КОМПОЗИЦИЯ И СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ ДИАБЕТА Российский патент 2023 года по МПК A61K33/242 A61K31/223 A61P3/10 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

1. Настоящее изобретение относится к области техники диабета, в частности к композиции и способам лечения диабета.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

2. Диабет (также называемый сахарным диабетом (СД)) поражает сотни миллионов людей во всем мире и представляет собой группу нарушений обмена веществ, характеризующихся высоким уровнем сахара в крови в течение длительного периода времени. Симптомы высокого уровня сахара в крови включают учащенное мочеиспускание (полиурия), жажду (полидипсия) и чувство голода (полифагия). При отсутствии лечения диабет вызывает острые и хронические осложнения. Острые осложнения включают диабетический кетоацидоз, гиперосмолярное гипергликемическое состояние или смерть. Хронические осложнения включают сердечно-сосудистые заболевания, инсульт, хроническую болезнь почек, язвы на ногах и повреждения глаз.

3. Диабет возникает либо из-за дефицита инсулина (т.е. поджелудочная железа не вырабатывает инсулин или производит его в недостаточном количестве), либо из-за резистентности к инсулину (т.е. клетки внутри организма не реагируют на инсулин должным образом). Диабет подразделяют на три основных типа. Диабет 1 типа возникает в результате неспособности поджелудочной железы вырабатывать достаточное количество инсулина вследствие потери бета-клеток. Диабет 1 типа лечат инъекциями инсулина. Диабет 2 типа начинается с инсулинорезистентности, состояния, при котором клетки не реагируют на инсулин должным образом. Диабет 2 типа можно лечить лекарственными средствами с инсулином или без него. Прогрессирование заболевания может привести к дефициту инсулина. Гестационный диабет представляет собой третью основную форму и возникает, когда у беременных женщин без предшествующего анамнеза диабета повышается уровень сахара в крови.

4. Несмотря на то, что доступные лекарственные средства помогают снизить уровень сахара в крови, по-прежнему существует острая необходимость в новых лекарственных средствах и способах лечения диабета.

РАСКРЫТИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

5. Целью настоящего изобретения является получение фармацевтической композиции и способ лечения диабета.

6. В некоторых вариантах осуществления способ получения кластеров золота, модифицированных лигандом (AuCs), включает обеспечение раствора HAuCl₄; последовательное добавление кислого раствора и раствора первого лиганда в раствор HAuCl₄ с образованием раствора первой смеси; где молярное соотношение между первым лигандом и HAuCl₄ находится в диапазоне от 1:1 до 20:1; добавление раствора NaBH₄ к раствору первой смеси с образованием раствора второй смеси; где молярное соотношение между NaBH₄ и HAuCl₄ находится в диапазоне от 1:1 до 10:1; добавление апротонного полярного растворителя к раствору второй смеси для прекращения реакции и получения раствора третьей смеси; центрифугирование раствора третьей смеси для сбора нижнего твердого осадка; растворение собранного нижнего твердого осадка во втором растворе лиганда с получением раствора четвертой смеси и выдерживание раствора четвертой смеси в течение определенного периода времени; где молярное соотношение между вторым лигандом и HAuCl₄ находится в диапазоне от 1:1 до 20:1; центрифугирование четвертого раствора смеси с получением супернатанта; и диализ супернатанта в диализном мешке с заданным предельным размером молекулы.

7. В некоторых вариантах осуществления способа раствор HAuCl₄ состоит из нейтрального или кислого растворителя, выбранного из группы, состоящей из воды, метанола, этанола, н-пропанола, 1-пропанола, 2-пропанола, 1-бутанола, 2-бутанола, пентанола, пентана, муравьиной кислоты, уксусной кислоты, диэтилового эфира, ацетона, анизола, этилформиата, метилацетата, этилацетата, пропилацетата, изопропилацетата, бутилацетата, изобутилацетата, трибутилметилового эфира, диметилсульфоксида, 2-метил-1-пропанола и смеси двух или более из них.

8. В некоторых вариантах осуществления способа кислый раствор состоит из кислоты, выбранной из группы, состоящей из соляной кислоты, фосфорной кислоты, серной кислоты, уксусной кислоты, пропионовой кислоты, масляной кислоты и смеси двух или более из них.

9. В некоторых вариантах осуществления способа первый лиганд и второй лиганд выбран из L-цистеина, D-цистеина и других производных цистеина; цистеинсодержащих олигопептидов и их производных; других тиолсодержащих соединений; и смеси двух или более из них.

10. В некоторых вариантах осуществления способа раствор первого лиганда и раствор второго лиганда состоят из растворителя, выбранного из группы, состоящей из воды, метанола, этанола, н-пропанола, 1-пропанола, 2-пропанола, 1-бутанола, 2-бутанола, пентанола, этилформиата, метилацетата, этилацетата, пропилацетата, изопропилацетата, бутилацетата, изо бутил ацетата, 2-метил-1-пропанола и смеси двух или более из них.

11. В некоторых вариантах осуществления способа раствор NaBH₄ состоит из растворителя, выбранного из группы, состоящей из воды, метанола, этанола, н-пропанола, 1-пропанола, 2-пропанола, 1-бутанола, 2-бутанола, пентанола, этилформиата, метилацетата, этилацетата, пропилацетата, изопропилацетата, бутилацетата, изо бутилацетата, 2-метил-1-пропанола и смеси двух или более из них.

12. В некоторых вариантах осуществления способа апротонный полярный растворитель выбран из группы, состоящей из диметилсульфоксида (ДМСО), ацетона, ацетонитрила, диметилформамида (ДМФА), диметилацетамида (ДМАЦ), гексаметилфосфорамида (ГМФ), хлороформа, четыреххлористого углерода, пиридина и смеси двух или более из них.

13. В некоторых вариантах осуществления способа период выдерживания четвертого раствора смеси составляет от 3 до 24 часов.

14. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает лиофилизацию диализированного супернатанта для получения порошка AuCs.

15. В некоторых вариантах осуществления в настоящем изобретении предложен порошок AuCs, полученный способом по настоящему изобретению.

16. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения используют кластер золота (AuC) для получения лекарственного средства для лечения диабета у субъекта, где указанный AuC содержит золотое ядро; и лиганд, модифицирующий золотое ядро.

17. В некоторых вариантах применения золотое ядро имеет диаметр менее 3 нм. В некоторых вариантах осуществления золотое ядро имеет диаметр в диапазоне 0,5-2,6 нм.

18. В некоторых вариантах применения лиганд выбран из группы, состоящей из L-цистеина и его производных, D-цистеина и его производных, цистеинсодержащих олигопептидов и их производных и других тиолсодержащих соединений.

19. В некоторых вариантах применения L-цистеин и его производные выбраны из группы, состоящей из L-цистеина, N-изобутирил-L-цистеина (L-NIBC) и N-ацетил-L-цистеина (L-NAC), а D-цистеин и его производные выбраны из группы, состоящей из D-цистеина, N-изобутирил-D-цистеина (D-NIBC) и N-ацетил-D-цистеина (D-NAC).

20. В некоторых вариантах применения цистеинсодержащие олигопептиды и их производные представляют собой цистеинсодержащие дипептиды, цистеинсодержащие трипептиды или цистеинсодержащие тетрапептиды.

21. В некоторых вариантах применения цистеинсодержащие дипептиды выбраны из группы, состоящей из дипептида L-цистеин-L-аргинин (CR), дипептида L-аргинин-L-цистеин (RC), дипептида L-гистидин-L-цистеин (НС) и дипептида L-цистеин-L-гистидин (СН).

22. В некоторых вариантах применения цистеинсодержащие трипептиды выбраны из группы, состоящей из трипептида глицин-L-цистеин-L-аргинин (GCR), трипептида L-пролин-L-цистеин-L-аргинин (PCR), трипептида L-лизин-L-цистеин-L-пролин (КСР) и L-глутатиона (GSH).

23. В некоторых вариантах применения цистеинсодержащие тетрапептиды выбраны из группы, состоящей из тетрапептида глицин-L-серин-L-цистеин-L-аргинин (GSCR) и тетрапептида глицин-L-цистеин-L-серин-L-аргинин (GCSR).

24. В некоторых вариантах применения другие тиолсодержащие соединения выбраны из группы, состоящей из 1-[(2S)-2-метил-3-тиол-1-оксопропил]-L-пролина, тиогликолевой кислоты, меркаптоэтанола, тиофенола, D-3-троловола, N-(2-меркаптопропионил)-глицина и додецилмеркаптана.

25. Задачи и преимущества настоящего изобретения станут очевидными из последующего подробного описания предпочтительных вариантов его осуществления в связи с прилагаемыми чертежами.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

26. Далее будут описаны предпочтительные варианты осуществления настоящего изобретения со ссылкой на Фигуры, на которых одинаковые ссылочные позиции обозначают одинаковые элементы.

27. На ФИГ. 1 показаны спектры в ультрафиолетовом и видимом (УФ) диапазонах, изображения на просвечивающем электронном микроскопе (ПЭМ) и диаграммы распределения по размерам наночастиц золота, модифицированных лигандом L-NIBC (L-NIBC-AuNP), с различными размерами частиц.

28. На ФИГ. 2 показаны спектры ультрафиолетового (УФ) и видимого спектра, ПЭМ-изображения и диаграммы распределения частиц по размерам модифицированных лигандом L-NIBC кластеров золота (L-NIBC-AuC) с различными размерами частиц.

29. На ФИГ. 3 показаны инфракрасные спектры L-NIBC-AuCs с частицами разного размера.

30. На ФИГ. 4 показаны УФ, инфракрасная, ПЭМ-диаграммы и диаграммы распределения по размерам частиц кластеров золота, модифицированных лигандом CR (CR-AuCs).

31. На ФИГ. 5 показаны УФ, инфракрасная, ПЭМ-диаграммы и диаграммы распределения по размерам частиц кластеров золота, модифицированных лигандом RC (RC-AuCs).

32. На ФИГ. 6 показаны УФ, инфракрасная, ПЭМ-диаграммы и диаграммы распределения по размерам частиц кластеров золота, модифицированных лигандом 1-[(2S)-2-метил-3-тиол-1-оксопропил]-L-пролин (т.е. Cap) (Cap-AuCs).

33. На ФИГ. 7 показаны УФ, инфракрасная, ПЭМ-диаграммы и диаграммы распределения по размерам частиц кластеров золота, модифицированных лигандом GSH (GSH-AuCs).

34. На ФИГ. 8 показаны УФ, инфракрасная, ПЭМ-диаграммы и диаграммы распределения по размерам частиц кластеров золота, модифицированных лигандом D-NIBC (D-NIBC-AuCs).

