование генов. Производные микроорганизмы используют для инокуляции сельскохозяйственных культур. В определенных примерах выбраны сельскохозяйственные культуры с наилучшими фенотипами.

[0318] Как предоставлено на фигуре 17A сначала можно определить состав микробиома и идентифицировать представляющий интерес вид. На фигуре 17B приведен расширенный вид этапа определения микробиома. Метаболизм микробиома можно картировать и связать с генетикой. Метаболизм азота может включать вход аммиака (NH₄⁺) из ризосферы в цитозоль бактерий посредством транспортера AmtB. Глутаминсинтетаза и АТФ осуществляют катализ преобразования аммиака и L-глутамината (L-Glu) в глутамин. Глутамин может приводить к формированию биомассы (росту растений), а также он может ингибировать экспрессию оперона nif. Затем, можно провести направленную генетическую вариацию способами, включающими в качестве неограничивающих примеров конъюгацию и рекомбинацию, химический мутагенез, адаптивную эволюцию и редактирование генов. Производные микроорганизмы используют для инокуляции сельскохозяйственных культур. Выбраны сельскохозяйственные культуры с наилучшими фенотипами.

Пример 9: Полевые испытания с микроорганизмами по изобретению - лето 2016 года

[0319] Для оценки воздействия штаммов по настоящему изобретению на рост и продуктивность кукурузы при различных режимах азота проводили полевые испытания.

[0320] Испытания проводили с (1) обработкой семи участков шестью штаммами и контролем - у четырех основных участков устанавливали 0, 15, 85 и 100% максимального возврата азота (MRTN) с региональным подтверждением. Контроль (только UTC) проводили при 10 100% MRTN плюс 5, 10 или 15 фунтов. Обработки проводили в четырех повторениях.

[0321] Участки кукурузы (минимум) составляли 4 ряда по 9,144 метра длиной с 124 участки на регион. Все наблюдения проводили в центральных двух рядах участков, а все получения образца с разрушением проводили во внешних рядах. Образцы семян перед использованием охлаждали до 1,5-2 часов.

[0322] Региональная сельскохозяйственная практика: Семена представляли собой коммерческую кукурузу без общепринятой обработки фунгицидами и инсектицидами. Все пропитки семян проводили одним специалистом по пропитке семян для обеспечения однородности. Дату посадки, норму высева, контроль сорняков/насекомых и т.д. оставляли как при региональной сельскохозяйственной практике. За исключением применения фунгицидов, использовали стандартные способы регуляции.

[0323] Характеристики почв: Оценивали текстуру почв и плодородность почв. Образцы почв для каждого повторения засеивали предварительно для гарантии остаточных уровней нитратов ниже 22,7 кг/акр. Получали образцы грунта от 0 см до 30 см. Почву дополнительно характеризовали по pH, CEC, общим K и P.

[0324] Оценки: Начальную популяцию растений оценивали через 14 суток после посадки (DAP)/акр и дополнительно оценивали на: (1) мощность (по шкале от 1 до 10, w/10=отлично) 14 DAP & V10; (2) ведение протокола рейтингов заболеваний в любой момент, когда на участках проявляются симптомы; (3) запись любых различий при полегании, если на участке происходит полегание; (4) урожайность (Bu/акр), скорректированная на стандартный процент влажности; (5) массу теста и (6) процент влажности зерен.

[0325] Требования к получению образцов: Образец почва получали в трех временных точках (до начала испытания, V10-VT, 1 неделя после сбора урожая). Во всех шести регионах и на всех участках отбирали образец с 10 граммами на образец (124 участка × 3 временные точки × 6 регионов).

[0326] Получение образца колонизации: Образцы колонизация собирали в двух временных точках (V10 и VT) для пяти регионов и шести временных точках (V4, V8, V10, VT, R5 и после сбора урожая). Образцы собирали следующим образом: (1) от 0% и 100% MRTN, 60 участков на регион; (2) 4 растения на участок, случайно выбранных из внешних рядов; (3) 5 граммов корня, 20,3 см стебля и вернхие три листа, каждый раздельно упакованный в мешок и с присвоенным ID - 12/мешков на участок; (4) пять регионов (60 участков × 2 временные точки × 12 мешков/участок); и один регион (60 участков × 6 временных точек × 12 мешков/участок. См., фигуру 17C, иллюстрирующую получение образцов колонизации.

[0327] Определение нормализованного разностного вегетационного индекса (NDVI) проводили с использованием инструмента Greenseeker в двух временных точках (V4 - V6 и VT). Анализировали каждый участок во всех шести регионах (124 участка × 2 временных точки × 6 регионов).

[0328] Анализ корней проводили с использованием Win Rhizo из оного региона, который лучше всего иллюстрировал различия обработки. Случайным образом проводили отбор десяти растений на участок (по 5 рядом с каждым внешним рядом; предпочтительно отбирали растения на этапе V3-V4) и осторожно промывали для удаления как можно большего количества загрязнений. Десять корни помещали в пластиковый пакет и помечали. Анализ корней проводили с использованием анализа корней WinRhizo.

[0329] Характеристики стеблей проводили для всех шести регионов между R2 и R5. Регистрировали диаметр стебля десяти растений на участок при высоте 15 см, а также длину первого междоузлия выше отметки 15 см. Проводили мониторинг десяти растений; пять последовательных растений от центра двух внутренних рядов. Проводили оценку в шести регионах (124 участка × 2 измерения × 6 регионов).

[0330] Нитраты тканей анализировали на всех участках и во всех регионах. Участок стебля длиной 20,3 см начинающийся от 15 см выше почва когда кукуруза находилась между первой и третей неделями после формирования черной точки; влагалища листьев удаляли. Оценивали все регионы и участки (6 регионов × 124 участка).

[0331] Для всех регионов от начала посадки до сбора урожая регистрировали следующие погодные данные: суточные максимальные и минимальные температуры, температура почвы при посеве, суточные осадки плюс полив (если применимо) и любые необычные погодные явления, такие как сильный дождь, ветер, холод или жара.

[0332] В таблице 8 приведены данные по урожайности во всех шести регионах. Уровень азота значимо влиял на урожайность, но штаммы по уровням азота влияния не оказывали. Однако при наименьшем уровне азота штаммы CI006, CM029 и CI019 численно превзошли UTC на 4-6 bu/акр. Урожайность также численно увеличилась на 2-4 bu/акр под действием штаммов CM029, CI019 и CM081 при 15% MRTN.

Таблица 8: Данные по урожайности для всех шести регионов

MRTN% Урожайность (bu) Мощность _E Мощность _L Диаметр стебля (мм) Длина междоузлия (in) NDVI _Veg NDVI _Rep 0 143,9 7,0 5,7 18,87 7,18 64,0 70,6 15 165,9 7,2 6,3 19,27 7,28 65,8 72,5 85 196,6 7,1 7,1 20,00 7,31 67,1 74,3 100 197,3 7,2 7,2 20,23 7,37 66,3 72,4 Штамм YLD (bu) Мощность _E Мощность _L Диаметр стебля (мм) Длина междоузлия (in) NDVI _Veg NDVI _Rep CI006 (1) 176,6 7,2 6,6 19,56 18,78 66,1 72,3 CM029 (2) 176,5 7,1 6,5 19,54 18,61 65,4 71,9 CM038 (3) 175,5 7,2 6,5 19,58 18,69 65,7 72,8 CI019 (4) 176,0 7,1 6,6 19,51 18,69 65,5 72,9 CM081 (5) 176,2 7,1 6,6 19,57 18,69 65,8 73,1 CM029/см081 (6) 174,3 7,1 6,6 19,83 18,79 66,2 72,5 UTC (7) 176,4 7,1 6,6 19,54 18,71 65,9 71,7 MRTN/Штамм YLD (bu) Мощность _E Мощность _L Диаметр стебля (мм) Длина междоузлия (in) NDVI _Veg NDVI _Rep 0 1 145,6 7,0 5,6 19,07 7,12 63,5 70,3 0 2 147,0 7,0 5,5 18,74 7,16 64,4 70,4 0 3 143,9 7,0 5,5 18,83 7,37 64,6 70,5 0 4 146,0 6,9 5,7 18,86 7,15 63,4 70,7 0 5 141,7 7,0 5,8 18,82 7,05 63,6 70,9 0 6 142,2 7,2 5,8 19,12 7,09 64,7 69,9 0 7 141,2 7,0 5,8 18,64 7,32 64,0 71,4 15 1 164,2 7,3 6,1 19,09 7,21 66,1 71,5 15 2 167,3 7,2 6,3 19,32 7,29 65,5 72,7 15 3 165,6 7,3 6,3 19,36 7,23 64,8 72,5 15 4 167,9 7,3 6,4 19,31 7,51 66,1 72,3 15 5 169,3 7,2 6,2 19,05 7,32 66,0 72,8 15 6 161,9 7,1 6,3 19,45 7,20 66,2 72,2 15 7 165,1 7,3 6,4 19,30 7,18 66,0 73,3 85 1 199,4 7,3 7,2 19,70 7,32 67,2 74,0 85 2 195,1 7,1 7,2 19,99 7,09 66,5 74,4 85 3 195,0 7,0 7,0 20,05 7,26 67,3 74,6 85 4 195,6 7,2 7,1 20,04 7,29 66,4 74,4 85 5 196,4 7,2 7,0 19,87 7,39 67,3 74,5 85 6 195,1 7,0 6,9 20,35 7,34 67,4 74,4 85 7 199,5 6,9 7,2 19,97 7,48 67,4 74,1 100 1 197,1 7,2 7,3 20,38 7,68 67,5 73,4 100 2 196,5 7,0 7,1 20,11 7,21 65,3 70,2 100 3 197,6 7,5 7,3 20,08 7,42 66,3 73,4 100 4 194,6 7,1 7,1 19,83 7,40 66,1 74,1 100 5 197,4 7,2 7,3 20,53 7,36 66,2 74,3 100 6 198,1 7,2 7,4 20,40 7,16 66,6 73,6 100 7 199,9 7,2 7,2 20,26 7,32 66,2 68,1

[0333] В таблице 9 представлен другой подход к анализу. В таблице представлены четыре региона, где реакция на азот была наибольшей, что позволяет предполагать, что доступный остаточный азот был наименьшим. Этот подход не меняет оценку того, что уровень азота значимо влияет на урожайность, чего не делали штаммы при усреднении по всем уровням азота. Однако числовое преимущество урожайности при наименьшем уровне N является более выраженным для всех штаммов, особенно для CI006, CM029 и CM029/CM081, где урожайность вырастала от 8 до 10 bu/акр. При 15% MRTN штамм CM081 превосходил UTC на 5 bu.

Таблица 9: Данные по урожайности в четырех регионах

Среднее по 4 регионам - SGS, AgIdea, Bennett, RFR Таблица 16 MRTN% YLD (bu) Мощность _E Мощность _L Диаметр стебля (мм) Длина междоузлия (in) 0 137,8 7,3 5,84 18,10 5,36 15 162,1 7,5 6,63 18,75 5,40 85 199,2 7,4 7,93 19,58 5,62 100 203,5 7,5 8,14 19,83 5,65 Штамм YLD (bu) Мощность _E Мощность _L Диаметр стебля (мм) Длина междоузлия (in) CI006 (1) 175,4 7,5 7,08 19,03 5,59 CM029 (2) 176,1 7,4 7,08 19,09 5,39 CM038 (3) 175,3 7,5 7,05 19,01 5,59 CI019 (4) 174,8 7,5 7,16 19,02 5,45 CM081 (5) 176,7 7,4 7,16 19,00 5,53 CM029/см081 (6) 175,1 7,4 7,17 19,33 5,46 UTC (7) 176,0 7,3 7,27 18,98 5,55 MRTN/Штамм YLD (bu) Мощность _E Мощность _L Диаметр стебля (мм) Длина междоузлия (in) 0 1 140,0 7,3 5,69 18,32 5,28 0 2 140,7 7,4 5,69 18,19 5,23 0 3 135,5 7,3 5,63 17,95 5,50 0 4 138,8 7,3 5,81 17,99 5,36 0 5 136,3 7,3 6,06 18,05 5,34 0 6 141,4 7,5 6,00 18,43 5,30 0 7 131,9 7,3 6,00 17,75 5,48 15 1 158,0 7,6 6,44 18,53 5,34 15 2 164,1 7,5 6,56 19,13 5,42 15 3 164,3 7,6 6,63 18,68 5,51 15 4 163,5 7,6 6,81 18,84 5,34 15 5 166,8 7,5 6,63 18,60 5,39 15 6 156,6 7,4 6,56 18,86 5,41 15 7 161,3 7,5 6,81 18,62 5,42 85 1 199,4 7,6 8,00 19,15 5,63 85 2 199,0 7,4 8,09 19,49 5,46 85 3 198,2 7,4 7,75 19,88 5,69 85 4 196,8 7,4 8,00 19,65 5,60 85 5 199,5 7,4 7,75 19,26 5,70 85 6 198,7 7,3 7,81 19,99 5,61 85 7 202,8 7,2 8,13 19,66 5,65 100 1 204,3 7,4 8,19 20,11 6,10 100 2 200,6 7,3 8,00 19,53 5,46 100 3 203,3 7,7 8,19 19,55 5,67 100 4 200,2 7,6 8,00 19,59 5,49 100 5 203,9 7,4 8,19 20,08 5,68 100 6 203,8 7,5 8,31 20,05 5,52 100 7 208,1 7,4 8,13 19,90 5,63

[0334] Результаты полевых испытаний также проиллюстрированы на фигурах 21-27. Результаты свидетельствуют, что микроорганизмы по изобретению способны увеличивать урожайность растений, что указывает на способность исследуемых микроорганизмов увеличивать фиксацию азота у важной сельскохозяйственной культуры, т.е. кукурузы.

[0335] Полевые результаты дополнительно подтверждают описанные способы не являющейся межродовой модификации генома отобранных штаммов микроорганизмов для получения сельскохозяйственно значимых результатов в полевых условиях при применении указанных инженерных штаммов к сельскохозяйственной культуре.

[0336] На фигуре 18 приведена линия модифицированных штаммов, полученных из штамма CI006 (дикий тип Kosakonia sacchari). Полевые данные демонстрируют, что подвергнутое генетической инженерии производное штаммов CI006 дикого типа, т.е. CM029, может приводить к численно релевантным результатам в полевых условиях. Например, таблица 8 демонстрирует, что при 0% MRTN CM029 приводил к урожайности 147,0 bu/акр по сравнению с необработанным контролем при 141,2 bu/акр (увеличение на 5,8 bu/акр). Таблица 8 также демонстрирует, что при 15% MRTN CM029 приводил к урожайности 167,3 bu/акр по сравнению с необработанным контролем при 165,1 bu/акр (увеличение на 2,2 bu/акр). Таблица 9 поддерживает эти заключения и демонстрирует, что при 0% MRTN CM029 приводил к урожайности 140,7 bu/акр по сравнению с необработанным контролем при 131,9 bu/акр (увеличение на 8,8 bu/акр). Таблица 9 также демонстрирует, что при 15% MRTN CM029 приводил к урожайности 164,1 bu/акр по сравнению с необработанным контролем при 161,3 bu/акр (увеличение на 2,8 bu/акр).

[0337] На фигуре 19 приведена линия модифицированных штаммов, полученных из штамма CI019 (дикий тип Rahnella aquatilis). Полевые данные демонстрируют, что подвергнутое генетической инженерии производное штаммов CI019 дикого типа, т.е. CM081, может приводить к численно релевантным результатам в полевых условиях. Например, таблица 8 демонстрирует, что при 15% MRTN CM081 приводил к урожайности 169,3 bu/акр по сравнению с необработанным контролем при 165,1 bu/акр (увеличение на 4,2 bu/акр). Таблица 9 поддерживает эти заключения и демонстрирует, что при 0% MRTN CM081 приводил к урожайности 136,3 bu/акр по сравнению с необработанным контролем при 131,9 bu/акр (увеличение на 4,4 bu/акр). Таблица 9 также демонстрирует, что при 15% MRTN CM081 приводил к урожайности 166,8 bu/акр по сравнению с необработанным контролем при 161,3 bu/акр (увеличение на 5,5 bu/акр).

[0338] Кроме того, в таблице 9 можно наблюдать, что комбинация CM029/см081 при 0% MRTN приводила к урожайности 141,4 bu/акр по сравнению с необработанным контролем при 131,9 bu/акр (увеличение на 9,5 bu/акр).

Пример 10: Полевые испытания с микроорганизмами по изобретению

[0339] В природе, включая сельскохозяйственные почвы, можно найти большое разнообразие фиксирующих азот бактерий можно. Однако потенциал микроорганизма для предоставления достаточного количество азота сельскохозяйственным культурам, чтобы обеспечить снижение использования удобрений, может быть лимитирован подавлением нитрогеназных генов в удобряемых почвах, а также низким количеством в тесной ассоциации с корнями сельскохозяйственных культур. Идентификация, выделение и выведение микроорганизмов, которые тесно ассоциированы с ключевыми коммерческими сельскохозяйственными культурами, может разрушить и улучшить регуляторные сети, связывающие чувствительность к азоту и фиксацию азота, и разблокировать значительный вклад ассоциированных с сельскохозяйственными культурами микроорганизмов в уровень азота. С этой целью идентифицированы фиксирующие азот микроорганизмы, ассоциированные и колонизирующие корневую систему кукурузы.

[0340] Собирали образцы корней растений кукурузы, выращиваемых в агротехнически значимых почвах, и из ризосферы и эндосферы выделяли популяции микроорганизмов. Выделяли геномную ДНК этих образцов с последующим секвенированием ампликонов 16S для профилирования состава сообщества. Выделен микроорганизм Kosakonia sacchari (штамм PBC6.1) и классифицирован посредством 16S рРНК и полногеномного секвенирования. Он представляет собой особенно интересный фиксатор азота, способный к колонизации почти 21% численности ассоциированной с корнями микробиоты (фигура 30). Для оценки чувствительности штамма к экзогенному азоту определяли уровни фиксации азота в чистой культуре с использованием классического анализа восстановления ацетилена (ARA) и различных уровней добавления глутамина. Вид демонстрировал высокий уровень активности фиксации азота в не содержащих азота средах, но экзогенный фиксированный азот подавлял экспрессию гена nif и нитрогеназную активность (штамм PBC6.1, фигура 28C и 28D). Кроме того, когда определяли аммиак, выделенный в супернатант PBC6.1, выращиваемого в азотфиксирующих условиях, можно было выявить очень небольшое выделение фиксированного азота (фигура 28E).

[0341] Авторы выдвинули гипотезу, что PBC6.1 мог бы стать значительным источником фиксированного азота на удобряемых полях, если бы регуляторные сети, контролирующие метаболизм азот были переконструированы с обеспечением оптимальной экспрессии нитрогеназы и выделения аммиака в присутствии фиксированного азота. Для обеспечения широкой фенотипической реконструкции без вставок трансгенов или синтетических регуляторных элементов в геноме PBC6.1 должно существовать достаточное генетическое разнообразие. Геном выделенного штамма составляет по меньшей мере 5,4 т.п.н. и содержит канонический кластер генов фиксации азота. Связанные пути метаболизма азота в PBC6.1 являются сходными с путями метаболизма азота модельного организма для фиксации азота, Klebsiella oxytoca m5al.

[0342] Идентифицировано несколько узлов генной регуляторной сети, которые могут усиливать фиксацию азота и последующую его передачу растению-хозяину, особенно в условиях высоких экзогенных концентраций фиксированного азота (рис. 28А). Оперон nifLA напрямую регулирует остальную часть кластера nif посредством активации транскрипции с помощью NifA и азот- и кислород-зависимой репрессии NifA посредством NifL. Разрушение nifL может устранить ингибирование NifA и улучшить экспрессию nif в присутствии кислорода и экзогенного фиксированного азота. Кроме того, экспрессия nifA под контролем азот-независимого промотора может отделить биосинтез нитрогеназы от регуляции азотчувствительным комплексом NtrB/NtrC. Ассимиляцию фиксированного азота микроорганизмом в глютамин посредством глутаминсинтетазы (GS) обратимо регулирует двухдоменный фермент аденилаттрансфераза (АТаза) GlnE посредством аденилирования и деаденилирования GS с ослаблением и восстановлением активности, соответственно. Укорочение белка GlnE с удалением его удаляющего аденилат (AR) домена может приводить к конститутивно аденилированной глутаминсинтетазе, ограничивающей ассимиляцию аммиака микроорганизмом и увеличивающей содержание внутри- и внеклеточного аммиака. Наконец, снижение экспрессии AmtB, переносчика, ответственного за захват аммиака, может приводить к увеличению содержания внеклеточного аммиака. Для получения рационально сконструированных фенотипов микроорганизмов без использования трансгенов использовали два подхода: получение безмаркерных делеций геномных последовательностей, кодирующих домены белка или целые гены, и перестройка регуляторных сетей посредством внутригеномной перегруппировки промоторов. Посредством повторяющегося процесса мутагенеза получено несколько нетрансгенных производных штаммов PBC6.1 (таблица 10).

Таблица 10. Список выделенных и производных штаммов K. sacchari используемых в настоящей работе. Prm, промоторная последовательность, полученная из генома PBC6.1; ΔglnE_AR1 и ΔglnE_AR2, различные укороченные варианты последовательности гена glnE, удаляющего удаляющий аденилат домен.

Штамм ID Генотип PBC6.1 дикий тип PBC6.14 ΔnifL::Prm1 PBC6.15 ΔnifL::Prm5 PBC6.22 ΔnifL::Prm3 PBC6.37 ΔnifL::Prm1 ΔglnE _AR2 PBC6.38 ΔnifL::Prm1 ΔglnE_AR1 PBC6.93 ΔnifL::Prm1 ΔglnE _AR2 ΔamtB PBC6.94 ΔnifL::Prm1 ΔglnE _AR1 ΔamtB

[0343] Проведено несколько анализов in vitro для характеристики конкретных фенотипов производных штаммов. Для оценки чувствительности штамма к экзогенному азоту использовали ARA, в котором PBC6.1 демонстрировал подавление активности нитрогеназы при высоких концентрациях глютамина (фиг. 28D). В отличие от этого у большинства производных штаммов выявлен дерепрессированный фенотип с варьирующими уровнями восстановления ацетилена, наблюдаемыми при высоких концентрациях глютамина. Скорости транскрипции nifA в образцах, анализируемых посредством кПЦР, хорошо коррелировали со скоростями восстановления ацетилена (рис. 31), свидетельствуя в пользу гипотезы о том, что разрушение nifL и вставка азот-независимого промотора для контроля nifA может приводить к дерепрессии кластера nif. Штаммы с измененной активностью GlnE или AmtB продемонстрировали заметно повышенные уровни экскреции аммония по сравнению со штаммами дикого типа или производными без этих мутаций (фиг. 28E), иллюстрируя влияние этих генотипов на ассимиляцию и обратный захват аммиака.

[0344] Проведено два эксперимента для изучения взаимодействия производных PBC6.1 с растениями кукурузы и количественной оценки введения фиксированного азота в ткани растений. Во-первых, в исследовани в теплице количественно определяли уровни фиксации азота микроорганизмами с использованием изотопных индикаторов. В кратком изложении, растения выращивают с меченным ¹⁵N удобрением, а разбавленные концентрации ¹⁵N в тканях растений указывают на вклад фиксированного азота из микроорганизмов. Саженцы кукурузы инокулировали отобранными штаммами микроорганизмов, и растения выращивали до стадии роста V6. Затем растения разрушали для обеспечения возможности определения колонизации микроорганизмами и экспрессии генов, а также измерения соотношений ¹⁵N/¹⁴N в тканях растений посредством масс-спектрометрии с соотношением изотопов (IRMS). Анализ находящейся на воздухе ткани продемонстрировал небольшой незначимый вклад PBC6.38 и значимый вклад PBC6.94 (p=0,011) в уровень азота в растениях. Приблизительно 20% азота, выявленного в надземных листьях кукурузы, продуцировано PBC6.94, а остальное поступило из семян, почвенной смеси или "фоновой" фиксации другими почвенными микроорганизмами (рис. 29C). Это демонстрирует, что конвейер размножения микроорганизмов авторов изобретения может обеспечивать получение штаммов, способных вносить существенный вклад азота в растения в присутствии азотных удобрений. Определена транскрипция микроорганизмов в тканях растений, и экспрессию кластера генов nif наблюдали у производных штаммов, но не у штамма дикого типа (рис. 29B), что демонстрирует важность дерепрессии nif для вклада BNF в сельскохозяйственные культуры в условиях добавки удобрений. Колонизация корней, определяемая посредством кПЦР, демонстрировала, что для каждого из протестированных штаммов плотность колонизации различна (фигура 29А). У PBC6.38 и PBC6.94 наблюдали 50-кратное различие колонизации. Это различие может указывать на то, что PBC6.94 снизил приспособленность к ризосфере по сравнению с PBC6.38 в результате высокого уровня фиксации и выведения.

Способы

Среды

[0345] Минимальная среда содержит (на литр) 25 г Na₂HPO₄, 0,1 г CaCL₂⋅2H₂O, 3 г KH₂PO₄, 0,25 г MgSO₄⋅7H₂O, 1 г NaC1, 2,9 мг FeCl₃, 0,25 мг Na₂MoO₄⋅2H₂O и 20 г сахарозу. Среда для выращивания определена как минимальная среда, дополненная 50 мл 200 мМ глутамин на литр.

Выделение диазотрофов

[0346] Саженцы кукурузы выращивали из семян (DKC 66-40, DeKalb, IL) в течение двух недель в условиях теплицы, с контролем от 22°C (ночью) до 26°C (днем), и обеспечивали 16-часовые световые циклы в почве, собранной в San Joaquin County, CA. Корни собирали и промывали стерильной деионизированной водой с удалением основной почвы. Ткани корня гомогенизировали с помощью 2-миллиметровых шариков из нержавеющей стали в лизаторе тканей (TissueLyser II, Qiagen P/N 85300) в течение трех минут при установке 30, и образцы центрифугировали в течение 1 минуты при 13000 об/мин для отделения ткани от бактерий, ассоциированных с корнем. Супернатанты разделяли на две фракции, и одну использовали для характеристики микробиома посредством секвенирования ампликона 16S рРНК, а оставшуюся фракцию разбавляли и высевали на среду, не содержащую азота (NfB), с добавлением 1,5% агара. Планшеты инкубировали при 30°С в течение 5-7 суток. Образовавшиеся колонии тестировали на присутствие гена nifH посредством ПЦР колоний с праймерами Ueda19f и Ueda406r. Геномную ДНК штаммов с положительной на nifH ПЦР колонии (QIAamp DNA Mini Kit, Cat No. 51306, QIAGEN, Germany) выделяли и секвенировали (Illumina MiSeq v3, SeqMatic, Fremont, CA). После сборки и аннотации последовательности изоляты, содержащие кластеры генов фиксации азота, использовали в последующих исследованиях.

Профилирование микробиома из саженцев после выделения

[0347] Из ассоциированных с корнями бактерий выделяли геномную ДНК с использованием набора ZR-96 Genomic DNA I (Zymo Research P/N D3011), и получали ампликоны 16S рРНК с использованием праймеров со штрихкодом Nextera, направленных к 799f и 1114r. Библиотеки ампликонов очищали и секвенировали с использованием платформы Illumina MiSeq v3 (SeqMatic, Fremont, CA). Считывания классифицировали по таксонам с использованием Kraken с использованием базы данных minikraken (фигура 30).

Анализ восстановления ацетилена (ARA)

[0348] Использовали модифицированную версию анализа восстановления ацетилена с определением нитрогеназной активности в условия культивирования чистых культур. Штаммы выращивали из одной колонии в SOB (RPI, P/N S25040-1000) при 30°C с перемешиванием при 200 об/мин в течение 24 часов, а затем субкультивировали 1:25 в среду для выращивания и аэробно выращивали в течение 24 часов (30°C, 200 об/мин). Затем 1 мл культуры из минимальной среды добавляли к 4 мл минимальной среды, дополненной от 0 до 10 мМ глутамином, в воздухонепроницаемых пробирках Hungate и выращивали анаэробно в течение 4 часов (30°C, 200 об/мин). Удаляли 10% свободного пространства, затем посредством инъекции проводили замещение равным объемом ацетилена, и инкубацию продолжали в течение 1 часа. Затем удаляли 2 мл свободного пространства посредством газонепроницаемого шприца для количественного определения продукции для количественного определения продукции этилена с использованием газового хроматографа Agilent 6850, оборудованного пламенно-ионизационного детектором (FID).

Анализ выделения аммония

[0349] Выведение фиксированного азота в форме аммиака определяли с использованием периодической ферментации в анаэробных биореакторах. Штаммы выращивали из одной колонии в 1 мл/лунку SOB в 96-луночных планшетах DeepWell. Планшеты инкубировали при 30°C с перемешиванием при 200 об/мин в течение 24 часов, а затем разбавляли 1:25 в свежем планшете, содержащем 1 мл/лунку среды для выращивания. Клетки инкубировали в течение 24 часов (30°C, 200 об/мин), а затем разбавляли 1:10 в свежем планшете, содержащем минимальную среду. Планшет переносили в анаэробную камеру с газовой смесью >98,5% азота, 1,2-1,5% водорода и < 30 м.д. кислорода и инкубировали с 1350 об/мин, комнатной температуре в течение 66-70 час. Биомассу исходной культуры сравнивали с конечной биомассой посредством определения оптической плотности при 590 нм. Затем клетки разделяли посредством центрифугирования, и супернатант из реакционного бульона анализировали на свободный аммиак с использованием набора для анализа аммиака Megazyme (P/N K-AMIAR) с нормализацией на биомассу в каждой временной точке.

Выделение ассоциированного с корнями микробиома

[0350] Корни осторожно встряхивали для удаления осыпающихся частиц и корневые системы разделяли и вымачивали в стабилизирующем РНК растворе (Thermo Fisher P/N AM7021) в течение 30 минут. Затем корни недолго промывали стерильной деионизированной водой. Образцы гомогенизировали с использованием перемешивания с шариками с использованием шарикоподшипников из нержавеющей стали размером 1,27 см в тканевом лизаторе (TissueLyser II, Qiagen P/N 85300) в 2 мл буфера для лизиса (Qiagen P/N 79216). Выделение геномной ДНК проводили с использованием набора ZR-96 Quick-gDNA (Zymo Research P/N D3010), а выделение РНК проводили с использованием набор RNeasy (Qiagen P/N 74104).

Анализ колонизации корня

[0351] Через четверо суток после посадки на почву выше посаженных семян наносили 1 мл бактериальной ночной культуры (приблизительно 10⁹ КОЕ). Саженцы удобряли три раза в неделю 25 мл модифицированного раствора Хогланда, дополненного 0,5 мМ нитратрм аммония. Через четыре недели после посадки собирали образцы корней и выделяли тотальную геномную ДНК (гДНК). Колонизацию корня количественно определяли с использованием кПЦР с праймерами, сконструированными для амплификации уникальных областей геномов дикого типа или производного штамма. Эффективность реакции кПЦР определяли с использованием стандартной кривой, получаемой на основе известных количеств гДНК из генома-мишени. Данные нормализовали на число копий генома на грамм сырой массы с использованием массы ткани и объема выделения. Для каждого эксперимента количество колонизаций сравнивали с саженцами необработанного контроля.

Транскриптомика in planta

[0352] Транскрипционное профилирование ассоциированных с корнями микроорганизмов проводили у саженцев, выращиваемы и обрабатываемых, как описано в разделе "Анализ колонизации корня". Очищенную РНК секвенировали с использованием платформы Illumina NextSeq (SeqMatic, Fremont, CA). Считывания картировали на геном инокулированного штамма с использованием bowtie2 с использованием параметров '-very-sensitive-local' и минимального показателя выравнивания 30. Покрытие генома рассчитывали с использованием samtools. Дифференциальное покрытие нормализовали на экспрессию генов домашнего хозяйства и визуализировали по геному с использованием Circos и по генному кластеру nif с использованием DNAplotlib. Кроме того, транскрипционный профиль in planta количественно определяли посредством направленного анализ Nanostring. Очищенные РНК обрабатывали на nCounter Sprint (Core Diagnostics, Hayward, CA).

Тепличное исследование разведения ¹⁵N

[0353] Эксперимент по разведению удобрения с ¹⁵N проводили для оценки активности оптимизированного штамма in planta. Среду для посадки, содержащую минимальный фоновый N получали с использованием смеси вермикулита и промытого песка (5 промываний в DI H₂O). Песчаную смесь автоклавировали в течение 1 часа при 122°C и отмеряли приблизительно 600 г в 656 мл горшки, которые пропитывали стерильной DI H₂O и за 24 часа перед посадкой оставляли стекать. Поверхность семян кукурузы (DKC 66-40) стерилизовали в 0,625% гипохлорите натрия в течение 10 минут, затем пять раз промывали в стерильной дистиллированной воде и высаживали на глубину 1 см. Растения содержали под флуоресцентными лампами в течение четырех недель с 16 часовой длиной суток при комнатных температурах в среднем от 22°C (ночью) до 26°C (днем).

[0354] Через пять суток после посадки саженцы инокулировали 1 мл суспензии клеток вымачивая непосредственно над растущим колеоптилем. Инокулят получали из 5 мл ночной культуры в SOB, которую дважды центрифугировали и ресуспендировали в 5 мл PBS для удаления остаточного SOB с последующим конечным разведением до OD 1,0 (приблизительно 10⁹ КОЕ/мл). Контрольные растения обрабатывали стерильным PBS, и каждую обработку проводили для десяти повторов растений.

[0355] Растения удобряли 25 мл раствора удобрения, содержащего 2% обогащенного ¹⁵N 2 мМ KNO₃, на 5, 9, 14 и 19 сутки после посадки, и тем же раствором без KNO₃ на 7, 12, 16 и 18 сутки после посадки. Раствор удобрения содержал (на литр) 3 ммоль CaCl₂, 0,5 ммоль KH₂PO₄, 2 ммоль MgSO₄, 17,9 мкмоль FeSO₄, 2,86 мг H₃BO₃, 1,81 мг MnCl₂⋅4H₂O, 0,22 мг ZnSO₄⋅7H₂O, 51 мкг CuSO₄⋅5H₂O, 0,12 мг Na₂MoO₄⋅2H₂O и 0,14 нмоль NiCl₂. Все горшки по мере необходимости смачивали стерильной DI H₂O для поддержания соответствующей влажности почвы без стекания.

[0356] Через четыре недели растения собирали и разделяли на самом нижнем узле на образцы для выделения гДНК и РНК корня и находящиеся на воздухе ткани для IRMS. Находящиеся на воздухе ткани по мере необходимости протирали для удаления песка, целиком помещали в бумажные пакеты и высушивали по меньшей мере в течение 72 часов при 60°C. После полного высыхания тотальную находящуюся на воздухе ткань гомогенизировали посредством перемешивания с гранулами и 5-7 мг образцы анализировали посредством масс-спектрометрии с соотношением изотопов (IRMS) на δ15N в MBL Stable Isotope Laboratory (The Ecosystems Center, Woods Hole, MA). Процент NDFA рассчитывали с использованием следующей формулы: %NDFA=(δ15N среднего UTC - δ15N образца)/(δ15N среднего UTC) × 100.

Пример 11: Полевые испытания с микроорганизмами по изобретению - лето 2017 года

[0357] Для оценки воздействия штаммов по настоящему изобретению рост и продуктивность кукурузы при различных режимах азота проводили полевые испытания. Приводимые ниже полевые данные демонстрируют, что не являющиеся межродовыми микроорганизмы по изобретению способны к фиксации атмосферного азота и доставке указанного азота в растение, что приводит к увеличенной урожайности в среде с ограниченным содержанием азота, а также в среде без ограничения азота.

[0358] Испытания проводили в семи регионы Соединенных Штатов в шести географически различных среднезападных регионах. Для обработки удобрениями использовали пять режимов азота: 100% от стандартной сельскохозяйственной практики участка/региона, 100% минус 25 фунтов, 100% минус 50 фунтов, 100% синус 75 фунтов и 0%; все данные приведены на акр. Фунты азота на акр для режима 100% зависели от стандартной сельскохозяйственной практики участка/региона. Указанные выше режимы азота находились в диапазоне приблизительно от 153 фунтов на акр до приблизительно 180 фунтов на акр со средним приблизительно 164 фунтов азота на акр.

[0359] Для каждого режима удобрения проводили 14 обработок. Для каждого режима проводили шесть повторений, и использовали схему с расщепленными делянками. 14 обработок включали: 12 различных микроорганизмов, 1 UTC c тем же уровнем удобрения как и основной участок и 1 UTC со 100% азота. В режиме со 100% азота 2-й UTC представлял собой 100 плюс 25 фунтов.

[0360] Участки кукурузы, минимально, состояли из 4 рядов по 9,144 м в длину (76,2 см между рядами) с 420 участками на регион. Если не указано иначе, все наблюдения проводили в центральных двух рядах участков, а все получения образца с разрушением проводили во внешних рядах. Образцы семян перед использованием охлаждали до 1,5-2 часов.

[0361] Региональная сельскохозяйственная практика: Семена представляли собой коммерческую кукурузу, используемую с коммерческой пропиткой для семян без биологического совместного применения. Норма высева, дата посадки, контроль сорняков/насекомых, времена сбора урожая и другие стандартные практики ведения хозяйства соответствовали нормам местных сельскохозяйственных практик для регионов за исключением применения фунгицидов (если требовалось).

[0362] Нанесение микроорганизмов: Микроорганизмы наносили на семена в пропитке для семян на семена, которым уже проводили нормальную химическую обработку. Семена покрывали ферментационным бульоном, содержащим микроорганизмы.

[0363] Характеристики почв: Оценивали текстуру почв и плодородность почв. Использовали стандартные способы получения образцов почв, которые включали образцы грунта на глубинах 0-30 см и 30-60 см. Стандарт получения образца почвы включал определение азота нитратов, азота аммония, общего азота, органических веществ и CEC. Стандарт получения образца почвы дополнительно включал определение pH, общего калия и общего фосфора. Для определения уровней азотных удобрений получали предпосадочные образцы почв из каждого региона для гарантии, что 0-12" и потенциально 12" до 24" почвенных регионов для азота нитратов.

[0364] Перед посадкой и внесением удобрений собирали по 2 мл образцов почв от 0 до 6-12" из UTC. Собирали по одному образцу на повтор на азотную область с использованием середины ряда. (5 режимов удобрения × 6 повторений=тридцать образцов почв).

[0365] После посадки (V4-V6) собирали по 2 мл образцов почв от 0 до 6-12" из UTC. Собирали по одному образцу на повтор на каждую азотную область с использованием середины ряда. (5 режимов удобрения × 6 повторений=тридцать образцов почв).

[0366] После сбора урожая (V4-V6) собирали по 2 мл образцы почв от 0 до 6-12" из UTC. Собирали по одному образцу на повтор на каждую азотную область с использованием середины ряда. Дополнительно после сбора урожая собирали образцы почвы на 0-12" из UTC и потенциально 12-24" из UTC (5 режимов удобрения × 6 повторений=тридцать образцов почв).

[0367] Образец почвы для V6-V10 для каждого режима удобрения (исключая обработку 100% и 100%+25 фунтов [в блоке 100%] для всех режимов удобрения при 0-12" и 12-24". (5 режимов удобрения × 2 глубины=10 образцов на регион).

[0368] После сбора урожая образец почва для каждого режима удобрения (исключая обработку 100% и 100%+25 фунтов [в блоке 100%] для всех режимов удобрения при 0-12" и 12-24". (5 режимов удобрения × 2 глубины=10 образцов на регион).

[0369] Анализ: Исходную популяцию растений оценивали при ≈50% UTC, а конечную популяцию растений оценивали перед сбором. Анализ включал (1) потенциально температуру (датчик температуры); (2) мощность (по шкале 1-10 с 10=отлично) при V4 и V8-V10; (3) высота растения при V8-V10 и V14; (4) урожайность (бушелей/акр), скорректированная на стандартный процент влажности; (5) тестовая масса; (6) процент влажности зерен; (7) тесты нитратов стебля при черной точке (420 участков × 7 регионов); (8) колонизацию с 1 растением на участок в пакете с застежкой на молнии при 0% и 100% удобрения при V4-V6 (1 растение × 14 обработок × 6 повторений × 2 режима удобрения=168 растений); (9) транскриптомика с 1 растением на участок в пакете с застежкой на молнии при 0% и 100% удобрения при V4-V6 (1 растение × 14 обработок × 6 повторений × 2 режима удобрения=168 растения); (10) определение нормализованного разностного вегетационного индекса (NDVI) или нормализованной разности красного края (NDRE) с использованием инструмента Greenseeker в два момента времени (V4-V6 и VT) для оценки каждого участка во всех 7 регионах (420 участки × 2 момента времени × 7 регионов=5880 точек данных); (11) характеристики стебля, определяемые во всех 7 регионах между R2 и R5 посредством регистрации диаметра стебля 10 растений/участок при высоте 15 см, регистрация длины первого междоузлия выше отметки 15 см, проводили мониторинг 10 растений (5 последовательных растений от центра двух внутренних рядов) (420 участки × 10 растений × 7 регионов=29400 точек данных).

[0370] Схема мониторинга: Практические исполнители посещали все испытания на стадии V3-V4 для оценки ранней сезонной реакции на обработки и в течение стадии репродуктивного роста для мониторинга созревания. Местный сотрудник непрерывно производил исследовательские испытания.

[0371] Информация о погоде: Собирали данные о погоде, охватывающие период от посадки до сбора урожая, и они состояли из суточных минимальных и максимальных температур, температуры почвы при посеве, суточных осадков и ирригации (если применяли) и необычных погодных явлений, таких как сильный ветер, дождь, холод, жара.

[0372] Представление данных: Включая данные, указанные выше, в полевых испытаниях получили точки данных, включая текстуры почвы; расстояние между рядами; размеры участка; ирригацию; обработку почвы; предыдущий урожай; норму высева; популяцию растений; сезонные поступления удобрений, включая источник, норму, сроки и место размещения; размеры площади уборки, способ сбора урожая, например, ручным или машинным способом и используемые измерительные инструменты (весы, монитор урожайности и т. д.)

[0373] Результаты: Избранные результаты указанного выше полевого испытания приведены на фигуре 32 и фигуре 33.

[0374] На фигуре 32, можно видеть, что использование микроорганизма по изобретению (т.е., 6-403) приводило к более высокому урожаю, чем у штамма дикого типа (дикий тип) и к более высокому урожаю, чем у необработанного контроля (UTC). При обработке "-25 lbs N" использовали на 25 фунтов N на акр менее, чем при стандартной сельскохозяйственной практике в регионе. Обработка UTC "100% N" предназначена для обозначения стандартной сельскохозяйственной практики региона, при которой 100% стандартного использования N применяет сельхозпроизводитель. Микроорганизм "6-403" депонирован под идентификатором NCMA 201708004, и его можно найти в таблице A. Он представляет собой мутант Kosakonia sacchari (также называемый CM037) и является мутантным потомком штамма CI006 дикого типа.

[0375] На фигуре 33 полученные результаты урожайности демонстрируют, что микроорганизмы по настоящему изобретению действуют в различных регионах действуют единообразно. Кроме того, результаты урожайности демонстрируют, что микроорганизмы по настоящему изобретению хорошо функционируют как в среде с недостаточным содержанием азота (то есть в среде с ограничением азота), так и в среде, которая с достаточным содержанием азота (то есть среда без ограничения азота). Микроорганизм "6-881" (также известный как CM094, PBC6.94), и который является мутантным потомком штамма Kosakonia sacchari CI006 дикого типа, депонирован под идентификатором NCMA 201708002, и его можно найти в таблице A. Микроорганизм "137-1034", который является мутантным потомком штамма Klebsiella variicola CI137 дикого типа, депонирован под идентификатором NCMA 201712001, и его можно найти в таблице A. Микроорганизм "137-1036", который является мутантным потомком штамма Klebsiella variicola CI137 дикого типа, депонирован под идентификатором NCMA 201712002, и его можно найти в таблице A. Микроорганизм "6-404" (также известный как CM38, PBC6.38), и который является мутантным потомком штамма Kosakonia sacchari CI006 дикого типа, депонирован под идентификатором NCMA 201708003, и его можно найти в таблице A.

Пример 12: Род не являющихся межродовыми микроорганизмов, эффективный для сельскохозяйственных систем

[0376] Микроорганизмы по настоящему изобретению оценивали и сравнивали друг с другом по продукции азота, происходящей на акре в течение сезона. См. фигуру 20, фигуру 40 и фигуру 41

[0377] Авторы изобретения выдвинули гипотезу, что для того, чтобы популяция подвергнутых генетической инженерии не являющихся межродовыми микроорганизмов была эффективна в современной сельскохозяйственной системе пропашных культур, популяция микроорганизмов должна продуцировать по меньшей мере один фунт или более азота на акр за сезон.

[0378] Исходя из этого, авторы изобретения неожиданно выявили функциональный род микроорганизмов, которые в числе прочего способны вносить вклад в: повышение урожайности у небобовых сельскохозяйственных культур; и/или снижение зависимости сельхозпроизводителя от применения экзогенного азота; и/или способность производить по меньшей мере один фунт азота на акр за сезон, даже в неограничивающих азот средах, где указанный род определен произведением колонизирующей способность × ммоль N, продуцируемых на микроорганизмом в час (т.е. линии, разделяющая фигуры 20, 40 и 41).

[0379] В отношении фигур 20, 40 и 41, определенные данные использования микроорганизмов по изобретению объединены для изображения тепловой карты количества фунтов азота, доставляемых на акре/сезон микроорганизмами по изобретению, которая зарегистрирована как функция микроорганизмов на грамм сырой массы на ммоль азота/микроорганизм/час. Ниже тонкой линии, пересекающей более крупное изображение, находятся микроорганизмы, доставляющие менее одного фунта азота на акре/сезон, а выше линии находятся микроорганизмы, доставляющие более одного фунта азота на акре/сезон.

[0380] Полевые данные и тепловая карта колонизация дикого типа: Микроорганизмы, используемые в тепловой карте фигуры 20, анализировали на продукцию N в кукурузе. Для штаммов дикого типа CI006 и CI019 данные по колонизации корня кукурузы получали с одного полевого участка. Для оставшихся штаммов колонизацию полагали такой же, как уровень в поле у дикого типа. Активность фиксации N определяли с использованием анализа ARA in vitro с 5 мМ глутамином. В таблице ниже тепловая карта на фигуре 20 дает точное значение ммоль N, продуцируемых микроорганизмом в час (ммоль N/микроорганизм/час), вместе с точными значениями КОЕ на грамм сырой массы (КОЕ/г св.масс.) для каждого микроорганизма, приведенного на тепловой карте.

[0381] Тепловая карта полевых данных: Данные, используемые в тепловой карте фигуры 40, получали у штаммов микроорганизмов, оцениваемых на продукцию N в кукурузе в полевых условиях. Каждая точка представляет собой фунты N/акр, продуцируемые микроорганизмом, с использованием данных по колонизации корня кукурузы с одного полевого участка. Активность фиксации N определяли с использованием анализа ARA in vitro с 5 мМ N в форме глутамина или фосфата аммония. В приводимой ниже таблице C даны точные значения ммоль N, продуцируемых микроорганизмом в час (ммоль N/микроорганизм/час) вместе с точными значениями КОЕ на грамм сырой массы (КОЕ/г св.масс.) для каждого микроорганизма, приведенного на тепловой карте фигуры 40.

[0382] Тепловая карта на основе тепличных и лабораторных данных: Данные, используемые в тепловой карте фигуры 41, получали у штаммов микроорганизмов, оцениваемых на продукцию N в кукурузе в лабораторных и тепличных условиях. Каждая точка представляет собой фунты N/акр, продуцируемые одним штаммом. Белые точки представляют штаммы, у которых данные по колонизации корня кукурузы собраны в тепличных условиях. Черные точки представляют мутантные штаммы, для которых уровни колонизации корней кукурузы получают на основе средних полевых уровней колонизации корней кукурузы родительского штамма дикого типа. Заштрихованные точки представляют родительские штаммы дикого типа с их средними полевыми уровнями колонизации корней кукурузы. Во всех случаях, активность фиксации N определяли посредством анализа ARA in vitro с 5 мМ N в форме глутамина или фосфата аммония. В приводимой ниже таблице D даны точные значения ммоль N, продуцируемых микроорганизмом в час (ммоль N/микроорганизм/час) вместе с точными значениями КОЕ на грамм сырой массы (КОЕ/г св.масс.) для каждого микроорганизма, приведенного на тепловой карте of фигура 41.

Таблица C: фигура 40 - Тепловая карта для полевых данных

Название штамма Активность (ммоль N/микроорганизм час) Пиковая колонизация (КОЕ/г св.масс.) Продуцируемый N/акр/сезон Таксономическ. обозначение CI006 3,88E-16 1,50E+07 0,24 Kosakonia sacchari 6-404 1,61E-13 3,50E+05 2,28 Kosakonia sacchari 6-848 1,80E-13 2,70E+05 1,97 Kosakonia sacchari 6-881 1,58E-13 5,00E+05 3,20 Kosakonia sacchari 6-412 4,80E-14 1,30E+06 2,53 Kosakonia sacchari 6-403 1,90E-13 1,30E+06 10,00 Kosakonia sacchari CI019 5,33E-17 2,40E+06 0,01 Rahnella aquatilis 19-806 6,65E-14 2,90E+06 7,80 Rahnella aquatilis 19-750 8,90E-14 2,60E+05 0,94 Rahnella aquatilis 19-804 1,72E-14 4,10E+05 0,29 Rahnella aquatilis CI137 3,24E-15 6,50E+06 0,85 Klebsiella variicola 137-1034 1,16E-14 6,30E+06 2,96 Klebsiella variicola 137-1036 3,47E-13 1,30E+07 182,56 Klebsiella variicola 137-1314 1,70E-13 1,99E+04 0,14 Klebsiella variicola 137-1329 1,65E-13 7,25E+04 0,48 Klebsiella variicola 63 3,60E-17 3,11E+05 0,00 Rahnella aquatilis 63-1146 1,90E-14 5,10E+05 0,39 Rahnella aquatilis 1021 1,77E-14 2,69E+07 19,25 Kosakonia pseudosacchari 728 5,56E-14 1445240,09 3,25 Klebsiella variicola

Таблица D: фигура 41 - Тепловая карта для тепличных и лабораторных данных

Название штамма Активность (ммоль N/микроорганизм час) Пиковая колонизация (КОЕ/г св.масс.) Продуцируемый N/акр/сезон Таксономическ. обозначение CI006 3,88E-16 1,50E+07 0,24 Kosakonia sacchari 6-400 2,72E-13 1,79E+05 1,97 Kosakonia sacchari 6-397 1,14E-14 1,79E+05 0,08 Kosakonia sacchari CI137 3,24E-15 6,50E+06 0,85 Klebsiella variicola 137-1586 1,10E-13 1,82E+06 8,10 Klebsiella variicola 137-1382 4,81E-12 1,82E+06 354,60 Klebsiella variicola 1021 1,77E-14 2,69E+07 19,25 Kosakonia pseudosacchari 1021-1615 1,20E-13 2,69E+07 130,75 Kosakonia pseudosacchari 1021-1619 3,93E-14 2,69E+07 42,86 Kosakonia pseudosacchari 1021-1612 1,20E-13 2,69E+07 130,75 Kosakonia pseudosacchari 1021-1623 4,73E-17 2,69E+07 0,05 Kosakonia pseudosacchari 1293 5,44E-17 8,70E+08 1,92 Azospirillum lipoferum 1116 1,05E-14 1,37E+07 5,79 Enterobacter sp. 1113 8,05E-15 4,13E+07 13,45 Enterobacter sp. 910 1,19E-13 1,34E+06 6,46 Kluyvera intermedia 910-1246 2,16E-13 1,34E+06 11,69 Kluyvera intermedia 850 7,2301E-16 1,17E+06 0,03 Achromobacter spiritinus 852 5,96E-16 1,07E+06 0,03 Achromobacter marplatensis 853 6,42E-16 2,55E+06 0,07 Microbacterium murale

[0383] Выводы: Данные на фигурах 20, 40, 41 и в таблицах C и D иллюстрируют большое количество представителей описанного рода (т.е. микроорганизмов справа от линии на фигурах). Кроме того, эти многочисленные представители происходят из разнообразного набора таксономических родов, которые можно найти в приводимых выше таблицах C и D. Кроме того, авторы изобретения выявили множество генетических свойств, которые отображают зависимость структура/функция, которая выявлено у многих микроорганизмов. Эту генетическую зависимость можно найти во множестве таблиц по изобретению, где приведены генетические модификации, проводимые авторами изобретения, которые включают внесение по меньшей мере одной генетической вариации по меньшей мере в один ген или некодирующий полинуклеотид генетической регуляторной сети фиксации или ассимиляции азота.

[0384] Таким образом, недавно выявленный род подтверждается: (1) надежным набором данных, (2) большим количеством представителей, (3) представителями из разных таксономических родов и (4) классами генетических модификаций, которые определяют зависимость структура/функция в лежащей в основе генетической архитектуре представителей рода.

Пример 13: Способы и анализы для детекции не являющихся межродовыми подвергнутых генетической инженерии микроорганизмов

[0385] В настоящем описании указаны праймеры, зонды и анализы, которые пригодны для детекции микроорганизмов, используемых в различных указанных выше примерах. Посредством анализов можно детектировать последовательности с неприродным "соединением" нуклеотидов в полученных/мутантных не являющихся межродовыми микроорганизмах. Эти неприродные соединения нуклеотидов можно использовать в качестве типа диагностики, которая является показателем присутствия конкретной генетической альтерация в микроорганизме.

[0386] Способами по настоящему изобретению можно детектировать эти неприродные соединения нуклеотидов с использованием специализированных способов количественной ПЦР, включая уникальным образом сконструированные праймеры и зонды. Зонды могут связываться с последовательностями с неприродным соединением нуклеотидов. Т.е. можно использовать специфичные для последовательностей ДНК-содержащие зонды, состоящие из олигонуклеотидов, которые мечены флуоресцентным репортером, обеспечивающем детекцию только после гибридизации зонда с комплементарной ему последовательностью. Количественные способы могут гарантировать, что амплификацию посредством указанных праймеров пройдет только неприродное соединение нуклеотидов, и, таким образом, его можно детектировать посредством неспецифического красителя или посредством использования специфического зонда для гибридизации. Другим аспектом способа является выбор праймеров так, чтобы праймеры фланкировали какой-либо конец последовательности с соединением так, что если происходит реакция амплификации, то указанная последовательность с соединением присутствует.

[0387] Таким образом, из образцов можно выделять геномную ДНК и использовать для количественного определения присутствия микроорганизмов по изобретению с применением кПЦР. Праймеры, используемые в реакции кПЦР, могут представлять собой праймеры, сконструированные посредством Primer Blast (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/праймер-blast/) с амплификацией уникальных областей генома дикого типа или уникальных областей подвергнутых генетической инженерии не являющихся межродовыми мутантных штаммов. Реакцию кПЦР можно проводить с использованием набор SYBR GreenER qPCR SuperMix Universal (Thermo Fisher P/N 11762100), с использованием только прямого и обратного праймеров для амплификации; альтернативно, можно использовать набор Kapa Probe Force (Kapa Biosystems P/N KK4301) с праймерами для амплификации и зондом TaqMan, содержащем красящую метку FAM dye на 5'-конец, внутренний гаситель ZEN, и связывающее малую бороздку средство и флуоресцентный гаситель на 3'-конце (Integrated DNA Technologies).

[0388] Определенные последовательности праймеров, зондов и последовательности с неприродным соединением, которые можно использовать в способах кПЦР, перечислены в приводимой ниже таблице E. Конкретно, последовательности с неприродным соединением можно найти в SEQ ID NO: 372-405.

Таблица E: Детекция микроорганизмов

Основн. CI Назв. соединения выше/ниже соединения SEQ ID NO 100 п.н. выше соединения SEQ ID NO 100 п.н. ниже соединения SEQ ID NO Последовательность соединения "/" указывает соединение Описан. соединения SEQ прямого праймера SEQ обратного праймера SEQ зонда 1021 ds1131 up 304 TGGTGTCCGGGCGAACGTCGCCAGGTGGCACAAATTGTCAGAACTACGACACGACTAACCGACCGCAGGAGTGTGCGATGACCCTGAATATGATGATGGA 338 TTCTTGGTTCTCTGGAGCGCTTTATCGGCATCCTGACTGAAGAATTTGCAGGCTTCTTCCCAACCTGGCTTGCACCCGTGCAGGTAGTTGTGATGAACAT 372 5'-TGGTGTCCGGGC
GAACGTCGCCAG
GTGGCACAAATT
GTCAGAACTACG
ACACGACTAACC
GACCGCAGGAG
TGTGCGATGACC
CTGAATATGATG
ATGGA/TTCTTGG
TTCTCTGGAGCG
CTTTATCGGCAT
CCTGACTGAAGA
ATTTGCAGGCTT
CTTCCCAACCTG
GCTTGCACCCGT
GCAGGTAGTTGT
GATGAACAT-3' разрушенный ген nifL/PinfC н.п. н.п. н.п. 1021 ds1131 down 305 CGGAAAACGAGTTCAAACGGCGCGTCCCAATCGTATTAATGGCGAGATTCGCGCCACGGAAGTTCGCTTAACAGGTCTGGAAGGCGAGCAGCTTGGTATT 339 GCGATAGAACTCACTTCACGCCCCGAAGGGGGAAGCTGCCTGACCCTACGATTCCCGCTATTTCATTCACTGACCGGAGGTTCAAAATGACCCAGCGAAC 373 5'-
CGGAAAACGAG
TTCAAACGGCGC
GTCCCAATCGTATTAATGGCGAGATTCGCGCCACGGAAGTTCGCTTAACAGGTCTGGAAGGCGAGCAGCTTGGTATT/GCGATAGAACTCACTTCACGCCCCGAAGGGGGAAGCTGCCTGACCCTACGATTCCCGCTATTTCATTCACTGACCGGAGGTTCAAAATGACCCAGCGAAC
-3' PinfC/разрушенный ген nifL н.п. н.п. н.п. 1021 ds1133 н.п. 306 CGCCAGAGAGTTGAAATCGAACATTTCCGTAATACCGCCATTACCCAGGAGCCGTTCTGGTTGCACAGCGGAAAACGTTAACGAAAGGATATTTCGCATG 340 TCCCTGTGCGCCGCGTCGCCGATGGTGGCCAGCCAACTGGCGCGCTACCCGATCCTGCTCGATGAACTGCTCGACCCGAACACGCTCTATCAACCGACGG 374 5'-CGCCAGAGAGTT
GAAATCGAACAT
TTCCGTAATACC
GCCATTACCCAG
GAGCCGTTCTGG
TTGCACAGCGGA
AAACGTTAACGA
AAGGATATTTCG
CATG/TCCCTGTG
CGCCGCGTCGCC
GATGGTGGCCAG
CCAACTGGCGCG
CTACCCGATCCT
GCTCGATGAACT
GCTCGACCCGAA
CACGCTCTATCA
ACCGACGG-3' 5'-UTR и ATG/укороченный glnE ген н.п. н.п. н.п. 1021 ds1145 up 307 CGGGCGAACGTCGCCAGGTGGCACAAATTGTCAGAACTACGACACGACTAACCGACCGCAGGAGTGTGCGATGACCCTGAATATGATGATGGATGCCAGC 341 CGTTCTGTAATAATAACCGGACAATTCGGACTGATTAAAAAAGCGCCCTCGCGGCGCTTTTTTTATATTCTCGACTCCATTTAAAATAAAAAATCCAATC 375 5'-CGGGCGAACGTC
GCCAGGTGGCAC
AAATTGTCAGAA
CTACGACACGAC
TAACCGACCGCA
GGAGTGTGCGAT
GACCCTGAATAT
GATGATGGATGC
CAGC/CGTTCTGT
AATAATAACCGG
ACAATTCGGACT
GATTAAAAAAG
CGCCCTCGCGGC
GCTTTTTTTATAT
TCTCGACTCCAT
TTAAAATAAAAA
ATCCAATC-3' разрушенный ген nifL/Prm1 н.п. н.п. н.п. 1021 ds1145 down 308 TCAACCTAAAAAAGTTTGTGTAATACTTGTAACGCTACATGGAGATTAACTCAATCTAGAGGGTATTAATAATGAATCGTACTAAACTGGTACTGGGCGC 342 AACTCACTTCACGCCCCGAAGGGGGAAGCTGCCTGACCCTACGATTCCCGCTATTTCATTCACTGACCGGAGGTTCAAAATGACCCAGCGAACCGAGTCG 376 5'-TCAACCTAAAAA
AGTTTGTGTAAT
ACTTGTAACGCT
ACATGGAGATTA
ACTCAATCTAGA
GGGTATTAATAA
TGAATCGTACTA
AACTGGTACTGG
GCGC/AACTCAC
TTCACGCCCCGA
AGGGGGAAGCT
GCCTGACCCTAC
GATTCCCGCTAT
TTCATTCACTGA
CCGGAGGTTCAA
AATGACCCAGCG
AACCGAGTCG-3' Prm1/разрушенный ген nifL н.п. н.п. н.п. 1021 ds1148 up 309 CGGGCGAACGTCGCCAGGTGGCACAAATTGTCAGAACTACGACACGACTAACCGACCGCAGGAGTGTGCGATGACCCTGAATATGATGATGGATGCCAGC 343 CGCGTCAGGTTGAACGTAAAAAAGTCGGTCTGCGCAAAGCACGTCGTCGTCCGCAGTTCTCCAAACGTTAATTGGTTTCTGCTTCGGCAGAACGATTGGC 377 5'-CGGGCGAACGTC
GCCAGGTGGCAC
AAATTGTCAGAA
CTACGACACGAC
TAACCGACCGCA
GGAGTGTGCGAT
GACCCTGAATAT
GATGATGGATGC
CAGC/CGCGTCA
GGTTGAACGTAA
AAAAGTCGGTCT
GCGCAAAGCAC
GTCGTCGTCCGC
AGTTCTCCAAAC
GTTAATTGGTTT
CTGCTTCGGCAG
AACGATTGGC-3' разрушенный ген nifL/Prm7 н.п. н.п. н.п. 1021 ds1148 down 310 AATTTTCTGCCCAAATGGCTGGGATTGTTCATTTTTTGTTTGCCTTACAACGAGAGTGACAGTACGCGCGGGTAGTTAACTCAACATCTGACCGGTCGAT 344 AACTCACTTCACGCCCCGAAGGGGGAAGCTGCCTGACCCTACGATTCCCGCTATTTCATTCACTGACCGGAGGTTCAAAATGACCCAGCGAACCGAGTCG 378 5'-AATTTTCTGCCC
AAATGGCTGGG
ATTGTTCATTTTT
TGTTTGCCTTAC
AACGAGAGTGA
CAGTACGCGCGG
GTAGTTAACTCA
ACATCTGACCGG
TCGAT/AACTCA
CTTCACGCCCCG
AAGGGGGAAGC
TGCCTGACCCTA
CGATTCCCGCTA
TTTCATTCACTG
ACCGGAGGTTCA
AAATGACCCAGC
GAACCGAGTCG-
3' Prm4/разрушенный ген nifL н.п. н.п. н.п. CI006 ds126 н.п. 311 GTAACCAATAAAGGCCACCACGCCAGACCACACGATAGTGATGGCAACACTTTCCAGCTGCACCAGCACCTGATGGCCCATGGTCACACCTTCAGCGAAA 345 CCGATCCCCATCACTGTGTGTCTTGTATTACAGTGCCGCTTCGTCGGCTTCGCCGGTACGAATACGAATGACGCGTTGCAGCTCAGCAACGAAAATTTTG 379 5'-GTAACCAATAAA
GGCCACCACGCC
AGACCACACGAT
AGTGATGGCAAC
ACTTTCCAGCTG
CACCAGCACCTG
ATGGCCCATGGT
CACACCTTCAGC
GAAA/CCGATCC
CCATCACTGTGT
GTCTTGTATTAC
AGTGCCGCTTCG
TCGGCTTCGCCG
GTACGAATACGA
ATGACGCGTTGC
AGCTCAGCAACG
AAAATTTTG-3' 5'-UTR до ATG-4 п.н. гена amtB/разрушенный ген amtB н.п. н.п. н.п. CI019 ds172 down 312 TGGTATTGTCAGTCTGAATGAAGCTCTTGAAAAAGCTGAGGAAGCGGGCGTCGATTTAGTAGAAATCAGTCCGAATGCCGAGCCGCCAGTTTGTCGAATC 346 CCGTCTCTGAAGCTCTCGGTGAACATTGTTGCGAGGCAGGATGCGAGCTGGTTGTGTTTTGACATTACCGATAATGTGCCGCGTGAACGGGTGCGTTATG 380 5'-TGGTATTGTCAG
TCTGAATGAAGC
TCTTGAAAAAGC
TGAGGAAGCGG
GCGTCGATTTAG
TAGAAATCAGTC
CGAATGCCGAGC
CGCCAGTTTGTC
GAATC/CCGTCTC
TGAAGCTCTCGG
TGAACATTGTTG
CGAGGCAGGAT
GCGAGCTGGTTG
TGTTTTGACATT
ACCGATAATGTG
CCGCGTGAACGG
GTGCGTTATG-3' Prm1.2/разрушенный ген nifL SEQ ID NO:406 CAAGAA
GTTCGC
CTCACA
GG SEQ ID NO:407 TGCC
TCGC
AACA
ATGT
TCAC н.п. CI019 ds172 up 313 ACCGATCCGCAGGCGCGCATTTGTTATGCCAATCCGGCATTCTGCCGCCAGACGGGTTTTGCACTTGAGACACTTTTGGGCGAGAACCACCGTCTGCTGG 347 TGAACATCACTGATGCACAAGCTACCTATGTCGAAGAATTAACTAAAAAACTGCAAGATGCAGGCATTCGCGTTAAAGCCGACTTGAGAAATGAGAAGAT 381 5'-ACCGATCCGCAG
GCGCGCATTTGT
TATGCCAATCCG
GCATTCTGCCGC
CAGACGGGTTTT
GCACTTGAGACA
CTTTTGGGCGAG
AACCACCGTCTG
CTGG/TGAACAT
CACTGATGCACA
AGCTACCTATGT
CGAAGAATTAAC
TAAAAAACTGCA
AGATGCAGGCAT
TCGCGTTAAAGC
CGACTTGAGAAA
TGAGAAGAT-3' разрушенный ген nifL/Prm1.2 н.п. н.п. н.п. CI019 ds175 down 314 CGGGAACCGGTGTTATAATGCCGCGCCCTCATATTGTGGGGATTTCTTAATGACCTATCCTGGGTCCTAAAGTTGTAGTTGACATTAGCGGAGCACTAAC 348 CCGTCTCTGAAGCTCTCGGTGAACATTGTTGCGAGGCAGGATGCGAGCTGGTTGTGTTTTGACATTACCGATAATGTGCCGCGTGAACGGGTGCGTTATG 382 5'-CGGGAACCGGT
GTTATAATGCCG
CGCCCTCATATT
GTGGGGATTTCT
TAATGACCTATC
CTGGGTCCTAAA
GTTGTAGTTGAC
ATTAGCGGAGCA
CTAAC/CCGTCTC
TGAAGCTCTCGG
TGAACATTGTTG
CGAGGCAGGAT
GCGAGCTGGTTG
TGTTTTGACATT
ACCGATAATGTG
CCGCGTGAACGG
GTGCGTTATG-3' Prm3.1/разрушенный ген nifL SEQ ID NO:408 CGCCCT
CATATT
GTGGGG
AT SEQ ID NO:409 GGCA
TAAC
GCAC
CCGT
TCA SEQ ID NO:410 /56-FA
M/T
A
AC
C
CG
T
C/Z
EN/
T
CT
G
AAG
CTC
TC
G
GT/
3IA
BkF
Q/ CI019 ds175 up 315 ACCGATCCGCAGGCGCGCATTTGTTATGCCAATCCGGCATTCTGCCGCCAGACGGGTTTTGCACTTGAGACACTTTTGGGCGAGAACCACCGTCTGCTGG 349 TACAGTAGCGCCTCTCAAAAATAGATAAACGGCTCATGTACGTGGGCCGTTTATTTTTTCTACCCATAATCGGGAACCGGTGTTATAATGCCGCGCCCTC 383 5'-ACCGATCCGCAG
GCGCGCATTTGT
TATGCCAATCCG
GCATTCTGCCGC
CAGACGGGTTTT
GCACTTGAGACA
CTTTTGGGCGAG
AACCACCGTCTG
CTGG/TACAGTA
GCGCCTCTCAAA
AATAGATAAAC
GGCTCATGTACG
TGGGCCGTTTAT
TTTTTCTACCCA
TAATCGGGAACC
GGTGTTATAATG
CCGCGCCCTC-3' разрушенный ген nifL/Prm3.1 н.п. н.п. н.п. CI006 ds20 down 316 TCAACCTAAAAAAGTTTGTGTAATACTTGTAACGCTACATGGAGATTAACTCAATCTAGAGGGTATTAATAATGAATCGTACTAAACTGGTACTGGGCGC 350 AACTCACTTCACACCCCGAAGGGGGAAGTTGCCTGACCCTACGATTCCCGCTATTTCATTCACTGACCGGAGGTTCAAAATGACCCAGCGAACCGAGTCG 384 5'-TCAACCTAAAAA
AGTTTGTGTAAT
ACTTGTAACGCT
ACATGGAGATTA
ACTCAATCTAGA
GGGTATTAATAA
TGAATCGTACTA
AACTGGTACTGG
GCGC/AACTCAC
TTCACACCCCGA
AGGGGGAAGTT
GCCTGACCCTAC
GATTCCCGCTAT
TTCATTCACTGA
CCGGAGGTTCAA
AATGACCCAGCG
AACCGAGTCG-3' Prm1/разрушенный ген nifL SEQ ID NO:411 TAAACT
GGTACT
GGGCGC
AACT SEQ ID NO:412 CAAA
TCGA
AGCG
CCAG
ACGG
TAT SEQ ID NO:413 /56-
FA
M/A
AG
TTG
CCT
/ZE
N/G
AC
CCT
AC
GA
TTC
CC/
3IA
BkF
Q/ CI006 ds20 up 317 GGGCGACAAACGGCCTGGTGGCACAAATTGTCAGAACTACGACACGACTAACTGACCGCAGGAGTGTGCGATGACCCTGAATATGATGATGGATGCCGGC 351 CGTCCTGTAATAATAACCGGACAATTCGGACTGATTAAAAAAGCGCCCTTGTGGCGCTTTTTTTATATTCCCGCCTCCATTTAAAATAAAAAATCCAATC 385 5'-GGGCGACAAAC
GGCCTGGTGGCA
CAAATTGTCAGA
ACTACGACACGA
CTAACTGACCGC
AGGAGTGTGCG
ATGACCCTGAAT
ATGATGATGGAT
GCCGGC/CGTCC
TGTAATAATAAC
CGGACAATTCGG
ACTGATTAAAAA
AGCGCCCTTGTG
GCGCTTTTTTTA
TATTCCCGCCTC
CATTTAAAATAA
AAAATCCAATC-
3' разрушенный ген nifL/Prm1 н.п. н.п. н.п. CI006 ds24 up 318 GGGCGACAAACGGCCTGGTGGCACAAATTGTCAGAACTACGACACGACTAACTGACCGCAGGAGTGTGCGATGACCCTGAATATGATGATGGATGCCGGC 352 GGACATCATCGCGACAAACAATATTAATACCGGCAACCACACCGGCAATTTACGAGACTGCGCAGGCATCCTTTCTCCCGTCAATTTCTGTCAAATAAAG 386 5'-GGGCGACAAAC
GGCCTGGTGGCA
CAAATTGTCAGA
ACTACGACACGA
CTAACTGACCGC
AGGAGTGTGCG
ATGACCCTGAAT
ATGATGATGGAT
GCCGGC/GGACA
TCATCGCGACAA
ACAATATTAATA
CCGGCAACCACA
CCGGCAATTTAC
GAGACTGCGCA
GGCATCCTTTCT
CCCGTCAATTTC
TGTCAAATAAAG
-3' разрушенный ген nifL/Prm5 SEQ ID NO:414 GGTGCA
CTCTTT
GCATGG
TT SEQ ID NO:415 GCGC
AGTC
TCGT
AAAT
TGCC SEQ ID NO:416 /56-
FA
M/C
A
GG
A
GT
G
T/Z
EN/G
CG
A
TG
A
CC
C
TG
A
AT/
3IA
BkF
Q CI006 ds24 down 319 TAAGAATTATCTGGATGAATGTGCCATTAAATGCGCAGCATAATGGTGCGTTGTGCGGGAAAACTGCTTTTTTTTGAAAGGGTTGGTCAGTAGCGGAAAC 353 AACTCACTTCACACCCCGAAGGGGGAAGTTGCCTGACCCTACGATTCCCGCTATTTCATTCACTGACCGGAGGTTCAAAATGACCCAGCGAACCGAGTCG 387 5'-TAAGAATTATCT
GGATGAATGTGC
CATTAAATGCGC
AGCATAATGGTG
CGTTGTGCGGGA
AAACTGCTTTTT
TTTGAAAGGGTT
GGTCAGTAGCGG
AAAC/AACTCAC
TTCACACCCCGA
AGGGGGAAGTT
GCCTGACCCTAC
GATTCCCGCTAT
TTCATTCACTGA
CCGGAGGTTCAA
AATGACCCAGCG
AACCGAGTCG-3' Prm5/разрушенный ген nifL н.п. н.п. н.п. CI006 ds30 н.п. 320 CGCCAGAGAGTCGAAATCGAACATTTCCGTAATACCGCGATTACCCAGGAGCCGTTCTGGTTGCACAGCGGAAAACGTTAACGAAAGGATATTTCGCATG 354 TTTAACGATCTGATTGGCGATGATGAAACGGATTCGCCGGAAGATGCGCTTTCTGAGAGCTGGCGCGAATTGTGGCAGGATGCGTTGCAGGAGGAGGATT 388 5'-CGCCAGAGAGTC
GAAATCGAACAT
TTCCGTAATACC
GCGATTACCCAG
GAGCCGTTCTGG
TTGCACAGCGGA
AAACGTTAACGA
AAGGATATTTCG
CATG/TTTAACG
ATCTGATTGGCG
ATGATGAAACG
GATTCGCCGGAA
GATGCGCTTTCT
GAGAGCTGGCG
CGAATTGTGGCA
GGATGCGTTGCA
GGAGGAGGATT-
3' 5'-UTR и ATG/укороченный glnE ген н.п. н.п. н.п. CI006 ds31 н.п. 321 CGCCAGAGAGTCGAAATCGAACATTTCCGTAATACCGCGATTACCCAGGAGCCGTTCTGGTTGCACAGCGGAAAACGTTAACGAAAGGATATTTCGCATG 355 GCACTGAAACACCTCATTTCCCTGTGTGCCGCGTCGCCGATGGTTGCCAGTCAGCTGGCGCGCTACCCGATCCTGCTTGATGAATTGCTCGACCCGAATA 389 5'-CGCCAGAGAGTC
GAAATCGAACAT
TTCCGTAATACC
GCGATTACCCAG
GAGCCGTTCTGG
TTGCACAGCGGA
AAACGTTAACGA
AAGGATATTTCG
CATG/GCACTGA
AACACCTCATTT
CCCTGTGTGCCG
CGTCGCCGATGG
TTGCCAGTCAGC
TGGCGCGCTACC
CGATCCTGCTTG
ATGAATTGCTCG
ACCCGAATA-3' 5'-UTR и ATG/укороченный glnE ген н.п. н.п. н.п. CI019 ds34 н.п. 322 GATGATGGATGCTTTCTGGTTAAACGGGCAACCTCGTTAACTGACTGACTAGCCTGGGCAAACTGCCCGGGCTTTTTTTTGCAAGGAATCTGATTTCATG 356 GCGCTCAAACAGTTAATCCGTCTGTGTGCCGCCTCGCCGATGGTCGCGACACAACTTGCACGTCATCCTTTATTGCTCGATGAACTGCTCGACCCGCGCA 390 5'-GATGATGGATGC
TTTCTGGTTAAA
CGGGCAACCTCG
TTAACTGACTGA
CTAGCCTGGGCA
AACTGCCCGGGC
TTTTTTTTGCAA
GGAATCTGATTT
CATG/GCGCTCA
AACAGTTAATCC
GTCTGTGTGCCG
CCTCGCCGATGG
TCGCGACACAAC
TTGCACGTCATC
CTTTATTGCTCG
ATGAACTGCTCG
ACCCGCGCA-3' 5'-UTR и ATG/укороченный glnE ген н.п. н.п. н.п. CI019 ds70 up 323 ACCGATCCGCAGGCGCGCATTTGTTATGCCAATCCGGCATTCTGCCGCCAGACGGGTTTTGCACTTGAGACACTTTTGGGCGAGAACCACCGTCTGCTGG 357 AGTCTGAACTCATCCTGCGGCAGTCGGTGAGACGTATTTTTGACCAAAGAGTGATCTACATCACGGAATTTTGTGGTTGTTGCTGCTTAAAAGGGCAAAT 391 5'-ACCGATCCGCAG
GCGCGCATTTGT
TATGCCAATCCG
GCATTCTGCCGC
CAGACGGGTTTT
GCACTTGAGACA
CTTTTGGGCGAG
AACCACCGTCTG
CTGG/AGTCTGA
ACTCATCCTGCG
GCAGTCGGTGAG
ACGTATTTTTGA
CCAAAGAGTGAT
CTACATCACGGA
ATTTTGTGGTTG
TTGCTGCTTAAA
AGGGCAAAT-3' разрушенный ген nifL/Prm4 н.п. н.п. н.п. CI019 ds70 down 324 CATCGGACACCACCAGCTTACAAATTGCCTGATTGCGGCCCCGATGGCCGGTATCACTGACCGACCATTTCGTGCCTTATGTCATGCGATGGGGGCTGGG 358 CCGTCTCTGAAGCTCTCGGTGAACATTGTTGCGAGGCAGGATGCGAGCTGGTTGTGTTTTGACATTACCGATAATGTGCCGCGTGAACGGGTGCGTTATG 392 5'-CATCGGACACCA
CCAGCTTACAAA
TTGCCTGATTGC
GGCCCCGATGGC
CGGTATCACTGA
CCGACCATTTCG
TGCCTTATGTCA
TGCGATGGGGGC
TGGG/CCGTCTCT
GAAGCTCTCGGT
GAACATTGTTGC
GAGGCAGGATG
CGAGCTGGTTGT
GTTTTGACATTA
CCGATAATGTGC
CGCGTGAACGG
GTGCGTTATG-3' Prm4/разрушенный ген nifL н.п. н.п. н.п. 137 ds799 down 325 TCTTCAACAACTGGAGGAATAAGGTATTAAAGGCGGAAAACGAGTTCAAACGGCACGTCCGAATCGTATCAATGGCGAGATTCGCGCCCTGGAAGTTCGC 359 GCCATTGAGCTGGCTTCCCGACCGCAGGGCGGCACCTGCCTGACCCTGCGTTTCCCGCTGTTTAACACCCTGACCGGAGGTGAAGCATGATCCCTGAATC 393 5'-TCTTCAACAACT
GGAGGAATAAG
GTATTAAAGGCG
GAAAACGAGTTC
AAACGGCACGTC
CGAATCGTATCA
ATGGCGAGATTC
GCGCCCTGGAAG
TTCGC/GCCATTG
AGCTGGCTTCCC
GACCGCAGGGC
GGCACCTGCCTG
ACCCTGCGTTTC
CCGCTGTTTAAC
ACCCTGACCGGA
GGTGAAGCATG
ATCCCTGAATC-
3' PinfC/разрушенный ген nifL SEQ ID NO:417 CTCGGC
AGCATG
GACGTA
A SEQ ID NO:418 AGG
GTGT
TAAA
CAGC
GGG
AAA SEQ ID NO:419 /56-
FA
M/A
A
CG
G
CA
C
G/Z
EN/
T
CC
G
AA
T
CG
T
AT
C
AA/
3IA
BkF
Q/ 137 ds799 up 326 TCCGGGTTCGGCTTACCCCGCCGCGTTTTGCGCACGGTGTCGGACAATTTGTCATAACTGCGACACAGGAGTTTGCGATGACCCTGAATATGATGCTCGA 360 AGCGTCAGGTACCGGTCATGATTCACCGTGCGATTCTCGGTTCCCTGGAGCGCTTCATTGGCATCCTGACCGAAGAGTTCGCTGGCTTCTTCCCAACCTG 394 5'-TCCGGGTTCGGC
TTACCCCGCCGC
GTTTTGCGCACG
GTGTCGGACAAT
TTGTCATAACTG
CGACACAGGAG
TTTGCGATGACC
CTGAATATGATG
CTCGA/AGCGTC
AGGTACCGGTCA
TGATTCACCGTG
CGATTCTCGGTT
CCCTGGAGCGCT
TCATTGGCATCC
TGACCGAAGAGT
TCGCTGGCTTCT
TCCCAACCTG-3' разрушенный ген nifL/PinfC н.п. н.п. н.п. 137 ds809 н.п. 327 ATCGCAGCGTCTTTGAATATTTCCGTCGCCAGGCGCTGGCTGCCGAGCCGTTCTGGCTGCATAGTGGAAAACGATAATTTCAGGCCAGGGAGCCCTTATG 361 GCGCTGAAGCACCTGATCACGCTCTGCGCGGCGTCGCCGATGGTCGCCAGCCAGCTGGCGCGCCACCCGCTGCTGCTGGATGAGCTGCTGGATCCCAACA 395 5'-ATCGCAGCGTCT
TTGAATATTTCC
GTCGCCAGGCGC
TGGCTGCCGAGC
CGTTCTGGCTGC
ATAGTGGAAAA
CGATAATTTCAG
GCCAGGGAGCC
CTTATG/GCGCTG
AAGCACCTGATC
ACGCTCTGCGCG
GCGTCGCCGATG
GTCGCCAGCCAG
CTGGCGCGCCAC
CCGCTGCTGCTG
GATGAGCTGCTG
GATCCCAACA-3' 5'-UTR и ATG/укороченный glnE ген SEQ ID NO:420 GAGCCG
TTCTGG
CTGCAT
AG SEQ ID NO:421 GCCG
TCGG
CTGA
TAGA
GG SEQ ID NO:422 /56-
FA
M/T
TAT
GG
CG
C/Z
EN/
TG
AA
GC
AC
CT
GA
TC
A/3I
ABk
FQ/ 137 ds843 up 328 TCCGGGTTCGGCTTACCCCGCCGCGTTTTGCGCACGGTGTCGGACAATTTGTCATAACTGCGACACAGGAGTTTGCGATGACCCTGAATATGATGCTCGA 362 GCCCGCTGACCGACCAGAACTTCCACCTTGGACTCGGCTATACCCTTGGCGTGACGGCGCGCGATAACTGGGACTACATCCCCATTCCGGTGATCTTACC 396 5'-TCCGGGTTCGGC
TTACCCCGCCGC
GTTTTGCGCACG
GTGTCGGACAAT
TTGTCATAACTG
CGACACAGGAG
TTTGCGATGACC
CTGAATATGATG
CTCGA/GCCCGC
TGACCGACCAGA
ACTTCCACCTTG
GACTCGGCTATA
CCCTTGGCGTGA
CGGCGCGCGATA
ACTGGGACTACA
TCCCCATTCCGG
TGATCTTACC-3' разрушенный ген nifL/Prm1.2 н.п. н.п. н.п. 137 ds843 down 329 TCACTTTTTAGCAAAGTTGCACTGGACAAAAGGTACCACAATTGGTGTACTGATACTCGACACAGCATTAGTGTCGATTTTTCATATAAAGGTAATTTTG 363 GCCATTGAGCTGGCTTCCCGACCGCAGGGCGGCACCTGCCTGACCCTGCGTTTCCCGCTGTTTAACACCCTGACCGGAGGTGAAGCATGATCCCTGAATC 397 5'-TCACTTTTTAGC
AAAGTTGCACTG
GACAAAAGGTA
CCACAATTGGTG
TACTGATACTCG
ACACAGCATTAG
TGTCGATTTTTC
ATATAAAGGTAA
TTTTG/GCCATTG
AGCTGGCTTCCC
GACCGCAGGGC
GGCACCTGCCTG
ACCCTGCGTTTC
CCGCTGTTTAAC
ACCCTGACCGGA
GGTGAAGCATG
ATCCCTGAATC-
3' Prm1.2/разрушенный ген nifL н.п. н.п. н.п. 137 ds853 up 330 TCCGGGTTCGGCTTACCCCGCCGCGTTTTGCGCACGGTGTCGGACAATTTGTCATAACTGCGACACAGGAGTTTGCGATGACCCTGAATATGATGCTCGA 364 GCTAAAGTTCTCGGCTAATCGCTGATAACATTTGACGCAATGCGCAATAAAAGGGCATCATTTGATGCCCTTTTTGCACGCTTTCATACCAGAACCTGGC 398 5'-TCCGGGTTCGGC
TTACCCCGCCGC
GTTTTGCGCACG
GTGTCGGACAAT
TTGTCATAACTG
CGACACAGGAG
TTTGCGATGACC
CTGAATATGATG
CTCGA/GCTAAA
GTTCTCGGCTAA
TCGCTGATAACA
TTTGACGCAATG
CGCAATAAAAG
GGCATCATTTGA
TGCCCTTTTTGC
ACGCTTTCATAC
CAGAACCTGGC-
3' разрушенный ген nifL/Prm6.2 н.п. н.п. н.п. 137 ds853 down 331 GTTCTCCTTTGCAATAGCAGGGAAGAGGCGCCAGAACCGCCAGCGTTGAAGCAGTTTGAACGCGTTCAGTGTATAATCCGAAACTTAATTTCGGTTTGGA 365 GCCATTGAGCTGGCTTCCCGACCGCAGGGCGGCACCTGCCTGACCCTGCGTTTCCCGCTGTTTAACACCCTGACCGGAGGTGAAGCATGATCCCTGAATC 399 5'-GTTCTCCTTTGC
AATAGCAGGGA
AGAGGCGCCAG
AACCGCCAGCGT
TGAAGCAGTTTG
AACGCGTTCAGT
GTATAATCCGAA
ACTTAATTTCGG
TTTGGA/GCCATT
GAGCTGGCTTCC
CGACCGCAGGG
CGGCACCTGCCT
GACCCTGCGTTT
CCCGCTGTTTAA
CACCCTGACCGG
AGGTGAAGCAT
GATCCCTGAATC
-3' Prm6.2/разрушенный ген nifL н.п. н.п. н.п. 137 ds857 up 332 TCCGGGTTCGGCTTACCCCGCCGCGTTTTGCGCACGGTGTCGGACAATTTGTCATAACTGCGACACAGGAGTTTGCGATGACCCTGAATATGATGCTCGA 366 CGCCGTCCTCGCAGTACCATTGCAACCGACTTTACAGCAAGAAGTGATTCTGGCACGCATGGAACAAATTCTTGCCAGTCGGGCTTTATCCGATGACGAA 400 5'-TCCGGGTTCGGC
TTACCCCGCCGC
GTTTTGCGCACG
GTGTCGGACAAT
TTGTCATAACTG
CGACACAGGAG
TTTGCGATGACC
CTGAATATGATG
CTCGA/CGCCGT
CCTCGCAGTACC
ATTGCAACCGAC
TTTACAGCAAGA
AGTGATTCTGGC
ACGCATGGAAC
AAATTCTTGCCA
GTCGGGCTTTAT
CCGATGACGAA-
3' разрушенный ген nifL/Prm8.2 н.п. н.п. н.п. 137 ds857 down 333 GATATGCCTGAAGTATTCAATTACTTAGGCATTTACTTAACGCAGGCAGGCAATTTTGATGCTGCCTATGAAGCGTTTGATTCTGTACTTGAGCTTGATC 367 GCCATTGAGCTGGCTTCCCGACCGCAGGGCGGCACCTGCCTGACCCTGCGTTTCCCGCTGTTTAACACCCTGACCGGAGGTGAAGCATGATCCCTGAATC 401 5'-GATATGCCTGAA
GTATTCAATTAC
TTAGGCATTTAC
TTAACGCAGGCA
GGCAATTTTGAT
GCTGCCTATGAA
GCGTTTGATTCT
GTACTTGAGCTT
GATC/GCCATTG
AGCTGGCTTCCC
GACCGCAGGGC
GGCACCTGCCTG
ACCCTGCGTTTC
CCGCTGTTTAAC
ACCCTGACCGGA
GGTGAAGCATG
ATCCCTGAATC-
3' Prm8.2/разрушенный ген nifL н.п. н.п. н.п. 63 ds908 down 334 TGGTATTGTCAGTCTGAATGAAGCTCTTGAAAAAGCTGAGGAAGCGGGCGTCGATTTAGTAGAAATCAGTCCGAATGCCGAGCCGCCAGTTTGTCGAATC 368 TCTTTAGATCTCTCGGTCCGCCCTGATGGCGGCACCTTGCTGACGTTACGCCTGCCGGTACAGCAGGTTATCACCGGAGGCTTAAAATGACCCAGTTACC 402 5'-TGGTATTGTCAG
TCTGAATGAAGC
TCTTGAAAAAGC
TGAGGAAGCGG
GCGTCGATTTAG
TAGAAATCAGTC
CGAATGCCGAGC
CGCCAGTTTGTC
GAATC/TCTTTAG
ATCTCTCGGTCC
GCCCTGATGGCG
GCACCTTGCTGA
CGTTACGCCTGC
CGGTACAGCAG
GTTATCACCGGA
GGCTTAAAATGA
CCCAGTTACC-3' PinfC/разрушенный ген nifL SEQ ID NO:423 GGAAAA
CGAGTT
CAACCG
GC SEQ ID NO:424 GGGC
GGAC
CGAG
AGAT
CTAA н.п. 63 ds908 up 335 TGCAAATTGCACGGTTATTCCGGGTGAGTATATGTGTGATTTGGGTTCCGGCATTGCGCAATAAAGGGGAGAAAGACATGAGCATCACGGCGTTATCAGC 369 TGAATATCACTGACTCACAAGCTACCTATGTCGAAGAATTAACTAAAAAACTGCAAGATGCAGGCATTCGCGTTAAAGCCGACTTGAGAAATGAGAAGAT 403 5'-TGCAAATTGCAC
GGTTATTCCGGG
TGAGTATATGTG
TGATTTGGGTTC
CGGCATTGCGCA
ATAAAGGGGAG
AAAGACATGAG
CATCACGGCGTT
ATCAGC/TGAAT
ATCACTGACTCA
CAAGCTACCTAT
GTCGAAGAATTA
ACTAAAAAACTG
CAAGATGCAGG
CATTCGCGTTAA
AGCCGACTTGAG
AAATGAGAAGAT-3' разрушенный ген nifL/PinfC н.п. н.п. н.п. 910 ds960 up 336 TCAGGGCTGCGGATGTCGGGCGTTTCACAACACAAAATGTTGTAAATGCGACACAGCCGGGCCTGAAACCAGGAGCGTGTGATGACCTTTAATATGATGC 370 CTGGGGTCACTGGAGCGCTTTATCGGCATCCTGACCGAAGAATTTGCCGGTTTCTTCCCGACCTGGCTGGCCCCTGTTCAGGTTGTGGTGATGAATATCA 404 5'-TCAGGGCTGCGG
ATGTCGGGCGTT
TCACAACACAAA
ATGTTGTAAATG
CGACACAGCCG
GGCCTGAAACCA
GGAGCGTGTGAT
GACCTTTAATAT
GATGC/CTGGGG
TCACTGGAGCGC
TTTATCGGCATC
CTGACCGAAGA
ATTTGCCGGTTT
CTTCCCGACCTG
GCTGGCCCCTGT
TCAGGTTGTGGT
GATGAATATCA-
3' разрушенный ген nifL/PinfC н.п. н.п. н.п. 910 ds960 down 337 CGGAAAACGAGTTCAAACGGCACGTCCGAATCGTATCAATGGCGAGATTCGCGCCCAGGAAGTTCGCTTAACTGGTCTGGAAGGTGAGCAGCTGGGTATT 371 GCAATAGAACTAACTACCCGCCCTGAAGGCGGTACCTGCCTGACCCTGCGATTCCCGTTATTTCATTCACTGACCGGAGGCCCACGATGACCCAGCGACC 405 5'-CGGAAAACGAG
TTCAAACGGCAC
GTCCGAATCGTA
TCAATGGCGAGA
TTCGCGCCCAGG
AAGTTCGCTTAA
CTGGTCTGGAAG
GTGAGCAGCTGG
GTATT/GCAATA
GAACTAACTACC
CGCCCTGAAGGC
GGTACCTGCCTG
ACCCTGCGATTC
CCGTTATTTCAT
TCACTGACCGGA
GGCCCACGATGA
CCCAGCGACC-3' PinfC/разрушенный ген nifL н.п. н.п. н.п.

