КЛАСТЕРЫ МЕДИ, КОМПОЗИЦИЯ И СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ ЦИРРОЗА ПЕЧЕНИ Российский патент 2023 года по МПК A61K33/34 A61K47/50 A61P1/16 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

1. Настоящее изобретение относится к кластерам меди (CuCs), связанным с лигандами, композициям, включающим CuCs, связанные с лигандами, и их применению для лечения цирроза печени. Настоящее изобретение также относится к способу применения CuCs, связанных с лигандами, и композиций для лечения цирроза печени.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

2. Печень - самый большой твердый орган человеческого тела, выполняющий множество важных функций, включая: производство белков крови, которые помогают свертыванию, переносу кислорода и иммунной системе; хранение избыточных питательных веществ и возвращение части питательных веществ в кровь; производство желчи для переваривания пищи; помощь организму в хранении сахара (глюкозы) в форме гликогена; очищение организма от вредных веществ в крови, включая наркотики и алкоголь; расщепление насыщенных жиров и производство холестерина.

3. Цирроз печени - это медленно прогрессирующее заболевание, развивающееся в течение многих лет вследствие длительного, непрерывного повреждения печени. Вместе с развитием цирроза печени здоровая ткань печени постепенно разрушается и заменяется рубцовой тканью. Рубцовая ткань блокирует кровоток через печень и замедляет способность печени перерабатывать питательные вещества, гормоны, лекарства и естественные токсины. Она также снижает выработку белков и других веществ, производимых печенью. Цирроз может в конечном итоге может привести к печеночной недостаточности, что может потребовать пересадки печени, и/или к раку печени.

4. На ранней стадии цирроза печени нет явных симптомов из-за сильной компенсаторной функции печени. На поздней стадии симптомы включают нарушение функции печени, портальную гипертензию, кровотечения в верхних отделах желудочно-кишечного тракта, печеночную энцефалопатию, вторичную инфекцию, гиперфункцию селезенки, асцит, рак и другие осложнения. Цирроз печени возникает в результате постепенной деформации и затвердения печени. Гистопатологически цирроз печени характеризуется обширным некрозом печеночных клеток, узелковым перерождением остаточных гепатоцитов, гиперплазией соединительной ткани и формированием фиброзных перегородок, что приводит к разрушению дольковой структуры печени и образованию псевдолобул.

5. Цирроз печени имеет разные причины. У некоторых людей с циррозом печени имеется более одной причины поражения печени. К распространенным причинам цирроза печени относятся длительное злоупотребление алкоголем, хронический гепатит В и С, жировая болезнь печени, токсичные металлы, генетические заболевания, нарушения питания, промышленные яды, наркотики, нарушения кровообращения, нарушения обмена веществ, холестаз, шистосомоз и др.

6. Цирроз печени может быть диагностирован с помощью многих тестов/методов. Например, анализ крови может свидетельствовать о циррозе печени, если уровень ферментов печени, включая аланиновую трансаминазу (ALT), аспартатаминотрансаминазу (AST) и щелочную фосфатазу (ALP), а также билирубина повышен, а уровень белков крови понижен.

7. В настоящее время, хотя лечение может задержать прогрессирование цирроза печени путем устранения его причин, специфических способов лечения цирроза печени не существует.

РАСКРЫТИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

8. Настоящее изобретение раскрывает применение кластера меди (CuC), связанного с лигандом, для лечения субъекта с циррозом печени, где указанный связанный с лигандом CuC включает медное ядро; и лиганд, где лиганд связывается с медным ядром, образуя кластер меди, связанный с лигандом (CuC).

9. В некоторых вариантах осуществления применения для лечения медное ядро имеет диаметр в интервале 0,5-5 нм. В некоторых вариантах осуществления изобретения медное ядро имеет диаметр в интервале 0,5-3 нм.

10. В некоторых вариантах осуществления применения для лечения лиганд представляет собой выбранный из группы, состоящей из тимина, тимин-модифицированной гиалуроновой кислоты (ТМНА), L-цистеина и его производных, D-цистеина и его производных, цистеинсодержащих олигопептидов и их производных и других тиолсодержащих соединений.

11. В некоторых вариантах осуществления применения для лечения L-цистеин и его производные выбирают из группы, состоящей из L-цистеина, N-изобутирил-L-цистеина (L-NIBC) и N-ацетил-L-цистеина (L-NAC), а D-цистеин и его производные выбирают из группы, состоящей из D-цистеина, N-изобутирил-D-цистеина (D-NIBC) и N-анетил-D-цистеина (D-NAC).

