РЕКОМБИНАНТНЫЙ ШТАММ С МОДИФИЦИРОВАННЫМ ГЕНОМ BBD29_11265 ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ L-ГЛУТАМИНОВОЙ КИСЛОТЫ, А ТАКЖЕ СПОСОБ ЕГО КОНСТРУИРОВАНИЯ И ПРИМЕНЕНИЯ Российский патент 2025 года по МПК C12N15/77 C07K14/34 C12P13/14 

Область техники

Настоящее изобретение относится к области конструирования генов и микроорганизмов, и в частности, относится к рекомбинантному штамму для продуцирования (получения) L-глутаминовой кислоты, а также способ его конструирования и применения.

Уровень техники

L-глутаминовая кислота представляет собой важную аминокислоту, которую используют в пищевых продуктах, в клинической медицине и в других областях. Традиционно L-глутаминовую кислоту получают в основном путем ферментации с использованием продуцирующих L-глутаминовую кислоту бактерий, принадлежащих к роду Brevibacterium, Corynebacterium или Microtatobiotes, или их мутантов.

L-Глутаминовая кислота синтезируется путем биосинтеза из α-кетоглутаровой кислоты, промежуточного продукта цикла лимонной кислоты в клетках микроорганизмов. Существует два биосинтетических пути образования L-глутаминовой кислоты из α-кетоглутаровой кислоты через ассимиляцию ионов аммония. Один путь представлен синтезом L-глутаминовой кислоты путем катализа глутаматдегидрогеназой (GDH) в присутствии ионов аммония в высокой концентрации. Другой путь (путь GS/GOGAT) представлен синтезом L-глутаминовой кислоты глутаминсинтетазой и аминотрансферазой глутамина-оксоглутаровой кислоты. Глутаминсинтетаза (GS) катализирует конверсию L-глутаминовой кислоты и ионов аммония в глутамин; аминотрансфераза глутамина оксоглутаровой кислоты, также известная как «глутаминсинтетаза» (GOGAT), катализирует синтез L-глутаминовой кислоты, в ходе которого две молекулы L-глутаминовой кислоты синтезируются из одной молекулы глутамина, которая была синтезирована GS из одной молекулы α-кетоглутаровой кислоты.

Улучшение получения L-аминокислот путем ферментации может относиться к методикам ферментации, таким как перемешивание и подача кислорода; или к составу питательной среды, например, к концентрации сахара во время ферментации; или к переработке ферментативного бульона в продукт в подходящей форме, например, путем высушивания и грануляции ферментативного бульона, или с помощью ионообменной хроматографии; или может относиться к собственным свойствам соответствующих продуцирующих микроорганизмов.

Способы улучшения свойств указанных продуцирующих микроорганизмов, включают мутагенез, выбор и скрининг мутантов. Штамм, полученный указанным способом, устойчив к антиметаболитам или ауксотрофен по метаболитам, имеющим регуляторное значение, и продуцирует L-аминокислоты, и т.п.

Хотя существует значительное число способов, способных усиливать способность к продуцированию L-глутаминовой кислоты, сохраняется потребность в разработке способов продуцирования L-глутаминовой кислоты для удовлетворения растущего спроса.

Краткое описание изобретения

Задача настоящего изобретения заключается в разработке новой методики для усиления способности бактерии к продуцированию L-глутаминовой кислоты, с обеспечением таким образом способа эффективного продуцирования L-глутаминовой кислоты.

В ходе исследований для решения вышеуказанной задачи авторы настоящего изобретения обнаружили, что ген BBD29_11265 или гомологичный ген бактерии может быть модифицирован или улучшен в отношении экспрессии указанного гена, чтобы обеспечить усиленную способность бактерии к продуцированию L-глутаминовой кислоты. Настоящее изобретение было выполнено с учетом этих находок.

Согласно настоящему изобретению предложена бактерия для продуцирования L-глутаминовой кислоты, характеризующаяся улучшенной экспрессией полинуклеотида, кодирующего последовательность аминокислот SEQ ID NO: 3 (последовательность 3 в перечне последовательностей), или гомологичную ей последовательность. Согласно настоящему изобретению также предложен способ получения L-глутаминовой кислоты с использованием микроорганизма.

Согласно первому аспекту настоящего изобретения предложена бактерия для продуцирования L-глутаминовой кислоты, обладающая улучшенной экспрессией полинуклеотида, кодирующего последовательность аминокислот SEQ ID NO: 3, или гомологичную ей последовательность. В соответствии с настоящим изобретением улучшенная экспрессия представляет собой усиленную экспрессию полинуклеотида, или наличие точечной мутации в полинуклеотиде, который кодирует последовательность аминокислот SEQ ID NO: 3, или гомологичную ей последовательность, или наличие точечной мутации в полинуклеотиде и усиленную экспрессию полинуклеотида, который кодирует последовательность аминокислот SEQ ID NO: 3, или гомологичную ей последовательность.

Последовательность аминокислот SEQ ID NO: 3, или гомологичная ей последовательность представляет собой белок, кодируемый геном BBD29_11265 или гомологичным ему геном.

Указанная бактерия имеет усиленную способность к продуцированию L-глутаминовой кислоты по сравнению с немодифицированным штаммом.

Согласно настоящему изобретению термин «бактерия, обладающая способностью к продуцированию L-глутаминовой кислоты» относится к бактерии, обладающей такой способностью к продуцированию и накоплению целевой L-глутаминовой кислоты в культуральной среде и/или в клетке указанной бактерии, из которой L-глутаминовая кислота может быть собрана при культивировании бактерии в культуральной среде. Бактерия, обладающая способностью к продуцированию L-глутаминовой кислоты, может представлять собой бактерию, способную к накоплению целевой L-глутаминовой кислоты в культуральной среде и/или в клетке указанной бактерии в большем количестве, чем у немодифицированного штамма.

Термин «немодифицированный штамм» относится к контрольному штамму, который не был модифицирован таким образом, чтобы включать некий специфический признак. Таким образом, примеры немодифицированного штамма включают штамм дикого типа и исходный штамм.

Бактерия, обладающая способностью к продуцированию L-глутаминовой кислоты, может представлять собой бактерию, способную к накоплению целевой L-глутаминовой кислоты в культуральной среде в количестве, предпочтительно превышающем 0,5 г/л, и более предпочтительно - превышающем 1,0 г/л.

Согласно настоящему изобретению, термин «L-глутаминовая кислота» относится к L-глутаминовой кислоте в свободной форме, к ее соли или смеси, если не указано иное.

Указанный полинуклеотид может кодировать последовательность аминокислот, обладающую приблизительно 90% или более, приблизительно 92% или более, приблизительно 95% или более, приблизительно 97% или более, приблизительно 98% или более, или приблизительно 99% или более гомологией последовательности в отношении последовательности аминокислот SEQ ID NO: 3. В настоящем документе термин «гомология» относится к проценту идентичности двух полинуклеотидов или двух полипептидов как модулей. Гомология последовательностей может быть измерена между одним модулем и другим модулем с применением способа, известного в данной области техники. Например, такая гомология последовательностей может быть измерена с помощью алгоритма BLAST.

Экспрессия полинуклеотида может быть усилена: путем замены или мутирования регуляторной последовательности экспрессии, введения мутации в последовательность полинуклеотида, и путем увеличения числа копий полинуклеотида, инсертированных в хромосому или введенных с помощью вектора, или комбинации перечисленного, и т.п.

Регуляторная последовательность экспрессии полинуклеотида может быть модифицирована. Регуляторная последовательность экспрессии контролирует экспрессию полинуклеотида, который функционально с ней связан, и может содержать, например, промоторы, терминаторы, энхансеры, сайленсеры и т.п. Полинуклеотид может иметь измененный инициирующий ко дон. Полинуклеотид может быть включен в определенный сайт хромосомы, с увеличением таким образом числа копий. Согласно настоящему документу специфический сайт может включать, например, сайт транспозона или межгенный сайт. Кроме того, полинуклеотид может быть включен в экспрессионный вектор, а указанный экспрессионный вектор введен в клетку-хозяина, с увеличением таким образом числа копий.

Согласно варианту реализации настоящего изобретения полинуклеотид, или полинуклеотид, имеющий точечную мутацию, включают в определенный сайт хромосомы микроорганизма с увеличением таким образом числа копий.

Согласно варианту реализации настоящего изобретения полинуклеотид с последовательностью промотора, или полинуклеотид, имеющий точечную мутацию, с последовательностью промотора встраивают в определенный сайт хромосомы микроорганизма, со сверхэкспрессией таким образом последовательности нуклеиновой кислоты.

Согласно варианту реализации настоящего изобретения полинуклеотид, или полинуклеотид, имеющий точечную мутацию, включают в экспрессионный вектор, а указанный экспрессионный вектор вводят в клетку-хозяина, с увеличением таким образом числа копий.

Согласно варианту реализации настоящего изобретения полинуклеотид с последовательностью промотора, или полинуклеотид, имеющий точечную мутацию, с последовательностью промотора включают в экспрессионный вектор, а указанный экспрессионный вектор вводят в клетку-хозяина, с обеспечением таким образом сверхэкспрессии последовательности аминокислот.

Согласно конкретному варианту реализации настоящего изобретения указанный полинуклеотид может содержать последовательность нуклеотидов SEQ ID NO: 1.

Согласно варианту реализации настоящего изобретения полинуклеотид, кодирующий последовательность аминокислот SEQ ID NO: 3, имеет точечную мутацию, такую, что аланин в положении 24 в последовательности аминокислот SEQ ID NO: 3, заменен на другую аминокислоту.

В соответствии с настоящим изобретением предпочтительно аланин в положении 24 заменен на треонин.

В соответствии с настоящим изобретением последовательность аминокислот согласно SEQ ID NO: 4 представляет собой последовательность аминокислот после замены аланина на треонин в положении 24 в последовательности аминокислот, представленной в SEQ ID NO: 3.

Согласно варианту реализации настоящего изобретения последовательность полинуклеотида, имеющего точечную мутацию, образуется в результате мутации основания в положении 70 последовательности полинуклеотида, представленной в SEQ ID NO: 1.

В соответствии с настоящим изобретением указанная мутация включает мутацию основания в положении 70 последовательности полинуклеотида, представленной в SEQ ID NO: 1, с заменой гуанина (G) на аденин (А).

Согласно варианту реализации настоящего изобретения последовательность полинуклеотида, имеющего точечную мутацию, содержит последовательность полинуклеотида, представленную в SEQ ID NO: 2.

В настоящем документе термин «функционально связанный» относится к функциональной связи между регуляторной последовательностью и последовательностью полинуклеотида, за счет которой регуляторная последовательность контролирует транскрипцию и/или трансляцию указанной последовательности полинуклеотида. Регуляторная последовательность может представлять собой сильный промотор, который может повышать уровень экспрессии полинуклеотида. Регуляторная последовательность может представлять собой промотор, происходящий из микроорганизма, принадлежащего к роду Corynebacterium, или может представлять собой промотор, происходящий из других микроорганизмов. Например, указанный промотор может представлять собой промотор trc, промотор gap, промотор tac, промотор Т7, промотор lac, промотор trp, промотор araBAD или промотор cj7.

Согласно конкретному варианту реализации настоящего изобретения указанный промотор представляет собой промотор полинуклеотида, кодирующего последовательность аминокислот SEQ ID NO: 3 (ген BBD29_11265).

В настоящем документе термин «вектор» относится к полинуклеотидной конструкции, содержащей регуляторную последовательность гена и последовательность гена, и выполненной с возможностью экспрессии целевого гена в подходящей клетке-хозяине. Термин "вектор" может также относиться к полинуклеотидной конструкции, содержащей последовательность для гомологичной рекомбинации, такой, что при введении этого вектора в клетку-хозяина может быть изменена регуляторная последовательность эндогенного гена в геноме клетки-хозяина, или целевой ген, который может экспрессироваться, может быть инсертирован в конкретный сайт генома хозяина. Таким образом, вектор для применения по настоящему изобретению может дополнительно содержать селективный маркер для определения введения вектора в клетку-хозяина или инсерции вектора в хромосому клетки-хозяина. Селективный маркер может включать маркер, обеспечивающий селектируемый фенотип, такой как лекарственная устойчивость, ауксотрофность, устойчивость к цитотоксическим агентам или экспрессия поверхностного белка. На среде, обработанной таким селективным агентом, может быть выбрана трансформированная клетка, поскольку только клетка, которая экспрессирует селективный маркер, может выживать или проявлять иные фенотипические черты. Вектор согласно описанию в настоящем документе хорошо известен специалистам в данной области техники и включает в том числе, но не ограничиваясь перечисленным: плазмиду, бактериофаг (такой как X бактериофаг или нитевидный бактериофаг М13, и т.п.), космиду или вирусный вектор.