Таблица F: Подвергнутые генетической инженерии не являющиеся межродовыми микроорганизмы

Название штамма Генотип SEQ ID NO CI006 16S рДНК - контиг 5 62 CI006 16S рДНК - контиг 8 63 CI019 16S рДНК 64 CI006 nifH 65 CI006 nifD 66 CI006 nifK 67 CI006 nifL 68 CI006 nifA 69 CI019 nifH 70 CI019 nifD 71 CI019 nifK 72 CI019 nifL 73 CI019 nifA 74 CI006 Prm5 с фланкирующими областями 500 п.н. 75 CI006 оперон nifLA - расположенная выше межгенная область и CDS nifL и nifA 76 CI006 nifL (аминокислота) 77 CI006 nifA (аминокислота) 78 CI006 glnE 79 CI006 glnE_KO1 80 CI006 glnE (аминокислота) 81 CI006 glnE_KO1 (аминокислота) 82 CI006 АТазный домен GlnE (аминокислота) 83 CM029 Prm5 встроенный в область nifL 84

Таблица G: Подвергнутые генетической инженерии не являющиеся межродовыми микроорганизмы

Штамм ID штамма SEQ ID NO Генотип Описание Ассоциированное новое соединение если применимо CI63; CI063 63 SEQ ID NO 85 16S н.п. н.п. CI63; CI063 63 SEQ ID NO 86 nifH н.п. н.п. CI63; CI063 63 SEQ ID NO 87 nifD1 1 из 2 уникальных генов, аннотированных в геноме 63 как nifD н.п. CI63; CI063 63 SEQ ID NO 88 nifD2 2 из 2 уникальных генов, аннотированных в геноме 63 как nifD н.п. CI63; CI063 63 SEQ ID NO 89 nifK1 1 из 2 уникальных генов, аннотированных в геноме 63 как nifK н.п. CI63; CI063 63 SEQ ID NO 90 nifK2 2 из 2 уникальных генов, аннотированных в геноме 63 как nifK н.п. CI63; CI063 63 SEQ ID NO 91 nifL н.п. н.п. CI63; CI063 63 SEQ ID NO 92 nifA н.п. н.п. CI63; CI063 63 SEQ ID NO 93 glnE н.п. н.п. CI63; CI063 63 SEQ ID NO 94 amtB н.п. н.п. CI63; CI063 63 SEQ ID NO 95 PinfC 500 п.н. непосредственно выше старт-кодона ATG гена infC н.п. CI137 137 SEQ ID NO 96 16S н.п. н.п. CI137 137 SEQ ID NO 97 nifH1 1 из 2 уникальных генов, аннотированных в геноме 137 как nifH н.п. CI137 137 SEQ ID NO 98 nifH2 2 из 2 уникальных генов, аннотированных в геноме 137 как nifH н.п. CI137 137 SEQ ID NO 99 nifD1 1 из 2 уникальных генов, аннотированных в геноме 137 как nifD н.п. CI137 137 SEQ ID NO 100 nifD2 2 из 2 уникальных генов, аннотированных в геноме 137 как nifD н.п. CI137 137 SEQ ID NO 101 nifK1 1 из 2 уникальных генов, аннотированных в геноме 137 как nifK н.п. CI137 137 SEQ ID NO 102 nifK2 2 из 2 уникальных генов, аннотированных в геноме 137 как nifK н.п. CI137 137 SEQ ID NO 103 nifL н.п. н.п. CI137 137 SEQ ID NO 104 nifA н.п. н.п. CI137 137 SEQ ID NO 105 glnE н.п. н.п. CI137 137 SEQ ID NO 106 PinfC 500 п.н. непосредственно выше старт-кодона TTG of infC н.п. CI137 137 SEQ ID NO 107 amtB н.п. н.п. CI137 137 SEQ ID NO 108 Prm8.2 внутренний промотор, расположенный в гене nlpI; 299 п.н., начиная от 81 п.н. после A ATG гена nlpI н.п. CI137 137 SEQ ID NO 109 Prm6.2 300 п.н. выше гена secE, начиная от 57 п.н. выше A ATG secE н.п. CI137 137 SEQ ID NO 110 Prm1.2 400 п.н. непосредственно выше ATG гена cspE н.п. нет 728 SEQ ID NO 111 16S н.п. н.п. нет 728 SEQ ID NO 112 nifH н.п. н.п. нет 728 SEQ ID NO 113 nifD1 1 из 2 уникальных генов, аннотированных в геноме 728 как nifD н.п. нет 728 SEQ ID NO 114 nifD2 2 из 2 уникальных генов, аннотированных в геноме 728 как nifD н.п. нет 728 SEQ ID NO 115 nifK1 1 из 2 уникальных генов, аннотированных в геноме 728 как nifK н.п. нет 728 SEQ ID NO 116 nifK2 2 из 2 уникальных генов, аннотированных в геноме 728 как nifK н.п. нет 728 SEQ ID NO 117 nifL н.п. н.п. нет 728 SEQ ID NO 118 nifA н.п. н.п. нет 728 SEQ ID NO 119 glnE н.п. н.п. нет 728 SEQ ID NO 120 amtB н.п. н.п. нет 850 SEQ ID NO 121 16S н.п. н.п. нет 852 SEQ ID NO 122 16S н.п. н.п. нет 853 SEQ ID NO 123 16S н.п. н.п. нет 910 SEQ ID NO 124 16S н.п. н.п. нет 910 SEQ ID NO 125 nifH н.п. н.п. нет 910 SEQ ID NO 126 CDS железо-молибденового кофактора динитрогеназы н.п. н.п. нет 910 SEQ ID NO 127 nifD1 н.п. н.п. нет 910 SEQ ID NO 128 nifD2 н.п. н.п. нет 910 SEQ ID NO 129 nifK1 н.п. н.п. нет 910 SEQ ID NO 130 nifK2 н.п. н.п. нет 910 SEQ ID NO 131 nifL н.п. н.п. нет 910 SEQ ID NO 132 nifA н.п. н.п. нет 910 SEQ ID NO 133 glnE н.п. н.п. нет 910 SEQ ID NO 134 amtB н.п. н.п. нет 910 SEQ ID NO 135 PinfC 498 п.н. непосредственно выше ATG гена infC н.п. нет 1021 SEQ ID NO 136 16S н.п. н.п. нет 1021 SEQ ID NO 137 nifH н.п. н.п. нет 1021 SEQ ID NO 138 nifD1 1 из 2 уникальных генов, аннотированных в геноме 910 как nifD н.п. нет 1021 SEQ ID NO 139 nifD2 2 из 2 уникальных генов, аннотированных в геноме 910 как nifD н.п. нет 1021 SEQ ID NO 140 nifK1 1 из 2 уникальных генов, аннотированных в геноме 910 как nifK н.п. нет 1021 SEQ ID NO 141 nifK2 2 из 2 уникальных генов, аннотированных в геноме 910 как nifK н.п. нет 1021 SEQ ID NO 142 nifL н.п. н.п. нет 1021 SEQ ID NO 143 nifA н.п. н.п. нет 1021 SEQ ID NO 144 glnE н.п. н.п. нет 1021 SEQ ID NO 145 amtB н.п. н.п. нет 1021 SEQ ID NO 146 PinfC 500 п.н. непосредственно выше старт-кодона ATG гена infC н.п. нет 1021 SEQ ID NO 147 Prm1 348 п.н. включает 319 п.н. непосредственно выше старт-кодона ATG гена lpp и первых 29 п.н. гена lpp н.п. нет 1021 SEQ ID NO 148 Prm7 339 п.н. выше гена sspA, кончается на 46 п.н. выше ATG гена sspA н.п. нет 1113 SEQ ID NO 149 16S н.п. н.п. нет 1113 SEQ ID NO 150 nifH н.п. н.п. нет 1113 SEQ ID NO 151 nifD1 1 из 2 уникальных генов, аннотированных в геноме 1113 как nifD н.п. нет 1113 SEQ ID NO 152 nifD2 2 из 2 уникальных генов, аннотированных в геноме 1113 как nifD н.п. нет 1113 SEQ ID NO 153 nifK н.п. н.п. нет 1113 SEQ ID NO 154 nifL н.п. н.п. нет 1113 SEQ ID NO 155 частичный ген nifA вследствие пропуска в сборке последовательности авторы могут идентифицировать только частичный ген из генома 1113 н.п. нет 1113 SEQ ID NO 156 glnE н.п. н.п. нет 1116 SEQ ID NO 157 16S н.п. нет 1116 SEQ ID NO 158 nifH н.п. нет 1116 SEQ ID NO 159 nifD1 1 из 2 уникальных генов, аннотированных в геноме 1116 как nifD н.п. нет 1116 SEQ ID NO 160 nifD2 2 из 2 уникальных генов, аннотированных в геноме 1116 как nifD н.п. нет 1116 SEQ ID NO 161 nifK1 1 из 2 уникальных генов, аннотированных в геноме 1116 как nifK н.п. нет 1116 SEQ ID NO 162 nifK2 2 из 2 уникальных генов, аннотированных в геноме 1116 как nifK н.п. нет 1116 SEQ ID NO 163 nifL н.п. н.п. нет 1116 SEQ ID NO 164 nifA н.п. н.п. нет 1116 SEQ ID NO 165 glnE н.п. н.п. нет 1116 SEQ ID NO 166 amtB н.п. н.п. нет 1293 SEQ ID NO 167 16S н.п. н.п. нет 1293 SEQ ID NO 168 nifH н.п. н.п. нет 1293 SEQ ID NO 169 nifD1 1 из 2 уникальных генов, аннотированных в геноме 1293 как nifD н.п. нет 1293 SEQ ID NO 170 nifD2 2 из 2 уникальных генов, аннотированных в геноме 1293 как nifD н.п. нет 1293 SEQ ID NO 171 nifK 1 из 2 уникальных генов, аннотированных в геноме 1293 как nifK н.п. нет 1293 SEQ ID NO 172 nifK1 2 из 2 уникальных генов, аннотированных в геноме 1293 как nifK н.п. нет 1293 SEQ ID NO 173 nifA н.п. н.п. нет 1293 SEQ ID NO 174 glnE н.п. н.п. нет 1293 SEQ ID NO 175 amtB1 1 из 2 уникальных генов, аннотированных в геноме 1293 как amtB н.п. нет 1293 SEQ ID NO 176 amtB2 2 из 2 уникальных генов, аннотированных в геноме 1293 как amtB н.п. нет 1021-1612 SEQ ID NO 177 ΔnifL::PinfC начиная от 24 п.н. после A старт-кодона ATG, 1375 п.н. nifL удалены и заменены последовательностью промотора PinfC 1021 ds1131 нет 1021-1612 SEQ ID NO 178 ΔnifL::PinfC с фланкирующими 500 п.н. начиная от 24 п.н. после A старт-кодона ATG, 1375 п.н. nifL удалены и заменены последовательностью промотора PinfC 1021; включены 500 п.н., фланкирующие ген nifL выше и ниже ds1131 нет 1021-1612 SEQ ID NO 179 glnEΔAR-2 ген glnE с 1673 п.н. непосредственно ниже старт-кодона ATG удален, приводя к укороченному белку glnE с отсутствием аденилил-удаляющего (AR) домена ds1133 нет 1021-1612 SEQ ID NO 180 glnEΔAR-2 с фланкирующими 500 п.н. ген glnE с 1673 п.н. непосредственно ниже старт-кодона ATG удалены, приводя к укороченному белку glnE с отсутствием аденилил-удаляющего (AR) домена; включены 500 п.н., фланкирующие ген glnE выше и ниже ds1133 нет 1021-1615 SEQ ID NO 181 ΔnifL::Prm1 начиная от 24 п.н. после A старт-кодона ATG, 1375 п.н. nifL удалены и заменены последовательностью промотора Prm1 1021 ds1145 нет 1021-1615 SEQ ID NO 182 ΔnifL::Prm1 с фланкирующими 500 п.н. начиная от 24 п.н. после A старт-кодона ATG, 1375 п.н. nifL удалены и заменены последовательностью промотора rm1 1021; включены 500 п.н., фланкирующие ген nifL выше и ниже ds1145 нет 1021-1615 SEQ ID NO 183 glnEΔAR-2 ген glnE с 1673 п.н. непосредственно ниже старт-кодона ATG удален, приводя к укороченному белку glnE с отсутствием аденилил-удаляющего (AR) домена ds1133 нет 1021-1615 SEQ ID NO 184 glnEΔAR-2 с фланкирующими 500 п.н. ген glnE с 1673 п.н. непосредственно ниже старт-кодона ATG удален, приводя к укороченному белку glnE с отсутствием аденилил-удаляющего (AR) домена; включены 500 п.н., фланкирующие ген glnE выше и ниже ds1133 нет 1021-1619 SEQ ID NO 185 ΔnifL::Prm1 начиная от 24 п.н. после A старт-кодона ATG, 1375 п.н. nifL удалены и заменены последовательностью промотора Prm1 1021 ds1145 нет 1021-1619 SEQ ID NO 186 ΔnifL::Prm1 с фланкирующими 500 п.н. начиная от 24 п.н. после A старт-кодона ATG, 1375 п.н. nifL удалены и заменены последовательностью промотора rm1 1021; включены 500 п.н., фланкирующие ген nifL выше и ниже ds1145 нет 1021-1623 SEQ ID NO 187 glnEΔAR-2 ген glnE с 1673 п.н. непосредственно ниже старт-кодона ATG удален, приводя к укороченному белку glnE с отсутствием аденилил-удаляющего (AR) домена ds1133 нет 1021-1623 SEQ ID NO 188 glnEΔAR-2 с фланкирующими 500 п.н. ген glnE с 1673 п.н. непосредственно ниже старт-кодона ATG удален, приводя к укороченному белку glnE с отсутствием аденилил-удаляющего (AR) домена; включены 500 п.н., фланкирующие ген glnE выше и ниже ds1133 нет 1021-1623 SEQ ID NO 189 ΔnifL::Prm7 начиная от 24 п.н. после A старт-кодона ATG, 1375 п.н. nifL удалены и заменены последовательностью промотора Prm7 1021 ds1148 нет 1021-1623 SEQ ID NO 190 ΔnifL::Prm7 с фланкирующими 500 п.н. начиная от 24 п.н. после A старт-кодона ATG, 1375 п.н. nifL удалены и заменены последовательностью промотора rm7 1021; включены 500 п.н., фланкирующие ген nifL выше и ниже ds1148 нет 137-1034 SEQ ID NO 191 glnEΔAR-2 ген glnE с 1290 п.н. непосредственно ниже старт-кодона ATG удален, приводя к укороченному белку glnE с отсутствием аденилил-удаляющего (AR) домена ds809 нет 137-1034 SEQ ID NO 192 glnEΔAR-2 с фланкирующими 500 п.н. ген glnE с 1290 п.н. непосредственно ниже старт-кодона ATG удален, приводя к укороченному белку glnE с отсутствием аденилил-удаляющего (AR) домена; включены 500 п.н., фланкирующие ген glnE выше и ниже ds809 нет 137-1036 SEQ ID NO 193 ΔnifL::PinfC начиная от 24 п.н. после A старт-кодона ATG, 1372 п.н. nifL удалены и заменены 137 последовательность промотора PinfC ds799 нет 137-1036 SEQ ID NO 194 ΔnifL::PinfC с фланкирующими 500 п.н. начиная от 24 п.н. после A старт-кодона ATG, 1372 п.н. nifL удалены и заменены 137 последовательность промотора PinfC; включены 500 п.н., фланкирующие ген nifL выше и ниже ds799 нет 137-1314 SEQ ID NO 195 glnEΔAR-2 делеция 36 п.н. ген glnE с 1290 п.н. непосредственно ниже старт-кодона ATG удален AND 36 п.н. удален, начиная с 1472 п.н. ниже старт-кодона, приводя к укороченному белку glnE с отсутствием аденилил-удаляющего (AR) домена нет нет 137-1314 SEQ ID NO 196 glnEΔAR-2 делеция 36 п.н. ген glnE с 1290 п.н. непосредственно ниже старт-кодона ATG удален AND 36 п.н. удален, начиная с 1472 п.н. ниже старт-кодона, приводя к укороченному белку glnE с отсутствием аденилил-удаляющего (AR) домена; включены 500 п.н., фланкирующие ген nifL выше и ниже нет нет 137-1314 SEQ ID NO 197 ΔnifL::Prm8.2 начиная от 24 п.н. после A старт-кодона ATG, 1372 п.н. nifL удалены и заменены последовательностью промотора Prm8.2 137 ds857 нет 137-1314 SEQ ID NO 198 ΔnifL::Prm8.2 с фланкирующими 500 п.н. начиная от 24 п.н. после A старт-кодона ATG, 1372 п.н. nifL удалены и заменены последовательностью промотора Prm8.2 137; включены 500 п.н., фланкирующие ген nifL выше и ниже ds857 нет 137-1329 SEQ ID NO 199 glnEΔAR-2 делеция 36 п.н. ген glnE с 1290 п.н. непосредственно ниже старт-кодона ATG удален AND 36 п.н. удален, начиная с 1472 п.н. ниже старт-кодона, приводя к укороченному белку glnE с отсутствием аденилил-удаляющего (AR) домена нет нет 137-1329 SEQ ID NO 200 glnEΔAR-2 делеция 36 п.н. ген glnE с 1290 п.н. непосредственно ниже старт-кодона ATG удален AND 36 п.н. удален, начиная с 1472 п.н. ниже старт-кодона, приводя к укороченному белку glnE с отсутствием аденилил-удаляющего (AR) домена; включены 500 п.н., фланкирующие ген nifL выше и ниже нет нет 137-1329 SEQ ID NO 201 ΔnifL::Prm6.2 начиная от 24 п.н. после A старт-кодона ATG, 1372 п.н. nifL удалены и заменены последовательностью промотора Prm6.2 137 ds853 нет 137-1329 SEQ ID NO 202 ΔnifL::Prm6.2 с фланкирующими 500 п.н. начиная от 24 п.н. после A старт-кодона ATG, 1372 п.н. nifL удалены и заменены последовательностью промотора Prm6.2 137; включены 500 п.н., фланкирующие ген nifL выше и ниже ds853 нет 137-1382 SEQ ID NO 203 ΔnifL::Prm1.2 начиная от 24 п.н. после A старт-кодона ATG, 1372 п.н. nifL удалены и заменены последовательностью промотора Prm1.2 137 ds843 нет 137-1382 SEQ ID NO 204 ΔnifL::Prm1.2 с фланкирующими 500 п.н. начиная от 24 п.н. после A старт-кодона ATG, 1372 п.н. nifL удалены и заменены последовательностью промотора Prm1.2 137; включены 500 п.н., фланкирующие ген nifL выше и ниже ds843 нет 137-1382 SEQ ID NO 205 glnEΔAR-2 делеция 36 п.н. ген glnE с 1290 п.н. непосредственно ниже старт-кодона ATG удален AND 36 п.н. удален, начиная с 1472 п.н. ниже старт-кодона, приводя к укороченному белку glnE с отсутствием аденилил-удаляющего (AR) домена нет нет 137-1382 SEQ ID NO 206 glnEΔAR-2 делеция 36 п.н. ген glnE с 1290 п.н. непосредственно ниже старт-кодона ATG удален AND 36 п.н. удален, начиная с 1472 п.н. ниже старт-кодона, приводя к укороченному белку glnE с отсутствием аденилил-удаляющего (AR) домена; включены 500 п.н., фланкирующие ген nifL выше и ниже нет нет 137-1586 SEQ ID NO 207 ΔnifL::PinfC начиная от 24 п.н. после A старт-кодона ATG, 1372 п.н. nifL удалены и заменены 137 последовательность промотора PinfC ds799 нет 137-1586 SEQ ID NO 208 ΔnifL::PinfC с фланкирующими 500 п.н. начиная от 24 п.н. после A старт-кодона ATG, 1372 п.н. nifL удалены и заменены 137 последовательность промотора PinfC; включены 500 п.н., фланкирующие ген nifL выше и ниже ds799 нет 137-1586 SEQ ID NO 209 glnEΔAR-2 ген glnE с 1290 п.н. непосредственно ниже старт-кодона ATG удален, приводя к укороченному белку glnE с отсутствием аденилил-удаляющего (AR) домена ds809 нет 137-1586 SEQ ID NO 210 glnEΔAR-2 с фланкирующими 500 п.н. ген glnE с 1290 п.н. непосредственно ниже старт-кодона ATG удален, приводя к укороченному белку glnE с отсутствием аденилил-удаляющего (AR) домена; включены 500 п.н., фланкирующие ген glnE выше и ниже ds809 нет 19-594 SEQ ID NO 211 glnEΔAR-2 ген glnE с 1650 п.н. непосредственно ниже старт-кодона ATG удален, приводя к укороченному белку glnE с отсутствием аденилил-удаляющего (AR) домена ds34 нет 19-594 SEQ ID NO 212 glnEΔAR-2 с фланкирующими 500 п.н. ген glnE с 1650 п.н. непосредственно ниже старт-кодона ATG удален, приводя к укороченному белку glnE с отсутствием аденилил-удаляющего (AR) домена; включены 500 п.н., фланкирующие ген glnE выше и ниже ds34 нет 19-594 SEQ ID NO 213 ΔnifL::Prm6.1 начиная от 221 п.н. после A старт-кодона ATG, 845 п.н. nifL удалены и заменены последовательностью промотора Prm6.1 CI019 ds180 нет 19-594 SEQ ID NO 214 ΔnifL::Prm6.1 с фланкирующими 500 п.н. начиная от 221 п.н. после A старт-кодона ATG, 845 п.н. nifL удалены и заменены CI019 Prm6.1промотор последовательность; включены 500 п.н., фланкирующие ген nifL выше и ниже ds180 нет 19-714 SEQ ID NO 215 ΔnifL::Prm6.1 начиная от 221 п.н. после A старт-кодона ATG, 845 п.н. nifL удалены и заменены последовательностью промотора Prm6.1 CI019 ds180 нет 19-714 SEQ ID NO 216 ΔnifL::Prm6.1 с фланкирующими 500 п.н. начиная от 221 п.н. после A старт-кодона ATG, 845 п.н. nifL удалены и заменены CI019 Prm6.1промотор последовательность; включены 500 п.н., фланкирующие ген nifL выше и ниже ds180 нет 19-715 SEQ ID NO 217 ΔnifL::Prm7.1 начиная от 221 п.н. после A старт-кодона ATG, 845 п.н. nifL удалены и заменены последовательностью промотора Prm7.1 CI019 ds181 нет 19-715 SEQ ID NO 218 ΔnifL::Prm7.1 с фланкирующими 500 п.н. начиная от 221 п.н. после A старт-кодона ATG, 845 п.н. nifL удалены и заменены CI019 Prm76,1промотор последовательность; включены 500 п.н., фланкирующие ген nifL выше и ниже ds181 19-713 19-750 SEQ ID NO 219 ΔnifL::Prm1.2 начиная от 221 п.н. после A старт-кодона ATG, 845 п.н. nifL удалены и заменены последовательностью промотора Prm1.2 CI019 ds172 19-713 19-750 SEQ ID NO 220 ΔnifL::Prm1.2 с фланкирующими 500 п.н. начиная от 221 п.н. после A старт-кодона ATG, 845 п.н. nifL удалены и заменены последовательностью промотора Prm1.2 CI019; включены 500 п.н., фланкирующие ген nifL выше и ниже ds172 17-724 19-804 SEQ ID NO 221 ΔnifL::Prm1.2 начиная от 221 п.н. после A старт-кодона ATG, 845 п.н. nifL удалены и заменены последовательностью промотора Prm1.2 CI019 ds172 17-724 19-804 SEQ ID NO 222 ΔnifL::Prm1.2 с фланкирующими 500 п.н. начиная от 221 п.н. после A старт-кодона ATG, 845 п.н. nifL удалены и заменены последовательностью промотора Prm1.2 CI019; включены 500 п.н., фланкирующие ген nifL выше и ниже ds172 17-724 19-804 SEQ ID NO 223 glnEΔAR-2 ген glnE с 1650 п.н. непосредственно ниже старт-кодона ATG удален, приводя к укороченному белку glnE с отсутствием аденилил-удаляющего (AR) домена ds34 17-724 19-804 SEQ ID NO 224 glnEΔAR-2 с фланкирующими 500 п.н. ген glnE с 1650 п.н. непосредственно ниже старт-кодона ATG удален, приводя к укороченному белку glnE с отсутствием аденилил-удаляющего (AR) домена; включены 500 п.н., фланкирующие ген glnE выше и ниже ds34 19-590 19-806 SEQ ID NO 225 ΔnifL::Prm3.1 начиная от 221 п.н. после A старт-кодона ATG, 845 п.н. nifL удалены и заменены последовательностью промотора Prm3.1 CI019 ds175 19-590 19-806 SEQ ID NO 226 ΔnifL::Prm3.1 с фланкирующими 500 п.н. начиная от 221 п.н. после A старт-кодона ATG, 845 п.н. nifL удалены и заменены последовательностью промотора Prm3.1 CI019; включены 500 п.н., фланкирующие ген nifL выше и ниже ds175 19-590 19-806 SEQ ID NO 227 glnEΔAR-2 ген glnE с 1650 п.н. непосредственно ниже старт-кодона ATG удален, приводя к укороченному белку glnE с отсутствием аденилил-удаляющего (AR) домена ds34 19-590 19-806 SEQ ID NO 228 glnEΔAR-2 с фланкирующими 500 п.н. ген glnE с 1650 п.н. непосредственно ниже старт-кодона ATG удален, приводя к укороченному белку glnE с отсутствием аденилил-удаляющего (AR) домена; включены 500 п.н., фланкирующие ген glnE выше и ниже ds34 нет 63-1146 SEQ ID NO 229 ΔnifL::PinfC начиная от 24 п.н. после A старт-кодона ATG, 1375 п.н. nifL удалены и заменены 63 последовательность промотора PinfC ds908 нет 63-1146 SEQ ID NO 230 ΔnifL::PinfC с фланкирующими 500 п.н. начиная от 24 п.н. после A старт-кодона ATG, 1375 п.н. nifL удалены и заменены 63 последовательность промотора PinfC; включены 500 п.н., фланкирующие ген nifL выше и ниже ds908 CM015; PBC6.15 6-397 SEQ ID NO 231 ΔnifL::Prm5 начиная от 31 п.н. после A старт-кодона ATG, 1375 п.н. nifL удалены и заменены последовательностью промотора Prm5 CI006 ds24 CM015; PBC6.15 6-397 SEQ ID NO 232 ΔnifL::Prm5 с фланкирующими 500 п.н. начиная от 31 п.н. после A старт-кодона ATG, 1375 п.н. nifL удалены и заменены последовательностью промотора Prm5 CI006; включены 500 п.н., фланкирующие ген nifL выше и ниже ds24 CM014 6-400 SEQ ID NO 233 ΔnifL::Prm1 начиная от 31 п.н. после A старт-кодона ATG, 1375 п.н. nifL удалены и заменены последовательностью промотора Prm1 CI006 ds20 CM014 6-400 SEQ ID NO 234 ΔnifL::Prm1 с фланкирующими 500 п.н. начиная от 31 п.н. после A старт-кодона ATG, 1375 п.н. nifL удалены и заменены последовательностью промотора Prm1 CI006; включены 500 п.н., фланкирующие ген nifL выше и ниже ds20 CM037; PBC6.37 6-403 SEQ ID NO 235 ΔnifL::Prm1 начиная от 31 п.н. после A старт-кодона ATG, 1375 п.н. nifL удалены и заменены последовательностью промотора Prm1 CI006 ds20 CM037; PBC6.38 6-403 SEQ ID NO 236 ΔnifL::Prm1 с фланкирующими 500 п.н. начиная от 31 п.н. после A старт-кодона ATG, 1375 п.н. nifL удалены и заменены последовательностью промотора Prm1 CI006; включены 500 п.н., фланкирующие ген nifL выше и ниже ds20 CM037; PBC6.39 6-403 SEQ ID NO 237 glnEΔAR-2 ген glnE с 1644 п.н. непосредственно ниже старт-кодона ATG удален, приводя к укороченному белку glnE с отсутствием аденилил-удаляющего (AR) домена ds31 CM037; PBC6.40 6-403 SEQ ID NO 238 glnEΔAR-2 с фланкирующими 500 п.н. ген glnE с 1644 п.н. непосредственно ниже старт-кодона ATG удален, приводя к укороченному белку glnE с отсутствием аденилил-удаляющего (AR) домена; включены 500 п.н., фланкирующие ген glnE выше и ниже ds31 CM038; PBC6.38 6-404 SEQ ID NO 239 glnEΔAR-1 ген glnE с 1287 п.н. непосредственно ниже старт-кодона ATG удален, приводя к укороченному белку glnE с отсутствием аденилил-удаляющего (AR) домена ds30 CM038; PBC6.38 6-404 SEQ ID NO 240 ΔnifL::Prm1 начиная от 31 п.н. после A старт-кодона ATG, 1375 п.н. nifL удалены и заменены последовательностью промотора Prm1 CI006 ds20 CM038; PBC6.38 6-404 SEQ ID NO 241 ΔnifL::Prm1 с фланкирующими 500 п.н. начиная от 31 п.н. после A старт-кодона ATG, 1375 п.н. nifL удалены и заменены последовательностью промотора Prm1 CI006; включены 500 п.н., фланкирующие ген nifL выше и ниже ds20 CM038; PBC6.38 6-404 SEQ ID NO 242 glnEΔAR-1 с фланкирующими 500 п.н. ген glnE с 1287 п.н. непосредственно ниже старт-кодона ATG удален, приводя к укороченному белку glnE с отсутствием аденилил-удаляющего (AR) домена; включены 500 п.н., фланкирующие ген glnE выше и ниже ds30 CM029; PBC6.29 6-412 SEQ ID NO 243 glnEΔAR-1 ген glnE с 1287 п.н. непосредственно ниже старт-кодона ATG удален, приводя к укороченному белку glnE с отсутствием аденилил-удаляющего (AR) домена ds30 CM029; PBC6.29 6-412 SEQ ID NO 244 glnEΔAR-1 с фланкирующими 500 п.н. ген glnE с 1287 п.н. непосредственно ниже старт-кодона ATG удален, приводя к укороченному белку glnE с отсутствием аденилил-удаляющего (AR) домена; включены 500 п.н., фланкирующие ген glnE выше и ниже ds30 CM029; PBC6.29 6-412 SEQ ID NO 245 ΔnifL::Prm5 начиная от 31 п.н. после A старт-кодона ATG, 1375 п.н. nifL удалены и заменены последовательностью промотора Prm5 CI006 ds24 CM029; PBC6.29 6-412 SEQ ID NO 246 ΔnifL::Prm5 с фланкирующими 500 п.н. начиная от 31 п.н. после A старт-кодона ATG, 1375 п.н. nifL удалены и заменены последовательностью промотора Prm5 CI006; включены 500 п.н., фланкирующие ген nifL выше и ниже ds24 CM093; PBC6.93 6-848 SEQ ID NO 247 ΔnifL::Prm1 начиная от 31 п.н. после A старт-кодона ATG, 1375 п.н. nifL удалены и заменены последовательностью промотора Prm1 CI006 ds20 CM093; PBC6.93 6-848 SEQ ID NO 248 ΔnifL::Prm1 с фланкирующими 500 п.н. начиная от 31 п.н. после A старт-кодона ATG, 1375 п.н. nifL удалены и заменены последовательностью промотора Prm1 CI006; включены 500 п.н., фланкирующие ген nifL выше и ниже ds20 CM093; PBC6.93 6-848 SEQ ID NO 249 glnEΔAR-2 ген glnE с 1644 п.н. непосредственно ниже старт-кодона ATG удален, приводя к укороченному белку glnE с отсутствием аденилил-удаляющего (AR) домена ds31 CM093; PBC6.93 6-848 SEQ ID NO 250 glnEΔAR-2 с фланкирующими 500 п.н. ген glnE с 1644 п.н. непосредственно ниже старт-кодона ATG удален, приводя к укороченному белку glnE с отсутствием аденилил-удаляющего (AR) домена; включены 500 п.н., фланкирующие ген glnE выше и ниже ds31 CM093; PBC6.93 6-848 SEQ ID NO 251 ΔamtB Первые 1088 п.н. гена amtB и 4 п.н. выше старт-кодона удалены; 199 п.н. гена в остатке отсутствует старт-кодон; трансляции белка amtB не происходит ds126 CM093; PBC6.93 6-848 SEQ ID NO 252 ΔamtB с фланкирующими 500 п.н. Первые 1088 п.н. гена amtB и 4 п.н. выше старт-кодона удалены; 199 п.н. гена в остатке отсутствует старт-кодон; трансляции белка amtB не происходит ds126 CM094; PBC6.94 6-881 SEQ ID NO 253 glnEΔAR-1 ген glnE с 1287 п.н. непосредственно ниже старт-кодона ATG удален, приводя к укороченному белку glnE с отсутствием аденилил-удаляющего (AR) домена ds30 CM094; PBC6.94 6-881 SEQ ID NO 254 glnEΔAR-1 с фланкирующими 500 п.н. ген glnE с 1287 п.н. непосредственно ниже старт-кодона ATG удален, приводя к укороченному белку glnE с отсутствием аденилил-удаляющего (AR) домена; включены 500 п.н., фланкирующие ген glnE выше и ниже ds30 CM094; PBC6.94 6-881 SEQ ID NO 255 ΔnifL::Prm1 начиная от 31 п.н. после A старт-кодона ATG, 1375 п.н. nifL удалены и заменены последовательностью промотора Prm1 CI006 ds20 CM094; PBC6.94 6-881 SEQ ID NO 256 ΔnifL::Prm1 с фланкирующими 500 п.н. начиная от 31 п.н. после A старт-кодона ATG, 1375 п.н. nifL удалены и заменены последовательностью промотора Prm1 CI006; включены 500 п.н., фланкирующие ген nifL выше и ниже ds20 CM094; PBC6.94 6-881 SEQ ID NO 257 ΔamtB Первые 1088 п.н. гена amtB и 4 п.н. выше старт-кодона удалены; 199 п.н. гена в остатке отсутствует старт-кодон; трансляции белка amtB не происходит ds126 CM094; PBC6.94 6-881 SEQ ID NO 258 ΔamtB с фланкирующими 500 п.н. Первые 1088 п.н. гена amtB и 4 п.н. выше старт-кодона удалены; 199 п.н. гена в остатке отсутствует старт-кодон; трансляции белка amtB не происходит ds126 нет 910-1246 SEQ ID NO 259 ΔnifL::PinfC начиная от 20 п.н. после A старт-кодона ATG, 1379 п.н. nifL удалены и заменены 910 последовательность промотора PinfC ds960 нет 910-1246 SEQ ID NO 260 ΔnifL::PinfC с фланкирующими 500 п.н. начиная от 20 п.н. после A старт-кодона ATG, 1379 п.н. nifL удалены и заменены 910 последовательность промотора PinfC; включены 500 п.н., фланкирующие ген nifL выше и ниже ds960 PBC6.1, 6, CI6 CI006 SEQ ID NO 261 16S-1 1 из 3 уникальных генов 16S рДНК в геноме CI006 н.п. PBC6.1, 6, CI6 CI006 SEQ ID NO 262 16S-2 2 из 3 уникальных генов 16S рДНК в геноме CI006 н.п. PBC6.1, 6, CI6 CI006 SEQ ID NO 263 nifH н.п. н.п. PBC6.1, 6, CI6 CI006 SEQ ID NO 264 nifD2 2 из 2 уникальных генов, аннотированных в геноме CI006 как nifD н.п. PBC6.1, 6, CI6 CI006 SEQ ID NO 265 nifK2 2 из 2 уникальных генов, аннотированных в геноме CI006 как nifK н.п. PBC6.1, 6, CI6 CI006 SEQ ID NO 266 nifL н.п. н.п. PBC6.1, 6, CI6 CI006 SEQ ID NO 267 nifA н.п. н.п. PBC6.1, 6, CI6 CI006 SEQ ID NO 268 glnE н.п. н.п. PBC6.1, 6, CI6 CI006 SEQ ID NO 269 16S-3 3 из 3 уникальных генов 16S рДНК в геноме CI006 н.п. PBC6.1, 6, CI6 CI006 SEQ ID NO 270 nifD1 1 из 2 уникальных генов, аннотированных в геноме CI006 как nifD н.п. PBC6.1, 6, CI6 CI006 SEQ ID NO 271 nifK1 1 из 2 уникальных генов, аннотированных в геноме CI006 как nifK н.п. PBC6.1, 6, CI6 CI006 SEQ ID NO 272 amtB н.п. н.п. PBC6.1, 6, CI6 CI006 SEQ ID NO 273 Prm1 348 п.н. включает 319 п.н. непосредственно выше старт-кодона ATG гена lpp и первые 29 п.н. гена lpp н.п. PBC6.1, 6, CI6 CI006 SEQ ID NO 274 Prm5 313 п.н. начиная от 432 п.н. выше старт-кодона ATG гена ompX и оканчиваясь 119 п.н. выше старт-кодона ATG гена ompX н.п. 19, CI19 CI019 SEQ ID NO 275 nifL н.п. н.п. 19, CI19 CI019 SEQ ID NO 276 nifA н.п. н.п. 19, CI19 CI019 SEQ ID NO 277 16S-1 1 из 7 уникальных генов 16S рДНК в геноме CI019 н.п. 19, CI19 CI019 SEQ ID NO 278 16S-2 2 из 7 уникальных генов 16S рДНК в геноме CI019 н.п. 19, CI19 CI019 SEQ ID NO 279 16S-3 3 из 7 уникальных генов 16S рДНК в геноме CI019 н.п. 19, CI19 CI019 SEQ ID NO 280 16S-4 4 из 7 уникальных генов 16S рДНК в геноме CI019 н.п. 19, CI19 CI019 SEQ ID NO 281 16S-5 5 из 7 уникальных генов 16S рДНК в геноме CI019 н.п. 19, CI19 CI019 SEQ ID NO 282 16S-6 6 из 7 уникальных генов 16S рДНК в геноме CI019 н.п. 19, CI19 CI019 SEQ ID NO 283 16S-7 7 из 7 уникальных генов 16S рДНК в геноме CI019 н.п. 19, CI19 CI019 SEQ ID NO 284 nifH1 1 из 2 уникальных генов, аннотированных в геноме CI019 как nifH н.п. 19, CI19 CI019 SEQ ID NO 285 nifH2 2 из 2 уникальных генов, аннотированных в геноме CI019 как nifH н.п. 19, CI19 CI019 SEQ ID NO 286 nifD1 1 из 2 уникальных генов, аннотированных в геноме CI019 как nifD н.п. 19, CI19 CI019 SEQ ID NO 287 nifD2 2 из 2 уникальных генов, аннотированных в геноме CI019 как nifD н.п. 19, CI19 CI019 SEQ ID NO 288 nifK1 1 из 2 уникальных генов, аннотированных в геноме CI019 как nifK н.п. 19, CI19 CI019 SEQ ID NO 289 nifK2 2 из 2 уникальных генов, аннотированных в геноме CI019 как nifK н.п. 19, CI19 CI019 SEQ ID NO 290 glnE н.п. н.п. 19, CI19 CI019 SEQ ID NO 291 Prm4 449 п.н. непосредственно выше ATG гена dscC 2 н.п. 19, CI19 CI019 SEQ ID NO 292 Prm1.2 500 п.н. непосредственно выше старт-кодона TTG гена infC н.п. 19, CI19 CI019 SEQ ID NO 293 Prm3.1 170 п.н. непосредственно выше старт-кодона ATG гена rplN н.п. 19, CI20 CI020 SEQ ID NO 294 Prm6.1 142 п.н. непосредственно выше ATG высокоэкспрессированного гипотетического белка (аннотированного как PROKKA_00662 в сборке 82 CI019) н.п. 19, CI21 CI021 SEQ ID NO 295 Prm7.1 293 п.н. непосредственно выше ATG гена lpp н.п. 19-375, 19-417, CM067 CM67 SEQ ID NO 296 glnEΔAR-2 ген glnE с 1650 п.н. непосредственно ниже старт-кодона ATG удален, приводя к укороченному белку glnE с отсутствием аденилил-удаляющего (AR) домена ds34 19-375, 19-417, CM067 CM67 SEQ ID NO 297 glnEΔAR-2 с фланкирующими 500 п.н. ген glnE с 1650 п.н. непосредственно ниже старт-кодона ATG удален, приводя к укороченному белку glnE с отсутствием аденилил-удаляющего (AR) домена; включены 500 п.н., фланкирующие ген glnE выше и ниже ds34 19-375, 19-417, CM067 CM67 SEQ ID NO 298 ΔnifL::null-v1 начиная от 221 п.н. после A старт-кодона ATG, 845 п.н. nifL удалены и заменены 31 п.н. последовательность "GGAGTCTGAACTCATCCTGCGATGGGGGCTG" нет 19-375, 19-417, CM067 CM67 SEQ ID NO 299 ΔnifL::null-v1 с фланкирующими 500 п.н. начиная от 221 п.н. после A старт-кодона ATG, 845 п.н. nifL удалены и заменены 31 п.н. последовательность "GGAGTCTGAACTCATCCTGCGATGGGGGCTG"; включены 500 п.н., фланкирующие ген nifL выше и ниже нет 19-377, CM069 CM69 SEQ ID NO 300 ΔnifL::null-v2 начиная от 221 п.н. после A старт-кодона ATG, 845 п.н. nifL удалены и заменены 5 п.н. последовательность "TTAAA" нет 19-377, CM069 CM69 SEQ ID NO 301 ΔnifL::null-v2 с фланкирующими 500 п.н. начиная от 221 п.н. после A старт-кодона ATG, 845 п.н. nifL удалены и заменены 5 п.н. последовательность "TTAAA"; включены 500 п.н., фланкирующие ген nifL выше и ниже нет 19-389, 19-418, CM081 CM81 SEQ ID NO 302 ΔnifL::Prm4 начиная от 221 п.н. после A старт-кодона ATG, 845 п.н. nifL удалены и заменены последовательностью Prm4 CI19 ds70 19-389, 19-418, CM081 CM81 SEQ ID NO 303 ΔnifL::Prm4 с фланкирующими 500 п.н. начиная от 221 п.н. после A старт-кодона ATG, 845 п.н. nifL удалены и заменены CI19 Prm4 последовательность; включены 500 п.н., фланкирующие ген nifL выше и ниже ds70