12. В некоторых вариантах осуществления применения для лечения цистеинсодержащие олигопептиды и их производные представляют собой цистеинсодержащие дипептиды, цистеинсодержащие трипептиды или цистеинсодержащие тетрапептиды.

13. В некоторых вариантах осуществления применения для лечения цистеинсодержащие дипептиды выбирают из группы, состоящей из L(D)-цистеил-L(D)-аргинин дипептида (CR), L(D)-аргинил-(D)L-цистеин дипептида (RC), L(D)-гистидил-L(D)-цистеин дипептида (НС) и L(D)-цистеил-(LD)-гистидин дипептида (СН).

14. В некоторых вариантах осуществления применения для лечения цистеинсодержащие трипептиды выбирают из группы, состоящей из глицил-L(D)-цистеил-L(D)-аргинин трипептида (GCR), L(D)-пролил-L(D)-цистеил-L(D)-аргинин трипептид (PCR), L(D)-лизил-L(D)-цистеил-L(D)-пролин трипептид (KCP) и L(D)-глутатиона (GSH).

15. В некоторых вариантах осуществления применения для лечения цистеинсодержащие тетрапептиды выбирают из группы, состоящей из глицил-L(D)-серил-L(D)-цистеил-L(D)-аргинин тетрапептида (GSCR) и глицил-L(D)-цистеил-L(D)-серил-L(D)-аргинин тетрапептида (GCSR).

16. В некоторых вариантах осуществления применения для лечения другие тиолсодержащие соединения выбирают из группы, состоящей из 1-[(2S)-2-метил-3-тиол-1-оксопропил]-L(D))-пролина, тиогликолевой кислоты, меркаптоэтанола, тиофенола, D-3-троловола, N-(2-меркаптопропионил)-глицина и додецилмеркаптана.

17. Цели и преимущества изобретения станут очевидны из следующего подробного описания предпочтительных вариантов его осуществления в связи с прилагаемыми чертежами.

ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

18. Предпочтительные варианты осуществления настоящего изобретения теперь будут описаны со ссылкой на Фигуры, на которых одинаковые ссылочные цифры обозначают одинаковые элементы.

19. На фиг. 1 представлены параметрические данные L-GSH-CuCs. (А) Типичное просвечивающее электронно-микроскопическое (ПЭМ) изображение GSH-CuCs. (В) Распределение размеров GSH-CuCs, рассчитанное на основе ПЭМ-изображений. (С) Спектр рентгеновской фотоэлектронной спектроскопии (XPS) 2р_3/2 и 2p_1/2 электронов Cu(0) в GSH-CuCs. (D) Сравнение ИК-Фурье спектроскопий (FT-IR) GSH-CuCs (вверху) и GSH (внизу). (E) Флуоресцентные спектры возбуждения (слева) и эмиссии (справа) GSH-CuCs.

20. На фиг. 2 представлены гистограммы, показывающие влияние различных дозировок Cu-1 и Cu-2 на уровни (A) ALT, (В) AST, (С) TBIL, (D) МАО и (Е) ALB в сыворотке крови у больных циррозом мышей, где 1) обозначает пустую контрольную группу, 2) модельную группу, 3) положительную группу, получавшую сорафениб, 4) группу низкой дозы Cu-1, 5) группу высокой дозы Cu-1, 6) группу низкой дозы Cu-2 и 7) группу высокой дозы Cu-2.

21. На фиг. 3 представлены изображения окрашивания НЕ: (А) пустая контрольная группа; (В) модельная группа; (С) группа положительного контроля; (D) группа низкой дозы Cu-1; (Е) группа высокой дозы Cu-1.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

22. Настоящее изобретение может быть более понятным из следующего подробного описания некоторых вариантов осуществления изобретения.

23. В настоящей заявке, где имеются ссылки на публикации, раскрытия этих публикаций включены в настоящую заявку посредством ссылки во всей их полноте для более полного описания уровня техники, к которому относится настоящее изобретение.

24. Кластеры меди, связанные с лигандами, состоят из медных ядер, образованных от двух до нескольких сотен атомов меди, и лигандов. Лиганды в составе молекул кластера меди, связанного с лигандами, связываются с медными ядрами, образуя кластеры меди, связанные с лигандами, стабильные в растворе. Из-за низкой контрастности атомов меди трудно определить точный размер медных ядер с помощью ПЭМ. Принято считать, что размеры медных ядер в кластерах меди, связанных с лигандами, находятся в интервале 0,5-5 нм по данным ПЭМ.