Согласно некоторым конкретным вариантам реализации настоящего изобретения в качестве вектора используют плазмиду pK18mobsacB и плазмиду pXMJ19.

В настоящем документе термин «трансформация» относится к введению полинуклеотида в клетку-хозяина таким образом, чтобы указанный полинуклеотид мог быть репликативно-компетентным в качестве элемента, чужеродного для генома, или путем встраивания в геном клетки-хозяина. Способ трансформации вектором, применяемый согласно настоящему изобретению, может включать способ введения нуклеиновой кислоты в клетку. Кроме того, в соответствии с описанием близких методик, может быть использован подходящий для клетки-хозяина способ, задействующий электрические импульсы.

Согласно настоящему изобретению микроорганизм может представлять собой дрожжи, бактерию, водоросль или гриб.

В соответствии с настоящим изобретением указанная бактерия может представлять собой микроорганизм, принадлежащий к роду Corynebacterium, такой как Corynebacterium acetoacidophilum, Corynebacterium acetoglutamicum, Corynebacterium callunae, Corynebacterium glutamicum, Brevibacterium flavum, Brevibacterium lactofermentum, Corynebacterium ammoniagenes, Corynebacterium pekinense, Brevibacterium sac char olyticum, Brevibacterium roseum и Brevibacterium thiogenitalis и т.п.

Согласно варианту реализации настоящего изобретения указанный микроорганизм, принадлежащий к роду Corynebacterium, представляет собой Corynebacterium glutamicum АТСС 13869.

Согласно варианту реализации настоящего изобретения указанный микроорганизм, принадлежащий к роду Corynebacterium, представляет собой Corynebacterium glutamicum YPGLU001, который обеспечивает высокие уровни продуцирования глутаминовой кислоты, и депонирован как штамм с названием: Corynebacterium glutamicum; латинское название: Corynebacterium glutamicum; штамм №: YPGLU001 в Китайском главном центре коллекций микробиологических культур («China General Microbiological Culture Collection Center»), сокращенно «CGMCC», адрес: No. 3, Yard 1, Beichen West Road, Chaoyang District, Beijing, 23 ноября 2020 г., под номером доступа: CGMCC №21220.

В соответствии с настоящим изобретением указанная бактерия может также иметь дополнительные улучшения, связанные с повышением уровней продуцирования L-глутаминовой кислоты, такие как усиление или снижение активности, или экспрессии генов глутаматдегидрогеназы, глутаминсинтетазы, аминотрансферазы глутамина - оксоглутаровой кислоты и т.п., или замена генов чужеродными генами.

Согласно второму аспекту настоящего изобретения предложены последовательность полинуклеотида, последовательность аминокислот, кодируемая указанной последовательностью полинуклеотида, рекомбинантный вектор, содержащий указанную последовательность полинуклеотида, и рекомбинантный штамм, содержащий указанную последовательность полинуклеотида.

В соответствии с настоящим изобретением указанная последовательность полинуклеотида включает полинуклеотид, кодирующий полипептид, содержащий последовательность аминокислот SEQ ID NO: 3, где аланин в положении 24 в последовательности заменен на другую аминокислоту.

В соответствии с настоящим изобретением предпочтительно аланин в положении 24 заменен на треонин.

В соответствии с настоящим изобретением, последовательность, представленная в SEQ ID NO: 4, представляет собой последовательность аминокислот после замены аланина на треонин в положении 24 в последовательности аминокислот, представленной в SEQ ID NO: 3.

В соответствии с настоящим изобретением предпочтительно указанная последовательность полинуклеотида, кодирующая полипептид, содержащий последовательность аминокислот SEQ ID NO: 3, содержит последовательность полинуклеотида согласно представленной в SEQ ID NO: 1.

Согласно варианту реализации настоящего изобретения указанная последовательность полинуклеотида образуется в результате мутации основания в положении 70 в последовательности полинуклеотида, представленной в SEQ ID NO: 1.

В соответствии с настоящим изобретением указанная мутация относится к изменению основания/нуклеотида в сайте, и способ осуществления мутации может представлять собой по меньшей мере один способ, выбранный из мутагенеза, сайт-направленного ПЦР-мутагенеза и/или гомологичной рекомбинации, и т.п. Согласно настоящему изобретению, предпочтительно используют сайт-направленный ПЦР-мутагенез и/или гомологичную рекомбинацию.

В соответствии с настоящим изобретением указанная мутация включает мутацию в положении 70 в последовательности полинуклеотида, представленной в SEQ ID NO: 1, с заменой гуанина (G) на аденин (А).

Согласно варианту реализации настоящего изобретения указанная последовательность полинуклеотида содержит последовательность полинуклеотида SEQ ID NO: 2.

В соответствии с настоящим изобретением указанная последовательность аминокислот содержит последовательность аминокислот SEQ ID NO: 4.

В соответствии с настоящим изобретением указанный рекомбинантный вектор конструируют путем введения последовательности полинуклеотида в плазмиду.

Согласно варианту реализации настоящего изобретения указанная плазмида представляет собой плазмиду pK18mobsacB.

Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения указанная плазмида представляет собой плазмиду pXMJ19.

В частности, указанные последовательность полинуклеотида и плазмида могут быть сконструированы в виде рекомбинантного вектора с помощью системы рекомбинации NEBuider.

В соответствии с настоящим изобретением указанный рекомбинантный штамм содержит указанную последовательность полинуклеотида.

Во варианте реализации настоящего изобретения исходный штамм для рекомбинантного штамма представляет собой Corynebacterium glutamicum CGMCC №21220.

Во варианте реализации настоящего изобретения исходный штамм для рекомбинантного штамма представляет собой АТСС 13869.

Согласно третьему аспекту настоящего изобретения также предложен способ конструирования рекомбинантного штамма, продуцирующего L-глутаминовую кислоту.

В соответствии с настоящим изобретением указанный способ конструирования включает следующий этап:

конструирование последовательности полинуклеотида гена BBD29_11265 дикого типа согласно SEQ ID NO: 1 у штамма-хозяина, чтобы вызвать мутацию основания в положении 70 с получением рекомбинантного штамма, содержащего кодирующий мутированный BBD29_11265 ген.

В соответствии со способом конструирования согласно настоящему изобретению указанное конструирование включает по меньшей мере что-либо одно из мутагенеза, сайт-направленного ПЦР-мутагенеза и/или гомологичной рекомбинации и т.п.

В соответствии со способом конструирования согласно настоящему изобретению мутация относится к изменению основания в положении 70 в SEQ ID NO: 1 с заменой гуанина (G) на аденин (А). В частности, последовательность полинуклеотида, содержащая кодирующий мутированный BBD29_11265 ген представлена в SEQ ID NO: 2.

Кроме того, указанный способ конструирования включает следующие этапы:

(1) конструирование последовательности нуклеотидов гена BBD29_11265 дикого типа, представленной в SEQ ID NO: 1, чтобы вызвать мутацию основания в положении 70 с получением последовательности полинуклеотида мутированного гена BBD29_11265;

(2) соединение мутированной последовательности полинуклеотида с плазмидой для конструирования рекомбинантного вектора; и

(3) введение указанного рекомбинантного вектора в штамм-хозяин с получением рекомбинантного штамма, содержащего кодирующий мутированный BBD29_11265 ген.

В соответствии со способом конструирования согласно настоящему изобретению указанный этап (1) включает конструирование гена BBD29_11265 с точечной мутацией: в соответствии с геномной последовательностью немодифицированного штамма, синтез двух пар праймеров P1, Р2 и Р3, Р4 для амплификации фрагмента гена BBD29_11265, и введение точечной мутации в ген BBD29_11265 дикого типа, SEQ ID NO: 1, с применением сайт-направленного ПЦР-мутагенеза с получением последовательности нуклеотидов гена BBD29_11265 с точечной мутацией, SEQ ID NO: 2, обозначенного как BBD29_11265^G70A.

Согласно варианту реализации настоящего изобретения геном немодифицированного штамма может происходить из штамма АТСС13869, геномную последовательность которого можно найти на вебсайте NCBI.

Согласно варианту реализации настоящего изобретения на этапе (1) используют следующие праймеры:

Согласно варианту реализации настоящего изобретения ПЦР-амплификацию осуществляют следующим образом: предварительная денатурация в течение 5 минут при 94°С, денатурация в течение 30 с при 94°С, ренатурация в течение 30 с при 52°С и удлинение в течение 45 с при 72°С в ходе 30 циклов, и избыточное удлинение в течение 10 мин при 72°С.

Согласно варианту реализации настоящего изобретения ПЦР-амплификацию с перекрывающимися праймерами осуществляют следующим образом: предварительная денатурация в течение 5 минут при 94°С, денатурация в течение 30 с при 94°С, ренатурация в течение 30 с при 52°С и удлинение в течение 90 с при 72°С в ходе 30 циклов, и избыточное удлинение в течение 10 мин при 72°С.

В соответствии со способом конструирования согласно настоящему изобретению этап (2) включает конструирование рекомбинантной плазмиды, включающей сборку выделенного и очищенного BBD29_11265^G70A с плазмидой pK18mobsacB с помощью системы рекомбинации NEBuider с получением рекомбинантной плазмиды.

В соответствии со способом конструирования согласно настоящему изобретению указанный этап (3) включает конструирование рекомбинантного штамма путем трансформации рекомбинантной плазмидой штамма-хозяина с получением рекомбинантного штамма.

Согласно варианту реализации настоящего изобретения трансформацию на этапе (3) осуществляют методом электротрансформации.

Согласно варианту реализации настоящего изобретения штамм-хозяин представляет собой АТСС 13869.

Согласно варианту реализации настоящего изобретения штамм-хозяин представляет собой Corynebacterium glutamicum CGMCC №21220.

Согласно варианту реализации настоящего изобретения указанная рекомбинация достигается путем гомологичной рекомбинации.

Согласно четвертому аспекту настоящего изобретения также предложен способ конструирования рекомбинантного штамма, продуцирующего L-глутаминовую кислоту.

В соответствии с настоящим изобретением указанный способ конструирования включает следующие этапы:

амплификация 5'- и 3'-фрагментов плеч гомологии BBD29_11265 и последовательности кодирующей области гена BBD29_11265 с областью его промотора, и введение гена BBD29_11265 или BBD29_11265^G70A в геном штамма-хозяина путем гомологичной рекомбинации, что позволит указанному штамму сверхэкспрессировать ген BBD29_11265 или BBD29_11265^G70A.

Согласно варианту реализации настоящего изобретения используют следующие праймеры для амплификации 5'-фрагментов плеч гомологии:

Согласно варианту реализации настоящего изобретения используют следующие праймеры для амплификации 3'-фрагментов плеча гомологии:

Согласно варианту реализации настоящего изобретения используют следующие праймеры для амплификации последовательности кодирующей области гена и области его промотора:

Согласно варианту реализации настоящего изобретения, опять же с вышеупомянутыми Р7/Р12 в качестве праймеров, осуществляют амплификацию с применением в качестве матриц смеси трех фрагментов, амплифицированного 5'- фрагмента плеча гомологии, 3'-фрагмента плеча гомологии и фрагмента последовательности кодирующей области гена и области его промотора, с получением интегрированного фрагмента плеча гомологии.

Согласно варианту реализации настоящего изобретения используемая ПЦР-система содержит: 10 × буфер Ex Taq Buffer: 5 мкл, смесь dNTP (2,5 мМ каждый): 4 мкл, М²⁺ (25 мМ): 4 мкл, праймеры (10 пМ): каждого по 2 мкл; и Ex Taq (5 Ед/мкл): 0,25 мкл, в общем объеме 50 мкл. ПЦР-амплификацию осуществляют следующим образом: предварительная денатурация в течение 5 минут при 94°С, денатурация в течение 30 с при 94°С, ренатурация в течение 30 с при 52°С, удлинение в течение 120 с при 72°С (30 циклов) и избыточное удлинение в течение 10 мин при 72°С.

Согласно варианту реализации настоящего изобретения используют систему рекомбинации NEBuider для сборки челночной плазмиды PK18mobsacB с интегрированным фрагментом плеча гомологии, с получением интегративной плазмиды.

Согласно варианту реализации настоящего изобретения штамма-хозяин трансфицируют указанной интегративной плазмидой для введения гена BBD29_11265 или BBD29_11265^G70A в геном штамма-хозяина путем гомологичной рекомбинации.