Таблица H

SEQ ID NO: Последовательность 61 atgtttaacgatctgattggcgatgatgaaacggattcgccggaagatgcgctttctgagagctggcgcgaattgtggcaggatgcgttgcaggaggaggattccacgcccgtgctggcgcatctctcagaggacgatcgccgccgcgtggtggcgctgattgccgattttcgcaaagagttggataaacgcaccattggcccgcgagggcggcaggtactcgatcacttaatgccgcatctgctcagcgatgtatgctcgcgcgacgatgcgccagtaccgctgtcacgcctgacgccgctgctcaccggaattattacccgcaccacttaccttgagctgctaagtgaatttcccggcgcactgaaacacctcatttccctgtgtgccgcgtcgccgatggttgccagtcagctggcgcgctacccgatcctgcttgatgaattgctcgacccgaatacgctctatcaaccgacggcgatgaatgcctatcgcgatgagctgcgccaatacctgctgcgcgtgccggaagatgatgaagagcaacagcttgaggcgctgcggcagtttaagcaggcgcagttgctgcgcgtggcggcggcggatattgccggtacgttgccagtaatgaaagtgagcgatcacttaacctggctggcggaagcgattattgatgcggtggtgcagcaagcctgggggcagatggtggcgcgttatggccagccaacgcatctgcacgatcgcgaagggcgcggttttgcggtggtcggttatggcaagctgggcggctgggagctgggttacagctccgatctggatctggtattcctgcacgactgcccgatggatgtgatgaccgatggcgagcgtgaaatcgatggtcgccagttctatttgcgtctcgcgcagcgcgtgatgcacctgtttagcacgcgcacgtcgtccggcatcctttatgaagttgatgcgcgtctgcgtccatctggcgctgcggggatgctggtcactactacggaatcgttcgccgattaccagcaaaacgaagcctggacgtgggaacatcaggcgctggcccgtgcgcgcgtggtgtacggcgatccgcaactgaccgccgaatttgacgccattcgccgcgatattctgatgacgcctcgcgacggcgcaacgctgcaaaccgacgtgcgagaaatgcgcgagaaaatgcgtgcccatcttggcaacaagcataaagaccgcttcgatctgaaagccgatgaaggcggtatcaccgacatcgagtttatcgcccaatatctggtgctgcgctttgcccatgacaagccgaaactgacgcgctggtcggataatgtgcgcattctcgaagggctggcgcaaaacggcatcatggaggagcaggaagcgcaggcattgacgctggcgtacaccacattgcgtgatgagctgcaccacctggcgctgcaagagttgccgggacatgtggcgctctcctgttttgtcgccgagcgtgcgcttattaaaaccagctgggacaagtggctggtggaaccgtgcgccccggcgtaa 62 ttgaagagtttgatcatggctcagattgaacgctggcggcaggcctaacacatgcaagtcgaacggtagcacagagagcttgctctcgggtgacgagtggcggacgggtgagtaatgtctgggaaactgcctgatggagggggataactactggaaacggtagctaataccgcataacgtcgcaagaccaaagagggggaccttcgggcctcttgccatcagatgtgcccagatgggattagctagtaggtggggtaacggctcacctaggcgacgatccctagctggtctgagaggatgaccagccacactggaactgagacacggtccagactcctacgggaggcagcagtggggaatattgcacaatgggcgcaagcctgatgcagccatgccgcgtgtgtgaagaaggccttcgggttgtaaagcactttcagcggggaggaagggagtaaggttaataaccttattcattgacgttacccgcagaagaagcaccggctaactccgtgccagcagccgcggtaatacggagggtgcaagcgttaatcggaattactgggcgtaaagcgcacgcaggcggtctgtcaagtcggatgtgaaatccccgggctcaacctgggaactgcatccgaaactggcaggcttgagtctcgtagagggaggtagaattccaggtgtagcggtgaaatgcgtagagatctggaggaataccggtggcgaaggcggcctcctggacgaagactgacgctcaggtgcgaaagcgtggggagcaaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacgatgtctatttggaggttgtgcccttgaggcgtggcttccggagctaacgcgttaaatagaccgcctggggagtacggccgcaaggttaaaactcaaatgaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgatgcaacgcgaagaaccttacctggtcttgacatccacagaactttccagagatggattggtgccttcgggaactgtgagacaggtgctgcatggctgtcgtcagctcgtgttgtgaaatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttatcctttgttgccagcggtccggccgggaactcaaaggagactgccagtgataaactggaggaaggtggggatgacgtcaagtcatcatggcccttacgaccagggctacacacgtgctacaatggcgcatacaaagagaagcgacctcgcgagagtaagcggacctcataaagtgcgtcgtagtccggattggagtctgcaactcgactccatgaagtcggaatcgctagtaatcgtggatcagaatgccacggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccatgggagtgggttgcaaaagaagtaggtagcttaaccttcgggagggcgcttaccactttgtgattcatgactggggtgaagtcgtaacaaggtaaccgtaggggaacctgcggttggatcacctcctt 63 ttgaagagtttgatcatggctcagattgaacgctggcggcaggcctaacacatgcaagtcgaacggtagcacagagagcttgctctcgggtgacgagtggcggacgggtgagtaatgtctgggaaactgcctgatggagggggataactactggaaacggtagctaataccgcataacgtcgcaagaccaaagagggggaccttcgggcctcttgccatcagatgtgcccagatgggattagctagtaggtggggtaacggctcacctaggcgacgatccctagctggtctgagaggatgaccagccacactggaactgagacacggtccagactcctacgggaggcagcagtggggaatattgcacaatgggcgcaagcctgatgcagccatgccgcgtgtgtgaagaaggccttcgggttgtaaagcactttcagcggggaggaaggnantanggttaataacctgtgttnattgacgttacccgcagaagaagcaccggctaactccgtgccagcagccgcggtaatacggagggtgcaagcgttaatcggaattactgggcgtaaagcgcacgcaggcggtctgtcaagtcggatgtgaaatccccgggctcaacctgggaactgcatccgaaactggcaggcttgagtctcgtagagggaggtagaattccaggtgtagcggtgaaatgcgtagagatctggaggaataccggtggcgaaggcggcctcctggacgaagactgacgctcaggtgcgaaagcgtggggagcaaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacgatgtctatttggaggttgtgcccttgaggcgtggcttccggagctaacgcgttaaatagaccgcctggggagtacggccgcaaggttaaaactcaaatgaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgatgcaacgcgaagaaccttacctggtcttgacatccacagaacttagcagagatgctttggtgccttcgggaactgtgagacaggtgctgcatggctgtcgtcagctcgtgttgtgaaatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttatcctttgttgccagcggttaggccgggaactcaaaggagactgccagtgataaactggaggaaggtggggatgacgtcaagtcatcatggcccttacgaccagggctacacacgtgctacaatggcgcatacaaagagaagcgacctcgcgagagtaagcggacctcataaagtgcgtcgtagtccggattggagtctgcaactcgactccatgaagtcggaatcgctagtaatcgtggatcagaatgccacggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccatgggagtgggttgcaaaagaagtaggtagcttaaccttcgggagggcgcttaccactttgtgattcatgactggggtgaagtcgtaacaaggtaaccgtaggggaacctgcggttggatcacctcctt 64 attgaagagtttgatcatggctcagattgaacgctggcggcaggcctaacacatgcaagtcgagcggcancgggaagtagcttgctactttgccggcgagcggcggacgggtgagtaatgtctgggaaactgcctgatggagggggataactactggaaacggtagctaataccgcatgacctcgaaagagcaaagtgggggatcttcggacctcacgccatcggatgtgcccagatgggattagctagtaggtgaggtaatggctnacctaggcgacgatccctagctggtctgagaggatgaccagccacactggaactgagacacggtccagactcctacgggaggcagcagtggggaatattgcacaatgggcgcaagcctgatgcagccatgccgcgtgtgtgaagaaggccttagggttgtaaagcactttcagcgaggaggaaggcancanacttaatacgtgtgntgattgacgttactcgcagaagaagcaccggctaactccgtgccagcagccgcggtaatacggagggtgcaagcgttaatcggaattactgggcgtaaagcgcacgcaggcggtttgttaagtcagatgtgaaatccccgagcttaacttgggaactgcatttgaaactggcaagctagagtcttgtagaggggggtagaattccaggtgtagcggtgaaatgcgtagagatctggaggaataccggtggcgaaggcggccccctggacaaagactgacgctcaggtgcgaaagcgtggggagcaaacaggattagataccctggtagtccacgctgtaaacgatgtcgacttggaggttgtgcccttgaggcgtggcttccggagctaacgcgttaagtcgaccgcctggggagtacggccgcaaggttaaaactcaaatgaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgatgcaacgcgaagaaccttacctactcttgacatccagagaatttgccagagatggcgaagtgccttcgggaactctgagacaggtgctgcatggctgtcgtcagctcgtgttgtgaaatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttatcctttgttgccagcacgtnatggtgggaactcaaaggagactgccggtgataaaccggaggaaggtggggatgacgtcaagtcatcatggcccttacgagtagggctacacacgtgctacaatggcatatacaaagagaagcgaactcgcgagagcaagcggacctcataaagtatgtcgtagtccggattggagtctgcaactcgactccatgaagtcggaatcgctagtaatcgtagatcagaatgctacggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccatgggagtgggttgcaaaagaagtaggtagcttaaccttcgggagggcgcttaccactttgtgattcatgactggggtgaagtcgtaacaaggtaaccgtaggggaacctgcggttggatcacctcctt 65 atgaccatgcgtcaatgcgccatttacggcaaaggtgggatcggcaaatcgaccaccacacagaacctggtcgccgcgctggcggagatgggtaaaaaagtcatgattgtcggctgtgacccgaaagccgattccacgcgtttgatcctgcatgcgaaagcgcagaacaccattatggagatggctgctgaagtcggctccgtggaagacctggagttagaagacgtgctgcaaatcggttacggcggcgtgcgctgcgcagagtccggcggcccggagccaggcgtgggctgtgccggtcgcggggtgatcaccgcgattaacttcctcgaagaagaaggcgcttacgtgccggatctcgattttgttttctacgacgtgctgggcgacgtggtatgcggtggtttcgccatgccgattcgtgaaaacaaagcgcaggagatctacatcgtttgctctggcgaaatgatggcgatgtacgccgccaacaacatctccaaaggcatcgtgaaatacgccaaatccggtaaagtgcgcctcggcgggctgatttgtaactcgcgccagaccgaccgtgaagatgaactgatcattgcgctggcagaaaaactcggcacgcagatgatccactttgttccccgcgacaacattgtgcagcgtgcggaaatccgccgtatgacggttatcgaatatgacccgacctgcaatcaggcgaacgaatatcgcagccttgccagcaaaatcgtcaacaacaccaaaatggtggtgcccaccccctgcaccatggatgaactggaagaactgctgatggagttcggcattatggatgtggaagacaccagcatcattggtaaaaccgccgccgaagaaaacgccgtctga 66 atgagcaatgcaacaggcgaacgcaacctggagataatcgagcaggtgctcgaggttttcccggagaagacgcgcaaagaacgcagaaaacacatgatggtgacggacccggagcaggaaagcgtcggtaagtgcatcatctctaaccgcaaatcgcagccaggcgtgatgaccgtgcgcggctgctcgtatgccggttcgaaaggggtggtatttgggccaatcaaggatatggcgcatatctcgcatggcccaatcggctgcggccaatactcccgcgccgggcggcggaactactacaccggcgtcagcggcgtggacagcttcggcacgctcaacttcacctccgattttcaggagcgcgacatcgtgtttggcggcgataaaaagctcgccaaactgattgaagagctggaagagctgttcccgctgaccaaaggcatttcgattcagtcggaatgcccggtcggcctgattggcgatgacattgaggccgtcgcgaacgccagccgcaaagccatcaacaaaccggttattccggtgcgttgcgaaggctttcgcggcgtgtcgcaatccctcggtcaccatattgccaacgatgtgatccgcgactgggtgctggataaccgcgaaggcaaaccgttcgaatccaccccttacgatgtggcgatcatcggcgattacaacatcggcggcgatgcctgggcttcgcgcattttgctcgaagagatgggcttgcgggtggtggcacagtggtctggcgacggtacgctggtggagatggaaaacacgccgttcgtcaaactgaacctggtgcattgttaccgctcaatgaactacatctcgcgccatatggaggagaagcacggtattccgtggatggaatacaacttctttggtccgacgaaaatcgcggaatcgctgcgcaaaatcgccgaccagtttgacgacaccattcgcgccaacgccgaagcggtgatcgccagataccaggcgcaaaacgacgccattatcgccaaatatcgcccgcgtctggaggggcgcaaagtgctgctttatatgggcgggctgcgtccgcgccatgtgattggcgcctatgaagacctgggaatggagatcatcgctgccggttatgagttcggtcataacgatgattacgaccgcaccttgccggatctgaaagagggcacgctgctgtttgatgatgccagcagttatgagctggaggcgttcgtcaacgcgctgaaaccggatctcatcggttccggcatcaaagagaagtacatctttcagaaaatgggcgtgccgtttcgccagatgcactcctgggattactccggcccgtaccacggctatgacggcttcgccatcttcgcccgcgatatggatatgacgctcaacaaccccgcgtggggccagttgaccgcgccgtggctgaaatccgcctga 67 atgagccagactgctgagaaaatacagaattgccatcccctgtttgaacaggatgcttaccagacgctgtttgccggtaaacgggcactcgaagaggcgcactcgccggagcgggtgcaggaagtgtttcaatggaccactaccccggaatatgaagcgctgaactttaaacgcgaagcgctgactatcgacccggcaaaagcctgccagccgctgggcgcggtgctctgttcgctggggtttgccaataccctaccgtatgtgcacggttcacagggttgcgtggcctatttccgcacgtactttaaccgccactttaaagaaccggtggcctgcgtgtcggattcaatgacggaagacgcggcggtgttcggcgggaataacaacctcaacaccggcttacaaaacgccagcgcgctgtataaaccggagattatcgccgtctctaccacctgtatggcggaagtgatcggtgatgatttgcaggcctttatcgccaacgccaaaaaagatggttttctcgatgccgccatccccgtgccctacgcgcacacccccagttttatcggcagccatatcaccggctgggataacatgtttgaaggttttgcccggacctttacggcagaccatgaagctcagcccggcaaactttcacgcatcaacctggtgaccgggtttgaaacctatctcggcaatttccgcgtgctgaaacgcatgatggaacaaatggaggtgccggcgagtgtgctctccgatccgtcggaagtgctggatactcccgccaacgggcattaccagatgtacgcgggcgggacgacgcagcaagagatgcgcgaggcgccggatgctatcgacaccctgttgctgcagccctggcaactggtgaaaagcaaaaaagtggtgcaggagatgtggaatcagcccgccaccgaggtttctgttcccgttgggctggcaggaacagacgaactgttgatggcgattagccagttaaccggcaaggccattcccgattcactggcgctggagcgcgggcggctggtcgatatgatgctcgattcccacacctggttgcacggtaaaaaattcggcctgtttggcgatccggattttgtcatgggattgacccgtttcctgctggagctgggctgcgaaccgaccgttatcctctgccacaacggtaacaaacgctggcagaaagcaatgaagaaaatgcttgacgcctcgccgtacggccaggagagcgaagtgtttatcaactgcgatttgtggcatttccgctcgctgatgtttacccgccagccggattttatgattggcaactcgtacggcaagttcattcagcgcgacaccttagccaaaggcgagcagtttgaagttccgctgatccgcctcggttttcccctgttcgaccgccaccatctgcaccgccagaccacctggggctacgagggcgccatgagcattctcactacccttgtgaatgcggtactggagaaagtggacaaagagaccatcaagctcggcaaaaccgactacagcttcgatcttatccgttaa 68 atgaccctgaatatgatgatggatgccggcgcgcccgaggcaatcgccggtgcgctttcgcgacaccatcctgggctgttttttaccatcgttgaagaagcgcccgtcgccatttcgctgactgatgccgacgcacgcattgtctatgccaacccggctttctgccgccagaccggctatgaactagaagcgttgttgcagcaaaatccccgcctgcttgcaagtcgccaaaccccacgggaaatctatcaggatatgtggcacaccttgttacaacgccgaccgtggcgcgggcaattgattaaccgccaccgcgacggcagcctgtatctggtcgagatcgatatcaccccggtgattaacccgtttggcgaactggaacactacctggcaatgcagcgcgatatcagcgccagttatgcgctggagcagcggttgcgcaatcacatgacgctgaccgaagcggtgctgaataacattccggcggcggtggttgtagtggatgaacgcgatcatgtggttatggataaccttgcctacaaaacgttctgtgccgactgcggcggaaaagagctcctgagcgaactcaatttttcagcccgaaaagcggagctggcaaacggccaggtcttaccggtggtgctgcgcggtgaggtgcgctggttgtcggtgacctgctgggcgctgccgggcgtcagcgaagaagccagtcgctactttattgataacaggctgacgcgcacgctggtggtgatcaccgacgacacccaacaacgccagcagcaggaacagggccgacttgaccgccttaaacagcagatgaccaacggcaaactactggcagcgatccgcgaagcgcttgacgccgcgctgatccagcttaactgccccatcaatatgctggcggcggcgcgacgtttaaacggcagtgataacaacaatgtggcgctcgacgccgcgtggcgcgaaggtgaagaggcgatggcgcggctgaaacgttgccgcccgtcgctggaactggaaagtgcggccgtctggccgctgcaacccttttttgacgatctgcgcgcgctttatcacacccgctacgagcaggggaaaaatttgcaggtcacgctggattcccatcatctggtgggatttggtcagcgtacgcaactgttagcctgcctgagtctgtggctcgatcgcacgctggatattgccgccgggctgggtgatttcaccgcgcaaacgcagatttacgcccgcgaagaagagggctggctctctttgtatatcactgacaatgtgccgctgatcccgctgcgccacacccactcgccggatgcgcttaacgctccgggaaaaggcatggagctgcgcctgatccagacgctggtggcacaccaccacggcgcaatagaactcacttcacaccccgaagggggaagttgcctgaccctacgattcccgctatttcattcactgaccggaggttcaaaatga 69 atgacccagcgaaccgagtcgggtaataccgtctggcgcttcgatttgtcccagcagttcactgcgatgcagcgcataagcgtggtactcagccgggcgaccgaggtcgatcagacgctccagcaagtgctgtgcgtattgcacaatgacgcctttttgcagcacggcatgatctgtctgtacgacagccagcaggcgattttgaatattgaagcgttgcaggaagccgatcagcagttaatccccggcagctcgcaaatccgctatcgtccgggcgaagggctggtcgggacggtgctttcgcagggccaatcattagtgctggcgcgcgttgctgacgatcagcgctttcttgaccggctcgggttgtatgattacaacctgccgtttatcgccgtgccgctgatagggccagatgcgcagactttcggtgtgctgacggcacaacccatggcgcgttacgaagagcgattacccgcctgcacccgctttctggaaacggtcgctaacctggtcgcgcaaaccgtgcgtttgatggcaccaccggcagtgcgcccttccccgcgcgccgccataacacaggccgccagcccgaaatcctgcacggcctcacgcgcatttggttttgaaaatatggtcggtaacagtccggcgatgcgccagaccatggagattatccgtcaggtttcgcgctgggacaccaccgttctggtacgcggcgagagtggcaccggcaaggagctgattgccaacgccatccaccaccattcgccgcgtgccggtgcgccatttgtgaaattcaactgtgcggcgctgccggacacactgctggaaagcgaattgttcggtcacgagaaaggggcatttaccggcgcggtacgccagcgtaaaggccgttttgagctggccgatggcggcacgctgtttcttgacgagatcggcgagagtagcgcctcgtttcaggctaagctgctgcgcattttgcaggaaggcgaaatggaacgcgtcggcggcgacgagacattgcaagtgaatgtgcgcattattgccgcgacgaaccgcaatcttgaagatgaagtccggctggggcactttcgcgaagatctctattatcgcctgaatgtgatgcccatcgccctgccgccactacgcgaacgccaggaggacattgccgagctggcgcactttctggtgcgtaaaatcgcccataaccagagccgtacgctgcgcattagcgagggcgctatccgcctgctgatgagctacaactggcccggtaatgtgcgcgaactggaaaactgccttgagcgctcagcggtgatgtcggagaacggtctgatcgatcgggatgtgattttgtttaatcatcgcgaccagccagccaaaccgccagttatcagcgtctcgcatgatgataactggctcgataacaaccttgacgagcgccagcggctgattgcggcgctggaaaaagcgggatgggtacaagccaaagccgcgcgcttgctggggatgacgccgcgccaggtcgcctatcgtattcagacgatggatataaccctgccaaggctataa 70 atggcaatgcgtcaatgtgcaatctacgggaaagggggtattggtaaatccaccactacccaaaaccttgtagcggctctggccgaaatgaataagaaggtcatgatcgtcggctgtgaccctaaggctgattcaacccgcctcattctgcatgcgaaagcacagaacaccatcatggaaatggccgctgaagtgggctccgtggaagatctggagctggaagatgtgatgcaaatcggctatggcggcgtgcgctgtgcggaatcaggcggccctgagcctggtgtgggttgtgccggacgcggggtgatcaccgccatcaacttcctcgaagaagaaggcgcgtatgtgccggatctggatttcgtgttttacgacgtattgggcgatgtggtctgtggcggtttcgcgatgccaattcgcgaaaacaaagcgcaggaaatctacatcgtatgctccggtgaaatgatggcgatgtatgccgccaacaacatttccaaaggcatcgtgaaatacgcgaaatcgggcaaagttcgcctggccgggctgatctgtaactcccgccagacggatcgcgaagatgaactgatcatcgcgctggctgaaaaacttggcacgcaaatgatccacttcgtgccgcgtgacaacattgtgcaacgcgctgaaatccgccgcatgacggtcatcgaatacgacccgacttgtgcgcaggcagatcagtatcgtgcactggcgaacaaaatcgtcaacaacaccaaaatggtggtgccgacaccggtcaccatggatgagctggaagccctgttaatggaatttggcattatggaagaagaagacctgaccatcgtcggtcgtaccgccgccgaagaggcgtga 71 atgaccagtgaaacacgcgaacgtaacgaggcattgatccaggaagtgctggagatcttccccgagaaggcgcttaaagatcgtaagaaacacatgatgaccaccgacccggcgatggaatctgtcggcaagtgtattgtctcaaaccgcaaatcacagccgggcgtgatgaccgtgcgaggctgcgcttacgccggttccaaaggcgtggtctttggcccgatcaaagacatggcgcatatctcccacggcccggttggttgcggccagtattctcgtgccggacgccgtaactattacaccggctggagcggcgtgaacagctttggcaccctcaacttcaccagtgattttcaggaacgggacatcgtatttggcggcgataaaaagctcgacaaactgatcgacgaactggagatgttgttcccgctgaccaaaggcatttcggtacagtcggaatgtccggtcggtctgatcggcgatgacatttctgccgtcgccaaagccagcagcgccaaaatcggtaagccggtcgtgccggtacgctgcgaggggttccgcggtgtgtcgcaatcgctcggccatcacattgctaacgatgtcatccgcgactgggtgctggataaccgcgaaggcaatgaatttgaaaccacgccttacgacgtggcgattatcggcgactacaacatcggcggtgacgcctgggcctcacgtattctgctcgaagaaatggggctgcgtgtggtggcgcagtggtccggcgacggcacgctggtggagatggaaaacaccccgaaagtcgcactcaatctggtgcactgctaccgctcgatgaactacatctcccgtcatatggaagaaaaacacggcattccgtggatggaatacaacttctttggcccgaccaaaattgcggaatctctgcgcgaaatcgcggcgcgttttgacgataccatccggaaaaacgccgaagcggtgattgaaaaatatcaggcgcaaacgcaggcggtgatcgacaaataccgtccgcgtctggaaggcaaaaaggtgctgttgtatctcggcggtttacgtccgcgccacatcatcggggcgtatgaagatctgggaatggaaatcatcggtaccggctatgaattcggtcataacgatgattacgaccgcaccttaccgatgctcaaagaaggcacgttgctgttcgatgacctgagcagttatgagctggaagcgttcgttaaagcgctgaaaccggatcttgtcgggtcaggcatcaaagaaaaatacattttccagaaaatgggcgtgccgttccgccagatgcactcctgggattattccggcccttatcacggctacgacggtttcggcatttttgcccgtgacatggacatgacgctgaacaatccgggctggagtcagctgaccgccccctggttgaaatcggcctga 72 atgagtcaagatcttggcaccccaaaatcctgtttcccgctgttcgagcaggatgaataccagagtatgtttacccacaaacgcgcgctggaagaagcacacggcgaggcgaaagtgcgggaagtgtttgaatggaccaccacgcaggaatatcaggatctgaacttctcgcgtgaagcgctgaccgtcgacccggcgaaagcctgccagccgttaggcgcggtactttgcgcgctgggttttgccaacacgttgccgtatgtccacggttcacaaggctgtgtggcgtatttccgtacctattttaatcgtcatttcaaagagccggtggcctgtgtttccgactcaatgaccgaagatgccgccgtttttggcggaaataacaacatgaatgtcggtctggaaaacgccagcgcgctgtacaagccggaaattattgctgtctccaccacctgtatggcggaagtgatcggtgatgacctgcaggcttttatcgccaacgccaaaaaagacggatttgtggatgccggtatgccaatcccgtatgcccatacaccgagttttctgggcagtcatgtcaccggctgggacaacatgtttgaaggcttcgcccgtacctttaccaccgacgccacgcgggaatatcagccgggcaaacttgccaaactgaacgtggtgaccggttttgaaacttatctcggcaactaccgggttattcaccgcatgatgagccagatgggggtcgaatgcagcgtcttgtccgatccgtctgaagtgctcgacaccccggctgacggccaataccgcatgtatgccggcggcaccacgcaaaccgaaatgcgtgatgcaccggatgccatcgacaccttgctgctgcaaccgtggcaattgcagaaaaccaaaaaagtggtgcagggcgactggaatcagccgggcaccgaagtcagtgtaccgattggcctggcggcgaccgatgccttgctgatgacggtaagcgaactgaccggcaaaccgatagctgacacgctggcgactgaacgtggccgtctggtggacatgatgctcgattcccacacctggctgcatggcaagcgtttcggtctctacggtgacccggattttgtgatgggcatgaccgcattcctgctggaactgggctgtgaaccgaccaccattctcagccataacggcaacaaacgctggcagaaagccatgaagaaaatgctggctgattcgccttacgggcaggacagcgaagtgtatgtgaactgcgatctgtggcatttccgctcgctgatgtttacccgtaaaccggactttatgatcggcaactcttacggaaaattcattcagcgtgacacgctggccaaaggcgaacagttcgaagtgccgctgatccgcatcggttttccgatttttgaccggcaccatttgcaccgtcagaccacctggggatacgaaggggcgatgagcatactgacgcaactggtgaatgcggtacttgaacaactggatcgcgaaaccatgaagctcggcaaaaccgactacaacttcgacctgatccgctaa 73 atgagcatcacggcgttatcagcatcatttcctgaggggaatatcgccagccgcttgtcgctgcaacatccttcactgttttataccgtggttgaacaatcttcggtggcgatttcgctgaccgatccgcaggcgcgcatttgttatgccaatccggcattctgccgccagacgggttttgcacttgagacacttttgggcgagaaccaccgtctgctggccagccagcagacgccgaaacatatctatgacgaaatgtggcgcactttgttgcagggcaaatcctggaacggccaactgatcaaccggcgtaataaccgttcgctttatctggcggatgtcactatcacgcctgttttaggcgcggacgggcaggtggagcattacctcggcatgcacaaagatatcagcgagaaatacgcgctggaacagcggttgcgcaaccacatcaccttgttcacggaggtgctgaacaatattcccgccgccgtggtggtggtggatgagcaggacaatgtggtgatggacaatctggcctacaaaaccctttgcgcggactgcggcggcaaagagctgctggctgaaatgggctatccgcaactcaaagagatgctcaacagtggcgaaccggtgccggtttccatgcgcggcaacgtacgctggttttctttcggtcaatggttattgcagggcgttaatgaagaggccagccgcttttttaccggcattaccgcgccgggaaaactgattgttctgaccgactgcaccgatcagcatcaccggcagcagcagggttatcttgaccggcttaagcaaaaactcaccaacggcaaattattggcggccatccgtgagtcgctcgatgccgcgcttatccagctcaacgggccaatcaatatgctggcggctgcgcgtcgtcttaacggcgaagaaggcaacaacatggcgctggaattcgcctggcgcgaaggcgagcaggcggtgagtcgcttacaggcctgccgtccgtcgctggattttgagccgcaggcagaatggccggtcagtgaattctttgacgatctgagcgcgctgtacgacagccattttctcagtgacggtgaattgcgttacgtggtcatgccatctgatctgcacgctgtcgggcaacgaacgcaaatccttaccgcgctgagcttatggattgatcacacgctgtcacaggcgcaggccatgccgtctctgaagctctcggtgaacattgttgcgaggcaggatgcgagctggttgtgttttgacattaccgataatgtgccgcgtgaacgggtgcgttatgcccgcccggaagcggcgttttcccgtccggggaatggcatggagctgcgccttatccagacgctgatcgcccatcatcgcggttctttagatctctcggtccgccctgatggcggcaccttgctgacgttacgcctgccggtacagcaggttatcaccggaggcttaaaatga 74 atgacccagttacctaccgcgggcccggttatccggcgctttgatatgtctgcccagtttacggcgctttatcgcatcagcgtggcgctgagtcaggaaagcaacaccgggcgcgcactggcggcgatcctcgaagtgcttcacgatcatgcatttatgcaatacggcatggtgtgtctgtttgataaagaacgcaatgcactctttgtggaatccctgcatggcatcgacggcgaaaggaaaaaagagacccgccatgtccgttaccgcatgggggaaggcgtgatcggcgcggtgatgagccagcgtcaggcgctggtgttaccgcgcatttcagacgatcagcgttttctcgaccgcctgaatatttacgattacagcctgccgttgattggcgtgccgatccccggtgcggataatcagccatcgggcgtgctggtggcacagccgatggcgttgcacgaagaccggctgactgccagtacgcggtttttagaaatggtcgccaatctcatcagccagccactgcgttctgccacgcccccggaatcattgcctgctcaaacgccggtccggtgcagtgttccgcgccagtttggtttcgagcagatggtcgggaaaagtcaggcgatgcgccagacgatggacattttacggcaggtttccaaatgggataccacggttctggtgcgtggtgaaagcggcaccggcaaggaacttatcgccaatgccattcattacaactcaccccgtgcggccgcgccatttgtgaaattcaactgcgccgcgctgccggataacctgctggaaagcgaactgttcggtcatgaaaaaggggccttcaccggcgctatccgtacccgtaaaggccgctttgaactggcggacgggggcacgttattcctcgatgaaatcggcgaatcgagcgcgtcgtttcaggccaaattgctgcgcattttgcaggaaggtgaaatggaacgggtcggcggcgataccacgctgaaagttgatgtgcgcattattgctgccaccaaccgtaatcttgaagaggaagtgcgtgccgggaattttcgcgaagacctgtattatcgcctgaacgtgatgccggtttcgctgcctgcactgcgtgaaaggctggatgatatcgccgatctggcgccgtttctggtcaaaaagattgcgctgcgtcaggggcgggaactgcgcatcagcgacggtgcggtgcgtctgctgatgacctacagctggccaggcaacgtgcgtgaactggaaaactgtctcgaacgggcgtcggtaatgaccgatgaagggctgatcgaccgcgacgtgatcctgttcaatcaccatgaatccccggcgctgtccgtcaaacccggcctgccgctcgcgacagatgaaagctggctggatcaggaactcgacgaacgccagcgggtgattgccgcactggagaaaaccggctgggtgcaggccaaagcggcccgactgctgggcatgacaccgcgccagattgcctaccgtatccagattatggacatcaacatgcaccgtatctga 75 aaaactaccgccgcaattaatgaacccaacgctactgttgccgggccatgctcttccccggcgcgctgcccggaaaggatatagattgcccagcacgcgccagcaccaagcgcgaacgccgcgccagtgagatcaacatgtgaaacattttcgcccagcggcagcagatacaagaggccaagtaccgccaggatcacccagatgaaatccaccgggcggcgtgaggcaaaaagcgccaccgccagcgggccggtaaattccagcgccaccgcaacgccgagcggtatcgtctggatcgataaatagaacatatagttcatggcgccgagcgacaggccataaaacagcagtggcaggcgttgttcacgggtaaaatgtaaacgccagggcttgaacactacgaccaaaataagggtgccaagtgcgagacgcagcgcggtgacgccgggtgcgccaacaatcggaaacagtgatttcgccagcgacgcgcctccctgaatggacatcatcgcgacaaacaatattaataccggcaaccacaccggcaatttacgagactgcgcaggcatcctttctcccgtcaatttctgtcaaataaagtaaaagaggcagtctacttgaattacccccggctggttgagcgtttgttgaaaaaaagtaactgaaaaatccgtagaatagcgccactctgatggttaattaacctattcaattaagaattatctggatgaatgtgccattaaatgcgcagcataatggtgcgttgtgcgggaaaactgcttttttttgaaagggttggtcagtagcggaaactttctgttacatcaaatggcgctttagaccccaattcccgcaaagagtttcttaactaattttgatatatttaaacgcgtaggacgtaggatttacttgaagcacatttgaggtggattatgaaaaaaattgcatgtctttcagcactggccgcacttctggcggtttctgcaggttccgcagtagcagcaacttcaaccgtaactggcggctacgctcagagcgacgctcagggtattgctaacaaaactaacggtttcaacctgaaatatcgctacgagcaggacaacaacccgctgggtgttatcggttcctttacttacactgaaaaagatcgcaccgaaagcagcgtttataacaaagcgcagtactacggcatcaccgcaggcccggcttaccgcatcaacgactgggcgagcatctacggtgttgtgggtgtaggttacggtaaattccagcagactgtagacaccgctaaagtgtctgacaccagcgactacg 76 aacacacgctcctgttgaaaaagagatcccgccgggaaatgcggtgaacgtgtctgatattgcgaagagtgtgccagttttggtcgcgggcaaaacctgcaccagtttggttattaatgcaccagtctggcgctttttttcgccgagtttctcctcgctaatgcccgccaggcgcggctttggcgctgatagcgcgctgaataccgatctggatcaaggttttgtcgggttatcagccaaaaggtgcactctttgcatggttatacgtgcctgacatgttgtccgggcgacaaacggcctggtggcacaaattgtcagaactacgacacgactaactgaccgcaggagtgtgcgatgaccctgaatatgatgatggatgccggcgcgcccgaggcaatcgccggtgcgctttcgcgacaccatcctgggctgttttttaccatcgttgaagaagcgcccgtcgccatttcgctgactgatgccgacgcacgcattgtctatgccaacccggctttctgccgccagaccggctatgaactagaagcgttgttgcagcaaaatccccgcctgcttgcaagtcgccaaaccccacgggaaatctatcaggatatgtggcacaccttgttacaacgccgaccgtggcgcgggcaattgattaaccgccaccgcgacggcagcctgtatctggtcgagatcgatatcaccccggtgattaacccgtttggcgaactggaacactacctggcaatgcagcgcgatatcagcgccagttatgcgctggagcagcggttgcgcaatcacatgacgctgaccgaagcggtgctgaataacattccggcggcggtggttgtagtggatgaacgcgatcatgtggttatggataaccttgcctacaaaacgttctgtgccgactgcggcggaaaagagctcctgagcgaactcaatttttcagcccgaaaagcggagctggcaaacggccaggtcttaccggtggtgctgcgcggtgaggtgcgctggttgtcggtgacctgctgggcgctgccgggcgtcagcgaagaagccagtcgctactttattgataacaggctgacgcgcacgctggtggtgatcaccgacgacacccaacaacgccagcagcaggaacagggccgacttgaccgccttaaacagcagatgaccaacggcaaactactggcagcgatccgcgaagcgcttgacgccgcgctgatccagcttaactgccccatcaatatgctggcggcggcgcgacgtttaaacggcagtgataacaacaatgtggcgctcgacgccgcgtggcgcgaaggtgaagaggcgatggcgcggctgaaacgttgccgcccgtcgctggaactggaaagtgcggccgtctggccgctgcaacccttttttgacgatctgcgcgcgctttatcacacccgctacgagcaggggaaaaatttgcaggtcacgctggattcccatcatctggtgggatttggtcagcgtacgcaactgttagcctgcctgagtctgtggctcgatcgcacgctggatattgccgccgggctgggtgatttcaccgcgcaaacgcagatttacgcccgcgaagaagagggctggctctctttgtatatcactgacaatgtgccgctgatcccgctgcgccacacccactcgccggatgcgcttaacgctccgggaaaaggcatggagctgcgcctgatccagacgctggtggcacaccaccacggcgcaatagaactcacttcacaccccgaagggggaagttgcctgaccctacgattcccgctatttcattcactgaccggaggttcaaaatgacccagcgaaccgagtcgggtaataccgtctggcgcttcgatttgtcccagcagttcactgcgatgcagcgcataagcgtggtactcagccgggcgaccgaggtcgatcagacgctccagcaagtgctgtgcgtattgcacaatgacgcctttttgcagcacggcatgatctgtctgtacgacagccagcaggcgattttgaatattgaagcgttgcaggaagccgatcagcagttaatccccggcagctcgcaaatccgctatcgtccgggcgaagggctggtcgggacggtgctttcgcagggccaatcattagtgctggcgcgcgttgctgacgatcagcgctttcttgaccggctcgggttgtatgattacaacctgccgtttatcgccgtgccgctgatagggccagatgcgcagactttcggtgtgctgacggcacaacccatggcgcgttacgaagagcgattacccgcctgcacccgctttctggaaacggtcgctaacctggtcgcgcaaaccgtgcgtttgatggcaccaccggcagtgcgcccttccccgcgcgccgccataacacaggccgccagcccgaaatcctgcacggcctcacgcgcatttggttttgaaaatatggtcggtaacagtccggcgatgcgccagaccatggagattatccgtcaggtttcgcgctgggacaccaccgttctggtacgcggcgagagtggcaccggcaaggagctgattgccaacgccatccaccaccattcgccgcgtgccggtgcgccatttgtgaaattcaactgtgcggcgctgccggacacactgctggaaagcgaattgttcggtcacgagaaaggggcatttaccggcgcggtacgccagcgtaaaggccgttttgagctggccgatggcggcacgctgtttcttgacgagatcggcgagagtagcgcctcgtttcaggctaagctgctgcgcattttgcaggaaggcgaaatggaacgcgtcggcggcgacgagacattgcaagtgaatgtgcgcattattgccgcgacgaaccgcaatcttgaagatgaagtccggctggggcactttcgcgaagatctctattatcgcctgaatgtgatgcccatcgccctgccgccactacgcgaacgccaggaggacattgccgagctggcgcactttctggtgcgtaaaatcgcccataaccagagccgtacgctgcgcattagcgagggcgctatccgcctgctgatgagctacaactggcccggtaatgtgcgcgaactggaaaactgccttgagcgctcagcggtgatgtcggagaacggtctgatcgatcgggatgtgattttgtttaatcatcgcgaccagccagccaaaccgccagttatcagcgtctcgcatgatgataactggctcgataacaaccttgacgagcgccagcggctgattgcggcgctggaaaaagcgggatgggtacaagccaaagccgcgcgcttgctggggatgacgccgcgccaggtcgcctatcgtattcagacgatggatataaccctgccaaggctataa 77 MTLNMMMDAGAPEAIAGALSRHHPGLFFTIVEEAPVAISLTDADARIVYANPAFCRQTGYELEALLQQNPRLLASRQTPREIYQDMWHTLLQRRPWRGQLINRHRDGSLYLVEIDITPVINPFGELEHYLAMQRDISASYALEQRLRNHMTLTEAVLNNIPAAVVVVDERDHVVMDNLAYKTFCADCGGKELLSELNFSARKAELANGQVLPVVLRGEVRWLSVTCWALPGVSEEASRYFIDNRLTRTLVVITDDTQQRQQQEQGRLDRLKQQMTNGKLLAAIREALDAALIQLNCPINMLAAARRLNGSDNNNVALDAAWREGEEAMARLKRCRPSLELESAAVWPLQPFFDDLRALYHTRYEQGKNLQVTLDSHHLVGFGQRTQLLACLSLWLDRTLDIAAGLGDFTAQTQIYAREEEGWLSLYITDNVPLIPLRHTHSPDALNAPGKGMELRLIQTLVAHHHGAIELTSHPEGGSCLTLRFPLFHSLTGGSK 78 MTQRTESGNTVWRFDLSQQFTAMQRISVVLSRATEVDQTLQQVLCVLHNDAFLQHGMICLYDSQQAILNIEALQEADQQLIPGSSQIRYRPGEGLVGTVLSQGQSLVLARVADDQRFLDRLGLYDYNLPFIAVPLIGPDAQTFGVLTAQPMARYEERLPACTRFLETVANLVAQTVRLMAPPAVRPSPRAAITQAASPKSCTASRAFGFENMVGNSPAMRQTMEIIRQVSRWDTTVLVRGESGTGKELIANAIHHHSPRAGAPFVKFNCAALPDTLLESELFGHEKGAFTGAVRQRKGRFELADGGTLFLDEIGESSASFQAKLLRILQEGEMERVGGDETLQVNVRIIAATNRNLEDEVRLGHFREDLYYRLNVMPIALPPLRERQEDIAELAHFLVRKIAHNQSRTLRISEGAIRLLMSYNWPGNVRELENCLERSAVMSENGLIDRDVILFNHRDQPAKPPVISVSHDDNWLDNNLDERQRLIAALEKAGWVQAKAARLLGMTPRQVAYRIQTMDITLPRL 79 atgccgcaccacgcaggattgtcgcagcactggcaaacggtattttctcgtctgccggaatcgctcaccgcgcagccattgagcgcgcaggcgcagtcagtgctcacttttagtgattttgttcaggacagcatcatcgcgcatcctgagtggctggcagagcttgaaagcgcgccgccgcctgcgaacgaatggcaacactatgcgcaatggctgcaagcggcgctggatggcgtcaccgatgaagcctcgctgatgcgcgcgctgcggctgtttcgccgtcgcatcatggtgcgcatcgcctggagccaggcgttacagttggtggcggaagaagatatcctgcaacagcttagcgtgctggcggaaaccctgatcgtcgccgcgcgcgactggctttatgaggcctgctgccgtgagtggggaacgccgagcaatccacaaggcgtggcgcagccgatgctggtactcggcatgggcaaactgggtggcggcgaactcaatttctcatccgatatcgatttgattttcgcctggccggaaaatggcgcaacgcgcggtggacgccgtgagctggataacgcgcaatttttcactcgccttggtcaacggctgattaaagtcctcgaccagccaacgcaggatggctttgtctaccgcgtcgatatgcgcttgcgcccgtttggcgacagcggcccgctggtgctgagctttgccgcgctggaagattactaccaggagcaggggcgcgattgggaacgctacgcgatggtgaaagcgcgcattatgggcgataacgacggcgaccatgcgcgggagttgcgcgcaatgctgcgcccgtttgttttccgccgttatatcgacttcagcgtgattcagtccctgcgtaacatgaaaggcatgattgcccgcgaagtgcgtcgccgtggcctgaaggacaacattaagctcggcgcgggcgggatccgcgaaatagaatttatcgtccaggttttccagctgattcgcggcggtcgcgagcctgcactgcaatcgcgttcactgttgccgacgcttgctgccatagatcaactgcatctgctgccggatggcgacgcaacccggctgcgcgaggcgtatttgtggctgcgacggctggagaacctgctgcaaagcatcaatgacgaacagacacagacgctgccgggcgatgaactgaatcgcgcgcgcctcgcctggggaatgggcaaagatagctgggaagcgctctgcgaaacgctggaagcgcatatgtcggcggtgcgtcagatatttaacgatctgattggcgatgatgaaacggattcgccggaagatgcgctttctgagagctggcgcgaattgtggcaggatgcgttgcaggaggaggattccacgcccgtgctggcgcatctctcagaggacgatcgccgccgcgtggtggcgctgattgccgattttcgcaaagagttggataaacgcaccattggcccgcgagggcggcaggtactcgatcacttaatgccgcatctgctcagcgatgtatgctcgcgcgacgatgcgccagtaccgctgtcacgcctgacgccgctgctcaccggaattattacccgcaccacttaccttgagctgctaagtgaatttcccggcgcactgaaacacctcatttccctgtgtgccgcgtcgccgatggttgccagtcagctggcgcgctacccgatcctgcttgatgaattgctcgacccgaatacgctctatcaaccgacggcgatgaatgcctatcgcgatgagctgcgccaatacctgctgcgcgtgccggaagatgatgaagagcaacagcttgaggcgctgcggcagtttaagcaggcgcagttgctgcgcgtggcggcggcggatattgccggtacgttgccagtaatgaaagtgagcgatcacttaacctggctggcggaagcgattattgatgcggtggtgcagcaagcctgggggcagatggtggcgcgttatggccagccaacgcatctgcacgatcgcgaagggcgcggttttgcggtggtcggttatggcaagctgggcggctgggagctgggttacagctccgatctggatctggtattcctgcacgactgcccgatggatgtgatgaccgatggcgagcgtgaaatcgatggtcgccagttctatttgcgtctcgcgcagcgcgtgatgcacctgtttagcacgcgcacgtcgtccggcatcctttatgaagttgatgcgcgtctgcgtccatctggcgctgcggggatgctggtcactactacggaatcgttcgccgattaccagcaaaacgaagcctggacgtgggaacatcaggcgctggcccgtgcgcgcgtggtgtacggcgatccgcaactgaccgccgaatttgacgccattcgccgcgatattctgatgacgcctcgcgacggcgcaacgctgcaaaccgacgtgcgagaaatgcgcgagaaaatgcgtgcccatcttggcaacaagcataaagaccgcttcgatctgaaagccgatgaaggcggtatcaccgacatcgagtttatcgcccaatatctggtgctgcgctttgcccatgacaagccgaaactgacgcgctggtcggataatgtgcgcattctcgaagggctggcgcaaaacggcatcatggaggagcaggaagcgcaggcattgacgctggcgtacaccacattgcgtgatgagctgcaccacctggcgctgcaagagttgccgggacatgtggcgctctcctgttttgtcgccgagcgtgcgcttattaaaaccagctgggacaagtggctggtggaaccgtgcgccccggcgtaa 80 atgtttaacgatctgattggcgatgatgaaacggattcgccggaagatgcgctttctgagagctggcgcgaattgtggcaggatgcgttgcaggaggaggattccacgcccgtgctggcgcatctctcagaggacgatcgccgccgcgtggtggcgctgattgccgattttcgcaaagagttggataaacgcaccattggcccgcgagggcggcaggtactcgatcacttaatgccgcatctgctcagcgatgtatgctcgcgcgacgatgcgccagtaccgctgtcacgcctgacgccgctgctcaccggaattattacccgcaccacttaccttgagctgctaagtgaatttcccggcgcactgaaacacctcatttccctgtgtgccgcgtcgccgatggttgccagtcagctggcgcgctacccgatcctgcttgatgaattgctcgacccgaatacgctctatcaaccgacggcgatgaatgcctatcgcgatgagctgcgccaatacctgctgcgcgtgccggaagatgatgaagagcaacagcttgaggcgctgcggcagtttaagcaggcgcagttgctgcgcgtggcggcggcggatattgccggtacgttgccagtaatgaaagtgagcgatcacttaacctggctggcggaagcgattattgatgcggtggtgcagcaagcctgggggcagatggtggcgcgttatggccagccaacgcatctgcacgatcgcgaagggcgcggttttgcggtggtcggttatggcaagctgggcggctgggagctgggttacagctccgatctggatctggtattcctgcacgactgcccgatggatgtgatgaccgatggcgagcgtgaaatcgatggtcgccagttctatttgcgtctcgcgcagcgcgtgatgcacctgtttagcacgcgcacgtcgtccggcatcctttatgaagttgatgcgcgtctgcgtccatctggcgctgcggggatgctggtcactactacggaatcgttcgccgattaccagcaaaacgaagcctggacgtgggaacatcaggcgctggcccgtgcgcgcgtggtgtacggcgatccgcaactgaccgccgaatttgacgccattcgccgcgatattctgatgacgcctcgcgacggcgcaacgctgcaaaccgacgtgcgagaaatgcgcgagaaaatgcgtgcccatcttggcaacaagcataaagaccgcttcgatctgaaagccgatgaaggcggtatcaccgacatcgagtttatcgcccaatatctggtgctgcgctttgcccatgacaagccgaaactgacgcgctggtcggataatgtgcgcattctcgaagggctggcgcaaaacggcatcatggaggagcaggaagcgcaggcattgacgctggcgtacaccacattgcgtgatgagctgcaccacctggcgctgcaagagttgccgggacatgtggcgctctcctgttttgtcgccgagcgtgcgcttattaaaaccagctgggacaagtggctggtggaaccgtgcgccccggcgtaa 81 MPHHAGLSQHWQTVFSRLPESLTAQPLSAQAQSVLTFSDFVQDSIIAHPEWLAELESAPPPANEWQHYAQWLQAALDGVTDEASLMRALRLFRRRIMVRIAWSQALQLVAEEDILQQLSVLAETLIVAARDWLYEACCREWGTPSNPQGVAQPMLVLGMGKLGGGELNFSSDIDLIFAWPENGATRGGRRELDNAQFFTRLGQRLIKVLDQPTQDGFVYRVDMRLRPFGDSGPLVLSFAALEDYYQEQGRDWERYAMVKARIMGDNDGDHARELRAMLRPFVFRRYIDFSVIQSLRNMKGMIAREVRRRGLKDNIKLGAGGIREIEFIVQVFQLIRGGREPALQSRSLLPTLAAIDQLHLLPDGDATRLREAYLWLRRLENLLQSINDEQTQTLPGDELNRARLAWGMGKDSWEALCETLEAHMSAVRQIFNDLIGDDETDSPEDALSESWRELWQDALQEEDSTPVLAHLSEDDRRRVVALIADFRKELDKRTIGPRGRQVLDHLMPHLLSDVCSRDDAPVPLSRLTPLLTGIITRTTYLELLSEFPGALKHLISLCAASPMVASQLARYPILLDELLDPNTLYQPTAMNAYRDELRQYLLRVPEDDEEQQLEALRQFKQAQLLRVAAADIAGTLPVMKVSDHLTWLAEAIIDAVVQQAWGQMVARYGQPTHLHDREGRGFAVVGYGKLGGWELGYSSDLDLVFLHDCPMDVMTDGEREIDGRQFYLRLAQRVMHLFSTRTSSGILYEVDARLRPSGAAGMLVTTTESFADYQQNEAWTWEHQALARARVVYGDPQLTAEFDAIRRDILMTPRDGATLQTDVREMREKMRAHLGNKHKDRFDLKADEGGITDIEFIAQYLVLRFAHDKPKLTRWSDNVRILEGLAQNGIMEEQEAQALTLAYTTLRDELHHLALQELPGHVALSCFVAERALIKTSWDKWLVEPCAPA 82 MFNDLIGDDETDSPEDALSESWRELWQDALQEEDSTPVLAHLSEDDRRRVVALIADFRKELDKRTIGPRGRQVLDHLMPHLLSDVCSRDDAPVPLSRLTPLLTGIITRTTYLELLSEFPGALKHLISLCAASPMVASQLARYPILLDELLDPNTLYQPTAMNAYRDELRQYLLRVPEDDEEQQLEALRQFKQAQLLRVAAADIAGTLPVMKVSDHLTWLAEAIIDAVVQQAWGQMVARYGQPTHLHDREGRGFAVVGYGKLGGWELGYSSDLDLVFLHDCPMDVMTDGEREIDGRQFYLRLAQRVMHLFSTRTSSGILYEVDARLRPSGAAGMLVTTTESFADYQQNEAWTWEHQALARARVVYGDPQLTAEFDAIRRDILMTPRDGATLQTDVREMREKMRAHLGNKHKDRFDLKADEGGITDIEFIAQYLVLRFAHDKPKLTRWSDNVRILEGLAQNGIMEEQEAQALTLAYTTLRDELHHLALQELPGHVALSCFVAERALIKTSWDKWLVEPCAPA 83 EEQQLEALRQFKQAQLLRVAAADIAGTLPVMKVSDHLTWLAEAIIDAVVQQAWGQMVARYGQPTHLHDREGRGFAVVGYGKLGGWELGYSSDLDLVFLHDCPMDVMTDGEREIDGRQFYLRLAQRVMHLFSTRTSSGILYEVDARLRPSGAAGMLVTTTESFADYQQNEAWTWEHQALARARVVYGDPQLTAEFDAIRRDILMTPRDGATLQTDVREMREKMRAHLGNKHKDRFDLKADEGGITDIEFIAQYLVLRFAHDKPKLTRWSDNVRILEGLAQNGIMEEQEAQALTLAYTTLRDELHHLALQELPGHVALSCFVAERALIKTSWDKWLVEPCAPA 84 ccgagcgtcggggtgcctaatatcagcaccggatacgagagaaaagtgtctacatcggttcggttgatattgaccggcgcatccgccagcccgcccagtttctggtggatctgtttggcgattttgcgggtcttgccggtgtcggtgccgaaaaaaataccaatatttgccataacacacgctcctgttgaaaaagagatcccgccgggaaatgcggtgaacgtgtctgatattgcgaagagtgtgccagttttggtcgcgggcaaaacctgcaccagtttggttattaatgcaccagtctggcgctttttttcgccgagtttctcctcgctaatgcccgccaggcgcggctttggcgctgatagcgcgctgaataccgatctggatcaaggttttgtcgggttatcagccaaaaggtgcactctttgcatggttatacgtgcctgacatgttgtccgggcgacaaacggcctggtggcacaaattgtcagaactacgacacgactaactgaccgcaggagtgtgcgatgaccctgaatatgatgatggatgccggcggacatcatcgcgacaaacaatattaataccggcaaccacaccggcaatttacgagactgcgcaggcatcctttctcccgtcaatttctgtcaaataaagtaaaagaggcagtctacttgaattacccccggctggttgagcgtttgttgaaaaaaagtaactgaaaaatccgtagaatagcgccactctgatggttaattaacctattcaattaagaattatctggatgaatgtgccattaaatgcgcagcataatggtgcgttgtgcgggaaaactgcttttttttgaaagggttggtcagtagcggaaacaactcacttcacaccccgaagggggaagttgcctgaccctacgattcccgctatttcattcactgaccggaggttcaaaatgacccagcgaaccgagtcgggtaataccgtctggcgcttcgatttgtcccagcagttcactgcgatgcagcgcataagcgtggtactcagccgggcgaccgaggtcgatcagacgctccagcaagtgctgtgcgtattgcacaatgacgcctttttgcagcacggcatgatctgtctgtacgacagccagcaggcgattttgaatattgaagcgttgcaggaagccgatcagcagttaatccccggcagctcgcaaatccgctatcgtccgggcgaagggctggtcgggacggtgctttcgcagggccaatcattagtgctggcgcgcgttgctgacgatcagcgctttcttgaccggctcgggttgtatgattacaacctgccgtttatc 85 attgaagagtttgatcatggctcagattgaacgctggcggcaggcctaacacatgcaagtcgagcggcagcgggaagtagcttgctactttgccggcgagcggcggacgggtgagtaatgtctgggaaactgcctgatggagggggataactactggaaacggtagctaataccgcatgacctcgnaagagcaaagtgggggatcttcggacctcacgccatcggatgtgcccagatgggattagctagtaggtgaggtaatggctcacctaggcgacgatccctagctggtctgagaggatgaccagccacactggaactgagacacggtccagactcctacgggaggcagcagtggggaatattgcacaatgggcgcaagcctgatgcagccatgccgcgtgtgtgaagaaggccttagggttgtaaagcactttcagcgaggaggaaggcatcanacttaatacgtgtggtgattgacgttactcgcagaagaagcaccggctaactccgtgccagcagccgcggtaatacggagggtgcaagcgttaatcggaattactgggcgtaaagcgcacgcaggcggtttgttaagtcagatgtgaaatccccgcgcttaacgtgggaactgcatttgaaactggcaagctagagtcttgtagaggggggtagaattccaggtgtagcggtgaaatgcgtagagatctggaggaataccggtggcgaaggcggccccctggacaaagactgacgctcaggtgcgaaagcgtggggagcaaacaggattagataccctggtagtccacgctgtaaacgatgtcgacttggaggttgtgcccttgaggcgtggcttccggagctaacgcgttaagtcgaccgcctggggagtacggccgcaaggttaaaactcaaatgaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgatgcaacgcgaagaaccttacctactcttgacatccacggaattcgccagagatggcttagtgccttcgggaaccgtganacaggtgctgcatggctgtcgtcagctcgtgttgtgaaatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttatcctttgttgccagcnngtnatgnngggaactcaaaggagactgccggtgataaaccggaggaaggtggggatgacgtcaagtcatcatggcccttacgagtagggctacacacgtgctacaatggcatatacaaagagaagcgaactcgcgagg 86 atggcaatgcgtcaatgcgcaatctacgggaaagggggtattgggaaatccaccactacccaaaaccttgtagcggctctggccgaaatgaataagaaggtcatgatcgtcggctgtgaccctaaggctgattcaacccgcctcattctgcatgcgaaagcacagaacaccatcatggaaatggccgctgaagtgggctccgtggaagatctggagctggaagatgtgatgcaaatcggctatggcggcgtgcgctgtgcggaatcaggcggccctgagcctggtgtgggttgtgccggacgcggggtgatcaccgccatcaacttcctcgaagaagaaggcgcgtatgtgccggatctggattttgtgttttacgacgtattgggcgatgtggtctgtggcggtttcgcgatgccaattcgcgaaaacaaagcgcaggaaatctacatcgtgtgctccggtgaaatgatggcgatgtatgccgccaacaacatttccaaaggcatcgtgaaatacgcgaaatcgggcaaagttcgcctggccgggctgatctgtaactcccgccagacggatcgcgaagatgaactgatcatcgcgctggctgaaaaacttggcacgcaaatgatccacttcgtgccgcgtgacaacattgtgcaacgcgctgaaatccgccgcatgacggtcatcgaatacgacccgacttgtgcgcaggcagatcagtatcgtgcactggcgaacaaaatcgtcaacaacaccaaaatggtggtgccgacaccggtcaccatggatgagctggaagccctgttaatggaatttggcattatggaagaagaagacctggccatcgtcggtcgtaccgccgccgaagaggcgtga 87 atgaaggcaaaagagattctggcgctgattgatgagccagcctgtgagcataaccacaagcagaagtcgggttgcagcctgccgaaaccgggcgcgacggcaggcggttgtgcgtttgatggcgcgcagattgcgctgctgccggtcgcggacgtcgcgcatctggtgcacggcccgattggctgtaccggcagttcatgggacaaccgtggcagccgcagttccgggccttccatcaaccgcatgggcttcaccaccgacatgagcgagcaggatgtgattatggggcgcggcgagcgacgcttatttcacgccgtgcagcacatcgtcagccattaccatccggtggcggtctttatttacaacacctgcgtacccgcgatggaaggggatgacgttgaagccgtgtgtcgcgccgcatcggccgctgccggtgtgccggttatttcagtcgatgccgccggtttctacggcagcaaaaatctcggtaaccgcattgccggggacgtgatggtcaaaaaggtgatcggccagcgcgaacccgcgccgtggccggaaaactcaccgatccccgccggacaccgccacagcatcagcctgattggcgaattcaatattgccggcgagttctggcacgttctgccgctgctcgatgagctcgggatccgcgtgctgtgcagcctttccggggattcccgttttgctgaaatccagactatgcaccgtggcgaagccaacatgctggtgtgctcgcgggcgctgatcaacgtcgcccgaaaaatggaagagcgttaccagatcccatggtttgaaggcagtttttatggcctgcgttccatggctgattccctgcgcacgatcgccgtgctgctcaaagacccggatttacaggcgcgcacagaacgtctgattgagcgcgaggaggcggcgacacatcttgcgcttgcgccttaccgtgcgcggctcagcgggcgcaaggcgctgctgtataccggtggcgtgaaatcctggtcggtggtctcggcgttacaggatttaggcatcacggtggtggcgaccggcacccgaaaatcaaccgaagaagacaagcagcgtattcgcgaactgatgggtgaagacgtgctgatgctcgacgaaggcaatgccagaaccttgctcgacaccctctatcgtttcggcggcgacatcatgatcgccgggggccgcaacatgtataccgcgtacaaagcccgcctgccgttcctggatatcaatcaggagcgcgagcatgcgtttgccggatatcacgggctggtaaatctggccgaacagttgtgtatcaccctggaaagcccggtctgggcgcaggtcaaccgtctggcgccgtggcgctaa 88 atgaccagtgaaacacgcgaacgtaacgaggcattgatccaggaagtgctggagatcttccccgagaaggcgcttaaagatcgtaagaaacacatgatgaccaccgacccggcgatggaatctgtcggcaagtgtattgtctcaaaccgcaaatcacagccgggcgtgatgaccgtgcgaggctgcgcttacgccggttccaaaggcgtggtctttggcccgatcaaagacatggcgcatatctcccacggcccggttggttgcggccagtattcccgtgccggacgccgtaactattacaccggctggagcggcgtgaacagctttggcaccctcaacttcaccagtgattttcaggaacgggacatcgtatttggcggcgataaaaagctcgacaaattgatcgatgaactggagatgttgttcccgctgagcaaaggcatttcggtgcagtcggaatgtccggtcggtctgatcggcgatgacatttctgccgtcgccaaagccagcagcgccaaaatcggtaagccggtcgtgccggtacgctgcgaggggttccgcggtgtgtcgcaatcgctcggccatcacattgctaacgatgtcatccgcgactgggtgctggataaccgcgaaggcaatgaatttgaaaccacgccttacgacgtggcgattatcggcgactacaacatcggcggtgacgcctgggcctcacgtattctgctcgaagaaatggggctgcgcgtggtggcgcagtggtccggcgacggcacgctggtggagatggaaaacaccccgaaagtcgcgctcaatctggtgcactgctaccgctcgatgaactacatctcccgtcatatggaagaaaaacacggcattccgtggatggaatacaacttctttggcccgaccaaaattgcggaatctctgcgcgaaatcgcggcgcgttttgacgataccatccggaaaaacgccgaagcggtgattgaaaaatatcaggcgcaaacgcaggcggtgatcgacaaataccgtccgcgtctggaaggcaaaaaggtgctgttgtatctcggcggtttacgtccgcgccacatcatcggggcgtatgaagatctgggaatggaaatcatcggtaccggctatgaattcggtcataacgatgattacgaccgcaccttaccgatgctcaaagaaggcacgttgctgttcgatgacctgagcagttatgagctggaagcgttcgttaaagcgctgaaaccggatcttgtcgggtcaggtatcaaagaaaaatacattttccagaaaatgggcgtgccgttccgccagatgcactcctgggattattccggcccttatcacggctacgacggtttcggcatttttgcccgtgacatggacatgacgctgaacaatccgggctggagtcagctgaccgccccctggttgaaaacggcctga 89 atggctcaaattctgcgtaatgccaagccgcttgccaccacgcctgtcaaaagcgggcaaccgctcggggcgatcctggccagtcaggggctggaaaattgcatcccgctggttcacggcgcgcaaggttgtagcgcgttcgccaaagttttcttcatccagcattttcacgatccgatcccgttgcagtccacggcgatggaatcgaccacgactatcatgggctcggatggcaacgtcagtactgcgttgaccacgttgtgtcagcgcagtaatccaaaagccattgtgattttgagcaccggactgtcagaagcgcagggcagtgatttgtcgatggcgctgcgtgagtttcgcgacaaagaaccgcgctttaatgccatcgctattctgaccgttaacacgccggatttttacggctcgctggaaaacggctacagcgcgctgatggaaagcgtgatcactcagtgggtgccggaaaagccgccgaccggcatgcgtaacaagcgcgtgaacctgctggtgagccatctgctgacgccgggggatctggaattactgcgcagctatgtcgaagcctttggcctgcaaccggtgatcctgccggatttatcacagtcgctggacggacatctggcgaatggcgatttcaatccggtcacgcagggcggcacgtcgcaacgccagattgaacaaatggggcagagcctgaccaccattaccattggcagttcgctcaactgcgccgccagtctgatggcgatgcgcagccgtggcatggcgctgaacctgccgcacctgatgacgctggaaaacatggacagtctgatccgccatctgcatcaggtgtcaggccgcgaggtaccggcatggattgagcgccagcgcgggcaactgctggacgccatgatcgactgccatacctggctgcagtcacagcgtattgcgctggcggcagaagcggatttgctggtggcgtggtgcgatttcgctcagagccagggaatgcgcgtcgggccggtgattgcgccggttaatcagcagtcactggccgggctgccggtcgaacaggtggtgatcggcgatctggaagatttacaaacccggctcgacagctacccggtttcactgctggtggcgaactcccacgctgcaccactggcggaaaaaaacggtatcgcgctggtacgtgccggtttcccgctttacgaccgtctcggggaatttcgccgcgtgcggcagggctatgcgggtattcgcgacaccttgttcgaactcgcgaacctgatgcaggcgcgccatcacatgctgacggcgtatcactcaccgcttaggcaggtgttcggcctgagcccggtaccggaggccagtcatgaggcgcgctaa 90 atgagtcaagatcttggcaccccaaaatcctgtttcccgctgttcgagcaggatgaataccagaatatgtttacccacaaacgcgcgctggaagaagcacacggcgaggcgaaagtgcgggaagtgtttgaatggaccaccacgcaggaatatcaggatctgaacttctcgcgtgaagcgctgaccgtcgacccggcgaaagcctgccagccgttaggcgcggtactttgcgcgctgggttttaccaacacgttgccgtatgtccatggttcacaaggctgtgtggcgtatttccgtacctattttaatcgtcatttcaaagagccggtggcctgtgtttccgactcaatgaccgaagatgccgccgtttttggcggaaataacaacatgaatgtcggtctggaaaacgccagcgcgctgtacaagccggaaattattgcggtctccaccacctgtatggcggaagtgatcggtgatgacctgcaggcttttatcgccaacgccaaaaaagacggatttgtggatgccggtatgccaatcccgtatgcccatacaccgagttttctgggcagtcatgtcaccggctgggacaacatgtttgaaggcttcgcccgtacctttaccaccgacgccacgcgggaatatcagccgggcaaacttgccaaactgaacgtggtgaccggttttgaaacttatctcggcaactaccgggttattcaccgcatgatgagccagatgggggtcgaatgcagcgtcttgtccgatccgtctgaagtgctcgacaccccggctgacggccaataccgcatgtatgccggcggcaccacgcaaaccgaaatgcgtgatgcaccggatgccatcgacaccttgctgctgcaaccgtggcaattacagaaaaccaaaaaggtggtgcagggcgactggaatcagccgggcaccgaagtcagtgtaccgattggcctggcggcgaccgatgccttgctgatgacggtaagcgaactgaccggcaaaccgatagctgacgcgctggcgactgaacgtggccgtctggtggacatgatgctcgattctcacacctggctgcacggcaagcgtttcggtctctacggtgacccggattttgtgatgggcatgaccgcattcctgctggaactgggctgtgaaccgaccaccattctcagccataacggcaacaaacgctggcagaaagccatgaagaaaatgctggctgattcgccttacggacaggacagcgaagtgtatgtgaactgcgatctgtggcatttccgctcgctgatgtttacccgtaaaccggactttatgatcggcaactcttacggaaaattcattcagcgtgacacgctggccaaaggcgaacagttcgaagtgccgctgatccgtatcggattcccgatttttgaccggcaccatttgcaccgtcagaccacctggggatacgagggcgcgatgagcatcctgacgcaactggtgaatgcggtgctcgaacagctggatcgcgaaaccatgaagctcggcaaaaccgactacaacttcgatctgatccgctaa 91 atgagcatcacggcgttatcagcatcatttcctgaggggaatatcgccagccgcttgtcgctgcaacatccttcactgttttataccgtggttgaacaatcatcggtggcgatttcgctgaccgatccgcaggcgcgcatttgttatgccaatccggcattctgccgccagacgggttttgcacttgagacacttttgggcgagaaccaccgtctgctggccagccagcagacgccgaaacatatctatgacgaaatgtggcgcactttgttgcagggcaaatcctggaacggccaactgatcaaccggcgtaataaccgttcgctttatctggcggatgtcactatcacgcctgttttaggcgcggacgggcaggtggagcattacctcggcatgcacaaagatatcagcgagaaatacgcgctggagcagcggttgcgcaaccacatcaccttgttcacggaggtgctgaacaatattcccgccgccgtggtggtggtggatgagcaggacaatgtggtgatggacaatctggcctacaaaaccctgtgcgctgactgcggcggaaaagagctgttggccgaaatgggctatccgcaactcaaagagatgctcaacagtggcgaaccggtgccggtttccatgcgcggcaacgtacgctggttttctttcggtcagtggtcattgcagggcgttaatgaagaggccagccgcttttttaccggcattaccgcgccgggaaaactgattgttctcaccgactgcaccgatcagcatcaccggcagcagcagggttatcttgaccggctcaagcaaaaacttaccaacggcaaattgctggcagccatccgcgagtcgcttgatgccgcgctgattcagctcaacgggccaattaatatgctggcggctgcgcgtcgtcttaacggcgaagaaggcaacaacatggcgctggaattcgcctggcgcgaaggcgagcaggcggtgagtcgcttacaggcctgccgtccgtcgctggattttgagccgcaggcagaatggccggtcagtgaattcttcgacgatctgagcgcgctgtacgacagccattttctcagtgacggtgaattgcgttacgtggtcatgccatctgatctgcacgctgtcgggcaacgaacgcaaatccttaccgcgctgagcttatggattgatcacacgctgtcacaggcgcaggccatgccgtctctgaagctctcggtgaacattgttgcgaagcaggatgcgagctggttgtgttttgacattaccgataatgtgccgcgtgaacgggtgcgttatgcccgcccggaagcggcgttttcccgtccggggaatggcatggagctgcgccttatccagacgctgatcgcccatcatcgcggttctttagatctctcggtccgccctgatggcggcaccttgctgacgttacgcctgccggtacagcaggttatcaccggaggcttaaaatga 92 atgacccagttacctaccgcgggcccggttatccggcgctttgatatgtctgcccagtttacggcgctttatcgcatcagcgtggcgctgagtcaggaaagcaataccgcgcgcgcactggcggcgatcctcgaagtgcttcacgatcatgcatttatgcaatacggcatggtgtgtctgttcgataaagaacgcaatgcactgtttgtggaatccctgcatggcatcgacggcgaaaggaaaaaagagacccgccatgtccgttaccgcatgggggaaggcgtgatcggcgcggtgatgagccagcgtcaggcgctggtgttaccgcgcatttcagacgatcagcgttttctcgaccgcctgaatatttacgattacagcctgccgctgattggtgtgccgatccccggtgcggataatcagcctgcgggtgtgctggtggcacagccgatggcgttgcacgaagaccggctggctgccagtacgcggtttttagaaatggtcgccaatctcatcagccagccactgcgttctgccacgcccccggaatcattgcctgctcaaacgccggtccggtgcagtgttccgcgccagtttggttttgagcagatggtcgggaaaagtcaggcgatgcgccagacgatggacattttacggcaggtttccaaatgggataccacggttctggtgcgtggtgaaagcggcaccggcaaggaacttatcgccaatgccattcattacaactcaccccgtgcggccgcgccatttgtgaaattcaactgcgccgcgctgccggataacctgctggaaagcgaactgttcggtcatgaaaaaggggccttcaccggcgctatacgcacccgaaaaggccgctttgaactggcggacgggggcacgttattcctcgatgaaatcggcgaatcgagcgcgtcgtttcaggccaaattgctgcgcattttgcaggaaggtgaaatggaacgggtcggcggcgataccacgctgaaagttgatgtgcgcattattgctgccaccaaccgtaatcttgaggaggaagtgcgtgccgggaattttcgcgaagacctgtattatcgcctgaacgtgatgccggtttcgctgcctgcactgcgtgaaaggctggatgatatcgccgatctggcgccgtttctggtcaaaaagattgcgctgcgtcaggggcgggaactgcgcatcagtgatggtgcggtgcgtctgctgatgacctacagctggccaggcaacgtgcgtgaactggaaaactgcctcgaacgggcgtcggtaatgaccgatgaagggctgatcgaccgcgacgtgatcctgttcaatcaccatgagtccccggcgctgtccgtcaaacccggtctgccgctggcgacagatgaaagctggctggatcaggaactcgacgaacgccagcgggtgattgctgcactggagaaaaccggctgggtgcaggccaaagcggcccgactgctgggcatgacaccgcgccagattgcctaccgtatccagattatggacatcaacatgcaccgtatctga 93 atgttgccactttcttctgttttgcaaagccacgcgcagagtttgcctgaacgctggcatgaacatcctgaaaacctgcccctccccgatgatgaacagctggctgtgctgagcagcagtgaattcatgacggacagtttgctggcttttccgcagtggtggcatgaaattgtccaaaatccccctcaggcgcaggagtggcaactttaccgtcagtggctggatgaatcgctgacgcaggtgactgacgaagccgggttaatgaaagctttgcgtctgttccgccgccgtattctgacccgcattgcgtggtcacagtccgcgcaaaccagcgaagcaaaagatacgcttcaccagctgagtgaactggcggaattattgattgtcagcgcccgtgactggctgtatgccgcttgctgtcgcgagttcggtacgccggtcaatgccgcaggggaaccgcagagaatgctgatcctcgggatgggcaaactcggcggtggcgagctgaatttctcatcggacatcgacctgatttttgcttatccggaaaatggccagacacgcggcggtcggcgtgaactggataacgcacaatttttcacccggctcggccagcgtctgatcaaagcgctggatcagcccactatcgacggttttgtctatcgcgtggacatgcgtttgcgtccgttcggcgacagtggcccgctggtgatgagcttcccggcactggaagattattatcaggaacaggggcgcgactgggaacgctacgcaatggtgaaagcgcgtctgatgggcggcgcggaggacatcagcagtcaggaattgcgtaaaatgctgatgccttttgtcttccgccgttatatcgatttcagtgtgatccagtccctgcgtaacatgaaaggcatgatcgcccgcgaagtacgccgccgtggtctgaaagacaacatcaaactcggcgcaggcggtattcgtgaaattgaatttatcgtgcaggtatttcagctgatccgtggcggtcgtgaaccggcattgcagcagcgtgcgttgttgccaacgcttcaggcgctggaaaatctggggctgctgccggtagagcaggtgttgcagttgcgtaacagctatctgttcctgcgacgtctggaaaacctgttgcaggccattgctgacgagcaaacgcaaaccttaccgtccgatgagctgaatcaggcgcgtctggcgtgggggatgaattacgctggctggccgcagcttctggatgcagtgaatgctcacatgcaggccgtacgcgcggtatttaacgatctgattggcgatgacacgccagatgccgaagatgacgtgcaactctcccggttcagcagtttatggattgatacgcttgagcctgacgagctggctccgctggtgccgcaacttgacgaaaatgcgcaacggcatgttttacatcagattgctgattttcgccgtgacgtggataaacgcacgatagggccacgtgggcgtgatcagttggatttgctgatgccgcgtttactggcccaggtctgcacctataaaaatgcggatgtgacgttacagcgcctgatgcagttgctgctcaatatcgtcacgcgcacgacgtatatcgagctgctggtggaatatcccggtgcgctcaaacagttaatacgtctgtgcgctgcctcgccgatggtggcgacgcaacttgcgcgtcatcctttattgctcgacgaactgctcgacccgcgcacgctttaccagccgattgagccgggcgcgtaccgtgatgaactgcggcaatatctgatgcgggtgccaaccgaagacgaagaacaacagcttgaagccgtgcgccagttcaaacaggcacagcatttacgtattgcggccggggatatttccggtgcgttgccggtgatgaaagtcagtgaccatttaacctaccttgcggaggccattctcgacgttgtggtgcaacaggcgtgggaacaaatggtcgtaaaatacggtcagccaacccatcttcagcaccgtaaagggcgcggttttgccgtggtgggttacggaaaactcggtggctgggagctgggttacagctcggatctggatctggtcttcctgctcgattgcgcgccggaagtcatgaccgacggcgaacgcagcattgacgggcgtcagttttatctgcggctggcgcagcgcatcatgcatttattcagcacccgtacgtcgtcaggcattctttatgaggttgacccgcgtctgcggccttccggtgcttccggcatgctggtcagcaccatcgaagcttttgcggattatcaggccaacgaagcctggacatgggagcatcaggcgctggttcgcgcgcgtgtggtttatggtgatccgcaactgacgcagcaatttaatgccacgcgtcgcgacattctttgccgccagcgcgatgccgacggcttgcgtaaggaagtccgtgaaatgcgcgagaaaatgtatgcccatctgggcagcaaaagagccgacgagtttgatctgaaagccgatccgggtggcataacggatattgaattcatcgcacaatatctggttctgcgtttcgcgcatgatgagccgaagctgacccgctggtctgataacgtgcggattttcgaactgatggcgcgacatgacatcatgccggaagaggaagcacgccatctgacgcaggcttacgtgacattgcgcgatgaaattcatcatctggcgttgcaggaacacagcgggaaagtggccgcagacagctttgccactgagcgcgcgcaaatccgcgccagctgggcaaactggcttggctga 94 atgaaaaaacttttatccatgatggggcttggtgcagtggctttgctaccttcgcttgccatggcagcagcaccagcagcggcaaacggtgctgataacgcctttatgatgatttgtaccgcgctggtattgttcatgaccgtacccggtgtggcgttgttctacggcggcttactgcgttctaaaaacgttttgtccatgctgactcaggttattgttacctttgctctggtctgcgtcctgtggatcctctacggttacagccttgccttcagtgaaggtaacgcgttcttcggtggtttcagcaacgtaatgatgaaaggcattggcctggattctgtgactggcaccttctcgcagatgatccacgttgcattccagtgttcatttgcctgcatcactgtagcgctgatcgtaggtggtattgctgaacgtgtgcgtttctcagcagttctgattttcactgtgatctggctgactttctcttatattccgatggctcacatggtatgggcaggcggtttcctggctgctgacggtgcgctggactttgccggtggtaccgttgttcatatcaatgccgcaattgctggcctggtaggggcttatctgctgggtaaacgcgccggttttggcaaagaagctttcaaaccacacaacctgccaatggtcttcactggcgcctcaatcctgtatgtgggctggttcggcttcaatgcgggttcagcaagtgccgcaagctctgttgccgcgctggctttcctgaacactgtcattgctactgctggcgcaatcctgtcctggacgctggttgagtggatggtgcgcggtaagccctcactgctgggcgcaagctccggtgctatcgcaggtctggtggctatcacgcctgcatgtggtacggtcggcgtaggtggtgctctgattatcggtctggtaggcggtatcactggtctgtggggggttgttaccctgaaaaaatggctgcgtgttgatgacacctgtgatgtgttcggtgttcatggcgtgtgcggtatcgtaggttgtctgctgacgggtgtattcacgtccagttcacttggcggcgtgggctacgcagaaggcgtgaccatgggccatcaggtttgggtgcagttcttcagcgtgtgcgtaacattggtctggtcaggcgttgttgccttcatcggttacaaagtggctgacatgatcgtaggtctgcgtgttcctgaagaacaagaacgcgaaggtctggacgttaacagccacggcgaaaacgcttacaaccaataa 95 tgaatatcactgactcacaagctacctatgtcgaagaattaactaaaaaactgcaagatgcaggcattcgcgttaaagccgacttgagaaatgagaagattggctttaaaattcgcgaacacacgctacgccgtgttccttatatgttagtttgtggcgataaagaggtcgaagcaggcaaagttgctgttcgtactcgtcgcggcaaagacttaggaagcatggatgttagcgaagtcgttgacaaactgctggcggaaatccgcagcagaagtcatcatcaactggaggaataaagtattaaaggcggaaaacgagttcaaccggcgcgtcctaatcgcattaacaaagagattcgcgcgcaagaagttcgcctcaccggcgtcgatggcgagcagattggtattgtcagtctgaatgaagctcttgaaaaagctgaggaagcgggcgtcgatttagtagaaatcagtccgaatgccgagccgccagtttgtcgaatc 96 attgaagagtttgatcatggctcagattgaacgctggcggcaggcctaacacatgcaagtcgagcggtagcacagagagcttgctctcgggtgacgagcggcggacgggtgagtaatgtctgggaaactgcctgatggagggggataactactggaaacggtagctaataccgcataacgtcgcaagaccaaagtgggggaccttcgggcctcatgccatcagatgtgcccagatgggattagctagtaggtggggtaacggctcacctaggcgacgatccctagctggtctgagaggatgaccagccacactggaactgagacacggtccagactcctacgggaggcagcagtggggaatattgcacaatgggcgcaagcctgatgcagccatgccgcgtgtgtgaagaaggccttcgggttgtaaagcactttcagcggggaggaaggcggtgaggttaataacctcaccgattgacgttacccgcagaagaagcaccggctaactccgtgccagcagccgcggtaatacggagggtgcaagcgttaatcggaattactgggcgtaaagcgcacgcaggcggtctgtcaagtcggatgtgaaatccccgggctcaacctgggaactgcattcgaaactggcaggctagagtcttgtagaggggggtagaattccaggtgtagcggtgaaatgcgtagagatctggaggaataccggtggcgaaggcggccccctggacaaagactgacgctcaggtgcgaaagcgtggggagcaaacaggattagataccctggtagtccacgctgtaaacgatgtcgatttggaggttgtgcccttgaggcgtggcttccggagctaacgcgttaaatcgaccgcctggggagtacggccgcaaggttaaaactcaaatgaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgatgcaacgcgaagaaccttacctggtcttgacatccacagaactttccagagatggattggtgccttcgggaactgtgagacaggtgctgcatggctgtcgtcagctcgtgttgtgaaatgttggg 97 atgaccatgcgtcaatgcgctatctacggtaaaggcggtatcggtaaatccaccaccacccagaatctcgtcgcggccctcgccgagatgggtaagaaagtgatgatcgtcggctgcgatccgaaagcggattccacccgtctgatcctccacgctaaagcccagaacaccatcatggagatggcggcggaagtgggctcggtcgaggatctggagctcgaagacgttctgcaaatcggctatggcgatgtccgttgcgccgaatccggcggcccggagccaggcgtcggctgcgccggacgcggggtgatcaccgccatcaacttcctcgaggaagaaggcgcctatgaagaagatttggatttcgtcttctatgacgtcctcggcgacgtggtctgcggcggcttcgctatgccgatccgcgaaaacaaagcccaggagatctacatcgtctgctccggcgagatgatggcgatgtatgccgccaacaatatctccaaagggatcgtgaagtacgccaaatccggcaaggtgcgcctcggcggcctgatctgtaactcgcgcaaaaccgaccgggaagacgaactgatcatcgccctggcggagaagcttggcacgcagatgatccacttcgttccccgcgacaacattgtgcagcgcgcggagatccgccggatgacggtgatcgagtacgacccgacctgtcagcaggcgaatgaatatcgtcaactggcgcagaagatcgtcaataacaccaaaaaagtggtgccgacgccgtgcaccatggacgagctggaatcgctgctgatggagttcggcatcatggaagaagaagacaccagcatcattggtaaaaccgccgctgaagaaaacgcggcctga 98 atggttaggaaaagtagaagtaaaaatacaaatatagaactaactgaacatgaccatttattaataagtcaaataaaaaagcttaaaacacaaaccacttgcttttttaataataaaggaggggttgggaagactacattagtagcaaatttaggagcagagctatcaataaactttagtgcaaaagttcttattgtggatgccgaccctcaatgtaatctcacgcagtatgtattaagtgatgaagaaactcaggacttatatgggcaagaaaatccagatagtatttatacagtaataagaccactatcctttggtaaaggatatgaaagtgacctccctataaggcatgtagagaatttcggttttgacataattgtcggtgaccctagacttgctttacaggaagaccttttagctggagactggcgagatgccaaaggcggtgggatgcgaggaattaggacaacttttgtatttgcagagttaattaagaaagctcgtgagctaaattatgattttgttttctttgacatgggaccatcattaggcgcaatcaacagggcagtattactggcaatggaattctttgtcgtcccaatgtcaatcgatgtattttcactatgggctattaaaaatattggctccacggtttcaatatggaaaaaagaattagacacagggattcggctctcagaggaacctagcgaattatcacaattatcacctcaaggaaaactaaagtttctcggttacgtcacccaacaacataaagaacgctctggatacgatacaattcagcttgagaatactgaggaagaaataaaatcgaaacgtcgggtaaaggcgtatgaagacattggagaggtgtttccttctaaaattactgagcatctttctaaactttatgcatcaaaagatatgaacccacaccttggagatatacgtcatttaggtagtttagctccgaaatcacaatcacaacacgttccgatgatatcagtgtctggtacaggaaattacaccagacttagaaaaagcgcgcgtgaactttatcgagatattgcaagaagatacttagagaacattcagactgctaatggcgagaaatag 99 atgaagggaaaggaaattctggcgctgctggacgaacccgcctgcgagcacaaccagaagcaaaaatccggctgcagcgcccctaagcccggcgctaccgccggcggttgcgccttcgacggcgcgcagataacgctcctgcccatcgccgacgtcgcgcacctggtgcacggccccatcggctgcgcgggcagctcgtgggataaccgcggcagcgtcagcgccggcccggccctcaaccggctcggctttaccaccgatcttaacgaacaggatgtgattatgggccgcggcgaacgccgcctgttccacgccgtgcgtcacatcgtcgaccgctatcatccggcggcggtctttatctacaacacctgcgtaccggcgatggagggcgatgacatcgaggcggtctgccaggccgcacagaccgccaccggcgtcccggtcatcgctattgacgccgccggtttctacggcagtaaaaatcttggcaaccgaatggcgggcgacgtgatgctcaggcaggtgattggccagcgcgaaccggccccgtggccagacaacacgccctttgccccggcccagcgccacgatatcggcctgattggcgaattcaatatcgccggcgagttctggcaggtccagccgctgctcgacgagctggggatccgcgtcctcggcagcctctccggcgacggccgctttgccgagatccagaccctgcaccgggcgcaggccaatatgctggtgtgctcgcgcgcgctgatcaacgtcgcccgggggctggagctgcgctacggcacgccgtggtttgaaggcagcttctacgggatccgcgccacctccgacgccttgcgccagctggcgacgctgctgggggatgacgacctgcgccgccgcaccgaggcgctgatcgcccgcgaagagcaggcggcggagcaggctcttgcgccgtggcgtgagcagctccgcgggcgcaaagtgctgctctataccggcggcgtgaaatcctggtcggtggtatcggccctgcaggatctcggcatgaccgtggtggccaccggcacgcgcaaatccaccgaggaggacaaacagcggatccgtgagctgatgggcgacgaggcggtgatgcttgaggagggcaatgcccgcaccctgctcgacgtggtgtaccgctatcaggccgacctgatgatcgccggcggacgcaatatgtacaccgcctggaaagcccggctgccgtttctcgatatcaatcaggagcgcgagcacgcctacgccggctatcagggcatcatcaccctcgcccgccagctctgtctgaccctcgccagccccgtctggccgcaaacgcatacccgcgccccgtggcgctag 100 