25. Настоящее изобретение раскрывает кластеры меди, связанные с лигандами (CuCs), где один или несколько лигандов связываются с медным ядром. Присоединение лигандов к медным ядрам означает, что лиганды образуют стабильные в растворе комплексные соединения с медными ядрами посредством ковалентной связи, водородной связи, электростатической силы, гидрофобной силы, медное ядро имеет диаметр в интервале 0,5-5 нм, предпочтительно в интервале 0,5-3 нм и более предпочтительно в интервале 0,5-2,5 нм.

26. В некоторых вариантах осуществления изобретения лиганды включают, но не ограничиваются, тимин, тимин-модифицированную гиалуроновую кислоту (ТМНА), L-цистеин, D-цистеин и другие производные цистеина, такие как N-изобутирил-L-цистеин (L-NIBC), N-изобутирил-D-цистеин (D-NIBC), N-ацетил-L-цистеин и N-ацетил-D-цистеин, цистеинсодержащие олигопептиды и их производные, включая, но не ограничиваясь, дипептиды, трипептиды, тетрапептиды и другие пептиды, содержащие цистеин, такие как L(D)-цистеил-L(D)-аргинин дипептид (CR), L(D)-аргинил-L(D)-цистеин дипептид (RC), L(D))-цистеил-L(D)-гистидин (СН), глицил-L(D)-цистеил-L(D)-аргинин трипептид (GCR), L(D)-пролил- L(D)-цистеил-L(D)-аргинин трипептид (PCR), L(D)-глутатион (GSH), глицил-L(D)-серил-L(D)-цистеил-L(D)-аргинин тетрапептид (GSCR) и глицил-L(D)-цистеил-L(D)-серил-L(D)-аргинин тетрапептид (GCSR), и другие тиолсодержащие соединения, такие как одно или более из 1-[(2S)-2-метил-3-тиол-1-оксопропил]-L(D)-пролина, тиогликолевой кислоты, меркаптоэтанола, тиофенола, D-3-троловола и додецилмеркаптана.

27. CuCs, связанные с различными лигандами, могут быть приготовлены способами, взятыми из литературы (Deng 2018, Jia 2013; Wang 2013).

28. Настоящее изобретение раскрывает композицию для лечения субъекта с циррозом печени. В некоторых вариантах осуществления изобретения композиция включает кластеры меди, связанные с лигандами (CuCs), и фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество. В некоторых вариантах осуществления изобретения вспомогательное вещество представляет собой фосфатно-буферный раствор или физиологический солевой раствор. В некоторых вариантах осуществления изобретения субъектом является человек. В некоторых вариантах осуществления изобретения субъектом является домашнее животное, например, собака.

29. Настоящее изобретение раскрывает применение вышеописанных CuCs, связанных с лигандами, для приготовления лекарственного средства для лечения цирроза печени у субъекта.

30. Настоящее изобретение раскрывает применение раскрытых выше CuCs, связанных с лигандами, для лечения цирроза печени у субъекта или способ лечения цирроза печени у субъекта с использованием раскрытых выше CuCs, связанных с лигандами. В некоторых вариантах осуществления изобретения способ лечения включает введение субъекту фармацевтически эффективного количества CuCs, связанных с лигандами. Фармацевтически эффективное количество может быть определено с помощью обычных исследований in vivo.

31. Следующие примеры приведены исключительно для иллюстрации основных положений настоящего изобретения; они ни в коем случае не предназначены для ограничения объема настоящего изобретения.

32. Варианты осуществления изобретения

33. Вариант 1. Синтез ТМНА-модифицированных CuCs с ТМНА

34. 10 мл раствора TMHA(DS 10,5%) (0,1 мМ, рН 7,0) постепенно нагревали до 37°С для растворения ТМНА. 2 мл раствора C11SO4 (20 мМ, рН 7,0) добавляли по каплям и давали прореагировать еще 20 мин в темноте при 37°С. При облучении УФ-светом (365 нм) было хорошо видно яркое оранжево-красное излучение, свидетельствующее об успешном образовании люминесцирующих ТМНА-модифицированных CuCs. Наконец, полученный раствор хранился в темноте при температуре 4°С для применения. Сферические ТМНА-модифицированные CuCs имеют медное ядро с диаметром в интервале 0,5-3 нм, средний диаметр которых составляет 1,64±0,48 нм.

35. Вариант 2. Синтез и определение характеристик лиганд связанных CuCs, связанных с различными лигандами

36. 2.1 Синтез кластеров меди, связанных с L-глутатионом (GSH) (L-GSH-CuCs)

37. В 50 мл воды добавили 500 мг глутатиона (GSH) для образования раствора GSH; при медленном перемешивании в раствор GSH добавили 20 мл 5 мМ раствора Cu(NO₃)₂, в результате чего быстро образовалась белая суспензия. Смесь медленно нагревали до 50-60°С и нагревание продолжали в течение 20 мин, затем по каплям добавляли 1 М раствор NaOH, пока раствор не стал светло-желтым, чистым и прозрачным. Продукт охлаждали до комнатной температуры, осаждали, добавляя несколько раз по объему этанол, и повторяли три раза.