Согласно варианту реализации настоящего изобретения указанный штамм-хозяин представляет собой Corynebacterium glutamicum CGMCC №21220.

Согласно варианту реализации настоящего изобретения указанный штамм-хозяин представляет собой АТСС 13869.

Согласно варианту реализации настоящего изобретения указанный штамм-хозяин представляет собой штамм, несущий последовательность полинуклеотида, представленную в SEQ ID NO: 2.

Согласно пятому аспекту настоящего изобретения также предложен способ конструирования рекомбинантного штамма, продуцирующего L-глутаминовую кислоту.

В соответствии с настоящим изобретением указанный способ конструирования включает следующие этапы:

амплификация последовательности кодирующей области гена BBD29_11265 и области промотора, или последовательности кодирующей области гена BBD29_11265^G70A и области промотора, конструирование сверхэкспрессирующего плазмидного вектора и трансформация указанным вектором штамма-хозяина, что позволяет указанному штамму сверхэкспрессировать ген BBD29_11265 или BBD29_11265^G70A.

Согласно варианту реализации настоящего изобретения используют следующие праймеры для амплификации последовательности кодирующей области гена и области его промотора:

Согласно варианту реализации настоящего изобретения указанная ПЦР-система содержит: 10 × буфер Ex Taq Buffer: 5 мкл, смесь dNTP (2,5 мМ каждый): 4 мкл, Mg²⁺(25 мМ): 4 мкл, праймеры (10 пМ): по 2 мкл каждого, Ex Taq (5 Ед/мкл): 0,25 мкл, в общем объеме 50 мкл. ПЦР-амплификацию осуществляют следующим образом: предварительная денатурация в течение 5 минут при 94°С, денатурация в течение 30 с при 94°С, ренатурация в течение 30 с при 52°С, удлинение в течение 45 с при 72°С (30 циклов) и избыточное удлинение в течение 10 мин при 72°С.

Согласно варианту реализации настоящего изобретения систему рекомбинации NEBuider применяют для сборки челночной плазмиды pXMJ19 с фрагментом BBD29_11265 или BBD29_11265^G70A, имеющей собственные промоторы, с получением сверхэкспрессирующей плазмиды.

Согласно варианту реализации настоящего изобретения указанный штамм-хозяин представляет собой Corynebacterium glutamicum CGMCC №21220.

Согласно варианту реализации настоящего изобретения указанный штамм-хозяин представляет собой АТСС 13869.

Согласно варианту реализации настоящего изобретения указанный штамм-хозяин представляет собой штамм, несущий последовательность полинуклеотида, представленную в SEQ ID NO: 2.

Рекомбинантный штамм, предложенный согласно настоящему изобретению, может индивидуально применяться при ферментации для продуцирования L-глутаминовой кислоты, и может также применяться для продуцирования L-глутаминовой кислоты при гибридной ферментации с другими продуцирующими L-глутаминовую кислоту бактериями.

Согласно другому аспекту настоящего изобретения предложен способ получения L-глутаминовой кислоты, который включает культивирование бактерии; и получение L-глутаминовой кислоты из культуры.

Бактерия может быть культивирована в подходящей культуральной среде в условиях культивирования, известных в данной области техники. Культуральная среда может содержать: источник углерода, источник азота, следовые элементы и комбинацию перечисленного. При культивировании могут корректироваться значения рН культуры. Кроме того, может предотвращаться образование пузырьков при культивировании, например, с применением пеногасителя для предотвращения образования пузырьков. Кроме того, в культуру могут вводиться газы при культивировании. Указанные газы могут включать любые газы, способные поддерживать аэробные условия в культуре. При культивировании температура культуры может составлять от 20°С до 45°С. Продуцированная L-глутаминовая кислота может быть выделена из культуры, т.е. культуру обрабатывают серной кислотой или соляной кислотой и т.п., с последующим применением комбинации таких способов, как анионообменная хроматография, конденсация, кристаллизация и изоэлектрическое осаждение.

Согласно настоящему изобретению:

SEQ ID NO: 1: последовательность ORF BBD29_11265 дикого типа

SEQ ID NO: 2: последовательность ORF BBD29_11265^G70A

SEQ ID NO: 3: последовательность аминокислот белка, кодируемого BBD29_11265 дикого типа

SEQ ID NO: 4: последовательность аминокислот белка, кодируемого BBD29_11265A24T

BBD29_11265^A24T представляет собой BBD29_11265А24Т.

Согласно настоящему изобретению также предложен белок, обозначенный как белок BBD29_11265^A24T, отличающийся тем, что указанный белок может представлять собой любое из:

А1) белка, имеющего последовательность аминокислот SEQ ID NO: 4;

А2) белка, обладающего 80% или более идентичностью и имеющего ту же функцию, что и белок, указанный в А1), полученного путем осуществления в последовательности аминокислот, представленной в SEQ ID NO: 4, замены, и/или делеции, и/или добавления остатков аминокислот,

A3) слитого белка, имеющего ту же функцию, полученного путем присоединения метки к N-концу и/или С-концу белка по А1) или А2).

Согласно настоящему изобретению также предложена молекула нуклеиновой кислоты, обозначенная как BBD29_11265^G70A, отличающаяся тем, что указанная молекула нуклеиновой кислоты BBD29_11265^G70A может представлять собой любое из:

В1) молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей белок BBD29_11265^А24Т;

В2) молекулы ДНК, кодирующая последовательность которой представлена в SEQ ID NO: 2;

В3) молекулы ДНК, последовательность нуклеотидов которой представлена в SEQ ID NO: 2.

Молекула ДНК, представленная в SEQ ID NO: 2, представляет собой ген BBD29_11265^G70A согласно настоящему изобретению.

Молекула ДНК, представленная в SEQ ID NO: 2 (ген BBD29_11265^G70A), кодирует белок BBD29_11265^A24T, представленный в SEQ ID NO: 4.

Наличие треонина (Т) в положении 24 в последовательности аминокислот белка BBD29_11265^A24T (SEQ ID NO: 4) обусловлено мутацией аланина (А).

Согласно настоящему изобретению также предложен биоматериал, отличающийся тем, что указанный биоматериал может представлять собой любое из:

С1) экспрессионной кассеты, содержащей молекулу нуклеиновой кислоты BBD29_11265^G70A;

С2) рекомбинантный вектор, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты BBD29_11265^G70A, или рекомбинантный вектор, содержащий экспрессионную кассету по С1);

С3) рекомбинантный микроорганизм, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты BBD29_11265^G70A, или рекомбинантный микроорганизм, содержащий экспрессионную кассету по С1), или рекомбинантный микроорганизм, содержащий рекомбинантный вектор по С2).

Согласно настоящему изобретению также предложено любое из следующих применений по любому из D1) - D8):

F1) применение по любому из D1) - D8) для регуляции продуцирования L-глутаминовой кислоты у микроорганизма;

F2) применение по любому из D1) - D8) для конструирования генетически сконструированной бактерии для продуцирования L-глутаминовой кислоты;

F3) применение по любому из D1) - D8) для продуцирования L-глутаминовой кислоты;

где D1) - D8) представляет собой:

D1) белок BBD29_11265^А24Т;

D2) молекулу нуклеиновой кислоты BBD29_11265^G70A;

D3) биоматериал;

D4) молекулу ДНК, последовательность нуклеотидов которой представляет собой SEQ ID NO: 1;

D5) молекулу ДНК, обладающей идентичностью 90% или более молекуле ДНК и имеющую ту же функцию, что и молекула ДНК, которая представлена в SEQ ID NO: 1, полученную путем осуществления в последовательности нуклеотидов, представленной в SEQ ID NO: 1, модификации, и/или замены, и/или делеции, и/или добавления одного или нескольких нуклеотидов;

D6) экспрессионную кассету, содержащую молекулу ДНК по D4) или D5);

D7) рекомбинантный вектор, содержащий молекулу ДНК по D4) или D5), или рекомбинантный вектор, содержащий экспрессионную кассету по D6);

D8) рекомбинантный микроорганизм, содержащий молекулу ДНК по D4) или D5), или рекомбинантный микроорганизм, содержащий экспрессионную кассету по D6), или рекомбинантный микроорганизм, содержащий рекомбинантный вектор по D7).

Молекула ДНК, представленная в SEQ ID NO: 1, представляет собой ген BBD29_11265 согласно настоящему изобретению.

Молекула ДНК, представленная в SEQ ID NO: 1 (ген BBD29_11265), кодирует белок, представленный в SEQ ID NO: 3.

В настоящем документе «идентичность» относится к идентичности последовательностей аминокислот или последовательностей нуклеотидов. Международные сайты поиска гомологии в сети Интернет могут применяться для определения идентичности последовательностей аминокислот, например, страница BLAST на главной странице вебсайта NCBI. Например, в Advanced BLAST2.1 может быть использована программа blastp со значением параметра Expect value, установленным на 10, всеми фильтрами в режиме OFF, BLOSUM62 в качестве матрицы и значениями штрафа за введение пропуска, штрафа за удлинение пропуска на один остаток и коэффициента лямбда (Lambda ratio), установленными на 11, 1 и 0,85 (устанавливаемые по умолчанию значения), соответственно, и выполнен поиск идентичности между парой аминокислотных последовательностей для расчета, после чего можно получить значение идентичности (%).

Согласно настоящему документу идентичность 80% или более может представлять собой по меньшей мере 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичность.

Согласно настоящему документу идентичность 90% или более может может представлять собой по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичность.

Регуляция продуцирования L-глутаминовой кислоты у микроорганизма согласно описанию в настоящем документе может представлять собой повышение или понижение уровня накопления L-глутаминовой кислоты у микроорганизма (т.е. стимуляцию или ингибирование биосинтеза L-глутаминовой кислоты).

Согласно настоящему изобретению также предложен способ повышения продуцирования L-глутаминовой кислоты у микроорганизма, при этом указанный способ включает любое из:

Е1) повышения уровня экспрессии или содержания молекулы нуклеиновой кислоты BBD29_11265^G70A в целевом микроорганизме с получением микроорганизма, продуцирующего больше L-глутаминовой кислоты, чем целевой микроорганизм;

Е2) повышения уровня экспрессии или содержания молекулы ДНК по D4) или D5) в целевом микроорганизме с получением микроорганизма, продуцирующего больше L-глутаминовой кислоты, чем целевой микроорганизм;

Е3) осуществления мутации в молекуле ДНК, последовательность нуклеотидов которой представляет собой SEQ ID NO: 1, в целевом микроорганизме с получением микроорганизма, продуцирующего больше L-глутаминовой кислоты, чем целевой микроорганизм.

Согласно описанному выше способу указанная мутация может представлять собой точечную мутацию, т.е. мутацию одного нуклеотида.

Согласно описанному выше способу указанная точечная мутация может представлять собой мутацию остатка аланина в положении 24 в последовательности аминокислот, кодируемой молекулой ДНК, представленной в SEQ ID NO: 1, на остаток другой аминокислоты.

Согласно описанному выше способу указанная точечная мутация может представлять собой мутацию аланина в положении 24 в последовательности аминокислот, кодируемой молекулой ДНК, представленной в SEQ ID NO: 1, на треонин, что обеспечивает мутированный белок BBD29_11265^A24T, последовательность аминокислот которого представляет собой SEQ ID NO: 4.

Указанная мутация относится к изменению одного или нескольких оснований в гене в результате сайт-направленной мутации, что приводит к изменению аминокислотного состава соответствующего белка, с получением таким образом нового белка, или обеспечением новой функции исходного белка, то есть представляет собой сайт-направленную мутацию генов. Методики осуществления сайт-направленных мутаций генов, таких как опосредованный олигонуклеотидными праймерами сайт-направленный мутагенез, ПЦР-опосредо ванный сайт-направленный мутагенез или кассетный мутагенез хорошо известны специалистам в данной области техники.

Точечная мутация согласно описанию в настоящем документе может представлять собой замену одного основания, инсерцию одного основания или делецию одного основания, и в особенности замену одного основания. Замена одного основания может представлять собой аллельную замену.

Указанная точечная мутация может заключаться в осуществлении модификации нуклеиновой кислоты с заменой гуанина (G) в положении 70 гена BBD29_11265 (SEQ ID NO: 1).

В частности, указанная точечная мутация может заключаться в осуществлении мутации гуанина (G) в положении 70 гена BBD29_11265 (SEQ ID NO: 1) на аденин (А) с получением молекулы ДНК, представленной в SEQ ID NO: 2.

В настоящем документе рекомбинантный вектор может представлять собой, в частности, рекомбинантный вектор pK18-BBD29_11265^G70A, PK18mobsacB-BBD29_11265, PK18mobsacB-BBD29_11265^G70A, pXMJ19-BBD29_11265 или pXMJ19-BBD29_11265^G70A.