atgaccaacgcaacaggcgaacgtaaccttgcgctcatccaggaagtcctggaggtgtttcccgaaaccgcgcgcaaagagcgcagaaagcacatgatgatcagcgatccgcagatggagagcgtcggcaagtgcattatctcgaaccgtaaatcgcagcccggggtgatgaccgtgcgcggctgcgcctatgcgggctcgaaaggggtggtgtttgggccaatcaaagacatggcccatatctcgcacggccccatcggctgcggccagtattcccgcgccggacggcgcaactactataccggcgtcagcggtgtcgacagcttcggcaccctgaacttcacctctgattttcaggagcgcgatattgttttcggcggcgataaaaagctgaccaaactgatcgaagagatggagctgctgttcccgctgaccaaagggatcaccatccagtcggagtgcccggtgggcctgatcggcgatgacatcagcgccgtagccaacgccagcagcaaggcgctggataaaccggtgatcccggtgcgctgcgaaggctttcgcggcgtatcgcaatcgctgggccaccatatcgccaacgacgtggtgcgcgactgggtgctgaacaatcgcgaagggcagccgtttgccagcaccccgtacgatgttgccatcattggcgattacaacatcggcggcgacgcctgggcctcgcgcattctgctggaagagatggggctgcgcgtagtggcgcagtggtccggcgacggcaccctggtggagatggagaacaccccattcgttaagcttaacctcgtccactgctaccgttcgatgaactatatcgcccgccatatggaggagaaacatcagatcccatggatggaatataacttcttcggcccgaccaaaatcgccgaatcgctgcgcaagatcgccgatcaatttgatgacaccattcgcgccaatgcggaagcggtgatcgccaaatatgaggggcagatggcggccatcatcgccaaatatcgcccgcggctggaggggcgcaaagtgctgctgtacatgggggggctgcggccgcgccacgtcatcggcgcctatgaggatctcgggatggagatcatcgccgccggctacgagtttgcccataacgatgattacgaccgcaccctgccggacctgaaagagggcaccctgctgtttgacgatgccagcagctatgagctggaggccttcgtcaaagcgctgaaacctgacctcatcggctccgggatcaaagagaaatatatcttccagaaaatgggggtgccgttccgccagatgcactcctgggactattccggcccctatcacggctatgacggcttcgccatctttgcccgcgatatggatatgaccctgaacaatccggcgtggaacgaactgactgccccgtggctgaagtctgcgtga 101 atggcagatattatccgcagtgaaaaaccgctggcggtgagcccgattaaaaccgggcaaccgctcggggcgatcctcgccagcctcgggctggcccaggccatcccgctggtccacggcgcccagggctgcagcgccttcgccaaagttttctttattcagcatttccatgacccggtgccgctgcagtcgacggccatggatccgaccgccacgatcatgggggccgacggcaatatcttcaccgcgctcgacaccctctgccagcgccacagcccgcaggccatcgtgctgctcagcaccggtctggcggaagcgcagggcagcgatatcgcccgggtggtgcgccagtttcgcgaggcgcatccgcgccataacggcgtggcgatcctcaccgtcaataccccggatttttttggctctatggaaaacggctacagcgcggtgatcgagagcgtgatcgagcagtgggtcgcgccgacgccgcgtccggggcagcggccccggcgggtcaacctgctggtcagccacctctgttcgccaggggatatcgaatggctgggccgctgcgtggaggcctttggcctgcagccggtgatcctgccggacctctcgcagtcaatggatggccacctcggtgaaggggattttacgcccctgacccagggcggcgcctcgctgcgccagattgcccagatgggccagagtctgggcagcttcgccattggcgtgtcgctccagcgggcggcatcgctcctgacccaacgcagccgcggcgacgtgatcgccctgccgcatctgatgaccctcgaccattgcgatacctttatccatcagctggcgaagatgtccggacgccgcgtaccggcctggattgagcgccagcgtggccagctgcaggatgcgatgatcgactgccatatgtggcttcagggccagcgcatggcgatggcggcggagggcgacctgctggcggcgtggtgtgatttcgcccgcagccaggggatgcagcccggcccgctggtcgcccccaccagccaccccagcctgcgccagctgccggtcgagcaagtcgtgccgggggatcttgaggatctgcagcagctgctgagccaccaacccgccgatctgctggtggctaactctcacgcccgcgatctggcggagcagtttgccctgccgctgatccgcgtcggttttcccctcttcgaccggctcggtgagtttcgtcgcgtccgccaggggtacgccggtatgcgagatacgctgtttgaactggccaatctgctgcgcgaccgccatcaccacaccgccctctaccgctcgccgcttcgccagggcgccgacccccagccggcttcaggagacgcttatgccgcccattaa 102 atgagccaaacgatcgataaaattcacagctgttatccgctgtttgaacaggatgaataccagaccctgttccagaataaaaagacccttgaagaggcgcacgacgcgcagcgtgtgcaggaggtttttgcctggaccaccaccgccgagtatgaagcgctgaacttccagcgcgaggcgctgaccgtcgacccggccaaagcctgccagccgctcggcgccgtactctgcgcgctggggttcgccggcaccctgccctacgtgcacggctcccagggctgcgtcgcctattttcgcacctactttaaccgccattttaaagagccggtcgcctgcgtctccgactccatgaccgaggacgcggcggtgttcggcggcaacaacaacatgaatctgggcctgcagaatgccagcgcgctgtataaacccgagattatcgccgtctccaccacctgtatggccgaggtgatcggcgacgatctgcaggcgtttatcgccaacgccaaaaaagagggatttgttgacgaccgcatcgccattccttacgcccatacccccagctttatcggcagccatgtcaccggctgggacaatatgttcgaagggttcgcgaagacctttaccgctgactacgccgggcagccgggcaaacagcaaaagctcaatctggtgaccggatttgagacctatctcggcaacttccgcgtgctgaagcggatgatggcgcagatggatgtcccgtgcagcctgctctccgacccatcagaggtgctcgacacccccgccgacggccattaccggatgtacgccggcggcaccagccagcaggagatcaaaaccgcgccggacgccattgacaccctgctgctgcagccgtggcagctggtgaaaagcaaaaaggtggttcaggagatgtggaaccagcccgccaccgaggtggccgttccgctgggcctggccgccaccgacgcgctgctgatgaccgtcagtcagctgaccggcaaaccgatcgccgacgctctgaccctggagcgcggccggctggtcgacatgatgctggattcccacacctggctgcatggcaaaaaattcggcctctacggcgatccggatttcgtgatggggctgacgcgcttcctgctggagctgggctgcgagccgacggtgatcctcagtcataacgccaataaacgctggcaaaaagcgatgaagaaaatgctcgatgcctcgccgtacggtcaggaaagcgaagtgttcatcaactgcgacctgtggcacttccggtcgctgatgttcacccgtcagccggactttatgatcggtaactcctacggcaagtttatccagcgcgataccctggcaaagggcaaagccttcgaagtgccgctgatccgtctgggctttccgctgttcgaccgccatcatctgcaccgccagaccacctggggctatgaaggcgcaatgaacatcgtcacgacgctggtgaacgccgtgctggaaaaactggaccacgacaccagccagttgggcaaaaccgattacagcttcgacctcgttcgttaa 103 atgaccctgaatatgatgctcgataacgccgcgccggaggccatcgccggcgcgctgactcaacaacatccggggctgttttttaccatggtggaacaggcctcggtggccatctccctcaccgatgccagcgccaggatcatttacgccaacccggcgttttgccgccagaccggctattcgctggcgcaattgttaaaccagaacccgcgcctgctggccagcagccagacgccgcgcgagatctatcaggagatgtggcataccctgctccagcgtcagccctggcgcggtcagctgattaatcagcgtcgggacggcggcctgtacctggtggagattgacatcaccccggtgcttagcccgcaaggggaactggagcattatctggcgatgcagcgggatatcagcgtcagctacaccctcgaacagcggctgcgcaaccatatgaccctgatggaggcggtgctgaataatatccccgccgccgtggtagtggtggacgagcaggatcgggtggtgatggacaacctcgcctacaaaaccttctgcgctgactgcggcggccgggagctgctcaccgagctgcaggtctcccctggccggatgacgcccggcgtggaggcgatcctgccggtggcgctgcgcggggccgcgcgctggctgtcggtaacctgctggccgttgcccggcgtcagtgaagaggccagccgctactttatcgacagcgcgctggcgcggaccctggtggtgatcgccgactgtacccagcagcgtcagcagcaggagcaagggcgccttgaccggctgaagcagcaaatgaccgccggcaagctgctggcggcgatccgcgagtcgctggacgccgcgctgatccagctgaactgcccgattaatatgctggcggcagcccgtcggctgaacggcgagggaagcgggaatgtggcgctggaggccgcctggcgtgaaggggaagaggcgatggcgcggctccagcgctgtcgcccatcgctggaactcgaaaaccccgccgtctggccgctgcagccctttttcgacgatctgtgcgccctctaccgtacacgcttcgatcccgacgggctgcaggtcgacatggcctcaccgcatctgatcggctttggccagcgcaccccactgctggcgtgcttaagcctgtggctcgatcgcaccctggccctcgccgccgaactcccctccgtgccgctggcgatgcagctctacgccgaggagaacgacggctggctgtcgctgtatctgactgacaacgtaccgctgctgcaggtgcgctacgctcactcccccgacgcgctgaactcgccgggcaaaggcatggagctgcggctgatccagaccctggtggcgcaccatcgcggggccattgagctggcttcccgaccgcagggcggcacctgcctgaccctgcgtttcccgctgtttaacaccctgaccggaggtgaagcatga 104 atgatccctgaatccgacccggacaccaccgtcagacgcttcgacctctctcagcagttcaccgccatgcagcggataagcgtggtgctgagccgggccaccgaggccagcaaaacgctgcaggaggtgctcagcgtattacacaacgatgcctttatgcagcacgggatgatctgcctgtacgacagcgagcaggagatcctcagtatcgaagcgctgcagcaaaccggccagcagcccctccccggcagcacgcagatccgctatcgccccggcgagggactggtggggaccgtgctggcccaggggcagtcgctggtgctgccccgggtcgccgacgatcagcgttttctcgaccgcctgagcctctacgattacgatctgccgtttatcgccgtaccgttgatggggcccaacgcccggccaataggggtgctggcggcccagccgatggcgcgccaggaagagcggctgccggcctgcacccgttttctcgaaaccgtcgccaacctcgtcgcccagaccatccggctgatgatccttccggcctcacccgccctgtcgagccgccagccgccgaaggtggaacggccgccggcctgctcgtcgtcgcgcggcgtgggccttgacaatatggtcggcaagagcccggcgatgcgccagatcgtggaggtgatccgtcaggtttcgcgctgggacaccaccgtgctggtacgcggcgaaagcggcaccgggaaagagctgatcgccaacgccatccatcaccattcgccacgggctggcgccgccttcgtcaaatttaactgcgcggcgctgccggacaccctgctggaaagcgaactgttcggccatgagaaaggcgcctttaccggggcggtgcgtcagcgtaaaggacgttttgagctggcggatggcggcaccctgttcctcgatgagattggtgaaagcagcgcctcgttccaggccaagctgctgcgtatcctccaggagggggagatggagcgggtcggcggcgatgagaccctgcgggtgaatgtccgcatcatcgccgccaccaaccgtcacctggaggaggaggtccggctgggccatttccgcgaggatctctactatcgtctgaacgtgatgcccatcgccctgcccccgctgcgcgagcgtcaggaggacatcgccgagctggcgcacttcctggtgcgcaaaatcggccagcatcaggggcgcacgctgcggatcagcgagggcgcgatccgcctgctgatggagtacagctggccgggtaacgttcgcgaactggagaactgcctcgaacgatcggcggtgatgtcggagagtggcctgatcgatcgcgacgtgatcctcttcactcaccaggatcgtcccgccaaagccctgcctgccagcgggccagcggaagacagctggctggacaacagcctggacgaacgtcagcgactgatcgccgcgctggaaaaagccggctgggtgcaggccaaggcggcacggctgctggggatgacgccgcgccaggtcgcttatcggatccagatcatggatatcaccctgccgcgtctgtag 105 atgatgccgctttctccgcaattacagcagcactggcagacggtcgctgaccgtctgccagcggattttcccattgccgaactgagcccacaggccaggtcggtcatggcgttcagcgattttgtcgaacagagtgtgatcgcccagccgggctggctgaatgagcttgcggactcctcgccggaggcggaagagtggcggcattacgaggcctggctgcaggatcgcctgcaggccgtcactgacgaagcggggttgatgcgagagctgcgtctcttccgccgccagatgatggtccgcatcgcctgggcgcaggcgctgtcgctggtgagcgaagaagagactctgcagcagctgagcgtcctggcggagaccctgattgtcgccgcccgcgactggctgtacgccgcctgctgtaaggagtggggaacgccatgcaatgccgagggccagccgcagccgctgctgatcctcgggatgggaaagctgggcggcggcgagctgaacttctcttccgatatcgatctgatctttgcctggcctgagcatggcgccacccgcggcggccgccgcgagctggataacgcccagttctttacccgtctggggcagcggctgatcaaggcccttgaccagccgacgcaggacggctttgtctatcgggttgacatgcgcctgcggccgtttggcgacagtgggccgctggtactcagttttgcggcgctggaagattattaccaggagcagggtcgggactgggaacgctatgcgatggtgaaagcgcggatcatgggcgataacgacggcgtgtacgccagcgagttgcgcgcgatgctccgtcctttcgtcttccgccgttatatcgacttcagcgtgatccagtcgctgcgtaacatgaaaggcatgatcgcccgcgaagtgcggcgtcgcgggctgaaagacaacatcaagctcggcgccggcgggatccgtgaaattgagtttatcgttcaggtctttcaactgatccgcggtggtcgcgaacctgcactgcagcagcgcgccctgctgccgacgctggcggcgattgatgagctacatctgctgccggaaggcgacgcggcgctgctgcgcgaggcctatctgttcctgcgccggctggaaaacctgctgcaaagcatcaacgatgagcagacccagaccctgccgcaggatgaacttaaccgcgccaggctggcgtgggggatgcataccgaagactgggagacgctgagcgcgcagctggcgagccagatggccaacgtgcggcgagtgtttaatgaactgatcggcgatgatgaggatcagtccccggatgagcaactggccgagtactggcgcgagctgtggcaggatgcgctggaagaagatgacgccagcccggcgctggcgcatttaaacgataccgaccgccgtagcgtgctggcgctgattgccgattttcgtaaagagctggatcggcgcaccatcggcccgcgcggccgccaggtgctggatcagctgatgccgcatctgctgagcgaaatctgctcgcgcgccgatgcgccgctgcctctggcgcggatcacgccgctgttgaccgggatcgtcacccgtaccacctatcttgagctgctgagcgaattccccggcgcgctgaagcacctgatcacgctctgcgcggcgtcgccgatggtcgccagccagctggcgcgccacccgctgctgctggatgagctgctggatcccaacaccctctatcagccgacggcgaccgatgcctatcgcgacgagctgcgccagtacctgctgcgcgtgccggaagaggatgaagagcagcagctggaggcgttgcgccagtttaagcaggcgcagcagctgcatatcgcggcggcggatatcgctggtaccctgccggtgatgaaggtcagcgatcacttaacctggcttgccgaagcgatcctcgacgcggtggtgcagcaggcatgggggcagatggtcgctcgctacggccagccgacccacctgcacgatcgccagggtcgcggcttcgccgtcgtcggctacggtaagcttggcggctgggagctgggctacagctccgatctcgatctggtgttcctccatgactgcccggcggaggtgatgaccgacggcgagcgggagattgacggccgtcagttctacctgcggctggcccagcggatcatgcacctgttcagcacccgcacctcgtccggtattctctacgaagtggacgcccggctgcgtccttctggcgcggcggggatgctggtcaccaccgccgacgcgtttgctgactatcagcagaacgaagcctggacgtgggaacatcaggcgctggtgcgcgcccgcgtggtctatggcgacccggcgctgcaggcgcgctttgacgccattcgtcgcgatatcctgaccaccccgcgggaggggatgaccctgcagaccgaggttcgcgagatgcgcgagaagatgcgcgcccaccttggcaacaaacatcccgatcgttttgatatcaaagccgatgccggcgggatcaccgatattgaatttattactcagtatctggtcctacgctatgccagtgacaagccgaagctgacccgctggtctgacaacgtgcgtattcttgagctgctggcgcagaacgacatcatggacgaggaggaggcgcgcgccttaacgcatgcgtacaccaccttgcgtgatgcgctccatcacctggccctgcaggagcagccgggacacgtggcgccagaggccttcagccgggagcgtcagcaggtcagcgccagctggcagaagtggctgatggcttaa 106 agcgtcaggtaccggtcatgattcaccgtgcgattctcggttccctggagcgcttcattggcatcctgaccgaagagttcgctggcttcttcccaacctggattgcaccagtgcaggtagtggtcatgaatattaccgattctcaggctgaatacgttaacgaattgacgcgtaaactacaaaatgcgggcattcgtgtaaaagcagacttgagaaatgagaagattggctttaaaatccgcgagcacactttacgtcgtgtcccgtatatgttggtctgtggcgacaaagaagtcgaagccggcaaagtggccgtgcgcacccgtcgcgggaaagacctcggcagcatggacgtaagtgaagtgattgagaagctgcaacaagagattcgcagccgcagtcttcaacaactggaggaataaggtattaaaggcggaaaacgagttcaaacggcacgtccgaatcgtatcaatggcgagattcgcgccctggaagttcgc 107 atgaaaatggcaacaatgaaatcgggtctgggggcattagcccttcttccgggactggcaatggccgcgcccgcagtggcggacaaagccgataacgcgtttatgatgatttgcaccgcgctggttctgtttatgaccatcccggggatcgcgctgttttacggcggcctgatccgcggcaaaaacgtcctttccatgctgactcaggtgattgtgacctttggcctggtctgcgtactgtgggtgatttatggctataccctggccttcggcaccggcggcagcttcttcggtagttttgactgggtgatgctgaaaaatattgaactgaaagcgctgatgggcaccttctatcagtacatccacgtggccttccagggctcgttcgcctgtatcaccgtcgggctgatcgtgggggcgctggctgagcgtattcgtttctccgccgtgctgatttttgtggtggtgtggatgacgctctcttatgttccgattgcgcacatggtctggggcggcggtctgctggcgacccacggcgcgctggacttcgcgggcggcaccgttgtacacatcaacgccgcggttgccgggctggtgggtgcgtacatgatgggcaaacgtgtgggcttcggcaaagaagcgttcaaaccgcacaatctgccgatggtgttcaccggaaccgccatcctctacgtgggctggttcggcttcaacgccggctccgccagcgcagcgaacgaaattgccgcattggctttcgtcaacaccgtcgtcgccacagcggctgccatcctggcgtggacctttggcgaatgggccctgcgcggtaaaccttcactgctgggcgcctgctccggggcgattgccggtctggttggcgtcacaccagcctgtgggtatatcggtgtcggtggggcgttgattgtgggtatcgcatctggtctggcgggcatctggggcgtaacggcgctgaaacgctggctgcgggttgatgacccttgcgacgtcttcggcgtccacggcgtctgcggcatcgtcggctgtatcctgaccggtatcttcgcggccacctctctgggcggcgtgggttatgcagaaggcgtcaccatgggccatcagctgctggtgcaactcgagagtatcgcgattaccatcgtctggtcgggcgttgtcgctttcattggctacaaagtggcggacatgaccgtggggctgcgcgtaccagaagagcaggagcgcgaaggactggacgtcaacagccatggcgaaaacgcctacaacgcctga 108 cgccgtcctcgcagtaccattgcaaccgactttacagcaagaagtgattctggcacgcatggaacaaattcttgccagtcgggctttatccgatgacgaacgcgcacagcttttatatgagcgcggagtgttgtatgatagtctcggtctgagggcattagcgcgaaatgatttttcacaagcgctggcaatccgacccgatatgcctgaagtattcaattacttaggcatttacttaacgcaggcaggcaattttgatgctgcctatgaagcgtttgattctgtacttgagcttgatc 109 gctaaagttctcggctaatcgctgataacatttgacgcaatgcgcaataaaagggcatcatttgatgccctttttgcacgctttcataccagaacctggctcatcagtgattttttttgtcataatcattgctgagacaggctctgaagagggcgtttatacaccaaaccattcgagcggtagcgcgacggcaagtcagcgttctcctttgcaatagcagggaagaggcgccagaaccgccagcgttgaagcagtttgaacgcgttcagtgtataatccgaaacttaatttcggtttgga 110 gcccgctgaccgaccagaacttccaccttggactcggctatacccttggcgtgacggcgcgcgataactgggactacatccccattccggtgatcttaccattggcgtcaataggttacggtccggcgactttccagatgacctatattcccggcacctacaataacggtaacgtttacttcgcctgggctcgtatacagttttaattcgctaagtcttagcaataaatgagataagcggtgtgtcttgtggaaaaacaaggactaaagcgttacccactaaaaaagatagcgacttttatcactttttagcaaagttgcactggacaaaaggtaccacaattggtgtactgatactcgacacagcattagtgtcgatttttcatataaaggtaattttg 111 ttgaagagtttgatcatggctcagattgaacgctggcggcaggcctaacacatgcaagtcgagcggtagcacagagagcttgctctcgggtgacgagcggcggacgggtgagtaatgtctgggaaactgcctgatggagggggataactactggaaacggtagctaataccgcataacgtcgcaagaccaaagtgggggaccttcgggcctcatgccatcagatgtgcccagatgggattagctngtaggtggggtaacggctcacctaggcgacgatccctagctggtctgagaggatgaccagccacactggaactgagacacggtccagactcctacgggaggcagcagtggggaatattgcacaatgggcgcaagcctgatgcagccatgccgcgtgtgtgaagaaggccttcgggttgtaaagcactttcagcggggaggaaggcgntnaggttaataaccttgtcgattgacgttacccgcagaagaagcaccggctaactccgtgccagcagccgcggtaatacggagggtgcaagcgttaatcggaattactgggcgtaaagcgcacgcaggcggtctgtcaagtcggatgtgaaatccccgggctcaacctgggaactgcattcgaaactggcaggctagagtcttgtagaggggggtagaattccaggtgtagcggtgaaatgcgtagagatctggaggaataccggtggcgaaggcggccccctggacaaagactgacgctcaggtgcgaaagcgtggggagcaaacaggattagataccctggtagtccacgctgtaaacgatgtcgatttggaggttgtgcccttgaggcgtggcttccggagctaacgcgttaaatcgaccgcctggggagtacggccgcaaggttaaaactcaaatgaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgatgcaacgcgaagaaccttacctggtcttgacatccacagaactttccagagatggattggtgccttcgggaactgtgagacaggtgctgcatggctgtcgtcagctcgtgttgtgaaatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttatcctttgttgccagcggtnnggccgggaactcaaaggagactgccagtgataaactggaggaaggtggggatgacgtcaagtcatcatggcccttacgaccagggctacacacgtgctacaatggcatatacaaagagaagcgacctcgcgagagcaagcggacctcataaagtatgtcgtagtccggattggagtctgcaactcgactccatgaagtcggaatcgctagtaatcgtagatcagaatgctacggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccatgggagtgggttgcaaaagaagtaggtagcttaaccttcgggagggcgcttaccactttgtgattcatgactggggtgaagtcgtaacaaggtaaccgtaggggaacctgcggttggatcacctcctt 112 atgaccatgcgtcaatgcgctatctacggtaaaggcggtatcggtaaatccaccaccacccagaatctcgtcgcggccctcgccgagatgggtaagaaagtgatgatcgtcggctgcgatccgaaagcggactccacccgtctgatccttcacgctaaagcccagaacaccatcatggagatggcggcggaagtgggctcggtcgaggatctggagctcgaagacgttctgcaaatcggctatggcgatgtccgttgcgccgaatccggcggcccggagccaggcgtcggctgcgccggacgcggggtgatcaccgccatcaacttcctcgaggaagaaggcgcctatgaggaagatttggatttcgtcttctatgacgtcctcggcgacgtagtctgcggcggcttcgccatgccgatccgcgaaaacaaagcccaggagatctacatcgtctgctccggcgagatgatggcgatgtatgccgccaacaatatctccaaggggatcgtgaagtacgcgaaatctggcaaggtgcgcctcggcggcctgatctgtaactcgcgcaaaaccgaccgggaagacgaactgatcatcgccctggcggagaagcttggcacgcagatgatccacttcgttccccgcgacaacattgtgcagcgcgcggagatccgccggatgacggtgatcgagtacgacccgacctgtcagcaggcgaatgaatatcgtcaactggcgcagaagatcgtcaataacaccaaaaaagtggtgccaacgccgtgcaccatggacgagctggaatcgctgctgatggagttcggcatcatggaagaagaagacaccagcatcattggtaaaaccgccgctgaagaaaacgcggcctga 113 atgaccaacgcaacaggcgaacgtaaccttgcgctcatccaggaagtcctggaggtgtttcccgaaaccgcgcgcaaagagcgcagaaagcacatgatgatcagcgatccgcagatggagagcgtcggcaagtgcattatctcgaaccgtaaatcgcagcccggggtgatgaccgtgcgtggctgcgcctatgcgggctcgaaaggggtggtgtttgggccaatcaaagacatggcccatatctcgcacggccccatcggctgcggccagtactcgcgcgccggacggcgcaactactataccggcgtcagcggtgtcgacagcttcggcaccctgaacttcacctctgattttcaggagcgcgatattgttttcggcggcgataaaaagctgaccaaactgatcgaagagatggagctgctgttcccgctgaccaaagggatcaccatccagtcggagtgcccggtgggcctgatcggcgatgacatcagcgccgtggccaacgccagcagcaaggcgctggataaaccggtgatcccggtgcgctgcgaaggctttcgcggcgtatcgcaatcgctgggccaccatatcgccaacgacgtggtgcgcgactgggtgctgaacaatcgcgaagggcagccgtttgccagcaccccgtatgatgttgccatcattggcgattacaacatcggcggcgacgcctgggcctcgcgcattctgctggaagagatggggctgcgcgtagtggcgcagtggtccggcgacggcaccctggtggagatggagaacaccccattcgttaagcttaacctcgtccactgctaccgttcgatgaactatatcgcccgccatatggaggagaaacatcagatcccgtggatggaatataacttcttcggcccgaccaaaatcgccgaatcgctgcgcaagatcgccgatcaatttgatgacaccattcgcgccaatgcggaagcggtgatcgccaaatatgaggggcagatggcggccatcatcgccaaatatcgcccgcggctggaggggcgcaaagtgctgctgtacatgggggggctgcggccgcgccacgtcatcggcgcctatgaggatctcgggatggagatcatcgccgccggctacgagtttgcccataacgatgattacgaccgcaccctgccggacctgaaagagggcaccctgctgtttgacgatgccagcagctatgagctggaggccttcgtcaaagcgctgaaacctgacctcatcggctccgggatcaaagagaaatatatcttccagaaaatgggggtgccgttccgccagatgcactcctgggactattccggcccctatcacggctatgacggcttcgccatctttgcccgcgatatggatatgaccctgaacaatccggcgtggaacgaactgactgccccgtggctgaagtctgcgtga 114 atgaagggaaaggaaattctggcgctgctggacgaacccgcctgcgagcacaaccagaagcaaaaatccggctgcagcgctcctaagcccggcgcaaccgccggcggctgcgccttcgacggcgcgcagataacgctcctgcccatcgccgacgtcgcgcacctggtgcacggccccatcggctgcgcgggcagctcgtgggataaccgcggcagcgtcagcgccggcccggccctcaaccggctcggctttaccaccgatcttaacgaacaggatgtgattatgggccgcggcgaacgccgcctgttccacgccgtccgtcacatcgtcgaccgctatcatccggcggcggtctttatctacaacacctgcgtaccggcgatggagggggatgacctggaggccgtctgccaggccgcacagaccgccaccggcgtcccggtcatcgccattgacgccgccggtttctacggcagtaaaaatcttggcaaccgaatggcgggcgacgtgatgctcaggcaggtgattggccagcgcgaaccggccccgtggccagacaacacgccctttgccccggcccagcgccacgatatcggcctgattggcgaattcaatatcgccggcgagttctggcaggtccagccgctgctcgacgagctggggatccgcgtcctcggcagcctctccggcgacggccgctttgccgagatccagaccctgcaccgggcgcaggccaatatgctggtgtgctcgcgcgcgctgatcaacgtcgcccgggggctggagctgcgctacggcacgccgtggtttgaaggcagcttctacgggatccgcgccacctccgacgccttgcgccagctggcggcgctgctgggggatgacgacctgtgccgccgcaccgaggcgctgatcgcccgcgaagagcaggcggcggagcaggcgctggcgccgtggcgcgagcagctccgtgggcgcaaagtgttgctctacaccggcggcgtgaaatcctggtcggtggtatcagccctgcaggatctcggcatgaccgtggtggccaccggcacgcggaaatccaccgaggaggacaaacagcggatccgtgagctgatgggcgacgaggcggtgatgcttgaggagggcaatgcccgcaccctgctcgacgtggtgtaccgctatcaggccgacctgatgatcgccggcggacgcaatatgtacaccgcctggaaagcccggctgccgtttctcgatatcaatcaggagcgcgagcacgcctacgccggctatcagggcatcatcaccctcgcccgccagctctgtctgaccctcgccagtcccgtctggccgcaaacgcatacccgcgccccgtggcgctag 115 atggcagacattatccgcagtgaaaaaccgctggcggtgagcccgattaaaaccgggcaaccgctcggggcgatcctcgccagcctcgggctggcccaggccatcccgctggtccacggcgcccagggctgcagcgccttcgccaaagttttctttattcagcatttccatgacccggtgccgctgcagtcgacggccatggatccgaccgccacgatcatgggggccgacggcaatatcttcaccgcgctcgacaccctctgccagcgccacagcccgcaggccatcgtgctgctcagcaccggtctggcggaagcgcagggcagcgatatcgcccgggtggtgcgccagtttcgtgaggcgcatccgcgccataacggcgtggcgatcctcaccgtcaataccccggatttttttggctcgatggaaaacggctacagcgcggtgatcgagagcgtgatcgagcagtgggtcgcgccgacgccgcgtccggggcagcggccccggcgggtcaacctgctggtcagccacctctgttcgccaggggatatcgaatggctgggccgctgcgtggaggcctttggcctgcagccggtgatcctgccggacctctcgcagtcaatggatggccacctcggtgaaggggattttacgcccctgacccagggcggcgcctcgctgcgccagattgcccagatgggccagagtctgggcagcttcgccattggcgtgtcgctccagcgggcggcatcgctcctgacccaacgcagccgcggcgacgtgatcgccctgccgcatctgatgaccctcgaccattgcgatacctttatccatcagctggcgaagatgtccggacgccgcgtaccggcctggattgagcgccagcgcggccagctgcaggatgcgatgatcgactgccatatgtggcttcagggccagcgcatggcgatggcggcggagggcgacctgctggcggcgtggtgtgatttcgcccgcagccaggggatgcagcccggcccgctggtcgcccccaccagccaccccagcctgcgccagctgccggtcgatcaggtcgtgccgggggatcttgaggatctgcagcagctgctgagccaccaacccgccgatctgctggtggctaactctcacgcccgcgatctggcggagcagtttgccctgccgctgatccgcgtcggttttcccctcttcgaccggctcggtgagtttcgtcgcgtccgccaggggtacgccggtatgcgagatacgctgtttgagctggccaatctgctgcgcgaccgccatcaccacaccgccctctaccgctcgccgcttcgccagggcgccgaccccctgccggcttcaggagacgcttatgccgcccattaa 116 gtgccgctgatccgtctgggctttccgctgttcgaccgccatcatctgcaccgccagaccacctggggctatgaaggcgcaatgaacatcgtcacgacgctggtgaacgccgtgctggaaaaactggaccacgacaccagccagttgggcaaaaccgattacagcttcgacctcgttcgttaa 117 atgaccctgaatatgatgctcgataacgccgcaccggaggccatcgccggcgcgctgactcaacaacatccggggctgttttttaccatggtggaacaggcctcggtggccatatccctcaccgatgccagcgccaggatcatttacgccaacccagcgttttgccgccagaccggctattcgctggcgcaattgttaaaccagaacccgcgcctgctggccagcagccagacgccgcgcgcgatctatcaggagatgtggcataccctgctccagcgtcagccctggcgcggtcagctgattaatcagcgtcgggacggcggcctgtgcctggtggagattgacatcaccccggtgcttagcccgcaaggggaactggagcattatctggcgatgcagcgggatatcagcgtcagctacaccctcgaacaacggctgcgcaaccatatgaccctgatggaggcggtgctgaataatatccccgccgccgtggtggtggtggacgagcaggatcgggtggtgatggacaacctcgcctacaaaaccttctgcgctgactgcggcggccgggagctgctcaccgagctgcaggtctcccctggccggatgacgcccggcgtggaggcgatcctgccggtagcgctgcgcggggccgcgcgctggctgtcggtaacctgctggccgttgcccggcgtcagtgaagaggccagccgctactttatcgacagcgcgctggcgcggaccctggtggtgatcgccgactgtacccagcagcgtcagcagcaggagcaaggacgccttgaccggctgaagcagcaaatgaccgccggcaagctgctggcggcgatccgcgagtcgctggacgccgcgctgatccagctgaactgcccgattaatatgctggcggcagcccgtcggctgaacggcgagggaagcgggaatgtggcgctggaggccgcctggcgtgaaggggaagaggcgatggcgcggctccagcgctgtcgcccatcgctggaactcgaaaaccccgccgtctggccgctgcagccctttttcgacgatctgtgcgccctctaccgtacccgcttcgatcccgacgggctgcaggtcgacatggcctcaccgcatctgatcggctttggccagcgcaccccgctgctggcgtgcttaagcctgtggctcgaccgcaccctggccctcgccgccgaattgccctccgtgccgctggcgatgcagctctatgccgaggagaacgacggctggctgtcgctgtacctgactgataacgtaccgctgttgcaggtgcgctacgcccactcccccgacgcgctgaactcgccgggtaaaggcatggagctgcggctgatccagaccctggtggcgcaccatcgcggggccattgagctggcttcccgaccgcagggcggcacctgcctgaccctgcgtttcccgctgtttaacaccctgaccggaggtgaagcatga 118 atgatccctgaatccgacccggacaccaccgtcagacgcttcgacctctctcagcagttcaccgccatgcagcggataagcgtggtgctgagccgggccaccgaggccagcaaaacgctgcaggaggtactcactgtattgcacaacgatgcctttatgcagcacgggatgatctgcctgtacgacagcgagcaggagatcctcagtatcgaagcgctgcagcaaaccggccagcagcccctccccggcagcacgcagatccgctatcgccccggcgagggactggtggggaccgtgctggcccaggggcagtcgctggtgctgccccgggtcgccgacgatcagcgttttctcgaccgcctgagcctctacgattacgatctgccgtttatcgccgtaccgttgatggggcccaacgcccggccaataggggtgctggcggcccagccgatggcgcgccaggaagagcggctgccggcctgcacccgttttctcgaaaccgtcgccaacctcgtcgcccagaccatccggctgatgatccttccggcctcacccgccctgtcgagccgccagccgccgaaggtggaacggccgccggcctgctcgtcgtcgcgcggcgtgggccttgacaatatggtcggcaagagcccggcgatgcgccagatcgtggaggtgatccgtcaggtttcgcgctgggacaccaccgtgctggtgcgcggtgaaagcggcaccgggaaagagctgatcgccaacgccatccatcaccattcgccacgggctggcgccgccttcgtcaaatttaactgcgcggcgctgccggacaccctgctggaaagcgaactgttcggccatgagaaaggcgcctttaccggggcggtgcgtcagcgtaaaggacgttttgagctggcggatggcggcaccctgttcctcgatgagattggtgaaagcagcgcctcgttccaggccaagctgctgcgtatcctccaggagggggagatggagcgggtcggcggcgatgagaccctgcgggtgaatgtccgcatcatcgccgccaccaaccgtcacctggaggaggaggtccggctgggccatttccgcgaggatctctattatcgtctgaacgtgatgcccatcgccctgcccccgctgcgcgagcgtcaggaggacatcgccgagctggcgcacttcctggtgcgcaaaatcggccagcatcaggggcgcacgctgcggatcagcgagggcgcgatccgcctgctgatggagtacagctggccgggtaacgttcgcgaactggagaactgcctcgaacgatcggcggtgatgtcggagagtggcctgatcgatcgcgacgtgatcctcttcactcaccaggatcgtcccgccaaagccctgcctgccagcgggccagcggaagacagctggctggacaacagcctggacgaacgtcagcgactgatcgccgcgctggaaaaagccggctgggtgcaggccaaggcggcacggctgctggggatgacgccgcgccaggtcgcttaccggatccagatcatggatatcaccctgccgcgtctgtag 119 atgatgccgctttctccgcaattacagcagcactggcagacggtcgctgaccgtctgccagcggattttcccattgcagaactgagcccacaggccaggtcggtcatggcgttcagcgattttgtcgaacagagtgtgatcgcccagccgggctggctgaatgagcttgcggactcctcgccggaggcggaagagtggcggcattacgaggcctggctgcaggatcgcctgcaggccgtcactgacgaagcggggttgatgcgagagctgcgtctcttccgccgccagatgatggtccgcatcgcctgggcgcaggcgctgtcgctggtgagcgaagaagagaccctgcagcagctgagcgccctggcggagaccctgattgtcgccgcccgcgactggctctacgccgcctgctgtaaggagtggggaacgccatgcaatgccgagggccagccgcagccgctgctgatcctcgggatgggaaagctgggcggcggcgagctgaacttctcttccgatatcgatctgatctttgcctggcctgagcatggcgccacccgcggcggccgccgcgagctggataacgcccagttctttacccgtctggggcagcggctgatcaaggcccttgaccagccgacgcaggacggctttgtctatcgggttgacatgcgcctgcggccgtttggcgacagtgggccgctggtactcagctttgcggcactggaagattattaccaggagcagggtcgggactgggaacgctatgcgatggtgaaagcgcggatcatgggcgataacgacggcgtgtacgccagcgagttgcgcgcgatgctccgtcctttcgtcttccgccgttatatcgacttcagcgtgatccagtcgctgcgtaacatgaaaggcatgatcgcccgcgaagtgcggcgtcgcgggctgaaagacaacatcaagctcggcgccggcgggatccgtgaaattgagtttatcgttcaggtctttcagctgatccgcggtggtcgcgaacctgcactgcagcagcgcgccctgctgccgacgctggcggcgattgatgagctacatctgctgccggaaggcgacgcggcgctgctgcgcgaggcctatctgttcctgcgccggctggaaaacctgctgcaaagcatcaacgatgaacagacccagaccctgccgcaggatgaacttaaccgcgccaggctggcgtgggggatgcataccgaagactgggagacgctgagcgcgcagctggcgagccagatggccaacgtgcggcgagtgtttaatgaactgatcggcgatgatgaggatcagtccccggatgagcaactggccgagtactggcgcgagctgtggcaggatgcgctggaagaagatgacgccagcccggcgctggcgcatttaaacgataccgaccgccgtagcgtgctggcgctgattgccgattttcgtaaagagctggatcggcgcaccatcggcccgcgcggccgccaggtgctggatcagctgatgccgcatctgctgagcgaaatctgctcgcgtgccgatgcgccgctgcctctggcgcggatcacgccgctgttgaccgggatcgtcacccgtaccacctatcttgagctgctgagcgaattccccggcgcgctgaagcacctgatcacgctctgcgcggcgtcgccgatggtcgccagccagctggcgcgccacccgctgctgctggatgagctgctggatcccaacaccctctatcagccgacggcgaccgatgcctatcgcgacgagctgcgccagtacctgctgcgcgtgccggaagaggatgaagagcagcagctggaggcgttgcgccagtttaagcaggcgcagcagctgcatatcgcggcggcggatatcgctggtaccctgccggtgatgaaggtcagcgatcacttaacctggcttgccgaagcgatcctcgacgcggtggtgcagcaggcatgggggcagatggtcgctcgctacggtcagccgacccacctgcacgatcgccagggtcgcggcttcgccgttgtcggctacggtaagctcggcggctgggagctgggctacagctccgatctcgatctggtgttcctccatgactgcccggcggaggtgatgaccgacggcgagcgggagattgacggccgtcagttctacctgcggctggcccagcggatcatgcacctgttcagcacccgcacctcgtccggtattctctacgaagtggacgcccggctgcgtccttctggcgcggcggggatgctggtcaccaccgccgacgcgtttgctgactatcagcagaacgaagcctggacgtgggaacatcaggcgctggtgcgcgcccgcgtggtctatggcgacccggcgctgcaggcgcgctttgacgccattcgtcgcgatatcctgaccaccccgcgggaggggacgaccctgcagaccgaggttcgcgagatgcgcgagaagatgcgcgcccaccttggcaacaaacatcccgatcgttttgatatcaaagccgatgccggcgggatcaccgatattgaatttattactcagtatctggtcctacgctatgccagtgacaagccgaagctgacccgctggtctgacaacgtgcgtattcttgagctgctggcgcagaacgacatcatggacgaggaggaggcgcgcgccttaacgcatgcatacaccaccttgcgtgatgcgctccatcacctggccctgcaggagcagccgggacacgtggcgccagaggccttcagccgggagcgtcagcaggtcagcgccagctggcagaagtggctgatggcttaa 120 atgaaaatggcaacaatgaaatcgggtctgggggcattagcccttcttccgggactggcaatggccgcgcccgcagtggcggacaaagccgataacgcgtttatgatgatttgcaccgcgctggttctgtttatgaccatcccggggatcgcgctgttttacggcggcctgatccgcggcaaaaacgtcctttccatgctgactcaggtgattgtgacctttggcctggtctgcgtactgtgggtgatttatggctataccctggccttcggcaccggcggcagcttcttcggtagctttgactgggtgatgctgaaaaatattgaactgaaagcgctgatgggcaccttctatcagtacatccacgtggccttccagggctcgttcgcctgtatcaccgtcgggctgatcgtgggggcgctggctgagcgtattcgtttctccgccgtgctgattttcgtggtggtgtggatgacgctctcttatgttccgattgcgcacatggtctggggcggcggtctgctggcgacccacggcgcgctggacttcgcgggcggcaccgttgtacacatcaacgccgcggttgccgggctggtgggtgcgtatatgatgggcaaacgtgtgggcttcggcaaagaagcgttcaaaccgcacaatctgccgatggtgttcaccggaaccgccatcctctacgtgggctggttcggcttcaacgccggctccgccagcgcagcgaacgaaattgccgcactggctttcgtcaacaccgtcgtcgccacagcggcagccatcctggcctggacctttggcgaatgggctctgcgcggcaaaccttcactgctgggcgcctgctccggggcgattgccggtctggttggcgtcacaccagcctgtgggtatatcggtgtcggtggggcgttgattgtgggtatcgcatctggtctggcgggcatctggggcgtaacggcgctgaaacgctggctgcgggttgatgacccttgcgacgtcttcggcgtccacggcgtctgcggcatcgtcggctgtatcctgaccggtatcttcgcggccacctctctgggcggcgtgggttatgcagaaggcgtcaccatgggccatcagctgctggtgcaactcgagagtatcgcgattaccatcgtctggtcgggcgttgtcgctttcattggctacaaagtggcggacatgaccgtggggctgcgcgtaccagaagagcaggagcgcgaaggactggacgtcaacagccatggcgaaaacgcctacaacgcctga 121 ctgaagagtttgatcctggctcagattgaacgctagcgggatgccttacacatgcaagtcgaacggcagcacggacttcggtctggtggcgagtggcgaacgggtgagtaatgtatcggaacgtgcctagtagcgggggataactacgcgaaagcgtagctaataccgcatacgccctacgggggaaagcaggggatcgcaagaccttgcactattagagcggccgatatcggattagctagttggtggggtaanggctcaccaaggcgacgatccgtagctggtttgagaggacgaccagccacactgggactgagacacggcccagactcctacgggaggcagcagtggggaattttggacaatgggggaaaccctgatccagccatcccgcgtgtgcgatgaaggccttcgggttgtaaagcacttttggcaggaaagaaacgtcatgggntaataccccgtgaaactgacggtacctgcagaataagcaccggctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtagggtgcaagcgttaatcggaattactgggcgtaaagcgtgcgcaggcggttcggaaagaaagatgtgaaatcccagagcttaactttggaactgcatttttaactaccgggctagagtgtgtcagagggaggtggaattccgcgtgtagcagtgaaatgcgtagatatgcggaggaacaccgatggcgaaggcagcctcctgggataacactgacgctcatgcacgaaagcgtggggagcaaacaggattagataccctggtagtccacgccctaaacgatgtcaactagctgttggggccttcgggccttagtagcgcagctaacgcgtgaagttgaccgcctggggagtacggtcgcaagattaaaactcaaaggaattgacggggacccgcacaagcggtggatgatgtggattaattcgatgcaacgcgaaaaaccttacctacccttgacatgtctggaattctgaagagattcggaagtgctcgcaagagaaccggaacacaggtgctgcatggctgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttgtcattagttgctacgaaagggcactctaatgagactgccggtgacaaaccggaggaaggtggggatgacgtcaagtcctcatggcccttatgggtagggcttcacacgtcatacaatggtcgggacagagggtcgccaacccgcgagggggagccaatcccagaaacccgatcgtagtccggatcgcagtctgcaactcgactgcgtgaagtcggaatcgctagtaatcgcggatcagcatgtcgcggtgaatacgttcccgggtcttgtacacaccgcccgtcacaccatgggagtgggttttaccagaagtagttagcctaacc 122 ctgaagagtttgatcctggctcagattgaacgctagcgggatgccttacacatgcaagtcgaacggcagcacggacttcggtctggtggcgagtggcgaacgggtgagtaatgtatcggaacgtgcctagtagcgggggataactacgcgaaagcgtagctaataccgcatacgccctacgggggaaagcaggggatcgcaagaccttgcactattagagcggccgatatcggattagctagttggtggggtaanggctcaccaaggcgacgatccgtagctggtttgagaggacgaccagccacactgggactgagacacggcccagactcctacgggaggcagcagtggggaattttggacaatgggggaaaccctgatccagccatcccgcgtgtgcgatgaaggccttcgggttgtaaagcacttttggcaggaaagaaacgtcatgggttaataccccgtgaaactgacggtacctgcagaataagcaccggctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtagggtgcaagcgttaatcggaattactgggcgtaaagcgtgcgcaggcggttcggaaagaaagatgtgaaatcccagagcttaactttggaactgcatttttaactaccgggctagagtgtgtcagagggaggtggaattccgcgtgtagcagtgaaatgcgtagatatgcggaggaacaccgatggcgaaggcagcctcctgggataacactgacgctcatgcacgaaagcgtggggagcaaacaggattagataccctggtagtccacgccctaaacgatgtcaactagctgttggggccttcgggccttagtagcgcagctaacgcgtgaagttgaccgcctggggagtacggtcgcaagattaaaactcaaaggaattgacggggacccgcacaagcggtggatgatgtggattaattcgatgcaacgcgaaaaaccttacctacccttgacatgtctggaattcngaagagattnggaagtgctcgcaagagaaccggaacacaggtgctgcatggctgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttgtcattagttgctacgaaagggcactctaatgagactgccggtgacaaaccggaggaaggtggggatgacgtcaagtcctcatggcccttatgggtagggcttcacacgtcatacaatggtcgggacagagggtcgccaacccgcgagggggagccaatcccagaaacccgatcgtagtccggatcgcagtctgcaactcgactgcgtgaagtcggaatcgctagtaatcgcggatcagcatgtcgcggtgaatacgttcccgggtcttgtacacaccgcccgtcacaccatgggagtgggttttaccagaagtagttagcctaaccgnaaggggggcgattaccacggtaggattcatgactggggtgaagtcgtaacaaggtagccgtatcggaaggtgcggctggatcacctccttt 123 tacggagagtttgatcctggctcaggatgaacgctggcggcgtgcttaacacatgcaagtcgaacggtgaacacggagcttgctctgtgggatcagtggcgaacgggtgagtaacacgtgagcaacctgcccctgactctgggataagcgctggaaacggcgtctaatactggatatgtgacgtggccgcatggtctgcgtctggaaagaatttcggttggggatgggctcgcggcctatcagcttgttggtgaggtaatggctcaccaaggcgtcgacgggtagccggcctgagagggtgaccggccacactgggactgagacacggcccagactcctacgggaggcagcagtggggaatattgcacaatgggcgcaagcctgatgcagcaacgccgcgtgagggatgacggccttcgggttgtaaacctcttttagcagggaagaagcgaaagtgacggtacctgcagaaaaagcgccggctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtagggcgcaagcgttatccggaattattgggcgtaaagagctcgtaggcggtttgtcgcgtctgctgtgaaatccggaggctcaacctccggcctgcagtgggtacgggcagactagagtgcggtaggggagattggaattcctggtgtagcggtggaatgcgcagatatcaggaggaacaccgatggcgaaggcagatctctgggccgtaactgacgctgaggagcgaaagggtggggagcaaacaggcttagataccctggtagtccaccccgtaaacgttgggaactagttgtggggtccattccacggattccgtgacgcagctaacgcattaagttccccgcctggggagtacggccgcaaggctaaaactcaaaggaattgacggggacccgcacaagcggcggagcatgcggattaattcgatgcaacgcgaagaaccttaccaaggcttgacatatacgagaacgggccagaaatggtcaactctttggacactcgtaaacaggtggtgcatggttgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaaccctcgttctatgttgccagcacgtaatggtgggaactcatgggatactgccggggtcaactcggaggaaggtggggatgacgtcaaatcatcatgccccttatgtcttgggcttcacgcatgctacaatggccggtacaaagggctgcaataccgcgaggtggagcgaatcccaaaaagccggtcccagttcggattgaggtctgcaactcgacctcatgaagtcggagtcgctagtaatcgcagatcagcaacgctgcggtgaatacgttcccgggtcttgtacacaccgcccgtcaagtcatgaaagtcggtaacacctgaagccggtggcctaacccttgtggagggagccgtcgaaggtgggatcggtaattaggactaagtcgtaacaaggtagccgtaccggaaggtgcggctggatcacctccttt 124 attgaagagtttgatcatggctcagattgaacgctggcggcaggcctaacacatgcaagtcgaacggtagcacagagagcttgctctcgggtgacgagtggcggacgggtgagtaatgtctgggaaactgcccgatggagggggataactactggaaacggtagctaataccgcataatgtcgcaagaccaaagagggggaccttcgggcctcttgccatcggatgtgcccagatgggattagcttgttggtgaggtaatggctcaccaaggcgacgatccctagctggtctgagaggatgaccagccacactggaactgagacacggtccagactcctacgggaggcagcagtggggaatattgcacaatgggcgcaagcctgatgcagccatgccgcgtgtgtgaagaaggccttcgggttgtaaagcactttcagcggggaggaaggcgatncggttaataaccgtgttgattgacgttacccgcagaagaagcaccggctaactccgtgccagcagccgcggtaatacggagggtgcaagcgttaatcggaattactgggcgtaaagcgcacgcaggcggtctgtcaagtcggatgtgaaatccccgggctcaacctgggaactgcattcgaaactggcaggcttgagtcttgtagaggggggtagaattccaggtgtagcggtgaaatgcgtagagatctggaggaataccggtggcgaaggcggccccctggacaaagactgacgctcaggtgcgaaagcgtggggagcaaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacgatgtcgacttggaggttgtgcccttgaggcgtggcttccggagctaacgcgttaagtcgaccgcctggggagtacggccgcaaggttaaaactcaaatgaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgatgcaacgcgaagaaccttacctggtcttgacatccacggaattnggcagagatgccttagtgccttcgggaaccgtgagacaggtgctgcatggctgtcgtcagctcgtgttgtgaaatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttatcctttgttgccagcggtccggccgggaactcaaaggagactgccagtgataaactggaggaaggtggggatgacgtcaagtcatcatggcccttacgaccagggctacacacgtgctacaatggcatatacaaagagaagcgacctcgcgagagcaagcggacctcataaagtatgtcgtagtccggattggagtctgcaactcgactccatgaagtcggaatcgctagtaatcgtggatcagaatgccacggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccatgggagtgggttgcaaaagaagtaggtagcttaaccttcgggagggcgcttaccactttgtgattcatgactggggtgaagtcgtaacaaggtaaccgtaggggaacctgcggttggatcacctcctt 125 atgaccatgcgtcaatgcgccatttatggcaaaggtgggatcggcaaatccaccaccacgcaaaacctcgtcgccgctctcgcggaaatgggtaaaaaagtgatgatcgtcggctgcgacccgaaagcggactccacccgtctgatcctgcatgcgaaagcacagaacaccattatggagatggccgccgaagtgggttcagtggaagaccttgaactggaagatgtgctgcaaatcggttacggcggcgtgcgttgtgcagaatccggcggcccggagccaggcgtgggttgtgcaggccgcggcgttattaccgccattaacttccttgaagaagaaggcgcctatgtcagcgacctcgactttgtcttctatgacgtcctcggtgacgtggtctgcggcgggttcgccatgccgattcgtgaaaacaaagcgcaagagatctatatcgtctgctccggggaaatgatggcgatgtatgccgctaacaacatctccaaaggcatcgtgaaatacgctaaatccggcaaggtgcgcctgggcgggctgatttgtaactcccgtcagaccgaccgcgaagatgaactgatcatcgcgctggcagaaaaactgggcacccagatgattcactttgtgccacgcgacaacatcgtccagcgcgcggaaattcgccgtatgacggttatcgaatatgacccgaaatgcaaccaggccgacgaataccgcgcgctggcgaacaagatcgtcaacaacaccctgatggtcgtcccgaccccttgcaccatggatgaactggaagagctgctgatggaattcggcattatggatgtggaagacgccagcatcatcggtaaaaccgccgccgaagaaaacgcggcctga 126 atgaacgataacgatgtccttttctggcgcatgctggcgctatttcagtgtctgccggaactgcaacccgcgcagatcctggcctggctgacaggagaacgcgacgacgccttaaccccggcgtacctcgataagcttaacgtccgcgaactggaagcgaccttcccgtctgaaacggcgatgatgtcgcccgcacgctggagccgcgttaacgcgtgccttcacggtacgctgcccgcacacctgcaggtaaaaagcaccactcgtcaggggcaattacgggtagccttttgttcacaggatggattgctgatcaatggtcattttggtcaggggcggctgttttttatctacgcctttgatgaacagggcggatggctacacgcgttacgccgtcttccctcggccccgcaaacccaggagccgaatgaagttcgcgcgcagctcctgagtgattgccacctgctgttttgtgaagccattggcggccctgcggcggcccggctgattcgtcacaatatccacccgatgaaagtgtcgccagggatgtccattgccgcccagtgtgatgccattaccgcactgctgagcggacgtctgccaccgtggctggcaaaacgtcttgagaaagccaacccgctggaagagcgggtgttttaa 127 atgaagggaaatgacattctcgcgctgctggatgaacccgcctgcgaacacaatcacaaacagaaatccggctgtagcgcccctaaacccggtgccacggcgggcggttgcgcgttcgacggcgcgcaaatcaccctgttgccgctgtcggatgtggcgcacctggtccacggaccgattggctgcacgggaagctcctgggataaccggggcagtatgagctccggccccagtctcaaccggctcggctttaccaccgacctgaacgagcaggatgtcattatggggcgcggcgaacggcggcttttccacgcggtgcgtcatatcgtcaaccgttatcaccctgccgccgtgtttatctataacacctgcgttccggcgatggagggtgatgatattgacgccgtctgtcaggcggcggaaaccgccaccggcgtgccagtgattgccgttgatgccgccgggttctatggcagcaaaaaccttggcaaccgtctcgcgggtgaagtgatggttaacaaggtcattggacggcgcccgcccgccccctggccggacgatacccccttcgcgccggaacaccgccacgatatcggcctgattggcgaatttaatatcgccggggagttctggcacgttcagccgctgctcgatgagctgggtattcgcgtgctgggcagcctttccggggatggccgttttagtgaaatccagaccctgcaccacgcgcaggtcaatatgctggtctgctcaagagcgctgatcaatgttgcccgcaccctggaacagcgctatggcaccccctggtttgagggcagtttttacggcgtgcgcgctacctccgatgccctgcgtcaactggcatccctgcttggcgacagcgatctgattgcccgcaccgaagccgttattgcccgcgaagaagccacggcaaatcaggcgctcgccccgtggcgcgaacggctacagggtcgcaaagtgctgctctataccggtggggtgaaatcctggtcggtggtctccgcattgcaggatttagggatgaccgtcgtggcgactggcacccgcaaatctaccgaagaagataagcagcgtattcgcgaattaatgggcgatgacgcgctaatgctggaagaaggcaacgcccgcaccctgctggatgtggtgtaccgctatcaggcggatttgatgatcgctggggggcgtaacatgtataccgcgtacaaagcgcggctgccgtttctggatatcaaccaggagcgtgaacacgcctttgcgggttatcgcggcatcgtcaccctcgcccaacagctttgccagactattgaaagccccgtctggccgcaaacacacgcccgcgcgccgtggcaataa 128 atgagcaatgcaacaggcgaacgtaatctggaaattatccaggaagtgctggagatctttcccgaaaaaacgcgcaaagaacgcagaaagcacatgatggtgaccgacccggagatggaaagcgtcgggaaatgcatcatctctaaccgcaaatcgcagccgggtgtgatgactgtccgcggctgctcctacgccgggtcgaaaggcgtggtttttgggccgattaaagatatggcccacatctcccacggcccgatcggctgtgggcagtactcccgtgccgggcggcgcaactactacaccggggtcagcggcgttgattccttcgggacgctgaactttacctctgattttcaggagcgcgatatcgtcttcggcggcgataaaaagctcaccaaactgattgaggagatggaggaactgttcccgctgaccaaaggcatctccattcagtcggagtgcccggtaggtttaatcggtgacgatatcgaagcggtggcgaatgccagtaaaaaagcgctcaacaagccggtgatcccggtgcgttgcgaaggctttcgcggcgtgtcgcagtcgctcggtcaccatatcgccaacgacgttatccgcgactgggtgctggataaccgcgaagggaagcccttcgaatctaccccctatgacgtggccatcatcggcgattacaacatcgggggggatgcctgggcgtcgcgcattctgcttgaagagatggggttacgcgtggtggcgcagtggtccggtgacggcacgctggtagagatggaaaacaccccgttcgtcaagctgaacctggtgcactgctaccgctctatgaactacatctctcgccatatggaagagaaacacggtatcccgtggatggagtacaacttcttcggcccgaccaaaatcgccgaatcgctgcgtaagatcgccgatcaatttgacgacaccatccgcgccaatgcggaagcggtgatcgccaaatatcaggcgcaaaacgatgcgattatcgccaaataccgcccgcgtctcgaaggccgcaaggtgctgctctatatgggtggcctgcgtcctcgccacgtgattggcgcgtatgaggatttgggcatggagattgtcgccgccgggtatgaatttgcccataacgacgattacgaccgcaccctgccggacctcaaagagggcacgctgttgttcgacgatgccagcagttatgaactggaagccttcgtgaaggcgattaagccggacctcattggctcaggcatcaaggaaaaatacattttccagaaaatgggggtaccgtttcgccagatgcactcctgggattactccggcccgtatcacggctatgacggctttgccatctttgcccgcgatatggacatgacgctcaacaatcccgcctggggcgagttgaccgcaccctggctgaaatcagcctga 129 atggcagatatcatccgtaatcagaaaccgctggcggtaagcccggtaaaaagcggccagccgttaggcgccattctggcgagcctcggctttgagcacagtattccactggtgcacggtgcgcagggatgcagcgcgttcgccaaagtgttttttatccaacattttcatgaccctattccgctgcaatccacggcgatggaccccacctcaacggtcatgggggcggacggcaatatccttgccgcgctcaatacgctgtgccagcgcaacaccccgaaagctatcgtcctgttgagtaccggcctgtctgaggcgcagggcagcgatatcagccgcgtggtacgtcagtttcgtgaggattttccccgccacaaaaatatcgccctcctgacggtcaacaccccggatttttacggcacgctggagaacggctttagtgcggtggtggaaagcgtcatcgaacagtgggtgccggaaaagcctcagcatggcctgcgtaaccggcgggtcaacttgttgttaagtcacctgctgacgcccggtgatgttgagttgctgcgcagctacgtggaggcttttggcctgcaaccggtgatcgtgccggatctttcacagtcgctggatggtcacctggcaagcggtgatttttcgccggtcactcaggggggaacgcccctgcgcattatcgaacagatgggacagagcctgtgcacgtttgctattggcgtgtcgctgtcccgtgcggcatcgctgctggcacagcgtagccgtggcgaggtgatcgtgcttccccatctgatgaccatggaacattgcgaccgttttattcatcaactgaagatcatttccgggcgcgaggttcccgcctggattgagcgccagcgcggacaattgcaggatgcgatgatcgattgtcatatgtggttgcaggatacccggctcgcgctggccgccgagggcgatctgctggcgggctggtgtgatttcgcccgtagccagggcatgctccccggccccgttgtggcgccggtcagccagccgggcctgcaacagcttcccgtggagaaagtggtcattggcgatctggaagatatgcaggatttactctgcgctatgcctgctgacctgctggtcgccaactcccatgccgcagacctggccgaacaattctccatcccgctgatccgcgccgggttccctatcttcgacaggcttggcgaatttcgtcgcgtgcgtcagggataccccggcattcgcgacacgctgtttgagctggcgaacctgatgcgcgaacgtcatcaccacctgcccgtctaccgctcccccctgcgccagcaatttgcccaggacgctgacggaggccgctatgcaacatgttaa 130 atgagccaaactgctgagaaaattgtcacctgtcatccgctgtttgaacaggacgaataccagacgctgtttcgcaataagcgcggtctggaagaggcgcacgacccgcagcgcgtgcaagaggtttttgaatggaccaccacggcggagtatgaagcgctgaactttaagcgtgaagcgttaaccgtcgatccggcaaaggcctgccagcctttaggatcggtactctgctcgctgggttttgccaatacgctgccttatgtgcacggttcccagggctgtgtggcctatttccgcacctattttaaccgtcatttcaaagagccgatcgcttgcgtttccgactctatgacagaggatgcggcggtcttcggcggcaacaacaaccttaacaccgggttgcaaaatgccagcgccctgtacaaaccggaaattgtcgctgtctccactacctgtatggcggaggtcatcggcgatgacctgcaggcctttatcgccaacgccaaaaaggacgggtttattgatgccgccattccggtgccctacgcccatacgccaagttttatcggtagccacatcaccggctgggacaacatgtttgaaggtttcgcccgggcatttaccgccgatcacgtggcgcaaccgggcaaactggcgaagctaaacctggtgaccggttttgaaacctatcttggcaattaccgcgtgctcaaacgcatgatggcccagatggaggtgccctgtagcctgctgtctgacccgtctgaggtgttagatacgccagccgacggccactatcgcatgtatgcgggcggcacaacgcaacaagagatgcgcgacgcccccgatgctatcgacaccctgctgctgcaaccctggcatctggtgaagagtaaaaaagtggtgcaggagtcctggggccagcccgccacagaagtgtccatcccaatgggactgaccgggaccgacgaactgctgatggcagtcagtcagttaaccggcaaaccggtggccgatgaactgacgctggagcgtgggcgcctggtggatatgattctcgattcacacacctggctgcacggtaagaaattcggtctctacggcgatccggattttgtgatggggctgacgcgtttcctgctggaactgggctgcgagccgacggttatcctctgtcataacggtagcaagcgctggcagaaagcgatgaagaaaatgcttgaggcatcgccctacggtcaggagagcgaagtgttcatcaactgcgatctgtggcatttccgctcgctgatgtttacccgcaaaccggactttatgatcggcaactcgtacgccaaattcatccagcgtgacacgctggcgaaaggcgaacagtttgaagttccgctgatccgtcttggcttcccgttgttcgaccgccaccacctgcatcgccagaccacatggggttatgaaggggcgatgaatatcgtcaccaccctggtcaacgccgtgctggaaaaagtcgaccgcgataccatcaaactgggcaaaacggactacagcttcgaccttgtccgctaa 131 atgacctttaatatgatgctggagaccagcgcaccgcagcacattgcgggcaacctctcacttcaacatcccggactgttttccacgatggttgaacaggctccgatcgcgatttcgctgaccgacccggacgcgaggattctgtacgctaatccggccttttgtcgccagaccggttatagcctggaagagctgctcaaccagaaccatcgcatactggcaagccaacagacgccgcgcagcatttatcaggaactgtggcaaacgctgctgcaacagatgccctggcgcggtcagctcatcaatcgccgtcgggatggcagcctttatctggctgaggtcgatatcaccccggtcgtcaacaaacagggcgaactggaacactacctcgccatgcaacgtgatatcagcgccagctatgcgctcgaacagcgattgcgcaatcacaccaccatgagcgaggcggtgctgaacaacattcctgccgccgtggtggtggtcaacgagcaggaccaggtagtcatggacaacctcgcctacaaaaccttctgtgccgactgcggtggcaaggagctgctcaccgaactggatttctcccggcgcaaaagcgatctctatgccgggcaaatactgcctgtggtgctgcgcggcgccgtgcgctggctctctgtcacctgctggaccttgccgggggtgagcgaagaagccagccgctactttattgataccgcgctgccccgcaccctggtggtgatcaccgactgcacccagcaacaacaacaggccgaacagggccgtctcgatcgtctcaaacaggagatgaccaccgggaagctgctggccgcgatccgtgaatcgttggatgccgcgctggttcagctaaactgccccatcaatatgctggcggcggcgcgacgtctcaacggtgaagataaccataacgtggcgctggatgccgcgtggcgcgagggggaagaggcgctggcccgcctgcaacgctgccgcccttctctcgatctggaagagagcgcgctgtggcctctgcaaccgctgtttgacgacctgcgcgccctttaccatacccgctataacaatggcgaaaatctgcacgttgaaatggcctctccgcatctggcggggtttggtcagcgcacgcagatccttgcctgtctcagtttgtggctcgaccgtacgctggccctcgccgccgcgctaccggacagaacgctgcatacccagctttacgcccgtgaagaagatggctggctgtccatttggctgacagataatgtgccgctcatccatgtgcgatacgcccactcccccgatgccctgaacgcccccggcaaagggatggagctgcgattgattcaaaccctggttgcccatcatcgcggcgcaatagaactaactacccgccctgaaggcggtacctgcctgaccctgcgattcccgttatttcattcactgaccggaggcccacgatga 132 atgacccagcgacccgagtcgggcaccaccgtctggcgttttgatctctcacagcaatttaccgccatgcagcgcatcagcgtggtgttgagtcgcgcaaccgagataagccagacgctgcaggaggtgctgtgtgttctgcataatgacgcatttatgcaacacggcatgctgtgtctgtatgacaaccagcaggaaattctgagtattgaagccttgcaggaggcagaccaacatctgatccccggcagctcgcaaattcgctatcgccctggcgaagggctggtaggagccgtactgtcccagggacaatctcttgtgctgccgcgtgtcgccgacgatcaacgctttctcgacaggcttggcatctatgattacaacctgccgtttatcgccgtccccttaatggggccaggcgcgcagacgattggcgtgctcgccgcgcagccgatggcgcgtctggaggagcggcttccttcctgtacgcgctttctggaaaccgtcgccaatctggtcgcacagacagtccggctgatgaccccgcctgccgccgccacaccgcgcgccgcgattgcccagaccgaacgccagcgcaactgtggcactcctcgccccttcggctttgagaatatggtgggcaaaagcccggccatgcagcagacaatggacattatccgccaggtttcgcgctgggataccacggtactggtgcgcggcgaaagcggcaccggtaaagaacttatcgccaatgctattcatcacaactcccctcgcgccgccgcgccctttgtgaaatttaactgcgcggcgctaccggatacgctactggagagcgaattgttcggccatgaaaaaggggcgttcaccggcgcggttcgccagcgtaaaggacgttttgaactggccgatggcggcacactgtttcttgatgaaattggcgaaagcagcgcctcgttccaggccaaactgctgcgtattttgcaggagggtgaaatggagcgcgttggcggcgacgaaaccctgcgcgtcaatgtgcgtatcatcgccgccaccaaccggaatctggaagaagaggtgcggatgggcaatttccgcgaggatctctattatcgcctcaacgtaatgcccatctccctgcccccgctgcgtgaacgtcaggaggacattgccgagctggcgcactttctggtgcgcaaaatcgcccataaccaggggcgtacgctgcgcatcagtgatggcgccatccgtctgctgatgggttacaactggcccggtaacgtgcgtgagctggaaaattgcctggaacgttcggcagtgatgtcagaaaacggcctgatcgaccgcgatgtggtgctctttaaccaccgtgagaacacgccaaaactcgctatcgccgccgcgccaaaagaggatagctggcttgatcaaacgctggatgaacgtcaacggctgattgccgcgctggaaaaagccgggtgggtgcaggccaaagcggcgcgtctgctgggtatgacgccccgtcaggtcgcctatcggatacaaattatggatatcagcatgcccaggatgtga 133 atgatgccgcactctccacagctacagcagcactggcaaactgtactggcccgcttgcctgagtcattcagtgaaacaccgcttagtgaacaagcgcagttagtgcttactttcagtgattttgtgcaggatagccttgccgcgcatcctgactggctggctgagctggaaagcgcaccgccacaggcggacgagtggaagcagtatgcgcaaacccttcgcgaatcgctggaaggtgtgggagatgaggcatcattaatgcgtgcgctgcgcctgttccgtcgccatatgatggtgcgcattgcctgggcgcagtcgctggcgctggtggcagaagatgagacgttgcagcagttgagcgtactggcggagaccctgatcgtcgctgcacgcgactggctttacgatgcctgctgtcgcgagtggggaacgccgtgcaatcagcagggggaaccgcagccgttgctgatcctgggcatgggcaagctgggtggcggggagcttaacttttcgtccgatatcgatctgatttttgcctggccggaaaacggttcaacgcgcggtgggcgacgcgaacttgataacgcccagttttttactcgcttgggacagcgcctgatcaaagtgctcgaccagccgacgcaggatggctttgtctatcgcgtggatatgcggctgcgcccgtttggcgacagcggtccgctggtgctgagttttgccgcgctggaagattattatcaggagcaggggcgcgactgggaacgttatgcgatggtgaaagcccgcattatgggcgataaggacgatgtttacgctggcgaattacgggccatgctgcggccgttcgtcttccgtcgctatatcgatttcagcgttattcagtctctgcgtaacatgaaagggatgattgcccgcgaagtgcgccgccgtggtctgaaagataacattaagctgggcgcgggcggcatccgtgagattgagtttatcgttcaggtgttccagttgatacgcggtgggcgcgagccgtcgttgcagtcccgttcactgttaccgacgctggacgctatcgataagctgggtttgctgccgcctggcgatgcaccggcgttacgccaggcctatttgtatctgcgccgtctggaaaacctgctgcaaagcattaacgacgaacaaacgcagacgctgccgacagatgaactcaatcgcgcgcgtctggcctgggggatgcgggtcgcagactgggaaaccctgaccgctgagcttgaaaagcagatgtctgccgtacgagggatattcaacaccctgattggcgatgacgaagccgaagagcagggggatgcgctctgcgggcaatggagtgagttgtggcaggatgcgtttcaggaagatgacagcacgcctgtgctggcgcacctttctgacgatgatcgccgccgcgtggtcgcgatgattgctgattttcgcaaagagctggataaacgcaccattggcccacgcggccgccaggtgctcgaccatctgatgccgcatctgttgagtgatgtctgctcccgtgaggatgcccctgtaccgttgtctcgcgtgacgccgctgttaacgggaattgtcacgcgtacgacgtatcttgagctgctcagcgagtttcctggtgcgcgtaagcatctgatttcactctgtgccgcctcgccgatggtggccagtaagctggcgcgctatccgttattgctggatgagttgctcgatccgaataccctttatcagcccacggcgatgaatgcctaccgggatgagctacgtcagtatctgctgcgtgtgccggatgacgatgaagagcagcaactggaggcgttacgccagtttaaacaggctcaattgttgcgtgtggcggcagcagatctggcaggcacactccccgtgatgaaagtgagcgatcacttaacatggcttgccgaagccatcattgaagccgtggtacaacaggcgtggagcctgatggtatcgcgttatgggcagccgaaacacttacgcgaccgtgaaggccgtgggtttgcagtggtcggttacggcaaactgggcggttgggagctgggctatagttccgatctggatttgattttccttcatgactgtccggtggacgtgatgactgacggcgagcgggaaatcgatggccgccaattttatctgcgccttgcccagcgcgtgatgcacctgttcagtacgcgcacctcatccgggatcctgtatgaggtagacgcgcgcttgcgcccgtccggtgcggcgggaatgctggtgacctcaaccgaatcctttgccgactaccagcgcaccgaagcctggacctgggaacatcaggcgctggttcgcgcccgcgttgtctatggcgatccacaattaaacgcgcaatttgatgccatccgccgcgatatcaccatgaccgtgcgtaatggtgcaacgttacaaaccgaggtgcgcgagatgcgcgaaaaaatgcgcgcccacttgagcaataagcacaaggatcgctttgatattaaagccgatgagggtggaattaccgatatcgaatttatcacccagtatctggtgctgcgttatgcccatgccaaaccgaaactgacgcgctggtcggacaatgtccgcattctggaagggctggcgcaaaacggcattatggaagagcaggaagcgcaggcacttaccaccgcctatacaacgttgcgtgatgagctgcatcacctggcgctacaggagctgccaggacatgttccggaggcatgttttgtcgctgaacgcgcgatggtgcgagcctgctggaacaagtggttggtggagccgtgcgaggacgcgtaa 134 atgaagaaagcactattaaaagcgggtctggcctcgctggcattactgccgtgtctggctatggcagccgatccggttgtcgtcgataaagccgacaatgcctttatgatgatttgcaccgcgctggtgctgtttatgtcaattccgggcatcgccctgttctatggtggtttaatccgcggtaaaaacgtcctttctatgctgacacaggttgcggttacgttcgcactggtgtgcgtgctgtgggtggtttacggctactctctggcctttggcactggcggcagcttcttcggtagcttcgactgggtgatgctgaaaaatattgagctgaaagcgctgatgggcaccatctatcagtacattcacgttgcgttccagggctcgtttgcctgtattaccgtcggcctgattgtcggtgcgctggcagaacgtatccgtttctccgcagtactgattttcgtcgtggtatggctgacgctgtcctacgtgccgatcgcacacatggtctggggcggcggtctgctggcaacccatggcgccatggattttgcgggcggtacagtcgttcacatcaacgcagccgttgcaggcctggtgggtgcttacctgattggcaaacgtgtcggtttcggtaaagaagcgtttaaaccgcacaacctgccgatggtgtttaccggtacggcaatcctctactttggctggttcggattcaacgcgggttctgcaagcgcggcgaacgaaattgcgggtctggcttttgttaacaccgtcgtggcaacagcgggtgcaatcctctcctgggtcttcggtgagtgggcgctgcgcggcaaaccgtctctgttgggtgcctgttctggtgcgattgctggcctcgtgggtatcaccccggcgtgtggttacgttggtgtgggtggcgcgctgatcgtgggcatcgttgcaggcctggcgggtctgtggggcgttaccgcgctgaaacgctggctgcgtgttgacgacccgtgtgatgtcttcggtgttcacggcgtgtgcggtatcgtaggttgtatcatgacaggtatcttcgcagccacttcactgggcggcgtgggttatgccgaaggcgtgaccatgggccatcaggttctggtacaactggaaagtatcgccattactatcgtatggtctggtatcgtcgcctttatcggttacaaactggctgatatgacagtgggtctgcgtgttccggaagatcaggaacgcgaagggctggacgtcaacagccacggcgagaacgcctacaacgcctga 135 ctggggtcactggagcgctttatcggcatcctgaccgaagaatttgccggtttcttcccgacctggctggcccctgttcaggttgtggtgatgaatatcactgattctcaagctgaatatgtcaacgaattgacccgtaaattgcaaaatgcgggcattcgtgtaaaagcggacttgagaaacgagaagattggctttaaaatccgcgagcacactttacgtcgtgtcccttatatgttggtctgtggtgataaagaggtggaagcaggcaaagtggccgttcgcacccgccgcggtaaagacctgggcagcctggacgtaagtgaagtgattgagaagctgcaacaagagattcgcagccgcagtcttcaacaactggaggaataaggtattaaaggcggaaaacgagttcaaacggcacgtccgaatcgtatcaatggcgagattcgcgcccaggaagttcgcttaactggtctggaaggtgagcagctgggtatt 136 attgaagagtttgatcatggctcagattgaacgctggcggcaggcctaacacatgcaagtcgaacggtagcacagagagcttgctctcgggtgacgagtggcggacgggtgagtaatgtctgggaaactgcctgatggagggggataactactggaaacggtagctaataccgcataacgtcgcaagaccaaagagggggaccttcgggcctcttgccatcagatgtgcccagatgggattagctagtaggtggggtaacggctcacctaggcgacgatccctagctggtctgagaggatgaccagccacactggaactgagacacggtccagactcctacgggaggcagcagtggggaatattgcacaatgggcgcaagcctgatgcagccatgccgcgtgtatgaagaaggccttcgggttgtaaagtactttcagcggggaggaaggcganacggttaataaccgtgttgattgacgttacccgcagaagaagcaccggctaactccgtgccagcagccgcggtaatacggagggtgcaagcgttaatcggaattactgggcgtaaagcgcacgcaggcggtctgtcaagtcggatgtgaaatccccgggctcaacctgggaactgcatccgaaactggcaggcttgagtctcgtagagggaggtagaattccaggtgtagcggtgaaatgcgtagagatctggaggaataccggtggcgaaggcggcctcctggacgaagactgacgctcaggtgcgaaagcgtggggagcaaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacgatgtctatttggaggttgtgcccttgaggcgtggcttccggagctaacgcgttaaatagaccgcctggggagtacggccgcaaggttaaaactcaaatgaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgatgcaacgcgaagaaccttacctggtcttgacatccacagaacttgccagagatggcttggtgccttcgggaactgtgagacaggtgctgcatggctgtcgtcagctcgtgttgtgaaatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttatcctttgttgccagcggtccggccgggaactcaaaggagactgccagtgataaactggaggaaggtggggatgacgtcaagtcatcatggcccttacgaccagggctacacacgtgctacaatggcgcatacaaagagaagcgacctcgcgagagcaagcggacctcataaagtgcgtcgtagtccggattggagtctgcaactcgactccatgaagtcggaatcgctagtaatcgtggatcagaatgccacggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccatgggagtgggttgcaaaagaagtaggtagcttaaccttcgggagggcgcttaccactttgtgattcatgactggggtgaagtcgtaacaaggtaaccgtaggggaacctgcggttggatcacctcctt 137 atgaccatgcgtcaatgcgccatttacggcaaaggtgggatcggtaaatcgaccaccacacagaacctggtcgccgcgctggcggagatgggtaagaaagtcatgatcgtcggctgcgatccgaaagccgactccacgcgtttgatcctgcatgcgaaagcgcagaacaccattatggagatggccgccgaagtcggctccgtcgaagacctggaattagaagacgtgctgcaaatcggttacggcggcgtgcgctgcgcggaatccggtggcccggagccaggtgtgggttgtgccggtcgtggcgtgatcaccgcgattaacttcctcgaagaagaaggcgcttacgtgccggatctggattttgttttctacgacgtgctgggcgacgtggtatgcggtggtttcgccatgccgattcgtgaaaacaaagcgcaggagatctacatcgtttgctctggcgaaatgatggcgatgtacgccgccaataacatctccaaaggcatcgtgaaatatgccaaatccggtaaagtgcgcctcggcgggctgatttgtaactcgcgccagaccgaccgcgaagatgaactcatcattgcgctggcggaaaaactcggcacgcaaatgatccactttgttccccgcgacaacattgtgcagcgtgcggaaatccgccgtatgacggttatcgaatatgacccgacctgcaatcaggccaacgaatatcgcagccttgccagcaaaatcgtcaacaacaccaaaatggtggtaccaaccccctgcaccatggatgaactggaagaactgctgatggagttcggcattatggatgtggaagacgccagcatcattggtaaaaccgccgccgaagaaaacgccgtctga 138 atgagcaatgcaacaggcgaacgtaacctggaaatcatcgagcaggtgctggaggttttcccggaaaagacgcgcaaagagcgcagaaaacacatgatggtgacggacccggagcaggagagcgtcggcaagtgcatcatctctaaccgcaaatcgcagccgggcgtgatgaccgtgcgtggctgctcgtatgccggatcaaaaggggtggtatttgggccaatcaaagatatggcgcatatctcccacggcccgatcggctgcgggcagtactcccgcgccgggcggcgtaactactataccggcgtcagcggcgtggacagtttcggcacgctcaacttcacctccgatttccaggagcgcgacatcgtgtttggcggcgacaaaaagctcgccaaactgattgaagagctggaagaactgtttccgctgaccaaaggcatttcgattcagtcggaatgcccggtcggcctgattggcgatgatattgaagccgtggcgaacgccagccgcaaagcgatcaacaaaccggttattccggtgcgttgcgaaggctttcgcggcgtgtcgcaatccctcggtcaccatattgccaacgatgtgatccgcgactgggtactggataaccgcgaaggcaaaccgtttgaatccaccccttacgatgtggcgatcatcggcgattacaacatcggtggcgacgcctgggcctcgcgcattttgctcgaagagatggggttgcgggtggtcgcgcagtggtccggcgacggtacgctggtggagatggaaaacacgccgttcgtcaaactgaacctggtgcactgctaccgctcgatgaactacatctcgcgccatatggaggagaagcacggtattccgtggatggaatacaacttctttggcccgacgaaaatcgcggaatcgctgcgcaaaatcgccgacctgttcgacgacaccattcgcgccaacgccgaagcggtgatcgcccgataccaggcgcagaacgacgccattatcgccaaatatcgcccacgtctggagggtcgcaaagtgttgctctatatgggcgggctgcgtccgcgccatgtgattggcgcctatgaagatctgggaatggagatcatcgccgccggttatgagtttggtcataacgacgattacgaccgcaccctgccggatctgaaagagggcacgctgctgtttgatgacgccagcagctatgagctggaggcgtttgtcaacgcgctgaaaccggatctcatcggttccggcatcaaagagaagtacatctttcagaaaatgggcgtgccgtttcgccagatgcactcctgggattactccggcccgtaccacggctatgacggcttcgccatcttcgcccgcgatatggatatgacgctcaacaaccccgcctggggtcagttgaccgcgccgtggcttaaatccgcctga 139 atgaaggggaacgacatcctggctctgctcgatgaaccagcctgcgagcataaccataaacagaaaaccggctgtagcgcgccaaaacccggcgccaccgccggaggctgcgccttcgacggcgcacagatcaccctgctgccactttccgatgtggcgcatctggtacatggcccgattggctgcgccggcagctcatgggataaccgtggcagcctgagttctggcccgctgattaaccgactcggattcaccactgatttgaacgaacaggatgtcatcatggggcgcggcgagcggcggttgtttcacgcggtgcgccatattgtcgagcgctatcacccggcggcggtatttatttacaacacctgcgttccggctatggaaggcgatgacattgacgcggtctgccaggccgccgcgaccgccaccggtgtgcccgtgattgccgtagatgtggccggtttttacggtagcaaaaacctgggtaaccgcctcgcgggcgaggtgatggtgaaaaaagttatcggcgggcgcgaacccgcgccgtggccggacaatacaccttttgccccggcgcaccgccatgacataggcctgattggcgaatttaacatcgccggcgagttctggcatatccagccgctgcttgatgagctgggtattcgcgtccttggctccctttccggcgacgggcgctttgccgagatccagacgttgcaccgcgcgcaggtcaatatgctggtgtgctccagggcgctgattaatgtcgccagatcgcttgaacaacgttatggcacaccctggtttgaaggcagtttttatggcgttcgcgccacctccgatgccctgcgccagctggcaacactcaccggcgatagcgatttaatggcgcgaaccgaacggctgatcgcacgtgaagagcaagccacagaacaggcgctagcaccgctgcgtgaacggttacacggccggaaagtgctgctctataccggtggcgtgaaatcctggtcggtggtttcggcgctgcaggatctcggcatgacggtcgttgctaccggaacgcgcaaatccaccgaagaggataaacaacgcatccgtgaactgatgggcgatgacgccatcatgctggatgaaggcaatgcccgcgccttgctggatgtggtctatcgctacaaagccgacatgatgatcgcgggcgggcgcaacatgtacaccgcctataaagcgcgtctgccctttctggatatcaaccaggagcgtgaacacgcgtttgccggttatcgcggcatcatcacgcttgccgaacaactttgtcagacgctggaaagcccggtctggccgcaaacacatgcccgcgccccgtggcaataa 140 