38. 2.2 Синтез кластеров меди, связанных с L-цистеином

39. 50 мл 10 мМ CuCl₂ медленно добавляли по каплям в свежеприготовленный раствор L-цистеина (50 мл, 10 мМ) при интенсивном перемешивании. Примерно через 30 минут к этому раствору медленно добавляли по каплям 0,5 мл NaOH (1 М). Реакция продолжалась в течение 2 часов. Продукт центрифугировали при 8000 об/мин в течение 20 мин, а супернатант хранили при 4°С вдали от света.

40. 2.3 Синтез кластеров меди, связанных с ПЭГ

41. 2,5 г PEG-SH (молекулярная масса 2000 или 5000) растворяли в 100 мл сверхчистой воды при комнатной температуре, и 4 мл 0,5 М раствора Cu(NO₃)₂ добавляли по каплям при интенсивном перемешивании. Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение некоторого времени, пока ее цвет не потускнел и постепенно не образовался молочно-белый цвет. Затем гель постепенно нагревали до 80°С и выдерживали в течение 15 минут. 3 М раствор NaOH добавляли по каплям, пока раствор не стал прозрачным и чистым. Продукт центрифугировали при 8000 об/мин в течение 20 мин и конечный продукт лиофилизировали в сублимационной сушилке для получения твердого образца.

42. 2.4 Синтез лигандсвязанных кластеров меди, связанных с другими лигандами

43. Лигандсвязанные кластеры меди, связанные с другими лигандами, также могут быть синтезированы вышеописанным способом, при этом конкретный способ синтеза должен быть немного изменен с использованием некоторых растворителей и операций. Другие лиганды включают тимин, L(D)-цистеин и другие производные цистеина, такие как N-изобутирил-L-цистеин (L-NIBC), N-изобутирил-D-цистеин (D-NIBC), N-ацетил-L-цистеин и N-ацетил-D-цистеин, цистеинсодержащие олигопептиды и их производные, включая, но не ограничиваясь, дипептиды, трипептиды, тетрапептиды и другие пептиды, содержащие цистеин, такие как L(D)-цистеил- L(D)-аргинин дипептид (CR), L(D)-аргинин-L(D)-цистеин дипептид (RC), L(D)-цистеил-L(D)-гистидин (СН), глицил-L(D)-цистеил-L(D)-аргинин трипептид (GCR), L(D)-пролил-L(D)-цистеил-L(D)-аргинин трипептид (PCR), L(D)-глутатион (GSH), глицил- L(D)-серил-L(D)-цистеил-L(D))-аргинин тетрапептид (GSCR) и глицил- L(D)-цистеил-L(D)-серил-L(D)-аргинин тетрапептид (GCSR), и другие тиолсодержащие соединения, такие как одно или более из 1-[(2S)-2-метил-3-тиол-1-оксопропил]-L(D))-пролина, тиогликолевой кислоты, меркаптоэтанола, тиофенола, D-3-троловола и додецилмеркаптана.

44. 2.5 Характеристика кластеров меди, связанных с лигандами

45. В качестве примера приведены следующие параметрические данные L-GSH-CuCs.

46. Наблюдение морфологии с помощью просвечивающего электронного микроскопа (ПЭМ)

47. Тест-порошки (образец GSH-CuCs) были растворены в сверхчистой воде до 2 мг/л в качестве образцов, а затем тест-образцы были подготовлены методом висячей капли. Более конкретно, 5 мкл образцов капали на медную сетку, испаряли естественным образом до исчезновения капли воды, а затем наблюдали морфологию образцов с помощью полевой эмиссионной ПЭМ высокого разрешения JEM-2100F STEM/EDS.

48. На панелях А и В фиг. 1 показаны типичные изображения GSH-CuCs, полученные с помощью SEM, а их распределение по размерам было рассчитано на основе различных изображений, полученных методом ПЭМ. Это показывает, что GSH-CuCs хорошо диспергированы, а их размеры находятся в интервале 0,5-5,0 нм.

49. 2) Рентгеновская фотоэлектронная спектроскопия

50. Спектры рентгеновской фотоэлектронной спектроскопии (XPS) были измерены на рентгеновском фотоэлектронном спектрометре ESCALAB 250Xi. Двусторонний проводящий клей (3 мм×3 мм) был прикреплен к алюминиевой фольге, исследуемый порошок был равномерно распределен на двустороннем скотче и покрыт слоем алюминиевой фольги. Образец выдерживался под давлением 8 МПа в течение одной минуты. Остатки порошка на поверхности удаляли, затем вырезали центральный образец (1 мм×1 мм) для XPS-испытаний.