Рекомбинантный вектор pK18-BBD29_11265^G70A представляет собой рекомбинантный вектор, полученный путем замены фрагмента (фрагмента малого размера) между сайтами распознавания Xbal I и BamH I в векторе pK18mobsacB на фрагмент ДНК, представленный положениями 37-1495 SEQ ID NO: 29 в перечне последовательностей, при сохранении в неизмененном виде других последовательностей вектора pK18mobsacB. Рекомбинантный вектор pK18-BBD29_11265^G70A содержит молекулу ДНК, представленную положениями 1-273 в мутированном гене BBD29_11265^G70A, представленном в SEQ ID NO: 2.

Рекомбинантный вектор PK18mobsacB-BBD29_11265 применяют для интеграции экзогенного гена BBD29_11265 в хромосому хозяина для сверхэкспрессии гена BBD29_11265 дикого типа у бактерии-продуцента. Рекомбинантный вектор pK18mobsacB-BBD29_11265 представляет собой рекомбинантный вектор, полученный путем замены фрагмента (фрагмента малого размера) между сайтами распознавания Xbal I и BamH I в векторе pK18mobsacB на фрагмент ДНК, представленный положениями 37-1966 SEQ ID NO: 30 в перечне последовательностей, при сохранении в неизмененном виде других последовательностей вектора pK18mobsacB.

Рекомбинантный вектор PK18mobsacB-BBD29_11265^G70A применяют для интеграции экзогенного гена BBD29_11265^G70A в хромосому хозяина для сверхэкспрессии мутантного типа гена BBD29_11265^G70A у бактерии-продуцента. Рекомбинантный вектор pK18mobsacB-BBD29_11265^G70A представляет собой рекомбинантный вектор, полученный путем замены фрагмента (фрагмента малого размера) между сайтами распознавания Xbal I и BamH I в векторе pK18mobsacB на фрагмент ДНК, представленный положениями 37-1966 SEQ ID NO: 31 в перечне последовательностей, при сохранении в неизмененном виде других последовательностей вектора pK18mobsacB.

Рекомбинантный вектор pXMJ19-BBD29_11265 применяют для экспрессии с помощью плазмиды экзогенного гена BBD29_11265 вне хромосомы для сверхэкспрессии гена BBD29_11265 дикого типа у бактерии-продуцента. Рекомбинантный вектор pXMJ19-BBD29_11265 представляет собой рекомбинантный вектор, полученный путем замены фрагмента (фрагмента малого размера) между сайтами распознавания EcoR I и Kpn I в векторе pXMJ19 на фрагмент ДНК, представленный положениями 37 486 SEQ ID NO: 32 в перечне последовательностей, при сохранении в неизмененном виде других последовательностей вектора pXMJ19.

Рекомбинантный вектор pXMJ19-BBD29_11265^G70A применяют для экспрессии с помощью плазмиды экзогенного гена BBD29_11265^G70A вне хромосомы для сверхэкспрессии мутантного типа гена BBD29_11265^G70A у бактерии-продуцента. Рекомбинантный вектор pXMJ19-BBD29_11265^G70A представляет собой рекомбинантный вектор, полученный путем замены фрагмента (фрагмента малого размера) между сайтами распознавания EcoR I и Kpn I в векторе pXMJ19 на фрагмент ДНК, представленный положениями 37-486 SEQ ID NO: 33 в перечне последовательностей, при сохранении в неизмененном виде других последовательностей вектора pXMJ19.

Все рекомбинантные векторы из pK18-BBD29_11265^G70A, PK18mobsacB-BBD29_11265, PK18mobsacB-BBD29_11265^G70A, pXMJ19-BBD29_11265 и pXMJ19-BBD29_11265^G70A включены в заявленный объем настоящего изобретения.

В настоящем документе рекомбинантный микроорганизм может представлять собой, в частности, рекомбинантную бактерию YPG-013, YPG-014, YPG-015, YPG-016 или YPG-017.

Рекомбинантная бактерия YPG-013 представляет собой рекомбинантную бактерию, полученную путем трансформации рекомбинантным вектором pK18-BBD29_11265^G70A Corynebacterium glutamicum CGMCC №21220, и указанная рекомбинантная бактерия YPG-013 содержит мутированный ген BBD29_11265^G70A, представленный в SEQ ID NO: 2.

Рекомбинантная бактерия YPG-014 содержит двухкопийный ген BBD29_11265, представленный в SEQ ID NO: 1; рекомбинантная бактерия, содержащая двухкопийный ген BBD29_11265, способна значимо и устойчиво повышать уровень экспрессии гена BBD29_11265. Рекомбинантная бактерия YPG-014 представляет собой сконструированную бактерию, сверхэкспрессирующую ген BBD29_11265 дикого типа из генома.

Рекомбинантная бактерия YPG-015 содержит мутированный ген BBD29_11265^G70A, представленный в SEQ ID NO: 2; указанная рекомбинантная бактерия YPG-015 представляет собой сконструированную бактерию, сверхэкспрессирующую мутантный тип гена BBD29_11265^G70A из генома.

Рекомбинантная бактерия YPG-016 содержит двухкопийный ген BBD29_11265, представленный в SEQ ID NO: 1; указанная рекомбинантная бактерия YPG-016 представляет собой сконструированную бактерию, сверхэкспрессирующую ген BBD29_11265 дикого типа на плазмиде, т.е. сверхэкспрессия происходит вне хромосомы с помощью плазмиды pXMJ19-BBD29_11265.

Рекомбинантная бактерия YPG-017 содержит мутированный ген BBD29_11265^G70A, представленный в SEQ ID NO: 2; указанная рекомбинантная бактерия YPG-017 представляет собой сконструированную бактерию, сверхэкспрессирующую мутантный тип гена BBD29_11265^G70A на плазмиде, т.е. сверхэкспрессия происходит вне хромосомы с помощью плазмиды pXMJ19-BBD29_11265^G70A.

Всерекомбинантные бактерии из YPG-013, YPG-014, YPG-015, YPG-016 и YPG-017 входят в заявленный объем настоящего изобретения.

Согласно настоящему изобретению также предложен способ конструирования рекомбинантного микроорганизма, при этом указанный способ включает по меньшей мере что-либо одно из:

F1) введение молекулы нуклеиновой кислоты BBD29_11265^G70A в целевой микроорганизм с получением рекомбинантного микроорганизма;

F2) введения молекулы ДНК, представленной в SEQ ID NO: 1, в целевой микроорганизм с получением рекомбинантного микроорганизма;

F3) редактирования молекулы ДНК, представленной в SEQ ID NO: 1, с использованием средства редактирования генов (такого как редактирование генов с изменением одного основания) для введения молекулы ДНК, представленной в SEQ ID NO: 2, в целевой микроорганизм.

Указанное введение может быть представлено трансформацией бактерии-хозяина трансформация вектором, несущим молекулу ДНК согласно настоящему изобретению, любыми известными способами трансформации, такими как способ химической трансформации или способ электротрансформации. Введенная молекула ДНК может быть однокопийной или многокопийной. Введение может быть представлено интеграцией экзогенного гена в хромосому хозяина, или экспрессией вне хромосомы с помощью плазмиды.

Согласно настоящему изобретению также предложен способ получения L-глутаминовой кислоты, при этом указанный способ включает продуцирование L-глутаминовой кислоты любым из рекомбинантных микроорганизмов согласно описанию в настоящем документе.

Описанный выше способ может представлять собой получение L-глутаминовой кислоты ферментативным способом, а рекомбинантный микроорганизм может относиться к роду Corynebacterium, и в частности, представлять собой Corynebacterium glutamicum и его варианты.

Информация о депонировании: Название штамма: Corynebacterium glutamicum; Латинское название: Corynebacterium glutamicum; штамм №: YPGLU001; Депозитарное учреждение: Китайский главный центр коллекций микробиологических культур, сокращенно CGMCC; адрес: No. 3, Yard 1, Beichen West Road, Chaoyang District, Beijing; Дата депонирования: 23 ноября 2020 г.; номер доступа в депозитарном центре: CGMCC №21220.

Наилучшие способы реализации изобретения

Настоящее изобретение будет подробно описано ниже на конкретных вариантах реализации; указанные примеры приведены исключительно для иллюстрации настоящего изобретения, но не для ограничения объема настоящего изобретения. Примеры, представленные ниже, могут применяться в качестве руководства для дальнейшего улучшения специалистами в данной области техники, и не подразумевают каких-либо ограничений настоящего изобретения.

Если конкретным образом не указано иное, все экспериментальные способы в приведенных ниже примерах представляют собой обычные способы, которые осуществляют в соответствии с методиками или условиями, описанными в литературе, относящейся к данной области техники, или в соответствии с инструкциями по применению продуктов. Если конкретным образом не указано иное, материалы и реагенты, используемые в приведенных ниже примерах, могут быть коммерчески доступными.

В приведенных ниже примерах состав основной среды, используемой для культивирования штамма, одинаковый, а сахарозу, канамицин или хлорамфеникол добавляют в состав основной среды по мере необходимости. Состав основной среды приведен в таблице 1:

Corynebacterium glutamicum YPGLU001 CGMCC №21220 в примерах ниже был депонирован в Китайском главном центре коллекций микробиологических культур (сокращенно CGMCC, адрес: No. 3, Yard 1, Beichen West Road, Chaoyang District, Beijing, Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences) 23 ноября 2020 г. под номером доступа CGMCC №21220. Corynebacterium glutamicum YPGLU001 также известен как Corynebacterium glutamicum CGMCC №21220.

Пример 1. Конструирование вектора для трансформации pK18-BBD29_11265^G70A, содержащего кодирующую область гена BBD29_11265 с точечной мутацией

В соответствии с последовательностью генома Corynebacterium glutamicum АТСС13869, опубликованной в базе NCBI, разрабатывали и синтезировали два пары праймеров для амплификации последовательности кодирующей области гена BBD29_11265, и вводили точечную мутацию в штамм Corynebacterium glutamicum CGMCC №21220 путем аллельной замены (подтверждено соответствие кодирующей области гена BBD29_11265 на хромосоме у указанного штамма области штамма АТСС13869 при секвенировании). Последовательность аминокислот, соответствующая кодируемому белку, представлена в SEQ ID NO: 3, при замене гуанина (G) в положении 70 последовательности нуклеотидов гена BBD29_11265 на аденин (А) (SEQ ID NO: 2: BBD29_11265^G70A), соответственно, происходит замена аланина (А) в положении 24 в последовательности аминокислот, соответствующей кодируемому белку, на треонин (Т) (SEQ ID NO: 4: BBD29_11265^А24Т).

Точечная мутация представляет собой мутацию гуанина (G) в положении 70 в последовательности нуклеотидов гена BBD29_11265 (SEQ ID NO: 1) на аденин (А), обеспечивающую молекулу ДНК, представленную в SEQ ID NO: 2 (мутированный ген BBD29_11265, обозначенная как BBD29_11265^G70A).

При этом молекула ДНК, представленная в SEQ ID NO: 1, кодирует белок, имеющий последовательность аминокислот SEQ ID NO: 3 (белок обозначен как белок BBD29_11265).

Молекула ДНК, представленная в SEQ ID NO: 2, кодирует мутантный белок, последовательность аминокислот которого представлена SEQ ID NO: 4 (указанный мутантный белок обозначен как BBD29_11265^A24T). Наличие треонина (Т) в положении 24 в последовательности аминокислот мутантного белка BBD29_11265^A24T (SEQ ID NO: 4) обусловлено мутацией аланина (А).

Методику ПЦР с перекрывающимися праймерами используют для сайт-направленного мутагенеза генов со следующими разработанными праймерами (синтезированы Invitrogen Corporation, Шанхай). Основание, где происходит мутация, выделено жирным шрифтом:

Способ конструирования: используя Corynebacterium glutamicum АТСС13869 в качестве матрицы, осуществляют ПЦР-амплификацию с соответствующими праймерами P1, Р2 и Р3, Р4 с получением двух фрагментов ДНК кодирующей области гена BBD29_11265, каждый из которых содержит мутированное основание и имеет размер 775 п.о. и 788 п.о., соответственно (BBD29_11265 Up и BBD29_11265 Down).

ПЦР-система: 10 × буфер Ex Taq Buffer: 5 мкл, смесь dNTP (каждый 2,5 мМ): 4 мкл, Mg²⁺ (25 мМ): 4 мкл, праймеры (10 пМ): по 2 мкл каждого, Ex Taq (5 Ед/мкл): 0,25 мкл, в общем объеме 50 мкл.