atgagccagactgctgagaaaatacagaattgccatcccctgtttgaacaggacgcctaccagacactatttgccggtaaacgggcactcgaagaggctcactcgccggagcgggtgcaggaagtgtttcaatggaccaccaccccggaatacgaagcgctgaacttcaaacgcgaagcgctgactatcgacccggcaaaagcctgccagccgctgggggcggtgctctgttcgctggggtttgccaacaccctgccgtatgtgcacggttcacagggttgtgtggcctatttccgtacgtactttaaccgccacttcaaagaaccggtggcctgcgtgtcggattcgatgacggaagacgcggccgtgttcggcgggaataacaacctcaacaccgggttacaaaacgccagcgcactgtataaaccggagattatcgccgtctctaccacctgtatggcggaagtgatcggtgatgatttacaggcgtttatcgccaacgccaaaaaagatggttttctcgatgccgccatccccgtgccctacgcccacacccccagttttatcggtagccatatcaccggctgggacaacatgtttgaaggttttgcccgtacctttaccgcaaaccatcagccacagcccggtaaactttcacgcctgaacctggtgaccgggtttgaaacctatctcggcaatttccgcgtgctgaaacgcatgatggaacaaatggaggtgcaggcgagtgtgctctccgatccgtcggaggtgctggacacccccgccaatggccattaccagatgtacgcgggcggtacgacgcagcaagagatgcgcgaggcaccggatgccatcgacaccctgctgctgcaaccgtggcagctggtgaaaagcaaaaaagtggtgcaggagatgtggaatcagcccgccaccgaggttgccattcccgtcgggctggcaggcacagacgaactgttgatggcgattagccagttaaccggcaaagccattcccgattcgctggcgctggagcgcgggcggctggtcgatatgatgctcgactcccacacctggttacacggtaaaaaattcggtctgtttggcgatccggattttgtcatgggattgacccgcttcctgctggaactgggctgtgaacctgccgtcatcctctgccataacggtaacaaacgctggcaaaaagcgatgaagaaaatgctcgatgcttcaccgtacggccaggagagcgaagtgtttatcaactgcgacttgtggcatttccgctcgctgatgttcacccgccagccggattttatgattggcaactcgtacgccaagtttattcagcgcgacaccttagccaagggcgaacagtttgaagtcccgctgatccgcctcggttttccgctgttcgaccgtcaccatctgcaccgccagaccacctggggctacgagggcgcgatgagcattctcacgacgctggtgaatgcggtactggagaaagtggacaaagagaccatcaagctcggcaaaaccgactacagcttcgatcttatccgttaa 141 atggctgatattgttcgtagtaaaaaaccgctggcggtgagcccgataaaaagcggccagccgctgggggcgatcctggcaagcctgggtttcgaacagtgcataccgctggtacacggcgctcaggggtgcagcgcgttcgcgaaagtgttctttattcaacattttcacgacccgatcccgctgcaatcgacggcgatggacccgacttccaccattatgggcgccgatgaaaacatttttaccgcgctcaatgttctctgccagcgcaacgccgcgaaagccatcgtgctgctcagcaccgggctgtcagaagcccagggcagcgatatttcacgagtggtgcgccagtttcgtgatgactttccgcggcataaaaacgtggcgctgctcaccgtcaacaccccggatttctacggctcgctggaaaacggctacagcgccgtgctggaaagcatgattgaacagtgggtgcccgcgcagcccgccgccagcctgcgcaaccgtcgcgtcaacctgctggtcagccatttactgacgccgggcgatatcgaactgttacgcagttatgtggaagcattcggtctgcaaccggtgattgtgccggatctatcgcagtcgctggacggacatctggccaacggtgatttttcgcccgtcacccaggggggaacaccgctgcgcatgattgaacagatggggcaaaacctggccacttttgtgattggccactcgctggggcgggcggcggcgttactggcgcagcgcagccgtggcgaggtgatcgccctgccgcatctgatgacgcttgatgcgtgcgacacctttatccatcgcctgaaaaccctctccgggcgcgacgtgcccgcgtggattgagcgccagcgcgggcaagtgcaggatgcgatgatcgattgccatatgtggttgcagggcgcggctatcgccatggccgcagaaggcgatcacctggcggcatggtgcgatttcgcccgcagccagggcatgatccccggcccggttgtcgcgccggtcagccagccggggttgcaaaatctgccggttgaaatggtggtcatcggcgatctggaagatatgcaggatcggctttgcgcgacgcccgccgcgttactggtggccaattctcatgccgccgatctcgccacgcagtttgatatgtcgcttatccgcgccgggtttccggtgtatgaccggctgggggaatttcgtcggctgcgccaggggtatagcggcattcgtgacacgctgtttgagctggcgaatgtgatgcgcgaacgccattgcccgcttgcaacctaccgctcgccgctgcgtcagcgcttcggcgacaacgttacgccaggagatcggtatgccgcatgttaa 142 atgaccctgaatatgatgatggatgccagcgcgcccgaggccatcgccggtgcgctttcgcaacaacatcctgggctgttttttaccatcgttgaagaagcccccgtcgctatttcactaaccgatgccgaggcacgtattgtctatgccaacccggcattctgccgccagaccggctatgagcttgaggagttgttgcagcaaaatccccgcctgcttgccagtcagcagaccccacgggaaatctaccaggatatgtggcacaccctgttacaacgtcgaccatggcgcgggcaattgatcaaccgccaccgtgacggcagcctttttctggttgagatcgatatcaccccggtgattaacccgtttggcgaactggaacactacctggccatgcagcgcgatatcagcgccggttatgcgctggagcagcggttgcgtaatcacatggcgctgaccgaagcggtgctgaataacattccggcggcggtggtcgtggtcgatgaacgcgatcgtgtggttatggataacctcgcctataaaactttctgtgctgattgcggcggaaaagagctactgagcgaactccatttttcagcccgtaaagcggagctggcaaacggccaggtcttaccggtggtgctgcgcggcgcggtgcgctggttgtcggtcacctgctgggcgctgccaggcgtcagcgaagaagccagtcgctactttattgataataccttgacgcgcacgctggtggtcatcaccgacgacacccagcagcgccagcagcaagagcaaggacggcttgaccgccttaaacagcagatgaccagcggcaaactgctggcggcgatccgcgaagcgcttgacgccgcgctgatccagcttaactgccccatcaatatgctggcggcggcgcggcgtttaaacggcagtgataacagcaacgtagcgctggacgccgcgtggcgcgaaggtgaagaagcgatggcgcggctgaaacggtgccgcccgtcgctggagctggaaagtgccgccgtctggccgctgcaacccttttttgacgacttgcgcgcgctttatcacacccgctacgagcagggtaaaaatttgcaggtcacgctggattcgacgcatctggtgggatttggtcagcgaacccaactgctggcctgcctgagtctgtggctcgatcgcacgctggatattgccgtcgggctgcgtgatttcaccgcccaaacgcagatttacgcccgggaagaagcgggctggctctcgttgtatatcactgacaatgtgccgttgattccgctgcgccatacccattcgccggatgcgcttaacgcaccgggaaaaggtatggagttgcggctgatccagacgctggtagcgcatcacaacggcgcgatagaactcacttcacgccccgaagggggaagctgcctgaccctacgattcccgctatttcattcactgaccggaggttcaaaatga 143 atgacccagcgaaccgagtcgggtaataccgtctggcgcttcgatttatcccagcagttcaccgcgatgcagcggataagcgtggttctcagccgggcgaccgaggttgaacagacactccagcaggtgctgtgcgtattgcacaatgacgcctttttgcagcacggcatgatctgtctgtacgacagccagcaggcgattttgactattgaagcgttgcaggaagccgatcagcagttgatccccggcagctcgcaaattcgctaccgtccgggtgaagggctggtcgggacggtgctttcgcaggggcaatcgttagtgctggcgcgtgtggctgacgatcagcgctttcttgaccgcctgggactgtatgattacaacctgccgtttatcgccgtgccgctgatagggccggatgcgcagacttttggcgtgctgacggcgcaaccgatggcgcgttacgaagagcggttacccgcctgcacccgctttctggaaacggtcgcgaatctggtggcgcagaccgtgcgtttgatgacgccgccggctgcacgcccttccccacgcgctgccatcacgccaaccgccagcccgaaatcgtgcagtacttcacgcgcgttcggcttcgaaaatatggtcggcaacagcccggcaatgcgccagaccatggagattatccgtcaggtttcgcgctgggataccaccgttctggtgcgcggcgagagcggcaccggcaaggaactgattgccaacgccatccatcacaattcgccgcgcgccagtgcgccatttgtgaaattcaactgtgcggcgctgccggacacattgcttgaaagcgaattatttggtcatgaaaaaggcgcctttaccggcgcggtacgccagcgtaaaggccgttttgagctggccgatggcggcacgctgtttcttgacgaaattggggaaagcagcgcctcgtttcaggctaagctgctgcgtattttgcaggagggcgaaatggaacgcgtcggtggtgacgagacattgcaagtgaatgtgcgcatcattgccgcgacgaaccgcaaccttgaagatgaagtacgcctgggacattttcgcgaagatctctattaccgcctgaatgtgatgcccatcgccctgccgccgctgcgcgaacgccaggacgacatcgccgaactggcacattttctggtgcgtaaaatcgcccacaaccagaaccgcacgctgcgcattagcgagggcgctatccgcctgctgatgagctacagctggcccggcaatgtgcgcgaactggaaaactgccttgagcgctctgcggtgatgtcggaaaacggtctgatcgatcgggacgtgattttatttaatcatcgcgaccagccagccaaaccgccggttatcagcgtcacgcccgacgataactggctcgataacacccttgacgagcgccagcggctgattgccgcgctggaaaaagcgggatgggtacaagccaaagccgcccgcttgctggggatgacgccgcgccaggtcgcttatcgtattcagaccatggatatcaccctgccaaggctataa 144 atgccgcaccacgcaggattgtcgcagcactggcaaacggttttttctcgtctgccggaagcgctcaccgcgcaaccattgagcgcgcaggcgcagtcagtgctcacttttagtgattttgttcaggacagcatcatcgtgcatcctgagtggctggcagagcttgaaagcgcaccgccgccagcgaacgagtggcaacactacgcgcaatggctgcaagcggcgctggagggcgtcaccgatgaaacctcgctgatgcgcacgctgcggctgtttcgccgtcgcattatggtgcgcatcgcctggagtcaggcgctacagttggtggcggaagaggatatcctgcaacagctcagcgtgctggcggaaactctgatcgtcgccgcgcgcgactggctctatgacgcctgctgccgtgagtggggaacgccgtgcaatccgcaaggcgtcgcgcagccgatgctggtgctcggcatgggcaaacttggcggcggcgaactcaatttctcatccgatatcgatttgatttttgcctggccggaaaatggcaccacgcgcggcggacgccgtgaactggataacgcgcagttttttacccgccttggtcaacggctaattaaagtcctcgaccagcccacgcaggatggctttgtctaccgcgtcgatatgcgcttgcgtccctttggcgacagcggcccgctggtgctgagttttgccgcgctggaagattactaccaggagcaggggcgcgactgggaacgatacgcgatggtgaaagcgcgcattatgggggacaacgacggcgaccatgcgcgagagttgcgcgccatgctgcgcccgttcgttttccgccgctatatcgacttcagcgtgatccagtctctgcgcaacatgaaaggcatgattgcccgcgaagtgcggcgtcgcggcctgaaggacaacataaaactcggcgcgggcggtattcgcgaaatagagtttatcgtgcaggttttccagttgattcgcggcggtcgcgagcctgcgctgcaatcgcgttcgctgttgccgacgcttgctgccattgatcaactacatctgctgccggatggtgatgcaccccggctgcgcgaggcgtatttgtggctgcgacggctggaaaacttgctgcaaagcattaatgacgaacagacacagacgctgccggccgatgatttgaatcgcgcgcgcctcgcctggggaatgggcaaagagagctgggaagcgctctgcgaaacgctggaagcgcatatgtcggcggtgcggcagattttcaacgatctgattggcgatgatgaaacggattcgccggaagatgcgctttctgagggctggcgcgaattgtggcaggatgcgttgcaggaagaggactctacgcccgtgctggcgcatctttccgaggacgatcgccgccgcgtggtggcgctgattgctgattttcgcaaagagctggataaacgcaccattggcccgcgcgggcgacaggtactcgatcacttaatgccgcatctgctcagcgatgtatgctcgcgtgacgatgcgccagtgccgctgtcgcgtctgacgccgctgctcaccggtattattacgcgcaccacttaccttgagctgctgagtgaattccccggtgcgctgaaacacctcatttccctgtgcgccgcgtcgccgatggtggccagccaactggcgcgctacccgatcctgctcgatgaactgctcgacccgaacacgctctatcaaccgacggcgatgaacgcctatcgcgatgaactgcgacaatacctgttgcgcgtgccggaagaggatgaagagcagcaactggaggcgctacggcagtttaagcaggcgcagttgttgcgcgtagcggcggcggatatcgccggtacgttacccgtcatgaaagtgagcgatcacttaacctggctggcggaagcgattatcgatgcggtggtgcagcaagcctggaaccagatggtggcgcgttacggccagccgacgcatctgcacgatcgcgaagggcgcggtttcgccgtggtcggttacggcaaacttggcggctgggaattaggttacagctccgatctggatctggtgttcctgcacgactgccccatggatgtgatgaccgatggcgagcgtgaaatcgatggccgccagttctatttgcgcctcgcgcagcgcgtgatgcacctgttcagcacgcgcacgtcgtccggcattctttatgaagtcgatgcgcgtttgcgcccgtccggcgcggccggaatgctggtgaccactgcggaagcgttcgccgattatcaaaaaaatgaagcctggacatgggagcatcaggcgctggcgcgtgcgcgcgtggtgtacggcgatccgcaactgaccgccgaatttgacgccattcgccgcgatatcctgatgacctcccgcgatgccgctaccctgcaaaccgaagtgcgggaaatgcgtgagaaaatgcgcgcccatcttggtaacaagcacaaagaccgtttcgatctgaaagccgatgaaggcggtatcaccgatattgagtttatcgctcagtatctggtgctgcgctttgcccatgagaagccgaaactgacgcgctggtcggataatgtgcgcatcctcgaagggctggcgcaaaacggcatcatggatgagcaggaagcgcaggcattgacgctggcgtacaccacgttgcgtgatgagctgcaccacctggcgctgcaagagctgccaggacatgtggcgctctcctgttttgtcgccgagcgtgcgcttatcaaaaccagctgggacaagtggctggtggaaccgtgcgccccggcgtaa 145 atgaaaaacacaacattaaaaacggctcttgcttcgctggcgttgctgccaggcctggcgatggcggctcccgctgtggcggataaagccgacaacggctttatgatgatttgcaccgcgctggtgctgtttatgaccattccgggcattgcgctgttctacggcggtttgatccgcggtaaaaacgtgctgtcgatgctgacgcaggttgccgtcaccttcgctctggtgtgcatcctgtgggtggtttacggctactctctggcatttggcgagggcaacagcttcttcggcagtttcaactgggcgatgttgaaaaacatcgaattgaaagccgtgatgggcagcatttatcagtacatccacgtggcgttccagggctcctttgcttgtatcaccgttggcctgattgtcggtgcgctggctgagcgtattcgcttctctgcggtgctgatttttgtggtggtatggctgacgctttcttatgtgccgattgcgcacatggtctggggtggcggtctgctggcaacccacggcgcgctggatttcgcgggcggtacggttgttcacatcaacgccgcgatcgcaggtctggtgggggcttacctgattggcaaacgcgtgggctttggcaaagaagcgttcaaaccgcataacctgccgatggtcttcaccggcaccgcgatcctctatgttggctggtttggcttcaacgccggctctgcaagctcggcgaacgaaatcgctgcgctggctttcgtgaacacggttgttgccactgcggccgctattctggcgtgggtatttggcgagtgggcaatgcgcggtaagccgtctctgctcggtgcctgttctggtgccatcgcgggtctggttggtatcaccccggcgtgcggttatgtgggtgtcggcggcgcgctgattgtgggtctgattgccggtctggcagggctgtggggcgttactgcactgaaacgtatgttgcgtgttgatgacccatgcgatgtcttcggtgtgcacggcgtgtgcggcatcgtgggttgtatcctgaccggtatcttcgcgtctacgtcgctgggcggtgtcggtttcgctgaaggggtgaccatgggccatcaggtactggtacagctggaaagcgttgccatcactatcgtgtggtctggcgtggtggcctttatcggttacaaactggcggatatgacggtaggcctgcgcgtaccggaagagcaagagcgtgaagggctggatgtgaacagccacggcgaaaatgcgtataacgcctga 146 ttcttggttctctggagcgctttatcggcatcctgactgaagaatttgcaggcttcttcccaacctggcttgcacccgtgcaggtagttgtgatgaacatcactgattcgcaggctgaatacgttaacgaattgacccgtaaactgcaaaatgcgggcattcgtgtaaaagcagacttgagaaacgagaagattggctttaaaatccgcgagcacactttacgtcgtgtcccttatatgctggtttgtggtgacaaagaggtcgaagccggcaaagttgctgtgcgtacccgtcgcggtaaagacctgggtagcctggacgtaaatgatgttatcgagaagctgcaacaagagattcgcagccgcagtcttcaacaactggaggaataaggtattaaaggcggaaaacgagttcaaacggcgcgtcccaatcgtattaatggcgagattcgcgccacggaagttcgcttaacaggtctggaaggcgagcagcttggtatt 147 cgttctgtaataataaccggacaattcggactgattaaaaaagcgccctcgcggcgctttttttatattctcgactccatttaaaataaaaaatccaatcggatttcactatttaaactggccattatctaagatgaatccgatggaagctcgctgttttaacacgcgttttttaaccttttattgaaagtcggtgcttctttgagcgaacgatcaaatttaagtggattcccatcaaaaaaatattctcaacctaaaaaagtttgtgtaatacttgtaacgctacatggagattaactcaatctagagggtattaataatgaatcgtactaaactggtactgggcgc 148 cgcgtcaggttgaacgtaaaaaagtcggtctgcgcaaagcacgtcgtcgtccgcagttctccaaacgttaattggtttctgcttcggcagaacgattggcgaaaaaacccggtgcgaaccgggtttttttatggataaagatcgtgttatccacagcaatccattgattatctcttctttttcagcatttccagaatcccctcaccacaaagcccgcaaaatctggtaaactatcatccaattttctgcccaaatggctgggattgttcattttttgtttgccttacaacgagagtgacagtacgcgcgggtagttaactcaacatctgaccggtcgat 149 ttgaagagtttgatcatggctcagattgaacgctggcggcaggcctaacacatgcaagtcgngcggaagcacaggagagcttgctctctgggtgacgagcggcggacgggtgagtaatgtctgggaaactgcctgatggagggggataactactggaaacggtagctaataccgcataacgtcgcaagaccaaagagggggaccttcgggcctcttgccatcagatgtgcccagatgggattagctagtaggtggggtaacggcncacctaggcgacgatccctagctggtctgagaggatgaccagccacactggaactgagacacggtccagactcctacgggaggcagcagtggggaatattgcacaatgggcgcaagcctgatgcagccatgccgcgtgtatgaagaaggccttcgggttgtaaagtactttcagcggggaggaaggtgttgnggttaataaccncagcaattgacgttacccgcagaagaagcaccggctaactccgtgccagcagccgcggtaatacggaggntgcaagcgttanncggaatnantgggcgtaaagcgtncgcaggcggtntgtnaagtcggatgtgaaatccccgggctcaacctgggaactgcattcgaaactggcaggctagagtnnngtagaggngggtagaattccnggtgtagcggtgaaatgcgtagagatcnggangaanaccngtggcgaaggcggcccnctggacaaagactgacgctnaggngcgaaagcgtggggagcaaacaggattagataccctngtagtccacgccgtaaacgatgtcgacttggaggttgtgcccttgaggcgtggcttccggagctaacgcgttaagtcgaccgcctggggagtacggccgcaaggttaaaactcaaatgaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgatgcaacgcgaagaaccttacctactcttgacatccagagaacttnncagagatgnnttggtgccttcgggaactctgagacaggtgctgcatggctgtcgtcagctcgtgttgtgaaatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttatcctttgttgccagcggtncggccgggaactcaaaggagactgccagtgataaactggaggaaggtggggatgacgtcaagtcatcatggcccttacgagtagggctacacacgtgctacaatggcgcatacaaagagaagcgacctcgcgagagcaagcggacctcataaagtgcgtcgtagtccggattggagtctgcaactcgactccatgaagtcggaatcgctagtaatcgtagatcagaatgctacggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccatgggagtgggttgcaaaagaagtaggtagcttaaccttcgggagggcgcttaccactttgtgattcatgactggggtgaagtcgtaacaaggtaaccgtaggggaacctgcggttggatcacctcctt 150 atgaccatgcgtcaatgtgccatttacggcaaaggtggtatcggtaaatccactaccacgcaaaacctggtcgccgcgctggcggagatgggcaagaaagtaatgatcgtcggctgcgacccgaaagcagactccactcgtctgatcctgcatgcgaaagcgcagaacaccattatggagatggcggctgaagtcggctccgtggaagaccttgaactggaagatgtgctgcaaatcggttacggcgacgtacgctgcgcagaatccggcggcccggaaccaggcgttggctgtgctggtcgcggggtaattaccgccatcaacttcctggaagaagaaggcgcctatgttcccgacctcgatttcgtcttttacgacgtgttgggcgacgtggtgtgcggggggttcgccatgccgattcgcgaaaacaaagcgcaggagatctacatcgtctgctccggcgaaatgatggcgatgtacgccgccaacaacatctctaaaggcatcgtgaaatacgccaaatccggcaaagtgcgccttggcgggctgatctgtaactcccgtcagaccgaccgcgaagatgagctgatcatagcgctggcggaaaaactcggcacccagatgatccacttcgtgccgcgcgacaacatcgtgcaacgcgctgaaatccgccgtatgacggtgattgagtacgatccgaaatgcaaccaggccaatgaataccgcacgctggcgaacaagatcgtcaacaacaccaaaatggtcgtgccaacgcccatcaccatggacgaactggaagagctgttgatggaattcggcattatggatgtggaagacaccagcattatcggtaaaaccgccgcagaagaaaacgcggtttga 151 atgagcaatgcaacaggcgaacgtaatctggagatcatccaggaagtgctggagatctttccggaaaaaacgcgcaaagaacgcagaaagcacatgatggtgagcgacccggagatggaaagcgtcgggaaatgcatcatctccaaccgtaagtcgcagcccggcgtaatgaccgtgcgcggttgctcttacgccggttctaaaggggtggtattcgggccgatcaaagatatggcccatatttcccacggcccggtcggctgcggtcagtactcccgcgccgggcggcgtaactactacaccggcgtcagcggtgtggatagcttcggtacgctcaactttacctccgattttcaggagcgcgatatcgtgtttggcggcgataaaaagctgaccaaactgattgaagagatggagacgctgttcccgctgaccaaagggatctccattcagtccgaatgcccggtcggcctgattggcgacgacattgaagccgttgccaacgccagccgcaaagccatcaataaaccggtcattccggtgcgctgcgaaggttttcgcggcgtttcccagtcactcggtcaccacattgccaacgacgtgatccgcgactgggtactggataaccgcgaaggcaagccgtttgaggccggtccttatgacgtggcgatcatcggcgattacaacatcggcggcgatgcctgggcgtcgcgcattttgctcgaagagatgggcctgcgcgtggtggcgcagtggtccggcgacggcacgctggttgagatggagaacacgccgttcgtcaaactcaaccttgtgcactgctaccgctcaatgaactatatctcccgccatatggaggagaaacacggtattccgtggatggagtacaacttcttcggtccgaccaaagtcgccgaatcgttgcgcaaaatcgccgatatgtttgatgacaccattcgcgccaacgccgaagcggtgatcgccaaatatcaggcgcagaacgacgccatcatcgccaaataccgtccgcgtctggaaggccgcaaagtgctgctgtatatgggcggtttacgtcctcgccatgtgattggcgcttatgaagatctggggatggaaattatcgctgcgggttatgaattcgcccacaacgatgactacgaccgcaccctgccggatctgaaagaaggcaccttgctgttcgacgatgccagcagttatgaactggaagcctttgtcaaagcgctgaagccggatctgatcggctccggcattaaagagaagtacatcttccagaaaatgggcgtgccgtttcgccagatgcactcctgggattactccggcccctatcacggttatgacggctttgccatcttcgcccgcgatatggatatgacgatcaacaaccccgcgtggggccagttgaccgcgccgtggctgaaatccgcctga 152 atgggacgcggcgagcgccgcctgttccatgccgtgcgccacatcgtcaaccgctaccacccggccgccgtctttatctataacacctgcgttcccgcgatggagggcgacgatatcgaagccgtctgccaggcggcagaaaccgccatcggcgtaccggtgattgccgttgatgtcgccgggttttacggcagcaaaaatctcggcaaccggttggccggtgaagtgatggtgaaaaaggtgattggcgggcgtgaacccgcgccgtggccggaagataccccttttgccccggcgcaccgccacgatatcgggctgattggcgaattcaatattgccggagagttctggcatattcagccgctgctcgatgagctgggtattcgcgtgctcggcagcctctccggcgacgggcgcttcagtgaaatccagacgctgcaccgggcgcaggtcaatatgctggtctgctccagggcgctgatcaacgtcgcccgctcgctggagcagcgctacggcacgccgtggtttgaaggcagtttttatggtgttcgcgccacctctgacgccctgcgccaactggcggcgctgaccggagaccgcgatctgatgcagcgcaccgaacagctcattgcccgcgaagagcagcaaacagagcaggcgctggccccgctgcgcgagcgcctgcgcgggcgcaaagcgctgctctatnccggcggcgtgaaatcctggtcggtggtttcggcgcttcaggatctgggcatggaagtggtggcgaccggcacgcgcaaatccaccgaagaggataaacagcgcatccgcgaactgatgggcgccgacgcgctgatgcttgatgaaggtaacgcccgctcgctgctggacgtggtttaccgctacaaggcggacatgatgatcgccgggggacgcaatatgtacaccgcctacaaagcgcggctgccgttcctcgatatcaatcaggagcgcgagcacgcctttgccggctaccgcggcattgtcaccctggccgaacagctctgcctgaccatggaaagcccggtctggccgcaaacccattcccgcgcaccgtggcaataa 153 atgatggagcaaatggacgtgccgtgcagcctgctttccgatccctccgaagtgctggataccccggctgacgggcattaccacatgtatgcgggcggtacgacccagcaggagatgcgcgaagcgcctgacgctatcgacaccctgctgctgcaaccctggcaactggtgaaaaccaaaaaagtggtgcaggaaagctggaaccagcccgctaccgaggtgcaaatcccaatggggctggccggaaccgacgagctgctgatgacggtaagccagttaaccggcaaagccattccggatagcttagcgctggaacgcggtcggctggtggatatgatgctcgactcccacacctggctgcacggcaagaaattcggcctgttcggtgacccggattttgtcatggggctgacccgcttcctgctggaactgggctgcgaaccgacggtgattctgtgccataacggcagcaagcgctggcagaaagcgatgaagaaaatgcttgaagcctcgccgtacgggaaagagagcgaagtctttatcaactgcgatttgtggcatttccgctcgctgatgtttacccgtcagccggactttatgatcggcaactcctacgccaagtttatccagcgcgatacgctggcgaagggtgagcagtttgaagtgccgctgatccgcctggggttcccgctgttcgatcgccaccatctgcaccgccagaccacctggggttacgaaggggccatgagtatcctcaccacgctggttaatgcggtgctggagaaagtcgacagagagaccatcaagctcggcaaaaccgactacagcttcgatcttatccgttaa 154 atgcagcgcgacatcagcaccagctacgcgctggaacaacggctgcgcaatcatatgacgctgaccgaagccgtcttgaataacattccggcggcggttgtagtggtggatgaacgcgatcgggtggtgatggataacctcgcctacaaaaccttttgcgccgattgcggcggtaaagaactactcaccgaaatcaacttttccgcccataaggcggagctggcgcagggcctggtactgccggtagtgctgcgcggcaccgtgcgctggttgtccgttacctgttgggcgctgccgggcgtcagcgaagaagcaggccgctactttattgatagcgccgtgccgcgcacgctggtggtgatcaccgataatactcagcagcagcaacaacaggagcaggggcgtcttgatcgtctgaagcagcagataaccagcggtaaattgctggcggcgatccgcgaatcgctggacgccgcgctggtacaactcaattgcccaattaatatgctggccgccgcacgccgcttaaatggcgacgagcatagcaatctggcgctggatgccgcatggcgtgaaggcgaagaagcgatggcgcggttgcagcgctgccgcccgtcgctggaactggaaagcccggcagtctggccgctccagccgttccttgacgatctgcgtgccctgtatcacacccgatataaccagggcgaaaacctgcaaattgagctggaatcccccgacctggtgggctttggccagcgaacacaactgcttgcctgcctgagcctgtggctcgacagaaccctggatattgccgcggagctacgtgatttcacggtacagactcaactttacgcccgcgaagagagcggctggctgtcgttctatttaaacgacaatgtgccgctgattcaggtgcgctacacccattcacccgatgcactnaatgcgcccggtaaaggcatggagctgcggctgatccagacgctggtcgcccaccatcgaggcgcaatagaactgacctcacgccctcagggaggcacctgtctgatcctgcgtttcccattattttactcgctgacaggaggctcactatga 155 atgactcagcgaaccgagtcgggtacaaccgtctggcgctttgacctctcccaacagtttacagccatgcagcgtatcagtgtggtgttaagccgcgcgacggagatcgggcagacgctacaggaagtgctgtgcgtgctgcacaacgatgcctttatgcagcacgggatgatctgtccgtacgcgcgggtgcgcgtcttcgcgagcgtatggctttga 156 atgcgcgtggaagactggtcaacgctgaccgaacggctcgatgcccatatggcaggcgtgcgccgaatctttaacgaactgatcggtgatgacgaaagtgagtcgcaggacgatgcgctctccgagcactggcgcgagctgtggcaggacgcgcttcaggaagatgacaccacgccggtgctgacgcacttaaccgacgacgcgcgccatcgcgtggtggcgctgatcgctganttccgtcttgagctgaacaaacgcgccatcggcccgcgtngtcgccaggtgctggatcacctgatgccgcacctgctgagcgaagtctgctcgcgtgccgatgcgccggtgccgctgtcgcggatgatgcccctgctgagcgggattatcacccgtactacctaccttgaactcctgagcgagttccctggcgcgcttaagcacctgatttcactctgcgccgcgtcgccgatggtggccaacaagctggcgcgttacccgctgctgctggatgagctgctcgatccgaataccctttatcaaccgacggcgaccgacgcctaccgggacgaactgcgtcagtatctgctgcgcgtgccggaagaagacgaagagcaacagctggaggcgctgcgtcagtttaagcaggcccagatgctgcgcgtggcggccgcagatattgccggaacgctgccggtgatgaaagtgagcgatcacttaacctggcttgcggaagcgattatcgacgcggtggtgcatcaggcctgggtgcagatggtggcgcgctatggccagccgaaacatctggctgaccgtgatggtcgcggcttcgcggtggtgggttacggtaagctcggcggttgggagctgggctatagctccgatctggatttaatcttcctccacgactgcccggttgatgtgatgaccgacggcgagcgcgagattgacgggcgtcagttctacctgcgcctggcgcagcgcatcatgcacctgttcagcacccgcacctcgtcgggcattttgtatgaagtggatgcccgtctgcgcccgtccggcgcggcgggcatgctggtcacctcgacggagtccttcgctgattaccagaagaatgaagcctggacgtgggagcatcaggcgctggtgcgcgcccgtgtggtgtatggcgatccgctgctgaaaacgcagtttgacgtgattcgtaaggaagtcatgaccaccgtgcgcgatggcagcacgctgcaaacggaagtgcgcgaaatgcgcgagaaaatgcgcgcgcacttaggcaataaacatcgcgatcgctttgatattaaagccgatgagggcggtattaccgatattgagtttattacccagtatctggtgttgctgcacgcgcatgacaagccgaagctgacgcgctggtcggataacgtgcgcattctggaactgctggcgcaaaacgacattatggacgagcaggaggcgcaggccttaacccgtgcctatacaacgcttcgcgatgagctccatcatctggcgttgcaggagcagcngggacacgtggcgctggactgtttcaccgctgaacgcgctcaggtaacggccagctggcagaagtggctggtggaaccgtgcgtaacaaatcaagtgtga 157 agatgtgcccagatgggattagctagtaggtggggtaacggcncacctaggcgacgatccctagctggtctgagaggatgaccagccacactggaactgagacacggtccagactcctacgggaggcagcagtggggaatattgcacaatgggcgcaagcctgatgcagccatgccgcgtgtatgaagaaggccttcgggttgtaaagtactttcagcggggaggaaggtgttgtggttaataaccncagcaattgacgttacccgcagaagaagcaccggctaactccgtgccagcagccgcggtaatacggagggtgcaagcgttaatcggaattactgggcgtaaagcgcacgcaggcggtctgtcaagtcggatgtgaaatccccgggctcaacctgggaactgcattcgaaactggcaggctagagtcttgtagaggggggtagaattccaggtgtagcggtgaaatgcgtagagatctggaggaataccggtggcgaaggcggccccctggacaaagactgacgctcaggtgcgaaagcgtggggagcaaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacgatgtcgacttggaggttgtgcccttgaggcgtggcttccggagctaacgcgttaagtcgaccgcctggggagtacggccgcaaggttaaaactcaaatgaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgatgcaacgcgaagaaccttacctactcttgacatccagagaacttnncagagatgnnttggtgccttcgggaactctgagacaggtgctgcatggctgtcgtcagctcgtgttgtgaaatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttatcctttgttgccagcggtccggccgggaactcaaaggagactgccagtgataaactggaggaaggtggggatgacgtcaagtcatcatggcccttacgagtagggctacacacgtgctacaatggcgcatacaaagagaagcgacctcgcgagagcaagcggacctcataaagtgcgtcgtagtccggattggagtctgcaactcgactccatgaagtcggaatcgctagtaatcgtagatcagaatgctacggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccatgggagtgggttgcaaaagaagtaggtagcttaaccttcgggagggcgcttaccactttgtgattcatgactggggtgaagtcgtaacaaggtaaccgtaggggaacctgcggttggatcacctcctt 158 atgaccatgcgtcaatgtgccatttacggcaaaggtggtatcggtaaatccactaccacgcaaaacctggtcgccgcgctggcggagatgggcaagaaagtaatgatcgtcggctgcgacccgaaagcagactccactcgtctgatcctgcatgcgaaagcgcagaacaccattatggagatggcggctgaagtcggctccgtggaagaccttgaactggaagatgtgctgcaaatcggttacggcgacgtacgctgcgcagaatccggcggcccggaaccaggcgttggctgtgctggtcgcggggtaattaccgccatcaacttcctggaagaagaaggcgcctatgttcccgacctcgatttcgtcttttacgacgtgttgggcgacgtggtgtgcggggggttcgccatgccgattcgcgaaaacaaagcgcaggagatctacatcgtctgctccggcgaaatgatggcgatgtacgccgccaacaacatctctaaaggcatcgtgaaatacgccaaatccggcaaagtgcgccttggcgggctgatctgtaactcccgtcagaccgaccgcgaagatgagctgatcatagcgctggcggaaaaactcggcacccagatgatccacttcgtgccgcgcgacaacatcgtgcaacgcgctgaaatccgccgtatgacggtgattgagtacgatccgaaatgcaaccaggccaatgaataccgcacgctggcgaacaagatcgtcaacaacaccaaaatggtcgtgccaacgcccatcaccatggacgaactggaagagctgttgatggaattcggcattatggatgtggaagacaccagcattatcggtaaaaccgccgcagaagaaaacgcggtttga 159 atgagcaatgcaacaggcgaacgtaatctggagatcatccaggaagtgctggagatctttccggaaaaaacgcgcaaagaacgcagaaagcacatgatggtgagcgacccggagatggaaagcgtcgggaaatgcatcatctccaaccgtaagtcgcagcccggcgtaatgaccgtgcgcggttgctcttacgccggttctaaaggggtggtattcgggccgatcaaagatatggcccatatttcccacggcccggtcggctgcggtcagtactcccgcgccgggcggcgtaactactacaccggcgtcagcggtgtggatagcttcggtacgctcaactttacctccgattttcaggagcgcgatatcgtgtttggcggcgataaaaagctgaccaaactgattgaagagatggagacgctgttcccgctgaccaaagggatctccattcagtccgaatgcccggtcggcctgattggcgacgacattgaagccgttgccaacgccagccgcaaagccatcaataaaccggtcattccggtgcgctgcgaaggttttcgcggcgtttcccagtcactcggtcaccacattgccaacgacgtgatccgcgactgggtactggataaccgcgaaggcaagccgtttgaggccggtccttatgacgtggcgatcatcggcgattacaacatcggcggcgatgcctgggcgtcgcgcattttgctcgaagagatgggcctgcgcgtggtggcgcagtggtccggcgacggcacgctggttgagatggagaacacgccgttcgtcaaactcaaccttgtgcactgctaccgctcaatgaactatatctcccgccatatggaggagaaacacggtattccgtggatggagtacaacttcttcggtccgaccaaagtcgccgaatcgttgcgcaaaatcgccgatatgtttgatgacaccattcgcgccaacgccgaagcggtgatcgccaaatatcaggcgcagaacgacgccatcatcgccaaataccgtccgcgtctggaaggccgcaaagtgctgctgtatatgggcggtttacgtcctcgccatgtgattggcgcttatgaagatctggggatggaaattatcgctgcgggttatgaattcgcccacaacgatgactacgaccgcaccctgccggatctgaaagaaggcaccttgctgttcgacgatgccagcagttatgaactggaagcctttgtcaaagcgctgaagccggatctgatcggctccggcattaaagagaagtacatcttccagaaaatgggcgtgccgtttcgccagatgcactcctgggattactccggcccctatcacggttatgacggctttgccatcttcgcccgcgatatggatatgacgatcaacaaccccgcgtggggccagttgaccgcgccgtggctgaaatccgcctga 160 atgaaggggaacgagatcctggctttgctcgatgaacctgcctgcgagcacaaccataaacagaaatccggctgcagcgcgccgaaacccggcgcgacagcgggcggctgcgcctttgacggtgcgcagatcaccctgctgccactctccgatgttgcccacctggtacacggccccattggttgtaccggtagctcatgggataaccgtggcagcttcagttccggcccgacgatcaaccggctgggttttaccaccgatctgagcgaacaggatgtgatcatgggacgcggcgagcgccgcctgttccatgccgtgcgccacatcgtcaaccgctaccacccggccgccgtctttatctataacacctgcgttcccgcgatggagggcgacgatatcgaagccgtctgccaggcggcagaaaccgccatcggcgtaccggtgattgccgttgatgtcgccgggttttacggcagcaaaaatctcggcaaccggttggccggtgaagtgatggtgaaaaaggtgattggcgggcgtgaacccgcgccgtggccggaagataccccttttgccccggcgcaccgccacgatatcgggctgattggcgaattcaatattgccggagagttctggcatattcagccgctgctcgatgagctgggtattcgcgtgctcggcagcctctccggcgacgggcgcttcagtgaaatccagacgctgcaccgggcgcaggtcaatatgctggtctgctccagggcgctgatcaacgtcgcccgctcgctggagcagcgctacggcacgccgtggtttgaaggcagtttttatggtgttcgcgccacctctgacgccctgcgccaactggcggcgctgaccggagaccgcgatctgatgcagcgcaccgaacagctcattgcccgcgaagagcagcaaacagagcaggcgctggccccgctgcgcgagcgcctgcgcgggcgcaaagcgctgctctataccggcggcgtgaaatcctggtcggtggtttcggcgcttcaggatctgggcatggaagtggtggcgaccggcacgcgcaaatccaccgaagaggataaacagcgcatccgcgaactgatgggcgccgacgcgctgatgcttgatgaaggtaacgcccgctcgctgctggacgtggtttaccgctacaaggcggacatgatgatcgccgggggacgcaatatgtacaccgcctacaaagcgcggctgccgttcctcgatatcaatcaggagcgcgagcacgcctttgccggctaccgcggcattgtcaccctggccgaacagctctgcctgaccatggaaagcccggtctggccgcaaacccattcccgcgcaccgtggcaataa 161 atgagccaaagtgctgagaaaattcaaaactgtcatccgctgtttgaacaggatgcgtaccagatgctgtttaaagataaacggcaactggaagaggcccacgatccggcgcgcgtgcaggaggtctttcaatggaccaccaccgccgagtatgaagcgcttaactttcaacgcgaagcgctgactatcgatccggccaaagcctgccagccgctgggtgcggtactgtgctcgctgggctttgccaataccctgccctatgttcacggctcccaggggtgcgtggcctatttccgcacctattttaaccgtcactttaaagagccgattgcctgtgtttctgactcgatgacggaagatgcggcagtattcggcggcaacaacaacctgaacaccgggttgcagaacgccagcgccctctacaagccggaaatcattgccgtctccaccacctgtatggcggaggtcatcggcgacgacctgcaggcgtttattgctaacgccaaaaaagacggctttatcgacgcggcgatcccggtgccttacgcgcacacgccaagctttatcggcagccatatcaccggctgggacaatatgtttgagggcttcgcccgtacctttaccgccgattacagcggacaaccgggcaaattaccgcgtatcaatctggtcagcggatttgaaacctatctcggtaatttccgcgtgctgaaacgcatgatggagcaaatggacgtgccgtgcagcctgctttccgatccctccgaagtgctggataccccggctgacgggcattaccacatgtatgcgggcggtacgacccagcaggagatgcgcgaagcgcctgacgctatcgacaccctgctgctgcaaccctggcaactggtgaaaaccaaaaaagtggtgcaggaaagctggaaccagcccgctaccgaggtgcaaatcccaatggggctggccggaaccgacgagctgctgatgacggtaagccagttaaccggcaaagccattccggatagcttagcgctggaacgcggtcggctggtggatatgatgctcgactcccacacctggctgcacggcaagaaattcggcctgttcggtgacccggattttgtcatggggctgacccgcttcctgctggaactgggctgcgaaccgacggtgattctgtgccataacggcagcaagcgctggcagaaagcgatgaagaaaatgcttgaagcctcgccgtacgggaaagagagcgaagtctttatcaactgcgatttgtggcatttccgctcgctgatgtttacccgtcagccggactttatgatcggcaactcctacgccaagtttatccagcgcgatacgctggcgaagggtgagcagtttgaagtgccgctgatccgcctggggttcccgctgttcgatcgccaccatctgcaccgccagaccacctggggttacgaaggggccatgagtatcctcaccacgctggttaatgcggtgctggagaaagtcgacagagagaccatcaagctcggcaaaaccgactacagcttcgatcttatccgttaa 162 atggcagaaattatccgtagtaaaaagccgctggccgtcagcccggtaaaaagtggccagccgctgggcgcgattctggcgagcatgggctttgaacagagcattccgctggttcatggcgctcaggggtgcagcgccttcgcgaaggtcttttttatccagcattttcacgatccgatcccgctgcaatcgacggcaatggacccgacatcgaccattatgggtgccgatgagaacatctttaccgcgctgaatgtgctgtgttcacgcaacaacccgaaagcgattgttctgctgagcactggcctttccgaggcgcagggcagcgatatttcgcgcgtggtgcgccagttccgcgatgaatatccgcgccataaaggggtggcgctgctgaccgtcaacacgccggatttttacggcagcctggaaaacggctacagcgcggtgctggagagcatggttgaacagtgggtgccggaaaaaccgcagccgggcgtgcgcaatcgccgcgtgaacctgctgctcagccatttgcttacgccgggcgacattgagctgctgcgaagttatgtcgaggcatttggcctgcagccggtgatggtgccggatctttcccagtcgctggatggccatctcgccagcggggatttctcgccaattacccagggcggcagcagcctgcggctgattgaacagatgggacagagtcttggcacgttcgccattggcgtatccctctcccgcgccgcgcaattgctggcgcagcgcagccatgcggaagtggtcaccctgccgcatctgatgaccatgagccagtgcgatacgtttattcatcaactgaagcgcctctccgggcgcgatgttccggcgtggatcgaacgccagcgcgggcaactgcaggatgcgatgatcgattgtcatatgtggttgcagggcgcgcctgtcgcgctggccgccgagggcgatctgctcgccgcctggtgcgatttcgcctgcgatatgggcatggtgcccggcccggtggtggcgccggtgagccagaaagggttgcaggatctgccggtcgaaaaagtcattatcggcgatctggaggatatgcaggatctgttgtgtgaaacgcctgcatcgctgctcgtctctaattctcacgccgctgatttggccgggcagttcgacattccgctggtgcgcgccggtttccccctgttcgaccgtctgggcgagtttcgccgcgtgcgccagggttacgccgggatgcgcgacaccttgtttgagctggcgaatgcgctgcgcgatcgccatcatcatcttgccgcttatcactcgccgctgcgccagcgtttttacgaacccgcatcttcgggaggtgactatgcaacatgttaa 163 atgaccctgaatatgatgatggacgccaccgcgcccgccgagatcgccggagcgctctcacaacagcatcccgggttgtttttcaccatggttgaacaggcgcccgtcgcgatttcactgaccgatgccgatgcccacattctctacgccaaccccgcgttttgtcgccagtcggggtatgaactggaagagttgttgcagcaaaacccgcgcctgcttgccagtaagcagacgccgcgtgaaatctaccaggaaatgtggcacaccctgctgcaacaccgtccgtggcgcggacaactgatcaaccgtcgccgcgacggcagcctgtttctggtggaaatcgacatcaccccactgtttgatgcgttcggcaaactcgaacattacctggccatgcagcgcgacatcagcaccagctacgcgctggaacaacggctgcgcaatcatatgacgctgaccgaagccgtcttgaataacattccggcggcggttgtagtggtggatgaacgcgatcgggtggtgatggataacctcgcctacaaaaccttttgcgccgattgcggcggtaaagaactactcaccgaaatcaacttttccgcccataaggcggagctggcgcagggcctggtactgccggtagtgctgcgcggcaccgtgcgctggttgtccgttacctgttgggcgctgccgggcgtcagcgaagaagcaggccgctactttattgatagcgccgtgccgcgcacgctggtggtgatcaccgataatactcagcagcagcaacaacaggagcaggggcgtcttgatcgtctgaagcagcagataaccagcggtaaattgctggcggcgatccgcgaatcgctggacgccgcgctggtacaactcaattgcccaattaatatgctggccgccgcacgccgcttaaatggcgacgagcatagcaatctggcgctggatgccgcatggcgtgaaggcgaagaagcgatggcgcggttgcagcgctgccgcccgtcgctggaactggaaagcccggcagtctggccgctccagccgttccttgacgatctgcgtgccctgtatcacacccgatataaccagggcgaaaacctgcaaattgagctggaatcccccgacctggtgggctttggccagcgaacacaactgcttgcctgcctgagcctgtggctcgacagaaccctggatattgccgcggagctacgtgatttcacggtacagactcaactttacgcccgcgaagagagcggctggctgtcgttctatttaaacgacaatgtgccgctgattcaggtgcgctacacccattcacccgatgcactcaatgcgcccggtaaaggcatggagctgcggctgatccagacgctggtcgcccaccatcgaggcgcaatagaactgacctcacgccctcagggaggcacctgtctgatcctgcgtttcccattattttactcgctgacaggaggctcactatga 164 atgactcagcgaaccgagtcgggtacaaccgtctggcgctttgacctctcccaacagtttacagccatgcagcgtatcagtgtggtgttaagccgcgcgacggagatcgggcagacgctacaggaagtgctgtgcgtgctgcacaacgatgcctttatgcagcacgggatgatctgtctgtacgacagtaagcaagcgatcctttccattgaagccttgcatgaggccgatcagcagttaattcccggcagttcacagattcgctaccgtccgggcgaagggctggtaggcacggtgctttcacagggacagtcgctggtactgccctgtgtctccgacgatcggcgttttctcgatcgcctgggattgtatgattacagcttgccgtttatcgccgtgccgctgatggggccaaactcgcagcctatcggcgtgctggccgcccagcctatggcgcgttacgaggagcggctgcccgcctgcacgcgttttcttgaaaccgtcgccaatctggtggcgcaaaccgttcgcctgatgacaccgcccagcgtcgcgtctccaccccgtgctgctgccgcgcagattgccagccagcgcgggtgcgcgtcttcgcgagcgtatggctttgaaaacatggtcggtaaaagcgcggctatgcgtcagacgctggaaattattcgccaggtatcacgctgggacaccaccgtgctggtgcgtggcgaaagcggaaccggtaaagagttgatagccaacgctatccaccacaattcaccgcgcgccgccgcgccgtttgtcaaattcaactgcgcggcgctgcccgatacgctgctggagagtgaactcttcggtcatgaaaaaggcgcgtttaccggcgcggtgcgccagcgcaaaggccgtttcgaactggcggatggcggtacgctgtttcttgatgagatcggcgaaagtagcgcctcgtttcaggcgaaattgctgcgtatcttgcaggaaggcgaaatggaacgcgtcggcggcgacgaaacgctgcgggtgaatgtacggatcattgccgccaccaaccgcaatctggaagaggaagtgcggctgggtaattttcgcgaagatctctactatcgccttaatgtgatgccgatctccctgcccccgctccgcgagcgtcaggaggacatcgtcgagctggcgcattttctggtgcgcaaaatcgcgcaaaaccagaaccgcacgctgcgcatcagcgatggcgcgatccgtttgttgatgagctatagctggcctggaaacgtgcgtgagctggaaaactgccttgagcgatcggcggtgatgtcggaaaacgggctgatcgatcgcgacgtgattttgtttcaccacagggaaaatctgccaaaaacgccacagaccagtgcgccgcgcgaagagagctggctcgatcagaacctcgatgagcgacaaagattgatcgccgcgctggagaaagccggttgggtacaggcaaaagccgcgcgcctgctgggaatgaccccgcgccaggtggcctatcgtattcagacgatggacattgccatgccgagattgtag 165 atgccgctttcttcgcagttacagcagcagtggcagaccgtttgcgaacgtctgcctgagtcattaccggcgtcatcgttaagcgagcaggcaaagagcgtgctcgtcttcagtgattttgtgcaggaaagtatcaccgccaacccgaactggctggcggaacttgagaacgcaccaccgcaggcagaagagtggcggcactatgctggctggctgcaaactgtactcgaagacgttacggatgaggccacgctgatgcgcgtcctgcgccagttccgtcgtcgggtgatggtgcgcattgcctgggctcaggcgctggaactggtgagcgaagagagtacgctgcagcagttaagcgagctggcgcaaacgttgattgtcgccgcgcgagactggctctatgccgcctgctgtaaagagtggggcacgccgtgcagcgaggaaggggttcctcagccgctgttgattctggggatgggaaagctgggcggctgcgagctgaacttctcctctgatatcgacctgatttttgcctggccggagaacggctccacgcgcggaggccgccgcgagctggacaacgcgcagttctttacccgtctcggccagcgcctgattaaagcgctggatcagcccacgcaggacggttttgtttaccgcgtggacatgcgcctgcgtccgtttggcgacagcgggccgctggtgctgagctttgcggcgctggaagattattaccaggagcaaggtcgcgactgggagcgttacgcgatggtcaaagcgcggatcatgggcgacagcgacgacgcttatgccaacgagctgcgcgccatgctgcgtccgttcgtgttccgtcgctatatcgacttcagcgtcatccagtccctgcgaaatatgaaagggatgattgcccgcgaggtgcgccgccgtgggctgaaagacaatatcaagctcggtgcgggcggcatccgcgaaatcgaatttatcgtccaggtcttccagcttattcgcggcggacgcgagccgtcgctgcagtcccgttccttattaccgacgctgagcgccattgcgcagctgcatctcctgccggacggcgacgcgcaaaccctgcgcgaggcctatcttttcctgcgtcgtctggaaaacctgctgcaaagcattaatgacgaacagacccaaaccctgccgggcgacgaccttaaccgggcgcgtctggcctggggaatgcgcgtggaagactggtcaacgctgaccgaacggctcgatgcccatatggcaggcgtgcgccgaatctttaacgaactgatcggtgatgacgaaagtgagtcgcaggacgatgcgctctccgagcactggcgcgagctgtggcaggacgcgcttcaggaagatgacaccacgccggtgctgacgcacttaaccgacgacgcgcgccatcgcgtggtggcgctgatcgctgatttccgtcttgagctgaacaaacgcgccatcggcccgcgtggtcgccaggtgctggatcacctgatgccgcacctgctgagcgaagtctgctcgcgtgccgatgcgccggtgccgctgtcgcggatgatgcccctgctgagcgggattatcacccgtactacctaccttgaactcctgagcgagttccctggcgcgcttaagcacctgatttcactctgcgccgcgtcgccgatggtggccaacaagctggcgcgttacccgctgctgctggatgagctgctcgatccgaataccctttatcaaccgacggcgaccgacgcctaccgggacgaactgcgtcagtatctgctgcgcgtgccggaagaagacgaagagcaacagctggaggcgctgcgtcagtttaagcaggcccagatgctgcgcgtggcggccgcagatattgccggaacgctgccggtgatgaaagtgagcgatcacttaacctggcttgcggaagcgattatcgacgcggtggtgcatcaggcctgggtgcagatggtggcgcgctatggccagccgaaacatctggctgaccgtgatggtcgcggcttcgcggtggtgggttacggtaagctcggcggttgggagctgggctatagctccgatctggatttaatcttcctccacgactgcccggttgatgtgatgaccgacggcgagcgcgagattgacgggcgtcagttctacctgcgcctggcgcagcgcatcatgcacctgttcagcacccgcacctcgtcgggcattttgtatgaagtggatgcccgtctgcgcccgtccggcgcggcgggcatgctggtcacctcgacggagtccttcgctgattaccagaagaatgaagcctggacgtgggagcatcaggcgctggtgcgcgcccgtgtggtgtatggcgatccgctgctgaaaacgcagtttgacgtgattcgtaaggaagtcatgaccaccgtgcgcgatggcagcacgctgcaaacggaagtgcgcgaaatgcgcgagaaaatgcgcgcgcacttaggcaataaacatcgcgatcgctttgatattaaagccgatgagggcggtattaccgatattgagtttattacccagtatctggtgttgctgcacgcgcatgacaagccgaagctgacgcgctggtcggataacgtgcgcattctggaactgctggcgcaaaacgacattatggacgagcaggaggcgcaggccttaacccgtgcctatacaacgcttcgcgatgagctccatcatctggcgttgcaggagcagccgggacacgtggcgctggactgtttcaccgctgaacgcgctcaggtaacggccagctggcagaagtggctggtggaaccgtgcgtaacaaatcaagtgtga 166 atgaagatagcaacacttaaaacgggtctgggttcgctggcactgctgccgggcctggcgctggctgctgcacctgcggtggcagacaaagccgataacgcctttatgatgatcagcaccgcgctggtgctgttcatgtccattccgggcattgcgctgttctatggcggcctgatccgtggcaaaaacgttctctccatgctgacgcaggttgccgtaacgttcgcgctggtctgcgtactgtgggtggtttacggttactcgctggctttcggcacgggcaacgcgttctttggtaacttcgactgggtgatgctgaaaaatattgaactgaccgcgctgatgggcagtttctaccagtatattcacgttgctttccagggctcgttcgcctgcattaccgtcgggctgattgtaggcgcgcttgccgagcgtattcgtttctctgcggtcctgatcttcgtggtggtctggctgacgctctcctatgtgccgattgcgcacatggtctggggtggcggtctgctggcgacgcatggcgcgctggacttcgcgggcggtaccgttgtgcacattaacgccgcggtagcgggtctggttggcgcatacctgattggcaaacgcgtgggcttcggtaaagaagcgttcaaaccgcacaacctgccgatggtcttcaccggtaccgcgatcctctactttggctggtttggtttcaacgccggctcagcaagtgccgcgaacgaaatcgccgcgctggccttcgtgaataccgttgtggccacggcaggtgcaatcctctcctgggtctttggcgagtgggctgtgcgcggtaaaccttctctgctgggtgcctgttcgggggcgattgctggtctggtcggtatcaccccagcatgtggttatgtcggtgtgggtggcgcgctgctggtcggcctggtgtcaggtctggcgggtctgtggggcgtgacggcgctgaaacgtattctgcgcgttgatgacccttgcgatgtgtttggcgtgcacggcgtgtgcggcatcgtcggctgtatcatgaccggtatctttgcagcgaaatcgctgggtggcgtgggctacgcagaaggcgtcaccatggcccatcaggtgctggtgcagctggaaagtattgctgtcaccgtggtgtggtctgccgttgtcgctttcattggctacaaactggcggacatgacggttggtctgcgcgtgccggaagagcaggaacgcgaaggtctggacgtcaacagccacggcgagaatgcgtataacgcatga 167 gccgagagaggggcccgcgtcggattaggtagttggtgaggtaatggctcaccaagccttcgatccgtagctggtctgagaggatgatcagccacactgggactgagacacggcccagactcctacgggaggcagcagtggggaatattggacaatgggcgcaagcctgatccagcaatgccgcgtgagtgatgaaggccttagggttgtaaagctctttcgcacgcgacgatgatgacggtagcgtgagaagaagccccggctaacttcgtgccagcagccgcggtaatacgnagggngcnagcgttnntcggaattactgggcgtaaagngcgcgtaggcggcntgttnagtcagaagtgaaagccccgggctcaacctgggaatagcttttgatactggcaggcttgagttccggagaggatggtggaattcccngtgtagnggtgaaatncgtagatattgggangaacaccngtggcgaaggcggcnatctggacgganactgacgctgaggcgcgaaagcgtggggagcaaacaggattagataccctngtagtccacgccgtaaacgatgaatgctagacgtcggggtgcatgcacttcggtgtcgccgctaacgcattaagcattccgcctggggagtacggccgcaaggttaaaactcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgaagcaacgcgcagaaccttaccaacccttgacatgtccactttgggctcgagagatngggtccttcagttcggctgggtggaacacaggtgctgcatggctgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccctaccgtcagttgccatcattcagttgggcactctggtggaaccgccggtgacaagccggaggaaggcggggatgacgtcaagtcctcatggcccttatgggttgggctacacacgtgctacaatggcggtgacagtgggaagcgaagtcgcgagatggagcaaatccccaaaagccgtctcagttcggatcgcactctgcaactcgagtgcgtgaagttggaatcgctagtaatcgcggatcagcacgccgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccatgggagttggttttacccgaaggtggtgcgctaaccgcaaggaggcagccaaccacggtaaggtcagcgactggggtgaagtcgtaacaaggtagccgtaggggaacctgcggctggatcacctccttt 168 atggccaaagcgcctctgcgtcagatcgccttttacggcaagggcggtatcggcaagtccaccacctctcagaacacgctggccgcgctggtcgagctggatcagaggatcctgatcgtcggctgcgacccgaaggccgactcgacccgcctgatcctgcacgcaaaggcccaggacaccgtcctgcatctggccgccgaggccggctcggtcgaggatctggagctcgaggacgttctcaagatcggctacaagaacatcaagtgcgtcgagtccggcggtccggagccgggggtcggctgcgccggccgcggcgtcatcacctcgatcaacttcctggaagagaacggcgcctacgacgacgtggactatgtgtcctacgacgtgctgggcgacgtggtctgcggcggcttcgccatgccgatccgcgagaacaaggcccaggaaatctacatcgtcatgtccggcgagatgatggcgctgtacgccgccaacaacatcgccaagggcatcctgaagtacgcgcacagcggcggcgtccgtctcggcggcctgatctgcaacgagcgccagaccgacaaggaatgggatctggccgacgcgctggccaagcgcctgggctccaagctgatccacttcgtgccgcgcgacaacatcgtccagcacgccgagctgcgccgcatgacggtcatcgagtacgccccggacagcaagcaggccggcgaataccgcgcgctcgccaacaagatccatgcgaactccggccagggttgcatcccgaccccgatcaccatggaagagctggaagagatgctgatggacttcggcatcatgaagaccgaggagcagcagctcgccgagctcgccgccaaggaagcggcgaaggccggcgcctga 169 atgagcctgtccgagaacaccacggtcgacgtcaagaacctcgtcaacgaagtcctcgaagcctatcccgaaaaatcccgcaagcgccgcgccaagcacctgaacgtgctggaggccgaggccaaggactgcggcgtcaagtcgaacgtcaagtccatccccggcgtcatgaccatccgcggctgcgcctatgccggctccaagggcgtggtgtggggtccgatcaaggacatgatccacatctcccacggtccggtcggctgcggctactactcctggtccggccgccgcaactactacatcggcgacaccggtgtggacagctggggcacgatgcacttcacctccgacttccaggagaaggacatcgtcttcggcggcgacaagaagctgcacaaggtcatcgaggaaatcaacgagctgttcccgctggtgaacggcatctcgatccagtcggaatgcccgatcggcctgatcggcgacgacatcgaggctgtcgcccgcgccaagtcggcggaaatcggcaagccggtcatccccgtgcgctgcgaaggcttccgcggcgtgtcccagtcgctgggccaccacatcgccaacgacgccatccgagactgggtgttcgagaagacggaacccaaggccggcttcgtctccaccccctatgacgtcaccatcatcggcgactacaacatcggcggcgacgcctggtcgtcccgcatcctgctggaggagatcggcctgcgcgtgatcgcccagtggtcgggcgacggcacgctcgccgaactggagaacacgccgaaggccaaggtcaacctgatccactgctaccgctcgatgaactacatcgcgcgccacatggaagagaagttcaacattccttggatggaatacaacttcttcggcccgagccagatcgccgaatccctgcgcaagatcgccgctctcttcgacgacaagatcaaggagaacgccgagaaggtcatcgcccgctaccagccgatggtcgatgcggtcatcgccaagtacaagccgcggctcgaaggcaagaaggtcatgatctacgtcggcggcctgcgtccccgccacgtcgtcgatgcctaccatgacctcggcatggagatcaccggcaccggctacgagttcgcccacaacgacgactatcagcgcacgcagcactacgtgaaggaaggcacgctgatctacgacgacgtcaccgcgttcgaactggagaagttcgtcgaggcgatgcgtcccgacctcgtcgcgtcgggcatcaaggaaaagtacgtgttccagaagatgggcctgccgttccgccagatgcacagctgggactactccggcccgtaccacggctatgacggcttcgcgatcttcgcccgcgacatggacctggccatcaacaaccccgtctggggcgtgatgaaggccccgttctga 170 atgctccaggacaagatccaggatgtcttcaacgaaccgggctgcgcgaccaaccaagccaaatcggccaaggagaagaagaagggctgcaccaagtcgctgaaaccgggggcggcagccggcggctgcgcctatgacggggcgatgatcgtgctccagccgatcgccgacgccgcccatctggtccatggccccatcgcctgcctcggaaacagttgggacaaccgcggctccaaatcctccggctcgcagctctaccgcaccggcttcaccaccgatctgtcggaactggacgtcatcggcggcggcgagaagaagctctaccgcgccatcaaggagatcgttcagcaatacgacccgccggccgtcttcgtctatcagacctgcgtgcccgccatgaccggcgacgacatcgccgcggtctgcaagttcgccacgcagaagctgggcaagccggtgatcccggtggactcgccgggcttcgtcgggtcgaagaatctcggcaacaagctggccggcgaagccctgctggagcatgtcatcggcacggtcgaaccggactacaccaccccgaccgacgtctgcatcatcggcgaatacaaccttgccggcgagctgtggctggtcaagccgctgctggacgagatcggcatccgcctcctgtcctgcatttccggcgacggccgctaccgggaggtggcgcaggcccaccgcgcccgcgtcaccatgatggtgtgcagccaggcgctggtgaatgtcgggcgcaagatggaggagcgctacggcatcccctatttcgaggggtccttctacggcgtgtccgacatgtcggacaccctgcgcaccatgacccgcatgctggtggagcgcggcgccgacaagggcctgatcgaccgggcggagggcgtgatcgcgcgggaggaaagccgggtctggcgccggctggaaccctacaagccgcgcttcgacggcaagcgcgtccttctcttcaccggcggcgtcaagagctggtcgatggtcagcgcgctggagggtgcggggctgaccatcctcggcacctccaccaagaaatcgaccagggaggacaaggagcgcatcaagaagatgaagggcgaagagttccaccagtgggacgatttgaagccgcgcgacatctacaggatgctggccgacgatcaggccgacatcatgatgtccggcggccgctcgcagttcatctcgctgaaggccaaggttccctggctcgacatcaaccaggagcgccaccacgcctatgccggctatgacggcatcgtcaatctctgcgaggagatcgacaaaacgctgtcgaatccgatctggcgtcaggtgcgtcagccggcaccgtgggagtccggcgcgtcctccacccttctggcttcctcgatggcggcggagtga 171 atgtcccacatccagcgcttcccctccgccgccaaggccgcctccaccaacccgctgaagatgagccagccgctgggtgcggctctggcctatctcggcgtcgaccgctgcctgccgctgttccatggctcgcagggctgcaccgccttcgggctggtcctgctggtgcgccatttccgcgaggcgatcccgctccagaccacggcgatggatcaggtcgccaccatcctcggcggctacgacaatctggagcaggcgatccgcaccatcgtcgagcgcaaccagcccgccatgatcggcgtcgccaccaccggcgtcaccgagaccaagggcgaggatatggccggacagtacacgctgttccgccagcgcaaccccgacttggccgacacggccctggtcttcgccaacacccccgacttcgccggcggcttcgaggacggcttcgccgccgcggtcaccgcgatggtcgagcggttggtcgaaccgtcgccggtgcgcatcccgacccaggtcaacgtgctggccggctgccatctgtcccccggcgacgtggaggaactgcgcgacatcatcgaaggcttcggcctgtcgccgatcttcctgcccgacctgtcgctgtcgatggcgggccgccagccggccgacttcaccgccacctcgctgggcggcgtgaccgtcgatcagatccgcgccatgggcgcttcggccctcaccatcgtggtcggtgagcatatgcgggtggccggtaacgcgctggagctgaagaccgacgtgcccagccatttcttcaaccgcctgaccgggctggaggcgacggacaagctggtccggctgctgatggagttgtcgggcaagccggcgcccgcccggctgcggcgccagcgcgaaagcctggtcgatgccatgctcgacgggcatttcttctacagccgcaagcgcatcgccgtcgcgctggagcccgacctgctctatgccgtcaccggcttcctcgccgacatgggggccgaggtgatcgccgcggtgtccccgacgcagagcccggtgctggagcggttgaaggccgccaccatcatggtcggcgatcattccgacgtggagacgctggcccgcgacgccgacctgatcgtctccaactcgcacgggcggcagggagccgcgcggatcggcgtggctctgcaccgcatgggcctgccgctgttcgaccggctgggggccggcctgcgcgtccaggtcggctaccgcggcacgcgggaactgctgtgcgacatcggcaacctgttcctcgcccgcgagatggaccacgagcacgggcacgagagccacgaccacggggaatcccacggctgcggaggcggatcatgcggatgcaacgccgtctga 172 atgaccgacaagctttcgcagagcgccgacaaggtcctcgaccactacaccctcttccggcagcccgaatacgcggcgatgttcgagaagaagaagaccgagttcgagtacggccattcggacgaggaagtcgcccgcgtgtccgaatggaccaagtccgaggactacaaggcgaagaacttcgcccgtgaagcggtcgtcatcaacccgaccaaggcctgccagccgatcggcgcaatgttcgccgcccagggcttcgaaggcaccctgcccttcgtccacggctcccagggctgcgtcgcctattaccgcacccacctgacccgtcacttcaaggagccgaacagcgcggtctcctcgtcgatgacggaggacgcggcggtgttcggcggcctgaacaacatgatcgacggcctggcgaacgcctatgcgctctacaagccgaagatgatcgcggtgatgaccacctgcatggccgaagtcatcggcgacgatttgcagggcttcatcgccaatgcgaagaccaaggacagcgtcccggccgacttcccggtcccctacgcccacaccccggccttcgtcggcagccacatcgtcggctacgacaacatgatcaaggggatcctgaccaacttctggggtacgtcggagaatttcgacacacccaagaccgagcagatcaacctgatcccgggcttcgacggcttcgccgtcggcaacaaccgcgaactgaagcgcatcgccggcgaattcggcgtgaagctgcaaatcctgtccgacgtgtccgacaatttcgacacgccgatggatggcgagtaccgcatgtatgacggcggcaccaccatcgaggagaccaaggaggccctgcacgccaaggccaccatctccatgcaggagtacaacacgacccagaccctgcaattctgcaaggagaagggtcaggaagtcgccaagttcaactacccgatgggcgtcaccggcaccgacgagctgctgctgaagctcgccgaactgtcgggcaagccggtcccggccagcctgaagctggagcgcggccgtctggtcgacgccatcgccgacagccacacccacatgcacggcaagcgcttcgccgtctatggcgacccggacttctgcctgggcatgtccaagttcctgctggagctgggtgcggagccggtgcacatcctgtcgacgtcgggctccaagaagtgggagaagcaggtccagaaggtgctggacggctcgcccttcggcgcctcgggcaaggcccatggcggcaaggatctgtggcacctgcgttcgctgatcttcaccgacaaggtggactacatcatcggcaacagctacggcaagtatctggagcgcgacaccaaggttccgctgatccgcctgacctacccgatcttcgaccgccaccaccaccaccgctacccgacctggggctaccagggcgcgctgaacgtgctggtacggatcctggaccggatcttcgaggacatcgacgccaacaccaacatcgtcggccagaccgactactcgttcgacctgatccgctga 173 atgttgacctctgatattgttggcaaattgcgctgcatcgcagcagaccccaaagcgggcatcgcaaggggcctcgacaccgggacgacgaagatcggtcccgtttgggagggtgacgtgggcgacaccgtggatttcgaagcgctgcgccagcgggcggtccactccctgttcgaacatctggaatccatgtgcgtcggcgccgtcgccgtcgaccacaccggccgcatcgcctggatggacgagaagtacaaggctctgctgggcgttcccgacgacccgcgcggccggcaggtggaggacgtcatccccaacagccagctgcgccgggtgatcgacagcggccagccgcagccgctggacatcatggagttcgacgaccggtccttcgtggtgacgcggatgccgctgttcggcaccgacggttcgatcatcggcgccatcggcttcgtgctgttcgaccgcgccgaatatctccgcccgctggtccgcaaatacgagaagatgcaggaggagctggcccgcacccagcaggagctggcgcatgagcgccgcgccaaatactccttctcgcagttcctgggcgccagcgaatcgatccgcgagatcaagcggctggggcgccgcgccgcccagatggattcgaccgtcctgctgctgggcgaaaccgggaccggcaaggagctgctggcccaggccatccattccgccagcccgcgggcgtccaagcccttcgtcggcgtcaatgtcgccgccattccggaaaccctgctggaggcggagttcttcggcgtcgcccccggcgccttcaccggcgccgaccgccgccaccgcgacggcaagttccagctcgccaacggcggcaccctgttcctcgacgagatcggcgacatgccgctgccggtgcaggccaagcttctgcgcgtgctgcaggagcgggagatcgagccgctcggctccaacaaggtggtgcgggtcgatgtccgcatcatcgccgccaccagccgtgacctgcacgccctggtgcgtgagaagcagttccgcgccgacctctattaccggctgaatgtggtgccgatcaccctgccgccgctgcgcgaccggccggaggacatcgagagcatcgccgaccgcatcctggaacagctggcgatccagcagggcacgccgccgcgcgagctgctggaatcggcggtgcaggtgctgcgcgactatgactggcccggcaatgtgcgcgagctttacaacacgctggaacgggtggtggcgctgaccgatgcgccgatcctgaccgcgccgcacatccgcagcgtgctgcccggccagcatccggccggcgcgtcggccctgccgctggcggccggcgcgcggccgttgcaggaggtgctgcacgccgccgagcgccacgccatcgccgcggcgcttgaggaggcgaacggcgtcaaggcgcgggcggcgaagctgctgggcatttcgcgcgcgtcgctgtacgaacgcatggtgacgctggggttgggggcgacgcagtag 174 atgccgagtcccatcgcgttctcaagccccttgccgaagcctttcgacagcgcgcaggcggcgctggggatggagcgctggcgccagcaggccgccgcggcggagccggagacccgcgcctgggcggaagccttcgccgattcggagaccggccgggcgctgatcggggcggtgtgcggcaacagcccgtatctcggccacagcctgacgcgggagttgcccttcgtcgcccgtacagtgcaggacggcttcgacgacaccttcgccgcgctgatcgccgctctccatgccgagcatggcgaggagaaatcgatggaccggctgatggccggcctgcgggtggcgaagcggcgggcggcgctgctgatcgcgctggccgacatcgccggcgcgtggccgctgttccgcgtcaccggcgccctgtcggagctggcggagacgggggtgcagctggccgcgaatttcctgctgcgccgcgccagggaggcggggacgctgacgctgccggatccgcagcgaccgtgggtcggttcgggcctgatcgttttgggcatgggtaagcttggcgggcgcgaactcaactattccagcgacatcgacctgatcgtcctgtatgacgacgctgttgtgcagacgccccagccggacaacctcgcgcgaaccttcatcaggctcgcacgcgatcttgtccgcattatggatgaacggaccaaggacggctacgtcttccgcaccgaccttcggcttaggcccgatcccggcgccacgccgctggcggtttccgtctccgcagccgaaatttattacggcagcgtcggtcagaactgggaacgcgcggcgatgatcaaggcccgtcccatcgccggcgatctggaggcgggcgcctcctttgtccgcttcctggagcccttcgtctggcgccgcaacctggatttcgccgccatccaggacatccattcgatcaaacgccagatcaacgcccacaagggccaccgcgaggtgacggtcaacggccacgacatcaaggtcggccgcggcggcatccgcgagatcgagttcttcgcccagacccagcagctgatcttcggcgggcgcgacccgcgcgtgcgaatcgctccgaccctgatggcgaacgaggcgctgcgcgacgtcggccgcgtgccgccgcagacggtggaagagcttgccggggcctatcatttcctgcgccgtgtcgaacatcgcatccagatgatcgacgaccagcagacccatcgtattcccgccgacgatgccggggtggcgcatttggccaccttcctcggctatgacgaccccgccgccttccgggcggaactgctggcgacgctggggcaggtggaggaccgctatgccgagctgttcgaggaggcgccgtcgctttccggccccggcaatctggtcttcaccggcaccgaccccgatccgggcacgatggagacgctgaagggcatgggcttcgccgatccggcccgcgtcatcagcgtggtgtcggcctggcatcgcggccgctaccgcgccacccggtcgggccgggcgcgggagctgctgacggagctgacgccggccctgctgagtgcgctgaccaagaccccggcccccgattcggcgctgatgaacttcgacgatttcctcggcaagctgccggccggcgtcggtctgttctcgctgttcgtcgccaatccctggctcctggagctggtggcggagatcatgggcatcgcgccgcagatggcgcagacgctgtcgcgcaacccgtcgctgctcgacgccgtgctgtcgccggacttcttcgacccgctgccgggcaaggaggacgggctggccgacgaccacgcccgcgtgatggcgccggcccgcgatttcgaggatgcgctgaccctgtcgcggcgctggaccaacgaccagcgcttccgcgccggggtgcatatcctgcgcggcatcaccgatggcgaccgctgcggcgccttcctggccgatctggccgacatcgtcgtccccgaccttgcccgccgggtggaggaggagttcgcccagcgccacggccatattcccggcggcgcctgggtggtggtggcgatgggcaagctcggcagccggcagctgaccatcacgtccgacatcgacctgatcgtcatctacgatgtggcgccgggccaagggggcgggggcggtccccgcttgtcggatggtgccaagccgctgtcgcccaacgagtattacatcaagctgactcagcgtctgaccaacgccattaccgcgccgatgggcgacggccggctctacgaggtcgacatgcggctgcgcccgtcgggcaacgccgggccgctcgccacctcgctggacgctttcctgaaatatcaggcgaccgatgcctggacctgggagcatatggccctgacccgcgcccgggtgatcggcggtgatgcggagctggccgggcgggtgtcggcagcgatccgctcggtgctgacggcgccgcgcgatgccgaccggctgctgtgggacgtggccgacatgcggcggcggatcgagaaggagttcgggacgaccaatgtctggaacgtcaaatacgcccgcggcggcctgatcgacatcgagttcatcgcccagtacctgcaactgcgccatggtcacgagcggccggacatcctgcacatcggcaccgccaaggcgctgggctgcgccgcccggacgggcgcgctggcgccggaggtggcggaggatctggagacgacgctgcggctgtggcggcgggtgcagggctttctgcggttgaccaccgccggggtgctcgatcccaatcaggtgtcgcccagcctgctggccgggctggtccgcgccgcctttcctgctgactttcagggcgagcgtgagcctggcactgttgacttccccgaactggaccacaaaatccgtgccgtcgccgcccgcgcccatggtcatttcaagaccctggtcgaggaaccggcgggccgtctggccccacccgccaccacgcctccagcctga 175 atgaaccgtctgttccttatggccgcaccgatgatggcggttgctctgggcgcggtcggcatgccggccgcagcccttgcccaggatccggcggctgccgccgctgccgcggctgcggctgcggctgccgccgctgctgccgcaccggcggctccggcgctgaatggcggcgacaccgcctggatgctcatctccaccgcgctggtgctgatgatgaccatccccggcctggcgctgttctacggcggcatggtccgcaagatgaacgtgctgtcgacggtgatgcagagcttcgccatcacctgcctgatcagcgtcctgtggtacgtcatcggctacagcctggccttcaccggcaccggtgcctatgtcggcggtctcgaccggctgttcctcaacgggctcgacttcacgaaggccttcgtgctgggcgaggcgaccgggtcgggcgtcccgacgaccatccccgagccggtcttcatgatgttccagatgacctttgcgatcatcaccccggccctgatcaccggcgccttcgccgaccgcatgaagttctcctccctgctggtcttcaccgcgctgtggtcgatcgtggtctatgcgccgatcgcccactgggtctggtacccgtcgggcttcctgttcggcctgggcgtgctggacttcgccggcggcacggtcgtgcacatcaacgccggcgtcgccggcctggtcgccgcgctggtgatcggcaagcgcaagggctacccgaaggaagccttcatgccgcacaacctggtgctgtcgctgatcggcgcctcgctgctgtgggtcggctggttcggcttcaacgccggttcggccctgaccgccggtccgcgtgccggcatggcgctggccgccacgcacatcgccaccgccggtgccgccatgggctggctgttcgcggagtggatcgtcaagggcaagccgtcgatcctcggcatcatctccggcgccgtcgccggcctggtcgcggtgaccccggccgccggcttcgtcgacccgacgggcgccatcgtcatcggcatcgtcgccggcgtggtctgcttctggtcggccaccagcctcaagcacatgctgggctatgacgacagcctggacgccttcggcgtgcacggcgtcggcggcctgatcggcgccatcctgaccggcgtcttcgccaagatgtcggtgtccaacagcgaaggcggcttcgcctccgtcctgcaggccgacccgaaggccacgctgggcctgctggaaggcaacgccgccgccgtctggatccaggtccagggcgtcctctacaccatggtctggtgcgccatcgccaccttcgtcctgctgaagatcgtcgatgtggtcatgggcctgcgcgtcgaagaggatgtggagcgcgacggtctcgacctcgccctgcatggcgagagcatccactaa 176 atggatgcggcaaagacgggtggcgacgtccttttcgtgctgatgggcgcggtgatggtgctggcgatgcattgcggcttcgccctgctggaggtcgggacggtccggcgcaagaatcaggtcaacgcgctggtgaagatcctgtcggacttcgccatgtcgaccatcgcctattttttcgtcggttatgccgtggcctacggcatcgacttcttcgccgacgcccacacgctggtcggcaagggaagcggcgggttcgcggcctatggctacgatctggtgaagttcttcttcctggcgaccttcgccgccgcggtgccggccatcgtctcgggcggcatcgccgagcgtgctaggttctggccgcaggccgccgccacgctggcgctgatcgcgctgttctatccattgctggaaggcacggtctggggcacccgcttcggcctgcaaagctggatggccgcgaccttcggccagcctttccacgacttcgccggatctgtggtggtgcatgccttcggcggctgggtggcgctgggtgccgtgctgaacctcggcaaccgccgcggccgctaccgtccgaacggctcgctgatcgccattccgccgtcgaacatccccttcctggcgctgggcgcctgggtgctgtgcgtggggtggttcggcttcaacgtgatgagcgcccaggtgctggatggcgtgacgggtctggtggcgctgaactcgctgatggcgatggtcggcggcatcgtcacctcgctggtgatcagccgcaccgatcccggcttcgtccacaacggcgcgctggccggtctggtggcggtctgcgccgggtccgacgtgatgcacccgctgggcgcgctggtcaccggcggcatcgccgggctgctgttcgtctgggccttcaacaaatgccagatcgactggaagatcgacgacgtgctgggcgtctggccgctgcacggtctgtgcggcctgaccggcggcctgctggccggcgtcttcgggcaggaggcactgggcggccttggcggcgtgtcgatcctcagccagatcgtcggcacggcaagcggcgccagcttcggattcgtctcgggtctggcggtctacggcctgctgcgcgtcaccgtcggcatccgcctcgatcccgagcaggagtacaagggcgccgacttgtcgttgcaccatatcaccgcgtacccggaagaggacgcgccgaccctgtaa 177 atgaccctgaatatgatgatggattcttggttctctggagcgctttatcggcatcctgactgaagaatttgcaggcttcttcccaacctggcttgcacccgtgcaggtagttgtgatgaacatcactgattcgcaggctgaatacgttaacgaattgacccgtaaactgcaaaatgcgggcattcgtgtaaaagcagacttgagaaacgagaagattggctttaaaatccgcgagcacactttacgtcgtgtcccttatatgctggtttgtggtgacaaagaggtcgaagccggcaaagttgctgtgcgtacccgtcgcggtaaagacctgggtagcctggacgtaaatgatgttatcgagaagctgcaacaagagattcgcagccgcagtcttcaacaactggaggaataaggtattaaaggcggaaaacgagttcaaacggcgcgtcccaatcgtattaatggcgagattcgcgccacggaagttcgcttaacaggtctggaaggcgagcagcttggtattgcgatagaactcacttcacgccccgaagggggaagctgcctgaccctacgattcccgctatttcattcactgaccggaggttcaaaatga 178 accggataagagagaaaagtgtcgacgtcggtccggttgatattgaccggcgcatccgccagctcgcccagtttttggtggatctgtttggcgattttgcgggtcttgccggtgtcggtgccgaaaaaaataccaatatttgccataacacacgctcctgttgaaaaagagatcccgcggggaaaatgcggtgaacatgtcagctattgcgaagagtgtgccagttttgctcacgggcaaaagctgcaccagaatgggtattaatgcaccagcctggcgctttttttcgcggcacgtcccctcgctaatgcccgtctggcgcggctttgacgctgataaggcgctgaataccgatctggatcaaggttttgtcgggttatcgtccaaaaggtgcactctttgcatggttataagtgcctgacatggtgtccgggcgaacgtcgccaggtggcacaaattgtcagaactacgacacgactaaccgaccgcaggagtgtgcgatgaccctgaatatgatgatggattcttggttctctggagcgctttatcggcatcctgactgaagaatttgcaggcttcttcccaacctggcttgcacccgtgcaggtagttgtgatgaacatcactgattcgcaggctgaatacgttaacgaattgacccgtaaactgcaaaatgcgggcattcgtgtaaaagcagacttgagaaacgagaagattggctttaaaatccgcgagcacactttacgtcgtgtcccttatatgctggtttgtggtgacaaagaggtcgaagccggcaaagttgctgtgcgtacccgtcgcggtaaagacctgggtagcctggacgtaaatgatgttatcgagaagctgcaacaagagattcgcagccgcagtcttcaacaactggaggaataaggtattaaaggcggaaaacgagttcaaacggcgcgtcccaatcgtattaatggcgagattcgcgccacggaagttcgcttaacaggtctggaaggcgagcagcttggtattgcgatagaactcacttcacgccccgaagggggaagctgcctgaccctacgattcccgctatttcattcactgaccggaggttcaaaatgacccagcgaaccgagtcgggtaataccgtctggcgcttcgatttatcccagcagttcaccgcgatgcagcggataagcgtggttctcagccgggcgaccgaggttgaacagacactccagcaggtgctgtgcgtattgcacaatgacgcctttttgcagcacggcatgatctgtctgtacgacagccagcaggcgattttgactattgaagcgttgcaggaagccgatcagcagttgatccccggcagctcgcaaattcgctaccgtccgggtgaagggctggtcgggacggtgctttcgcaggggcaatcgttagtgctggcgcgtgtggctgacgatcagcgctttcttgaccgcctgggactgtatgattacaacctgccgtttatcgccgtgccgctgatagggccggatgcgcagacttttggcgtgctgacggcgcaaccgatggcgcgttacgaagagcggttacccgcctgcacccgctttctggaaacggtc 179 tccctgtgcgccgcgtcgccgatggtggccagccaactggcgcgctacccgatcctgctcgatgaactgctcgacccgaacacgctctatcaaccgacggcgatgaacgcctatcgcgatgaactgcgacaatacctgttgcgcgtgccggaagaggatgaagagcagcaactggaggcgctacggcagtttaagcaggcgcagttgttgcgcgtagcggcggcggatatcgccggtacgttacccgtcatgaaagtgagcgatcacttaacctggctggcggaagcgattatcgatgcggtggtgcagcaagcctggaaccagatggtggcgcgttacggccagccgacgcatctgcacgatcgcgaagggcgcggtttcgccgtggtcggttacggcaaacttggcggctgggaattaggttacagctccgatctggatctggtgttcctgcacgactgccccatggatgtgatgaccgatggcgagcgtgaaatcgatggccgccagttctatttgcgcctcgcgcagcgcgtgatgcacctgttcagcacgcgcacgtcgtccggcattctttatgaagtcgatgcgcgtttgcgcccgtccggcgcggccggaatgctggtgaccactgcggaagcgttcgccgattatcaaaaaaatgaagcctggacatgggagcatcaggcgctggcgcgtgcgcgcgtggtgtacggcgatccgcaactgaccgccgaatttgacgccattcgccgcgatatcctgatgacctcccgcgatgccgctaccctgcaaaccgaagtgcgggaaatgcgtgagaaaatgcgcgcccatcttggtaacaagcacaaagaccgtttcgatctgaaagccgatgaaggcggtatcaccgatattgagtttatcgctcagtatctggtgctgcgctttgcccatgagaagccgaaactgacgcgctggtcggataatgtgcgcatcctcgaagggctggcgcaaaacggcatcatggatgagcaggaagcgcaggcattgacgctggcgtacaccacgttgcgtgatgagctgcaccacctggcgctgcaagagctgccaggacatgtggcgctctcctgttttgtcgccgagcgtgcgcttatcaaaaccagctgggacaagtggctggtggaaccgtgcgccccggcgtaa 