51. Панель С фиг. 1 представляет собой XPS-спектр элемента Cu в GSH-CuCs. Появляются два пика при 931,98 и 951,88 эВ, которые могут быть приписаны энергиям связи 2р_3/2 и 2p_1/2 электронов Cu, соответственно. Отсутствие пика спутника Cu 2р_3/2 около 942,0 эВ подтверждает отсутствие электронов Cu(II). Поскольку энергия связи Cu(0) всего на 0,1 эВ больше энергии связи Cu(I), нельзя исключить образование Cu(I), и валентное состояние Cu в полученных GSH-CuCs, скорее всего, находится между 0 и+1.

52. 3) ИК-спектроскопия с преобразованием Фурье (ИК-Фурье)

53. ИК-Фурье спектры были исследованы на флуоресцентном спектрометре PerkinElmer LS 55. Тест-порошок растворяли в сверхчистой воде и измеряли при комнатной температуре. Диапазон сканирования составлял 200-800 нм, кювета для образца представляла собой стандартную кварцевую кювету с оптическим путем 1 см.

54. На панели D фиг. 1 показано сравнение ИК-Фурье спектроскопий GSH-CuCs (вверху) и GSH (внизу). GSH демонстрирует ряд характерных ИК-полос, а именно: СООН- (1 390 и 1 500 см^-1), растяжение N-H (3 410 см^-1) и изгиб N-H (1 610 см^-1) группы NH₂. Пик, наблюдаемый при 2 503 см^-1, может быть отнесен к колебаниям растяжения S-H. Для GSH-CuCs можно обнаружить все соответствующие характерные ИК-полосы, кроме полосы S-Н растягивающих колебаний (2 503 см^-1). Это свидетельствует о расщеплении связи S-H и связывании молекул GSH с поверхностью медного ядра через образование связи Cu-S.

55. 4) Флуоресцентная спектроскопия

56. Тест-порошок растворяли в сверхчистой воде и измеряли с помощью флуоресцентной спектроскопии при комнатной температуре.

57. Как показано на панели Е фиг. 1, GSH-CuCs демонстрируют красное излучение с пиком при 595 нм и соответствующей полной шириной на половине максимума (FWHM) приблизительно 80 нм под пиком возбуждения при 365 нм. Стоит отметить, что интенсивность флюоресценции GSH-CuCs значительно улучшается при добавлении этанола в раствор из-за усиления эмиссии, вызванной агрегацией. Кроме того, большой стоксов сдвиг (230 нм) указывает на хорошие перспективы для флуоресцентных зондов и биоимиджинга.

58. Вариант 3

59. 3.1 Материалы и животные

60. 3.1.1 Тест-образец

61. Cu-01: кластеры меди, модифицированные GSH (L-GSH-CuCs), 0,5-5 нм.

62. Cu-02: кластеры меди, модифицированные цистеином (L-Cys-CuCs), 0,5-5 нм.

63. Все тест-образцы были приготовлены по описанному выше способу с незначительными изменениями, и их качество было охарактеризовано с помощью описанных выше способов.

64. 3.1.2 Положительный контрольный образец

65. Сорафениб.

66. 3.1.3 Подопытные животные и группы

67. 70 SPF самцов мышей C57BL/6N, возраст 6-8 недель, масса тела 16-20 г, были приобретены у Beijing Huafukang Experimental Animal Technology Co. (номер лицензии на производство: SCXK (Jing) 2019-0008). В соответствии с массой тела они были случайным образом разделены на 7 групп (n=10): пустая контрольная группа, модельная группа, группа положительного контроля, группа низкой дозы Cu-1, группа высокой дозы Cu-1, группа низкой дозы Cu-2, группа высокой дозы Cu-2.

68. 3.2 Модельный протокол

69. За исключением пустой контрольной группы, мышиная модель цирроза печени в других группах была подготовлена с помощью индукционной терапии четыреххлористым углеродом (CCl₄). Модельный протокол был следующим: (1) каждой мыши внутрибрюшинно вводили 10% CCU (разбавленный оливковым маслом) в дозе 7 мкл/г массы тела дважды в неделю в течение 8 недель; мышам пустой контрольной группы внутрибрюшинно вводили такое же количество растворителя оливкового масла. (2) Начиная с 6-й недели, каждую неделю отбирали двух мышей и умерщвляли их через 48 часов после последней инъекции. Наблюдали за внешним видом печени. После того как внешний вид приобретал признаки цирроза (8-я неделя), ткань печени фиксировали формалином. Для оценки модели цирроза использовали окрашивание ГЭ и окрашивание по Массону.