ПЦР-амплификацию осуществляют путем предварительной денатурации в течение 5 минут при 94°С, денатурации в течение 30 с при 94°С, ренатурации в течение 30 с при 52°С, удлинения в течение 45 с при 72°С в ходе 30 циклов и избыточного удлинения в течение 10 мин при 72°С, с получением двух фрагментов ДНК, содержащих кодирующую область гена BBD29_11265, каждый из который имеет размер 775 п.о. и 788 п.о. (BBD29_11265 Up и BBD29_11265 Down).

Указанные два фрагмента ДНК (BBD29_11265 Up и BBD29_11265 Down) выделяют посредством электрофореза на агарозном геле и очищают, после чего извлекают целевые полосы извлекают. Указанные два фрагмента ДНК затем используют в качестве матрицы с Р1 и Р4 в качестве праймеров для ПЦР-амплификации с перекрывающимися праймерами с получением фрагмента длиной 1533 п.о., обозначенного как BBD29_11265 Up-Down (представленного в SEQ ID NO: 29). В молекуле ДНК, представленной в SEQ ID NO: 29, положения 693-965 представляют собой фрагмент гена BBD29_11265^G70A с сайтом мутации (т.е. положения 1-273 SEQIDNO: 2).

ПЦР-система с перекрывающимися праймерами: 10 × буфер Ex Taq Buffer: 5 мкл, смесь dNTP (каждый 2,5 мМ): 4 мкл, Mg²⁺(25 мМ): 4 мкл, праймеры (10 пМ): по 2 мкл каждого, Ex Taq (5 Ед/мкл): 0,25 мкл, в общем объеме 50 мкл.

ПЦР-амплификацию с перекрывающимися праймерами осуществляют путем предварительной денатурации в течение 5 минут при 94°С, денатурации в течение 30 с при 94°С, ренатурации в течение 30 с при 52°С, удлинения в течение 90 с при 72°С в ходе 30 циклов и избыточного удлинения в течение 10 мин при 72°С.

Фрагмент ДНК BBD29_11265 Up-Down (SEQ ID NO: 29) содержит сайт мутации для введения модификации нуклеиновой кислоты в положении 70 кодирующей области гена BBD29_11265 у Corynebacterium glutamicum CGMCC №21220, в частности, изменения гуанина (G) в положении 70 кодирующей области гена BBD29_11265 штамма Corynebacterium glutamicum CGMCC №21220 на аденин (А), в конечном итоге обуславливающего изменение аминокислоты в положении 24 кодируемого белка с аланина (А) на треонин (Т). После расщепления плазмиды pK18mobsacB (приобретена у Addgene Corporation) Xba I /BamH I, BBD29_11265^G70A и линеаризированную плазмиду pK18mobsacB выделяют посредством электрофореза на агарозном геле и очищают, с последующей сборкой с применением системы рекомбинации NEBuider, получая вектор pK18-BBD29_11265^G70A, плазмиду, содержащую маркер устойчивости к канамицину. При этом вектор pK18-BBD29_11265^G70A отправляют для секвенирования и идентификации в компанию, осуществляющую секвенирование, а вектор pK18-BBD29 _11265^G70A, содержащий корректную точечную мутацию (G-A), отправляют на хранение.

В частности, фрагмент ДНК (BBD29_11265 Up-Down) очищают после выделения посредством электрофореза на агарозном геле, с последующим лигированием в плазмиду pK18mobsacB (приобретена у Addgene Corporation, расщеплена Xbal I /BamH I), очищенную после расщепления ферментами (Xbal I/ BamH I) в течение 30 минут при 50°С с применением фермента NEBuilder (приобретен у NEB Corporation). Выросший одиночный клон после трансформации продуктом лигирования DH5a (приобретены у TAKARA Corporation), подвергают ПНР-идентификации для обнаружения положительного рекомбинантного вектора pK18-BBD29_11265^G70A, содержащего маркер устойчивости к канамицину (Kan^r). Корректно расщепленный рекомбинантный вектор pK18-BBD29_11265^G70A отправляют для секвенирования и идентификации в компанию, осуществляющую секвенирование, тогда как рекомбинантный вектор pK18-BBD29_11265^G70A содержащий корректную точечную мутацию (G-A), отправляют на хранение.

Рекомбинантный вектор pK18-BBD29_11265^G70A представляет собой рекомбинантный вектор, полученный путем замены фрагмента (фрагмента малого размера) между сайтами распознавания Xbal I и BamH I в векторе pK18mobsacB на фрагмент ДНК, представленный положениями 37-1495 SEQ ID NO: 29 в перечне последовательностей, при сохранении в неизмененном виде других последовательностей вектора pK18mobsacB.

Рекомбинантный вектор pK18-BBD29_l 1265^G70A содержит молекулу ДНК, представленную положениями 1-273 в мутированном гене BBD29_11265^G70A, представленном в SEQ ID NO: 2

Пример 2. Конструирование сконструированного штамма, содержащего BBD29_11265^G70A с точечной мутацией

Способ конструирования: Плазмидой pK18-BBD29_11265^G70A после аллельной замены согласно примеру 1 электротрансформируют Corynebacterium glutamicum CGMCC №21220 для культивирования в культуральной среде. См. в таблице 1 ингредиенты среды и условия культивирования. Каждую из выросших моноколоний идентифицируют с применением праймера Р1 и универсального праймера M13R для определения положительного штамма по полосе, соответствующей размеру приблизительно 1560 п.о., полученной при амплификации. Положительный штамм культивируют на культуральной среде, содержащей 15% сахарозы, и выросшие моноколонии культивируют на культуральных средах с канамицином и без канамицина, соответственно. Штаммы, растущие на культуральной среде без канамицина и не растущие на культуральной среде с канамицином, выбирают для дальнейшей идентификации с помощью ПЦР со следующими праймерами (синтезированы Invitrogen Corporation, Шанхай):

Описанные выше полученные с помощью ПЦР амплифицированные продукты подвергают денатурации при высокой температуре и в ледяной бане, после чего проводят SSCP-электрофорез (с амплифицированным фрагментом плазмиды pK18-BBD29_11265^G70A в качестве положительного контроля, амплифицированным фрагментом АТСС13869 в качестве отрицательного контроля, и водой в качестве холостого контроля). См. в таблице 2 описание подготовки ПААГ для SSCP-электрофореза и условий электрофореза. Поскольку фрагменты отличаются структурой, их локализация при электрофорезе будет разной. Соответственно, штамм, характеризующийся успешной аллельной заменой, представляет собой такой штамм, локализация фрагмента которого при электрофорезе не совпадает с локализацией отрицательного контрольного фрагмента, и совпадает с локализацией положительного контрольного фрагмента. Праймеры Р5 и Р6 используют также для ПЦР-амплификации целевого фрагмента штамма, характеризующегося успешной аллельной заменой, который затем лигируют в вектор PMD19-T для секвенирования. Используя выравнивание последовательностей для мутированной последовательности оснований, подтверждают успешность аллельной замены у указанного штамма, который обозначен как YPG-013.

Рекомбинантная бактерия YPG-013 содержит мутированный ген BBD29_11265^G70A, представленный в SEQ ID NO: 2.

Пример 3. Конструирование сконструированного штамма со сверхэкспрессируемым геном BBD29_11265 или BBD29_11265^G70A из генома.

Для дополнительного изучения и подтверждения того, что сверхэкспрессия гена BBD29_11265 дикого типа или производного мутантного гена BBD29_11265^G70A у бактерии-продуцента может повышать продуцирование L-глутаминовой кислоты, экзогенный ген интегрируют в хромосому хозяина для конструирования сконструированного штамма с геном BBD29_11265 или геном BBD29_11265^G70A, сверхэкспрессируемым из генома.

В соответствии с последовательностью генома Corynebacterium glutamicum АТСС13869, опубликованной в базе NCBI, разрабатывали и синтезировали три пары праймеров для амплификации 5'- и 3'-фрагментов плеч гомологии, а также последовательность кодирующей области гена BBD29_11265 и область промотора для введения гена BBD29_11265 или BBD29_11265^G70A в штамм Corynebacterium glutamicum CGMCC №21220 путем гомологичной рекомбинации.

Разработаны следующие праймеры (синтезированы Invitrogen Corporation, Шанхай):

Способ конструирования: Используя Corynebacterium glutamicum АТСС13869 или YPG-013, соответственно, в качестве матрицы, осуществляют ПЦР-амплификацию с праймерами Р7/Р8, Р9/Р10 и Р11/Р22, соответственно, с получением 5'-фрагмента плеча гомологии длиной приблизительно 806 п.о., фрагмента кодирующей области гена BBD29_11265 и области промотора длиной 490 п.о., или фрагмента кодирующей области гена BBD29_11265^G70A и области промотора длиной приблизительно 490 п.о., и 3'-фрагмента плеча гомологии длиной приблизительно 788 п.о. Кроме того, с применением Р7/Р12 в качестве праймеров осуществляют амплификацию со смесью трех описанных выше амплифицированных фрагментов в качестве матрицы с получением единых фрагментов плеч гомологии 1 и 2 (единый фрагмент плеча гомологии 1 длиной 2004 п.о., согласно SEQ ID NO: 30; и единый фрагмент плеча гомологии 2 длиной 2004 п.о., согласно SEQ ID NO: 31). После завершения ПЦР-реакции осуществляют электрофорез амплифицированных продуктов для выделения требуемого фрагмента ДНК длиной приблизительно 2004 п.о. с применением набора с колонкой для выделения ДНК на геле (TIANGEN), который лигируют, используя систему рекомбинации NEBuider, в челночную плазмиду PK18mobsacB, расщепленную Xba I и выделенную с получением интегративной плазмиды (т.е. рекомбинантного вектора) PK18mobsacB-BBD29_11265 или PK18mobsacB-BBD29_11265^G70A. Указанная плазмида содержит маркер устойчивости к канамицину, благодаря чему путем скрининга с канамицином может быть получен рекомбинантный штамм, содержащий интегрированную в геном плазмиду.

Рекомбинантный вектор pK18mobsacB-BBD29_11265 представляет собой рекомбинантный вектор, полученный путем замены фрагмента (фрагмента малого размера) между сайтами распознавания Xbal I и BamH I в векторе pK18mobsacB на фрагмент ДНК, представленный положениями 37-1966 SEQ ID NO: 30 в перечне последовательностей, при сохранении в неизмененном виде других последовательностей вектора pK18mobsacB.

Рекомбинантный вектор pK18mobsacB-BBD29 _11265^G70A представляет собой рекомбинантный вектор, полученный путем замены фрагмента (фрагмента малого размера) между сайтами распознавания Xbal I и BamH I в векторе pK18mobsacB на фрагмент ДНК, представленный положениями 37-1966 SEQ ID NO: 31 в перечне последовательностей, при сохранении в неизмененном виде других последовательностей вектора pK18mobsacB.

ПЦР-система: 10 × буфер Ex Taq Buffer: 5 мкл, смесь dNTP (каждый 2,5 мМ): 4 мкл, Mg²⁺ (25 мМ): 4 мкл, праймеры (10 пМ): по 2 мкл каждого, Ex Taq (5 Ед/мкл): 0,25 мкл, в общем объеме 50 мкл.

ПЦР-амплификацию осуществляют путем предварительной денатурации в течение 5 минут при 94°С, денатурации в течение 30 с при 94°С, ренатурации в течение 30 с при 52°С и удлинения в течение 120 с при 72°С (30 циклов) и избыточного удлинения в течение 10 мин при 72°С.

Каждую из этих двух интегративных плазмид (PK18mobsacB-BBD29_11265 и PK18mobsacB-BBD29_11265^G70A) вводят в штамм Corynebacterium glutamicum CGMCC №21220 путем электротрансформации, и осуществляют ПЦР-идентификацию выросших моноколоний с праймерами Р13/Р14 для обнаружения положительного штамма, содержащего фрагмент длиной приблизительно 1190 п.о., полученный при ПЦР-амплификации, тогда как штамм, не содержащий каких-либо амплифицированных этим способом фрагментов, представляет собой исходный штамм. При скрининге с 15% сахарозы положительный штамм культивируют на культуральных средах с канамицином и без канамицина, соответственно, и штаммы, растущие на культуральной среде без канамицина и не растущие на культуральной среде с канамицином подвергают дальнейшей ПНР с праймерами Р15/Р16 для идентификации. Штамм с амплифицированным этим способом фрагментом длиной приблизительно 1200 п.о. представляет собой штамм с геном BBD29_11265 или BBD29_11265^G70A, интегрированным в геном Corynebacterium glutamicum CGMCC №21220, обозначенный как YPG-014 (без точечной мутации) и YPG-015 (с точечной мутацией).