180 taaagcgagcgctcacttacgtgatctgttgacgcagtccgaagcgaccattacttcagccgtttcagcagatacggcggtgtggagtgcgcaatcagccctggcgaaactggtgctcaccgagtggttagtgacgcagggctggcgaaccttccttgatgaaaaagcgcaggctaagtttgccgactcctttaaacgctttgctgacgttcatctgtcacgcagcgccgccgagctgaaaaaagcctttgcccagccgctgggcgacagctatcgcgaccagttaccgcggctggcgcgtgatatcgacagcgcgttattgctggccggacattacgatcgcgcgcgcgccgtggagtggctggaaaactggcaggggcttcagcacgctattgaaacgcgccagagagttgaaatcgaacatttccgtaataccgccattacccaggagccgttctggttgcacagcggaaaacgttaacgaaaggatatttcgcatgtccctgtgcgccgcgtcgccgatggtggccagccaactggcgcgctacccgatcctgctcgatgaactgctcgacccgaacacgctctatcaaccgacggcgatgaacgcctatcgcgatgaactgcgacaatacctgttgcgcgtgccggaagaggatgaagagcagcaactggaggcgctacggcagtttaagcaggcgcagttgttgcgcgtagcggcggcggatatcgccggtacgttacccgtcatgaaagtgagcgatcacttaacctggctggcggaagcgattatcgatgcggtggtgcagcaagcctggaaccagatggtggcgcgttacggccagccgacgcatctgcacgatcgcgaagggcgcggtttcgccgtggtcggttacggcaaacttggcggctgggaattaggttacagctccgatctggatctggtgttcctgcacgactgccccatggatgtgatgaccgatggcgagcgtgaaatcgatggccgccagttctatttgcgcctcgcgcagcgcgtgatgcacctgttcagcacgcgcacgtcgtccggcattctttatgaagtcgatgcgcgtttgcgcccgtccggcgcggccggaatgctggtgaccactgcggaagcgttcgccgattatcaaaaaaatgaagcctggacatgggagcatcaggcgctggcgcgtgcgcgcgtggtgtacggcgatccgcaactgaccgccgaatttgacgccattcgccgcgatatcctgatgacctcccgcgatgccgctaccctgcaaaccgaagtgcgggaaatgcgtgagaaaatgcgcgcccatcttggtaacaagcacaaagaccgtttcgatctgaaagccgatgaaggcggtatcaccgatattgagtttatcgctcagtatctggtgctgcgctttgcccatgagaagccgaaactgacgcgctggtcggataatgtgcgcatcctcgaagggctggcgcaaaacggcatcatggatgagcaggaagcgcaggcattgacgctggcgtacaccacgttgcgtgatgagctgcaccacctggcgctgcaagagctgccaggacatgtggcgctctcctgttttgtcgccgagcgtgcgcttatcaaaaccagctgggacaagtggctggtggaaccgtgcgccccggcgtaagtgtggtatcatcgcgcgcaaattttgtatctctcaggagacaggaatgaaagttacgctgccagagttcaatcaagccggtgtcatggtggtgggtgatgtgatgctggatcgctactggtacggcccaaccagccgcatttctccggaagcgccagttccggttgttaaagtcgatactattgaagagcgaccgggcggtgcggcaaacgtggcgatgaacattgcctcgctgggcgcaacggcgcgtctggttggcctgactggcattgatgatgcggcgcgcgcgctgagcaaagcgctggcggatgttaatgttaaatgtgacttcgtttctgttccgactcaccccaccatcactaagctgcgcgtgctgtcgcgtaaccagcaactgattcgc 181 atgaccctgaatatgatgatggatgccagccgttctgtaataataaccggacaattcggactgattaaaaaagcgccctcgcggcgctttttttatattctcgactccatttaaaataaaaaatccaatcggatttcactatttaaactggccattatctaagatgaatccgatggaagctcgctgttttaacacgcgttttttaaccttttattgaaagtcggtgcttctttgagcgaacgatcaaatttaagtggattcccatcaaaaaaatattctcaacctaaaaaagtttgtgtaatacttgtaacgctacatggagattaactcaatctagagggtattaataatgaatcgtactaaactggtactgggcgcaactcacttcacgccccgaagggggaagctgcctgaccctacgattcccgctatttcattcactgaccggaggttcaaaatga 182 accggataagagagaaaagtgtcgacgtcggtccggttgatattgaccggcgcatccgccagctcgcccagtttttggtggatctgtttggcgattttgcgggtcttgccggtgtcggtgccgaaaaaaataccaatatttgccataacacacgctcctgttgaaaaagagatcccgcggggaaaatgcggtgaacatgtcagctattgcgaagagtgtgccagttttgctcacgggcaaaagctgcaccagaatgggtattaatgcaccagcctggcgctttttttcgcggcacgtcccctcgctaatgcccgtctggcgcggctttgacgctgataaggcgctgaataccgatctggatcaaggttttgtcgggttatcgtccaaaaggtgcactctttgcatggttataagtgcctgacatggtgtccgggcgaacgtcgccaggtggcacaaattgtcagaactacgacacgactaaccgaccgcaggagtgtgcgatgaccctgaatatgatgatggatgccagccgttctgtaataataaccggacaattcggactgattaaaaaagcgccctcgcggcgctttttttatattctcgactccatttaaaataaaaaatccaatcggatttcactatttaaactggccattatctaagatgaatccgatggaagctcgctgttttaacacgcgttttttaaccttttattgaaagtcggtgcttctttgagcgaacgatcaaatttaagtggattcccatcaaaaaaatattctcaacctaaaaaagtttgtgtaatacttgtaacgctacatggagattaactcaatctagagggtattaataatgaatcgtactaaactggtactgggcgcaactcacttcacgccccgaagggggaagctgcctgaccctacgattcccgctatttcattcactgaccggaggttcaaaatgacccagcgaaccgagtcgggtaataccgtctggcgcttcgatttatcccagcagttcaccgcgatgcagcggataagcgtggttctcagccgggcgaccgaggttgaacagacactccagcaggtgctgtgcgtattgcacaatgacgcctttttgcagcacggcatgatctgtctgtacgacagccagcaggcgattttgactattgaagcgttgcaggaagccgatcagcagttgatccccggcagctcgcaaattcgctaccgtccgggtgaagggctggtcgggacggtgctttcgcaggggcaatcgttagtgctggcgcgtgtggctgacgatcagcgctttcttgaccgcctgggactgtatgattacaacctgccgtttatcgccgtgccgctgatagggccggatgcgcagacttttggcgtgctgacggcgcaaccgatggcgcgttacgaagagcggttacccgcctgcacccgctttctggaaacggtc 183 tccctgtgcgccgcgtcgccgatggtggccagccaactggcgcgctacccgatcctgctcgatgaactgctcgacccgaacacgctctatcaaccgacggcgatgaacgcctatcgcgatgaactgcgacaatacctgttgcgcgtgccggaagaggatgaagagcagcaactggaggcgctacggcagtttaagcaggcgcagttgttgcgcgtagcggcggcggatatcgccggtacgttacccgtcatgaaagtgagcgatcacttaacctggctggcggaagcgattatcgatgcggtggtgcagcaagcctggaaccagatggtggcgcgttacggccagccgacgcatctgcacgatcgcgaagggcgcggtttcgccgtggtcggttacggcaaacttggcggctgggaattaggttacagctccgatctggatctggtgttcctgcacgactgccccatggatgtgatgaccgatggcgagcgtgaaatcgatggccgccagttctatttgcgcctcgcgcagcgcgtgatgcacctgttcagcacgcgcacgtcgtccggcattctttatgaagtcgatgcgcgtttgcgcccgtccggcgcggccggaatgctggtgaccactgcggaagcgttcgccgattatcaaaaaaatgaagcctggacatgggagcatcaggcgctggcgcgtgcgcgcgtggtgtacggcgatccgcaactgaccgccgaatttgacgccattcgccgcgatatcctgatgacctcccgcgatgccgctaccctgcaaaccgaagtgcgggaaatgcgtgagaaaatgcgcgcccatcttggtaacaagcacaaagaccgtttcgatctgaaagccgatgaaggcggtatcaccgatattgagtttatcgctcagtatctggtgctgcgctttgcccatgagaagccgaaactgacgcgctggtcggataatgtgcgcatcctcgaagggctggcgcaaaacggcatcatggatgagcaggaagcgcaggcattgacgctggcgtacaccacgttgcgtgatgagctgcaccacctggcgctgcaagagctgccaggacatgtggcgctctcctgttttgtcgccgagcgtgcgcttatcaaaaccagctgggacaagtggctggtggaaccgtgcgccccggcgtaa 184 taaagcgagcgctcacttacgtgatctgttgacgcagtccgaagcgaccattacttcagccgtttcagcagatacggcggtgtggagtgcgcaatcagccctggcgaaactggtgctcaccgagtggttagtgacgcagggctggcgaaccttccttgatgaaaaagcgcaggctaagtttgccgactcctttaaacgctttgctgacgttcatctgtcacgcagcgccgccgagctgaaaaaagcctttgcccagccgctgggcgacagctatcgcgaccagttaccgcggctggcgcgtgatatcgacagcgcgttattgctggccggacattacgatcgcgcgcgcgccgtggagtggctggaaaactggcaggggcttcagcacgctattgaaacgcgccagagagttgaaatcgaacatttccgtaataccgccattacccaggagccgttctggttgcacagcggaaaacgttaacgaaaggatatttcgcatgtccctgtgcgccgcgtcgccgatggtggccagccaactggcgcgctacccgatcctgctcgatgaactgctcgacccgaacacgctctatcaaccgacggcgatgaacgcctatcgcgatgaactgcgacaatacctgttgcgcgtgccggaagaggatgaagagcagcaactggaggcgctacggcagtttaagcaggcgcagttgttgcgcgtagcggcggcggatatcgccggtacgttacccgtcatgaaagtgagcgatcacttaacctggctggcggaagcgattatcgatgcggtggtgcagcaagcctggaaccagatggtggcgcgttacggccagccgacgcatctgcacgatcgcgaagggcgcggtttcgccgtggtcggttacggcaaacttggcggctgggaattaggttacagctccgatctggatctggtgttcctgcacgactgccccatggatgtgatgaccgatggcgagcgtgaaatcgatggccgccagttctatttgcgcctcgcgcagcgcgtgatgcacctgttcagcacgcgcacgtcgtccggcattctttatgaagtcgatgcgcgtttgcgcccgtccggcgcggccggaatgctggtgaccactgcggaagcgttcgccgattatcaaaaaaatgaagcctggacatgggagcatcaggcgctggcgcgtgcgcgcgtggtgtacggcgatccgcaactgaccgccgaatttgacgccattcgccgcgatatcctgatgacctcccgcgatgccgctaccctgcaaaccgaagtgcgggaaatgcgtgagaaaatgcgcgcccatcttggtaacaagcacaaagaccgtttcgatctgaaagccgatgaaggcggtatcaccgatattgagtttatcgctcagtatctggtgctgcgctttgcccatgagaagccgaaactgacgcgctggtcggataatgtgcgcatcctcgaagggctggcgcaaaacggcatcatggatgagcaggaagcgcaggcattgacgctggcgtacaccacgttgcgtgatgagctgcaccacctggcgctgcaagagctgccaggacatgtggcgctctcctgttttgtcgccgagcgtgcgcttatcaaaaccagctgggacaagtggctggtggaaccgtgcgccccggcgtaagtgtggtatcatcgcgcgcaaattttgtatctctcaggagacaggaatgaaagttacgctgccagagttcaatcaagccggtgtcatggtggtgggtgatgtgatgctggatcgctactggtacggcccaaccagccgcatttctccggaagcgccagttccggttgttaaagtcgatactattgaagagcgaccgggcggtgcggcaaacgtggcgatgaacattgcctcgctgggcgcaacggcgcgtctggttggcctgactggcattgatgatgcggcgcgcgcgctgagcaaagcgctggcggatgttaatgttaaatgtgacttcgtttctgttccgactcaccccaccatcactaagctgcgcgtgctgtcgcgtaaccagcaactgattcgc 185 atgaccctgaatatgatgatggatgccagccgttctgtaataataaccggacaattcggactgattaaaaaagcgccctcgcggcgctttttttatattctcgactccatttaaaataaaaaatccaatcggatttcactatttaaactggccattatctaagatgaatccgatggaagctcgctgttttaacacgcgttttttaaccttttattgaaagtcggtgcttctttgagcgaacgatcaaatttaagtggattcccatcaaaaaaatattctcaacctaaaaaagtttgtgtaatacttgtaacgctacatggagattaactcaatctagagggtattaataatgaatcgtactaaactggtactgggcgcaactcacttcacgccccgaagggggaagctgcctgaccctacgattcccgctatttcattcactgaccggaggttcaaaatga 186 accggataagagagaaaagtgtcgacgtcggtccggttgatattgaccggcgcatccgccagctcgcccagtttttggtggatctgtttggcgattttgcgggtcttgccggtgtcggtgccgaaaaaaataccaatatttgccataacacacgctcctgttgaaaaagagatcccgcggggaaaatgcggtgaacatgtcagctattgcgaagagtgtgccagttttgctcacgggcaaaagctgcaccagaatgggtattaatgcaccagcctggcgctttttttcgcggcacgtcccctcgctaatgcccgtctggcgcggctttgacgctgataaggcgctgaataccgatctggatcaaggttttgtcgggttatcgtccaaaaggtgcactctttgcatggttataagtgcctgacatggtgtccgggcgaacgtcgccaggtggcacaaattgtcagaactacgacacgactaaccgaccgcaggagtgtgcgatgaccctgaatatgatgatggatgccagccgttctgtaataataaccggacaattcggactgattaaaaaagcgccctcgcggcgctttttttatattctcgactccatttaaaataaaaaatccaatcggatttcactatttaaactggccattatctaagatgaatccgatggaagctcgctgttttaacacgcgttttttaaccttttattgaaagtcggtgcttctttgagcgaacgatcaaatttaagtggattcccatcaaaaaaatattctcaacctaaaaaagtttgtgtaatacttgtaacgctacatggagattaactcaatctagagggtattaataatgaatcgtactaaactggtactgggcgcaactcacttcacgccccgaagggggaagctgcctgaccctacgattcccgctatttcattcactgaccggaggttcaaaatgacccagcgaaccgagtcgggtaataccgtctggcgcttcgatttatcccagcagttcaccgcgatgcagcggataagcgtggttctcagccgggcgaccgaggttgaacagacactccagcaggtgctgtgcgtattgcacaatgacgcctttttgcagcacggcatgatctgtctgtacgacagccagcaggcgattttgactattgaagcgttgcaggaagccgatcagcagttgatccccggcagctcgcaaattcgctaccgtccgggtgaagggctggtcgggacggtgctttcgcaggggcaatcgttagtgctggcgcgtgtggctgacgatcagcgctttcttgaccgcctgggactgtatgattacaacctgccgtttatcgccgtgccgctgatagggccggatgcgcagacttttggcgtgctgacggcgcaaccgatggcgcgttacgaagagcggttacccgcctgcacccgctttctggaaacggtc 187 tccctgtgcgccgcgtcgccgatggtggccagccaactggcgcgctacccgatcctgctcgatgaactgctcgacccgaacacgctctatcaaccgacggcgatgaacgcctatcgcgatgaactgcgacaatacctgttgcgcgtgccggaagaggatgaagagcagcaactggaggcgctacggcagtttaagcaggcgcagttgttgcgcgtagcggcggcggatatcgccggtacgttacccgtcatgaaagtgagcgatcacttaacctggctggcggaagcgattatcgatgcggtggtgcagcaagcctggaaccagatggtggcgcgttacggccagccgacgcatctgcacgatcgcgaagggcgcggtttcgccgtggtcggttacggcaaacttggcggctgggaattaggttacagctccgatctggatctggtgttcctgcacgactgccccatggatgtgatgaccgatggcgagcgtgaaatcgatggccgccagttctatttgcgcctcgcgcagcgcgtgatgcacctgttcagcacgcgcacgtcgtccggcattctttatgaagtcgatgcgcgtttgcgcccgtccggcgcggccggaatgctggtgaccactgcggaagcgttcgccgattatcaaaaaaatgaagcctggacatgggagcatcaggcgctggcgcgtgcgcgcgtggtgtacggcgatccgcaactgaccgccgaatttgacgccattcgccgcgatatcctgatgacctcccgcgatgccgctaccctgcaaaccgaagtgcgggaaatgcgtgagaaaatgcgcgcccatcttggtaacaagcacaaagaccgtttcgatctgaaagccgatgaaggcggtatcaccgatattgagtttatcgctcagtatctggtgctgcgctttgcccatgagaagccgaaactgacgcgctggtcggataatgtgcgcatcctcgaagggctggcgcaaaacggcatcatggatgagcaggaagcgcaggcattgacgctggcgtacaccacgttgcgtgatgagctgcaccacctggcgctgcaagagctgccaggacatgtggcgctctcctgttttgtcgccgagcgtgcgcttatcaaaaccagctgggacaagtggctggtggaaccgtgcgccccggcgtaa 188 taaagcgagcgctcacttacgtgatctgttgacgcagtccgaagcgaccattacttcagccgtttcagcagatacggcggtgtggagtgcgcaatcagccctggcgaaactggtgctcaccgagtggttagtgacgcagggctggcgaaccttccttgatgaaaaagcgcaggctaagtttgccgactcctttaaacgctttgctgacgttcatctgtcacgcagcgccgccgagctgaaaaaagcctttgcccagccgctgggcgacagctatcgcgaccagttaccgcggctggcgcgtgatatcgacagcgcgttattgctggccggacattacgatcgcgcgcgcgccgtggagtggctggaaaactggcaggggcttcagcacgctattgaaacgcgccagagagttgaaatcgaacatttccgtaataccgccattacccaggagccgttctggttgcacagcggaaaacgttaacgaaaggatatttcgcatgtccctgtgcgccgcgtcgccgatggtggccagccaactggcgcgctacccgatcctgctcgatgaactgctcgacccgaacacgctctatcaaccgacggcgatgaacgcctatcgcgatgaactgcgacaatacctgttgcgcgtgccggaagaggatgaagagcagcaactggaggcgctacggcagtttaagcaggcgcagttgttgcgcgtagcggcggcggatatcgccggtacgttacccgtcatgaaagtgagcgatcacttaacctggctggcggaagcgattatcgatgcggtggtgcagcaagcctggaaccagatggtggcgcgttacggccagccgacgcatctgcacgatcgcgaagggcgcggtttcgccgtggtcggttacggcaaacttggcggctgggaattaggttacagctccgatctggatctggtgttcctgcacgactgccccatggatgtgatgaccgatggcgagcgtgaaatcgatggccgccagttctatttgcgcctcgcgcagcgcgtgatgcacctgttcagcacgcgcacgtcgtccggcattctttatgaagtcgatgcgcgtttgcgcccgtccggcgcggccggaatgctggtgaccactgcggaagcgttcgccgattatcaaaaaaatgaagcctggacatgggagcatcaggcgctggcgcgtgcgcgcgtggtgtacggcgatccgcaactgaccgccgaatttgacgccattcgccgcgatatcctgatgacctcccgcgatgccgctaccctgcaaaccgaagtgcgggaaatgcgtgagaaaatgcgcgcccatcttggtaacaagcacaaagaccgtttcgatctgaaagccgatgaaggcggtatcaccgatattgagtttatcgctcagtatctggtgctgcgctttgcccatgagaagccgaaactgacgcgctggtcggataatgtgcgcatcctcgaagggctggcgcaaaacggcatcatggatgagcaggaagcgcaggcattgacgctggcgtacaccacgttgcgtgatgagctgcaccacctggcgctgcaagagctgccaggacatgtggcgctctcctgttttgtcgccgagcgtgcgcttatcaaaaccagctgggacaagtggctggtggaaccgtgcgccccggcgtaagtgtggtatcatcgcgcgcaaattttgtatctctcaggagacaggaatgaaagttacgctgccagagttcaatcaagccggtgtcatggtggtgggtgatgtgatgctggatcgctactggtacggcccaaccagccgcatttctccggaagcgccagttccggttgttaaagtcgatactattgaagagcgaccgggcggtgcggcaaacgtggcgatgaacattgcctcgctgggcgcaacggcgcgtctggttggcctgactggcattgatgatgcggcgcgcgcgctgagcaaagcgctggcggatgttaatgttaaatgtgacttcgtttctgttccgactcaccccaccatcactaagctgcgcgtgctgtcgcgtaaccagcaactgattcgc 189 atgaccctgaatatgatgatggatgccagccgcgtcaggttgaacgtaaaaaagtcggtctgcgcaaagcacgtcgtcgtccgcagttctccaaacgttaattggtttctgcttcggcagaacgattggcgaaaaaacccggtgcgaaccgggtttttttatggataaagatcgtgttatccacagcaatccattgattatctcttctttttcagcatttccagaatcccctcaccacaaagcccgcaaaatctggtaaactatcatccaattttctgcccaaatggctgggattgttcattttttgtttgccttacaacgagagtgacagtacgcgcgggtagttaactcaacatctgaccggtcgataactcacttcacgccccgaagggggaagctgcctgaccctacgattcccgctatttcattcactgaccggaggttcaaaatga 190 accggataagagagaaaagtgtcgacgtcggtccggttgatattgaccggcgcatccgccagctcgcccagtttttggtggatctgtttggcgattttgcgggtcttgccggtgtcggtgccgaaaaaaataccaatatttgccataacacacgctcctgttgaaaaagagatcccgcggggaaaatgcggtgaacatgtcagctattgcgaagagtgtgccagttttgctcacgggcaaaagctgcaccagaatgggtattaatgcaccagcctggcgctttttttcgcggcacgtcccctcgctaatgcccgtctggcgcggctttgacgctgataaggcgctgaataccgatctggatcaaggttttgtcgggttatcgtccaaaaggtgcactctttgcatggttataagtgcctgacatggtgtccgggcgaacgtcgccaggtggcacaaattgtcagaactacgacacgactaaccgaccgcaggagtgtgcgatgaccctgaatatgatgatggatgccagccgcgtcaggttgaacgtaaaaaagtcggtctgcgcaaagcacgtcgtcgtccgcagttctccaaacgttaattggtttctgcttcggcagaacgattggcgaaaaaacccggtgcgaaccgggtttttttatggataaagatcgtgttatccacagcaatccattgattatctcttctttttcagcatttccagaatcccctcaccacaaagcccgcaaaatctggtaaactatcatccaattttctgcccaaatggctgggattgttcattttttgtttgccttacaacgagagtgacagtacgcgcgggtagttaactcaacatctgaccggtcgataactcacttcacgccccgaagggggaagctgcctgaccctacgattcccgctatttcattcactgaccggaggttcaaaatgacccagcgaaccgagtcgggtaataccgtctggcgcttcgatttatcccagcagttcaccgcgatgcagcggataagcgtggttctcagccgggcgaccgaggttgaacagacactccagcaggtgctgtgcgtattgcacaatgacgcctttttgcagcacggcatgatctgtctgtacgacagccagcaggcgattttgactattgaagcgttgcaggaagccgatcagcagttgatccccggcagctcgcaaattcgctaccgtccgggtgaagggctggtcgggacggtgctttcgcaggggcaatcgttagtgctggcgcgtgtggctgacgatcagcgctttcttgaccgcctgggactgtatgattacaacctgccgtttatcgccgtgccgctgatagggccggatgcgcagacttttggcgtgctgacggcgcaaccgatggcgcgttacgaagagcggttacccgcctgcacccgctttctggaaacggt 191 atggcgctgaagcacctgatcacgctctgcgcggcgtcgccgatggtcgccagccagctggcgcgccacccgctgctgctggatgagctgctggatcccaacaccctctatcagccgacggcgaccgatgcctatcgcgacgagctgcgccagtacctgctgcgcgtgccggaagaggatgaagagcagcagctggaggcgttgcgccagtttaagcaggcgcagcagctgcatatcgcggcggcggatatcgctggtaccctgccggtgatgaaggtcagcgatcacttaacctggcttgccgaagcgatcctcgacgcggtggtgcagcaggcatgggggcagatggtcgctcgctacggccagccgacccacctgcacgatcgccagggtcgcggcttcgccgtcgtcggctacggtaagcttggcggctgggagctgggctacagctccgatctcgatctggtgttcctccatgactgcccggcggaggtgatgaccgacggcgagcgggagattgacggccgtcagttctacctgcggctggcccagcggatcatgcacctgttcagcacccgcacctcgtccggtattctctacgaagtggacgcccggctgcgtccttctggcgcggcggggatgctggtcaccaccgccgacgcgtttgctgactatcagcagaacgaagcctggacgtgggaacatcaggcgctggtgcgcgcccgcgtggtctatggcgacccggcgctgcaggcgcgctttgacgccattcgtcgcgatatcctgaccaccccgcgggaggggatgaccctgcagaccgaggttcgcgagatgcgcgagaagatgcgcgcccaccttggcaacaaacatcccgatcgttttgatatcaaagccgatgccggcgggatcaccgatattgaatttattactcagtatctggtcctacgctatgccagtgacaagccgaagctgacccgctggtctgacaacgtgcgtattcttgagctgctggcgcagaacgacatcatggacgaggaggaggcgcgcgccttaacgcatgcgtacaccaccttgcgtgatgcgctccatcacctggccctgcaggagcagccgggacacgtggcgccagaggccttcagccgggagcgtcagcaggtcagcgccagctggcagaagtggctgatggcttaa 192 cgtaaggcgaccacccagctccgcgcgttgctgaacgacgctgaagccgttctgctggccgcggacaccgccgacgaggcgttattccgcaccgaggtcgtcggcgccaaactggccctgactgaatggctggtccagcgcggctggcgtccgttcctcaacgaggcaggagagaaaaaaatagccggatcgttcaaacggtttgccgatattaacctctcgcgggtggcggccgagctgcgcagcgccgtgcagcatctggcggttgaagatgccgccgaccagttgccgaagctgtcccgcgacatcgacagcgtccagctgctggcgggcgcctatggcgacgccgtcgcgccgtggctggagaactggcaggagcttcaccgtgcaatagcacatgacgatcgcagcgtctttgaatatttccgtcgccaggcgctggctgccgagccgttctggctgcatagtggaaaacgataatttcaggccagggagcccttatggcgctgaagcacctgatcacgctctgcgcggcgtcgccgatggtcgccagccagctggcgcgccacccgctgctgctggatgagctgctggatcccaacaccctctatcagccgacggcgaccgatgcctatcgcgacgagctgcgccagtacctgctgcgcgtgccggaagaggatgaagagcagcagctggaggcgttgcgccagtttaagcaggcgcagcagctgcatatcgcggcggcggatatcgctggtaccctgccggtgatgaaggtcagcgatcacttaacctggcttgccgaagcgatcctcgacgcggtggtgcagcaggcatgggggcagatggtcgctcgctacggccagccgacccacctgcacgatcgccagggtcgcggcttcgccgtcgtcggctacggtaagcttggcggctgggagctgggctacagctccgatctcgatctggtgttcctccatgactgcccggcggaggtgatgaccgacggcgagcgggagattgacggccgtcagttctacctgcggctggcccagcggatcatgcacctgttcagcacccgcacctcgtccggtattctctacgaagtggacgcccggctgcgtccttctggcgcggcggggatgctggtcaccaccgccgacgcgtttgctgactatcagcagaacgaagcctggacgtgggaacatcaggcgctggtgcgcgcccgcgtggtctatggcgacccggcgctgcaggcgcgctttgacgccattcgtcgcgatatcctgaccaccccgcgggaggggatgaccctgcagaccgaggttcgcgagatgcgcgagaagatgcgcgcccaccttggcaacaaacatcccgatcgttttgatatcaaagccgatgccggcgggatcaccgatattgaatttattactcagtatctggtcctacgctatgccagtgacaagccgaagctgacccgctggtctgacaacgtgcgtattcttgagctgctggcgcagaacgacatcatggacgaggaggaggcgcgcgccttaacgcatgcgtacaccaccttgcgtgatgcgctccatcacctggccctgcaggagcagccgggacacgtggcgccagaggccttcagccgggagcgtcagcaggtcagcgccagctggcagaagtggctgatggcttaactataaaatcgggtgtgctattatcgcgcgcaaagtttgcgtctcgcaggagagagtcatgaaagtaacgctgccggagtttgaacgtgcaggagtgttggtggtgggtgatgtgatgctggaccgctactggtacggccccaccagtcgtatttccccggaagccccggtgccggtggtgaaggtggaaaatatcgaagaacgtcctggcggcgcggcaaacgtagcgatgaacatcgcctccctgggggcaacgtcgcgcctggtgggattgaccgggattgatgacgctgcccgcgcgctgagccaggcgctggccaatgtgaatgtgaagtgcgacttcgtctccgtcccgactcacccgaccatcaccaagctgcgggtgctgtcgcgcaatcagcagctgatccgcctcgactttgaagagggcttctccggcgtggatccgcagccgatgcatgagcgcattcagcaggcgctgggagccattggcgcactgg 193 atgaccctgaatatgatgctagaagcgtcaggtaccggtcatgattcaccgtgcgattctcggttccctggagcgcttcattggcatcctgaccgaagagttcgctggcttcttcccaacctggattgcaccagtgcaggtagtggtcatgaatattaccgattctcaggctgaatacgttaacgaattgacgcgtaaactacaaaatgcgggcattcgtgtaaaagcagacttgagaaatgagaagattggctttaaaatccgcgagcacactttacgtcgtgtcccgtatatgttggtctgtggcgacaaagaagtcgaagccggcaaagtggccgtgcgcacccgtcgcgggaaagacctcggcagcatggacgtaagtgaagtgattgagaagctgcaacaagagattcgcagccgcagtcttcaacaactggaggaataaggtattaaaggcggaaaacgagttcaaacggcacgtccgaatcgtatcaatggcgagattcgcgccctggaagttcgcgccattgagctggcttcccgaccgcagggcggcacctgcctgaccctgcgtttcccgctgtttaacaccctgaccggaggtgaagcatga 194 ggccgtcgcccagcgtcggcgtccccaacagcagggccgggtaggccagcaggtccgccagcgtggcgcggttaatattgaccggggcggcggcggcctcccccagctgcttgtggatcattttcgcgatcttgcgggttttaccggtatcggtaccaaagaaaatgccaatgttcgccatagtacgctcctgtcggaatggtgttgaaaaaaggaatgacgacagaggtattgcgaaggctgtgccaggttgccctgcaccgcgacggcccatccctgccccatcaggatcgcttcgcatcacgatgccgcgcgccaaaggcgcacccggcggggcgaaaggtaaaaatccgtgaattttccccctgtcggatcaatgtttcgcgtggtcgttccgataagggcgcacactttgcatggttatccgggttcggcttaccccgccgcgttttgcgcacggtgtcggacaatttgtcataactgcgacacaggagtttgcgatgaccctgaatatgatgctagaagcgtcaggtaccggtcatgattcaccgtgcgattctcggttccctggagcgcttcattggcatcctgaccgaagagttcgctggcttcttcccaacctggattgcaccagtgcaggtagtggtcatgaatattaccgattctcaggctgaatacgttaacgaattgacgcgtaaactacaaaatgcgggcattcgtgtaaaagcagacttgagaaatgagaagattggctttaaaatccgcgagcacactttacgtcgtgtcccgtatatgttggtctgtggcgacaaagaagtcgaagccggcaaagtggccgtgcgcacccgtcgcgggaaagacctcggcagcatggacgtaagtgaagtgattgagaagctgcaacaagagattcgcagccgcagtcttcaacaactggaggaataaggtattaaaggcggaaaacgagttcaaacggcacgtccgaatcgtatcaatggcgagattcgcgccctggaagttcgcgccattgagctggcttcccgaccgcagggcggcacctgcctgaccctgcgtttcccgctgtttaacaccctgaccggaggtgaagcatgatccctgaatccgacccggacaccaccgtcagacgcttcgacctctctcagcagttcaccgccatgcagcggataagcgtggtgctgagccgggccaccgaggccagcaaaacgctgcaggaggtgctcagcgtattacacaacgatgcctttatgcagcacgggatgatctgcctgtacgacagcgagcaggagatcctcagtatcgaagcgctgcagcaaaccggccagcagcccctccccggcagcacgcagatccgctatcgccccggcgagggactggtggggaccgtgctggcccaggggcagtcgctggtgctgccccgggtcgccgacgatcagcgttttctcgaccgcctgagcctctacgattacgatctgccgtttatcgccgtaccgttgatggggcccaacgcccggccaataggggtgctggcggcccagccgatggcgcgccaggaagagcggctgccggcctgcacccgttttctcgaaaccgtc 195 atggcgctgaagcacctgatcacgctctgcgcggcgtcgccgatggtcgccagccagctggcgcgccacccgctgctgctggatgagctgctggatcccaacaccctctatcagccgacggcgaccgatgcctatcgcgacgagctgcgccagtacctgctgcgcgtgccggaagaggatgaagagcagcagctgcatatcgcggcggcggatatcgctggtaccctgccggtgatgaaggtcagcgatcacttaacctggcttgccgaagcgatcctcgacgcggtggtgcagcaggcatgggggcagatggtcgctcgctacggccagccgacccacctgcacgatcgccagggtcgcggcttcgccgtcgtcggctacggtaagcttggcggctgggagctgggctacagctccgatctcgatctggtgttcctccatgactgcccggcggaggtgatgaccgacggcgagcgggagattgacggccgtcagttctacctgcggctggcccagcggatcatgcacctgttcagcacccgcacctcgtccggtattctctacgaagtggacgcccggctgcgtccttctggcgcggcggggatgctggtcaccaccgccgacgcgtttgctgactatcagcagaacgaagcctggacgtgggaacatcaggcgctggtgcgcgcccgcgtggtctatggcgacccggcgctgcaggcgcgctttgacgccattcgtcgcgatatcctgaccaccccgcgggaggggatgaccctgcagaccgaggttcgcgagatgcgcgagaagatgcgcgcccaccttggcaacaaacatcccgatcgttttgatatcaaagccgatgccggcgggatcaccgatattgaatttattactcagtatctggtcctacgctatgccagtgacaagccgaagctgacccgctggtctgacaacgtgcgtattcttgagctgctggcgcagaacgacatcatggacgaggaggaggcgcgcgccttaacgcatgcgtacaccaccttgcgtgatgcgctccatcacctggccctgcaggagcagccgggacacgtggcgccagaggccttcagccgggagcgtcagcaggtcagcgccagctggcagaagtggctgatggcttaa 196 cgtaaggcgaccacccagctccgcgcgttgctgaacgacgctgaagccgttctgctggccgcggacaccgccgacgaggcgttattccgcaccgaggtcgtcggcgccaaactggccctgactgaatggctggtccagcgcggctggcgtccgttcctcaacgaggcaggagagaaaaaaatagccggatcgttcaaacggtttgccgatattaacctctcgcgggtggcggccgagctgcgcagcgccgtgcagcatctggcggttgaagatgccgccgaccagttgccgaagctgtcccgcgacatcgacagcgtccagctgctggcgggcgcctatggcgacgccgtcgcgccgtggctggagaactggcaggagcttcaccgtgcaatagcacatgacgatcgcagcgtctttgaatatttccgtcgccaggcgctggctgccgagccgttctggctgcatagtggaaaacgataatttcaggccagggagcccttatggcgctgaagcacctgatcacgctctgcgcggcgtcgccgatggtcgccagccagctggcgcgccacccgctgctgctggatgagctgctggatcccaacaccctctatcagccgacggcgaccgatgcctatcgcgacgagctgcgccagtacctgctgcgcgtgccggaagaggatgaagagcagcagctgcatatcgcggcggcggatatcgctggtaccctgccggtgatgaaggtcagcgatcacttaacctggcttgccgaagcgatcctcgacgcggtggtgcagcaggcatgggggcagatggtcgctcgctacggccagccgacccacctgcacgatcgccagggtcgcggcttcgccgtcgtcggctacggtaagcttggcggctgggagctgggctacagctccgatctcgatctggtgttcctccatgactgcccggcggaggtgatgaccgacggcgagcgggagattgacggccgtcagttctacctgcggctggcccagcggatcatgcacctgttcagcacccgcacctcgtccggtattctctacgaagtggacgcccggctgcgtccttctggcgcggcggggatgctggtcaccaccgccgacgcgtttgctgactatcagcagaacgaagcctggacgtgggaacatcaggcgctggtgcgcgcccgcgtggtctatggcgacccggcgctgcaggcgcgctttgacgccattcgtcgcgatatcctgaccaccccgcgggaggggatgaccctgcagaccgaggttcgcgagatgcgcgagaagatgcgcgcccaccttggcaacaaacatcccgatcgttttgatatcaaagccgatgccggcgggatcaccgatattgaatttattactcagtatctggtcctacgctatgccagtgacaagccgaagctgacccgctggtctgacaacgtgcgtattcttgagctgctggcgcagaacgacatcatggacgaggaggaggcgcgcgccttaacgcatgcgtacaccaccttgcgtgatgcgctccatcacctggccctgcaggagcagccgggacacgtggcgccagaggccttcagccgggagcgtcagcaggtcagcgccagctggcagaagtggctgatggcttaactataaaatcgggtgtgctattatcgcgcgcaaagtttgcgtctcgcaggagagagtcatgaaagtaacgctgccggagtttgaacgtgcaggagtgttggtggtgggtgatgtgatgctggaccgctactggtacggccccaccagtcgtatttccccggaagccccggtgccggtggtgaaggtggaaaatatcgaagaacgtcctggcggcgcggcaaacgtagcgatgaacatcgcctccctgggggcaacgtcgcgcctggtgggattgaccgggattgatgacgctgcccgcgcgctgagccaggcgctggccaatgtgaatgtgaagtgcgacttcgtctccgtcccgactcacccgaccatcaccaagctgcgggtgctgtcgcgcaatcagcagctgatccgcctcgactttgaagagggcttctccggcgtggatccgcagccgatgcatgagcgcattcagcaggcgctgggagccattggcgcactgg 197 atgaccctgaatatgatgctcgacgccgtcctcgcagtaccattgcaaccgactttacagcaagaagtgattctggcacgcatggaacaaattcttgccagtcgggctttatccgatgacgaacgcgcacagcttttatatgagcgcggagtgttgtatgatagtctcggtctgagggcattagcgcgaaatgatttttcacaagcgctggcaatccgacccgatatgcctgaagtattcaattacttaggcatttacttaacgcaggcaggcaattttgatgctgcctatgaagcgtttgattctgtacttgagcttgatcgccattgagctggcttcccgaccgcagggcggcacctgcctgaccctgcgtttcccgctgtttaacaccctgaccggaggtgaagcatga 198 cccaacagcagggccgggtaggccagcaggtccgccagcgtggcgcggttaatattgaccggggcggcggcggcctcccccagctgcttgtggatcattttcgcgatcttgcgggttttaccggtatcggtaccaaagaaaatgccaatgttcgccatagtacgctcctgtcggaatggtgttgaaaaaaggaatgacgacagaggtattgcgaaggctgtgccaggttgccctgcaccgcgacggcccatccctgccccatcaggatcgcttcgcatcacgatgccgcgcgccaaaggcgcacccggcggggcgaaaggtaaaaatccgtgaattttccccctgtcggatcaatgtttcgcgtggtcgttccgataagggcgcacactttgcatggttatccgggttcggcttaccccgccgcgttttgcgcacggtgtcggacaatttgtcataactgcgacacaggagtttgcgatgaccctgaatatgatgctcgacgccgtcctcgcagtaccattgcaaccgactttacagcaagaagtgattctggcacgcatggaacaaattcttgccagtcgggctttatccgatgacgaacgcgcacagcttttatatgagcgcggagtgttgtatgatagtctcggtctgagggcattagcgcgaaatgatttttcacaagcgctggcaatccgacccgatatgcctgaagtattcaattacttaggcatttacttaacgcaggcaggcaattttgatgctgcctatgaagcgtttgattctgtacttgagcttgatcgccattgagctggcttcccgaccgcagggcggcacctgcctgaccctgcgtttcccgctgtttaacaccctgaccggaggtgaagcatgatccctgaatccgacccggacaccaccgtcagacgcttcgacctctctcagcagttcaccgccatgcagcggataagcgtggtgctgagccgggccaccgaggccagcaaaacgctgcaggaggtgctcagcgtattacacaacgatgcctttatgcagcacgggatgatctgcctgtacgacagcgagcaggagatcctcagtatcgaagcgctgcagcaaaccggccagcagcccctccccggcagcacgcagatccgctatcgccccggcgagggactggtggggaccgtgctggcccaggggcagtcgctggtgctgccccgggtcgccgacgatcagcgttttctcgaccgcctgagcctctacgattacgatctgccgtttatcgccgtaccgttgatggggcccaacgcccggccaataggggtgctggcggcccagccgatggcgcgccaggaagagcggctgccggcctgcacccgttttctcgaaaccgtc 199 atggcgctgaagcacctgatcacgctctgcgcggcgtcgccgatggtcgccagccagctggcgcgccacccgctgctgctggatgagctgctggatcccaacaccctctatcagccgacggcgaccgatgcctatcgcgacgagctgcgccagtacctgctgcgcgtgccggaagaggatgaagagcagcagctgcatatcgcggcggcggatatcgctggtaccctgccggtgatgaaggtcagcgatcacttaacctggcttgccgaagcgatcctcgacgcggtggtgcagcaggcatgggggcagatggtcgctcgctacggccagccgacccacctgcacgatcgccagggtcgcggcttcgccgtcgtcggctacggtaagcttggcggctgggagctgggctacagctccgatctcgatctggtgttcctccatgactgcccggcggaggtgatgaccgacggcgagcgggagattgacggccgtcagttctacctgcggctggcccagcggatcatgcacctgttcagcacccgcacctcgtccggtattctctacgaagtggacgcccggctgcgtccttctggcgcggcggggatgctggtcaccaccgccgacgcgtttgctgactatcagcagaacgaagcctggacgtgggaacatcaggcgctggtgcgcgcccgcgtggtctatggcgacccggcgctgcaggcgcgctttgacgccattcgtcgcgatatcctgaccaccccgcgggaggggatgaccctgcagaccgaggttcgcgagatgcgcgagaagatgcgcgcccaccttggcaacaaacatcccgatcgttttgatatcaaagccgatgccggcgggatcaccgatattgaatttattactcagtatctggtcctacgctatgccagtgacaagccgaagctgacccgctggtctgacaacgtgcgtattcttgagctgctggcgcagaacgacatcatggacgaggaggaggcgcgcgccttaacgcatgcgtacaccaccttgcgtgatgcgctccatcacctggccctgcaggagcagccgggacacgtggcgccagaggccttcagccgggagcgtcagcaggtcagcgccagctggcagaagtggctgatggcttaa 200 cgtaaggcgaccacccagctccgcgcgttgctgaacgacgctgaagccgttctgctggccgcggacaccgccgacgaggcgttattccgcaccgaggtcgtcggcgccaaactggccctgactgaatggctggtccagcgcggctggcgtccgttcctcaacgaggcaggagagaaaaaaatagccggatcgttcaaacggtttgccgatattaacctctcgcgggtggcggccgagctgcgcagcgccgtgcagcatctggcggttgaagatgccgccgaccagttgccgaagctgtcccgcgacatcgacagcgtccagctgctggcgggcgcctatggcgacgccgtcgcgccgtggctggagaactggcaggagcttcaccgtgcaatagcacatgacgatcgcagcgtctttgaatatttccgtcgccaggcgctggctgccgagccgttctggctgcatagtggaaaacgataatttcaggccagggagcccttatggcgctgaagcacctgatcacgctctgcgcggcgtcgccgatggtcgccagccagctggcgcgccacccgctgctgctggatgagctgctggatcccaacaccctctatcagccgacggcgaccgatgcctatcgcgacgagctgcgccagtacctgctgcgcgtgccggaagaggatgaagagcagcagctgcatatcgcggcggcggatatcgctggtaccctgccggtgatgaaggtcagcgatcacttaacctggcttgccgaagcgatcctcgacgcggtggtgcagcaggcatgggggcagatggtcgctcgctacggccagccgacccacctgcacgatcgccagggtcgcggcttcgccgtcgtcggctacggtaagcttggcggctgggagctgggctacagctccgatctcgatctggtgttcctccatgactgcccggcggaggtgatgaccgacggcgagcgggagattgacggccgtcagttctacctgcggctggcccagcggatcatgcacctgttcagcacccgcacctcgtccggtattctctacgaagtggacgcccggctgcgtccttctggcgcggcggggatgctggtcaccaccgccgacgcgtttgctgactatcagcagaacgaagcctggacgtgggaacatcaggcgctggtgcgcgcccgcgtggtctatggcgacccggcgctgcaggcgcgctttgacgccattcgtcgcgatatcctgaccaccccgcgggaggggatgaccctgcagaccgaggttcgcgagatgcgcgagaagatgcgcgcccaccttggcaacaaacatcccgatcgttttgatatcaaagccgatgccggcgggatcaccgatattgaatttattactcagtatctggtcctacgctatgccagtgacaagccgaagctgacccgctggtctgacaacgtgcgtattcttgagctgctggcgcagaacgacatcatggacgaggaggaggcgcgcgccttaacgcatgcgtacaccaccttgcgtgatgcgctccatcacctggccctgcaggagcagccgggacacgtggcgccagaggccttcagccgggagcgtcagcaggtcagcgccagctggcagaagtggctgatggcttaactataaaatcgggtgtgctattatcgcgcgcaaagtttgcgtctcgcaggagagagtcatgaaagtaacgctgccggagtttgaacgtgcaggagtgttggtggtgggtgatgtgatgctggaccgctactggtacggccccaccagtcgtatttccccggaagccccggtgccggtggtgaaggtggaaaatatcgaagaacgtcctggcggcgcggcaaacgtagcgatgaacatcgcctccctgggggcaacgtcgcgcctggtgggattgaccgggattgatgacgctgcccgcgcgctgagccaggcgctggccaatgtgaatgtgaagtgcgacttcgtctccgtcccgactcacccgaccatcaccaagctgcgggtgctgtcgcgcaatcagcagctgatccgcctcgactttgaagagggcttctccggcgtggatccgcagccgatgcatgagcgcattcagcaggcgctgggagccattggcgcactgg 201 atgaccctgaatatgatgctcgagctaaagttctcggctaatcgctgataacatttgacgcaatgcgcaataaaagggcatcatttgatgccctttttgcacgctttcataccagaacctggctcatcagtgattttttttgtcataatcattgctgagacaggctctgaagagggcgtttatacaccaaaccattcgagcggtagcgcgacggcaagtcagcgttctcctttgcaatagcagggaagaggcgccagaaccgccagcgttgaagcagtttgaacgcgttcagtgtataatccgaaacttaatttcggtttggagccattgagctggcttcccgaccgcagggcggcacctgcctgaccctgcgtttcccgctgtttaacaccctgaccggaggtgaagcatga 202 ggccgtcgcccagcgtcggcgtccccaacagcagggccgggtaggccagcaggtccgccagcgtggcgcggttaatattgaccggggcggcggcggcctcccccagctgcttgtggatcattttcgcgatcttgcgggttttaccggtatcggtaccaaagaaaatgccaatgttcgccatagtacgctcctgtcggaatggtgttgaaaaaaggaatgacgacagaggtattgcgaaggctgtgccaggttgccctgcaccgcgacggcccatccctgccccatcaggatcgcttcgcatcacgatgccgcgcgccaaaggcgcacccggcggggcgaaaggtaaaaatccgtgaattttccccctgtcggatcaatgtttcgcgtggtcgttccgataagggcgcacactttgcatggttatccgggttcggcttaccccgccgcgttttgcgcacggtgtcggacaatttgtcataactgcgacacaggagtttgcgatgaccctgaatatgatgctcgagctaaagttctcggctaatcgctgataacatttgacgcaatgcgcaataaaagggcatcatttgatgccctttttgcacgctttcataccagaacctggctcatcagtgattttttttgtcataatcattgctgagacaggctctgaagagggcgtttatacaccaaaccattcgagcggtagcgcgacggcaagtcagcgttctcctttgcaatagcagggaagaggcgccagaaccgccagcgttgaagcagtttgaacgcgttcagtgtataatccgaaacttaatttcggtttggagccattgagctggcttcccgaccgcagggcggcacctgcctgaccctgcgtttcccgctgtttaacaccctgaccggaggtgaagcatgatccctgaatccgacccggacaccaccgtcagacgcttcgacctctctcagcagttcaccgccatgcagcggataagcgtggtgctgagccgggccaccgaggccagcaaaacgctgcaggaggtgctcagcgtattacacaacgatgcctttatgcagcacgggatgatctgcctgtacgacagcgagcaggagatcctcagtatcgaagcgctgcagcaaaccggccagcagcccctccccggcagcacgcagatccgctatcgccccggcgagggactggtggggaccgtgctggcccaggggcagtcgctggtgctgccccgggtcgccgacgatcagcgttttctcgaccgcctgagcctctacgattacgatctgccgtttatcgccgtaccgttgatggggcccaacgcccggccaataggggtgctggcggcccagccgatggcgcgccaggaagagcggctgccggcctgcacccgttttctcgaaaccgtc 203 atgaccctgaatatgatgctcgagcccgctgaccgaccagaacttccaccttggactcggctatacccttggcgtgacggcgcgcgataactgggactacatccccattccggtgatcttaccattggcgtcaataggttacggtccggcgactttccagatgacctatattcccggcacctacaataacggtaacgtttacttcgcctgggctcgtatacagttttaattcgctaagtcttagcaataaatgagataagcggtgtgtcttgtggaaaaacaaggactaaagcgttacccactaaaaaagatagcgacttttatcactttttagcaaagttgcactggacaaaaggtaccacaattggtgtactgatactcgacacagcattagtgtcgatttttcatataaaggtaattttggccattgagctggcttcccgaccgcagggcggcacctgcctgaccctgcgtttcccgctgtttaacaccctgaccggaggtgaagcatga 204 ggccgtcgcccagcgtcggcgtccccaacagcagggccgggtaggccagcaggtccgccagcgtggcgcggttaatattgaccggggcggcggcggcctcccccagctgcttgtggatcattttcgcgatcttgcgggttttaccggtatcggtaccaaagaaaatgccaatgttcgccatagtacgctcctgtcggaatggtgttgaaaaaaggaatgacgacagaggtattgcgaaggctgtgccaggttgccctgcaccgcgacggcccatccctgccccatcaggatcgcttcgcatcacgatgccgcgcgccaaaggcgcacccggcggggcgaaaggtaaaaatccgtgaattttccccctgtcggatcaatgtttcgcgtggtcgttccgataagggcgcacactttgcatggttatccgggttcggcttaccccgccgcgttttgcgcacggtgtcggacaatttgtcataactgcgacacaggagtttgcgatgaccctgaatatgatgctcgagcccgctgaccgaccagaacttccaccttggactcggctatacccttggcgtgacggcgcgcgataactgggactacatccccattccggtgatcttaccattggcgtcaataggttacggtccggcgactttccagatgacctatattcccggcacctacaataacggtaacgtttacttcgcctgggctcgtatacagttttaattcgctaagtcttagcaataaatgagataagcggtgtgtcttgtggaaaaacaaggactaaagcgttacccactaaaaaagatagcgacttttatcactttttagcaaagttgcactggacaaaaggtaccacaattggtgtactgatactcgacacagcattagtgtcgatttttcatataaaggtaattttggccattgagctggcttcccgaccgcagggcggcacctgcctgaccctgcgtttcccgctgtttaacaccctgaccggaggtgaagcatgatccctgaatccgacccggacaccaccgtcagacgcttcgacctctctcagcagttcaccgccatgcagcggataagcgtggtgctgagccgggccaccgaggccagcaaaacgctgcaggaggtgctcagcgtattacacaacgatgcctttatgcagcacgggatgatctgcctgtacgacagcgagcaggagatcctcagtatcgaagcgctgcagcaaaccggccagcagcccctccccggcagcacgcagatccgctatcgccccggcgagggactggtggggaccgtgctggcccaggggcagtcgctggtgctgccccgggtcgccgacgatcagcgttttctcgaccgcctgagcctctacgattacgatctgccgtttatcgccgtaccgttgatggggcccaacgcccggccaataggggtgctggcggcccagccgatggcgcgccaggaagagcggctgccggcctgcacccgttttctcgaaaccgtc 205 atggcgctgaagcacctgatcacgctctgcgcggcgtcgccgatggtcgccagccagctggcgcgccacccgctgctgctggatgagctgctggatcccaacaccctctatcagccgacggcgaccgatgcctatcgcgacgagctgcgccagtacctgctgcgcgtgccggaagaggatgaagagcagcagctgcatatcgcggcggcggatatcgctggtaccctgccggtgatgaaggtcagcgatcacttaacctggcttgccgaagcgatcctcgacgcggtggtgcagcaggcatgggggcagatggtcgctcgctacggccagccgacccacctgcacgatcgccagggtcgcggcttcgccgtcgtcggctacggtaagcttggcggctgggagctgggctacagctccgatctcgatctggtgttcctccatgactgcccggcggaggtgatgaccgacggcgagcgggagattgacggccgtcagttctacctgcggctggcccagcggatcatgcacctgttcagcacccgcacctcgtccggtattctctacgaagtggacgcccggctgcgtccttctggcgcggcggggatgctggtcaccaccgccgacgcgtttgctgactatcagcagaacgaagcctggacgtgggaacatcaggcgctggtgcgcgcccgcgtggtctatggcgacccggcgctgcaggcgcgctttgacgccattcgtcgcgatatcctgaccaccccgcgggaggggatgaccctgcagaccgaggttcgcgagatgcgcgagaagatgcgcgcccaccttggcaacaaacatcccgatcgttttgatatcaaagccgatgccggcgggatcaccgatattgaatttattactcagtatctggtcctacgctatgccagtgacaagccgaagctgacccgctggtctgacaacgtgcgtattcttgagctgctggcgcagaacgacatcatggacgaggaggaggcgcgcgccttaacgcatgcgtacaccaccttgcgtgatgcgctccatcacctggccctgcaggagcagccgggacacgtggcgccagaggccttcagccgggagcgtcagcaggtcagcgccagctggcagaagtggctgatggcttaa 206 cgtaaggcgaccacccagctccgcgcgttgctgaacgacgctgaagccgttctgctggccgcggacaccgccgacgaggcgttattccgcaccgaggtcgtcggcgccaaactggccctgactgaatggctggtccagcgcggctggcgtccgttcctcaacgaggcaggagagaaaaaaatagccggatcgttcaaacggtttgccgatattaacctctcgcgggtggcggccgagctgcgcagcgccgtgcagcatctggcggttgaagatgccgccgaccagttgccgaagctgtcccgcgacatcgacagcgtccagctgctggcgggcgcctatggcgacgccgtcgcgccgtggctggagaactggcaggagcttcaccgtgcaatagcacatgacgatcgcagcgtctttgaatatttccgtcgccaggcgctggctgccgagccgttctggctgcatagtggaaaacgataatttcaggccagggagcccttatggcgctgaagcacctgatcacgctctgcgcggcgtcgccgatggtcgccagccagctggcgcgccacccgctgctgctggatgagctgctggatcccaacaccctctatcagccgacggcgaccgatgcctatcgcgacgagctgcgccagtacctgctgcgcgtgccggaagaggatgaagagcagcagctgcatatcgcggcggcggatatcgctggtaccctgccggtgatgaaggtcagcgatcacttaacctggcttgccgaagcgatcctcgacgcggtggtgcagcaggcatgggggcagatggtcgctcgctacggccagccgacccacctgcacgatcgccagggtcgcggcttcgccgtcgtcggctacggtaagcttggcggctgggagctgggctacagctccgatctcgatctggtgttcctccatgactgcccggcggaggtgatgaccgacggcgagcgggagattgacggccgtcagttctacctgcggctggcccagcggatcatgcacctgttcagcacccgcacctcgtccggtattctctacgaagtggacgcccggctgcgtccttctggcgcggcggggatgctggtcaccaccgccgacgcgtttgctgactatcagcagaacgaagcctggacgtgggaacatcaggcgctggtgcgcgcccgcgtggtctatggcgacccggcgctgcaggcgcgctttgacgccattcgtcgcgatatcctgaccaccccgcgggaggggatgaccctgcagaccgaggttcgcgagatgcgcgagaagatgcgcgcccaccttggcaacaaacatcccgatcgttttgatatcaaagccgatgccggcgggatcaccgatattgaatttattactcagtatctggtcctacgctatgccagtgacaagccgaagctgacccgctggtctgacaacgtgcgtattcttgagctgctggcgcagaacgacatcatggacgaggaggaggcgcgcgccttaacgcatgcgtacaccaccttgcgtgatgcgctccatcacctggccctgcaggagcagccgggacacgtggcgccagaggccttcagccgggagcgtcagcaggtcagcgccagctggcagaagtggctgatggcttaactataaaatcgggtgtgctattatcgcgcgcaaagtttgcgtctcgcaggagagagtcatgaaagtaacgctgccggagtttgaacgtgcaggagtgttggtggtgggtgatgtgatgctggaccgctactggtacggccccaccagtcgtatttccccggaagccccggtgccggtggtgaaggtggaaaatatcgaagaacgtcctggcggcgcggcaaacgtagcgatgaacatcgcctccctgggggcaacgtcgcgcctggtgggattgaccgggattgatgacgctgcccgcgcgctgagccaggcgctggccaatgtgaatgtgaagtgcgacttcgtctccgtcccgactcacccgaccatcaccaagctgcgggtgctgtcgcgcaatcagcagctgatccgcctcgactttgaagagggcttctccggcgtggatccgcagccgatgcatgagcgcattcagcaggcgctgggagccattggcgcactgg 207 atgaccctgaatatgatgctagaagcgtcaggtaccggtcatgattcaccgtgcgattctcggttccctggagcgcttcattggcatcctgaccgaagagttcgctggcttcttcccaacctggattgcaccagtgcaggtagtggtcatgaatattaccgattctcaggctgaatacgttaacgaattgacgcgtaaactacaaaatgcgggcattcgtgtaaaagcagacttgagaaatgagaagattggctttaaaatccgcgagcacactttacgtcgtgtcccgtatatgttggtctgtggcgacaaagaagtcgaagccggcaaagtggccgtgcgcacccgtcgcgggaaagacctcggcagcatggacgtaagtgaagtgattgagaagctgcaacaagagattcgcagccgcagtcttcaacaactggaggaataaggtattaaaggcggaaaacgagttcaaacggcacgtccgaatcgtatcaatggcgagattcgcgccctggaagttcgcgccattgagctggcttcccgaccgcagggcggcacctgcctgaccctgcgtttcccgctgtttaacaccctgaccggaggtgaagcatga 208 ggccgtcgcccagcgtcggcgtccccaacagcagggccgggtaggccagcaggtccgccagcgtggcgcggttaatattgaccggggcggcggcggcctcccccagctgcttgtggatcattttcgcgatcttgcgggttttaccggtatcggtaccaaagaaaatgccaatgttcgccatagtacgctcctgtcggaatggtgttgaaaaaaggaatgacgacagaggtattgcgaaggctgtgccaggttgccctgcaccgcgacggcccatccctgccccatcaggatcgcttcgcatcacgatgccgcgcgccaaaggcgcacccggcggggcgaaaggtaaaaatccgtgaattttccccctgtcggatcaatgtttcgcgtggtcgttccgataagggcgcacactttgcatggttatccgggttcggcttaccccgccgcgttttgcgcacggtgtcggacaatttgtcataactgcgacacaggagtttgcgatgaccctgaatatgatgctagaagcgtcaggtaccggtcatgattcaccgtgcgattctcggttccctggagcgcttcattggcatcctgaccgaagagttcgctggcttcttcccaacctggattgcaccagtgcaggtagtggtcatgaatattaccgattctcaggctgaatacgttaacgaattgacgcgtaaactacaaaatgcgggcattcgtgtaaaagcagacttgagaaatgagaagattggctttaaaatccgcgagcacactttacgtcgtgtcccgtatatgttggtctgtggcgacaaagaagtcgaagccggcaaagtggccgtgcgcacccgtcgcgggaaagacctcggcagcatggacgtaagtgaagtgattgagaagctgcaacaagagattcgcagccgcagtcttcaacaactggaggaataaggtattaaaggcggaaaacgagttcaaacggcacgtccgaatcgtatcaatggcgagattcgcgccctggaagttcgcgccattgagctggcttcccgaccgcagggcggcacctgcctgaccctgcgtttcccgctgtttaacaccctgaccggaggtgaagcatgatccctgaatccgacccggacaccaccgtcagacgcttcgacctctctcagcagttcaccgccatgcagcggataagcgtggtgctgagccgggccaccgaggccagcaaaacgctgcaggaggtgctcagcgtattacacaacgatgcctttatgcagcacgggatgatctgcctgtacgacagcgagcaggagatcctcagtatcgaagcgctgcagcaaaccggccagcagcccctccccggcagcacgcagatccgctatcgccccggcgagggactggtggggaccgtgctggcccaggggcagtcgctggtgctgccccgggtcgccgacgatcagcgttttctcgaccgcctgagcctctacgattacgatctgccgtttatcgccgtaccgttgatggggcccaacgcccggccaataggggtgctggcggcccagccgatggcgcgccaggaagagcggctgccggcctgcacccgttttctcgaaaccgtc 209 atggcgctgaagcacctgatcacgctctgcgcggcgtcgccgatggtcgccagccagctggcgcgccacccgctgctgctggatgagctgctggatcccaacaccctctatcagccgacggcgaccgatgcctatcgcgacgagctgcgccagtacctgctgcgcgtgccggaagaggatgaagagcagcagctggaggcgttgcgccagtttaagcaggcgcagcagctgcatatcgcggcggcggatatcgctggtaccctgccggtgatgaaggtcagcgatcacttaacctggcttgccgaagcgatcctcgacgcggtggtgcagcaggcatgggggcagatggtcgctcgctacggccagccgacccacctgcacgatcgccagggtcgcggcttcgccgtcgtcggctacggtaagcttggcggctgggagctgggctacagctccgatctcgatctggtgttcctccatgactgcccggcggaggtgatgaccgacggcgagcgggagattgacggccgtcagttctacctgcggctggcccagcggatcatgcacctgttcagcacccgcacctcgtccggtattctctacgaagtggacgcccggctgcgtccttctggcgcggcggggatgctggtcaccaccgccgacgcgtttgctgactatcagcagaacgaagcctggacgtgggaacatcaggcgctggtgcgcgcccgcgtggtctatggcgacccggcgctgcaggcgcgctttgacgccattcgtcgcgatatcctgaccaccccgcgggaggggatgaccctgcagaccgaggttcgcgagatgcgcgagaagatgcgcgcccaccttggcaacaaacatcccgatcgttttgatatcaaagccgatgccggcgggatcaccgatattgaatttattactcagtatctggtcctacgctatgccagtgacaagccgaagctgacccgctggtctgacaacgtgcgtattcttgagctgctggcgcagaacgacatcatggacgaggaggaggcgcgcgccttaacgcatgcgtacaccaccttgcgtgatgcgctccatcacctggccctgcaggagcagccgggacacgtggcgccagaggccttcagccgggagcgtcagcaggtcagcgccagctggcagaagtggctgatggcttaa 210 cgtaaggcgaccacccagctccgcgcgttgctgaacgacgctgaagccgttctgctggccgcggacaccgccgacgaggcgttattccgcaccgaggtcgtcggcgccaaactggccctgactgaatggctggtccagcgcggctggcgtccgttcctcaacgaggcaggagagaaaaaaatagccggatcgttcaaacggtttgccgatattaacctctcgcgggtggcggccgagctgcgcagcgccgtgcagcatctggcggttgaagatgccgccgaccagttgccgaagctgtcccgcgacatcgacagcgtccagctgctggcgggcgcctatggcgacgccgtcgcgccgtggctggagaactggcaggagcttcaccgtgcaatagcacatgacgatcgcagcgtctttgaatatttccgtcgccaggcgctggctgccgagccgttctggctgcatagtggaaaacgataatttcaggccagggagcccttatggcgctgaagcacctgatcacgctctgcgcggcgtcgccgatggtcgccagccagctggcgcgccacccgctgctgctggatgagctgctggatcccaacaccctctatcagccgacggcgaccgatgcctatcgcgacgagctgcgccagtacctgctgcgcgtgccggaagaggatgaagagcagcagctggaggcgttgcgccagtttaagcaggcgcagcagctgcatatcgcggcggcggatatcgctggtaccctgccggtgatgaaggtcagcgatcacttaacctggcttgccgaagcgatcctcgacgcggtggtgcagcaggcatgggggcagatggtcgctcgctacggccagccgacccacctgcacgatcgccagggtcgcggcttcgccgtcgtcggctacggtaagcttggcggctgggagctgggctacagctccgatctcgatctggtgttcctccatgactgcccggcggaggtgatgaccgacggcgagcgggagattgacggccgtcagttctacctgcggctggcccagcggatcatgcacctgttcagcacccgcacctcgtccggtattctctacgaagtggacgcccggctgcgtccttctggcgcggcggggatgctggtcaccaccgccgacgcgtttgctgactatcagcagaacgaagcctggacgtgggaacatcaggcgctggtgcgcgcccgcgtggtctatggcgacccggcgctgcaggcgcgctttgacgccattcgtcgcgatatcctgaccaccccgcgggaggggatgaccctgcagaccgaggttcgcgagatgcgcgagaagatgcgcgcccaccttggcaacaaacatcccgatcgttttgatatcaaagccgatgccggcgggatcaccgatattgaatttattactcagtatctggtcctacgctatgccagtgacaagccgaagctgacccgctggtctgacaacgtgcgtattcttgagctgctggcgcagaacgacatcatggacgaggaggaggcgcgcgccttaacgcatgcgtacaccaccttgcgtgatgcgctccatcacctggccctgcaggagcagccgggacacgtggcgccagaggccttcagccgggagcgtcagcaggtcagcgccagctggcagaagtggctgatggcttaactataaaatcgggtgtgctattatcgcgcgcaaagtttgcgtctcgcaggagagagtcatgaaagtaacgctgccggagtttgaacgtgcaggagtgttggtggtgggtgatgtgatgctggaccgctactggtacggccccaccagtcgtatttccccggaagccccggtgccggtggtgaaggtggaaaatatcgaagaacgtcctggcggcgcggcaaacgtagcgatgaacatcgcctccctgggggcaacgtcgcgcctggtgggattgaccgggattgatgacgctgcccgcgcgctgagccaggcgctggccaatgtgaatgtgaagtgcgacttcgtctccgtcccgactcacccgaccatcaccaagctgcgggtgctgtcgcgcaatcagcagctgatccgcctcgactttgaagagggcttctccggcgtggatccgcagccgatgcatgagcgcattcagcaggcgctgggagccattggcgcactgg 211 atggcgctcaaacagttaatccgtctgtgtgccgcctcgccgatggtcgcgacacaacttgcacgtcatcctttattgctcgatgaactgctcgacccgcgcacgctttaccagccgattgagccgggcgcttaccgcgacgaactgcgtcagtatctgatgcgggtgccaacagaagacgaagaacagcagcttgaagccgtgcgccagttcaaacaggcccagcatttgcgtatcgcagccggggatatttccggggcattgccggtgatgaaagtcagtgaccatttaacctaccttgccgaggccattctcgatgtcgtggtgcagcatgcgtgggaacaaatggtcgtaaaatacgggcagcccgcgcatcttcagcaccgtgaggggcgcggttttgccgtggtcggttacgggaaactcggtggctgggagctgggttatagctcagatctggatctggtcttcctgctcgattgcgcgccggaggtgatgacggacggcgaacgcagcatcgacggacgtcagttttatcttcggctggcgcagcgcattatgcacttattcagcacccggacatcgtcaggcattctttacgaggttgatccgcgtctgcgaccttccggcgcatccggcatgctggtcagtaccattgaagcgtttgcagattatcaggccaatgaagcctggacgtgggagcatcaggcgctggttcgcgcgcgcgtggtttacggggatccgcaactgacacagcaatttaacgccacgcgtcgcgacattctttgccgccagcgcgatggcgacggcctgcgtaaggaggtccgtgaaatgcgcgagaaaatgtatgcccatctggggagtaaaaaagcccacgagtttgatctgaaagccgatccgggtggcatcacggatattgaattcattgcacaatacctggttctgcgtttcgcgcatgatgagccgaagctgacgcgctggtctgataacgtgcggatttttgaactgatggcacgatatgacatcatgccggaagaggaagcgcgccatctgacgcaggcttatgtgacgctgcgcgatgaaattcatcatctggcgttgcaggaacacagcgggaaagtggccgcggacagctttgctactgagcgcgcgcagatccgtgccagctgggcaaagtggctcggctga 212 cggtactggaacagaaatcggcggatgcgcaggaaatttgttatgacacggcctgtctgaagtgcaagttagtgcttacttcctggctggcaacctcaggctggacgccgtttattgatgataaatctgcgaagaaactggacgcttccttcaaacgttttgctgacatcatgctcggtcgtaccgcagcggatctgaaagaagcctttgcgcagccactgacggaagaaggttatcgcgatcagctggcgcgcctgaaacgccagatcattaccttccatttgcttgccggtgcttaccctgaaaaagacgtcgatgcgtatattgccggctgggtggacctgcaacaggccatcgttcagcagcaacacgcctgggaggattcggcccgttctcacgcggtgatgatggatgctttctggttaaacgggcaacctcgttaactgactgactagcctgggcaaactgcccgggcttttttttgcaaggaatctgatttcatggcgctcaaacagttaatccgtctgtgtgccgcctcgccgatggtcgcgacacaacttgcacgtcatcctttattgctcgatgaactgctcgacccgcgcacgctttaccagccgattgagccgggcgcttaccgcgacgaactgcgtcagtatctgatgcgggtgccaacagaagacgaagaacagcagcttgaagccgtgcgccagttcaaacaggcccagcatttgcgtatcgcagccggggatatttccggggcattgccggtgatgaaagtcagtgaccatttaacctaccttgccgaggccattctcgatgtcgtggtgcagcatgcgtgggaacaaatggtcgtaaaatacgggcagcccgcgcatcttcagcaccgtgaggggcgcggttttgccgtggtcggttacgggaaactcggtggctgggagctgggttatagctcagatctggatctggtcttcctgctcgattgcgcgccggaggtgatgacggacggcgaacgcagcatcgacggacgtcagttttatcttcggctggcgcagcgcattatgcacttattcagcacccggacatcgtcaggcattctttacgaggttgatccgcgtctgcgaccttccggcgcatccggcatgctggtcagtaccattgaagcgtttgcagattatcaggccaatgaagcctggacgtgggagcatcaggcgctggttcgcgcgcgcgtggtttacggggatccgcaactgacacagcaatttaacgccacgcgtcgcgacattctttgccgccagcgcgatggcgacggcctgcgtaaggaggtccgtgaaatgcgcgagaaaatgtatgcccatctggggagtaaaaaagcccacgagtttgatctgaaagccgatccgggtggcatcacggatattgaattcattgcacaatacctggttctgcgtttcgcgcatgatgagccgaagctgacgcgctggtctgataacgtgcggatttttgaactgatggcacgatatgacatcatgccggaagaggaagcgcgccatctgacgcaggcttatgtgacgctgcgcgatgaaattcatcatctggcgttgcaggaacacagcgggaaagtggccgcggacagctttgctactgagcgcgcgcagatccgtgccagctgggcaaagtggctcggctgagggtttttattcggctaacaggcgcttgtgatattatccggcgcattgtatttacccgatttgatttatctgttttggagtcttgggatgaaagtgactttgcctgattttcaccgcgcaggtgtgctggttgtcggtgacgtaatgttagaccgttactggtatggcccgaccaatcgtatttctccggaagctccggtgccggtggtgaaggtcagtaccattgaagagcggcctggcggtgcagctaacgtggcgatgaacatttcatctctgggcgcctcttcctgtctgatcggcctgaccggcgtagacgacgctgcgcgtgccctcagtgagcgtctggcagaagtgaaagttaactgcgatttcgtcgcactatccacacatcctaccatcaccaaactgcgaattttgtcccgtaaccagcaactgatccgcctcgactttgaggaaggttttgaaggcgttgatctcgagccgatgctgaccaaaataga 213 atgagcatcacggcgttatcagcatcatttcctgaggggaatatcgccagccgcttgtcgctgcaacatccttcactgttttataccgtggttgaacaatcttcggtggcgatttcgctgaccgatccgcaggcgcgcatttgttatgccaatccggcattctgccgccagacgggttttgcacttgagacacttttgggcgagaaccaccgtctgctggaattttttttcacaaagcgtagcgttattgaatcgcacattttaaactgttggccgctgtggaagcgaatattggtgaaaggtgcggttttaaggcctttttctttgactctctgtcgttacaaagttaatatgcgcgccctccgtctctgaagctctcggtgaacattgttgcgaggcaggatgcgagctggttgtgttttgacattaccgataatgtgccgcgtgaacgggtgcgttatgcccgcccggaagcggcgttttcccgtccggggaatggcatggagctgcgccttatccagacgctgatcgcccatcatcgcggttctttagatctctcggtccgccctgatggcggcaccttgctgacgttacgcctgccggtacagcaggttatcaccggaggcttaaaatga 214 tgtttcgtctcgaggccgggcaactgagcggccccgttgaaaccgacctgggctggcatctgttgttgtgcgaacaaattcgcctgccgcaacccttgccgaaagccgaagccttaacgcgggtgcgtcagcaactgattgcccggcaacagaaacattatcagcgccagtggctgcaacaactgatcaacgcctgagcctgttctccttcttgttgatgcagacgggttaatgcccgttttgcacgaaaaatgcacataaattgcctgcgttgccttataacagcgcagggaaatcctgcctccggccttgtgccacaccgcgctttgcctggtttgtggtaaaaactggcccgctttgcatcctgatgcttaaaacaccccgttcagatcaacctttgggcagataagcccgcgaaaggcctgcaaattgcacggttattccgggtgagtatatgtgtgatttgggttccggcattgcgcaataaaggggagaaagacatgagcatcacggcgttatcagcatcatttcctgaggggaatatcgccagccgcttgtcgctgcaacatccttcactgttttataccgtggttgaacaatcttcggtggcgatttcgctgaccgatccgcaggcgcgcatttgttatgccaatccggcattctgccgccagacgggttttgcacttgagacacttttgggcgagaaccaccgtctgctggaattttttttcacaaagcgtagcgttattgaatcgcacattttaaactgttggccgctgtggaagcgaatattggtgaaaggtgcggttttaaggcctttttctttgactctctgtcgttacaaagttaatatgcgcgccctccgtctctgaagctctcggtgaacattgttgcgaggcaggatgcgagctggttgtgttttgacattaccgataatgtgccgcgtgaacgggtgcgttatgcccgcccggaagcggcgttttcccgtccggggaatggcatggagctgcgccttatccagacgctgatcgcccatcatcgcggttctttagatctctcggtccgccctgatggcggcaccttgctgacgttacgcctgccggtacagcaggttatcaccggaggcttaaaatgacccagttacctaccgcgggcccggttatccggcgctttgatatgtctgcccagtttacggcgctttatcgcatcagcgtggcgctgagtcaggaaagcaacaccgggcgcgcactggcggcgatcctcgaagtgcttcacgatcatgcatttatgcaatacggcatggtgtgtctgtttgataaagaacgcaatgcactctttgtggaatccctgcatggcatcgacggcgaaaggaaaaaagagacccgccatgtccgttaccgcatgggggaaggcgtgatcggcgcggtgatgagccagcgtcaggcgctggtgttaccgcgcatttcagacgatcagcgttttctcgaccgcctgaatatttacgattacagcctgccgttgattggcgtgccgatccccggtgcggataatcagccatcgggcgtgctggtggcacagccgatggcgttgcacgaagaccggctgactgccagtacgcggtttttagaaatggtc 215 atgagcatcacggcgttatcagcatcatttcctgaggggaatatcgccagccgcttgtcgctgcaacatccttcactgttttataccgtggttgaacaatcttcggtggcgatttcgctgaccgatccgcaggcgcgcatttgttatgccaatccggcattctgccgccagacgggttttgcacttgagacacttttgggcgagaaccaccgtctgctggaattttttttcacaaagcgtagcgttattgaatcgcacattttaaactgttggccgctgtggaagcgaatattggtgaaaggtgcggttttaaggcctttttctttgactctctgtcgttacaaagttaatatgcgcgccctccgtctctgaagctctcggtgaacattgttgcgaggcaggatgcgagctggttgtgttttgacattaccgataatgtgccgcgtgaacgggtgcgttatgcccgcccggaagcggcgttttcccgtccggggaatggcatggagctgcgccttatccagacgctgatcgcccatcatcgcggttctttagatctctcggtccgccctgatggcggcaccttgctgacgttacgcctgccggtacagcaggttatcaccggaggcttaaaatga 216 tgtttcgtctcgaggccgggcaactgagcggccccgttgaaaccgacctgggctggcatctgttgttgtgcgaacaaattcgcctgccgcaacccttgccgaaagccgaagccttaacgcgggtgcgtcagcaactgattgcccggcaacagaaacattatcagcgccagtggctgcaacaactgatcaacgcctgagcctgttctccttcttgttgatgcagacgggttaatgcccgttttgcacgaaaaatgcacataaattgcctgcgttgccttataacagcgcagggaaatcctgcctccggccttgtgccacaccgcgctttgcctggtttgtggtaaaaactggcccgctttgcatcctgatgcttaaaacaccccgttcagatcaacctttgggcagataagcccgcgaaaggcctgcaaattgcacggttattccgggtgagtatatgtgtgatttgggttccggcattgcgcaataaaggggagaaagacatgagcatcacggcgttatcagcatcatttcctgaggggaatatcgccagccgcttgtcgctgcaacatccttcactgttttataccgtggttgaacaatcttcggtggcgatttcgctgaccgatccgcaggcgcgcatttgttatgccaatccggcattctgccgccagacgggttttgcacttgagacacttttgggcgagaaccaccgtctgctggaattttttttcacaaagcgtagcgttattgaatcgcacattttaaactgttggccgctgtggaagcgaatattggtgaaaggtgcggttttaaggcctttttctttgactctctgtcgttacaaagttaatatgcgcgccctccgtctctgaagctctcggtgaacattgttgcgaggcaggatgcgagctggttgtgttttgacattaccgataatgtgccgcgtgaacgggtgcgttatgcccgcccggaagcggcgttttcccgtccggggaatggcatggagctgcgccttatccagacgctgatcgcccatcatcgcggttctttagatctctcggtccgccctgatggcggcaccttgctgacgttacgcctgccggtacagcaggttatcaccggaggcttaaaatgacccagttacctaccgcgggcccggttatccggcgctttgatatgtctgcccagtttacggcgctttatcgcatcagcgtggcgctgagtcaggaaagcaacaccgggcgcgcactggcggcgatcctcgaagtgcttcacgatcatgcatttatgcaatacggcatggtgtgtctgtttgataaagaacgcaatgcactctttgtggaatccctgcatggcatcgacggcgaaaggaaaaaagagacccgccatgtccgttaccgcatgggggaaggcgtgatcggcgcggtgatgagccagcgtcaggcgctggtgttaccgcgcatttcagacgatcagcgttttctcgaccgcctgaatatttacgattacagcctgccgttgattggcgtgccgatccccggtgcggataatcagccatcgggcgtgctggtggcacagccgatggcgttgcacgaagaccggctgactgccagtacgcggtttttagaaatggtc 217 atgagcatcacggcgttatcagcatcatttcctgaggggaatatcgccagccgcttgtcgctgcaacatccttcactgttttataccgtggttgaacaatcttcggtggcgatttcgctgaccgatccgcaggcgcgcatttgttatgccaatccggcattctgccgccagacgggttttgcacttgagacacttttgggcgagaaccaccgtctgctggttaaaaacgtgaccacgagcattaataaacgccacgaaatgtggcgtttatttattcaaaaagtatcttctttcataaaaagtgctaaatgcagtagcagcaaaattgggataagtcccatggaatacggctgttttcgctgcaatttttaactttttcgtaaaaaaagatgtttctttgagcgaacgatcaaaatatagcgttaaccggcaaaaaattattctcattagaaaatagtttgtgtaatacttgtaacgctacatggagattaacttaatctagagggttttataccgtctctgaagctctcggtgaacattgttgcgaggcaggatgcgagctggttgtgttttgacattaccgataatgtgccgcgtgaacgggtgcgttatgcccgcccggaagcggcgttttcccgtccggggaatggcatggagctgcgccttatccagacgctgatcgcccatcatcgcggttctttagatctctcggtccgccctgatggcggcaccttgctgacgttacgcctgccggtacagcaggttatcaccggaggcttaaaatga 218 gtttcgtctcgaggccgggcaactgagcggccccgttgaaaccgacctgggctggcatctgttgttgtgcgaacaaattcgcctgccgcaacccttgccgaaagccgaagccttaacgcgggtgcgtcagcaactgattgcccggcaacagaaacattatcagcgccagtggctgcaacaactgatcaacgcctgagcctgttctccttcttgttgatgcagacgggttaatgcccgttttgcacgaaaaatgcacataaattgcctgcgttgccttataacagcgcagggaaatcctgcctccggccttgtgccacaccgcgctttgcctggtttgtggtaaaaactggcccgctttgcatcctgatgcttaaaacaccccgttcagatcaacctttgggcagataagcccgcgaaaggcctgcaaattgcacggttattccgggtgagtatatgtgtgatttgggttccggcattgcgcaataaaggggagaaagacatgagcatcacggcgttatcagcatcatttcctgaggggaatatcgccagccgcttgtcgctgcaacatccttcactgttttataccgtggttgaacaatcttcggtggcgatttcgctgaccgatccgcaggcgcgcatttgttatgccaatccggcattctgccgccagacgggttttgcacttgagacacttttgggcgagaaccaccgtctgctggttaaaaacgtgaccacgagcattaataaacgccacgaaatgtggcgtttatttattcaaaaagtatcttctttcataaaaagtgctaaatgcagtagcagcaaaattgggataagtcccatggaatacggctgttttcgctgcaatttttaactttttcgtaaaaaaagatgtttctttgagcgaacgatcaaaatatagcgttaaccggcaaaaaattattctcattagaaaatagtttgtgtaatacttgtaacgctacatggagattaacttaatctagagggttttataccgtctctgaagctctcggtgaacattgttgcgaggcaggatgcgagctggttgtgttttgacattaccgataatgtgccgcgtgaacgggtgcgttatgcccgcccggaagcggcgttttcccgtccggggaatggcatggagctgcgccttatccagacgctgatcgcccatcatcgcggttctttagatctctcggtccgccctgatggcggcaccttgctgacgttacgcctgccggtacagcaggttatcaccggaggcttaaaatgacccagttacctaccgcgggcccggttatccggcgctttgatatgtctgcccagtttacggcgctttatcgcatcagcgtggcgctgagtcaggaaagcaacaccgggcgcgcactggcggcgatcctcgaagtgcttcacgatcatgcatttatgcaatacggcatggtgtgtctgtttgataaagaacgcaatgcactctttgtggaatccctgcatggcatcgacggcgaaaggaaaaaagagacccgccatgtccgttaccgcatgggggaaggcgtgatcggcgcggtgatgagccagcgtcaggcgctggtgttaccgcgcatttcagacgatcagcgttttctcgaccgcctgaatatttacgattacagcctgccgttgattggcgtgccgatccccggtgcggataatcagccatcgggcgtgctggtggcacagccgatggcgttgcacgaagaccggctgactgccagtacgcggtttttagaaatggtcg 219 atgagcatcacggcgttatcagcatcatttcctgaggggaatatcgccagccgcttgtcgctgcaacatccttcactgttttataccgtggttgaacaatcttcggtggcgatttcgctgaccgatccgcaggcgcgcatttgttatgccaatccggcattctgccgccagacgggttttgcacttgagacacttttgggcgagaaccaccgtctgctggtgaacatcactgatgcacaagctacctatgtcgaagaattaactaaaaaactgcaagatgcaggcattcgcgttaaagccgacttgagaaatgagaagattggctttaaaattcgcgaacacacgctacgccgtgttccttatatgttagtttgtggcgataaagaggtcgaagcaggcaaagttgctgttcgtacccgccgcggcaaagacttaggaagcatggatgttagcgaagtcgttgacaaactgctggcggaaatccgcagcagaagtcttcatcaactggaggaataaagtattaaaggcggaaaacgagttcaaccggcgcgtcctaatcgcattaacaaagagattcgcgcgcaagaagttcgcctcacaggcgtcgatggcgagcagattggtattgtcagtctgaatgaagctcttgaaaaagctgaggaagcgggcgtcgatttagtagaaatcagtccgaatgccgagccgccagtttgtcgaatcccgtctctgaagctctcggtgaacattgttgcgaggcaggatgcgagctggttgtgttttgacattaccgataatgtgccgcgtgaacgggtgcgttatgcccgcccggaagcggcgttttcccgtccggggaatggcatggagctgcgccttatccagacgctgatcgcccatcatcgcggttctttagatctctcggtccgccctgatggcggcaccttgctgacgttacgcctgccggtacagcaggttatcaccggaggcttaaaatga 220 