35. На ФИГ. 9 показаны результаты окрашивания НЕ поджелудочной железы; (а) группа отрицательного контроля; отсутствие аномальных изменений; (b) модельная контрольная группа; резкое уменьшение числа островков, объемов островков и количества островковых клеток, а также очевидная инфильтрация лимфоцитов в островки; (с) группа положительного контроля; умеренное уменьшение числа островков, объемов островков и количества островковых клеток, а также очевидная инфильтрация лимфоцитов в островки; (d) группа образца; без явного уменьшения числа островков, объемов островков и количества островковых клеток, а также без инфильтрации лимфоцитов в островки.

36. На ФИГ. 10 показаны результаты иммуногистохимии инсулина в поджелудочной железе; (а) группа отрицательного контроля; нормальные инсулин-положительные островки; (b) модельная контрольная группа; резкое уменьшение инсулин-положительных островков; (с) группа положительного контроля; значительное уменьшение инсулин-положительных островков; (d) группа образца; нет явного уменьшения инсулин-положительных островков.

37. На ФИГ. 11 показаны результаты иммуногистохимии инсулина в островках; (а) группа отрицательного контроля; нормальное количество инсулин-положительных клеток; (b) модельная контрольная группа; резкое уменьшение количества инсулин-положительных клеток; (с) группа положительного контроля; значительное уменьшение количества инсулин-положительных клеток; (d) группа образца; нет явного уменьшения количества инсулин-положительных клеток.

38. На ФИГ. 12 показана блок-схема способа получения AuCs в соответствии с некоторыми вариантами осуществления настоящего изобретения.

39. На ФИГ. 13 показано сравнение нормальной контрольной группы с модельной контрольной группой: (а) различия в массе тела, весе жира и нежирного мяса мышей; (b) индекс глюкозы крови натощак и гипогликемическая способность инсулина; (с) индекс толерантности к глюкозе.

40. На ФИГ. 14 показан острый гипогликемический эффект лекарственного средства А-03 у: (а) нормальных мышей; (b) модельных мышей.

41. На ФИГ. 15 показан эффект лекарственного средства А-03 на модельных мышей: (а) масса тела; (b) жир, где (1) представляет собой нормальную контрольную группу, (2) представляет собой модельную контрольную группу, (3) представляет собой группу введения средней дозы А-03; (с) мышечная ткань, где (1) представляет собой нормальную контрольную группу, (2) представляет собой модельную контрольную группу и (3) представляет собой группу ведения средней дозы А-03.

42. На ФИГ. 16 показан гипогликемический эффект лекарственного средства А-03 через месяц после введения, где (1) представляет собой модельную контрольную группу; (2) представляет собой группу введения высокой дозы; (3) представляет собой группу введения средней дозы; и (4) представляет собой группу введения низкой дозы.

43. На ФИГ. 17 показано гипогликемическое действие лекарственного средства А-03 через два месяца после введения, где (1) представляет собой модельную контрольную группу, (2) представляет собой группу введения высокой дозы, (3) представляет собой группу введения средней дозы, и (4) представляет собой группу введения низкой дозы.

44. На ФИГ. 18 показано действие лекарственного средства А-03 на (а) толерантность к глюкозе и (b) гипогликемический эффект инсулина (* означает Р<0,05).

45. На ФИГ. 19 показано действие средних и высоких доз лекарственного средства А-03 на липиды крови у модельных мышей: (а) содержание неэтерифицированных жирных кислот в плазме (NEFA в плазме); (b) триглицериды сыворотки (ТГ плазмы); (с) общий холестерин сыворотки (ХС плазмы), где (1) представляет собой нормальную контрольную группу; (2) представляет собой модельную контрольную группу; (3) представляет собой группу введения средней дозы А-03; (4) представляет собой группу введения высокой дозы А-03.

46. На ФИГ. 20 показано влияние введения средней дозы А-03 на: (а) уровень глюкозы в крови натощак и (b) содержание инсулина в крови, где (1) представляет собой нормальную контрольную группу; (2) представляет собой модельную контрольную группу; и (3) представляет собой группу введения средней дозы А-03.

47. На ФИГ. 21 показано влияние введения средней дозы А-03 на печень мышей: (а) экспрессия глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (G6Pase), где (1) представляет собой нормальную контрольную группу, (2) представляет собой модельную контрольную группу, (3) представляет собой группу введения средней дозы А-03; (b) количество гликогена в печени, где (1) представляет собой нормальную контрольную группу, (2) представляет собой модельную контрольную группу, (3) представляет собой группу введения средней дозы А-03; (с) экспрессия ключевых молекул в окислительном фосфорилировании во время метаболизма глюкозы, где в каждом гене столбцы слева направо представляют собой нормальную контрольную группу, модельную контрольную группу и группу введения средней дозы А-03.

48. На ФИГ. 22 показано влияние лекарственного средства А-03 на печень: (а) вестерн-блоттинг показал репрезентативные полосы белков pS473 PKB, PKB, рТ389-S6k и S6K; (b) и (с) представляют собой результаты соответствующего статистического анализа экспрессии, где 1-3 представляют собой нормальную контрольную группу, модельную контрольную группу и группу введения средней дозы А-03.

49. На ФИГ. 23 показано влияние введения А-03 на (а) глютаминовую оксалоацетиновую трансаминазу и (b) аланинаминотрансферазу у мышей с диетой с высоким содержанием жиров, где 1-3 представляют собой нормальную контрольную группу, модельную контрольную группу и группу введения средней дозы А-03.

ОСУЩЕСТВЛЕНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

50. Настоящее изобретение может быть легче понято со ссылкой на следующее подробное описание некоторых вариантов осуществления изобретения.

51. В настоящей заявке, где присутствуют ссылки на публикации, раскрытие данных публикаций настоящим включено посредством ссылки во всей своей полноте в настоящую заявку, чтобы более полно описать уровень техники, к которому относится настоящее изобретение.

52. Кластеры золота (AuCs) представляют собой особую форму золота, существующую между атомами золота и наночастицами золота. AuCs имеют размер менее 3 нм и состоят из от нескольких единиц до нескольких сотен атомов золота, что приводит к коллапсу гранецентрированной кубической упаковки структуры наночастиц золота. В результате AuCs демонстрируют дискретные электронные структуры, подобные молекулам, с отчетливой щелью HOMO-LUMO, в отличие от непрерывных или квазинепрерывных уровней энергии наночастиц золота. Это приводит к исчезновению эффекта поверхностного плазмонного резонанса и соответствующей полосы поглощения плазмонного резонанса (520±20 нм) в УФ-видимом спектре, которой обладают обычные наночастицы золота.

53. Настоящее изобретение относится к AuC, модифицированному лигандом.

54. В некоторых вариантах осуществления AuC, модифицированный лигандом, содержит лиганд и золотое ядро диаметром в диапазоне 0,5-3 нм. В некоторых вариантах осуществления диаметр золотого ядра находится в диапазоне 0,5-2,6 нм.

55. В некоторых вариантах осуществления лиганд AuC, модифицированного лигандом, представляет собой тиолсодержащее соединение или олигопептид. Лиганд модифицирует золотое ядро с образованием AuC, модифицированного лигандом, через связь Au-S.

56. В некоторых вариантах осуществления лиганд представляет собой, помимо прочего, L-цистеин, D-цистеин или производное цистеина. В некоторых вариантах осуществления производное цистеина представляет собой N-изобутирил-L-цистеин (L-NIBC), N-изобутирил-D-цистеин (D-NIBC), N-ацетил-L-цистеин (L-NAC) или N-ацетил-D-цистеин (D-NAC).

57. В некоторых вариантах осуществления лиганд представляет собой, помимо прочего, цистеинсодержащий олигопептид и его производные. В некоторых вариантах осуществления цистеинсодержащий олигопептид представляет собой цистеинсодержащий дипептид. В некоторых вариантах осуществления цистеинсодержащий дипептид представляет собой дипептид L-цистеин-L-аргинин (CR), дипептид L-аргинин-L-цистеин (RC) или дипептид L-цистеин-L-гистидин (СН). В некоторых вариантах осуществления цистеинсодержащий олигопептид представляет собой цистеинсодержащий трипептид. В некоторых вариантах осуществления цистеинсодержащий трипептид представляет собой трипептид глицин-L-цистеин-L-аргинин (GCR), трипептид L-пролин-L-цистеин-L-аргинин (PCR) или L-глутатион (GSH). В некоторых вариантах осуществления цистеинсодержащий олигопептид представляет собой цистеинсодержащий тетрапептид. В некоторых вариантах осуществления цистеинсодержащий тетрапептид представляет собой тетрапептид глицин-L-серин-L-цистеин-L-аргинин (GSCR) или тетрапептид глицин-L-цистеин-L-серин-L-аргинин (GCSR).

58. В некоторых вариантах осуществления лиганд представляет собой тиолсодержащее соединение. В некоторых вариантах осуществления тиолсодержащее соединение представляет собой 1-[(2S)-2-метил-3-тиол-1-оксопропил]-L-пролин, тиогликолевую кислоту, меркаптоэтанол, тиофенол, D-3-троловол или додецилмеркаптан.

59. В настоящем изобретении предложена фармацевтическая композиция для лечения диабета у субъекта. В некоторых вариантах осуществления субъектом является человек. В некоторых вариантах осуществления субъект представляет собой домашнее животное, такое как собака.

60. В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция содержит AuC, модифицированный лигандом, как описано выше, и фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество. В некоторых вариантах осуществления вспомогательное вещество представляет собой раствор фосфатного буфера или физиологический раствор.

61. В настоящем изобретении предложено применение описанных выше AuCs для получения лекарственного средства для лечения диабета у субъекта.

62. В настоящем изобретении предложено применение описанных выше AuCs для лечения диабета у субъекта или способ лечения диабета у субъекта с применением раскрытых выше AuCs. В некоторых вариантах осуществления способ лечения включает введение субъекту фармацевтически эффективного количества AuCs. Фармацевтически эффективное количество можно определить с помощью рутинных исследований in vivo.