Рекомбинантная бактерия YPG-014 содержит двухкопийный ген BBD29_11265 согласно SEQ ID NO: 1; указанная рекомбинантная бактерия, содержащая двухкопийный ген BBD29_11265, способна значимо и устойчиво повышать уровень экспрессии гена BBD29_11265. Рекомбинантная бактерия YPG-014 представляет собой сконструированную бактерию, сверхэкспрессирующую ген BBD29_11265 дикого типа из генома.

Рекомбинантная бактерия YPG-015 содержит мутированный ген BBD29_11265^G70A согласно SEQ ID NO: 2; указанная рекомбинантная бактерия YPG-015 представляет собой сконструированную бактерию, сверхэкспрессирующую мутантный ген BBD29_11265^G70A из генома.

Праймеры для ПЦР-идентификации представлены ниже:

Пример 4. Конструирование сконструированного штамма, сверхэкспрессирующего ген BBD29_11265 или BBD29_11265^G70A с плазмиды

В соответствии с последовательностью генома Corynebacterium glutamicum АТСС13869, опубликованной в базе NCBI, разрабатывали и синтезировали пару праймеров для амплификации последовательности кодирующей области гена BBD29_11265 и области промотора. Разработаны следующие праймеры (синтезированы Invitrogen Corporation, Шанхай):

Способ конструирования: Используя YPG-0014 или YPG-0013, соответственно, в качестве матрицы, осуществляют ПЦР-амплификацию с праймерами Р17/Р18 с получением фрагмента гена BBD29_11265 и его промотора длиной 520 п.о. (SEQ ID NO: 32) или фрагмента гена BBD29_11265^G70A и его промотора длиной 520 п.о. (SEQ ID NO: 33). Осуществляют электрофорез амплифицированных продуктов для выделения требуемого фрагмента ДНК длиной 520 п.о. с применением набора с колонкой для выделения ДНК на геле, который лигируют с использованием системы рекомбинации NEBuider в челночную плазмиду рХМЛ9, расщепленную EcoR I, и выделяют, получая сверхэкспрессирующую плазмиду (т.е. рекомбинантный вектор) pXMJ19-BBD29_11265 или pXMJ19-BBD29_11265^G70A. Указанная плазмида содержит а маркер устойчивости к хлорамфениколу, и трансформация штамма плазмидой может быть достигнута при скрининге с хлорамфениколом.

Рекомбинантный вектор pXMJ19-BBD29_11265 представляет собой рекомбинантный вектор, полученный путем замены фрагмента (фрагмента малого размера) между сайтами распознавания EcoR I и Kpn I в векторе рХМ119 на фрагмент ДНК, представленный положениями 37-486 SEQ ID NO: 32 в перечне последовательностей, при сохранении в неизмененном виде других последовательностей вектора pXMJ19.

Рекомбинантный вектор pXMJ19-BBD29_11265^G70A представляет собой рекомбинантный вектор, полученный путем замены фрагмента (фрагмента малого размера) между сайтами распознавания EcoR I и Kpn I в векторе pXMJ19 на фрагмент ДНК, представленный положениями 37-486 SEQ ID NO: 33 в перечне последовательностей, при сохранении в неизмененном виде других последовательностей вектора pXMJ19.

ПЦР-система: 10 × буфер Ex Taq Buffer: 5 мкл, смесь dNTP (каждый 2,5 мМ): 4 мкл, Mg²⁺ (25 мМ): 4 мкл, праймеры (10 пМ): по 2 мкл каждого, Ex Taq (5 Ед/мкл): 0,25 мкл, в общем объеме 50 мкл.

ПЦР-амплификацию осуществляют путем предварительной денатурации в течение 5 минут при 94°С, денатурации в течение 30 с при 94°С, ренатурации в течение 30 с при 52°С и удлинения в течение 45 с при 72°С (30 циклов), и избыточного удлинения в течение 10 мин при 72°С.

Каждую из двух плазмид (pXMJ19-BBD29_11265 и pXMJ19-BBD29_11265^G70A) вводят в штамм Corynebacterium glutamicum CGMCC №21220 путем электротрансформации, и осуществляют ПЦР-идентификацию выросших моноколоний с праймерами M13R (-48) и Р18 для обнаружения трансформированного штамма, содержащего фрагмент длиной приблизительно 569 п.о., полученный при ПНР-амплификации, обозначенного как YPG-016 (без точечной мутации) и YPG-017 (с точечной мутацией).

Рекомбинантная бактерия YPG-016 содержит двухкопийный ген BBD29_11265 согласно SEQ ID NO: 1; рекомбинантная бактерия YPG-016 представляет собой сконструированную бактерию, сверхэкспрессирующую ген BBD29_11265 дикого типа на плазмиде, т.е. сверхэкспрессия происходит вне хромосомы с плазмиды pXMJ19-BBD29_11265.

Рекомбинантная бактерия YPG-017 содержит мутированный ген BBD29_11265^G70A согласно SEQ ID NO: 2; рекомбинантная бактерия YPG-017 представляет собой сконструированную бактерию, сверхэкспрессирующую мутантный ген BBD29_11265^G70A на плазмиде, т.е. сверхэкспрессия происходит вне хромосомы с плазмиды pXMJ19-BBD29_11265^G70A.

Пример 5. Конструирование сконструированного штамма с делетированным в геноме геном BBD29_11265.

В соответствии с последовательностью генома Corynebacterium glutamicum АТСС13869, опубликованной в базе NCBI, синтезируют две пары праймеров для амплификации фрагментов на обоих концах кодирующей области гена BBD29_11265, в виде 5'- и 3'-фрагментов плеч гомологии. Разработаны следующие праймеры (синтезированы Invitrogen Corporation, Шанхай):

Способ конструирования: Используя в качестве матрицы Corynebacterium glutamicum АТСС13869, осуществляют ПЦР-амплификацию с праймерами Р19/Р20 и Р21/Р22, соответственно, с получением 5'-фрагмента плеча гомологии длиной 773 п.о. и 3'-фрагмента плеча гомологии длиной 778 п.о. Кроме того, Р19/Р22 используют в качестве праймеров для ПЦР с перекрывающимися праймерами с получением единого фрагмента плеча гомологии длиной 1511 п.о. После завершения ПЦР-реакции осуществляют электрофорез амплифицированных продуктов для выделения требуемого фрагмента ДНК длиной 1511 п.о. с применением набора с колонкой для выделения ДНК на геле, который лигируют, с помощью системы рекомбинации NEBuider, в челночную плазмиду, плазмиду pk18mobsacB, расщепленную Xba I и BamH I и выделенную с получением нокаутной плазмиды. Указанная плазмида содержит маркер устойчивости к канамицину.

Указанной нокаутной плазмидой электротрансформируют штамм Corynebacterium glutamicum CGMCC №21220, и осуществляют ПЦР-идентификацию выросших моноколоний, в каждом случае со следующими праймерами (синтезированы bivitrogen Corporation, Шанхай):

Штамм с полосами, соответствующими длине 1437 п.о. и 1710 п.о., амплифицированными в ходе описанной выше ПЦР-амплификации, представляет собой положительный штамм, тогда как штамм с единственной полосой, соответствующей длине 1710 п.о., амплифицированной этим способом, представляет собой исходный штамм. При скрининге на культуральной среде с 15% сахарозы положительный штамм культивируют на культуральных средах с канамицином и без канамицина, соответственно, и выбирают штаммы, растущие на культуральной среде без канамицина и не растущие на культуральной среде с канамицином, для дальнейшей ПЦР-идентификации с праймерами Р23/Р24. Штамм с полосой, соответствующей 1437 п.о., амплифицированной этим способом, представляет собой генетически сконструированный штамм с нокаутом кодирующей области гена BBD29_11265, обозначенный как YPG-018 (нокаутирован ген BBD29_11265 в геноме Corynebacterium glutamicum CGMCC №21220).

Пример 6. Эксперименты с ферментацией для получения L-глутаминовой кислоты

Эксперименты с ферментацией осуществляют на штаммах (YPG-013, YPG-014, YPG-015, YPG-016, YPG-017 и YPG-018), сконструированных согласно приведенным выше примерам 2-5, и исходном штамме Corynebacterium glutamicum CGMCC №21220, в ферментативном реакторе типа BLBIO-5GC-4-H (приобретен у Shanghai Bailun Biological Technology Co., Ltd.); культуральная среда представлена в таблице 3, процесс управления представлен в таблице 4. Для каждого штамма эксперименты проводят в трех повторностях. Результаты приведены в таблице 5.

Результаты из таблицы 5 демонстрируют, что сверхэкспрессия гена BBD29_11265, или точечная мутация в кодирующей области гена BBD29_11265, BBD29_11265^G70A, и/или сверхэкспрессия гена BBD29_11265 или производного мутантного гена BBD29_11265^G70A у Corynebacterium glutamicum способствуют повышению продуцирования L-глутаминовой кислоты, тогда как ослабление экспрессии или нокаут гена BBD29_11265 неблагоприятны для накопления L-глутаминовой кислоты.

Настоящее изобретение было подробно описано выше. Специалисты в данной области техники смогут широко реализовать настоящее изобретение на практике, используя эквивалентные параметры, концентрации и условия без отступления от существа и объема настоящего изобретения, не прибегая к избыточному экспериментированию. Хотя были предложены конкретные примеры реализации настоящего изобретения, следует понимать, что возможны его дальнейшие улучшения. Таким образом, в соответствии с принципами настоящего изобретения, настоящим документом охвачены все варианты, применения или улучшения настоящего изобретения, в том числе изменения, вносимые с использованием обычных методик, известных в данной области техники, выходящие за пределы заявленного в настоящем документе объема изобретения. Некоторые существенные признаки могут быть использованы в соответствии с прилагаемой формулой изобретения.

Промышленное применение

Согласно настоящему изобретению было обнаружено, что через снижение экспрессии или нокаут гена BBD29_11265 кодируемый этим геном продукт влияет на способность к продуцированию L-глутаминовой кислоты, и что рекомбинантный штамм, полученный путем введения точечной мутации в кодирующую последовательность, или путем увеличения числа копий, или сверхэкспрессии указанного гена, способствует продуцированию глутаминовой кислоты в более высокой концентрации по сравнению с немодифицированным штаммом.

В частности, согласно настоящему изобретению сначала конструируют генетически сконструированную бактерию YPG-013 с точечной мутацией (G-A) путем введения точечной мутации в кодирующую область гена BBD29_11265 (SEQ ID NO: 1) Corynebacterium glutamicum CGMCC №21220 путем аллельной замены. Для дополнительного изучения и подтверждения того, что сверхэкспрессия гена BBD29_11265 дикого типа или производного мутантного гена BBD29_11265^G70A у бактерии-продуцента может повышать продуцирование L-глутаминовой кислоты, экзогенный ген интегрируют в хромосому хозяина или экспрессируют вне хромосомы с плазмиды, соответственно, конструируя таким образом сконструированные бактерии YPG-014, YPG-015, YPG-016 и YPG-017, сверхэкспрессирующие ген BBD29_11265 или ген BBD29_11265^G70A из генома и с плазмиды. Эксперименты предполагают, что ген BBD29_11265 и его варианты вовлечены в биосинтез L-глутаминовой кислоты. Используя сверхэкспрессию или нокаут гена BBD29_11265, или сайт-направленную мутацию (такую как точечная мутация) в указанном гене, можно регулировать уровень накопления L-глутаминовой кислоты у микроорганизма. Точечная мутация в кодирующей области гена BBD29_11265 или сверхэкспрессия гена BBD29_11265 или производного мутантного гена BBD29_11265^G70A у бактерии-продуцента способствует повышению продуцирования и увеличению показателя конверсии L-глутаминовой кислоты, тогда как нокаут или ослабление экспрессии гена BBD29_11265 неблагоприятны для накопления L-глутаминовой кислоты. Ген BBD29_11265 и его вариант (такой как ген BBD29_11265^G70A) могут применяться для конструирования генетически сконструированного штамм для продуцирования L-глутаминовой кислоты, чтобы способствовать повышению продуцирования L-глутаминовой кислоты, и для получения высокопродуктивного и высококачественного штамма для промышленного производства, полезного для широкого диапазона вариантов применения и имеющего высокую экономическую ценность для промышленного производства L-глутаминовой кислоты.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> NINGXIA EPPEN BIOTECH CO., LTD/ НИНСЯ ЭППЕН БИОТЕХ КО., ЛТД