tgtttcgtctcgaggccgggcaactgagcggccccgttgaaaccgacctgggctggcatctgttgttgtgcgaacaaattcgcctgccgcaacccttgccgaaagccgaagccttaacgcgggtgcgtcagcaactgattgcccggcaacagaaacattatcagcgccagtggctgcaacaactgatcaacgcctgagcctgttctccttcttgttgatgcagacgggttaatgcccgttttgcacgaaaaatgcacataaattgcctgcgttgccttataacagcgcagggaaatcctgcctccggccttgtgccacaccgcgctttgcctggtttgtggtaaaaactggcccgctttgcatcctgatgcttaaaacaccccgttcagatcaacctttgggcagataagcccgcgaaaggcctgcaaattgcacggttattccgggtgagtatatgtgtgatttgggttccggcattgcgcaataaaggggagaaagacatgagcatcacggcgttatcagcatcatttcctgaggggaatatcgccagccgcttgtcgctgcaacatccttcactgttttataccgtggttgaacaatcttcggtggcgatttcgctgaccgatccgcaggcgcgcatttgttatgccaatccggcattctgccgccagacgggttttgcacttgagacacttttgggcgagaaccaccgtctgctggtgaacatcactgatgcacaagctacctatgtcgaagaattaactaaaaaactgcaagatgcaggcattcgcgttaaagccgacttgagaaatgagaagattggctttaaaattcgcgaacacacgctacgccgtgttccttatatgttagtttgtggcgataaagaggtcgaagcaggcaaagttgctgttcgtacccgccgcggcaaagacttaggaagcatggatgttagcgaagtcgttgacaaactgctggcggaaatccgcagcagaagtcttcatcaactggaggaataaagtattaaaggcggaaaacgagttcaaccggcgcgtcctaatcgcattaacaaagagattcgcgcgcaagaagttcgcctcacaggcgtcgatggcgagcagattggtattgtcagtctgaatgaagctcttgaaaaagctgaggaagcgggcgtcgatttagtagaaatcagtccgaatgccgagccgccagtttgtcgaatcccgtctctgaagctctcggtgaacattgttgcgaggcaggatgcgagctggttgtgttttgacattaccgataatgtgccgcgtgaacgggtgcgttatgcccgcccggaagcggcgttttcccgtccggggaatggcatggagctgcgccttatccagacgctgatcgcccatcatcgcggttctttagatctctcggtccgccctgatggcggcaccttgctgacgttacgcctgccggtacagcaggttatcaccggaggcttaaaatgacccagttacctaccgcgggcccggttatccggcgctttgatatgtctgcccagtttacggcgctttatcgcatcagcgtggcgctgagtcaggaaagcaacaccgggcgcgcactggcggcgatcctcgaagtgcttcacgatcatgcatttatgcaatacggcatggtgtgtctgtttgataaagaacgcaatgcactctttgtggaatccctgcatggcatcgacggcgaaaggaaaaaagagacccgccatgtccgttaccgcatgggggaaggcgtgatcggcgcggtgatgagccagcgtcaggcgctggtgttaccgcgcatttcagacgatcagcgttttctcgaccgcctgaatatttacgattacagcctgccgttgattggcgtgccgatccccggtgcggataatcagccatcgggcgtgctggtggcacagccgatggcgttgcacgaagaccggctgactgccagtacgcggtttttagaaatggtc 221 atgagcatcacggcgttatcagcatcatttcctgaggggaatatcgccagccgcttgtcgctgcaacatccttcactgttttataccgtggttgaacaatcttcggtggcgatttcgctgaccgatccgcaggcgcgcatttgttatgccaatccggcattctgccgccagacgggttttgcacttgagacacttttgggcgagaaccaccgtctgctggtgaacatcactgatgcacaagctacctatgtcgaagaattaactaaaaaactgcaagatgcaggcattcgcgttaaagccgacttgagaaatgagaagattggctttaaaattcgcgaacacacgctacgccgtgttccttatatgttagtttgtggcgataaagaggtcgaagcaggcaaagttgctgttcgtacccgccgcggcaaagacttaggaagcatggatgttagcgaagtcgttgacaaactgctggcggaaatccgcagcagaagtcttcatcaactggaggaataaagtattaaaggcggaaaacgagttcaaccggcgcgtcctaatcgcattaacaaagagattcgcgcgcaagaagttcgcctcacaggcgtcgatggcgagcagattggtattgtcagtctgaatgaagctcttgaaaaagctgaggaagcgggcgtcgatttagtagaaatcagtccgaatgccgagccgccagtttgtcgaatcccgtctctgaagctctcggtgaacattgttgcgaggcaggatgcgagctggttgtgttttgacattaccgataatgtgccgcgtgaacgggtgcgttatgcccgcccggaagcggcgttttcccgtccggggaatggcatggagctgcgccttatccagacgctgatcgcccatcatcgcggttctttagatctctcggtccgccctgatggcggcaccttgctgacgttacgcctgccggtacagcaggttatcaccggaggcttaaaatga 222 tgtttcgtctcgaggccgggcaactgagcggccccgttgaaaccgacctgggctggcatctgttgttgtgcgaacaaattcgcctgccgcaacccttgccgaaagccgaagccttaacgcgggtgcgtcagcaactgattgcccggcaacagaaacattatcagcgccagtggctgcaacaactgatcaacgcctgagcctgttctccttcttgttgatgcagacgggttaatgcccgttttgcacgaaaaatgcacataaattgcctgcgttgccttataacagcgcagggaaatcctgcctccggccttgtgccacaccgcgctttgcctggtttgtggtaaaaactggcccgctttgcatcctgatgcttaaaacaccccgttcagatcaacctttgggcagataagcccgcgaaaggcctgcaaattgcacggttattccgggtgagtatatgtgtgatttgggttccggcattgcgcaataaaggggagaaagacatgagcatcacggcgttatcagcatcatttcctgaggggaatatcgccagccgcttgtcgctgcaacatccttcactgttttataccgtggttgaacaatcttcggtggcgatttcgctgaccgatccgcaggcgcgcatttgttatgccaatccggcattctgccgccagacgggttttgcacttgagacacttttgggcgagaaccaccgtctgctggtgaacatcactgatgcacaagctacctatgtcgaagaattaactaaaaaactgcaagatgcaggcattcgcgttaaagccgacttgagaaatgagaagattggctttaaaattcgcgaacacacgctacgccgtgttccttatatgttagtttgtggcgataaagaggtcgaagcaggcaaagttgctgttcgtacccgccgcggcaaagacttaggaagcatggatgttagcgaagtcgttgacaaactgctggcggaaatccgcagcagaagtcttcatcaactggaggaataaagtattaaaggcggaaaacgagttcaaccggcgcgtcctaatcgcattaacaaagagattcgcgcgcaagaagttcgcctcacaggcgtcgatggcgagcagattggtattgtcagtctgaatgaagctcttgaaaaagctgaggaagcgggcgtcgatttagtagaaatcagtccgaatgccgagccgccagtttgtcgaatcccgtctctgaagctctcggtgaacattgttgcgaggcaggatgcgagctggttgtgttttgacattaccgataatgtgccgcgtgaacgggtgcgttatgcccgcccggaagcggcgttttcccgtccggggaatggcatggagctgcgccttatccagacgctgatcgcccatcatcgcggttctttagatctctcggtccgccctgatggcggcaccttgctgacgttacgcctgccggtacagcaggttatcaccggaggcttaaaatgacccagttacctaccgcgggcccggttatccggcgctttgatatgtctgcccagtttacggcgctttatcgcatcagcgtggcgctgagtcaggaaagcaacaccgggcgcgcactggcggcgatcctcgaagtgcttcacgatcatgcatttatgcaatacggcatggtgtgtctgtttgataaagaacgcaatgcactctttgtggaatccctgcatggcatcgacggcgaaaggaaaaaagagacccgccatgtccgttaccgcatgggggaaggcgtgatcggcgcggtgatgagccagcgtcaggcgctggtgttaccgcgcatttcagacgatcagcgttttctcgaccgcctgaatatttacgattacagcctgccgttgattggcgtgccgatccccggtgcggataatcagccatcgggcgtgctggtggcacagccgatggcgttgcacgaagaccggctgactgccagtacgcggtttttagaaatggtc 223 atggcgctcaaacagttaatccgtctgtgtgccgcctcgccgatggtcgcgacacaacttgcacgtcatcctttattgctcgatgaactgctcgacccgcgcacgctttaccagccgattgagccgggcgcttaccgcgacgaactgcgtcagtatctgatgcgggtgccaacagaagacgaagaacagcagcttgaagccgtgcgccagttcaaacaggcccagcatttgcgtatcgcagccggggatatttccggggcattgccggtgatgaaagtcagtgaccatttaacctaccttgccgaggccattctcgatgtcgtggtgcagcatgcgtgggaacaaatggtcgtaaaatacgggcagcccgcgcatcttcagcaccgtgaggggcgcggttttgccgtggtcggttacgggaaactcggtggctgggagctgggttatagctcagatctggatctggtcttcctgctcgattgcgcgccggaggtgatgacggacggcgaacgcagcatcgacggacgtcagttttatcttcggctggcgcagcgcattatgcacttattcagcacccggacatcgtcaggcattctttacgaggttgatccgcgtctgcgaccttccggcgcatccggcatgctggtcagtaccattgaagcgtttgcagattatcaggccaatgaagcctggacgtgggagcatcaggcgctggttcgcgcgcgcgtggtttacggggatccgcaactgacacagcaatttaacgccacgcgtcgcgacattctttgccgccagcgcgatggcgacggcctgcgtaaggaggtccgtgaaatgcgcgagaaaatgtatgcccatctggggagtaaaaaagcccacgagtttgatctgaaagccgatccgggtggcatcacggatattgaattcattgcacaatacctggttctgcgtttcgcgcatgatgagccgaagctgacgcgctggtctgataacgtgcggatttttgaactgatggcacgatatgacatcatgccggaagaggaagcgcgccatctgacgcaggcttatgtgacgctgcgcgatgaaattcatcatctggcgttgcaggaacacagcgggaaagtggccgcggacagctttgctactgagcgcgcgcagatccgtgccagctgggcaaagtggctcggctga 224 cggtactggaacagaaatcggcggatgcgcaggaaatttgttatgacacggcctgtctgaagtgcaagttagtgcttacttcctggctggcaacctcaggctggacgccgtttattgatgataaatctgcgaagaaactggacgcttccttcaaacgttttgctgacatcatgctcggtcgtaccgcagcggatctgaaagaagcctttgcgcagccactgacggaagaaggttatcgcgatcagctggcgcgcctgaaacgccagatcattaccttccatttgcttgccggtgcttaccctgaaaaagacgtcgatgcgtatattgccggctgggtggacctgcaacaggccatcgttcagcagcaacacgcctgggaggattcggcccgttctcacgcggtgatgatggatgctttctggttaaacgggcaacctcgttaactgactgactagcctgggcaaactgcccgggcttttttttgcaaggaatctgatttcatggcgctcaaacagttaatccgtctgtgtgccgcctcgccgatggtcgcgacacaacttgcacgtcatcctttattgctcgatgaactgctcgacccgcgcacgctttaccagccgattgagccgggcgcttaccgcgacgaactgcgtcagtatctgatgcgggtgccaacagaagacgaagaacagcagcttgaagccgtgcgccagttcaaacaggcccagcatttgcgtatcgcagccggggatatttccggggcattgccggtgatgaaagtcagtgaccatttaacctaccttgccgaggccattctcgatgtcgtggtgcagcatgcgtgggaacaaatggtcgtaaaatacgggcagcccgcgcatcttcagcaccgtgaggggcgcggttttgccgtggtcggttacgggaaactcggtggctgggagctgggttatagctcagatctggatctggtcttcctgctcgattgcgcgccggaggtgatgacggacggcgaacgcagcatcgacggacgtcagttttatcttcggctggcgcagcgcattatgcacttattcagcacccggacatcgtcaggcattctttacgaggttgatccgcgtctgcgaccttccggcgcatccggcatgctggtcagtaccattgaagcgtttgcagattatcaggccaatgaagcctggacgtgggagcatcaggcgctggttcgcgcgcgcgtggtttacggggatccgcaactgacacagcaatttaacgccacgcgtcgcgacattctttgccgccagcgcgatggcgacggcctgcgtaaggaggtccgtgaaatgcgcgagaaaatgtatgcccatctggggagtaaaaaagcccacgagtttgatctgaaagccgatccgggtggcatcacggatattgaattcattgcacaatacctggttctgcgtttcgcgcatgatgagccgaagctgacgcgctggtctgataacgtgcggatttttgaactgatggcacgatatgacatcatgccggaagaggaagcgcgccatctgacgcaggcttatgtgacgctgcgcgatgaaattcatcatctggcgttgcaggaacacagcgggaaagtggccgcggacagctttgctactgagcgcgcgcagatccgtgccagctgggcaaagtggctcggctgagggtttttattcggctaacaggcgcttgtgatattatccggcgcattgtatttacccgatttgatttatctgttttggagtcttgggatgaaagtgactttgcctgattttcaccgcgcaggtgtgctggttgtcggtgacgtaatgttagaccgttactggtatggcccgaccaatcgtatttctccggaagctccggtgccggtggtgaaggtcagtaccattgaagagcggcctggcggtgcagctaacgtggcgatgaacatttcatctctgggcgcctcttcctgtctgatcggcctgaccggcgtagacgacgctgcgcgtgccctcagtgagcgtctggcagaagtgaaagttaactgcgatttcgtcgcactatccacacatcctaccatcaccaaactgcgaattttgtcccgtaaccagcaactgatccgcctcgactttgaggaaggttttgaaggcgttgatctcgagccgatgctgaccaaaataga 225 atgagcatcacggcgttatcagcatcatttcctgaggggaatatcgccagccgcttgtcgctgcaacatccttcactgttttataccgtggttgaacaatcttcggtggcgatttcgctgaccgatccgcaggcgcgcatttgttatgccaatccggcattctgccgccagacgggttttgcacttgagacacttttgggcgagaaccaccgtctgctggtacagtagcgcctctcaaaaatagataaacggctcatgtacgtgggccgtttattttttctacccataatcgggaaccggtgttataatgccgcgccctcatattgtggggatttcttaatgacctatcctgggtcctaaagttgtagttgacattagcggagcactaacccgtctctgaagctctcggtgaacattgttgcgaggcaggatgcgagctggttgtgttttgacattaccgataatgtgccgcgtgaacgggtgcgttatgcccgcccggaagcggcgttttcccgtccggggaatggcatggagctgcgccttatccagacgctgatcgcccatcatcgcggttctttagatctctcggtccgccctgatggcggcaccttgctgacgttacgcctgccggtacagcaggttatcaccggaggcttaaaatga 226 tgtttcgtctcgaggccgggcaactgagcggccccgttgaaaccgacctgggctggcatctgttgttgtgcgaacaaattcgcctgccgcaacccttgccgaaagccgaagccttaacgcgggtgcgtcagcaactgattgcccggcaacagaaacattatcagcgccagtggctgcaacaactgatcaacgcctgagcctgttctccttcttgttgatgcagacgggttaatgcccgttttgcacgaaaaatgcacataaattgcctgcgttgccttataacagcgcagggaaatcctgcctccggccttgtgccacaccgcgctttgcctggtttgtggtaaaaactggcccgctttgcatcctgatgcttaaaacaccccgttcagatcaacctttgggcagataagcccgcgaaaggcctgcaaattgcacggttattccgggtgagtatatgtgtgatttgggttccggcattgcgcaataaaggggagaaagacatgagcatcacggcgttatcagcatcatttcctgaggggaatatcgccagccgcttgtcgctgcaacatccttcactgttttataccgtggttgaacaatcttcggtggcgatttcgctgaccgatccgcaggcgcgcatttgttatgccaatccggcattctgccgccagacgggttttgcacttgagacacttttgggcgagaaccaccgtctgctggtacagtagcgcctctcaaaaatagataaacggctcatgtacgtgggccgtttattttttctacccataatcgggaaccggtgttataatgccgcgccctcatattgtggggatttcttaatgacctatcctgggtcctaaagttgtagttgacattagcggagcactaacccgtctctgaagctctcggtgaacattgttgcgaggcaggatgcgagctggttgtgttttgacattaccgataatgtgccgcgtgaacgggtgcgttatgcccgcccggaagcggcgttttcccgtccggggaatggcatggagctgcgccttatccagacgctgatcgcccatcatcgcggttctttagatctctcggtccgccctgatggcggcaccttgctgacgttacgcctgccggtacagcaggttatcaccggaggcttaaaatgacccagttacctaccgcgggcccggttatccggcgctttgatatgtctgcccagtttacggcgctttatcgcatcagcgtggcgctgagtcaggaaagcaacaccgggcgcgcactggcggcgatcctcgaagtgcttcacgatcatgcatttatgcaatacggcatggtgtgtctgtttgataaagaacgcaatgcactctttgtggaatccctgcatggcatcgacggcgaaaggaaaaaagagacccgccatgtccgttaccgcatgggggaaggcgtgatcggcgcggtgatgagccagcgtcaggcgctggtgttaccgcgcatttcagacgatcagcgttttctcgaccgcctgaatatttacgattacagcctgccgttgattggcgtgccgatccccggtgcggataatcagccatcgggcgtgctggtggcacagccgatggcgttgcacgaagaccggctgactgccagtacgcggtttttagaaatggtc 227 atggcgctcaaacagttaatccgtctgtgtgccgcctcgccgatggtcgcgacacaacttgcacgtcatcctttattgctcgatgaactgctcgacccgcgcacgctttaccagccgattgagccgggcgcttaccgcgacgaactgcgtcagtatctgatgcgggtgccaacagaagacgaagaacagcagcttgaagccgtgcgccagttcaaacaggcccagcatttgcgtatcgcagccggggatatttccggggcattgccggtgatgaaagtcagtgaccatttaacctaccttgccgaggccattctcgatgtcgtggtgcagcatgcgtgggaacaaatggtcgtaaaatacgggcagcccgcgcatcttcagcaccgtgaggggcgcggttttgccgtggtcggttacgggaaactcggtggctgggagctgggttatagctcagatctggatctggtcttcctgctcgattgcgcgccggaggtgatgacggacggcgaacgcagcatcgacggacgtcagttttatcttcggctggcgcagcgcattatgcacttattcagcacccggacatcgtcaggcattctttacgaggttgatccgcgtctgcgaccttccggcgcatccggcatgctggtcagtaccattgaagcgtttgcagattatcaggccaatgaagcctggacgtgggagcatcaggcgctggttcgcgcgcgcgtggtttacggggatccgcaactgacacagcaatttaacgccacgcgtcgcgacattctttgccgccagcgcgatggcgacggcctgcgtaaggaggtccgtgaaatgcgcgagaaaatgtatgcccatctggggagtaaaaaagcccacgagtttgatctgaaagccgatccgggtggcatcacggatattgaattcattgcacaatacctggttctgcgtttcgcgcatgatgagccgaagctgacgcgctggtctgataacgtgcggatttttgaactgatggcacgatatgacatcatgccggaagaggaagcgcgccatctgacgcaggcttatgtgacgctgcgcgatgaaattcatcatctggcgttgcaggaacacagcgggaaagtggccgcggacagctttgctactgagcgcgcgcagatccgtgccagctgggcaaagtggctcggctga 228 cggtactggaacagaaatcggcggatgcgcaggaaatttgttatgacacggcctgtctgaagtgcaagttagtgcttacttcctggctggcaacctcaggctggacgccgtttattgatgataaatctgcgaagaaactggacgcttccttcaaacgttttgctgacatcatgctcggtcgtaccgcagcggatctgaaagaagcctttgcgcagccactgacggaagaaggttatcgcgatcagctggcgcgcctgaaacgccagatcattaccttccatttgcttgccggtgcttaccctgaaaaagacgtcgatgcgtatattgccggctgggtggacctgcaacaggccatcgttcagcagcaacacgcctgggaggattcggcccgttctcacgcggtgatgatggatgctttctggttaaacgggcaacctcgttaactgactgactagcctgggcaaactgcccgggcttttttttgcaaggaatctgatttcatggcgctcaaacagttaatccgtctgtgtgccgcctcgccgatggtcgcgacacaacttgcacgtcatcctttattgctcgatgaactgctcgacccgcgcacgctttaccagccgattgagccgggcgcttaccgcgacgaactgcgtcagtatctgatgcgggtgccaacagaagacgaagaacagcagcttgaagccgtgcgccagttcaaacaggcccagcatttgcgtatcgcagccggggatatttccggggcattgccggtgatgaaagtcagtgaccatttaacctaccttgccgaggccattctcgatgtcgtggtgcagcatgcgtgggaacaaatggtcgtaaaatacgggcagcccgcgcatcttcagcaccgtgaggggcgcggttttgccgtggtcggttacgggaaactcggtggctgggagctgggttatagctcagatctggatctggtcttcctgctcgattgcgcgccggaggtgatgacggacggcgaacgcagcatcgacggacgtcagttttatcttcggctggcgcagcgcattatgcacttattcagcacccggacatcgtcaggcattctttacgaggttgatccgcgtctgcgaccttccggcgcatccggcatgctggtcagtaccattgaagcgtttgcagattatcaggccaatgaagcctggacgtgggagcatcaggcgctggttcgcgcgcgcgtggtttacggggatccgcaactgacacagcaatttaacgccacgcgtcgcgacattctttgccgccagcgcgatggcgacggcctgcgtaaggaggtccgtgaaatgcgcgagaaaatgtatgcccatctggggagtaaaaaagcccacgagtttgatctgaaagccgatccgggtggcatcacggatattgaattcattgcacaatacctggttctgcgtttcgcgcatgatgagccgaagctgacgcgctggtctgataacgtgcggatttttgaactgatggcacgatatgacatcatgccggaagaggaagcgcgccatctgacgcaggcttatgtgacgctgcgcgatgaaattcatcatctggcgttgcaggaacacagcgggaaagtggccgcggacagctttgctactgagcgcgcgcagatccgtgccagctgggcaaagtggctcggctgagggtttttattcggctaacaggcgcttgtgatattatccggcgcattgtatttacccgatttgatttatctgttttggagtcttgggatgaaagtgactttgcctgattttcaccgcgcaggtgtgctggttgtcggtgacgtaatgttagaccgttactggtatggcccgaccaatcgtatttctccggaagctccggtgccggtggtgaaggtcagtaccattgaagagcggcctggcggtgcagctaacgtggcgatgaacatttcatctctgggcgcctcttcctgtctgatcggcctgaccggcgtagacgacgctgcgcgtgccctcagtgagcgtctggcagaagtgaaagttaactgcgatttcgtcgcactatccacacatcctaccatcaccaaactgcgaattttgtcccgtaaccagcaactgatccgcctcgactttgaggaaggttttgaaggcgttgatctcgagccgatgctgaccaaaataga 229 atgagcatcacggcgttatcagctgaatatcactgactcacaagctacctatgtcgaagaattaactaaaaaactgcaagatgcaggcattcgcgttaaagccgacttgagaaatgagaagattggctttaaaattcgcgaacacacgctacgccgtgttccttatatgttagtttgtggcgataaagaggtcgaagcaggcaaagttgctgttcgtactcgtcgcggcaaagacttaggaagcatggatgttagcgaagtcgttgacaaactgctggcggaaatccgcagcagaagtcatcatcaactggaggaataaagtattaaaggcggaaaacgagttcaaccggcgcgtcctaatcgcattaacaaagagattcgcgcgcaagaagttcgcctcaccggcgtcgatggcgagcagattggtattgtcagtctgaatgaagctcttgaaaaagctgaggaagcgggcgtcgatttagtagaaatcagtccgaatgccgagccgccagtttgtcgaatctctttagatctctcggtccgccctgatggcggcaccttgctgacgttacgcctgccggtacagcaggttatcaccggaggcttaaaatga 230 tgtttcgtctcgaagccgggcaactgagcagccccgttgaaaccgaactgggctggcatctgttgttgtgcgaacaaattcgcctgccgcaacccttgccgaaagccgaggccttaacgcgggtgcgtcagcaactgattgcccggcaacagaatcattatcagcgccagtggctgcaacaactgatcaacgcctgagcctgttctccttcttgttggtgcagacgggttaatgcccgttttgcacgaaaaatgcacataaactgccttcgctgccttataacagcgcatggaaatcctgcctcctgccttgtgccacgccgcgctttgcctggtttgtggtaaaaactggcccgctttgcatcctgatgtttaaaacaccccgttcagatcaacctttgggcagataagcccgcgaaaggcctgcaaattgcacggttattccgggtgagtatatgtgtgatttgggttccggcattgcgcaataaaggggagaaagacatgagcatcacggcgttatcagctgaatatcactgactcacaagctacctatgtcgaagaattaactaaaaaactgcaagatgcaggcattcgcgttaaagccgacttgagaaatgagaagattggctttaaaattcgcgaacacacgctacgccgtgttccttatatgttagtttgtggcgataaagaggtcgaagcaggcaaagttgctgttcgtactcgtcgcggcaaagacttaggaagcatggatgttagcgaagtcgttgacaaactgctggcggaaatccgcagcagaagtcatcatcaactggaggaataaagtattaaaggcggaaaacgagttcaaccggcgcgtcctaatcgcattaacaaagagattcgcgcgcaagaagttcgcctcaccggcgtcgatggcgagcagattggtattgtcagtctgaatgaagctcttgaaaaagctgaggaagcgggcgtcgatttagtagaaatcagtccgaatgccgagccgccagtttgtcgaatctctttagatctctcggtccgccctgatggcggcaccttgctgacgttacgcctgccggtacagcaggttatcaccggaggcttaaaatgacccagttacctaccgcgggcccggttatccggcgctttgatatgtctgcccagtttacggcgctttatcgcatcagcgtggcgctgagtcaggaaagcaataccgcgcgcgcactggcggcgatcctcgaagtgcttcacgatcatgcatttatgcaatacggcatggtgtgtctgttcgataaagaacgcaatgcactgtttgtggaatccctgcatggcatcgacggcgaaaggaaaaaagaaacccgccatgtccgttaccgcatgggggaaggcgtgatcggcgcggtgatgagccagcgtcaggcgctggtgttaccgcgcatttcagacgatcagcgttttctcgaccgcctgaatatttacgattacagcctgccgctgattggtgtgccgatccccggtgcggataatcagcctgcgggtgtgctggtggcacagccgatggcgttgcacgaagaccggctggctgccagtacgcggtttttagaaatggtc 231 atgaccctgaatatgatgatggatgccggcggacatcatcgcgacaaacaatattaataccggcaaccacaccggcaatttacgagactgcgcaggcatcctttctcccgtcaatttctgtcaaataaagtaaaagaggcagtctacttgaattacccccggctggttgagcgtttgttgaaaaaaagtaactgaaaaatccgtagaatagcgccactctgatggttaattaacctattcaattaagaattatctggatgaatgtgccattaaatgcgcagcataatggtgcgttgtgcgggaaaactgcttttttttgaaagggttggtcagtagcggaaacaactcacttcacaccccgaagggggaagttgcctgaccctacgattcccgctatttcattcactgaccggaggttcaaaatga 232 accggatacgagagaaaagtgtctacatcggttcggttgatattgaccggcgcatccgccagcccgcccagtttctggtggatctgtttggcgattttgcgggtcttgccggtgtcggtgccgaaaaaaataccaatatttgccataacacacgctcctgttgaaaaagagatcccgccgggaaatgcggtgaacgtgtctgatattgcgaagagtgtgccagttttggtcgcgggcaaaacctgcaccagtttggttattaatgcaccagtctggcgctttttttcgccgagtttctcctcgctaatgcccgccaggcgcggctttggcgctgatagcgcgctgaataccgatctggatcaaggttttgtcgggttatcagccaaaaggtgcactctttgcatggttatacgtgcctgacatgttgtccgggcgacaaacggcctggtggcacaaattgtcagaactacgacacgactaactgaccgcaggagtgtgcgatgaccctgaatatgatgatggatgccggcggacatcatcgcgacaaacaatattaataccggcaaccacaccggcaatttacgagactgcgcaggcatcctttctcccgtcaatttctgtcaaataaagtaaaagaggcagtctacttgaattacccccggctggttgagcgtttgttgaaaaaaagtaactgaaaaatccgtagaatagcgccactctgatggttaattaacctattcaattaagaattatctggatgaatgtgccattaaatgcgcagcataatggtgcgttgtgcgggaaaactgcttttttttgaaagggttggtcagtagcggaaacaactcacttcacaccccgaagggggaagttgcctgaccctacgattcccgctatttcattcactgaccggaggttcaaaatgacccagcgaaccgagtcgggtaataccgtctggcgcttcgatttgtcccagcagttcactgcgatgcagcgcataagcgtggtactcagccgggcgaccgaggtcgatcagacgctccagcaagtgctgtgcgtattgcacaatgacgcctttttgcagcacggcatgatctgtctgtacgacagccagcaggcgattttgaatattgaagcgttgcaggaagccgatcagcagttaatccccggcagctcgcaaatccgctatcgtccgggcgaagggctggtcgggacggtgctttcgcagggccaatcattagtgctggcgcgcgttgctgacgatcagcgctttcttgaccggctcgggttgtatgattacaacctgccgtttatcgccgtgccgctgatagggccagatgcgcagactttcggtgtgctgacggcacaacccatggcgcgttacgaagagcgattacccgcctgcacccgctttctggaaacggtc 233 atgaccctgaatatgatgatggatgccggccgtcctgtaataataaccggacaattcggactgattaaaaaagcgcccttgtggcgctttttttatattcccgcctccatttaaaataaaaaatccaatcggatttcactatttaaactggccattatctaagatgaatccgatggaagctcgctgttttaacacgcgttttttaaccttttattgaaagtcggtgcttctttgagcgaacgatcaaatttaagtggattcccatcaaaaaaatattctcaacctaaaaaagtttgtgtaatacttgtaacgctacatggagattaactcaatctagagggtattaataatgaatcgtactaaactggtactgggcgcaactcacttcacaccccgaagggggaagttgcctgaccctacgattcccgctatttcattcactgaccggaggttcaaaatga 234 accggatacgagagaaaagtgtctacatcggttcggttgatattgaccggcgcatccgccagcccgcccagtttctggtggatctgtttggcgattttgcgggtcttgccggtgtcggtgccgaaaaaaataccaatatttgccataacacacgctcctgttgaaaaagagatcccgccgggaaatgcggtgaacgtgtctgatattgcgaagagtgtgccagttttggtcgcgggcaaaacctgcaccagtttggttattaatgcaccagtctggcgctttttttcgccgagtttctcctcgctaatgcccgccaggcgcggctttggcgctgatagcgcgctgaataccgatctggatcaaggttttgtcgggttatcagccaaaaggtgcactctttgcatggttatacgtgcctgacatgttgtccgggcgacaaacggcctggtggcacaaattgtcagaactacgacacgactaactgaccgcaggagtgtgcgatgaccctgaatatgatgatggatgccggccgtcctgtaataataaccggacaattcggactgattaaaaaagcgcccttgtggcgctttttttatattcccgcctccatttaaaataaaaaatccaatcggatttcactatttaaactggccattatctaagatgaatccgatggaagctcgctgttttaacacgcgttttttaaccttttattgaaagtcggtgcttctttgagcgaacgatcaaatttaagtggattcccatcaaaaaaatattctcaacctaaaaaagtttgtgtaatacttgtaacgctacatggagattaactcaatctagagggtattaataatgaatcgtactaaactggtactgggcgcaactcacttcacaccccgaagggggaagttgcctgaccctacgattcccgctatttcattcactgaccggaggttcaaaatgacccagcgaaccgagtcgggtaataccgtctggcgcttcgatttgtcccagcagttcactgcgatgcagcgcataagcgtggtactcagccgggcgaccgaggtcgatcagacgctccagcaagtgctgtgcgtattgcacaatgacgcctttttgcagcacggcatgatctgtctgtacgacagccagcaggcgattttgaatattgaagcgttgcaggaagccgatcagcagttaatccccggcagctcgcaaatccgctatcgtccgggcgaagggctggtcgggacggtgctttcgcagggccaatcattagtgctggcgcgcgttgctgacgatcagcgctttcttgaccggctcgggttgtatgattacaacctgccgtttatcgccgtgccgctgatagggccagatgcgcagactttcggtgtgctgacggcacaacccatggcgcgttacgaagagcgattacccgcctgcacccgctttctggaaacggtc 235 atgaccctgaatatgatgatggatgccggccgtcctgtaataataaccggacaattcggactgattaaaaaagcgcccttgtggcgctttttttatattcccgcctccatttaaaataaaaaatccaatcggatttcactatttaaactggccattatctaagatgaatccgatggaagctcgctgttttaacacgcgttttttaaccttttattgaaagtcggtgcttctttgagcgaacgatcaaatttaagtggattcccatcaaaaaaatattctcaacctaaaaaagtttgtgtaatacttgtaacgctacatggagattaactcaatctagagggtattaataatgaatcgtactaaactggtactgggcgcaactcacttcacaccccgaagggggaagttgcctgaccctacgattcccgctatttcattcactgaccggaggttcaaaatga 236 accggatacgagagaaaagtgtctacatcggttcggttgatattgaccggcgcatccgccagcccgcccagtttctggtggatctgtttggcgattttgcgggtcttgccggtgtcggtgccgaaaaaaataccaatatttgccataacacacgctcctgttgaaaaagagatcccgccgggaaatgcggtgaacgtgtctgatattgcgaagagtgtgccagttttggtcgcgggcaaaacctgcaccagtttggttattaatgcaccagtctggcgctttttttcgccgagtttctcctcgctaatgcccgccaggcgcggctttggcgctgatagcgcgctgaataccgatctggatcaaggttttgtcgggttatcagccaaaaggtgcactctttgcatggttatacgtgcctgacatgttgtccgggcgacaaacggcctggtggcacaaattgtcagaactacgacacgactaactgaccgcaggagtgtgcgatgaccctgaatatgatgatggatgccggccgtcctgtaataataaccggacaattcggactgattaaaaaagcgcccttgtggcgctttttttatattcccgcctccatttaaaataaaaaatccaatcggatttcactatttaaactggccattatctaagatgaatccgatggaagctcgctgttttaacacgcgttttttaaccttttattgaaagtcggtgcttctttgagcgaacgatcaaatttaagtggattcccatcaaaaaaatattctcaacctaaaaaagtttgtgtaatacttgtaacgctacatggagattaactcaatctagagggtattaataatgaatcgtactaaactggtactgggcgcaactcacttcacaccccgaagggggaagttgcctgaccctacgattcccgctatttcattcactgaccggaggttcaaaatgacccagcgaaccgagtcgggtaataccgtctggcgcttcgatttgtcccagcagttcactgcgatgcagcgcataagcgtggtactcagccgggcgaccgaggtcgatcagacgctccagcaagtgctgtgcgtattgcacaatgacgcctttttgcagcacggcatgatctgtctgtacgacagccagcaggcgattttgaatattgaagcgttgcaggaagccgatcagcagttaatccccggcagctcgcaaatccgctatcgtccgggcgaagggctggtcgggacggtgctttcgcagggccaatcattagtgctggcgcgcgttgctgacgatcagcgctttcttgaccggctcgggttgtatgattacaacctgccgtttatcgccgtgccgctgatagggccagatgcgcagactttcggtgtgctgacggcacaacccatggcgcgttacgaagagcgattacccgcctgcacccgctttctggaaacggtc 237 atggcactgaaacacctcatttccctgtgtgccgcgtcgccgatggttgccagtcagctggcgcgctacccgatcctgcttgatgaattgctcgacccgaatacgctctatcaaccgacggcgatgaatgcctatcgcgatgagctgcgccaatacctgctgcgcgtgccggaagatgatgaagagcaacagcttgaggcgctgcggcagtttaagcaggcgcagttgctgcgcgtggcggcggcggatattgccggtacgttgccagtaatgaaagtgagcgatcacttaacctggctggcggaagcgattattgatgcggtggtgcagcaagcctgggggcagatggtggcgcgttatggccagccaacgcatctgcacgatcgcgaagggcgcggttttgcggtggtcggttatggcaagctgggcggctgggagctgggttacagctccgatctggatctggtattcctgcacgactgcccgatggatgtgatgaccgatggcgagcgtgaaatcgatggtcgccagttctatttgcgtctcgcgcagcgcgtgatgcacctgtttagcacgcgcacgtcgtccggcatcctttatgaagttgatgcgcgtctgcgtccatctggcgctgcggggatgctggtcactactacggaatcgttcgccgattaccagcaaaacgaagcctggacgtgggaacatcaggcgctggcccgtgcgcgcgtggtgtacggcgatccgcaactgaccgccgaatttgacgccattcgccgcgatattctgatgacgcctcgcgacggcgcaacgctgcaaaccgacgtgcgagaaatgcgcgagaaaatgcgtgcccatcttggcaacaagcataaagaccgcttcgatctgaaagccgatgaaggcggtatcaccgacatcgagtttatcgcccaatatctggtgctgcgctttgcccatgacaagccgaaactgacgcgctggtcggataatgtgcgcattctcgaagggctggcgcaaaacggcatcatggaggagcaggaagcgcaggcattgacgctggcgtacaccacattgcgtgatgagctgcaccacctggcgctgcaagagttgccgggacatgtggcgctctcctgttttgtcgccgagcgtgcgcttattaaaaccagctgggacaagtggctggtggaa 238 gcgcaaagcgagtgctcacttacgtgatctgttgacacaatctgaagcgaccataacttctgccgtttcagcgaatacggcggtgtggagcgcacaatcagccctggcgaagctggtgctcaccgagtggctagtgacgcagggctggcgaaccttccttgatgaaaaagcgcaggccaaattcgccgactcctttaaacgctttgctgacatccatctgtcacgcagcgccgccgagctgaaaaaagcctttgcccaaccgctgggcgacagctatcgcgaccagttgccgcgcctggcgcgtgatatcgactgcgcgttactgctggccgggcattacgatcgcgcgcgcgccgtggaatggctggaaaactggcaggggcttcagcacgccattgaaacgcgccagagagtcgaaatcgaacatttccgtaataccgcgattacccaggagccgttctggttgcacagcggaaaacgttaacgaaaggatatttcgcatggcactgaaacacctcatttccctgtgtgccgcgtcgccgatggttgccagtcagctggcgcgctacccgatcctgcttgatgaattgctcgacccgaatacgctctatcaaccgacggcgatgaatgcctatcgcgatgagctgcgccaatacctgctgcgcgtgccggaagatgatgaagagcaacagcttgaggcgctgcggcagtttaagcaggcgcagttgctgcgcgtggcggcggcggatattgccggtacgttgccagtaatgaaagtgagcgatcacttaacctggctggcggaagcgattattgatgcggtggtgcagcaagcctgggggcagatggtggcgcgttatggccagccaacgcatctgcacgatcgcgaagggcgcggttttgcggtggtcggttatggcaagctgggcggctgggagctgggttacagctccgatctggatctggtattcctgcacgactgcccgatggatgtgatgaccgatggcgagcgtgaaatcgatggtcgccagttctatttgcgtctcgcgcagcgcgtgatgcacctgtttagcacgcgcacgtcgtccggcatcctttatgaagttgatgcgcgtctgcgtccatctggcgctgcggggatgctggtcactactacggaatcgttcgccgattaccagcaaaacgaagcctggacgtgggaacatcaggcgctggcccgtgcgcgcgtggtgtacggcgatccgcaactgaccgccgaatttgacgccattcgccgcgatattctgatgacgcctcgcgacggcgcaacgctgcaaaccgacgtgcgagaaatgcgcgagaaaatgcgtgcccatcttggcaacaagcataaagaccgcttcgatctgaaagccgatgaaggcggtatcaccgacatcgagtttatcgcccaatatctggtgctgcgctttgcccatgacaagccgaaactgacgcgctggtcggataatgtgcgcattctcgaagggctggcgcaaaacggcatcatggaggagcaggaagcgcaggcattgacgctggcgtacaccacattgcgtgatgagctgcaccacctggcgctgcaagagttgccgggacatgtggcgctctcctgttttgtcgccgagcgtgcgcttattaaaaccagctgggacaagtggctggtggaaccgtgcgccccggcgtaagtgtggtatcatcgcgcgcaaattttgtatctctcaggagacaggaatgaaagtgacgctgccagagtttaagcaagccggtgtaatggtggtgggtgatgtgatgctggatcgttactggtatggcccaaccagccgtatctctccggaagcgccagtcccggttgttaaagtcgataccattgaagagcgtcctggcggcgcggcaaacgtggcgatgaatatcgcctcactgggcgccacggcgcgtctggttggcctgactggcattgacgatgcggcgcgcgcgctgagcaaagcgctggccgatgttaacgttaaatgtgacttcgtttctgttccgacgcatcccaccatcactaagctgcgcgtgctgtcgcgtaaccagcagctgattcgcctggactttgaagagggttttgaaggagtcgatccgcaaccgatgcatgaacgcatcagccaggcgcttggtaatattggcgcgctggtgctgtcggatt 239 atgtttaacgatctgattggcgatgatgaaacggattcgccggaagatgcgctttctgagagctggcgcgaattgtggcaggatgcgttgcaggaggaggattccacgcccgtgctggcgcatctctcagaggacgatcgccgccgcgtggtggcgctgattgccgattttcgcaaagagttggataaacgcaccattggcccgcgagggcggcaggtactcgatcacttaatgccgcatctgctcagcgatgtatgctcgcgcgacgatgcgccagtaccgctgtcacgcctgacgccgctgctcaccggaattattacccgcaccacttaccttgagctgctaagtgaatttcccggcgcactgaaacacctcatttccctgtgtgccgcgtcgccgatggttgccagtcagctggcgcgctacccgatcctgcttgatgaattgctcgacccgaatacgctctatcaaccgacggcgatgaatgcctatcgcgatgagctgcgccaatacctgctgcgcgtgccggaagatgatgaagagcaacagcttgaggcgctgcggcagtttaagcaggcgcagttgctgcgcgtggcggcggcggatattgccggtacgttgccagtaatgaaagtgagcgatcacttaacctggctggcggaagcgattattgatgcggtggtgcagcaagcctgggggcagatggtggcgcgttatggccagccaacgcatctgcacgatcgcgaagggcgcggttttgcggtggtcggttatggcaagctgggcggctgggagctgggttacagctccgatctggatctggtattcctgcacgactgcccgatggatgtgatgaccgatggcgagcgtgaaatcgatggtcgccagttctatttgcgtctcgcgcagcgcgtgatgcacctgtttagcacgcgcacgtcgtccggcatcctttatgaagttgatgcgcgtctgcgtccatctggcgctgcggggatgctggtcactactacggaatcgttcgccgattaccagcaaaacgaagcctggacgtgggaacatcaggcgctggcccgtgcgcgcgtggtgtacggcgatccgcaactgaccgccgaatttgacgccattcgccgcgatattctgatgacgcctcgcgacggcgcaacgctgcaaaccgacgtgcgagaaatgcgcgagaaaatgcgtgcccatcttggcaacaagcataaagaccgcttcgatctgaaagccgatgaaggcggtatcaccgacatcgagtttatcgcccaatatctggtgctgcgctttgcccatgacaagccgaaactgacgcgctggtcggataatgtgcgcattctcgaagggctggcgcaaaacggcatcatggaggagcaggaagcgcaggcattgacgctggcgtacaccacattgcgtgatgagctgcaccacctggcgctgcaagagttgccgggacatgtggcgctctcctgttttgtcgccgagcgtgcgcttattaaaaccagctgggacaagtggctggtggaaccgtgcgccccggcgtaa 240 atgaccctgaatatgatgatggatgccggccgtcctgtaataataaccggacaattcggactgattaaaaaagcgcccttgtggcgctttttttatattcccgcctccatttaaaataaaaaatccaatcggatttcactatttaaactggccattatctaagatgaatccgatggaagctcgctgttttaacacgcgttttttaaccttttattgaaagtcggtgcttctttgagcgaacgatcaaatttaagtggattcccatcaaaaaaatattctcaacctaaaaaagtttgtgtaatacttgtaacgctacatggagattaactcaatctagagggtattaataatgaatcgtactaaactggtactgggcgcaactcacttcacaccccgaagggggaagttgcctgaccctacgattcccgctatttcattcactgaccggaggttcaaaatga 241 accggatacgagagaaaagtgtctacatcggttcggttgatattgaccggcgcatccgccagcccgcccagtttctggtggatctgtttggcgattttgcgggtcttgccggtgtcggtgccgaaaaaaataccaatatttgccataacacacgctcctgttgaaaaagagatcccgccgggaaatgcggtgaacgtgtctgatattgcgaagagtgtgccagttttggtcgcgggcaaaacctgcaccagtttggttattaatgcaccagtctggcgctttttttcgccgagtttctcctcgctaatgcccgccaggcgcggctttggcgctgatagcgcgctgaataccgatctggatcaaggttttgtcgggttatcagccaaaaggtgcactctttgcatggttatacgtgcctgacatgttgtccgggcgacaaacggcctggtggcacaaattgtcagaactacgacacgactaactgaccgcaggagtgtgcgatgaccctgaatatgatgatggatgccggccgtcctgtaataataaccggacaattcggactgattaaaaaagcgcccttgtggcgctttttttatattcccgcctccatttaaaataaaaaatccaatcggatttcactatttaaactggccattatctaagatgaatccgatggaagctcgctgttttaacacgcgttttttaaccttttattgaaagtcggtgcttctttgagcgaacgatcaaatttaagtggattcccatcaaaaaaatattctcaacctaaaaaagtttgtgtaatacttgtaacgctacatggagattaactcaatctagagggtattaataatgaatcgtactaaactggtactgggcgcaactcacttcacaccccgaagggggaagttgcctgaccctacgattcccgctatttcattcactgaccggaggttcaaaatgacccagcgaaccgagtcgggtaataccgtctggcgcttcgatttgtcccagcagttcactgcgatgcagcgcataagcgtggtactcagccgggcgaccgaggtcgatcagacgctccagcaagtgctgtgcgtattgcacaatgacgcctttttgcagcacggcatgatctgtctgtacgacagccagcaggcgattttgaatattgaagcgttgcaggaagccgatcagcagttaatccccggcagctcgcaaatccgctatcgtccgggcgaagggctggtcgggacggtgctttcgcagggccaatcattagtgctggcgcgcgttgctgacgatcagcgctttcttgaccggctcgggttgtatgattacaacctgccgtttatcgccgtgccgctgatagggccagatgcgcagactttcggtgtgctgacggcacaacccatggcgcgttacgaagagcgattacccgcctgcacccgctttctggaaacggtc 242 gcgcaaagcgagtgctcacttacgtgatctgttgacacaatctgaagcgaccataacttctgccgtttcagcgaatacggcggtgtggagcgcacaatcagccctggcgaagctggtgctcaccgagtggctagtgacgcagggctggcgaaccttccttgatgaaaaagcgcaggccaaattcgccgactcctttaaacgctttgctgacatccatctgtcacgcagcgccgccgagctgaaaaaagcctttgcccaaccgctgggcgacagctatcgcgaccagttgccgcgcctggcgcgtgatatcgactgcgcgttactgctggccgggcattacgatcgcgcgcgcgccgtggaatggctggaaaactggcaggggcttcagcacgccattgaaacgcgccagagagtcgaaatcgaacatttccgtaataccgcgattacccaggagccgttctggttgcacagcggaaaacgttaacgaaaggatatttcgcatgtttaacgatctgattggcgatgatgaaacggattcgccggaagatgcgctttctgagagctggcgcgaattgtggcaggatgcgttgcaggaggaggattccacgcccgtgctggcgcatctctcagaggacgatcgccgccgcgtggtggcgctgattgccgattttcgcaaagagttggataaacgcaccattggcccgcgagggcggcaggtactcgatcacttaatgccgcatctgctcagcgatgtatgctcgcgcgacgatgcgccagtaccgctgtcacgcctgacgccgctgctcaccggaattattacccgcaccacttaccttgagctgctaagtgaatttcccggcgcactgaaacacctcatttccctgtgtgccgcgtcgccgatggttgccagtcagctggcgcgctacccgatcctgcttgatgaattgctcgacccgaatacgctctatcaaccgacggcgatgaatgcctatcgcgatgagctgcgccaatacctgctgcgcgtgccggaagatgatgaagagcaacagcttgaggcgctgcggcagtttaagcaggcgcagttgctgcgcgtggcggcggcggatattgccggtacgttgccagtaatgaaagtgagcgatcacttaacctggctggcggaagcgattattgatgcggtggtgcagcaagcctgggggcagatggtggcgcgttatggccagccaacgcatctgcacgatcgcgaagggcgcggttttgcggtggtcggttatggcaagctgggcggctgggagctgggttacagctccgatctggatctggtattcctgcacgactgcccgatggatgtgatgaccgatggcgagcgtgaaatcgatggtcgccagttctatttgcgtctcgcgcagcgcgtgatgcacctgtttagcacgcgcacgtcgtccggcatcctttatgaagttgatgcgcgtctgcgtccatctggcgctgcggggatgctggtcactactacggaatcgttcgccgattaccagcaaaacgaagcctggacgtgggaacatcaggcgctggcccgtgcgcgcgtggtgtacggcgatccgcaactgaccgccgaatttgacgccattcgccgcgatattctgatgacgcctcgcgacggcgcaacgctgcaaaccgacgtgcgagaaatgcgcgagaaaatgcgtgcccatcttggcaacaagcataaagaccgcttcgatctgaaagccgatgaaggcggtatcaccgacatcgagtttatcgcccaatatctggtgctgcgctttgcccatgacaagccgaaactgacgcgctggtcggataatgtgcgcattctcgaagggctggcgcaaaacggcatcatggaggagcaggaagcgcaggcattgacgctggcgtacaccacattgcgtgatgagctgcaccacctggcgctgcaagagttgccgggacatgtggcgctctcctgttttgtcgccgagcgtgcgcttattaaaaccagctgggacaagtggctggtggaaccgtgcgccccggcgtaagtgtggtatcatcgcgcgcaaattttgtatctctcaggagacaggaatgaaagtgacgctgccagagtttaagcaagccggtgtaatggtggtgggtgatgtgatgctggatcgttactggtatggcccaaccagccgtatctctccggaagcgccagtcccggttgttaaagtcgataccattgaagagcgtcctggcggcgcggcaaacgtggcgatgaatatcgcctcactgggcgccacggcgcgtctggttggcctgactggcattgacgatgcggcgcgcgcgctgagcaaagcgctggccgatgttaacgttaaatgtgacttcgtttctgttccgacgcatcccaccatcactaagctgcgcgtgctgtcgcgtaaccagcagctgattcgcctggactttgaagagggttttgaaggagtcgatccgcaaccgatgcatgaacgcatcagccaggcgcttggtaatattggcgcgctggtgctgtcggatt 243 atgtttaacgatctgattggcgatgatgaaacggattcgccggaagatgcgctttctgagagctggcgcgaattgtggcaggatgcgttgcaggaggaggattccacgcccgtgctggcgcatctctcagaggacgatcgccgccgcgtggtggcgctgattgccgattttcgcaaagagttggataaacgcaccattggcccgcgagggcggcaggtactcgatcacttaatgccgcatctgctcagcgatgtatgctcgcgcgacgatgcgccagtaccgctgtcacgcctgacgccgctgctcaccggaattattacccgcaccacttaccttgagctgctaagtgaatttcccggcgcactgaaacacctcatttccctgtgtgccgcgtcgccgatggttgccagtcagctggcgcgctacccgatcctgcttgatgaattgctcgacccgaatacgctctatcaaccgacggcgatgaatgcctatcgcgatgagctgcgccaatacctgctgcgcgtgccggaagatgatgaagagcaacagcttgaggcgctgcggcagtttaagcaggcgcagttgctgcgcgtggcggcggcggatattgccggtacgttgccagtaatgaaagtgagcgatcacttaacctggctggcggaagcgattattgatgcggtggtgcagcaagcctgggggcagatggtggcgcgttatggccagccaacgcatctgcacgatcgcgaagggcgcggttttgcggtggtcggttatggcaagctgggcggctgggagctgggttacagctccgatctggatctggtattcctgcacgactgcccgatggatgtgatgaccgatggcgagcgtgaaatcgatggtcgccagttctatttgcgtctcgcgcagcgcgtgatgcacctgtttagcacgcgcacgtcgtccggcatcctttatgaagttgatgcgcgtctgcgtccatctggcgctgcggggatgctggtcactactacggaatcgttcgccgattaccagcaaaacgaagcctggacgtgggaacatcaggcgctggcccgtgcgcgcgtggtgtacggcgatccgcaactgaccgccgaatttgacgccattcgccgcgatattctgatgacgcctcgcgacggcgcaacgctgcaaaccgacgtgcgagaaatgcgcgagaaaatgcgtgcccatcttggcaacaagcataaagaccgcttcgatctgaaagccgatgaaggcggtatcaccgacatcgagtttatcgcccaatatctggtgctgcgctttgcccatgacaagccgaaactgacgcgctggtcggataatgtgcgcattctcgaagggctggcgcaaaacggcatcatggaggagcaggaagcgcaggcattgacgctggcgtacaccacattgcgtgatgagctgcaccacctggcgctgcaagagttgccgggacatgtggcgctctcctgttttgtcgccgagcgtgcgcttattaaaaccagctgggacaagtggctggtggaaccgtgcgccccggcgtaa 244 gcgcaaagcgagtgctcacttacgtgatctgttgacacaatctgaagcgaccataacttctgccgtttcagcgaatacggcggtgtggagcgcacaatcagccctggcgaagctggtgctcaccgagtggctagtgacgcagggctggcgaaccttccttgatgaaaaagcgcaggccaaattcgccgactcctttaaacgctttgctgacatccatctgtcacgcagcgccgccgagctgaaaaaagcctttgcccaaccgctgggcgacagctatcgcgaccagttgccgcgcctggcgcgtgatatcgactgcgcgttactgctggccgggcattacgatcgcgcgcgcgccgtggaatggctggaaaactggcaggggcttcagcacgccattgaaacgcgccagagagtcgaaatcgaacatttccgtaataccgcgattacccaggagccgttctggttgcacagcggaaaacgttaacgaaaggatatttcgcatgtttaacgatctgattggcgatgatgaaacggattcgccggaagatgcgctttctgagagctggcgcgaattgtggcaggatgcgttgcaggaggaggattccacgcccgtgctggcgcatctctcagaggacgatcgccgccgcgtggtggcgctgattgccgattttcgcaaagagttggataaacgcaccattggcccgcgagggcggcaggtactcgatcacttaatgccgcatctgctcagcgatgtatgctcgcgcgacgatgcgccagtaccgctgtcacgcctgacgccgctgctcaccggaattattacccgcaccacttaccttgagctgctaagtgaatttcccggcgcactgaaacacctcatttccctgtgtgccgcgtcgccgatggttgccagtcagctggcgcgctacccgatcctgcttgatgaattgctcgacccgaatacgctctatcaaccgacggcgatgaatgcctatcgcgatgagctgcgccaatacctgctgcgcgtgccggaagatgatgaagagcaacagcttgaggcgctgcggcagtttaagcaggcgcagttgctgcgcgtggcggcggcggatattgccggtacgttgccagtaatgaaagtgagcgatcacttaacctggctggcggaagcgattattgatgcggtggtgcagcaagcctgggggcagatggtggcgcgttatggccagccaacgcatctgcacgatcgcgaagggcgcggttttgcggtggtcggttatggcaagctgggcggctgggagctgggttacagctccgatctggatctggtattcctgcacgactgcccgatggatgtgatgaccgatggcgagcgtgaaatcgatggtcgccagttctatttgcgtctcgcgcagcgcgtgatgcacctgtttagcacgcgcacgtcgtccggcatcctttatgaagttgatgcgcgtctgcgtccatctggcgctgcggggatgctggtcactactacggaatcgttcgccgattaccagcaaaacgaagcctggacgtgggaacatcaggcgctggcccgtgcgcgcgtggtgtacggcgatccgcaactgaccgccgaatttgacgccattcgccgcgatattctgatgacgcctcgcgacggcgcaacgctgcaaaccgacgtgcgagaaatgcgcgagaaaatgcgtgcccatcttggcaacaagcataaagaccgcttcgatctgaaagccgatgaaggcggtatcaccgacatcgagtttatcgcccaatatctggtgctgcgctttgcccatgacaagccgaaactgacgcgctggtcggataatgtgcgcattctcgaagggctggcgcaaaacggcatcatggaggagcaggaagcgcaggcattgacgctggcgtacaccacattgcgtgatgagctgcaccacctggcgctgcaagagttgccgggacatgtggcgctctcctgttttgtcgccgagcgtgcgcttattaaaaccagctgggacaagtggctggtggaaccgtgcgccccggcgtaagtgtggtatcatcgcgcgcaaattttgtatctctcaggagacaggaatgaaagtgacgctgccagagtttaagcaagccggtgtaatggtggtgggtgatgtgatgctggatcgttactggtatggcccaaccagccgtatctctccggaagcgccagtcccggttgttaaagtcgataccattgaagagcgtcctggcggcgcggcaaacgtggcgatgaatatcgcctcactgggcgccacggcgcgtctggttggcctgactggcattgacgatgcggcgcgcgcgctgagcaaagcgctggccgatgttaacgttaaatgtgacttcgtttctgttccgacgcatcccaccatcactaagctgcgcgtgctgtcgcgtaaccagcagctgattcgcctggactttgaagagggttttgaaggagtcgatccgcaaccgatgcatgaacgcatcagccaggcgcttggtaatattggcgcgctggtgctgtcggatt 245 atgaccctgaatatgatgatggatgccggcggacatcatcgcgacaaacaatattaataccggcaaccacaccggcaatttacgagactgcgcaggcatcctttctcccgtcaatttctgtcaaataaagtaaaagaggcagtctacttgaattacccccggctggttgagcgtttgttgaaaaaaagtaactgaaaaatccgtagaatagcgccactctgatggttaattaacctattcaattaagaattatctggatgaatgtgccattaaatgcgcagcataatggtgcgttgtgcgggaaaactgcttttttttgaaagggttggtcagtagcggaaacaactcacttcacaccccgaagggggaagttgcctgaccctacgattcccgctatttcattcactgaccggaggttcaaaatga 246 accggatacgagagaaaagtgtctacatcggttcggttgatattgaccggcgcatccgccagcccgcccagtttctggtggatctgtttggcgattttgcgggtcttgccggtgtcggtgccgaaaaaaataccaatatttgccataacacacgctcctgttgaaaaagagatcccgccgggaaatgcggtgaacgtgtctgatattgcgaagagtgtgccagttttggtcgcgggcaaaacctgcaccagtttggttattaatgcaccagtctggcgctttttttcgccgagtttctcctcgctaatgcccgccaggcgcggctttggcgctgatagcgcgctgaataccgatctggatcaaggttttgtcgggttatcagccaaaaggtgcactctttgcatggttatacgtgcctgacatgttgtccgggcgacaaacggcctggtggcacaaattgtcagaactacgacacgactaactgaccgcaggagtgtgcgatgaccctgaatatgatgatggatgccggcggacatcatcgcgacaaacaatattaataccggcaaccacaccggcaatttacgagactgcgcaggcatcctttctcccgtcaatttctgtcaaataaagtaaaagaggcagtctacttgaattacccccggctggttgagcgtttgttgaaaaaaagtaactgaaaaatccgtagaatagcgccactctgatggttaattaacctattcaattaagaattatctggatgaatgtgccattaaatgcgcagcataatggtgcgttgtgcgggaaaactgcttttttttgaaagggttggtcagtagcggaaacaactcacttcacaccccgaagggggaagttgcctgaccctacgattcccgctatttcattcactgaccggaggttcaaaatgacccagcgaaccgagtcgggtaataccgtctggcgcttcgatttgtcccagcagttcactgcgatgcagcgcataagcgtggtactcagccgggcgaccgaggtcgatcagacgctccagcaagtgctgtgcgtattgcacaatgacgcctttttgcagcacggcatgatctgtctgtacgacagccagcaggcgattttgaatattgaagcgttgcaggaagccgatcagcagttaatccccggcagctcgcaaatccgctatcgtccgggcgaagggctggtcgggacggtgctttcgcagggccaatcattagtgctggcgcgcgttgctgacgatcagcgctttcttgaccggctcgggttgtatgattacaacctgccgtttatcgccgtgccgctgatagggccagatgcgcagactttcggtgtgctgacggcacaacccatggcgcgttacgaagagcgattacccgcctgcacccgctttctggaaacggtc 247 atgaccctgaatatgatgatggatgccggccgtcctgtaataataaccggacaattcggactgattaaaaaagcgcccttgtggcgctttttttatattcccgcctccatttaaaataaaaaatccaatcggatttcactatttaaactggccattatctaagatgaatccgatggaagctcgctgttttaacacgcgttttttaaccttttattgaaagtcggtgcttctttgagcgaacgatcaaatttaagtggattcccatcaaaaaaatattctcaacctaaaaaagtttgtgtaatacttgtaacgctacatggagattaactcaatctagagggtattaataatgaatcgtactaaactggtactgggcgcaactcacttcacaccccgaagggggaagttgcctgaccctacgattcccgctatttcattcactgaccggaggttcaaaatga 248 accggatacgagagaaaagtgtctacatcggttcggttgatattgaccggcgcatccgccagcccgcccagtttctggtggatctgtttggcgattttgcgggtcttgccggtgtcggtgccgaaaaaaataccaatatttgccataacacacgctcctgttgaaaaagagatcccgccgggaaatgcggtgaacgtgtctgatattgcgaagagtgtgccagttttggtcgcgggcaaaacctgcaccagtttggttattaatgcaccagtctggcgctttttttcgccgagtttctcctcgctaatgcccgccaggcgcggctttggcgctgatagcgcgctgaataccgatctggatcaaggttttgtcgggttatcagccaaaaggtgcactctttgcatggttatacgtgcctgacatgttgtccgggcgacaaacggcctggtggcacaaattgtcagaactacgacacgactaactgaccgcaggagtgtgcgatgaccctgaatatgatgatggatgccggccgtcctgtaataataaccggacaattcggactgattaaaaaagcgcccttgtggcgctttttttatattcccgcctccatttaaaataaaaaatccaatcggatttcactatttaaactggccattatctaagatgaatccgatggaagctcgctgttttaacacgcgttttttaaccttttattgaaagtcggtgcttctttgagcgaacgatcaaatttaagtggattcccatcaaaaaaatattctcaacctaaaaaagtttgtgtaatacttgtaacgctacatggagattaactcaatctagagggtattaataatgaatcgtactaaactggtactgggcgcaactcacttcacaccccgaagggggaagttgcctgaccctacgattcccgctatttcattcactgaccggaggttcaaaatgacccagcgaaccgagtcgggtaataccgtctggcgcttcgatttgtcccagcagttcactgcgatgcagcgcataagcgtggtactcagccgggcgaccgaggtcgatcagacgctccagcaagtgctgtgcgtattgcacaatgacgcctttttgcagcacggcatgatctgtctgtacgacagccagcaggcgattttgaatattgaagcgttgcaggaagccgatcagcagttaatccccggcagctcgcaaatccgctatcgtccgggcgaagggctggtcgggacggtgctttcgcagggccaatcattagtgctggcgcgcgttgctgacgatcagcgctttcttgaccggctcgggttgtatgattacaacctgccgtttatcgccgtgccgctgatagggccagatgcgcagactttcggtgtgctgacggcacaacccatggcgcgttacgaagagcgattacccgcctgcacccgctttctggaaacggtc 249 atggcactgaaacacctcatttccctgtgtgccgcgtcgccgatggttgccagtcagctggcgcgctacccgatcctgcttgatgaattgctcgacccgaatacgctctatcaaccgacggcgatgaatgcctatcgcgatgagctgcgccaatacctgctgcgcgtgccggaagatgatgaagagcaacagcttgaggcgctgcggcagtttaagcaggcgcagttgctgcgcgtggcggcggcggatattgccggtacgttgccagtaatgaaagtgagcgatcacttaacctggctggcggaagcgattattgatgcggtggtgcagcaagcctgggggcagatggtggcgcgttatggccagccaacgcatctgcacgatcgcgaagggcgcggttttgcggtggtcggttatggcaagctgggcggctgggagctgggttacagctccgatctggatctggtattcctgcacgactgcccgatggatgtgatgaccgatggcgagcgtgaaatcgatggtcgccagttctatttgcgtctcgcgcagcgcgtgatgcacctgtttagcacgcgcacgtcgtccggcatcctttatgaagttgatgcgcgtctgcgtccatctggcgctgcggggatgctggtcactactacggaatcgttcgccgattaccagcaaaacgaagcctggacgtgggaacatcaggcgctggcccgtgcgcgcgtggtgtacggcgatccgcaactgaccgccgaatttgacgccattcgccgcgatattctgatgacgcctcgcgacggcgcaacgctgcaaaccgacgtgcgagaaatgcgcgagaaaatgcgtgcccatcttggcaacaagcataaagaccgcttcgatctgaaagccgatgaaggcggtatcaccgacatcgagtttatcgcccaatatctggtgctgcgctttgcccatgacaagccgaaactgacgcgctggtcggataatgtgcgcattctcgaagggctggcgcaaaacggcatcatggaggagcaggaagcgcaggcattgacgctggcgtacaccacattgcgtgatgagctgcaccacctggcgctgcaagagttgccgggacatgtggcgctctcctgttttgtcgccgagcgtgcgcttattaaaaccagctgggacaagtggctggtggaa 250 gcgcaaagcgagtgctcacttacgtgatctgttgacacaatctgaagcgaccataacttctgccgtttcagcgaatacggcggtgtggagcgcacaatcagccctggcgaagctggtgctcaccgagtggctagtgacgcagggctggcgaaccttccttgatgaaaaagcgcaggccaaattcgccgactcctttaaacgctttgctgacatccatctgtcacgcagcgccgccgagctgaaaaaagcctttgcccaaccgctgggcgacagctatcgcgaccagttgccgcgcctggcgcgtgatatcgactgcgcgttactgctggccgggcattacgatcgcgcgcgcgccgtggaatggctggaaaactggcaggggcttcagcacgccattgaaacgcgccagagagtcgaaatcgaacatttccgtaataccgcgattacccaggagccgttctggttgcacagcggaaaacgttaacgaaaggatatttcgcatggcactgaaacacctcatttccctgtgtgccgcgtcgccgatggttgccagtcagctggcgcgctacccgatcctgcttgatgaattgctcgacccgaatacgctctatcaaccgacggcgatgaatgcctatcgcgatgagctgcgccaatacctgctgcgcgtgccggaagatgatgaagagcaacagcttgaggcgctgcggcagtttaagcaggcgcagttgctgcgcgtggcggcggcggatattgccggtacgttgccagtaatgaaagtgagcgatcacttaacctggctggcggaagcgattattgatgcggtggtgcagcaagcctgggggcagatggtggcgcgttatggccagccaacgcatctgcacgatcgcgaagggcgcggttttgcggtggtcggttatggcaagctgggcggctgggagctgggttacagctccgatctggatctggtattcctgcacgactgcccgatggatgtgatgaccgatggcgagcgtgaaatcgatggtcgccagttctatttgcgtctcgcgcagcgcgtgatgcacctgtttagcacgcgcacgtcgtccggcatcctttatgaagttgatgcgcgtctgcgtccatctggcgctgcggggatgctggtcactactacggaatcgttcgccgattaccagcaaaacgaagcctggacgtgggaacatcaggcgctggcccgtgcgcgcgtggtgtacggcgatccgcaactgaccgccgaatttgacgccattcgccgcgatattctgatgacgcctcgcgacggcgcaacgctgcaaaccgacgtgcgagaaatgcgcgagaaaatgcgtgcccatcttggcaacaagcataaagaccgcttcgatctgaaagccgatgaaggcggtatcaccgacatcgagtttatcgcccaatatctggtgctgcgctttgcccatgacaagccgaaactgacgcgctggtcggataatgtgcgcattctcgaagggctggcgcaaaacggcatcatggaggagcaggaagcgcaggcattgacgctggcgtacaccacattgcgtgatgagctgcaccacctggcgctgcaagagttgccgggacatgtggcgctctcctgttttgtcgccgagcgtgcgcttattaaaaccagctgggacaagtggctggtggaaccgtgcgccccggcgtaagtgtggtatcatcgcgcgcaaattttgtatctctcaggagacaggaatgaaagtgacgctgccagagtttaagcaagccggtgtaatggtggtgggtgatgtgatgctggatcgttactggtatggcccaaccagccgtatctctccggaagcgccagtcccggttgttaaagtcgataccattgaagagcgtcctggcggcgcggcaaacgtggcgatgaatatcgcctcactgggcgccacggcgcgtctggttggcctgactggcattgacgatgcggcgcgcgcgctgagcaaagcgctggccgatgttaacgttaaatgtgacttcgtttctgttccgacgcatcccaccatcactaagctgcgcgtgctgtcgcgtaaccagcagctgattcgcctggactttgaagagggttttgaaggagtcgatccgcaaccgatgcatgaacgcatcagccaggcgcttggtaatattggcgcgctggtgctgtcggatt 251 tttcgctgaaggtgtgaccatgggccatcaggtgctggtgcagctggaaagtgttgccatcactatcgtgtggtctggcgtggtggcctttattggttacaaactggcggacatgacggtaggcctgcgcgtaccggaagaacaagaacgtgaagggctggatgtaaacagccacggcgaaaacgcctataacgcctga 252 tttcctttctgactctgcccgtccgggcgcactaacggcctgaaatactccctcttttcattcctggcacaacgattgcaatgtctgttgcgtgttagctgcggccattatcgaattcgactggagggggatctatgaagctggttaccgtggtgattaagccattcaaacttgaagacgtgcgtgaagcgctttcttctattggtattcaagggttgaccgtaactgaagtgaaaggctttggccgtcagaagggtcacgctgagctgtaccgcggtgcggaatatagcgttaatttcctgccgaaagtgaaaattgatgtggcgatcgctgacgatcaactcgatgaagtaatcgatgtgatcagcaaagcggcctacaccggaaaaattggcgacggcaaaattttcgttgctgagctgcaacgcgtcattcgtattcgtaccggcgaagccgacgaagcggcactgtaatacaagacacacagtgatggggatcggtttcgctgaaggtgtgaccatgggccatcaggtgctggtgcagctggaaagtgttgccatcactatcgtgtggtctggcgtggtggcctttattggttacaaactggcggacatgacggtaggcctgcgcgtaccggaagaacaagaacgtgaagggctggatgtaaacagccacggcgaaaacgcctataacgcctgattgcgttgagttatctcctgagcataaaaaagcctccattcggaggcttttctttttttaagtttaaagcgcggttagttgcgattgcgcatgacgccttcctgcacgctggacgcgaccagcacaccctcttgcgtatagaactcgccgcgcacaaaaccgcgagcgctggaggctgacgtgctttccacactgtagagcagccattcgttcatattaaacgggcgatggaaccacatggagtggtcaatggtggcaacctgcataccgcgctcaaggaagcccacgccgtgcggctgaagtgcaaccggcaggaagttaaagtctgaggcatatccaagcagatattgatgtacgcgaaaatcgtccggcaccgtgccgtttgcgcggatccatacctggcgggtgggatcggcaacgtggcctttcagcgggttatgaaactcaaccgggcggatctccagtggtttatcactaagaaacttctctttggcctgcgg 253 atgtttaacgatctgattggcgatgatgaaacggattcgccggaagatgcgctttctgagagctggcgcgaattgtggcaggatgcgttgcaggaggaggattccacgcccgtgctggcgcatctctcagaggacgatcgccgccgcgtggtggcgctgattgccgattttcgcaaagagttggataaacgcaccattggcccgcgagggcggcaggtactcgatcacttaatgccgcatctgctcagcgatgtatgctcgcgcgacgatgcgccagtaccgctgtcacgcctgacgccgctgctcaccggaattattacccgcaccacttaccttgagctgctaagtgaatttcccggcgcactgaaacacctcatttccctgtgtgccgcgtcgccgatggttgccagtcagctggcgcgctacccgatcctgcttgatgaattgctcgacccgaatacgctctatcaaccgacggcgatgaatgcctatcgcgatgagctgcgccaatacctgctgcgcgtgccggaagatgatgaagagcaacagcttgaggcgctgcggcagtttaagcaggcgcagttgctgcgcgtggcggcggcggatattgccggtacgttgccagtaatgaaagtgagcgatcacttaacctggctggcggaagcgattattgatgcggtggtgcagcaagcctgggggcagatggtggcgcgttatggccagccaacgcatctgcacgatcgcgaagggcgcggttttgcggtggtcggttatggcaagctgggcggctgggagctgggttacagctccgatctggatctggtattcctgcacgactgcccgatggatgtgatgaccgatggcgagcgtgaaatcgatggtcgccagttctatttgcgtctcgcgcagcgcgtgatgcacctgtttagcacgcgcacgtcgtccggcatcctttatgaagttgatgcgcgtctgcgtccatctggcgctgcggggatgctggtcactactacggaatcgttcgccgattaccagcaaaacgaagcctggacgtgggaacatcaggcgctggcccgtgcgcgcgtggtgtacggcgatccgcaactgaccgccgaatttgacgccattcgccgcgatattctgatgacgcctcgcgacggcgcaacgctgcaaaccgacgtgcgagaaatgcgcgagaaaatgcgtgcccatcttggcaacaagcataaagaccgcttcgatctgaaagccgatgaaggcggtatcaccgacatcgagtttatcgcccaatatctggtgctgcgctttgcccatgacaagccgaaactgacgcgctggtcggataatgtgcgcattctcgaagggctggcgcaaaacggcatcatggaggagcaggaagcgcaggcattgacgctggcgtacaccacattgcgtgatgagctgcaccacctggcgctgcaagagttgccgggacatgtggcgctctcctgttttgtcgccgagcgtgcgcttattaaaaccagctgggacaagtggctggtggaaccgtgcgccccggcgtaa 254 gcgcaaagcgagtgctcacttacgtgatctgttgacacaatctgaagcgaccataacttctgccgtttcagcgaatacggcggtgtggagcgcacaatcagccctggcgaagctggtgctcaccgagtggctagtgacgcagggctggcgaaccttccttgatgaaaaagcgcaggccaaattcgccgactcctttaaacgctttgctgacatccatctgtcacgcagcgccgccgagctgaaaaaagcctttgcccaaccgctgggcgacagctatcgcgaccagttgccgcgcctggcgcgtgatatcgactgcgcgttactgctggccgggcattacgatcgcgcgcgcgccgtggaatggctggaaaactggcaggggcttcagcacgccattgaaacgcgccagagagtcgaaatcgaacatttccgtaataccgcgattacccaggagccgttctggttgcacagcggaaaacgttaacgaaaggatatttcgcatgtttaacgatctgattggcgatgatgaaacggattcgccggaagatgcgctttctgagagctggcgcgaattgtggcaggatgcgttgcaggaggaggattccacgcccgtgctggcgcatctctcagaggacgatcgccgccgcgtggtggcgctgattgccgattttcgcaaagagttggataaacgcaccattggcccgcgagggcggcaggtactcgatcacttaatgccgcatctgctcagcgatgtatgctcgcgcgacgatgcgccagtaccgctgtcacgcctgacgccgctgctcaccggaattattacccgcaccacttaccttgagctgctaagtgaatttcccggcgcactgaaacacctcatttccctgtgtgccgcgtcgccgatggttgccagtcagctggcgcgctacccgatcctgcttgatgaattgctcgacccgaatacgctctatcaaccgacggcgatgaatgcctatcgcgatgagctgcgccaatacctgctgcgcgtgccggaagatgatgaagagcaacagcttgaggcgctgcggcagtttaagcaggcgcagttgctgcgcgtggcggcggcggatattgccggtacgttgccagtaatgaaagtgagcgatcacttaacctggctggcggaagcgattattgatgcggtggtgcagcaagcctgggggcagatggtggcgcgttatggccagccaacgcatctgcacgatcgcgaagggcgcggttttgcggtggtcggttatggcaagctgggcggctgggagctgggttacagctccgatctggatctggtattcctgcacgactgcccgatggatgtgatgaccgatggcgagcgtgaaatcgatggtcgccagttctatttgcgtctcgcgcagcgcgtgatgcacctgtttagcacgcgcacgtcgtccggcatcctttatgaagttgatgcgcgtctgcgtccatctggcgctgcggggatgctggtcactactacggaatcgttcgccgattaccagcaaaacgaagcctggacgtgggaacatcaggcgctggcccgtgcgcgcgtggtgtacggcgatccgcaactgaccgccgaatttgacgccattcgccgcgatattctgatgacgcctcgcgacggcgcaacgctgcaaaccgacgtgcgagaaatgcgcgagaaaatgcgtgcccatcttggcaacaagcataaagaccgcttcgatctgaaagccgatgaaggcggtatcaccgacatcgagtttatcgcccaatatctggtgctgcgctttgcccatgacaagccgaaactgacgcgctggtcggataatgtgcgcattctcgaagggctggcgcaaaacggcatcatggaggagcaggaagcgcaggcattgacgctggcgtacaccacattgcgtgatgagctgcaccacctggcgctgcaagagttgccgggacatgtggcgctctcctgttttgtcgccgagcgtgcgcttattaaaaccagctgggacaagtggctggtggaaccgtgcgccccggcgtaagtgtggtatcatcgcgcgcaaattttgtatctctcaggagacaggaatgaaagtgacgctgccagagtttaagcaagccggtgtaatggtggtgggtgatgtgatgctggatcgttactggtatggcccaaccagccgtatctctccggaagcgccagtcccggttgttaaagtcgataccattgaagagcgtcctggcggcgcggcaaacgtggcgatgaatatcgcctcactgggcgccacggcgcgtctggttggcctgactggcattgacgatgcggcgcgcgcgctgagcaaagcgctggccgatgttaacgttaaatgtgacttcgtttctgttccgacgcatcccaccatcactaagctgcgcgtgctgtcgcgtaaccagcagctgattcgcctggactttgaagagggttttgaaggagtcgatccgcaaccgatgcatgaacgcatcagccaggcgcttggtaatattggcgcgctggtgctgtcggatt 255 atgaccctgaatatgatgatggatgccggccgtcctgtaataataaccggacaattcggactgattaaaaaagcgcccttgtggcgctttttttatattcccgcctccatttaaaataaaaaatccaatcggatttcactatttaaactggccattatctaagatgaatccgatggaagctcgctgttttaacacgcgttttttaaccttttattgaaagtcggtgcttctttgagcgaacgatcaaatttaagtggattcccatcaaaaaaatattctcaacctaaaaaagtttgtgtaatacttgtaacgctacatggagattaactcaatctagagggtattaataatgaatcgtactaaactggtactgggcgcaactcacttcacaccccgaagggggaagttgcctgaccctacgattcccgctatttcattcactgaccggaggttcaaaatga 256 accggatacgagagaaaagtgtctacatcggttcggttgatattgaccggcgcatccgccagcccgcccagtttctggtggatctgtttggcgattttgcgggtcttgccggtgtcggtgccgaaaaaaataccaatatttgccataacacacgctcctgttgaaaaagagatcccgccgggaaatgcggtgaacgtgtctgatattgcgaagagtgtgccagttttggtcgcgggcaaaacctgcaccagtttggttattaatgcaccagtctggcgctttttttcgccgagtttctcctcgctaatgcccgccaggcgcggctttggcgctgatagcgcgctgaataccgatctggatcaaggttttgtcgggttatcagccaaaaggtgcactctttgcatggttatacgtgcctgacatgttgtccgggcgacaaacggcctggtggcacaaattgtcagaactacgacacgactaactgaccgcaggagtgtgcgatgaccctgaatatgatgatggatgccggccgtcctgtaataataaccggacaattcggactgattaaaaaagcgcccttgtggcgctttttttatattcccgcctccatttaaaataaaaaatccaatcggatttcactatttaaactggccattatctaagatgaatccgatggaagctcgctgttttaacacgcgttttttaaccttttattgaaagtcggtgcttctttgagcgaacgatcaaatttaagtggattcccatcaaaaaaatattctcaacctaaaaaagtttgtgtaatacttgtaacgctacatggagattaactcaatctagagggtattaataatgaatcgtactaaactggtactgggcgcaactcacttcacaccccgaagggggaagttgcctgaccctacgattcccgctatttcattcactgaccggaggttcaaaatgacccagcgaaccgagtcgggtaataccgtctggcgcttcgatttgtcccagcagttcactgcgatgcagcgcataagcgtggtactcagccgggcgaccgaggtcgatcagacgctccagcaagtgctgtgcgtattgcacaatgacgcctttttgcagcacggcatgatctgtctgtacgacagccagcaggcgattttgaatattgaagcgttgcaggaagccgatcagcagttaatccccggcagctcgcaaatccgctatcgtccgggcgaagggctggtcgggacggtgctttcgcagggccaatcattagtgctggcgcgcgttgctgacgatcagcgctttcttgaccggctcgggttgtatgattacaacctgccgtttatcgccgtgccgctgatagggccagatgcgcagactttcggtgtgctgacggcacaacccatggcgcgttacgaagagcgattacccgcctgcacccgctttctggaaacggtc 257 tttcgctgaaggtgtgaccatgggccatcaggtgctggtgcagctggaaagtgttgccatcactatcgtgtggtctggcgtggtggcctttattggttacaaactggcggacatgacggtaggcctgcgcgtaccggaagaacaagaacgtgaagggctggatgtaaacagccacggcgaaaacgcctataacgcctga 258 tttcctttctgactctgcccgtccgggcgcactaacggcctgaaatactccctcttttcattcctggcacaacgattgcaatgtctgttgcgtgttagctgcggccattatcgaattcgactggagggggatctatgaagctggttaccgtggtgattaagccattcaaacttgaagacgtgcgtgaagcgctttcttctattggtattcaagggttgaccgtaactgaagtgaaaggctttggccgtcagaagggtcacgctgagctgtaccgcggtgcggaatatagcgttaatttcctgccgaaagtgaaaattgatgtggcgatcgctgacgatcaactcgatgaagtaatcgatgtgatcagcaaagcggcctacaccggaaaaattggcgacggcaaaattttcgttgctgagctgcaacgcgtcattcgtattcgtaccggcgaagccgacgaagcggcactgtaatacaagacacacagtgatggggatcggtttcgctgaaggtgtgaccatgggccatcaggtgctggtgcagctggaaagtgttgccatcactatcgtgtggtctggcgtggtggcctttattggttacaaactggcggacatgacggtaggcctgcgcgtaccggaagaacaagaacgtgaagggctggatgtaaacagccacggcgaaaacgcctataacgcctgattgcgttgagttatctcctgagcataaaaaagcctccattcggaggcttttctttttttaagtttaaagcgcggttagttgcgattgcgcatgacgccttcctgcacgctggacgcgaccagcacaccctcttgcgtatagaactcgccgcgcacaaaaccgcgagcgctggaggctgacgtgctttccacactgtagagcagccattcgttcatattaaacgggcgatggaaccacatggagtggtcaatggtggcaacctgcataccgcgctcaaggaagcccacgccgtgcggctgaagtgcaaccggcaggaagttaaagtctgaggcatatccaagcagatattgatgtacgcgaaaatcgtccggcaccgtgccgtttgcgcggatccatacctggcgggtgggatcggcaacgtggcctttcagcgggttatgaaactcaaccgggcggatctccagtggtttatcactaagaaacttctctttggcctgcgg 259 atgacctttaatatgatgcctggggtcactggagcgctttatcggcatcctgaccgaagaatttgccggtttcttcccgacctggctggcccctgttcaggttgtggtgatgaatatcactgattctcaagctgaatatgtcaacgaattgacccgtaaattgcaaaatgcgggcattcgtgtaaaagcggacttgagaaacgagaagattggctttaaaatccgcgagcacactttacgtcgtgtcccttatatgttggtctgtggtgataaagaggtggaagcaggcaaagtggccgttcgcacccgccgcggtaaagacctgggcagcctggacgtaagtgaagtgattgagaagctgcaacaagagattcgcagccgcagtcttcaacaactggaggaataaggtattaaaggcggaaaacgagttcaaacggcacgtccgaatcgtatcaatggcgagattcgcgcccaggaagttcgcttaactggtctggaaggtgagcagctgggtattgcaatagaactaactacccgccctgaaggcggtacctgcctgaccctgcgattcccgttatttcattcactgaccggaggcccacgatga 260 ggtacgacaaaaacgtctccagcgacgtgcggttaatattgactggcgcatccgccacatcccccagtttttgctggatcagtttggcgattttgcgggtttttcccgtgtcactgccaaaaaaaataccaatgttagccatgtcgcgctcctgttgagaaagaataaggccgcctgcaaacggcggatatcccttctcctgttgcgaaggctgtgccaggtttttttaaggccttctgtgcactgaaatgggtgaaaaaatgactcttttttgtgcaggcaccgtcctctctccgctatccagacctgctttgaaggcctctgagggccaaatcagggccaaaacacgaatcaggatcaatgtttcggcgcgttacctgttcgaaaggtgcactctttgcatggttaatcacacccaatcagggctgcggatgtcgggcgtttcacaacacaaaatgttgtaaatgcgacacagccgggcctgaaaccaggagcgtgtgatgacctttaatatgatgcctggggtcactggagcgctttatcggcatcctgaccgaagaatttgccggtttcttcccgacctggctggcccctgttcaggttgtggtgatgaatatcactgattctcaagctgaatatgtcaacgaattgacccgtaaattgcaaaatgcgggcattcgtgtaaaagcggacttgagaaacgagaagattggctttaaaatccgcgagcacactttacgtcgtgtcccttatatgttggtctgtggtgataaagaggtggaagcaggcaaagtggccgttcgcacccgccgcggtaaagacctgggcagcctggacgtaagtgaagtgattgagaagctgcaacaagagattcgcagccgcagtcttcaacaactggaggaataaggtattaaaggcggaaaacgagttcaaacggcacgtccgaatcgtatcaatggcgagattcgcgcccaggaagttcgcttaactggtctggaaggtgagcagctgggtattgcaatagaactaactacccgccctgaaggcggtacctgcctgaccctgcgattcccgttatttcattcactgaccggaggcccacgatgacccagcgacccgagtcgggcaccaccgtctggcgttttgatctctcacagcaatttaccgccatgcagcgcatcagcgtggtgttgagtcgcgcaaccgagataagccagacgctgcaggaggtgctgtgtgttctgcataatgacgcatttatgcaacacggcatgctgtgtctgtatgacaaccagcaggaaattctgagtattgaagccttgcaggaggcagaccaacatctgatccccggcagctcgcaaattcgctatcgccctggcgaagggctggtaggagccgtactgtcccagggacaatctcttgtgctgccgcgtgtcgccgacgatcaacgctttctcgacaggcttggcatctatgattacaacctgccgtttatcgccgtccccttaatggggccaggcgcgcagacgattggcgtgctcgccgcgcagccgatggcgcgtctggaggagcggcttccttcctgtacgcgctttctggaaaccgtc 261 