63. В настоящем изобретении предложен способ получения кластеров золота, модифицированных лигандами (AuCs). Ссылаясь теперь на ФИГ. 12, представлена блок-схема способа в соответствии с некоторыми вариантами осуществления настоящего изобретения. Способ 1200 включает:

64. обеспечение раствора HAuCl₄ 1210, при этом раствор HAuCl₄ состоит из нейтрального или кислого растворителя, выбранного из группы, состоящей из воды, метанола, этанола, н-пропанола, 1-пропанола, 2-пропанола, 1-бутанола, 2-бутанола, пентанола, пентана, муравьиной кислоты, уксусной кислоты, диэтилового эфира, ацетона, анизола, этилформиата, метилацетата, этилацетата, пропилацетата, изопропилацетата, бутилацетата, изобутилацетата, трибутилметилового эфира, диметилсульфоксида, 2-метил-1-пропанола и смеси двух или более из них. В некоторых вариантах осуществления растворитель представляет собой метанол. В некоторых вариантах осуществления раствор HAuCl₄ предварительно охлаждают до 0°С или ниже без света при медленном перемешивании. В некоторых вариантах осуществления концентрация HAuCl₄ в растворе HAuCl₄ находится в диапазоне 1-20 г/л, предпочтительно 2-10 г/л. В некоторых вариантах осуществления, когда общий объем полной реакции обозначен как 1 объем, раствор HAuCl₄ находится в диапазоне 0,1-0,7 объема, предпочтительно в диапазоне 0,2-0,5 объема.

65. последовательное добавление кислого раствора и раствора первого лиганда в раствор НАиСЦ с образованием раствора первой смеси 1220. В некоторых вариантах осуществления кислый раствор состоит из кислоты, выбранной из группы, состоящей из соляной кислоты, фосфорной кислоты, серной кислоты, уксусной кислоты, пропионовой кислоты, масляной кислоты и смеси двух или более из них. В некоторых вариантах осуществления кислый раствор находится в диапазоне 0,01-0,1 объема. В некоторых вариантах осуществления кислый раствор обеспечивает проведение реакции при рН<5, предпочтительно при рН в диапазоне 1-3, наиболее предпочтительно при рН в диапазоне 1-2. В некоторых вариантах осуществления температура реакции составляет ниже 4°С. В некоторых вариантах осуществления первый лиганд выбран из L-цистеина, D-цистеина и других производных цистеина, таких как N-изобутирил-L-цистеин (L-NIBC), N-изобутирил-D-цистеин (D-NIBC), N-ацетил-L-цистеин (L-NAC) и N-ацетил-D-цистеин (D-NAC), цистеинсодержащих олигопептидов и их производных, включая, но не ограничиваясь ими, дипептиды, трипептиды, тетрапептиды и другие пептиды, содержащие цистеин, такие как дипептид L-цистеин-L-аргинин (CR), дипептид L-аргинин-L-цистеин (RC), L-цистеин-L-гистидин (СН), трипептид глицин-L-цистеин-L-аргинин (GCR), трипептид L-пролин-L-цистеин-L-аргинин (PCR), L-глутатион (GSH), тетрапептид глицин-L-серин-L-цистеин-L-аргинин (GSCR) и тетрапептид глицин-L-цистеин-L-серин-L-аргинин (GCSR), и других тиолсодержащих соединений, таких как одно или более из 1-[(2S)-2-метил-3-тиол-1-оксопропил]-L-пролина, тиогликолевой кислоты, меркаптоэтанола, тиофенола, D-3-троловола, додецилмеркаптана и смеси двух или более из них. В некоторых вариантах осуществления раствор первого лиганда состоит из растворителя, выбранного из группы, состоящей из воды, метанола, этанола, н-пропанола, 1-пропанола, 2-пропанола, 1-бутанола, 2-бутанола, пентанола, этилформиата, метилацетата, этилацетата, пропилацетата, изопропилацетата, бутилацетата, изобутилацетата, 2-метил-1-пропанола и смеси двух или более из них. В некоторых вариантах осуществления концентрация первого лиганда в растворе первого лиганда находится в диапазоне 5-150 г/л, предпочтительно 20-80 г/л. В некоторых вариантах осуществления раствор первого лиганда находится в диапазоне 0,01-0,6 объема. В некоторых вариантах осуществления молярное соотношение между первым лигандом и HAuCL находится в диапазоне от 1:1 до 20:1, предпочтительно от 2:1 до 5:1. В некоторых вариантах осуществления время реакции раствора первой смеси составляет 0,5-2 часа.

66. добавление раствора NaBH₄ к раствору первой смеси с образованием раствора второй смеси 1230. В некоторых вариантах осуществления раствор NaBH₄ состоит из растворителя, выбранного из группы, состоящей из воды, метанола, этанола, н-пропанола, 1-пропанола, 2-пропанола, 1-бутанола, 2-бутанола, пентанола, этилформиата, метилацетата, этилацетата, пропилацетата, изопропилацетата, бутилацетата, изобутилацетата, 2-метил-1-пропанола и смеси двух или более из них. В некоторых вариантах осуществления концентрация NaBH₄ в растворе NaBH₄ находится в диапазоне 1-100 г/л, предпочтительно 10-50 г/л. В некоторых вариантах объем раствора NaBH₄ находится в диапазоне 0,01-0,6. В некоторых вариантах осуществления молярное соотношение между NaBH₄ и HAuCl₄ находится в диапазоне от 1:1 до 10:1, предпочтительно от 1:1 до 5:1. В некоторых вариантах осуществления период реакции раствора второй смеси находится в диапазоне 5-100 минут.

67. добавление апротонного полярного растворителя к раствору второй смеси для прекращения реакции и получения раствора третьей смеси 1240. В некоторых вариантах осуществления апротонный полярный растворитель выбран из группы, состоящей из диметилсульфоксида (ДМСО), ацетона, ацетонитрила, диметилформамида (ДМФА), диметилацетамида (ДМАЦ), гексаметилфосфорамида (ГМФ), хлороформа, четыреххлористого углерода, пиридина и смеси двух или более из них.

68. центрифугирование раствора третьей смеси для сбора твердого осадка 1250. В некоторых вариантах осуществления центрифугирование осуществляют в диапазоне 1500-6000g, предпочтительно 2000-5000g.

69. растворение твердого осадка со стадии 1250 в растворе второго лиганда для получения раствора четвертой смеси и поддержания раствора четвертой смеси в течение периода времени 1260. В некоторых вариантах осуществления второй лиганд выбран из L-цистеина, D-цистеина и других производных цистеина, таких как N-изобутирил-L-цистеин (L-NIBC), N-изобутирил-D-цистеин (D-NIBC), N-ацетил-L-цистеин (L-NAC) и N-ацетил-D-цистеин (D-NAC), цистеинсодержащих олигопептидов и их производных, включая, но не ограничиваясь ими, дипептиды, трипептиды, тетрапептиды и другие пептиды, содержащие цистеин, такие как дипептид L-цистеин-L-аргинин (CR), дипептид L-аргинин-L-цистеин (RC), L-цистеин-L-гистидин (СН), трипептид глицин-L-цистеин-L-аргинин (GCR), трипептид L-пролин-L-цистеин-L-аргинин (PCR), L-глутатион (GSH), тетрапептид глицин-L-серин-L-цистеин-L-аргинин (GSCR) и тетрапептид глицин-L-цистеин-L-серин-L-аргинин (GCSR), и других тиолсодержащих соединений, таких как одно или более из 1-[(2S)-2-метил-3-тиол-1-оксопропил]-L-пролина, тиогликолевой кислоты, меркаптоэтанола, тиофенола, D-3-троловола, додецилмеркаптана и смеси двух или более из них. В некоторых вариантах осуществления раствор второго лиганда состоит из растворителя, выбранного из группы, состоящей из воды, метанола, этанола, н-пропанола, 1-пропанола, 2-пропанола, 1-бутанола, 2-бутанола, пентанола, этилформиата, метилацетата, этилацетата, пропилацетата, изопропилацетата, бутилацетата, изобутилацетата, 2-метил-1-пропанола и смеси двух или более из них. В некоторых вариантах осуществления первый лиганд и второй лиганд являются одними и теми же. В некоторых вариантах осуществления растворители в растворе первого лиганда и растворе второго лиганда являются одними и теми же. В некоторых вариантах осуществления концентрация второго лиганда в растворе второго лиганда находится в диапазоне 5-100 г/л, предпочтительно 20-50 г/л. В некоторых вариантах осуществления раствор второго лиганда находится в диапазоне 0,1-10 объемов, предпочтительно 1-2 объема. Следует отметить, что «объем» в настоящем документе относится к тому же обозначению, что и указано выше. В некоторых вариантах осуществления молярное соотношение между вторым лигандом и HAuCl₄ находится в диапазоне от 1:1 до 20:1, предпочтительно от 2:1 до 5:1. В некоторых вариантах осуществления период времени находится в диапазоне от 3 до 24 часов.

70. центрифугирование раствора четвертой смеси для получения супернатанта 1270. В некоторых вариантах осуществления центрифугирование находится в диапазоне 2000-8000g, предпочтительно 3000-5000g. В некоторых вариантах осуществления время центрифугирования находится в диапазоне 3-50 минут, предпочтительно 5-15 минут.

71. диализ супернатанта в диализном мешке с заданным пороговым размером молекулы 1280. В некоторых вариантах осуществления пороговый размер молекулы находится в диапазоне 500-5000 Дальтон. В некоторых вариантах осуществления диализ проводят в сверхчистой воде, и воду меняют 3-10 раз.

72. лиофилизация диализированного супернатанта для получения порошка AuCs 1290.

73. Следующие примеры приведены с единственной целью иллюстрации принципов настоящего изобретения; они никоим образом не предназначены для ограничения объема настоящего изобретения.