<120> Recombinant Strain with Modified Gene BBD29_11265 for Producing

L-Glutamic Acid, and Method for Constructing the Same and Use Thereof/

РЕКОМБИНАНТНЫЙ ШТАММ С МОДИФИЦИРОВАННЫМ ГЕНОМ BBD29_11265 ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ

L-ГЛУТАМИНОВОЙ КИСЛОТЫ, А ТАКЖЕ СПОСОБ ЕГО КОНСТРУИРОВАНИЯ И ПРИМЕНЕНИЯ

<130> GNPDH21084

<150> CN202011631250.7

<151> 2020-12-30

<160> 33

<170> PatentIn, верс. 3.5

<210> 1

<211> 273

<212> ДНК

<213> Corynebacterium glutamicum

<220>

<221> Кодирующая последовательность

<222> (1)..(273)

<400> 1

atggctttag gcggcgcaga actgttaatt ctttttatcc tgtttattct gttcatgggc 60

gggatcgcag cgattgtcat cgttatcgtt aagttgaccc agcggtctaa cagtcgtggt 120

gcctcaacta cgtccacaat taacattgat ccgagtattc atgctgcatt gacagagatc 180

gcagctaggg acggggtacc ggcgtctagc gtggttaacg gtcttctgaa cgattacatc 240

aataagcgca ggtactggcc tcctacgcaa taa 273

<210> 2

<211> 273

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Искусственная последовательность

<220>

<221> Кодирующая последовательность

<222> (1)..(273)

<400> 2

atggctttag gcggcgcaga actgttaatt ctttttatcc tgtttattct gttcatgggc 60

gggatcgcaa cgattgtcat cgttatcgtt aagttgaccc agcggtctaa cagtcgtggt 120

gcctcaacta cgtccacaat taacattgat ccgagtattc atgctgcatt gacagagatc 180

gcagctaggg acggggtacc ggcgtctagc gtggttaacg gtcttctgaa cgattacatc 240

aataagcgca ggtactggcc tcctacgcaa taa 273

<210> 3

<211> 90

<212> Белок

<213> Corynebacterium glutamicum

<400> 3

Met Ala Leu Gly Gly Ala Glu Leu Leu Ile Leu Phe Ile Leu Phe Ile

1 5 10 15

Leu Phe Met Gly Gly Ile Ala Ala Ile Val Ile Val Ile Val Lys Leu

20 25 30

Thr Gln Arg Ser Asn Ser Arg Gly Ala Ser Thr Thr Ser Thr Ile Asn

35 40 45

Ile Asp Pro Ser Ile His Ala Ala Leu Thr Glu Ile Ala Ala Arg Asp

50 55 60

Gly Val Pro Ala Ser Ser Val Val Asn Gly Leu Leu Asn Asp Tyr Ile

65 70 75 80

Asn Lys Arg Arg Tyr Trp Pro Pro Thr Gln

85 90

<210> 4

<211> 90

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Искусственная последовательность

<400> 4

Met Ala Leu Gly Gly Ala Glu Leu Leu Ile Leu Phe Ile Leu Phe Ile

1 5 10 15

Leu Phe Met Gly Gly Ile Ala Thr Ile Val Ile Val Ile Val Lys Leu

20 25 30

Thr Gln Arg Ser Asn Ser Arg Gly Ala Ser Thr Thr Ser Thr Ile Asn

35 40 45

Ile Asp Pro Ser Ile His Ala Ala Leu Thr Glu Ile Ala Ala Arg Asp

50 55 60

Gly Val Pro Ala Ser Ser Val Val Asn Gly Leu Leu Asn Asp Tyr Ile

65 70 75 80

Asn Lys Arg Arg Tyr Trp Pro Pro Thr Gln

85 90

<210> 5

<211> 56

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Искусственная последовательность

<400> 5

cagtgccaag cttgcatgcc tgcaggtcga ctctagcggt gccagacact gtcaag 56

<210> 6

<211> 30

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Искусственная последовательность

<400> 6

acgatgacaa tcgttgcgat cccgcccatg 30

<210> 7

<211> 30

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Искусственная последовательность

<400> 7

catgggcggg atcgcaacga ttgtcatcgt 30

<210> 8

<211> 58

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Искусственная последовательность

<400> 8

cagctatgac catgattacg aattcgagct cggtaccccg tcagcccctg accgttct 58

<210> 9

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Искусственная последовательность

<400> 9

ttttctgact gctctgaacc 20

<210> 10

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Искусственная последовательность

<400> 10

gaccgttaac cacgctagac 20

<210> 11

<211> 56

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Искусственная последовательность

<400> 11

cagtgccaag cttgcatgcc tgcaggtcga ctctaggacc cgcttgccat acgaag 56

<210> 12

<211> 40

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Искусственная последовательность

<400> 12

cccagaacac gacaaaaggt atctactcat ctgaagaatc 40

<210> 13

<211> 40

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Искусственная последовательность

<400> 13

gattcttcag atgagtagat accttttgtc gtgttctggg 40

<210> 14

<211> 40

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Искусственная последовательность

<400> 14

caaaccagag tgcccacgaa ttattgcgta ggaggccagt 40

<210> 15

<211> 40

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Искусственная последовательность

<400> 15

actggcctcc tacgcaataa ttcgtgggca ctctggtttg 40

<210> 16

<211> 58

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Искусственная последовательность

<400> 16

cagctatgac catgattacg aattcgagct cggtacccca taagaaacaa ccacttcc 58

<210> 17

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Искусственная последовательность

<400> 17

gtccaaggtg acggccgcac 20

<210> 18

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Искусственная последовательность

<400> 18

tgcgatctct gtcaatgcag 20

<210> 19

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Искусственная последовательность

<400> 19

ctgggatagt ttcaagcctt 20

<210> 20

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Искусственная последовательность

<400> 20

atattcggcc cagcagcagc 20

<210> 21

<211> 56

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Искусственная последовательность

<400> 21

gcttgcatgc ctgcaggtcg actctagagg atccccacct tttgtcgtgt tctggg 56

<210> 22

<211> 54

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Искусственная последовательность

<400> 22

atcaggctga aaatcttctc tcatccgcca aaacttattg cgtaggaggc cagt 54

<210> 23

<211> 56

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Искусственная последовательность

<400> 23

cagtgccaag cttgcatgcc tgcaggtcga ctctaggatt tcgccacgcc atctac 56

<210> 24

<211> 40

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Искусственная последовательность

<400> 24

agcccctttt agatggggtg gttttctcct taaataacgg 40

<210> 25

<211> 40

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Искусственная последовательность

<400> 25

ccgttattta aggagaaaac caccccatct aaaaggggct 40

<210> 26

<211> 58

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Искусственная последовательность

<400> 26

cagctatgac catgattacg aattcgagct cggtaccccg agggtgagcc gggtgcat 58

<210> 27

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Искусственная последовательность

<400> 27

gatttcgcca cgccatctac 20

<210> 28

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Искусственная последовательность

<400> 28

cgagggtgag ccgggtgcat 20

<210> 29

<211> 1533

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Искусственная последовательность

<400> 29

cagtgccaag cttgcatgcc tgcaggtcga ctctagcggt gccagacact gtcaagcttg 60

aagaagacgc catccactta tccggtgatc gttgccttta cgttgtgacc aactacaact 120

ccgccgaaga agcagccgaa tggctcaccg ccatcgcttt cgattacgga ctgggccttg 180

ccgacatgaa cgcggacacc atcctgcttt tcggcgatga agattccgac gctgtcgtcc 240

aaatcgatga ctggttctcc cccgctttct ctgcgtacgg ccttccccac ctcctggtgg 300

aagtcatgcg cctgaaggat tccaaaaccc cttatcttcg agtcacactt gctgcagatg 360

actcgaaatt tatccaaacc ctttacgaaa ccgacaacaa acaatggttg gtggaaacct 420

cttcctccac aggcacggac gaaacccacg tgaagaccat taatgatgtg ctggaacgca 480

tcgagacatg gttcaaccag gagactgctg tctaaacctt ttgtcgtgtt ctggggttaa 540

ccacccttcg gccacctggg atagtttcaa gcctttccag gtggccgaag aactaaaagg 600

gcataatcac tgtatgggtt aagtagaaag tgtcattttc tgactgctct gaaccccaac 660

aaacactcag caccgttatt taaggagaaa acatggcttt aggcggcgca gaactgttaa 720

ttctttttat cctgtttatt ctgttcatgg gcgggatcgc aacgattgtc atcgttatcg 780

ttaagttgac ccagcggtct aacagtcgtg gtgcctcaac tacgtccaca attaacattg 840

atccgagtat tcatgctgca ttgacagaga tcgcagctag ggacggggta ccggcgtcta 900

gcgtggttaa cggtcttctg aacgattaca tcaataagcg caggtactgg cctcctacgc 960

aataacaccc catctaaaag gggctctctg gcagatatgc tctccggcag aagagcctct 1020

taatccttgt tgtacattac acagagcccc caaaagaacc ccaaaaacaa aaaactgccc 1080

ctcaccttcc caaaaggaaa gcaaggagca gttttaaact cgttgagtga gtgtgactta 1140

agcgtcaaca gcctcggtct cgacgatgtt caccaggcga cggttgcgct tggtggaaaa 1200

ctggacagcg ccagtcttca atgcgaagag agtgtcgtcg ccaccgcgac caacattctc 1260

acctgggtgg aacttggtgc cgcgctgacg aacaaggatc tcgcctgcgg aaacctgctg 1320

accaccgaaa cgcttgacgc caaggcgctt agcctcggaa tcacgaccgt tgctggagct 1380

agatgcaccc ttcttgtgtg ccatgtggta attccctcct tctaaaggaa aaactcatag 1440

aaagcccgag ggcttacttg attccggtta ccttcagaac ggtcaggggc tgacggggta 1500

ccgagctcga attcgtaatc atggtcatag ctg 1533

<210> 30

<211> 2004

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Искусственная последовательность

<400> 30

cagtgccaag cttgcatgcc tgcaggtcga ctctaggacc cgcttgccat acgaagtcct 60

ggagaagatc tccacccgca tcaccaacga agttccagac gtaaaccgcg tggttttgga 120

cgtaacctcc aagccaccag gaaccatcga atgggagtag gccttaaatg agccttcgtt 180

aagcggcaat caccttatcg gtgattgccg ctttcccatt tctccgggtt ttctggaact 240

ttttgggcgt atgctgggaa tgatcttatt attttgattt cagaaagcag gagagaccag 300

atgagcgaaa tccttgaaac ctactgggca ccccacttcg gaaacaccga tgaagccgca 360

gcactcgttt catacttggc acaagcttcc ggtgatccta ttgaggttca caccctgttc 420

ggggatttag gtttagacgg actctctgga aactacaccg acactgagat cgacggctac 480

ggcgacgcat tcctgctggt tgcagcacta gcagtgttga tggctgaaaa caaagcatcc 540

ggcggcgtga atctgggtga agttggggga gctgataaat cgatccggct gcatgttgaa 600

tccaaggaaa acacccagat caacaccgca ttgaagtact ttgcgctttc cccagaagac 660

cacgcagcgg cagatcgctt cgatgaggat gacctgtctg agcttgccaa cttgagtgaa 720

gagctgcgcg gacagctgga ctaattgctg cccgtttaag gagtccgatt cttcagatga 780

gtagatacct tttgtcgtgt tctggggtta accacccttc ggccacctgg gatagtttca 840

agcctttcca ggtggccgaa gaactaaaag ggcataatca ctgtatgggt taagtagaaa 900

gtgtcatttt ctgactgctc tgaaccccaa caaacactca gcaccgttat ttaaggagaa 960

aacatggctt taggcggcgc agaactgtta attcttttta tcctgtttat tctgttcatg 1020

ggcgggatcg cagcgattgt catcgttatc gttaagttga cccagcggtc taacagtcgt 1080

ggtgcctcaa ctacgtccac aattaacatt gatccgagta ttcatgctgc attgacagag 1140

atcgcagcta gggacggggt accggcgtct agcgtggtta acggtcttct gaacgattac 1200

atcaataagc gcaggtactg gcctcctacg caataattcg tgggcactct ggtttggtta 1260

ccaggatggg ttagtcattc tgatcagcga attccacgtt cacatcgcca attccagagt 1320

tcacaaccag attcagcatt ggaccttcta gatcagcatt gtgggcggtg agatctccaa 1380

catcacagcg cgctgtgccc acaccggcgg tacaacttag gctcacgggc acatcatcgg 1440

gcagggtgac catgacttcg ccgatccctg aggtgatttg gatgttttgt tcctgatcca 1500

attgggtgag gtggctgaaa tcgaggttca tttcacccac gccagaggtg tagctgctga 1560

ggagttcatc gttggtgggg atgagattga catcgccgat tccagggtcg tcttcaaagt 1620

agatgggatc gatatttgaa ataaacaggc ctgcgagggc gctcatgaca actccggtac 1680

caactacacc gccgacaatc catggccaca catggcgctt tttctgaggc ttttgtggag 1740

ggacttgtac atcccaggtg ttgtattggt tttgggcaag tggatcccaa tgaggcgctt 1800

cgggggtttg ttgcgcgaag ggtgcatagt agccctcaac gggggtgata gtgcttagat 1860

ctggttgggg ttgtgggtag agatcttcgt ttttcatggt ggcatcctca gaaacagtga 1920

attcagtggt gagtagtccg cggggtggaa gtggttgttt cttatggggt accgagctcg 1980

aattcgtaat catggtcata gctg 2004

<210> 31

<211> 2004

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Искусственная последовательность