70. 3.3 Введение

71. После успешного моделирования мышам в группе положительного контроля внутрижелудочно вводили 25 мг/кг сорафениба; мышам в группах с низкой или высокой дозой Cu-1 и Cu-2 вводили внутрибрюшинно 2,5 или 10 мг/кг соответствующего тест-материала соответственно; а мышам в пустой контрольной группе и модельной группе внутрибрюшинно вводили физиологический солевой раствор в дозировке 10 мл/кг. Введение осуществлялось один раз в день в течение 20 дней подряд.

72. 3.4 Биохимический анализ

73. По окончании введения препарата кровь собирали из мышиной орбиты и получали сыворотки для биохимического анализа альбумина (ALbumin, ALB), общего билирубина (TBIL), аминотрансферазы аланина (ALT), аминотрансферазы аспартата (AST) и моноаминоксидазы (МАО) с использованием Zhongsheng Beikong Kit и биохимического анализатора (Siemens). Определение проводилось в строгом соответствии с инструкцией к набору.

74. В таблице 1 представлена информация о наборах, используемых для биохимического анализа

75. 3.5 Патологическое исследование

76. 3.5.1 Окрашивание ГЭ

77. После умерщвления образцы ткани печени мышей фиксировали 4% параформальдегидным фиксатором в течение более 48 ч. После фиксации образцы печени обезвоживали в спиртовом градиенте и обрабатывали ксилолом и этанолом. Затем ткани печени окунали и погружали в парафин. После того, как погруженный материал был обрезан, закреплен и восстановлен, ткани печени были срезаны с помощью парафинового микротома, толщина срезов составляла 4 мкм. Основной процесс окрашивания ГЭ заключается в следующем: после высушивания в печи при 65°С срезы обрабатывали ксилолом и обезвоживали градиентным этанолом. Срезы последовательно окрашивали гематоксилином, раствором, усиливающим синий цвет, и 0,5% эозином, затем обрабатывали градиентным этанолом и ксилолом и запечатывали нейтральной камедью. Фиброз ткани печени наблюдали с помощью микроскопа.

78. 3.5.2 Окрашивание по Массону

79. После высушивания срезы ткани печени мыши подвергались депарафинизации и обезвоживанию. После хромирования ядра окрашивали раствором гематоксилина по Рего. После промывки водой срезы окрашивали кислотным фуксином Массона с красным Понсо, погружали в 2% водный раствор ледяной уксусной кислоты и дифференцировали с помощью 1% раствора фосфомолибденовой кислоты. После окрашивания анилиновым синим или светло-зеленым раствором срезы на некоторое время погружали в 0,2% водный раствор ледяной уксусной кислоты, затем просвечивали 95% спиртом, безводным спиртом и ксилолом, а затем запечатывали нейтральной камедью. Ткань печени наблюдали с помощью микроскопа.

80. 3.6 Результаты экспериментов

81. 3.6.1 Успешное моделирование

82. Печень мышей в модельной группе была разделена на круглые или овальные образования различных размеров пролиферирующими фиброзными перегородками. Показатели ALT, TBIL и AST в сыворотке крови значительно увеличились по сравнению с контрольной группой, ALB в сыворотке крови значительно снизился по сравнению с контрольной группой, а показатель МАО не имел существенных отличий от контрольной группы, но его значение также увеличилось. Все вышеперечисленные результаты свидетельствуют о том, что данное экспериментальное моделирование было успешным.

83. 3.6.2 Влияние тест-препаратов на аланиновую аминотрансферазу (ALT), общий билирубин (TBIL), аспартатаминотрансферазу (AST), моноаминоксидазу (МАО) и альбумин (ALB).

84. Как показано на фиг. 2А, по сравнению с пустой контрольной группой, активность ALT в модельной группе значительно увеличилась (с 43,5±8,1 Ед/л до 188,5±4,9 Ед/л; Р<0,01), что указывает на то, что функции печени мышей модельной группы претерпели патологические изменения. По сравнению с модельной группой, в группах низкой и высокой дозы Cu-1 и Cu-2 (низшая - 37,0±5,7 Ед/л; высшая - 38,6±5,6 Ед/л), а также положительного контроля (42,8±5,4 Ед/л) активность ALT значительно снизилась до уровня пустой контрольной группы (Р<0,01).