74. Примеры

75. Вариант осуществления 1. Получение AuCs, модифицированных лигандом

76. 1.1 HAuCl₄ растворяли в метаноле, воде, этаноле, н-пропаноле или этилацетате для получения раствора А, в котором концентрация HAuCl₄ составляет 0,01-0,03 М;

77. 1.2 Лиганд растворяли в растворителе для получения раствора В, в котором концентрация лиганда составляет 0,01~0,18 М; при этом лиганд включает, но не ограничивается ими, L-цистеин, D-цистеин и другие производные цистеина, такие как N-изобутирил-L-цистеин (L-NIBC), N-изобутирил-D-цистеин (D-NIBC), N-ацетил-L-цистеин (L-NAC) и N-ацетил-D-цистеин (D-NAC), цистеинсодержащие олигопептиды и их производные, включая, но не ограничиваясь ими, дипептиды, трипептиды, тетрапептиды и другие пептиды, содержащие цистеин, такие как дипептид L-цистеин-L-аргинин (CR), дипептид L-аргинин-L-цистеин (RC), L-цистеин-L-гистидин (СН), трипептид глицин-L-цистеин-L-аргинин (GCR), трипептид L-пролин-L-цистеин-L-аргинин (PCR), L-глутатион (GSH), тетрапептид глицин-L-серин-L-цистеин-L-аргинин (GSCR) и тетрапептид глицин-L-цистеин-L-серин-L-аргинин (GCSR), и другие тиолсодержащие соединения, такие как одно или более из 1-[(2S)-2-метил-3-тиол-1-оксопропил]-L-пролин, тиогликолевая кислота, меркаптоэтанол, тиофенол, D-3-троловол и додецилмеркаптан; при этом растворитель представляет собой один или более из метанола, этилацетата, воды, этанола, н-пропанола, пентана, муравьиной кислоты, уксусной кислоты, диэтилового эфира, ацетона, анизола, 1-пропанола, 2-пропанола, 1-бутанола, 2-бутанола, пентанола, бутилацетата, трибутилметилового эфира, изопропилацетата, диметилсульфоксида, этилформиата, изобутилацетата, метилацетата, 2-метил-1-пропанола и пропилацетата;

78. 1.3 Раствор А и раствор В смешивали таким образом, чтобы молярное соотношение между HAuCl₄ и лигандом составляло 1:(0,01~100), перемешивая их на бане со льдом в течение 0,1~48 часов, добавив 0,025~0,8 М раствор NaBH₄ в воде, этаноле или метаноле, продолжая перемешивать на бане с ледяной водой и проводить реакцию в течение 0,1-12 часов. Молярное соотношение между NaBH₄ и лигандом составляет 1:(0,01~100);

79. 1.4 Пробирки для ультрафильтрации MWCO 3K~30K применяли для центрифугирования реакционного раствора со скоростью 8000~17500 об/мин в градиенте в течение 10~100 минут после окончания реакции для получения осадка AuCs, модифицированного лигандом, с различными средними размерами частиц. Отверстие фильтрационных мембран для пробирок для ультрафильтрации с различными MWCO непосредственно определяет размер AuCs, модифицированных лигандом, которые могут проходить через мембраны. Этот шаг может быть опционально опущен;

80. 1.5 Осадок AuCs, модифицированного лигандом, с различными средними размерами частиц, полученными на стадии (1.4), растворяли в воде, помещали его в мешок для диализа, и проводили диализ в воде при комнатной температуре в течение 1~7 дней;

81. 1.6 AuCs, модифицированные лигандом, лиофилизировали в течение 12~24 часов после диализа для получения субстанции в виде порошка или флокулянта, т.е. AuCs, модифицированных лигандом.

82. Как было обнаружено, размер частиц субстанции в виде порошка или флокулянта, полученного вышеописанным способом, меньше 3 нм (в целом 0,5-2,6 нм). Явного пика поглощения при 520 нм нет. Определено, что полученный порошок или хлопья представляют собой AuCs, модифицированные лигандом.

83. Вариант 2. Получение и характеристика AuCs, модифицированных разными лигандами

84. 2.1 Получение L-NIBC-AuCs

85. Взяв, например, лиганд L-NIBC, подробно описано получение и подтверждение AuCs, модифицированных лигандом L-NIBC.

86. 2.1.1 Взвешивали 1,00 г HAuCl₄ и растворяли его в 100 мл метанола, чтобы получить 0,03 М раствор А;

87. 2.1.2 Взвешивали 0,57 г L-NIBC и растворяли его в 100 мл ледяной уксусной кислоты (уксусной кислоты), чтобы получить 0,03 М раствор В;

88. 2.1.3 Отмеряли 1 мл раствора А, смешивали его с 0,5 мл, 1 мл, 2 мл, 3 мл, 4 мл или 5 мл раствора В соответственно (т.е. молярное соотношение между HAuCl₄ и L-NIBC составляет 1:0,5, 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5 соответственно), проводили реакцию на бане со льдом при перемешивании в течение 2 часов, быстро добавляли 1 мл свежеприготовленного 0,03М (приготовленного путем взвешивания 11,3 мг NaBH₄ и растворения его в 10 мл этанола) раствора NaBH₄ в этаноле, когда раствор становился бесцветным с ярко-желтого, продолжали реакцию в течение 30 минут после того, как раствор становился темно-коричневым, и добавляли 10 мл ацетона, чтобы остановить реакцию.

89. 2.1.4 После реакции реакционный раствор подвергали градиентному центрифугированию с получением порошка L-NIBC-AuCs с частицами разного размера. Конкретный способ: После завершения реакции реакционный раствор переносили в пробирку для ультрафильтрации с MWCO 30K и объемом 50 мл и центрифугировали при 10000 об/мин в течение 20 мин, а ретентат во внутренней пробирке растворяли в сверхчистой воде с получением порошка с размером частиц примерно 2,6 нм. Затем смешанный раствор во внешней пробирке переносили в пробирку для ультрафильтрации объемом 50 мл с MWCO 10К и центрифугировали при 13000 об/мин в течение 30 мин. Ретентат во внутренней пробирке растворяли в сверхчистой воде с получением порошка с размером частиц примерно 1,8 нм. Затем смешанный раствор во внешней пробирке переносили в пробирку для ультрафильтрации объемом 50 мл с MWCO 3К и центрифугировали при 17500 об/мин в течение 40 мин. Ретентат во внутренней пробирке растворяли в сверхчистой воде с получением порошка с размером частиц примерно 1,1 нм.

90. 2.1.5 Порошок в виде частиц трех разных размеров, полученных градиентным центрифугированием, осаждали, соответственно удаляли растворитель, высушивали неочищенный продукт с помощью N₂, растворяли его в 5 мл сверхчистой воды, помещали в диализный мешок (MWCO составляет 3 кДа), диализный мешок помещали в 2 л сверхчистой воды, меняли воду через день, проводили диализ в течение 7 дней, лиофилизировали и хранили для применения в будущем.

91. 2.2 Характеристика L-NIBC-AuCs

92. Эксперимент по определению характеристик проводили для порошка, полученного выше (L-NIBC-AuCs). Между тем, наночастицы золота, модифицированные лигандом L-NIBC (L-NIBC-AuNP) применяли в качестве контроля. Способ получения наночастиц золота с лигандом, представляющим собой L-NIBC, относится к ссылке (W. Yan, L. Xu, С.Xu, W. Ma, H. Kuang, L. Wang and N.A. Kotov, Journal of the American Chemical Society 2012, 134, 15114; X. Yuan, B. Zhang, Z. Luo, Q. Yao, D. T. Leong, N. Yan and J. Xie, Angewandte Chemie International Edition 2014, 53, 4623).

93. 2.2.1 Наблюдение морфологии с помощью просвечивающего электронного микроскопа (ПЭМ)

94. Порошки для испытаний (образец L-NIBC-AuCs и образец L-NIBC-AuNPs) растворяли в ультрачистой воде до 2 мг/л в качестве образцов, а затем образцы для испытаний готовили способом висячей капли. В частности, 5 мкл образцов капали на ультратонкую углеродную пленку, испаряли естественным образом до исчезновения капли воды, а затем наблюдали морфологию образцов с помощью ПЭМ высокого разрешения с полевой эмиссией JEM-2100F STEM/EDS.

95. Четыре ПЭМ-изображения L-NIBC-AuNPs показаны на панелях В, Е, Н и К на ФИГ. 1; три ПЭМ-изображения L-NIBC-AuCs показаны на панелях В, Е и Н на ФИГ. 2.

96. Изображения на ФИГ. 2 показывают, что каждый из образцов L-NIBC-AuCs имеет одинаковый размер частиц и хорошую диспергируемость, а средний диаметр L-NIBC-AuCs (относится к диаметру золотого ядра) составляет 1,1 нм, 1,8 нм и 2,6 нм соответственно, что хорошо согласуется с результатами на панелях С, F и I на ФИГ. 2. Для сравнения, образцы L-NIBC-AuNPs имеют больший размер частиц. Их средний диаметр (относится к диаметру золотого ядра) составляет 3,6 нм, 6,0 нм, 10,1 нм и 18,2 нм соответственно, что хорошо согласуется с результатами на панелях С, F, I и L на ФИГ. 1.

97. 2.2.2 Спектр поглощения в ультрафиолетовой (УФ)-видимой (Вид) области

98. Порошки для испытаний (образец L-NIBC-AuCs и образец L-NIBC-AuNPs) растворяли в сверхчистой воде до концентрации 10 мг⋅л¹ и измеряли спектры поглощения в УФ-Вид области при комнатной температуре. Диапазон сканирования составлял 190-1100 нм, кювета для образцов представляла собой стандартную кварцевую кювету с оптическим путем 1 см, ячейку сравнения заполняли сверхчистой водой.

99. Спектры поглощения в УФ-Вид области четырех образцов L-NIBC-AuNPs разных размеров показаны на панелях A, D, G и J на ФИГ. 1, а статистическое распределение частиц по размерам показано на панелях С, F, I и L на ФИГ. 1; спектры поглощения в УФ-Вид области трех образцов L-NIBC-AuCs разных размеров показаны на панелях A, D и G на ФИГ. 2, а статистическое распределение частиц по размерам показано на панелях С, F и I на ФИГ. 2.

100. На ФИГ. 1 показано, что из-за поверхностного плазмонного эффекта L-NIBC-AuNPs имели пик поглощения примерно при 520 нм. Положение пика поглощения зависит от размера частиц. При размере частиц 3,6 нм пик УФ-поглощения появляется при 516 нм; при размере частиц 6,0 нм пик УФ-поглощения появляется при 517 нм; при размере частиц 10,1 нм пик УФ-поглощения появляется при 520 нм, а при размере частиц 18,2 нм пик поглощения появляется при 523 нм. Ни один из четырех образцов не имеет пика поглощения выше 560 нм.

101. На ФИГ. 2 показано, что в УФ-спектрах поглощения трех образцов L-NIBC-AuCs с разными размерами частиц пик поглощения поверхностного плазмонного эффекта при 520 нм исчез, и два очевидных пика поглощения появились выше 560 нм, а положение пиков поглощения незначительно варьировалось с учетом размеров частиц AuCs. Это связано с тем, что AuCs проявляют свойства, подобные молекулам, вследствие коллапса гранецентрированной кубической структуры, что приводит к разрыву плотности состояний AuCs, расщеплению энергетических уровней, исчезновению эффекта плазмонного резонанса и появлению нового пика поглощения в длинноволновом направлении Можно сделать вывод, что все три образца порошка с разным размером частиц, полученные выше, представляют собой AuCs, модифицированные лигандом.