ttgaagagtttgatcatggctcagattgaacgctggcggcaggcctaacacatgcaagtcgaacggtagcacagagagcttgctctcgggtgacgagtggcggacgggtgagtaatgtctgggaaactgcctgatggagggggataactactggaaacggtagctaataccgcataacgtcgcaagaccaaagagggggaccttcgggcctcttgccatcagatgtgcccagatgggattagctagtaggtggggtaacggctcacctaggcgacgatccctagctggtctgagaggatgaccagccacactggaactgagacacggtccagactcctacgggaggcagcagtggggaatattgcacaatgggcgcaagcctgatgcagccatgccgcgtgtgtgaagaaggccttcgggttgtaaagcactttcagcggggaggaagggagtaaggttaataaccttattcattgacgttacccgcagaagaagcaccggctaactccgtgccagcagccgcggtaatacggagggtgcaagcgttaatcggaattactgggcgtaaagcgcacgcaggcggtctgtcaagtcggatgtgaaatccccgggctcaacctgggaactgcatccgaaactggcaggcttgagtctcgtagagggaggtagaattccaggtgtagcggtgaaatgcgtagagatctggaggaataccggtggcgaaggcggcctcctggacgaagactgacgctcaggtgcgaaagcgtggggagcaaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacgatgtctatttggaggttgtgcccttgaggcgtggcttccggagctaacgcgttaaatagaccgcctggggagtacggccgcaaggttaaaactcaaatgaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgatgcaacgcgaagaaccttacctggtcttgacatccacagaactttccagagatggattggtgccttcgggaactgtgagacaggtgctgcatggctgtcgtcagctcgtgttgtgaaatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttatcctttgttgccagcggtccggccgggaactcaaaggagactgccagtgataaactggaggaaggtggggatgacgtcaagtcatcatggcccttacgaccagggctacacacgtgctacaatggcgcatacaaagagaagcgacctcgcgagagtaagcggacctcataaagtgcgtcgtagtccggattggagtctgcaactcgactccatgaagtcggaatcgctagtaatcgtggatcagaatgccacggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccatgggagtgggttgcaaaagaagtaggtagcttaaccttcgggagggcgcttaccactttgtgattcatgactggggtgaagtcgtaacaaggtaaccgtaggggaacctgcggttggatcacctcctt 262 ttgaagagtttgatcatggctcagattgaacgctggcggcaggcctaacacatgcaagtcgaacggtagcacagagagcttgctctcgggtgacgagtggcggacgggtgagtaatgtctgggaaactgcctgatggagggggataactactggaaacggtagctaataccgcataacgtcgcaagaccaaagagggggaccttcgggcctcttgccatcagatgtgcccagatgggattagctagtaggtggggtaacggctcacctaggcgacgatccctagctggtctgagaggatgaccagccacactggaactgagacacggtccagactcctacgggaggcagcagtggggaatattgcacaatgggcgcaagcctgatgcagccatgccgcgtgtgtgaagaaggccttcgggttgtaaagcactttcagcggggaggaaggnantanggttaataacctgtgttnattgacgttacccgcagaagaagcaccggctaactccgtgccagcagccgcggtaatacggagggtgcaagcgttaatcggaattactgggcgtaaagcgcacgcaggcggtctgtcaagtcggatgtgaaatccccgggctcaacctgggaactgcatccgaaactggcaggcttgagtctcgtagagggaggtagaattccaggtgtagcggtgaaatgcgtagagatctggaggaataccggtggcgaaggcggcctcctggacgaagactgacgctcaggtgcgaaagcgtggggagcaaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacgatgtctatttggaggttgtgcccttgaggcgtggcttccggagctaacgcgttaaatagaccgcctggggagtacggccgcaaggttaaaactcaaatgaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgatgcaacgcgaagaaccttacctggtcttgacatccacagaacttagcagagatgctttggtgccttcgggaactgtgagacaggtgctgcatggctgtcgtcagctcgtgttgtgaaatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttatcctttgttgccagcggttaggccgggaactcaaaggagactgccagtgataaactggaggaaggtggggatgacgtcaagtcatcatggcccttacgaccagggctacacacgtgctacaatggcgcatacaaagagaagcgacctcgcgagagtaagcggacctcataaagtgcgtcgtagtccggattggagtctgcaactcgactccatgaagtcggaatcgctagtaatcgtggatcagaatgccacggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccatgggagtgggttgcaaaagaagtaggtagcttaaccttcgggagggcgcttaccactttgtgattcatgactggggtgaagtcgtaacaaggtaaccgtaggggaacctgcggttggatcacctcctt 263 atgaccatgcgtcaatgcgccatttacggcaaaggtgggatcggcaaatcgaccaccacacagaacctggtcgccgcgctggcggagatgggtaaaaaagtcatgattgtcggctgtgacccgaaagccgattccacgcgtttgatcctgcatgcgaaagcgcagaacaccattatggagatggctgctgaagtcggctccgtggaagacctggagttagaagacgtgctgcaaatcggttacggcggcgtgcgctgcgcagagtccggcggcccggagccaggcgtgggctgtgccggtcgcggggtgatcaccgcgattaacttcctcgaagaagaaggcgcttacgtgccggatctcgattttgttttctacgacgtgctgggcgacgtggtatgcggtggtttcgccatgccgattcgtgaaaacaaagcgcaggagatctacatcgtttgctctggcgaaatgatggcgatgtacgccgccaacaacatctccaaaggcatcgtgaaatacgccaaatccggtaaagtgcgcctcggcgggctgatttgtaactcgcgccagaccgaccgtgaagatgaactgatcattgcgctggcagaaaaactcggcacgcagatgatccactttgttccccgcgacaacattgtgcagcgtgcggaaatccgccgtatgacggttatcgaatatgacccgacctgcaatcaggcgaacgaatatcgcagccttgccagcaaaatcgtcaacaacaccaaaatggtggtgcccaccccctgcaccatggatgaactggaagaactgctgatggagttcggcattatggatgtggaagacaccagcatcattggtaaaaccgccgccgaagaaaacgccgtctga 264 atgagcaatgcaacaggcgaacgcaacctggagataatcgagcaggtgctcgaggttttcccggagaagacgcgcaaagaacgcagaaaacacatgatggtgacggacccggagcaggaaagcgtcggtaagtgcatcatctctaaccgcaaatcgcagccaggcgtgatgaccgtgcgcggctgctcgtatgccggttcgaaaggggtggtatttgggccaatcaaggatatggcgcatatctcgcatggcccaatcggctgcggccaatactcccgcgccgggcggcggaactactacaccggcgtcagcggcgtggacagcttcggcacgctcaacttcacctccgattttcaggagcgcgacatcgtgtttggcggcgataaaaagctcgccaaactgattgaagagctggaagagctgttcccgctgaccaaaggcatttcgattcagtcggaatgcccggtcggcctgattggcgatgacattgaggccgtcgcgaacgccagccgcaaagccatcaacaaaccggttattccggtgcgttgcgaaggctttcgcggcgtgtcgcaatccctcggtcaccatattgccaacgatgtgatccgcgactgggtgctggataaccgcgaaggcaaaccgttcgaatccaccccttacgatgtggcgatcatcggcgattacaacatcggcggcgatgcctgggcttcgcgcattttgctcgaagagatgggcttgcgggtggtggcacagtggtctggcgacggtacgctggtggagatggaaaacacgccgttcgtcaaactgaacctggtgcattgttaccgctcaatgaactacatctcgcgccatatggaggagaagcacggtattccgtggatggaatacaacttctttggtccgacgaaaatcgcggaatcgctgcgcaaaatcgccgaccagtttgacgacaccattcgcgccaacgccgaagcggtgatcgccagataccaggcgcaaaacgacgccattatcgccaaatatcgcccgcgtctggaggggcgcaaagtgctgctttatatgggcgggctgcgtccgcgccatgtgattggcgcctatgaagacctgggaatggagatcatcgctgccggttatgagttcggtcataacgatgattacgaccgcaccttgccggatctgaaagagggcacgctgctgtttgatgatgccagcagttatgagctggaggcgttcgtcaacgcgctgaaaccggatctcatcggttccggcatcaaagagaagtacatctttcagaaaatgggcgtgccgtttcgccagatgcactcctgggattactccggcccgtaccacggctatgacggcttcgccatcttcgcccgcgatatggatatgacgctcaacaaccccgcgtggggccagttgaccgcgccgtggctgaaatccgcctga 265 atgagccagactgctgagaaaatacagaattgccatcccctgtttgaacaggatgcttaccagacgctgtttgccggtaaacgggcactcgaagaggcgcactcgccggagcgggtgcaggaagtgtttcaatggaccactaccccggaatatgaagcgctgaactttaaacgcgaagcgctgactatcgacccggcaaaagcctgccagccgctgggcgcggtgctctgttcgctggggtttgccaataccctaccgtatgtgcacggttcacagggttgcgtggcctatttccgcacgtactttaaccgccactttaaagaaccggtggcctgcgtgtcggattcaatgacggaagacgcggcggtgttcggcgggaataacaacctcaacaccggcttacaaaacgccagcgcgctgtataaaccggagattatcgccgtctctaccacctgtatggcggaagtgatcggtgatgatttgcaggcctttatcgccaacgccaaaaaagatggttttctcgatgccgccatccccgtgccctacgcgcacacccccagttttatcggcagccatatcaccggctgggataacatgtttgaaggttttgcccggacctttacggcagaccatgaagctcagcccggcaaactttcacgcatcaacctggtgaccgggtttgaaacctatctcggcaatttccgcgtgctgaaacgcatgatggaacaaatggaggtgccggcgagtgtgctctccgatccgtcggaagtgctggatactcccgccaacgggcattaccagatgtacgcgggcgggacgacgcagcaagagatgcgcgaggcgccggatgctatcgacaccctgttgctgcagccctggcaactggtgaaaagcaaaaaagtggtgcaggagatgtggaatcagcccgccaccgaggtttctgttcccgttgggctggcaggaacagacgaactgttgatggcgattagccagttaaccggcaaggccattcccgattcactggcgctggagcgcgggcggctggtcgatatgatgctcgattcccacacctggttgcacggtaaaaaattcggcctgtttggcgatccggattttgtcatgggattgacccgtttcctgctggagctgggctgcgaaccgaccgttatcctctgccacaacggtaacaaacgctggcagaaagcaatgaagaaaatgcttgacgcctcgccgtacggccaggagagcgaagtgtttatcaactgcgatttgtggcatttccgctcgctgatgtttacccgccagccggattttatgattggcaactcgtacggcaagttcattcagcgcgacaccttagccaaaggcgagcagtttgaagttccgctgatccgcctcggttttcccctgttcgaccgccaccatctgcaccgccagaccacctggggctacgagggcgccatgagcattctcactacccttgtgaatgcggtactggagaaagtggacaaagagaccatcaagctcggcaaaaccgactacagcttcgatcttatccgttaa 266 atgaccctgaatatgatgatggatgccggcgcgcccgaggcaatcgccggtgcgctttcgcgacaccatcctgggctgttttttaccatcgttgaagaagcgcccgtcgccatttcgctgactgatgccgacgcacgcattgtctatgccaacccggctttctgccgccagaccggctatgaactagaagcgttgttgcagcaaaatccccgcctgcttgcaagtcgccaaaccccacgggaaatctatcaggatatgtggcacaccttgttacaacgccgaccgtggcgcgggcaattgattaaccgccaccgcgacggcagcctgtatctggtcgagatcgatatcaccccggtgattaacccgtttggcgaactggaacactacctggcaatgcagcgcgatatcagcgccagttatgcgctggagcagcggttgcgcaatcacatgacgctgaccgaagcggtgctgaataacattccggcggcggtggttgtagtggatgaacgcgatcatgtggttatggataaccttgcctacaaaacgttctgtgccgactgcggcggaaaagagctcctgagcgaactcaatttttcagcccgaaaagcggagctggcaaacggccaggtcttaccggtggtgctgcgcggtgaggtgcgctggttgtcggtgacctgctgggcgctgccgggcgtcagcgaagaagccagtcgctactttattgataacaggctgacgcgcacgctggtggtgatcaccgacgacacccaacaacgccagcagcaggaacagggccgacttgaccgccttaaacagcagatgaccaacggcaaactactggcagcgatccgcgaagcgcttgacgccgcgctgatccagcttaactgccccatcaatatgctggcggcggcgcgacgtttaaacggcagtgataacaacaatgtggcgctcgacgccgcgtggcgcgaaggtgaagaggcgatggcgcggctgaaacgttgccgcccgtcgctggaactggaaagtgcggccgtctggccgctgcaacccttttttgacgatctgcgcgcgctttatcacacccgctacgagcaggggaaaaatttgcaggtcacgctggattcccatcatctggtgggatttggtcagcgtacgcaactgttagcctgcctgagtctgtggctcgatcgcacgctggatattgccgccgggctgggtgatttcaccgcgcaaacgcagatttacgcccgcgaagaagagggctggctctctttgtatatcactgacaatgtgccgctgatcccgctgcgccacacccactcgccggatgcgcttaacgctccgggaaaaggcatggagctgcgcctgatccagacgctggtggcacaccaccacggcgcaatagaactcacttcacaccccgaagggggaagttgcctgaccctacgattcccgctatttcattcactgaccggaggttcaaaatga 267 atgacccagcgaaccgagtcgggtaataccgtctggcgcttcgatttgtcccagcagttcactgcgatgcagcgcataagcgtggtactcagccgggcgaccgaggtcgatcagacgctccagcaagtgctgtgcgtattgcacaatgacgcctttttgcagcacggcatgatctgtctgtacgacagccagcaggcgattttgaatattgaagcgttgcaggaagccgatcagcagttaatccccggcagctcgcaaatccgctatcgtccgggcgaagggctggtcgggacggtgctttcgcagggccaatcattagtgctggcgcgcgttgctgacgatcagcgctttcttgaccggctcgggttgtatgattacaacctgccgtttatcgccgtgccgctgatagggccagatgcgcagactttcggtgtgctgacggcacaacccatggcgcgttacgaagagcgattacccgcctgcacccgctttctggaaacggtcgctaacctggtcgcgcaaaccgtgcgtttgatggcaccaccggcagtgcgcccttccccgcgcgccgccataacacaggccgccagcccgaaatcctgcacggcctcacgcgcatttggttttgaaaatatggtcggtaacagtccggcgatgcgccagaccatggagattatccgtcaggtttcgcgctgggacaccaccgttctggtacgcggcgagagtggcaccggcaaggagctgattgccaacgccatccaccaccattcgccgcgtgccggtgcgccatttgtgaaattcaactgtgcggcgctgccggacacactgctggaaagcgaattgttcggtcacgagaaaggggcatttaccggcgcggtacgccagcgtaaaggccgttttgagctggccgatggcggcacgctgtttcttgacgagatcggcgagagtagcgcctcgtttcaggctaagctgctgcgcattttgcaggaaggcgaaatggaacgcgtcggcggcgacgagacattgcaagtgaatgtgcgcattattgccgcgacgaaccgcaatcttgaagatgaagtccggctggggcactttcgcgaagatctctattatcgcctgaatgtgatgcccatcgccctgccgccactacgcgaacgccaggaggacattgccgagctggcgcactttctggtgcgtaaaatcgcccataaccagagccgtacgctgcgcattagcgagggcgctatccgcctgctgatgagctacaactggcccggtaatgtgcgcgaactggaaaactgccttgagcgctcagcggtgatgtcggagaacggtctgatcgatcgggatgtgattttgtttaatcatcgcgaccagccagccaaaccgccagttatcagcgtctcgcatgatgataactggctcgataacaaccttgacgagcgccagcggctgattgcggcgctggaaaaagcgggatgggtacaagccaaagccgcgcgcttgctggggatgacgccgcgccaggtcgcctatcgtattcagacgatggatataaccctgccaaggctataa 268 atgccgcaccacgcaggattgtcgcagcactggcaaacggtattttctcgtctgccggaatcgctcaccgcgcagccattgagcgcgcaggcgcagtcagtgctcacttttagtgattttgttcaggacagcatcatcgcgcatcctgagtggctggcagagcttgaaagcgcgccgccgcctgcgaacgaatggcaacactatgcgcaatggctgcaagcggcgctggatggcgtcaccgatgaagcctcgctgatgcgcgcgctgcggctgtttcgccgtcgcatcatggtgcgcatcgcctggagccaggcgttacagttggtggcggaagaagatatcctgcaacagcttagcgtgctggcggaaaccctgatcgtcgccgcgcgcgactggctttatgaggcctgctgccgtgagtggggaacgccgagcaatccacaaggcgtggcgcagccgatgctggtactcggcatgggcaaactgggtggcggcgaactcaatttctcatccgatatcgatttgattttcgcctggccggaaaatggcgcaacgcgcggtggacgccgtgagctggataacgcgcaatttttcactcgccttggtcaacggctgattaaagtcctcgaccagccaacgcaggatggctttgtctaccgcgtcgatatgcgcttgcgcccgtttggcgacagcggcccgctggtgctgagctttgccgcgctggaagattactaccaggagcaggggcgcgattgggaacgctacgcgatggtgaaagcgcgcattatgggcgataacgacggcgaccatgcgcgggagttgcgcgcaatgctgcgcccgtttgttttccgccgttatatcgacttcagcgtgattcagtccctgcgtaacatgaaaggcatgattgcccgcgaagtgcgtcgccgtggcctgaaggacaacattaagctcggcgcgggcgggatccgcgaaatagaatttatcgtccaggttttccagctgattcgcggcggtcgcgagcctgcactgcaatcgcgttcactgttgccgacgcttgctgccatagatcaactgcatctgctgccggatggcgacgcaacccggctgcgcgaggcgtatttgtggctgcgacggctggagaacctgctgcaaagcatcaatgacgaacagacacagacgctgccgggcgatgaactgaatcgcgcgcgcctcgcctggggaatgggcaaagatagctgggaagcgctctgcgaaacgctggaagcgcatatgtcggcggtgcgtcagatatttaacgatctgattggcgatgatgaaacggattcgccggaagatgcgctttctgagagctggcgcgaattgtggcaggatgcgttgcaggaggaggattccacgcccgtgctggcgcatctctcagaggacgatcgccgccgcgtggtggcgctgattgccgattttcgcaaagagttggataaacgcaccattggcccgcgagggcggcaggtactcgatcacttaatgccgcatctgctcagcgatgtatgctcgcgcgacgatgcgccagtaccgctgtcacgcctgacgccgctgctcaccggaattattacccgcaccacttaccttgagctgctaagtgaatttcccggcgcactgaaacacctcatttccctgtgtgccgcgtcgccgatggttgccagtcagctggcgcgctacccgatcctgcttgatgaattgctcgacccgaatacgctctatcaaccgacggcgatgaatgcctatcgcgatgagctgcgccaatacctgctgcgcgtgccggaagatgatgaagagcaacagcttgaggcgctgcggcagtttaagcaggcgcagttgctgcgcgtggcggcggcggatattgccggtacgttgccagtaatgaaagtgagcgatcacttaacctggctggcggaagcgattattgatgcggtggtgcagcaagcctgggggcagatggtggcgcgttatggccagccaacgcatctgcacgatcgcgaagggcgcggttttgcggtggtcggttatggcaagctgggcggctgggagctgggttacagctccgatctggatctggtattcctgcacgactgcccgatggatgtgatgaccgatggcgagcgtgaaatcgatggtcgccagttctatttgcgtctcgcgcagcgcgtgatgcacctgtttagcacgcgcacgtcgtccggcatcctttatgaagttgatgcgcgtctgcgtccatctggcgctgcggggatgctggtcactactacggaatcgttcgccgattaccagcaaaacgaagcctggacgtgggaacatcaggcgctggcccgtgcgcgcgtggtgtacggcgatccgcaactgaccgccgaatttgacgccattcgccgcgatattctgatgacgcctcgcgacggcgcaacgctgcaaaccgacgtgcgagaaatgcgcgagaaaatgcgtgcccatcttggcaacaagcataaagaccgcttcgatctgaaagccgatgaaggcggtatcaccgacatcgagtttatcgcccaatatctggtgctgcgctttgcccatgacaagccgaaactgacgcgctggtcggataatgtgcgcattctcgaagggctggcgcaaaacggcatcatggaggagcaggaagcgcaggcattgacgctggcgtacaccacattgcgtgatgagctgcaccacctggcgctgcaagagttgccgggacatgtggcgctctcctgttttgtcgccgagcgtgcgcttattaaaaccagctgggacaagtggctggtggaaccgtgcgccccggcgtaa 269 attgaagagtttgatcatggctcagattgaacgctggcggcaggcctaacacatgcaagtcgaacggtagcacagagagcttgctctcgggtgacgagtggcggacgggtgagtaatgtctgggaaactgcctgatggagggggataactactggaaacggtagctaataccgcataacgtcgcaagaccaaagagggggaccttcgggcctcttgccatcagatgtgcccagatgggattagctagtaggtggggtaacggctcacctaggcgacgatccctagctggtctgagaggatgaccagccacactggaactgagacacggtccagactcctacgggaggcagcagtggggaatattgcacaatgggcgcaagcctgatgcagccatgccgcgtgtgtgaagaaggccttcgggttgtaaagcactttcagcggggaggaagggagtaaggttaataaccttgctcattgacgttacccgcagaagaagcaccggctaactccgtgccagcagccgcggtaatacggagggtgcaagcgttaatcggaattactgggcgtaaagcgcacgcaggcggtctgtcaagtcggatgtgaaatccccgggctcaacctgggaactgcatccgaaactggcaggcttgagtctcgtagagggaggtagaattccaggtgtagcggtgaaatgcgtagagatctggaggaataccggtggcgaaggcggcctcctggacgaagactgacgctcaggtgcgaaagnnnnnnnnnnnaacaggattagataccctggtagtccatgccgtaaacgatgtctactagccgttggggcctttgaggctttagtggcgcagctaacgcgataagtagaccgcctggggagtacggtcgcaagactaaanctcaaatgaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgatgcaacgcgaagaaccttacctggccttgacatagtaagaattttccagagatggattggtgccttcgggaacttacatacaggtgctgcatggctgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttgtcattagttgctacatttagttgggcactctaatgagactgccggtgacaaaccggaggaaggtggggatgacgtcaagtcctcatggcccttataggtggggctacacacgtcatacaatggctggtacaaagggttgccaacccgcgagggggagctaatcccataaaaccagtcgtagtccggatcgcagtctgcaactcgactgcgtgaagtcggaatcgctagtaatcgtggatcagaatgtcacggtgaatacgttcccgggtcttgtacacaccgcccgtcacaccatgggagcgggttctgccagaagtagttagcttaaccgcaaggagggcgattaccacggcagggttcgtgactggggtgaagtcgtaacaaggtagccgtatcggaaggtgcggctggatcacctccttt 270 atgaccatgcgtcaatgcgccatttacggcaaaggtgggatcggcaaatcgaccaccacacagaacctggtcgccgcgctggcggagatgggtaaaaaagtcatgattgtcggctgtgacccgaaagccgattccacgcgtttgatcctgcatgcgaaagcgcagaacaccattatggagatggctgctgaagtcggctccgtggaagacctggagttagaagacgtgctgcaaatcggttacggcggcgtgcgctgcgcagagtccggcggcccggagccaggcgtgggctgtgccggtcgcggggtgatcaccgcgattaacttcctcgaagaagaaggcgcttacgtgccggatctcgattttgttttctacgacgtgctgggcgacgtggtatgcggtggtttcgccatgccgattcgtgaaaacaaagcgcaggagatctacatcgtttgctctggcgaaatgatggcgatgtacgccgccaacaacatctccaaaggcatcgtgaaatacgccaaatccggtaaagtgcgcctcggcgggctgatttgtaactcgcgccagaccgaccgtgaagatgaactgatcattgcgctggcagaaaaactcggcacgcagatgatccactttgttccccgcgacaacattgtgcagcgtgcggaaatccgccgtatgacggttatcgaatatgacccgacctgcaatcaggcgaacgaatatcgcagccttgccagcaaaatcgtcaacaacaccaaaatggtggtgcccaccccctgcaccatggatgaactggaagaactgctgatggagttcggcattatggatgtggaagacaccagcatcattggtaaaaccgccgccgaagaaaacgccgtctga 271 atggccgaaattctgcgcagtaaaaaaccgctggcggtcagcccgataaaaagcggccagccgctgggggcgatcctcgcaagcctgggtgtcgaacagtgcataccgctggtacacggcgcacagggatgtagcgcgttcgcgaaggtgttctttattcaacattttcacgatccgatcccgctgcaatcgacggcgatggatccgacttccaccattatgggcgccgatgaaaacatttttaccgcgctcaatgtgctctgccagcgcaacgccgcgaaagccattgtgctgctcagcaccgggctttcagaagcccagggcagcgacatttcgcgggtggtgcgccagtttcgtgatgattttccccggcataaaggcgttgcgctgctcaccgtcaacacacccgatttctacggctcgctggaaaacggctacagcgccgtgctggaaagcatgattgaacagtgggtacccgcacagcccgccgccagcctgcgcaaccgccgtgtcaacctgctggtcagccatttactgacaccaggcgatatcgaactgttgcgcagttatgttgaagccttcggcctgcaaccggtgattgtgccggatctgtcgctgtcgctggacgggcatctggcagacggtgatttttcgcctgttacccaagggggaacatcgctgcgcatgattgaacagatggggcaaaacctggccacctttgtgattggcgcctcgctgggccgtgcggcggcgttactggcgcagcgcagccgtggcgaggtgatcgccctgccgcatctgatgacgcttgcagcctgcgacacgtttattcatcgactgaaaaccctctccgggcgcgatgtccccgcgtggattgagcgccagcgcggccaagttcaggatgcgatgatcgattgccatatgtggctgcagggtgcggctatcgccatggcagcagaaggcgatcacctggcggcatggtgcgatttcgcccgcagccagggcatgatccccggcccgattgtcgcaccggtcagccagccggggttgcaaaatctgccggttgaaaccgtggttatcggcgatctggaagatatgcaggatcggctttgcgcgacgcccgccgcgttactggtggccaattctcatgccgccgatctcgccacgcagtttgatttgtcacttatccgcgccgggttcccggtgtatgaccggctgggggaatttcgtcgcctgcgccaggggtacagcggcattcgtgacacgctgtttgagctggcgaatgtgatgcgcgagcgccatcacccgcttgcaacctaccgctcgccgctgcgccagcacgccgacgacaacgttacgcctggagatctgtatgccgcatgttaa 272 atgaaaaacacaacattaaaaacagcgcttgcttcgctggcgttactgcctggcctggcgatggcggctcccgctgtggcggataaagccgacaacggctttatgatgatttgcaccgcgctggtgctgtttatgaccattccgggcattgcgctgttctacggcggtttgatccgcggtaaaaacgtgctgtcgatgctgacgcaggttgccgtcaccttcgcactggtgtgcattctgtgggtggtgtatggctactcgctggcatttggcgagggcaacagcttcttcgggagttttaactgggcgatgttgaaaaacatcgaactgaaagccgtgatgggcagcatttatcagtatatccacgtggcgttccagggttccttcgcctgtatcaccgttggcctgattgtcggtgcactggctgagcgtattcgcttctctgcggtgctgatttttgtggtggtatggctgacgctttcttacgtgccgattgcacacatggtgtggggcggcggtctgctggcaacccacggtgcgctggatttcgcaggcggtacggttgttcacatcaacgctgcgattgcaggtctggtgggggcttacctgattggcaaacgcgtgggctttggcaaagaagcattcaaaccgcataacctgccgatggtcttcactggcaccgctatcctgtatgttggctggtttggtttcaacgccggctccgcaagctcggcgaacgaaattgctgcgctggccttcgtgaacactgtcgttgccactgctgccgctattctggcgtgggtatttggcgaatgggcaatgcgcggcaagccgtctctgctcggtgcctgttctggtgccatcgcgggtctggttggtatcacccccgcctgtggttatgtgggtgtcggcggtgcgctgattgtgggtctgattgccggtctggctgggctgtggggcgttactgcgctgaaacgtatgttgcgtgtcgatgacccgtgtgacgtattcggtgtgcacggcgtgtgcggcatcgtgggctgtatcctgacgggtatcttcgcctctacgtcgctgggtggtgtcggtttcgctgaaggtgtgaccatgggccatcaggtgctggtgcagctggaaagtgttgccatcactatcgtgtggtctggcgtggtggcctttattggttacaaactggcggacatgacggtaggcctgcgcgtaccggaagaacaagaacgtgaagggctggatgtaaacagccacggcgaaaacgcctataacgcctga 273 cgtcctgtaataataaccggacaattcggactgattaaaaaagcgcccttgtggcgctttttttatattcccgcctccatttaaaataaaaaatccaatcggatttcactatttaaactggccattatctaagatgaatccgatggaagctcgctgttttaacacgcgttttttaaccttttattgaaagtcggtgcttctttgagcgaacgatcaaatttaagtggattcccatcaaaaaaatattctcaacctaaaaaagtttgtgtaatacttgtaacgctacatggagattaactcaatctagagggtattaataatgaatcgtactaaactggtactgggcgc 274 ggacatcatcgcgacaaacaatattaataccggcaaccacaccggcaatttacgagactgcgcaggcatcctttctcccgtcaatttctgtcaaataaagtaaaagaggcagtctacttgaattacccccggctggttgagcgtttgttgaaaaaaagtaactgaaaaatccgtagaatagcgccactctgatggttaattaacctattcaattaagaattatctggatgaatgtgccattaaatgcgcagcataatggtgcgttgtgcgggaaaactgcttttttttgaaagggttggtcagtagcggaaac 275 atgaccctgaatatgatgctcgataacgccgcgccggaggccatcgccggcgcgctgactcaacaacatccggggctgttttttaccatggtggaacaggcctcggtggccatctccctcaccgatgccagcgccaggatcatttacgccaacccggcgttttgccgccagaccggctattcgctggcgcaattgttaaaccagaacccgcgcctgctggccagcagccagacgccgcgcgagatctatcaggagatgtggcataccctgctccagcgtcagccctggcgcggtcagctgattaatcagcgtcgggacggcggcctgtacctggtggagattgacatcaccccggtgcttagcccgcaaggggaactggagcattatctggcgatgcagcgggatatcagcgtcagctacaccctcgaacagcggctgcgcaaccatatgaccctgatggaggcggtgctgaataatatccccgccgccgtggtagtggtggacgagcaggatcgggtggtgatggacaacctcgcctacaaaaccttctgcgctgactgcggcggccgggagctgctcaccgagctgcaggtctcccctggccggatgacgcccggcgtggaggcgatcctgccggtggcgctgcgcggggccgcgcgctggctgtcggtaacctgctggccgttgcccggcgtcagtgaagaggccagccgctactttatcgacagcgcgctggcgcggaccctggtggtgatcgccgactgtacccagcagcgtcagcagcaggagcaagggcgccttgaccggctgaagcagcaaatgaccgccggcaagctgctggcggcgatccgcgagtcgctggacgccgcgctgatccagctgaactgcccgattaatatgctggcggcagcccgtcggctgaacggcgagggaagcgggaatgtggcgctggaggccgcctggcgtgaaggggaagaggcgatggcgcggctccagcgctgtcgcccatcgctggaactcgaaaaccccgccgtctggccgctgcagccctttttcgacgatctgtgcgccctctaccgtacacgcttcgatcccgacgggctgcaggtcgacatggcctcaccgcatctgatcggctttggccagcgcaccccactgctggcgtgcttaagcctgtggctcgatcgcaccctggccctcgccgccgaactcccctccgtgccgctggcgatgcagctctacgccgaggagaacgacggctggctgtcgctgtatctgactgacaacgtaccgctgctgcaggtgcgctacgctcactcccccgacgcgctgaactcgccgggcaaaggcatggagctgcggctgatccagaccctggtggcgcaccatcgcggggccattgagctggcttcccgaccgcagggcggcacctgcctgaccctgcgtttcccgctgtttaacaccctgaccggaggtgaagcatga 276 atgatccctgaatccgacccggacaccaccgtcagacgcttcgacctctctcagcagttcaccgccatgcagcggataagcgtggtgctgagccgggccaccgaggccagcaaaacgctgcaggaggtgctcagcgtattacacaacgatgcctttatgcagcacgggatgatctgcctgtacgacagcgagcaggagatcctcagtatcgaagcgctgcagcaaaccggccagcagcccctccccggcagcacgcagatccgctatcgccccggcgagggactggtggggaccgtgctggcccaggggcagtcgctggtgctgccccgggtcgccgacgatcagcgttttctcgaccgcctgagcctctacgattacgatctgccgtttatcgccgtaccgttgatggggcccaacgcccggccaataggggtgctggcggcccagccgatggcgcgccaggaagagcggctgccggcctgcacccgttttctcgaaaccgtcgccaacctcgtcgcccagaccatccggctgatgatccttccggcctcacccgccctgtcgagccgccagccgccgaaggtggaacggccgccggcctgctcgtcgtcgcgcggcgtgggccttgacaatatggtcggcaagagcccggcgatgcgccagatcgtggaggtgatccgtcaggtttcgcgctgggacaccaccgtgctggtacgcggcgaaagcggcaccgggaaagagctgatcgccaacgccatccatcaccattcgccacgggctggcgccgccttcgtcaaatttaactgcgcggcgctgccggacaccctgctggaaagcgaactgttcggccatgagaaaggcgcctttaccggggcggtgcgtcagcgtaaaggacgttttgagctggcggatggcggcaccctgttcctcgatgagattggtgaaagcagcgcctcgttccaggccaagctgctgcgtatcctccaggagggggagatggagcgggtcggcggcgatgagaccctgcgggtgaatgtccgcatcatcgccgccaccaaccgtcacctggaggaggaggtccggctgggccatttccgcgaggatctctactatcgtctgaacgtgatgcccatcgccctgcccccgctgcgcgagcgtcaggaggacatcgccgagctggcgcacttcctggtgcgcaaaatcggccagcatcaggggcgcacgctgcggatcagcgagggcgcgatccgcctgctgatggagtacagctggccgggtaacgttcgcgaactggagaactgcctcgaacgatcggcggtgatgtcggagagtggcctgatcgatcgcgacgtgatcctcttcactcaccaggatcgtcccgccaaagccctgcctgccagcgggccagcggaagacagctggctggacaacagcctggacgaacgtcagcgactgatcgccgcgctggaaaaagccggctgggtgcaggccaaggcggcacggctgctggggatgacgccgcgccaggtcgcttatcggatccagatcatggatatcaccctgccgcgtctgtag 277 attgaagagtttgatcatggctcagattgaacgctggcggcaggcctaacacatgcaagtcgagcggcagcgggaagtagcttgctactttgccggcgagcggcggacgggtgagtaatgtctgggaaactgcctgatggagggggataactactggaaacggtagctaataccgcatgacctcgaaagagcaaagtgggggatcttcggacctcacgccatcggatgtgcccagatgggattagctagtaggtgaggtaatggctcacctaggcgacgatccctagctggtctgagaggatgaccagccacactggaactgagacacggtccagactcctacgggaggcagcagtggggaatattgcacaatgggcgcaagcctgatgcagccatgccgcgtgtgtgaagaaggccttagggttgtaaagcactttcagcgaggaggaaggcatcatacttaatacgtgtggtgattgacgttactcgcagaagaagcaccggctaactccgtgccagcagccgcggtaatacggagggtgcaagcgttaatcggaattactgggcgtaaagcgcacgcaggcggtttgttaagtcagatgtgaaatccccgagcttaacttgggaactgcatttgaaactggcaagctagagtcttgtagaggggggtagaattccaggtgtagcggtgaaatgcgtagagatctggaggaataccggtggcgaaggcggccccctggacaaagactgacgctcaggtgcgaaagcgtggggagcaaacaggattagataccctggtagtccacgctgtaaacgatgtcgacttggaggttgtgcccttgaggcgtggcttccggagctaacgcgttaagtcgaccgcctggggagtacggccgcaaggttaaaactcaaatgaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgatgcaacgcgaagaaccttacctactcttgacatccagagaatttgccagagatggcgaagtgccttcgggaactctgagacaggtgctgcatggctgtcgtcagctcgtgttgtgaaatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttatcctttgttgccagcacgtaatggtgggaactcaaaggagactgccggtgataaaccggaggaaggtggggatgacgtcaagtcatcatggcccttacgagtagggctacacacgtgctacaatggcatatacaaagagaagcgaactcgcgagagcaagcggacctcataaagtatgtcgtagtccggattggagtctgcaactcgactccatgaagtcggaatcgctagtaatcgtagatcagaatgctacggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccatgggagtgggttgcaaaagaagtaggtagcttaaccttcgggagggcgcttaccactttgtgattcatgactggggtgaagtcgtaacaaggtaaccgtaggggaacctgcggttggatcacctcctt 278 attgaagagtttgatcatggctcagattgaacgctggcggcaggcctaacacatgcaagtcgagcggcatcgggaagtagcttgctactttgccggcgagcggcggacgggtgagtaatgtctgggaaactgcctgatggagggggataactactggaaacggtagctaataccgcatgacctcgaaagagcaaagtgggggatcttcggacctcacgccatcggatgtgcccagatgggattagctagtaggtgaggtaatggctnacctaggcgacgatccctagctggtctgagaggatgaccagccacactggaactgagacacggtccagactcctacgggaggcagcagtggggaatattgcacaatgggcgcaagcctgatgcagccatgccgcgtgtgtgaagaaggccttagggttgtaaagcactttcagcgaggaggaaggcatcatacttaatacgtgtggtgattgacgttactcgcagaagaagcaccggctaactccgtgccagcagccgcggtaatacggagggtgcaagcgttaatcggaattactgggcgtaaagcgcacgcaggcggtttgttaagtcagatgtgaaatccccgagcttaacttgggaactgcatttgaaactggcaagctagagtcttgtagaggggggtagaattccaggtgtagcggtgaaatgcgtagagatctggaggaataccggtggcgaaggcggccccctggacaaagactgacgctcaggtgcgaaagcgtggggagcaaacaggattagataccctggtagtccacgctgtaaacgatgtcgacttggaggttgtgcccttgaggcgtggcttccggagctaacgcgttaagtcgaccgcctggggagtacggccgcaaggttaaaactcaaatgaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgatgcaacgcgaagaaccttacctactcttgacatccagagaatttgccagagatggcgaagtgccttcgggaactctgagacaggtgctgcatggctgtcgtcagctcgtgttgtgaaatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttatcctttgttgccagcacgtgatggtgggaactcaaaggagactgccggtgataaaccggaggaaggtggggatgacgtcaagtcatcatggcccttacgagtagggctacacacgtgctacaatggcatatacaaagagaagcgaactcgcgagagcaagcggacctcataaagtatgtcgtagtccggattggagtctgcaactcgactccatgaagtcggaatcgctagtaatcgtagatcagaatgctacggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccatgggagtgggttgcaaaagaagtaggtagcttaaccttcgggagggcgcttaccactttgtgattcatgactggggtgaagtcgtaacaaggtaaccgtaggggaacctgcggttggatcacctcctt 279 attgaagagtttgatcatggctcagattgaacgctggcggcaggcctaacacatgcaagtcgagcggcagcgggaagtagcttgctactttgccggcgagcggcggacgggtgagtaatgtctgggaaactgcctgatggagggggataactactggaaacggtagctaataccgcatgacctcgaaagagcaaagtgggggatcttcggacctcacgccatcggatgtgcccagatgggattagctagtaggtgaggtaatggctcacctaggcgacgatccctagctggtctgagaggatgaccagccacactggaactgagacacggtccagactcctacgggaggcagcagtggggaatattgcacaatgggcgcaagcctgatgcagccatgccgcgtgtgtgaagaaggccttagggttgtaaagcactttcagcgaggaggaaggcancatacttaatacgtgtggtgattgacgttactcgcagaagaagcaccggctaactccgtgccagcagccgcggtaatacggagggtgcaagcgttaatcggaattactgggcgtaaagcgcacgcaggcggtttgttaagtcagatgtgaaatccccgagcttaacttgggaactgcatttgaaactggcaagctagagtcttgtagaggggggtagaattccaggtgtagcggtgaaatgcgtagagatctggaggaataccggtggcgaaggcggccccctggacaaagactgacgctcaggtgcgaaagcgtggggagcaaacaggattagataccctggtagtccacgctgtaaacgatgtcgacttggaggttgtgcccttgaggcgtggcttccggagctaacgcgttaagtcgaccgcctggggagtacggccgcaaggttaaaactcaaatgaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgatgcaacgcgaagaaccttacctactcttgacatccagagaatttgccagagatggcgaagtgccttcgggaactctgagacaggtgctgcatggctgtcgtcagctcgtgttgtgaaatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttatcctttgttgccagcacgtgatggtgggaactcaaaggagactgccggtgataaaccggaggaaggtggggatgacgtcaagtcatcatggcccttacgagtagggctacacacgtgctacaatggcatatacaaagagaagcgaactcgcgagagcaagcggacctcataaagtatgtcgtagtccggattggagtctgcaactcgactccatgaagtcggaatcgctagtaatcgtagatcagaatgctacggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccatgggagtgggttgcaaaagaagtaggtagcttaaccttcgggagggcgcttaccactttgtgattcatgactggggtgaagtcgtaacaaggtaaccgtaggggaacctgcggttggatcacctcctt 280 attgaagagtttgatcatggctcagattgaacgctggcggcaggcctaacacatgcaagtcgagcggcancgggaagtagcttgctactttgccggcgagcggcggacgggtgagtaatgtctgggaaactgcctgatggagggggataactactggaaacggtagctaataccgcatgacctcgaaagagcaaagtgggggatcttcggacctcacgccatcggatgtgcccagatgggattagctagtaggtgaggtaatggcttacctaggcgacgatccctagctggtctgagaggatgaccagccacactggaactgagacacggtccagactcctacgggaggcagcagtggggaatattgcacaatgggcgcaagcctgatgcagccatgccgcgtgtgtgaagaaggccttagggttgtaaagcactttcagcgaggaggaaggcatcacacttaatacgtgtggtgattgacgttactcgcagaagaagcaccggctaactccgtgccagcagccgcggtaatacggagggtgcaagcgttaatcggaattactgggcgtaaagcgcacgcaggcggtttgttaagtcagatgtgaaatccccgagcttaacttgggaactgcatttgaaactggcaagctagagtcttgtagaggggggtagaattccaggtgtagcggtgaaatgcgtagagatctggaggaataccggtggcgaaggcggccccctggacaaagactgacgctcaggtgcgaaagcgtggggagcaaacaggattagataccctggtagtccacgctgtaaacgatgtcgacttggaggttgtgcccttgaggcgtggcttccggagctaacgcgttaagtcgaccgcctggggagtacggccgcaaggttaaaactcaaatgaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgatgcaacgcgaagaaccttacctactcttgacatccagagaatttgccagagatggcgaagtgccttcgggaactctgagacaggtgctgcatggctgtcgtcagctcgtgttgtgaaatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttatcctttgttgccagcacgtgatggtgggaactcaaaggagactgccggtgataaaccggaggaaggtggggatgacgtcaagtcatcatggcccttacgagtagggctacacacgtgctacaatggcatatacaaagagaagcgaactcgcgagagcaagcggacctcataaagtatgtcgtagtccggattggagtctgcaactcgactccatgaagtcggaatcgctagtaatcgtagatcagaatgctacggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccatgggagtgggttgcaaaagaagtaggtagcttaaccttcgggagggcgcttaccactttgtgattcatgactggggtgaagtcgtaacaaggtaaccgtaggggaacctgcggttggatcacctcctt 281 attgaagagtttgatcatggctcagattgaacgctggcggcaggcctaacacatgcaagtcgagcggcagcgggaagtagcttgctactttgccggcgagcggcggacgggtgagtaatgtctgggaaactgcctgatggagggggataactactggaaacggtagctaataccgcatgacctcgaaagagcaaagtgggggatcttcggacctcacgccatcggatgtgcccagatgggattagctagtaggtgaggtaatggctcacctaggcgacgatccctagctggtctgagaggatgaccagccacactggaactgagacacggtccagactcctacgggaggcagcagtggggaatattgcacaatgggcgcaagcctgatgcagccatgccgcgtgtgtgaagaaggccttagggttgtaaagcactttcagcgaggaggaaggcatcacacttaatacgtgtgttgattgacgttactcgcagaagaagcaccggctaactccgtgccagcagccgcggtaatacggagggtgcaagcgttaatcggaattactgggcgtaaagcgcacgcaggcggtttgttaagtcagatgtgaaatccccgagcttaacttgggaactgcatttgaaactggcaagctagagtcttgtagaggggggtagaattccaggtgtagcggtgaaatgcgtagagatctggaggaataccggtggcgaaggcggccccctggacaaagactgacgctcaggtgcgaaagcgtggggagcaaacaggattagataccctggtagtccacgctgtaaacgatgtcgacttggaggttgtgcccttgaggcgtggcttccggagctaacgcgttaagtcgaccgcctggggagtacggccgcaaggttaaaactcaaatgaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgatgcaacgcgaagaaccttacctactcttgacatccagagaatttgccagagatggcgaagtgccttcgggaactctgagacaggtgctgcatggctgtcgtcagctcgtgttgtgaaatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttatcctttgttgccagcacgtgatggtgggaactcaaaggagactgccggtgataaaccggaggaaggtggggatgacgtcaagtcatcatggcccttacgagtagggctacacacgtgctacaatggcatatacaaagagaagcgaactcgcgagagcaagcggacctcataaagtatgtcgtagtccggattggagtctgcaactcgactccatgaagtcggaatcgctagtaatcgtagatcagaatgctacggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccatgggagtgggttgcaaaagaagtaggtagcttaaccttcgggagggcgcttaccactttgtgattcatgactggggtgaagtcgtaacaaggtaaccgtaggggaacctgcggttggatcacctcctt 282 gtagctaataccgcatgacctcgaaagagcaaagtgggggatcttcggacctcacgccatcggatgtgcccagatgggattagctagtaggtgaggtaatggctcacctaggcgacgatccctagctggtctgagaggatgaccagccacactggaactgagacacggtccagactcctacgggaggcagcagtggggaatattgcacaatgggcgcaagcctgatgcagccatgccgcgtgtgtgaagaaggccttagggttgtaaagcactttcagcgaggaggaaggcatcanacttaatacgtgtgntgattgacgttactcgcagaagaagcaccggctaactccgtgccagcagccgcggtaatacggagggtgcaagcgttaatcggaattactgggcgtaaagcgcacgcaggcggtttgttaagtcagatgtgaaatccccgagcttaacttgggaactgcatttgaaactggcaagctagagtcttgtagaggggggtagaattccaggtgtagcggtgaaatgcgtagagatctggaggaataccggtggcgaaggcggccccctggacaaagactgacgctcaggtgcgaaagcgtggggagcaaacaggattagataccctggtagtccacgctgtaaacgatgtcgacttggaggttgtgcccttgaggcgtggcttccggagctaacgcgttaagtcgaccgcctggggagtacggccgcaaggttaaaactcaaatgaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgatgcaacgcgaagaaccttacctactcttgacatccagagaatttgccagagatggcgaagtgccttcgggaactctgagacaggtgctgcatggctgtcgtcagctcgtgttgtgaaatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttatcctttgttgccagcacgtnatggtgggaactcaaaggagactgccggtgataaac 283 attgaagagtttgatcatggctcagattgaacgctggcggcaggcctaacacatgcaagtcgagcggcagcgggaagtagcttgctactttgccggcgagcggcggacgggtgagtaatgtcctgatggaggggataactactggaacggtagctaataccgcacctcgaaagagcaaagtgggggatcttcggacctcacgccatcggatgtgcccagatgggattagctagtaggtgaggtaatggctcacctaggcgacgatccctagctggtctgagaggatgaccagccacactggaactgagacacggtccagactcctacgggaggcagcagtggggaatattgcacaatgggcgcaagcctgatgcagccatgccgcgtgtgtgaagaaggccttagggttgtaaagcactttcagcgaggaggaaggcatcatacttaatacgtgtggtgattgacgttactcgcagaagaagcaccggctaactccgtgccagcagccgcggtaatacggagggtgcaagcttaatcggaattactgggcgtaaagcgcacgcaggcggttgttaagtcagatgtgaaatccccgagcttaacttgggaactgcatttgaaactggcaagctagagtcttgtagaggggggtagaattccaggtgtagcggtgaaatgcgtagagatctggaggaataccggtggcgaaggcggccccctggacaaagactgacgctcaggtgcgaaagcgtggggagcaaacaggattaataccctggtagtccacgctgtaacgatgtcgacttggaggttgtgccctgaggcgtggcttccggagctaacgcgttaagtcgaccgcctggggagtacggccgcaaggttaaaactcaaatgaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgatgcaacgcgaagaaccttacctactcttgacatccagagaatttgccagagatggcgaagtgccttcgggaactctgagacaggtgctgcatggctgtcgtcagctcgtgttgtgaaatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttatcctttgttgccagcacgtaatggtgggaactcaaaggagactgccggtgataaaccggaggaaggtggggatgacgtcaagtcatcatggcccttacgagtagggctacacacgtgctacaatggcatatacaaagagaagcgaactcgcgagagcaagcggacctcataaagtatgtcgtagtccggattggagtctgcaactcgactccatgaagtcggaatcgctagtaatcgtagatcagaatgctacggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccatgggagtgggttgcaaaagaagtaggtagcttaaccttcgggagggcgcttaccactttgtgattcatgactggggtgaagtcgtaacaaggtaaccgtaggggaacctgcggttggatcacctcctt 284 atgaccatgcgtcaatgcgctatctacggtaaaggcggtatcggtaaatccaccaccacccagaatctcgtcgcggccctcgccgagatgggtaagaaagtgatgatcgtcggctgcgatccgaaagcggattccacccgtctgatcctccacgctaaagcccagaacaccatcatggagatggcggcggaagtgggctcggtcgaggatctggagctcgaagacgttctgcaaatcggctatggcgatgtccgttgcgccgaatccggcggcccggagccaggcgtcggctgcgccggacgcggggtgatcaccgccatcaacttcctcgaggaagaaggcgcctatgaagaagatttggatttcgtcttctatgacgtcctcggcgacgtggtctgcggcggcttcgctatgccgatccgcgaaaacaaagcccaggagatctacatcgtctgctccggcgagatgatggcgatgtatgccgccaacaatatctccaaagggatcgtgaagtacgccaaatccggcaaggtgcgcctcggcggcctgatctgtaactcgcgcaaaaccgaccgggaagacgaactgatcatcgccctggcggagaagcttggcacgcagatgatccacttcgttccccgcgacaacattgtgcagcgcgcggagatccgccggatgacggtgatcgagtacgacccgacctgtcagcaggcgaatgaatatcgtcaactggcgcagaagatcgtcaataacaccaaaaaagtggtgccgacgccgtgcaccatggacgagctggaatcgctgctgatggagttcggcatcatggaagaagaagacaccagcatcattggtaaaaccgccgctgaagaaaacgcggcctga 285 atggttaggaaaagtagaagtaaaaatacaaatatagaactaactgaacatgaccatttattaataagtcaaataaaaaagcttaaaacacaaaccacttgcttttttaataataaaggaggggttgggaagactacattagtagcaaatttaggagcagagctatcaataaactttagtgcaaaagttcttattgtggatgccgaccctcaatgtaatctcacgcagtatgtattaagtgatgaagaaactcaggacttatatgggcaagaaaatccagatagtatttatacagtaataagaccactatcctttggtaaaggatatgaaagtgacctccctataaggcatgtagagaatttcggttttgacataattgtcggtgaccctagacttgctttacaggaagaccttttagctggagactggcgagatgccaaaggcggtgggatgcgaggaattaggacaacttttgtatttgcagagttaattaagaaagctcgtgagctaaattatgattttgttttctttgacatgggaccatcattaggcgcaatcaacagggcagtattactggcaatggaattctttgtcgtcccaatgtcaatcgatgtattttcactatgggctattaaaaatattggctccacggtttcaatatggaaaaaagaattagacacagggattcggctctcagaggaacctagcgaattatcacaattatcacctcaaggaaaactaaagtttctcggttacgtcacccaacaacataaagaacgctctggatacgatacaattcagcttgagaatactgaggaagaaataaaatcgaaacgtcgggtaaaggcgtatgaagacattggagaggtgtttccttctaaaattactgagcatctttctaaactttatgcatcaaaagatatgaacccacaccttggagatatacgtcatttaggtagtttagctccgaaatcacaatcacaacacgttccgatgatatcagtgtctggtacaggaaattacaccagacttagaaaaagcgcgcgtgaactttatcgagatattgcaagaagatacttagagaacattcagactgctaatggcgagaaatag 286 atgaagggaaaggaaattctggcgctgctggacgaacccgcctgcgagcacaaccagaagcaaaaatccggctgcagcgcccctaagcccggcgctaccgccggcggttgcgccttcgacggcgcgcagataacgctcctgcccatcgccgacgtcgcgcacctggtgcacggccccatcggctgcgcgggcagctcgtgggataaccgcggcagcgtcagcgccggcccggccctcaaccggctcggctttaccaccgatcttaacgaacaggatgtgattatgggccgcggcgaacgccgcctgttccacgccgtgcgtcacatcgtcgaccgctatcatccggcggcggtctttatctacaacacctgcgtaccggcgatggagggcgatgacatcgaggcggtctgccaggccgcacagaccgccaccggcgtcccggtcatcgctattgacgccgccggtttctacggcagtaaaaatcttggcaaccgaatggcgggcgacgtgatgctcaggcaggtgattggccagcgcgaaccggccccgtggccagacaacacgccctttgccccggcccagcgccacgatatcggcctgattggcgaattcaatatcgccggcgagttctggcaggtccagccgctgctcgacgagctggggatccgcgtcctcggcagcctctccggcgacggccgctttgccgagatccagaccctgcaccgggcgcaggccaatatgctggtgtgctcgcgcgcgctgatcaacgtcgcccgggggctggagctgcgctacggcacgccgtggtttgaaggcagcttctacgggatccgcgccacctccgacgccttgcgccagctggcgacgctgctgggggatgacgacctgcgccgccgcaccgaggcgctgatcgcccgcgaagagcaggcggcggagcaggctcttgcgccgtggcgtgagcagctccgcgggcgcaaagtgctgctctataccggcggcgtgaaatcctggtcggtggtatcggccctgcaggatctcggcatgaccgtggtggccaccggcacgcgcaaatccaccgaggaggacaaacagcggatccgtgagctgatgggcgacgaggcggtgatgcttgaggagggcaatgcccgcaccctgctcgacgtggtgtaccgctatcaggccgacctgatgatcgccggcggacgcaatatgtacaccgcctggaaagcccggctgccgtttctcgatatcaatcaggagcgcgagcacgcctacgccggctatcagggcatcatcaccctcgcccgccagctctgtctgaccctcgccagccccgtctggccgcaaacgcatacccgcgccccgtggcgctag 287 atgaccaacgcaacaggcgaacgtaaccttgcgctcatccaggaagtcctggaggtgtttcccgaaaccgcgcgcaaagagcgcagaaagcacatgatgatcagcgatccgcagatggagagcgtcggcaagtgcattatctcgaaccgtaaatcgcagcccggggtgatgaccgtgcgcggctgcgcctatgcgggctcgaaaggggtggtgtttgggccaatcaaagacatggcccatatctcgcacggccccatcggctgcggccagtattcccgcgccggacggcgcaactactataccggcgtcagcggtgtcgacagcttcggcaccctgaacttcacctctgattttcaggagcgcgatattgttttcggcggcgataaaaagctgaccaaactgatcgaagagatggagctgctgttcccgctgaccaaagggatcaccatccagtcggagtgcccggtgggcctgatcggcgatgacatcagcgccgtagccaacgccagcagcaaggcgctggataaaccggtgatcccggtgcgctgcgaaggctttcgcggcgtatcgcaatcgctgggccaccatatcgccaacgacgtggtgcgcgactgggtgctgaacaatcgcgaagggcagccgtttgccagcaccccgtacgatgttgccatcattggcgattacaacatcggcggcgacgcctgggcctcgcgcattctgctggaagagatggggctgcgcgtagtggcgcagtggtccggcgacggcaccctggtggagatggagaacaccccattcgttaagcttaacctcgtccactgctaccgttcgatgaactatatcgcccgccatatggaggagaaacatcagatcccatggatggaatataacttcttcggcccgaccaaaatcgccgaatcgctgcgcaagatcgccgatcaatttgatgacaccattcgcgccaatgcggaagcggtgatcgccaaatatgaggggcagatggcggccatcatcgccaaatatcgcccgcggctggaggggcgcaaagtgctgctgtacatgggggggctgcggccgcgccacgtcatcggcgcctatgaggatctcgggatggagatcatcgccgccggctacgagtttgcccataacgatgattacgaccgcaccctgccggacctgaaagagggcaccctgctgtttgacgatgccagcagctatgagctggaggccttcgtcaaagcgctgaaacctgacctcatcggctccgggatcaaagagaaatatatcttccagaaaatgggggtgccgttccgccagatgcactcctgggactattccggcccctatcacggctatgacggcttcgccatctttgcccgcgatatggatatgaccctgaacaatccggcgtggaacgaactgactgccccgtggctgaagtctgcgtga 288 atggcagatattatccgcagtgaaaaaccgctggcggtgagcccgattaaaaccgggcaaccgctcggggcgatcctcgccagcctcgggctggcccaggccatcccgctggtccacggcgcccagggctgcagcgccttcgccaaagttttctttattcagcatttccatgacccggtgccgctgcagtcgacggccatggatccgaccgccacgatcatgggggccgacggcaatatcttcaccgcgctcgacaccctctgccagcgccacagcccgcaggccatcgtgctgctcagcaccggtctggcggaagcgcagggcagcgatatcgcccgggtggtgcgccagtttcgcgaggcgcatccgcgccataacggcgtggcgatcctcaccgtcaataccccggatttttttggctctatggaaaacggctacagcgcggtgatcgagagcgtgatcgagcagtgggtcgcgccgacgccgcgtccggggcagcggccccggcgggtcaacctgctggtcagccacctctgttcgccaggggatatcgaatggctgggccgctgcgtggaggcctttggcctgcagccggtgatcctgccggacctctcgcagtcaatggatggccacctcggtgaaggggattttacgcccctgacccagggcggcgcctcgctgcgccagattgcccagatgggccagagtctgggcagcttcgccattggcgtgtcgctccagcgggcggcatcgctcctgacccaacgcagccgcggcgacgtgatcgccctgccgcatctgatgaccctcgaccattgcgatacctttatccatcagctggcgaagatgtccggacgccgcgtaccggcctggattgagcgccagcgtggccagctgcaggatgcgatgatcgactgccatatgtggcttcagggccagcgcatggcgatggcggcggagggcgacctgctggcggcgtggtgtgatttcgcccgcagccaggggatgcagcccggcccgctggtcgcccccaccagccaccccagcctgcgccagctgccggtcgagcaagtcgtgccgggggatcttgaggatctgcagcagctgctgagccaccaacccgccgatctgctggtggctaactctcacgcccgcgatctggcggagcagtttgccctgccgctgatccgcgtcggttttcccctcttcgaccggctcggtgagtttcgtcgcgtccgccaggggtacgccggtatgcgagatacgctgtttgaactggccaatctgctgcgcgaccgccatcaccacaccgccctctaccgctcgccgcttcgccagggcgccgacccccagccggcttcaggagacgcttatgccgcccattaa 289 atgagccaaacgatcgataaaattcacagctgttatccgctgtttgaacaggatgaataccagaccctgttccagaataaaaagacccttgaagaggcgcacgacgcgcagcgtgtgcaggaggtttttgcctggaccaccaccgccgagtatgaagcgctgaacttccagcgcgaggcgctgaccgtcgacccggccaaagcctgccagccgctcggcgccgtactctgcgcgctggggttcgccggcaccctgccctacgtgcacggctcccagggctgcgtcgcctattttcgcacctactttaaccgccattttaaagagccggtcgcctgcgtctccgactccatgaccgaggacgcggcggtgttcggcggcaacaacaacatgaatctgggcctgcagaatgccagcgcgctgtataaacccgagattatcgccgtctccaccacctgtatggccgaggtgatcggcgacgatctgcaggcgtttatcgccaacgccaaaaaagagggatttgttgacgaccgcatcgccattccttacgcccatacccccagctttatcggcagccatgtcaccggctgggacaatatgttcgaagggttcgcgaagacctttaccgctgactacgccgggcagccgggcaaacagcaaaagctcaatctggtgaccggatttgagacctatctcggcaacttccgcgtgctgaagcggatgatggcgcagatggatgtcccgtgcagcctgctctccgacccatcagaggtgctcgacacccccgccgacggccattaccggatgtacgccggcggcaccagccagcaggagatcaaaaccgcgccggacgccattgacaccctgctgctgcagccgtggcagctggtgaaaagcaaaaaggtggttcaggagatgtggaaccagcccgccaccgaggtggccgttccgctgggcctggccgccaccgacgcgctgctgatgaccgtcagtcagctgaccggcaaaccgatcgccgacgctctgaccctggagcgcggccggctggtcgacatgatgctggattcccacacctggctgcatggcaaaaaattcggcctctacggcgatccggatttcgtgatggggctgacgcgcttcctgctggagctgggctgcgagccgacggtgatcctcagtcataacgccaataaacgctggcaaaaagcgatgaagaaaatgctcgatgcctcgccgtacggtcaggaaagcgaagtgttcatcaactgcgacctgtggcacttccggtcgctgatgttcacccgtcagccggactttatgatcggtaactcctacggcaagtttatccagcgcgataccctggcaaagggcaaagccttcgaagtgccgctgatccgtctgggctttccgctgttcgaccgccatcatctgcaccgccagaccacctggggctatgaaggcgcaatgaacatcgtcacgacgctggtgaacgccgtgctggaaaaactggaccacgacaccagccagttgggcaaaaccgattacagcttcgacctcgttcgttaa 290 atgatgccgctttctccgcaattacagcagcactggcagacggtcgctgaccgtctgccagcggattttcccattgccgaactgagcccacaggccaggtcggtcatggcgttcagcgattttgtcgaacagagtgtgatcgcccagccgggctggctgaatgagcttgcggactcctcgccggaggcggaagagtggcggcattacgaggcctggctgcaggatcgcctgcaggccgtcactgacgaagcggggttgatgcgagagctgcgtctcttccgccgccagatgatggtccgcatcgcctgggcgcaggcgctgtcgctggtgagcgaagaagagactctgcagcagctgagcgtcctggcggagaccctgattgtcgccgcccgcgactggctgtacgccgcctgctgtaaggagtggggaacgccatgcaatgccgagggccagccgcagccgctgctgatcctcgggatgggaaagctgggcggcggcgagctgaacttctcttccgatatcgatctgatctttgcctggcctgagcatggcgccacccgcggcggccgccgcgagctggataacgcccagttctttacccgtctggggcagcggctgatcaaggcccttgaccagccgacgcaggacggctttgtctatcgggttgacatgcgcctgcggccgtttggcgacagtgggccgctggtactcagttttgcggcgctggaagattattaccaggagcagggtcgggactgggaacgctatgcgatggtgaaagcgcggatcatgggcgataacgacggcgtgtacgccagcgagttgcgcgcgatgctccgtcctttcgtcttccgccgttatatcgacttcagcgtgatccagtcgctgcgtaacatgaaaggcatgatcgcccgcgaagtgcggcgtcgcgggctgaaagacaacatcaagctcggcgccggcgggatccgtgaaattgagtttatcgttcaggtctttcaactgatccgcggtggtcgcgaacctgcactgcagcagcgcgccctgctgccgacgctggcggcgattgatgagctacatctgctgccggaaggcgacgcggcgctgctgcgcgaggcctatctgttcctgcgccggctggaaaacctgctgcaaagcatcaacgatgagcagacccagaccctgccgcaggatgaacttaaccgcgccaggctggcgtgggggatgcataccgaagactgggagacgctgagcgcgcagctggcgagccagatggccaacgtgcggcgagtgtttaatgaactgatcggcgatgatgaggatcagtccccggatgagcaactggccgagtactggcgcgagctgtggcaggatgcgctggaagaagatgacgccagcccggcgctggcgcatttaaacgataccgaccgccgtagcgtgctggcgctgattgccgattttcgtaaagagctggatcggcgcaccatcggcccgcgcggccgccaggtgctggatcagctgatgccgcatctgctgagcgaaatctgctcgcgcgccgatgcgccgctgcctctggcgcggatcacgccgctgttgaccgggatcgtcacccgtaccacctatcttgagctgctgagcgaattccccggcgcgctgaagcacctgatcacgctctgcgcggcgtcgccgatggtcgccagccagctggcgcgccacccgctgctgctggatgagctgctggatcccaacaccctctatcagccgacggcgaccgatgcctatcgcgacgagctgcgccagtacctgctgcgcgtgccggaagaggatgaagagcagcagctggaggcgttgcgccagtttaagcaggcgcagcagctgcatatcgcggcggcggatatcgctggtaccctgccggtgatgaaggtcagcgatcacttaacctggcttgccgaagcgatcctcgacgcggtggtgcagcaggcatgggggcagatggtcgctcgctacggccagccgacccacctgcacgatcgccagggtcgcggcttcgccgtcgtcggctacggtaagcttggcggctgggagctgggctacagctccgatctcgatctggtgttcctccatgactgcccggcggaggtgatgaccgacggcgagcgggagattgacggccgtcagttctacctgcggctggcccagcggatcatgcacctgttcagcacccgcacctcgtccggtattctctacgaagtggacgcccggctgcgtccttctggcgcggcggggatgctggtcaccaccgccgacgcgtttgctgactatcagcagaacgaagcctggacgtgggaacatcaggcgctggtgcgcgcccgcgtggtctatggcgacccggcgctgcaggcgcgctttgacgccattcgtcgcgatatcctgaccaccccgcgggaggggatgaccctgcagaccgaggttcgcgagatgcgcgagaagatgcgcgcccaccttggcaacaaacatcccgatcgttttgatatcaaagccgatgccggcgggatcaccgatattgaatttattactcagtatctggtcctacgctatgccagtgacaagccgaagctgacccgctggtctgacaacgtgcgtattcttgagctgctggcgcagaacgacatcatggacgaggaggaggcgcgcgccttaacgcatgcgtacaccaccttgcgtgatgcgctccatcacctggccctgcaggagcagccgggacacgtggcgccagaggccttcagccgggagcgtcagcaggtcagcgccagctggcagaagtggctgatggcttaa 291 agtctgaactcatcctgcggcagtcggtgagacgtatttttgaccaaagagtgatctacatcacggaattttgtggttgttgctgcttaaaagggcaaatctacccttagaatcaactgttatatcagggggattcagagagatattaggaatttgcacaagcgcacaatttaaccacatcatgataacgccatgtaaaacaaagataaaaaaacaaaatgcagtgacttacatcgcaagcaaggcattttcttatccaattgctcaaagtttggcctttcatatcgcaacgaaaatgcgtaatatacgcgcccttgcggacatcagtatggtcattcctagttcatgcgcatcggacaccaccagcttacaaattgcctgattgcggccccgatggccggtatcactgaccgaccatttcgtgccttatgtcatgcgatgggggctgg 292 tgaacatcactgatgcacaagctacctatgtcgaagaattaactaaaaaactgcaagatgcaggcattcgcgttaaagccgacttgagaaatgagaagattggctttaaaattcgcgaacacacgctacgccgtgttccttatatgttagtttgtggcgataaagaggtcgaagcaggcaaagttgctgttcgtacccgccgcggcaaagacttaggaagcatggatgttagcgaagtcgttgacaaactgctggcggaaatccgcagcagaagtcttcatcaactggaggaataaagtattaaaggcggaaaacgagttcaaccggcgcgtcctaatcgcattaacaaagagattcgcgcgcaagaagttcgcctcacaggcgtcgatggcgagcagattggtattgtcagtctgaatgaagctcttgaaaaagctgaggaagcgggcgtcgatttagtagaaatcagtccgaatgccgagccgccagtttgtcgaatc 293 tacagtagcgcctctcaaaaatagataaacggctcatgtacgtgggccgtttattttttctacccataatcgggaaccggtgttataatgccgcgccctcatattgtggggatttcttaatgacctatcctgggtcctaaagttgtagttgacattagcggagcactaac 294 aattttttttcacaaagcgtagcgttattgaatcgcacattttaaactgttggccgctgtggaagcgaatattggtgaaaggtgcggttttaaggcctttttctttgactctctgtcgttacaaagttaatatgcgcgccct 295 ttaaaaacgtgaccacgagcattaataaacgccacgaaatgtggcgtttatttattcaaaaagtatcttctttcataaaaagtgctaaatgcagtagcagcaaaattgggataagtcccatggaatacggctgttttcgctgcaatttttaactttttcgtaaaaaaagatgtttctttgagcgaacgatcaaaatatagcgttaaccggcaaaaaattattctcattagaaaatagtttgtgtaatacttgtaacgctacatggagattaacttaatctagagggttttata 296 atggcgctcaaacagttaatccgtctgtgtgccgcctcgccgatggtcgcgacacaacttgcacgtcatcctttattgctcgatgaactgctcgacccgcgcacgctttaccagccgattgagccgggcgcttaccgcgacgaactgcgtcagtatctgatgcgggtgccaacagaagacgaagaacagcagcttgaagccgtgcgccagttcaaacaggcccagcatttgcgtatcgcagccggggatatttccggggcattgccggtgatgaaagtcagtgaccatttaacctaccttgccgaggccattctcgatgtcgtggtgcagcatgcgtgggaacaaatggtcgtaaaatacgggcagcccgcgcatcttcagcaccgtgaggggcgcggttttgccgtggtcggttacgggaaactcggtggctgggagctgggttatagctcagatctggatctggtcttcctgctcgattgcgcgccggaggtgatgacggacggcgaacgcagcatcgacggacgtcagttttatcttcggctggcgcagcgcattatgcacttattcagcacccggacatcgtcaggcattctttacgaggttgatccgcgtctgcgaccttccggcgcatccggcatgctggtcagtaccattgaagcgtttgcagattatcaggccaatgaagcctggacgtgggagcatcaggcgctggttcgcgcgcgcgtggtttacggggatccgcaactgacacagcaatttaacgccacgcgtcgcgacattctttgccgccagcgcgatggcgacggcctgcgtaaggaggtccgtgaaatgcgcgagaaaatgtatgcccatctggggagtaaaaaagcccacgagtttgatctgaaagccgatccgggtggcatcacggatattgaattcattgcacaatacctggttctgcgtttcgcgcatgatgagccgaagctgacgcgctggtctgataacgtgcggatttttgaactgatggcacgatatgacatcatgccggaagaggaagcgcgccatctgacgcaggcttatgtgacgctgcgcgatgaaattcatcatctggcgttgcaggaacacagcgggaaagtggccgcggacagctttgctactgagcgcgcgcagatccgtgccagctgggcaaagtggctcggctga 297 cggtactggaacagaaatcggcggatgcgcaggaaatttgttatgacacggcctgtctgaagtgcaagttagtgcttacttcctggctggcaacctcaggctggacgccgtttattgatgataaatctgcgaagaaactggacgcttccttcaaacgttttgctgacatcatgctcggtcgtaccgcagcggatctgaaagaagcctttgcgcagccactgacggaagaaggttatcgcgatcagctggcgcgcctgaaacgccagatcattaccttccatttgcttgccggtgcttaccctgaaaaagacgtcgatgcgtatattgccggctgggtggacctgcaacaggccatcgttcagcagcaacacgcctgggaggattcggcccgttctcacgcggtgatgatggatgctttctggttaaacgggcaacctcgttaactgactgactagcctgggcaaactgcccgggcttttttttgcaaggaatctgatttcatggcgctcaaacagttaatccgtctgtgtgccgcctcgccgatggtcgcgacacaacttgcacgtcatcctttattgctcgatgaactgctcgacccgcgcacgctttaccagccgattgagccgggcgcttaccgcgacgaactgcgtcagtatctgatgcgggtgccaacagaagacgaagaacagcagcttgaagccgtgcgccagttcaaacaggcccagcatttgcgtatcgcagccggggatatttccggggcattgccggtgatgaaagtcagtgaccatttaacctaccttgccgaggccattctcgatgtcgtggtgcagcatgcgtgggaacaaatggtcgtaaaatacgggcagcccgcgcatcttcagcaccgtgaggggcgcggttttgccgtggtcggttacgggaaactcggtggctgggagctgggttatagctcagatctggatctggtcttcctgctcgattgcgcgccggaggtgatgacggacggcgaacgcagcatcgacggacgtcagttttatcttcggctggcgcagcgcattatgcacttattcagcacccggacatcgtcaggcattctttacgaggttgatccgcgtctgcgaccttccggcgcatccggcatgctggtcagtaccattgaagcgtttgcagattatcaggccaatgaagcctggacgtgggagcatcaggcgctggttcgcgcgcgcgtggtttacggggatccgcaactgacacagcaatttaacgccacgcgtcgcgacattctttgccgccagcgcgatggcgacggcctgcgtaaggaggtccgtgaaatgcgcgagaaaatgtatgcccatctggggagtaaaaaagcccacgagtttgatctgaaagccgatccgggtggcatcacggatattgaattcattgcacaatacctggttctgcgtttcgcgcatgatgagccgaagctgacgcgctggtctgataacgtgcggatttttgaactgatggcacgatatgacatcatgccggaagaggaagcgcgccatctgacgcaggcttatgtgacgctgcgcgatgaaattcatcatctggcgttgcaggaacacagcgggaaagtggccgcggacagctttgctactgagcgcgcgcagatccgtgccagctgggcaaagtggctcggctgagggtttttattcggctaacaggcgcttgtgatattatccggcgcattgtatttacccgatttgatttatctgttttggagtcttgggatgaaagtgactttgcctgattttcaccgcgcaggtgtgctggttgtcggtgacgtaatgttagaccgttactggtatggcccgaccaatcgtatttctccggaagctccggtgccggtggtgaaggtcagtaccattgaagagcggcctggcggtgcagctaacgtggcgatgaacatttcatctctgggcgcctcttcctgtctgatcggcctgaccggcgtagacgacgctgcgcgtgccctcagtgagcgtctggcagaagtgaaagttaactgcgatttcgtcgcactatccacacatcctaccatcaccaaactgcgaattttgtcccgtaaccagcaactgatccgcctcgactttgaggaaggttttgaaggcgttgatctcgagccgatgctgaccaaaataga 298 atgagcatcacggcgttatcagcatcatttcctgaggggaatatcgccagccgcttgtcgctgcaacatccttcactgttttataccgtggttgaacaatcttcggtggcgatttcgctgaccgatccgcaggcgcgcatttgttatgccaatccggcattctgccgccagacgggttttgcacttgagacacttttgggcgagaaccaccgtctgctggagtctgaactcatcctgcgatgggggctgggccgtctctgaagctctcggtgaacattgttgcgaggcaggatgcgagctggttgtgttttgacattaccgataatgtgccgcgtgaacgggtgcgttatgcccgcccggaagcggcgttttcccgtccggggaatggcatggagctgcgccttatccagacgctgatcgcccatcatcgcggttctttagatctctcggtccgccctgatggcggcaccttgctgacgttacgcctgccggtacagcaggttatcaccggaggcttaaaatga 299 tgtttcgtctcgaggccgggcaactgagcggccccgttgaaaccgacctgggctggcatctgttgttgtgcgaacaaattcgcctgccgcaacccttgccgaaagccgaagccttaacgcgggtgcgtcagcaactgattgcccggcaacagaaacattatcagcgccagtggctgcaacaactgatcaacgcctgagcctgttctccttcttgttgatgcagacgggttaatgcccgttttgcacgaaaaatgcacataaattgcctgcgttgccttataacagcgcagggaaatcctgcctccggccttgtgccacaccgcgctttgcctggtttgtggtaaaaactggcccgctttgcatcctgatgcttaaaacaccccgttcagatcaacctttgggcagataagcccgcgaaaggcctgcaaattgcacggttattccgggtgagtatatgtgtgatttgggttccggcattgcgcaataaaggggagaaagacatgagcatcacggcgttatcagcatcatttcctgaggggaatatcgccagccgcttgtcgctgcaacatccttcactgttttataccgtggttgaacaatcttcggtggcgatttcgctgaccgatccgcaggcgcgcatttgttatgccaatccggcattctgccgccagacgggttttgcacttgagacacttttgggcgagaaccaccgtctgctggagtctgaactcatcctgcgatgggggctgggccgtctctgaagctctcggtgaacattgttgcgaggcaggatgcgagctggttgtgttttgacattaccgataatgtgccgcgtgaacgggtgcgttatgcccgcccggaagcggcgttttcccgtccggggaatggcatggagctgcgccttatccagacgctgatcgcccatcatcgcggttctttagatctctcggtccgccctgatggcggcaccttgctgacgttacgcctgccggtacagcaggttatcaccggaggcttaaaatgacccagttacctaccgcgggcccggttatccggcgctttgatatgtctgcccagtttacggcgctttatcgcatcagcgtggcgctgagtcaggaaagcaacaccgggcgcgcactggcggcgatcctcgaagtgcttcacgatcatgcatttatgcaatacggcatggtgtgtctgtttgataaagaacgcaatgcactctttgtggaatccctgcatggcatcgacggcgaaaggaaaaaagagacccgccatgtccgttaccgcatgggggaaggcgtgatcggcgcggtgatgagccagcgtcaggcgctggtgttaccgcgcatttcagacgatcagcgttttctcgaccgcctgaatatttacgattacagcctgccgttgattggcgtgccgatccccggtgcggataatcagccatcgggcgtgctggtggcacagccgatggcgttgcacgaagaccggctgactgccagtacgcggtttttagaaatggtc 300 atgagcatcacggcgttatcagcatcatttcctgaggggaatatcgccagccgcttgtcgctgcaacatccttcactgttttataccgtggttgaacaatcttcggtggcgatttcgctgaccgatccgcaggcgcgcatttgttatgccaatccggcattctgccgccagacgggttttgcacttgagacacttttgggcgagaaccaccgtctgctggttaaagcctgccggtacagcaggttatcaccggaggcttaaaatga 301 tgtttcgtctcgaggccgggcaactgagcggccccgttgaaaccgacctgggctggcatctgttgttgtgcgaacaaattcgcctgccgcaacccttgccgaaagccgaagccttaacgcgggtgcgtcagcaactgattgcccggcaacagaaacattatcagcgccagtggctgcaacaactgatcaacgcctgagcctgttctccttcttgttgatgcagacgggttaatgcccgttttgcacgaaaaatgcacataaattgcctgcgttgccttataacagcgcagggaaatcctgcctccggccttgtgccacaccgcgctttgcctggtttgtggtaaaaactggcccgctttgcatcctgatgcttaaaacaccccgttcagatcaacctttgggcagataagcccgcgaaaggcctgcaaattgcacggttattccgggtgagtatatgtgtgatttgggttccggcattgcgcaataaaggggagaaagacatgagcatcacggcgttatcagcatcatttcctgaggggaatatcgccagccgcttgtcgctgcaacatccttcactgttttataccgtggttgaacaatcttcggtggcgatttcgctgaccgatccgcaggcgcgcatttgttatgccaatccggcattctgccgccagacgggttttgcacttgagacacttttgggcgagaaccaccgtctgctggttaaagcctgccggtacagcaggttatcaccggaggcttaaaatgacccagttacctaccgcgggcccggttatccggcgctttgatatgtctgcccagtttacggcgctttatcgcatcagcgtggcgctgagtcaggaaagcaacaccgggcgcgcactggcggcgatcctcgaagtgcttcacgatcatgcatttatgcaatacggcatggtgtgtctgtttgataaagaacgcaatgcactctttgtggaatccctgcatggcatcgacggcgaaaggaaaaaagagacccgccatgtccgttaccgcatgggggaaggcgtgatcggcgcggtgatgagccagcgtcaggcgctggtgttaccgcgcatttcagacgatcagcgttttctcgaccgcctgaatatttacgattacagcctgccgttgattggcgtgccgatccccggtgcggataatcagccatcgggcgtgctggtggcacagccgatggcgttgcacgaagaccggctgactgccagtacgcggtttttagaaatggtc 302 atgagcatcacggcgttatcagcatcatttcctgaggggaatatcgccagccgcttgtcgctgcaacatccttcactgttttataccgtggttgaacaatcttcggtggcgatttcgctgaccgatccgcaggcgcgcatttgttatgccaatccggcattctgccgccagacgggttttgcacttgagacacttttgggcgagaaccaccgtctgctggagtctgaactcatcctgcggcagtcggtgagacgtatttttgaccaaagagtgatctacatcacggaattttgtggttgttgctgcttaaaagggcaaatctacccttagaatcaactgttatatcagggggattcagagagatattaggaatttgcacaagcgcacaatttaaccacatcatgataacgccatgtaaaacaaagataaaaaaacaaaatgcagtgacttacatcgcaagcaaggcattttcttatccaattgctcaaagtttggcctttcatatcgcaacgaaaatgcgtaatatacgcgcccttgcggacatcagtatggtcattcctagttcatgcgcatcggacaccaccagcttacaaattgcctgattgcggccccgatggccggtatcactgaccgaccatttcgtgccttatgtcatgcgatgggggctgggccgtctctgaagctctcggtgaacattgttgcgaggcaggatgcgagctggttgtgttttgacattaccgataatgtgccgcgtgaacgggtgcgttatgcccgcccggaagcggcgttttcccgtccggggaatggcatggagctgcgccttatccagacgctgatcgcccatcatcgcggttctttagatctctcggtccgccctgatggcggcaccttgctgacgttacgcctgccggtacagcaggttatcaccggaggcttaaaatga 303 tgtttcgtctcgaggccgggcaactgagcggccccgttgaaaccgacctgggctggcatctgttgttgtgcgaacaaattcgcctgccgcaacccttgccgaaagccgaagccttaacgcgggtgcgtcagcaactgattgcccggcaacagaaacattatcagcgccagtggctgcaacaactgatcaacgcctgagcctgttctccttcttgttgatgcagacgggttaatgcccgttttgcacgaaaaatgcacataaattgcctgcgttgccttataacagcgcagggaaatcctgcctccggccttgtgccacaccgcgctttgcctggtttgtggtaaaaactggcccgctttgcatcctgatgcttaaaacaccccgttcagatcaacctttgggcagataagcccgcgaaaggcctgcaaattgcacggttattccgggtgagtatatgtgtgatttgggttccggcattgcgcaataaaggggagaaagacatgagcatcacggcgttatcagcatcatttcctgaggggaatatcgccagccgcttgtcgctgcaacatccttcactgttttataccgtggttgaacaatcttcggtggcgatttcgctgaccgatccgcaggcgcgcatttgttatgccaatccggcattctgccgccagacgggttttgcacttgagacacttttgggcgagaaccaccgtctgctggagtctgaactcatcctgcggcagtcggtgagacgtatttttgaccaaagagtgatctacatcacggaattttgtggttgttgctgcttaaaagggcaaatctacccttagaatcaactgttatatcagggggattcagagagatattaggaatttgcacaagcgcacaatttaaccacatcatgataacgccatgtaaaacaaagataaaaaaacaaaatgcagtgacttacatcgcaagcaaggcattttcttatccaattgctcaaagtttggcctttcatatcgcaacgaaaatgcgtaatatacgcgcccttgcggacatcagtatggtcattcctagttcatgcgcatcggacaccaccagcttacaaattgcctgattgcggccccgatggccggtatcactgaccgaccatttcgtgccttatgtcatgcgatgggggctgggccgtctctgaagctctcggtgaacattgttgcgaggcaggatgcgagctggttgtgttttgacattaccgataatgtgccgcgtgaacgggtgcgttatgcccgcccggaagcggcgttttcccgtccggggaatggcatggagctgcgccttatccagacgctgatcgcccatcatcgcggttctttagatctctcggtccgccctgatggcggcaccttgctgacgttacgcctgccggtacagcaggttatcaccggaggcttaaaatgacccagttacctaccgcgggcccggttatccggcgctttgatatgtctgcccagtttacggcgctttatcgcatcagcgtggcgctgagtcaggaaagcaacaccgggcgcgcactggcggcgatcctcgaagtgcttcacgatcatgcatttatgcaatacggcatggtgtgtctgtttgataaagaacgcaatgcactctttgtggaatccctgcatggcatcgacggcgaaaggaaaaaagagacccgccatgtccgttaccgcatgggggaaggcgtgatcggcgcggtgatgagccagcgtcaggcgctggtgttaccgcgcatttcagacgatcagcgttttctcgaccgcctgaatatttacgattacagcctgccgttgattggcgtgccgatccccggtgcggataatcagccatcgggcgtgctggtggcacagccgatggcgttgcacgaagaccggctgactgccagtacgcggtttttagaaatggtc