85. Как показано на фиг. 2В, по сравнению с пустой контрольной группой, активность AST в модельной группе значительно увеличилась (с 141,8±13,5 Ед/л до 192,0±11,3 Ед/л; Р<0,05). Введение высокой дозы Cu-1 и Cu-2 может значительно снизить активность AST до 146,3±8,4 Ед/л или 144,3±8,1 Ед/л, соответственно; эти показатели находятся на том же уровне, что и в пустой контрольной группе (141,8±13,5 Ед/л), но значительно ниже, чем в модельной группе (Р<0,01). В группе положительного контроля активность AST также понижена (165,5±11,6 Ед/л; Р<0,05), но степень снижения ниже, чем в группах высоких доз Cu-1 и Cu-2.

86. Как показано на фиг. С, концентрация TBIL в модельной группе значительно выше, чем в пустой контрольной группе (увеличилась с 1,02±0,20 мкмоль/л до 2,91±0,39 мкмоль/ л; Р<0,01). По сравнению с модельной группой, введение низкой и высокой доз Cu-1 и Cu-2 значительно снизило уровень TBIL в сыворотке крови (самый высокий 1,16±0,30 мкмоль/л; самый низкий 1,08±0,08 мкмоль/л; Р<0,01); эти показатели близки к показателям пустой контрольной группы (1,02±0,20 мкмоль/л; Р<0,01).

87. Как показано на фиг. 2D, активность МАО в модельной группе (21,5±0,7 Ед/л) выше, чем в пустой контрольной группе (18,8±2,9 Ед/л), но статистически значимой разницы нет, что указывает на отсутствие изменения показателя активности МАО в мышиной модели цирроза печени, вызванного CCU. Однако, по сравнению с модельной группой, высокая доза Cu-1 и Cu-2 значительно снижала активность МАО в сыворотке крови до 17,3±1,5 Ед/л (Р<0,01) или (18,3±2,1 Ед/л; Р<0,05), и эффект был лучше, чем в группе положительного контроля.

88. Как показано на фиг. Е, уровень ALB в модельной группе (24,2±0,6 г/л) значительно ниже, чем в пустой контрольной группе (22,1±1,3 г/л) (Р<0,05), что указывает на то, что лечение CCU может значительно снизить уровень ALB в сыворотке крови. Однако Cu-1 и Cu-2 не оказывают значительного влияния на уровень ALB в сыворотке крови.

89. Приведенные выше результаты показали, что кластеры меди (CuCs) снижали уровни ALT, AST, TBIL и МАО дозозависимым образом, что свидетельствует о восстановлении функции печени мышей, и их действие лучше, чем действие препаратов положительного контроля, по крайней мере, по некоторым показателям.

90. 3.6.3 Анализы на патологии

91. Цирроз печени патологически характеризуется диффузным фиброзом ткани печени и образованием псевдолобул. Результаты анализов на предмет патологий с окрашиванием ГЭ показали, что, как показано на фиг. 3А, нормальная ткань печени мышей из пустой контрольной группы имела четкую структуру, неповрежденные печеночные дольки, аккуратно расположенные гепатоциты, радиальное расположение с центром на центральной вене, нормальное ядро гепатоцитов и лишь небольшое количество фиброзной ткани в зоне захвата. Как показано на фиг. 3В, в ткани печени модельной группы гепатоциты были неупорядочены, появились шаровидные структуры, печеночные дольки почти исчезли, обильно формировались псевдолобулы (на фиг. 3В указаны стрелками вправо), в ткани печени присутствовало большое количество пролиферированных протофибрилл, образующих фиброзные перегородки круглой или овальной формы (на фиг. 3В указаны стрелками влево). Как показано на фиг. 3С, по сравнению с модельной контрольной группой, в группе положительного контроля наблюдалось значительное уменьшение повреждений печени; гепатоциты, очевидно, имели аккуратное расположение; фиброзная гиперплазия, хотя и была увеличена, очевидно, уменьшилась, не образуя фиброзных септ; псевдолобулы почти исчезли; но по сравнению с нормальными тканями печени, в тканях печени группы положительного контроля наблюдалось явное увеличение межклеточных щелей (на что указывают стрелки, направленные вниз). По сравнению с контрольной группой, в двух группах, которым вводили препараты с кластерами меди (Cu1 и Cu2), гепатоциты значительно восстановились после повреждения печени, о чем свидетельствует явное уменьшение фиброзной гиперплазии и псевдолобул, и это восстановление в определенной степени зависит от дозы.