102. 2.2.3 Инфракрасная спектроскопия с преобразованием Фурье

103. Инфракрасные спектры измеряли на инфракрасном Фурье-спектрометре VERTEX80V производства Bruker в режиме полного отражения с твердым порошком в высоком вакууме. Диапазон сканирования составлял 4000-400 см^-1, а количество сканирований составляло 64. Например, для образцов L-NIBC-AuCs, образцы для испытаний представляли собой сухой порошок L-NIBC-AuCs с тремя различными размерами частиц, а контрольный образец представлял собой чистый порошок L-NIBC. Результаты показаны на ФИГ. 3.

104. На ФИГ. 3 показан инфракрасный спектр L-NIBC-AuCs с частицами разного размера. По сравнению с чистым L-NIBC (кривая внизу) валентные колебания SH в L-NIBC-AuCs с разным размером частиц полностью исчезли при 2500-2600 см^-1, в то время как другие характеристические пики L-NIBC все еще наблюдались, доказывая, что молекулы L-NIBC были успешно закреплены на поверхности AuCs с помощью связи Au-S. На фигуре также показано, что инфракрасный спектр AuCs, модифицированных лигандом, не зависит от их размера.

105. AuCs, модифицированные другими лигандами, получали способом, аналогичным описанному выше, за исключением того, что растворитель раствора В, соотношение подачи между HAuCl₄ и лигандом, время реакции и количество добавляемого NaBH₄ слегка корректировали. Например: когда в качестве лиганда применяли L-цистеин, D-цистеин, N-изобутирил-L-цистеин (L-NIBC) или N-изобутирил-D-цистеин (D-NIBC), в качестве растворителя выбирали уксусную кислоту; когда в качестве лиганда применяли дипептид CR, дипептид RC или 1-[(2S)-2-метил-3-тиол-1-оксопропил]-L-пролин, в качестве растворителя выбирали воду и так далее и тому подобное; другие стадии являются аналогичными, поэтому в настоящем документе не приводится никаких дополнительных подробностей.

106. В рамках настоящего изобретения описанным выше способом была приготовлена и получена серия AuCs, модифицированных лигандом. Лиганды и параметры способа получения показаны в Таблице 1.

107.

108. Образцы, перечисленные в Таблице 1, подтверждены вышеуказанными способами. Характеристики пяти различных AuCs, модифицированных лигандом, показаны на ФИГ. 4 (CR-AuCs), на ФИГ. 5 (RC-AuCs), на ФИГ. 6 (Cap-AuCs) (Сар обозначает 1-[(2S)-2-метил-3-тиол-1-оксопропил]-L-пролин), на ФИГ. 7 (GSH-AuCs) и на ФИГ. 8 (D-NIBC-AuCs). На ФИГ. 4-8 показаны УФ-спектры (панель А), инфракрасные спектры (панель В), изображения, полученные с помощью ПЭМ (панель С), и распределение частиц по размерам (панель D).

109. Результаты показывают, что все диаметры AuCs, модифицированных различными лигандами, полученные из Таблицы 1, меньше 3 нм. В ультрафиолетовых спектрах также наблюдается исчезновение пика при 520±20 нм и появление пика поглощения выше 560 нм. Только положение этого пика поглощения незначительно меняется в зависимости от лиганда и размера частиц. Между тем, инфракрасные спектры с преобразованием Фурье также показывают исчезновение пика инфракрасного поглощения тиолов лиганда (между пунктирными линиями на панели В на ФИГ. 4-8), в то время как все другие пики инфракрасных характеристик сохраняются, что позволяет предположить, что все молекулы лиганда были успешно закреплены на поверхности AuCs, и в рамках настоящего изобретения были успешно получены AuCs, модифицированные лигандами, перечисленными в Таблице 1.

110. Вариант осуществления 3

111. 3.1 Материалы и животные

112. 3.1.1 Образец для испытаний

113. 3.1.1.1 L-NIBC-AuCs с диаметром ядра 1,5 нм синтезировали в соответствии с приведенным ниже протоколом.

114. 0,5 объема метанольного раствора HAuCl₄ с концентрацией 5 г/л добавляли в реакционный сосуд для предварительного охлаждения до 0°С без света. Затем метанольный раствор HAuCl₄ выдерживали при 0°С и медленно перемешивали. Последовательно добавляли 0,05 объема уксусной кислоты (выше аналитической чистоты) и 0,1 объема метанольного раствора NIBC с концентрацией 40 г/л. После 1 часа реакции скорость вращения увеличивали и добавляли 0,3 объема 15 г/л этанольного раствора NaBH₄. Раствор продолжал реагировать в течение 30 минут, затем реакцию останавливали добавлением достаточного количества ацетона. Затем раствор центрифугировали при 4000 об/мин в течение 10 минут. Супернатант удаляли для сбора нижнего твердого осадка. Затем к твердому осадку добавляли 1 объем 30 г/л водного раствора NIBC, который растворяли и герметизировали для старения. После выдержки в течение 24 часов раствор центрифугировали при 4000 об/мин в течение 10 минут для удаления осадка, а супернатант помещали в диализный мешок с молекулярной массой 3000, который помещали в сверхчистую воду для диализа. После 5-кратного диализа раствор из диализного мешка извлекали и лиофилизировали с получением порошка для применения в качестве образца для испытаний. Образец для испытаний имел диаметр 1,5 нм и сферическую форму, как показано на изображении, полученном с помощью ПЭМ (ФИГ. 2K). Спектр поглощения образца для испытаний в УФ-Вид области показан на ФИГ. 2J, а статистическое распределение частиц по размерам показано на ФИГ. 2L.

115. 3.1.1.2 Спецификация: 25 мг/флакон;

116. 3.1.1.3 Признаки: Серо-коричневый порошок;

117. 3.1.1.4 Условия хранения: 2~8°С Консервация в закрытом помещении;

118. 3.1.2 Положительный контрольный образец

119. 3.1.2.1 Название: Таблетки пиоглитазонагидрохлорида;

120. 3.1.2.2 Номер партии: 1809001;

121. 3.1.2.3 Признаки: Белый или похожий на белый предмет;

122. 3.1.2.4 Спецификация/чистота: пиоглитазон 15 мг;

123. 3.1.2.5 Упаковка: алюминиевая пластиковая упаковка, 7 штук в коробке;

124. 3.1.2.6 Дата производства: 20180901;

125. 3.1.2.7 Годен до: 202108;

126. 3.1.2.8 Производитель: Yantai Zhengfang Pharmaceutical Co., Ltd.;

127. 3.1.2.9 Клиническая доза или рекомендуемая доза для человека: начальная доза может составлять 15 мг или 30 мг один раз в день. Если первоначальная доза не дает хорошего ответа, добавляли до 45 мг один раз в день.

128. 3.1.2.10 Условия хранения: в закрытом герметичном состоянии.

129. 3.1.3 Инструменты

130. 3.1.3.1 Электронные аналитические весы (Shanghai Yousheng Weighing Apparatus Co., Ltd.; Sartorius Scientific Instruments (Beijing) Technology Co., Ltd.);

131. 3.1.3.2 Глюкометр и тест-полоска для определения уровня глюкозы в крови (Johnson & Johnson);

132. 3.1.3.3 Автоматический дегидратор LEICA® ASP300S;

133. 3.1.3.4 Машина для заливки биологических тканей LEICA® EG1150;

134. 3.1.3.4 Роторный слайсер LEICA®, модель RM2235;

135. 3.1.3.5 Распределитель LEICA® HI1210;

136. 3.1.3.6 Осушитель LEICA® HI1220;

137. 3.1.3.7 Машина для автоматического окрашивания LEICA® AutoStainer-XL;

138. 3.1.3.8 Биологический микроскоп OLYMPUS® ВХ43;

139. 3.1.3.9 Программное обеспечение для микроскопических изображений OLYMPUS® CellSens Dimension;

140. 3.1.3.10 Программное обеспечение для анализа изображений Image-Pro® Plus, версия 6.0.

141. 3.1.4 Реагенты

142. 3.1.4.1 Раствор хлорида натрия (Guangdong Kelun Pharmaceutical Co., Ltd.);

143. 3.1.4.2 Карбоксиметилцеллюлоза натрия (Tianjin Fuchen Chemical Reagent Factory); точно взвешивали 5,0 г КМЦ-Na, медленно добавляли в 800 мл очищенной воды в химическом стакане при перемешивании магнитной мешалкой до растворения; 2-8°С, в течение ночи; разводили до 1000 мл на следующий день; и хранили при 2-8°С для последующего применения;

144. 3.1.4.3 Глюкоза (Guangdong Guanghua Technology Co., Ltd.); готовили раствор глюкозы 0,25 г/мл, добавляя 7,5 г глюкозы в очищенную воду до конечного объема 30 мл; готовили раствор глюкозы 0,125 г/мл, добавляя 7,5 г глюкозы в очищенную воду до конечного объема 60 мл;

145. 3.1.4.4 Стрептозотоцин (СТЗ) (MP Bio company); раствор для нанесения СТЗ с концентрацией 5 мг/мл готовили путем растворения 0,15 г СТЗ в 30 мл нитратного буфера с концентрацией 0,1 моль/л;

146. 3.1.4.5 Моногидрат лимонной кислоты, безводный этанол, 95% этанол (Guangdong Guanghua Technology Co., Ltd.); цитрат натрия (Guangzhou Zhongnan Chemical Reagent Co., Ltd.); цитратный буфер с концентрацией 0,1 моль/л готовили следующим образом: добавляли 2,1 г моногидрата лимонной кислоты в деионизированную воду до конечного объема 100 мл, который представляет собой жидкость А; путем добавления 2,94 г цитрата натрия в деионизированную воду до конечного объема 100 мл, что представляет собой жидкость В; при использовании смешивали А и В в соотношении 1:1~1,2, доводили рН до 4,2~4,5; хранили при 2~8°С.

147. 3.1.4.6 Парафин (Maoming Dachuan Special Wax Factory Co., Ltd.);

148. 3.1.4.7 Прозрачный агент (Shanghai Hongzi Industrial Co., Ltd.);

149. 3.1.4.8 Розовый краситель (водорастворимый) (Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd.); и

150. 3.1.4.9 Су Мусу (Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd).