<400> 31

cagtgccaag cttgcatgcc tgcaggtcga ctctaggacc cgcttgccat acgaagtcct 60

ggagaagatc tccacccgca tcaccaacga agttccagac gtaaaccgcg tggttttgga 120

cgtaacctcc aagccaccag gaaccatcga atgggagtag gccttaaatg agccttcgtt 180

aagcggcaat caccttatcg gtgattgccg ctttcccatt tctccgggtt ttctggaact 240

ttttgggcgt atgctgggaa tgatcttatt attttgattt cagaaagcag gagagaccag 300

atgagcgaaa tccttgaaac ctactgggca ccccacttcg gaaacaccga tgaagccgca 360

gcactcgttt catacttggc acaagcttcc ggtgatccta ttgaggttca caccctgttc 420

ggggatttag gtttagacgg actctctgga aactacaccg acactgagat cgacggctac 480

ggcgacgcat tcctgctggt tgcagcacta gcagtgttga tggctgaaaa caaagcatcc 540

ggcggcgtga atctgggtga agttggggga gctgataaat cgatccggct gcatgttgaa 600

tccaaggaaa acacccagat caacaccgca ttgaagtact ttgcgctttc cccagaagac 660

cacgcagcgg cagatcgctt cgatgaggat gacctgtctg agcttgccaa cttgagtgaa 720

gagctgcgcg gacagctgga ctaattgctg cccgtttaag gagtccgatt cttcagatga 780

gtagatacct tttgtcgtgt tctggggtta accacccttc ggccacctgg gatagtttca 840

agcctttcca ggtggccgaa gaactaaaag ggcataatca ctgtatgggt taagtagaaa 900

gtgtcatttt ctgactgctc tgaaccccaa caaacactca gcaccgttat ttaaggagaa 960

aacatggctt taggcggcgc agaactgtta attcttttta tcctgtttat tctgttcatg 1020

ggcgggatcg caacgattgt catcgttatc gttaagttga cccagcggtc taacagtcgt 1080

ggtgcctcaa ctacgtccac aattaacatt gatccgagta ttcatgctgc attgacagag 1140

atcgcagcta gggacggggt accggcgtct agcgtggtta acggtcttct gaacgattac 1200

atcaataagc gcaggtactg gcctcctacg caataattcg tgggcactct ggtttggtta 1260

ccaggatggg ttagtcattc tgatcagcga attccacgtt cacatcgcca attccagagt 1320

tcacaaccag attcagcatt ggaccttcta gatcagcatt gtgggcggtg agatctccaa 1380

catcacagcg cgctgtgccc acaccggcgg tacaacttag gctcacgggc acatcatcgg 1440

gcagggtgac catgacttcg ccgatccctg aggtgatttg gatgttttgt tcctgatcca 1500

attgggtgag gtggctgaaa tcgaggttca tttcacccac gccagaggtg tagctgctga 1560

ggagttcatc gttggtgggg atgagattga catcgccgat tccagggtcg tcttcaaagt 1620

agatgggatc gatatttgaa ataaacaggc ctgcgagggc gctcatgaca actccggtac 1680

caactacacc gccgacaatc catggccaca catggcgctt tttctgaggc ttttgtggag 1740

ggacttgtac atcccaggtg ttgtattggt tttgggcaag tggatcccaa tgaggcgctt 1800

cgggggtttg ttgcgcgaag ggtgcatagt agccctcaac gggggtgata gtgcttagat 1860

ctggttgggg ttgtgggtag agatcttcgt ttttcatggt ggcatcctca gaaacagtga 1920

attcagtggt gagtagtccg cggggtggaa gtggttgttt cttatggggt accgagctcg 1980

aattcgtaat catggtcata gctg 2004

<210> 32

<211> 520

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Искусственная последовательность

<400> 32

gcttgcatgc ctgcaggtcg actctagagg atccccacct tttgtcgtgt tctggggtta 60

accacccttc ggccacctgg gatagtttca agcctttcca ggtggccgaa gaactaaaag 120

ggcataatca ctgtatgggt taagtagaaa gtgtcatttt ctgactgctc tgaaccccaa 180

caaacactca gcaccgttat ttaaggagaa aacatggctt taggcggcgc agaactgtta 240

attcttttta tcctgtttat tctgttcatg ggcgggatcg cagcgattgt catcgttatc 300

gttaagttga cccagcggtc taacagtcgt ggtgcctcaa ctacgtccac aattaacatt 360

gatccgagta ttcatgctgc attgacagag atcgcagcta gggacggggt accggcgtct 420

agcgtggtta acggtcttct gaacgattac atcaataagc gcaggtactg gcctcctacg 480

caataagttt tggcggatga gagaagattt tcagcctgat 520

<210> 33

<211> 520

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Искусственная последовательность

<400> 33

gcttgcatgc ctgcaggtcg actctagagg atccccacct tttgtcgtgt tctggggtta 60

accacccttc ggccacctgg gatagtttca agcctttcca ggtggccgaa gaactaaaag 120

ggcataatca ctgtatgggt taagtagaaa gtgtcatttt ctgactgctc tgaaccccaa 180

caaacactca gcaccgttat ttaaggagaa aacatggctt taggcggcgc agaactgtta 240

attcttttta tcctgtttat tctgttcatg ggcgggatcg caacgattgt catcgttatc 300

gttaagttga cccagcggtc taacagtcgt ggtgcctcaa ctacgtccac aattaacatt 360

gatccgagta ttcatgctgc attgacagag atcgcagcta gggacggggt accggcgtct 420

agcgtggtta acggtcttct gaacgattac atcaataagc gcaggtactg gcctcctacg 480

caataagttt tggcggatga gagaagattt tcagcctgat 520

<---

Изобретение относится к биотехнологии. Предложены бактерия Corynebacterium для продуцирования L-глутаминовой кислоты, способ получения L-глутаминовой кислоты с использованием указанной бактерии, белок и молекула нуклеиновой кислоты для продуцирования L-глутаминовой кислоты. Также предложены рекомбинантный микроорганизм для продуцирования L-глутаминовой кислоты, содержащий указанную молекулу нуклеиновой кислоты, способ его конструирования и способ получения L-глутаминовой кислоты с его использованием. Также предложены применение указанной молекулы нуклеиновой кислоты для конструирования генетически модифицированной бактерии для продуцирования L-глутаминовой кислоты, способ повышения продукции L-глутаминовой кислоты в бактерии рода Corynebacterium с использованием указанной молекулы нуклеиновой кислоты. Изобретение обеспечивает получение высокой продукции L-глутаминовой кислоты. 9 н. и 7 з.п. ф-лы, 5 табл., 6 пр.

1. Бактерия Corynebacterium для продуцирования L-глутаминовой кислоты, где указанная бактерия характеризуется улучшенной экспрессией полинуклеотида, кодирующего последовательность аминокислот SEQ ID NO: 3, по сравнению с немодифицированной бактерией Corynebacterium;

где указанная улучшенная экспрессия представляет собой усиленную экспрессию полинуклеотида, кодирующего последовательность аминокислот SEQ ID NO: 3, или наличие точечной мутации в полинуклеотиде, кодирующем последовательность аминокислот SEQ ID NO: 3, или наличие точечной мутации в полинуклеотиде и усиленную экспрессию полинуклеотида, который кодирует последовательность аминокислот SEQ ID NO: 3; причем указанная точечная мутация в полинуклеотиде, кодирующем последовательность аминокислот SEQ ID NO: 3, представляет собой замену аланина в положении 24 в последовательности аминокислот SEQ ID NO: 3 на треонин.

2. Бактерия Corynebacterium по п. 1, где полинуклеотид, кодирующий последовательность аминокислот SEQ ID NO: 3, содержит последовательность нуклеотидов SEQ ID NO: 1.

3. Бактерия Corynebacterium по п. 1, где указанная последовательность полинуклеотида содержит точечную мутацию основания в положении 70 последовательности полинуклеотида, представленной в SEQ ID NO: 1, с заменой гуанина (G) на аденин (A).

4. Бактерия Corynebacterium по п. 1, где указанная последовательность полинуклеотида, имеющая точечную мутацию, содержит последовательность полинуклеотида SEQ ID NO: 2.

5. Бактерия Corynebacterium по п. 1, где указанная бактерия Corynebacterium представляет собой Corynebacterium glutamicum CGMCC № 21220 или ATCC 13869.

6. Способ получения L-глутаминовой кислоты, который включает: культивирование бактерии по п. 1 и выделение L-глутаминовой кислоты из указанной культуры.

7. Белок, характеризующийся тем, что он имеет последовательность аминокислот SEQ ID NO: 4, причем указанный белок применяют в продуцировании L-глутаминовой кислоты.

8. Молекула нуклеиновой кислоты для применения в продуцировании L-глутаминовой кислоты, характеризующаяся тем, что указанная молекула нуклеиновой кислоты представляет собой любое из:

B1) молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей белок по п. 7;

B2) молекулы ДНК, кодирующая последовательность которой представлена в SEQ ID NO: 2;

B3) молекулы ДНК, последовательность нуклеотидов которой представлена в SEQ ID NO: 2; или

B4) последовательности полинуклеотида, содержащей полинуклеотид, кодирующий последовательность аминокислот, представленную в SEQ ID NO: 3, где аланин в положении 24 заменен на треонин.

9. Молекула нуклеиновой кислоты по п. 8, где указанная последовательность полинуклеотида содержит полинуклеотид, кодирующий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 4.

10. Молекула нуклеиновой кислоты по п. 8, где указанная последовательность полинуклеотида образована в результате мутации основания в положении 70 последовательности полинуклеотида, представленной в SEQ ID NO: 1, с гуанина (G) на аденин (A).

11. Молекула нуклеиновой кислоты по п. 8, где указанная последовательность полинуклеотида содержит последовательность полинуклеотида, представленную в SEQ ID NO: 2.

12. Рекомбинантный микроорганизм для продукции L-глутаминовой кислоты, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты по п. 8, или рекомбинантный вектор, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты по п. 8.

13. Применение молекулы нуклеиновой кислоты по п. 8 для конструирования генетически модифицированной бактерии для продуцирования L-глутаминовой кислоты.

14. Способ повышения продуцирования L-глутаминовой кислоты в бактерии Corynebacterium, характеризующийся тем, что он включает:

введение мутации в молекуле ДНК, последовательность нуклеотидов которой представлена SEQ ID NO: 1, в микроорганизм-мишень с получением рекомбинантного микроорганизма, культивирование указанного рекомбинантного микроорганизма с получением повышенной продукции L-глутаминовой кислоты по сравнению с микроорганизмом-мишенью без мутации и выделение L-глутаминовой кислоты из культуры, причем мутация представляет собой точечную мутацию остатка аланина в положении 24 в последовательности аминокислот, кодируемой молекулой ДНК, представленной в SEQ ID NO: 1, на треонин с получением мутированного белка, последовательность аминокислот которого представлена SEQ ID NO: 4.

15. Способ конструирования рекомбинантного микроорганизма по п. 12, характеризующийся тем, что указанный способ включает по меньшей мере одно из:

F1) введения молекулы нуклеиновой кислоты по п. 8 в микроорганизм-мишень с получением рекомбинантного микроорганизма;

F2) редактирования молекулы ДНК, представленной в SEQ ID NO: 1, с использованием средства редактирования генов, таким образом, чтобы микроорганизм-мишень содержал молекулу ДНК, представленную в SEQ ID NO: 2.

16. Способ получения L-глутаминовой кислоты, характеризующийся тем, что указанный способ включает: культивирование рекомбинантного микроорганизма по п. 12 и выделение L-глутаминовой кислоты из культуры.