151. 3.2 Эксперимент на животных

152. 3.2.1 В исследованиях диабета чаще всего применяют мышей C57BL/6. 90 мышей-самцов линии C57BL/6 (уровень SPF) с массой тела 18,8-24,2 г в начале эксперимента были приобретены в Медицинском лабораторном центре животных провинции Гуандун (лицензия на производство экспериментальных животных №SCXK (Yue) 2018-0002; сертификат на животных №44007200059759);

153. 3.2.2 Содержание и процедуры, связанные с испытаниями на животных, соответствуют применимым законам и правилам, регулирующим использование и управление лабораторными животными, и соответствующим положениям Институционального комитета по этике лабораторных животных для обеспечения благополучия животных;

154. 3.2.3 В конце экспериментов мышам внутрибрюшинно вводили 3% раствор пентобарбитала натрия в количестве 1 мл/кг массы тела, собирали глазные яблоки и кровь, а затем умерщвляли путем смещения шейных позвонков;

155. 3.2.4 Мышей помещали в карантин на 4 дня с ежедневным осмотром;

156. 3.2.5 Мышей содержали в одиночной клетке с 12-часовым: 12-часовым дневным/ночным освещением; состояние помещения всегда было стабильным, чтобы обеспечить достоверность результатов испытаний. Мыши могли свободно есть и пить во время экспериментов.

157. 3.2.6 Дизайн дозы и распределение на группы

158. 3.2.6.1 Схема дозирования: Доза испытуемого образца составляет 10 мг/кг массы тела. Клиническая доза таблеток пиоглитазона гидрохлорида составляет 45 мг/день для человека, т.е. 0,75 мг/кг массы тела, исходя из средней массы тела взрослого человека 60 кг; тестовая доза в 30 раз превышает клиническую дозу для человека; так, группе положительного контроля вводили дозу 22,5 мг/кг массы тела;

159. 3.2.6.2 Распределение на группы: после окончания карантина у животных, которых не кормили в течение примерно 5 часов, брали кровь из хвоста, измеряли уровень глюкозы в крови (0 часов), и вводили раствор глюкозы 0,25 г/мл из расчета 10 мл/кг массы тела, и уровень глюкозы в крови измеряли через 0,5 часа. Шесть мышей со слишком высоким или слишком низким уровнем глюкозы в крови были исключены. Оставшихся мышей разделили на группу отрицательного контроля, модельную контрольную группу, группу положительного контроля и группу образцов по 12 мышей на группу (Таблица 2).

160. Таблица 2. Распределение мышей на группы 161.

161.

162. 3.2.7 Способы

163. 3.2.7.1 Высокоэнергетическое питание

164. Животный жир 10%, сахароза 15%, порошок яичного желтка 15%, казеин 5%, холестерин 1,2%, холат натрия 0,2%, гидрофосфат кальция 0,6%, каменная мука 0,4%, поддерживающий материал для мышей 52,6%.

165. 3.2.7.2 Подготовка образцов: Образец для испытаний по настоящему изобретению готовили путем добавления раствора хлорида натрия для инъекций во флакон с образцом до получения концентрации 0,5 мг/мл; затем хранили при 2~8°С в защищенном от света месте. Образец положительного контроля готовили путем смешивания 1 таблетки гидрохлорида пиоглитазона (спецификация 15 мг/таблетка) с 0,5% раствором КМЦ-Na и равномерного измельчения, затем добавляли 0,5% раствор КМЦ-Na до конечного объема 13,3 мл и хорошо встряхивали перед применением.

166. 3.2.7.3 Создание диабетической модели

167. После того, как каждая группа получала поддерживающий корм в течение 1 недели, за исключением группы отрицательного контроля, для других групп осуществляли замену на высококалорийный корм из 3.1.7.1. Через 3 недели кормления каждой группе обеспечивали голодание в течение 24 часов. За исключением группы отрицательного контроля, остальным группам внутрибрюшинно вводили 5 мг/мл раствора СТЗ в дозе 20 мл/кг массы тела. Все группы кормили в течение 4 дней. Глюкозу в крови натощак и толерантность к глюкозе измеряли на 5-й день, а испытание прекращали на следующий день.

168. 3.2.7.4 Введение образца для испытаний и образца положительного контроля

169. После кормления поддерживающим кормом группе образцов внутрибрюшинно вводили раствор образца для испытаний один раз в день в количестве 20 мл/кг массы тела, группе отрицательного контроля и модельной контрольной группе внутрибрюшинно вводили раствор хлорида натрия, а группе положительного контроля группе внутрижелудочно вводили раствор пиоглитазона гидрохлорида в дозе 20 мл/кг массы тела в течение 34 дней до окончания испытания. В день введения СТЗ каждой группе осуществляли введение через 4 ч после введения СТЗ.

170. 3.2.7.5 Измерение последнего уровня глюкозы в крови натощак и толерантности к глюкозе, а также извлечение материала

171. На 5-й день после внутрибрюшинной инъекции СТЗ мышам в каждой группе обеспечивали голодание в течение примерно 5 часов с обеспечением водой. После измерения уровня глюкозы в крови натощак (0 ч) группе образцов и группе положительного контроля внутрибрюшинно вводили соответствующие лекарственные средства. Группе отрицательного контроля и модельной контрольной группе внутрибрюшинно вводили раствор хлорида натрия. Через 20 мин каждой группе внутрижелудочно вводили 0,125 г/мл раствора глюкозы из расчета 20 мл/кг массы тела и измеряли уровень глюкозы в крови через 0,5, 1, 1,5, 2 ч после введения раствора глюкозы. На следующий день мышам в каждой группе обеспечивали голодание в течение 5 ч после введения. Мышей анестезировали 3% раствором пентобарбитала натрия в количестве 10 мл/кг массы тела и умерщвляли после забора глазных яблок и крови. Образцы крови центрифугировали при 3000 об/мин в течение 10 мин и собирали сыворотку для определения сывороточного инсулина, триглицеридов и общего холестерина. Одновременно собирали поджелудочную железу каждого животного. Шесть животных в каждой группе фиксировали 10% параформальдегидом для окрашивания с помощью НЕ и иммуногистохимического окрашивания инсулином в поджелудочной железе. Остальные 6 животных были сохранены при -80°С для определения содержания инсулина.

172. 3.2.8 Индикаторы обнаружения

173. 3.2.8.1 Общее клиническое наблюдение

174. Общее клиническое состояние животных наблюдали один раз в день до конца исследования.

175. 3.2.8.2 Масса тела

176. Взвешивание проводили в начале исследования, в конце исследования и один раз в неделю во время исследования.

177. 3.2.8.3 Потребление корма

178. Каждую неделю потребление корма животными за два дня измеряли один раз путем взвешивания добавленного корма и оставшегося корма на следующий день.

179. 3.2.8.4 Скорость снижения уровня глюкозы в крови

180. Скорость снижения уровня глюкозы в крови = (значение уровня глюкозы в крови до эксперимента - значение уровня глюкозы в крови после эксперимента) / (значение уровня глюкозы в крови до эксперимента) × 100%.

181. 3.2.8.5 Площадь под кривой толерантности к глюкозе в крови

182. Рассчитывали площадь под кривой уровня глюкозы крови через 0, 0,5, 1, 1,5, 2 ч после введения глюкозы. Формула выглядит следующим образом:

183. Площадь под кривой уровня глюкозы в крови: [(0 ч глюкоза в крови + 0,5 ч глюкоза в крови) × 0,5] / 2+[(0,5 ч глюкоза в крови + 1 ч глюкоза в крови) × 0,5] / 2+[(1 ч глюкоза в крови + 1,5 ч) уровень глюкозы в крови) × 0,5] / 2 + [(1,5 ч уровень глюкозы в крови + 2 ч значение глюкозы в крови) × 0,5] / 2.

184. 3.2.8.6 Сывороточный инсулин, холестерин и триглицериды

185. В конце эксперимента собирали сыворотку для анализа сывороточного инсулина, триглицеридов и общего холестерина. Рассчитывали индекс инсулинорезистентности.

186. Индекс инсулинорезистентности = инсулин / 22,5е^{-глюкоза в крови}

187. 3.2.8.7 Окрашивание с помощью НЕ

188. После того, как поджелудочную железу от 6 животных в каждой группе фиксировали 10% параформальдегидом, воспаление островков наблюдали с применением окрашивания с помощью НЕ и проводили полуколичественную оценку по шкале 0~4.

189. 0: Нет патологических изменений;

190. 1: Периферическое воспаление островков: признаки патологической инфильтрации, патологические изменения ограничены периферией островков;

191. 2: легкое воспаление островков: менее 25% островков имеют патологические инфильтрационные изменения;

192. 3: Умеренное воспаление островков: от 25% до 75% островков демонстрируют патологические инфильтрационные изменения;

193. 4: тяжелое воспаление островков: более 75% островков имеют патологические инфильтрационные изменения.

194. 3.2.8.8 Иммуногистохимия

195. Ткани поджелудочной железы, фиксированные 10% параформальдегидом, использовали для иммуногистохимии для определения экспрессии инсулина.

196. 3.2.8.9 Определение содержания инсулина в ткани поджелудочной железы

197. Ткань поджелудочной железы остальных 6 животных в каждой группе хранили при 80°С для ИФА для определения содержания инсулина в поджелудочной железе.

198. 3.2.9 Оценка результатов

199. 3.2.9.1 Условия построения модели нарушения метаболизма глюкозы

200. Модельная контрольная группа имела уровень глюкозы в крови ≥10 ммоль/л через 0,5 ч, или уровень глюкозы в крови или площадь под кривой глюкозы в любой момент времени через 0,5, 1, 1,5 и 2 ч имели статистически значимое увеличение по сравнению с группой отрицательного контроля.

201. 3.2.9.2 Индекс глюкозы в крови натощак

202. При условии создания модели нарушения метаболизма глюкозы, по сравнению с модельной контрольной группой, снижение уровня глюкозы в крови натощак или снижение процентного содержания глюкозы в крови было статистически значимым, а индекс глюкозы в крови натощак в образце для испытаний был положительным.

203. 3.2.9.3 Индекс толерантности к глюкозе

204. При условии создания модели нарушения метаболизма глюкозы по сравнению с модельной контрольной группой группа образцов для испытаний была статистически значимой через 0, 1, 1,5 и 2 ч после введения раствора глюкозы, или площадь под кривой глюкозы в крови 0, 0,5, 1, 1,5 и 2 ч была статистически значимой, поэтому индекс толерантности к глюкозе образца для испытаний был положительным.

205. 3.2.10 Статистический анализ

206. Все данные были выражены с использованием программного обеспечения SPSS 21.0 для статистического анализа; масса тела, потребление пищи, уровень глюкозы в крови натощак после исследования, толерантность к глюкозе с использованием дисперсионного анализа повторных измерений; предварительное исследование уровня глюкозы в крови натощак, содержание ХС, сывороточный инсулин, панкреатический инсулин с использованием дисперсионного анализа после логарифмического преобразования. Среднюю оптическую плотность панкреатического инсулина измеряли с помощью Т-критерия; процент падения глюкозы в крови, площадь под кривой глюкозы в крови, содержание ТГ анализировали по критерию суммы рангов; и статистический анализ оценки воспаления островков с использованием критерия хи-квадрат. Уровень критерия равен α=0,05, а уровень критерия хи-квадрат скорректирован до α=0,0024.

207. 3.3 Результаты

208. 3.3.1 Наблюдение

209. До внутрибрюшинного введения СТЗ не было выявлено отклонений в общей клинической ситуации и втором стуле животных. После внутрибрюшинного введения СТЗ масса тела уменьшилась.

210. 3.3.2 Масса тела

211. Во время исследования статистических различий в массе тела между группами не было (Таблица 3).

212.

213. 3.3.3 Потребление пищи

214. По сравнению с контрольной группой, в группе положительного контроля потребление пищи увеличилось на 1-й неделе, и в группе образцов увеличилось потребление пищи на 1-й неделе, но уменьшилось на 2-й и 5-й неделе (Таблица 4).

215.

216. 3.3.4 Индекс глюкозы в крови натощак

217. По сравнению с группой отрицательного контроля, в модельной контрольной группе был повышен уровень глюкозы в крови натощак. Значение повышенного процента уровня глюкозы в крови натощак было отрицательным и статистически значимым по сравнению с группой отрицательного контроля (Р<0,05). По сравнению с модельной контрольной группой уровни глюкозы в крови натощак в группе образцов и группе положительного контроля значительно снизились (Р<0,05).

218.

219. 3.3.5 Индекс толерантности к глюкозе

220. По сравнению с группой отрицательного контроля уровень глюкозы в крови в модельной контрольной группе через 0,5 ч, 1 ч, 1,5 ч, 2 ч и площадь под кривой уровня глюкозы в крови были статистически значимыми (Р<0,01), и создана модель нарушения метаболизма глюкозы. По сравнению с модельной контрольной группой уровни глюкозы в крови в контрольной группе через 0,5 ч, 1 ч, 1,5 ч и 2 ч были статистически значимыми (Р<0,05 или Р<0,01).

221.

222. 3.3.6 Содержание инсулина в сыворотке

223. По сравнению с группой отрицательного контроля содержание инсулина в сыворотке в модельной контрольной группе статистически уменьшилось (Р<0,01). По сравнению с модельной контрольной группой содержание инсулина в сыворотке в группе положительного контроля статистически увеличилось (Р<0,05).

224. 3.3.7 Содержание панкреатического инсулина

225. По сравнению с группой отрицательного контроля содержание панкреатического инсулина в модельной контрольной группе статистически уменьшилось (Р<0,01). По сравнению с модельной контрольной группой содержание панкреатического инсулина в группе положительного контроля увеличилось, но незначительно (Р>0,05).

226. 3.3.8 Содержание холестерина (ХС)

227. По сравнению с группой отрицательного контроля содержание ХС в модельной контрольной группе статистически увеличилось (Р<0,01); по сравнению с модельной контрольной группой содержание ХС в группе выборки статистически уменьшилось (Р<0,01).

228. 3.3.9 Содержание триглицеридов (ТГ)

229. По сравнению с группой отрицательного контроля содержание ТГ в модельной контрольной группе увеличилось, но статистической значимости не было (Р>0,05). Содержание ТГ в группе с положительным лекарственным средством и в группе образца уменьшилось, но незначительно (Р>0,05).

230.

231. 3.3.10 Результаты окрашивания с помощью НЕ

232. По сравнению с группой отрицательного контроля (ФИГ. 9(a)), в модельной контрольной группе наблюдалось резкое уменьшение числа островков, объема островков и количества островковых клеток, а также выраженная инфильтрация лимфоцитов в островки (ФИГ. 9(b)), группа положительного контроля показала умеренное уменьшение количества островков, объема островков и количества островковых клеток, а также очевидную инфильтрацию лимфоцитов в островки (ФИГ. 9(c)), но в группе образца не было обнаружено явного уменьшения количества островков, объема островков и количества островковых клеток, и отсутствие инфильтрации лимфоцитов в островки (ФИГ. 9(d)).

233. 3.3.11 Результаты иммуногистохимии инсулина

234. По сравнению с группой отрицательного контроля (ФИГ. 10(a) и ФИГ. 11(a)), в модельной контрольной группе наблюдалось значительное уменьшение количества инсулинположительных островков и клеток поджелудочной железы (ФИГ. 10(b) и ФИГ. 11(b)), в группе положительного контроля наблюдалось значительное уменьшение количества инсулинположительных островков и клеток поджелудочной железы (ФИГ. 10(c) и ФИГ. 11(c)), но в группе образцов не наблюдалось явного уменьшения количества инсулинположительных островков и клеток поджелудочной железы (ФИГ. 10(d) и ФИГ. 11(d)).

235. Вариант осуществления 4

236. 4.1 Реагенты

237. Набор для тестов на холестерин, LabAssay™ Cholestro, Baobai Bio/Wako

238. Набор для обнаружения триглицеридов, LabAssay Triglyceride, Baobai Bio/Wako.

239. Набор для определения свободных жирных кислот, LabAssay NEFA, Baobai Bio/ Wako

240. Набор для определения уровня глюкозы, LabAssay Glucose, Baobai/Wako

241. Набор для тестирования инсулина, крысиный/мышиный инсулин ИФА, Shanghai Jifeng/Millipore

242. GOT, набор GPT, Nanjing Jiancheng Biology Co., Ltd.

243. Реагент обратной транскрипции, Novozan

244. HieffTM qPCR SBYR Green Mastey Mix, Eason Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd.

245. Диета с высоким содержанием жиров, Исследовательская диета, №по каталогу D12492

246. 4.2 Испытуемое лекарственное средство

247. А-03: L-NIBC-AuCs с размером 0,5-2,6 нм

248. 4.3 Способы проведения испытаний

249. Мышиная модель: Мышиная модель с высоким содержанием жира В6.

250. Мышей В6 делили на пять групп: нормальная контрольная группа (мыши В6 получали обычное питание на протяжении всего эксперимента); контрольная группа лекарственного средства А-03 (мыши В6 получали обычное питание на протяжении всего эксперимента, и им внутрибрюшинно вводили высокую дозу А-03 (10 мг/кг массы тела мыши) с 5-месячного возраста); модельная контрольная группа (мыши В6 с 2-месячного возраста получали диету с высоким содержанием жира, а с 5-месячного возраста им внутрибрюшинно вводили физиологический раствор); группа с низкой дозой (мыши В6 получали диету с высоким содержанием жира с 2-месячного возраста, и им внутрибрюшинно вводили низкую дозу А-03 (1 мг/кг массы тела мыши) с 5-месячного возраста; группа со средней дозой (мыши В6 получали диету с высоким содержанием жира с 2-месячного возраста, и им внутрибрюшинно вводили среднюю дозу А-03 (5 мг/кг массы тела мыши) с 5-месячного возраста; и группа с высокой дозой (мыши В6 получали диету с высоким содержанием жира с 2-месячного возраста, и им внутрибрюшинно вводили высокую дозу А-03 (10 мг/кг массы тела мыши) с 5-месячного возраста.

251. 4.4 Результаты

252. 4.4.1 Создание диабетической мышиной модели

253. Мышиную модель ожирения, индуцированную диетой с высоким содержанием жира, использовали для изучения терапевтического действия лекарственного средства А-03 на диабет.

254. На ФИГ. 13а показано сравнение массы тела, массы жира и мышечной ткани между нормальной контрольной группой и модельной контрольной группой. По сравнению с нормальной контрольной группой масса тела и масса жира в модельной контрольной группе были значительно увеличены (Р<0,05, *), но содержание мышечной ткани не претерпело значительных изменений.

255. На ФИГ. 13b показано сравнение индекса глюкозы в крови натощак и гипогликемической способности инсулина между нормальной контрольной группой и модельной контрольной группой (все со значительными различиями; Р<0,05, *).

256. На ФИГ. 13 с показано сравнение индексов толерантности к глюкозе между нормальной контрольной группой и модельной контрольной группой (все со значительными различиями, Р<0,05, *).

257. Все группы лечения были такими же, как и модельная контрольная группа. Результаты показали, что модель успешно создана.

258. 4.4.2 Влияние лекарственного средства А-03 на уровень глюкозы в крови у мышей с диабетом

259. Были разработаны две схемы введения. Первая представляла собой быстрое введение лекарственного средства, т.е. испытание проводили сразу после 30 минут введения лекарственного средства. Вторая представляла собой длительный прием лекарственного средства, т.е. лекарственное средство вводили один раз в сутки в течение двух месяцев подряд, а испытание проводили через 1 месяц и 2 месяца после введения.

260. 4.4.2.1 Результаты быстрого введения лекарственного средства

261. Для нормальных мышей и модельных мышей через 30 минут после однократного введения лекарственного средства А-03 (10 мг/кг массы тела мыши) было обнаружено влияние лекарственного средства A-03d на толерантность к глюкозе (инъекция физиологического раствора в качестве контроля как для нормальных, так и для модельных мышей). После 30 минут введения высоких доз А-03 толерантность к глюкозе у модельных мышей с диетой с высоким содержанием жира значительно улучшилась (ФИГ. 14b, через 15 и 30 минут уровень глюкозы в крови в группе, получавшей высокие дозы А-03, значительно ниже, чем у контрольной группы с нормальным физиологическим раствором, Р<0,05, *), но у нормальных мышей не было значительных изменений (ФИГ. 14а).

262. 4.4.2.2 Результаты длительного введения лекарственного средства

263. На ФИГ. 15а показаны изменения массы тела в группах введения низких, средних и высоких доз А-03 по сравнению с модельной контрольной группой.

264. На ФИГ. 15b и 15 с показано влияние примерной средней дозы лекарственного средства А-03 на жир и мышечную ткань соответственно.

265. В заключение, по сравнению с модельными мышами, длительное введение трех доз А-03 не оказывает существенного влияния на массу тела и соотношение жира в организме модельных мышей. Поэтому в первую очередь исключается токсичность лекарственного средства, и можно объяснить, что применение лекарственных средств не оказывает существенного влияния на рацион и метаболические потребности мышей.

266. Через один месяц после введения измеряли уровень глюкозы в крови модельной контрольной группы и каждой группы, получавшей лекарственное средство, в условиях случайной диеты (без голодания). На ФИГ. 16 показано, что три концентрации лекарственного средства А-03 оказывают значительное гипогликемическое действие (Р<0,05, *).

267. Через два месяца после введения измеряли уровень глюкозы в крови натощак в модельной контрольной группе и в каждой группе, получавшей лекарственное средство, после голодания в течение ночи. На ФИГ. 17 показано, что лекарственное средство А-03 оказывает значительное регулирующее действие на уровень глюкозы в крови (Р<0,05, *).

268. Эти результаты показывают, что лекарственное средство А-03 оказывает значительное ингибирующее действие на уровень глюкозы в крови.

269. Дальнейшие эксперименты показали, что низкие, средние и высокие дозы лекарственного средства А-03 могут значительно улучшать толерантность к глюкозе и резистентность к инсулину, вызванные диетой с высоким содержанием жира. На ФИГ. 18 показано влияние примерной средней дозы лекарственного средства А-03 на (а) толерантность к глюкозе и (b) гипогликемический эффект инсулина (* означает Р<0,05).

270. 4.4.3 Влияние лекарственного средства А-03 на содержание общего холестерина в плазме у модельных мышеи

271. В дополнение к гипогликемическому эффекту авторы настоящего изобретения также обнаружили, что после лечения лекарственным средством значительно улучшился уровень липидов в крови. Здесь липиды крови относятся к общему холестерину сыворотки, триглицеридам и неэтерифицированным жирным кислотам. На ФИГ. 19 показано влияние средней и высокой дозы лекарственного средства А-03 на содержание неэтерифицированных жирных кислот в сыворотке (ФИГ. 19а), триглицеридов в сыворотке (ФИГ. 19b) и общего холестерина в сыворотке (ФИГ. 19с), где 1-4 представляет собой нормальную контрольную группу, модельную контрольную группу, группу введения средней дозы А-03 и группу введения высокой дозы А-03 соответственно. Средние и высокие дозы А-03 не оказывали существенного влияния на NEFA и ТГ, но снижали ХС с 243,2±9,7 мг/дл (модельная контрольная группа) до 188,4±9,4 мг/дл и 197,1±10,4 мг/дл соответственно, а различия были достоверными (Р<0,05, *).

272. 4.4.4 Влияние лекарственного средства А-03 на содержание инсулина в крови модельных мышеи

273. На ФИГ. 20 показано влияние лекарственного средства А-03 после введения средней дозы лекарственного средства в течение 2 месяцев на уровень глюкозы в крови (ФИГ. 20а) и содержание инсулина в крови (ФИГ. 20b) у модельных мышей в условиях голодания, где 1-3 в колонке графика представляет нормальную контрольную группу, модельную контрольную группу и группу введения средней дозы А-03 соответственно. Глюкоза крови натощак снизилась с 10,38±0,39 мм до 8,55±0,45 мм (Р<0,05, *). Соответствующее содержание инсулина в крови снизилось с 6,03±0,85 нг/мл до 3,86±0,38 нг/мл (Р<0,05, *).

274. 4.4.5 Влияние лекарственного средства А-03 на печень

275. Мышей кормили, и вводили лекарственное средство А-03 в соответствии с протоколом длительного введения лекарственного средства, описанным выше, период введения лекарственного средства составлял 2,5 месяца.

276. 4.4.5.1 Влияние на G6Pase, ключевой фермент, ограничивающий скорость глюконеогенеза

277. Глюконеогенез представляет собой процесс, в основном происходящий в печени, при котором неглюкозные предшественники превращаются в глюкозу. Глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа (G6Pase) является ключевым ферментом, ограничивающим скорость глюконеогенеза. Экспрессия G6Pase напрямую связана со скоростью продукции глюкозы. На ФИГ. 21а показано, что лекарственное средство А-03 в примерной средней дозе может значительно ингибировать экспрессию гена G6Pase (Р<0,05, *), тогда как на ФИГ. 21b показано, что содержание гликогена в печени значительно снижено (Р<0,05, *). На ФИГ. 21С показано влияние на экспрессию других ключевых молекул окислительного фосфорилирования в метаболизме глюкозы, таких как цитохром-с-оксидаза IV (Сох4), цитохром-с-оксидаза VII (Сох7), альфа-пептид митохондриального комплекса F1 АТФазы, транспортирующей ионы водорода (Atp5a), цитохром с (Cycs), ген цитохрома b (Cytb) в митохондриальной ДНК и карнитин-пальмитоилтрансфераза 1А (Ctp1a). Видно, что окислительное фосфорилирование не увеличивалось, но Сох 4, Сох 7 и Atp5a значительно снизились (Р<0,05, *), что свидетельствует о том, что снижение уровня глюкозы в крови может быть связано с эффективным медикаментозным контролем глюконеогенеза в печени, а не ростом потребления.

278. 4.4.5.2 Влияние на внутрипеченочную чувствительность к инсулину

279. Обработка тканей, электрофоретическое разделение белков и вестерн-блоттинг являются хорошо известными способами и не будут описаны в настоящей заявке. На ФИГ. 22 показано влияние лекарственного средства А-03 в примерной средней дозе на фосфорилирование ключевых регуляторных белков чувствительности к инсулину, включая протеинкиназу В (PKB) и фосфорилированную рибосомальную протеинкиназу S6 (S6K). На ФИГ. 22а показаны репрезентативные полосы белков pS473-PKB, PKB, pT389-S6K и S6K, а на ФИГ. 22b и 22 с представлены результаты соответствующего статистического анализа экспрессии (среди них 1-3 представляют нормальную контрольную группу, модельную контрольную группу и группу средней дозы А-03 последовательно). Видно, что диета с высоким содержанием жира значительно снижает долю фосфорилированной протеинкиназы В в общем белке (pS473-PKB/PKB). По сравнению с модельной контрольной группой введение лекарственного средства А-03 значительно увеличивало фосфорилирование белка РКВ (Р<0,05, *) и значительно повышало белковое соотношение фосфорилированной рибосомальной протеинкиназы вб/рибосомальной протеинкиназы S6 (pT389-S6K/S6K) (Р<0,05, *). Результаты показали, что лекарственное средство А-03 значительно активировало сигнальный путь PKB-S6K, что повышало чувствительность клеток-мишеней к инсулину и улучшало резистентность к инсулину.

280. 4.4.5.3 Защитный эффект при нарушении функции печени, вызванном сахарным диабетом с ожирением

281. Способы определения глютаминовой оксалоацетиновой трансаминазы и аланинаминотрансферазы в крови хорошо известны и не будут повторяться в настоящей заявке. Обнаружение содержания глютаминовой оксалоацетиновой трансаминазы (GOT или AST) и аланинаминотрансферазы (ALT или GPT) в крови мышей показало, что как AST, так и ALT были значительно повышены у мышей с модельным рационом с высоким содержанием жиров. После лечения лекарственным средством А-03 был достигнут очень эффективный контроль. На ФИГ. 23а и 23b показано влияние средней дозы лекарственного средства А-03 на AST или GOT и ALT или GPT соответственно, где 1-3 на гистограмме представляют нормальную контрольную группу, модельную контрольную группу и группу введения средней дозы А-03 соответственно. Видно, что после введения лекарственного средства А-03 AST и ALT достоверно снижались (Р<0,05, *). Это свидетельствует о том, что лекарственное средство А-03 оказывает значительное терапевтическое действие на нарушения функции печени, вызванные ожирением при сахарном диабете.

282. Другие AuCs, модифицированные лигандом, разного размера также обладают сходными эффектами. Они не будут подробно описаны в настоящей заявке.

283. Промышленная применимость

284. AuCs можно применять для лечения диабета. Они подходят для промышленного применения.

Изобретение относится к области медицины, а именно к применению кластера золота (AuC) для получения лекарственного средства для лечения диабета у субъекта. Применение кластера золота (AuC) для получения лекарственного средства для лечения диабета у субъекта, при этом указанный AuC содержит: золотое ядро и лиганд, модифицирующий золотое ядро, где лиганд выбран из группы, состоящей из L-цистеина и его производных, D-цистеина и его производных, цистеинсодержащих олигопептидов и их производных и других тиолсодержащих соединений, золотое ядро имеет диаметр в диапазоне 0,5-2,6 нм. Вышеописанное решение позволяет применять кластеры золота для получения лекарственного средства для лечения диабета. 6 з.п. ф-лы, 23 ил., 7 табл., 4 пр.

1. Применение кластера золота (AuC) для получения лекарственного средства для лечения диабета у субъекта, при этом указанный AuC содержит:

золотое ядро и

лиганд, модифицирующий золотое ядро;

где лиганд выбран из группы, состоящей из L-цистеина и его производных, D-цистеина и его производных, цистеинсодержащих олигопептидов и их производных и других тиолсодержащих соединений;

золотое ядро имеет диаметр в диапазоне 0,5-2,6 нм.

2. Применение по п. 1, отличающееся тем, что L-цистеин и его производные выбраны из группы, состоящей из L-цистеина, N-изобутирил-L-цистеина (L-NIBC) и N-ацетил-L-цистеина (L-NAC), и причем D-цистеин и его производные выбраны из группы, состоящей из D-цистеина, N-изобутирил-D-цистеина (D-NIBC) и N-ацетил-D-цистеина (D-NAC).

3. Применение по п. 1, отличающееся тем, что цистеинсодержащие олигопептиды и их производные представляют собой цистеинсодержащие дипептиды, цистеинсодержащие трипептиды или цистеинсодержащие тетрапептиды.

4. Применение по п. 3, отличающееся тем, что цистеинсодержащие дипептиды выбраны из группы, состоящей из дипептида L-цистеин-L-аргинин (CR), дипептида L-аргинин-L-цистеин (RC), дипептида L-гистидин-L-цистеин (HC) и дипептида L-цистеин-L-гистидин (CH).

5. Применение по п. 3, отличающееся тем, что цистеинсодержащие трипептиды выбраны из группы, состоящей из трипептида глицин-L-цистеин-L-аргинин (GCR), трипептида L-пролин-L-цистеин-L-аргинин (PCR), трипептида L-лизин-L-цистеин-L-пролин (KCP) и L-глутатиона (GSH).

6. Применение по п. 3, отличающееся тем, что цистеинсодержащие тетрапептиды выбраны из группы, состоящей из тетрапептида глицин-L-серин-L-цистеин-L-аргинин (GSCR) и тетрапептида глицин-L-цистеин-L-серин-L-аргинин (GCSR).

7. Применение по п. 1, отличающееся тем, что другие тиолсодержащие соединения выбраны из группы, состоящей из 1-[(2S)-2-метил-3-тиол-1-оксопропил]-L-пролина, тиогликолевой кислоты, меркаптоэтанола, тиофенола, D-3-троловола, N-(2-меркаптопропионил)-глицина и додецилмеркаптана.