92. На фиг. 3D и фиг. 3Е представлены изображения ГЭ, показывающие влияние введения низких и высоких доз препарата Cu-1, соответственно, на восстановление повреждений печени. Как показано на фиг. 3D, в группе введения низкой дозы препарата Cu-1 наблюдается относительно аккуратное расположение гепатоцитов, почти полное исчезновение псевдолобул, явное уменьшение фиброзной гиперплазии, но межгепатоцитарные щели, по сравнению с нормальной тканью печени, увеличены до определенной степени (на что указывают направленные вниз стрелки на фиг. 3D). Как показано на фиг. 3Е, по сравнению с группой введения низкой дозы препарата Cu-1, группа введения высокой дозы препарата Cu-1 имела еще лучший эффект в виде уменьшения повреждений печени, полного исчезновения псевдолобул, отсутствия фиброзной гиперплазии, отсутствия заметного увеличения межгепатоцитарных щелей и отсутствия видимых отличий от нормальных тканей печени. В заключение, препарат Cu-1 показал лучший эффект на восстановление повреждений печени, чем препарат положительного контроля.

93 Результаты окрашивания по Массону позволили сделать те же выводы, что и результаты окрашивания по ГЭ.

94. Препарат Cu-2 также показал схожие эффекты с препаратом Си-1; подробное описание не требуется.

95. В целом, препараты Cu-1 и Cu-2 значительно уменьшили фиброз печени и псевдолобулины печени. Результаты тестирования показателей функции печени также показали восстановление функции печени. Наиболее значительными изменениями были аланин-аминотрансфераза (ALT) и общий билирубин (TBIL). Аспартатаминотрансфераза (AST) и моноаминооксидаза (МАО) также значительно восстановились, в то время как альбумин (ALB) существенно не изменился. Оба тестируемых вещества могут значительно улучшить функцию печени и ее патологическую структуру у цирротических мышей; кроме того, общий эффект кластеров меди превосходит положительный контроль сорафениб. Эти результаты создают экспериментальную основу для дальнейшего применения в будущем.

96. L-Cys-CuCs и L-GSH-CuCs других размеров, а также другие CuCs, связанные с лигандами, различных размеров также обладают аналогичными эффектами, хотя их действие варьируется в определенных пределах. Они не будут подробно описаны здесь.

97. Хотя настоящее изобретение было описано со ссылкой на конкретные варианты осуществления, следует понимать, что эти варианты являются иллюстративными и не ограничивают объем изобретения. Альтернативные варианты осуществления настоящего изобретения станут очевидными для тех, кто обладает обычными навыками в области, к которой относится настоящее изобретение. Такие альтернативные варианты осуществления считаются включенными в объем настоящего изобретения. Соответственно, объем настоящего изобретения определяется прилагаемой формулой изобретения и подтверждается приведенным выше описанием.

Источники

Deng Н.Н. et al. An ammonia-based etchant for attaining copper nanoclusters with green fluorescence emission. Nanoscale, 2018, 10, 6467.

Jia X. et al. Cu Nanoclusters with Aggregation Induced Emission Enhancement. Small, 2013, DOI: 10.1002/smll.201300896.

Wang C. and Huang Y. GREEN ROUTE TO PREPARE BIOCOMPATIBLE AND NEAR INFRARED THIOLATE-PROTECTED COPPER NANOCLUSTERS FOR CELLULAR IMAGING. NANO: Brief Reports and Reviews. 2013, 8(5): 1350054 (10 pages).

Изобретение относится к лечению цирроза печени. Раскрыто применение кластера меди (CuC), связанного с лигандом, для лечения субъекта с циррозом печени, где указанный связанный с лигандом CuC включает: медное ядро и лиганд, где лиганд связывается с медным ядром, образуя кластер меди, связанный с лигандом (CuC); где медное ядро имеет диаметр в интервале 0,5-5 нм; лиганд выбран из группы, состоящей из L-цистеина и его производных, D-цистеина и его производных, цистеинсодержащих олигопептидов и их производных и других тиолсодержащих соединений. Изобретение обеспечивает восстановление функции печени. 7 з.п. ф-лы, 3 ил., 1 табл., 3 пр.

1. Применение кластера меди (CuC), связанного с лигандом, для лечения субъекта с циррозом печени, где указанный связанный с лигандом CuC включает:

медное ядро; и

лиганд, где лиганд связывается с медным ядром, образуя кластер меди, связанный с лигандом (CuC);

где медное ядро имеет диаметр в интервале 0,5-5 нм; лиганд выбран из группы, состоящей из L-цистеина и его производных, D-цистеина и его производных, цистеинсодержащих олигопептидов и их производных и других тиолсодержащих соединений.

2. Применение по п. 1, где медное ядро имеет диаметр в интервале 0,5-3 нм.

3 . Применение по п. 1, где L-цистеин и его производные выбирают из группы, состоящей из L-цистеина, N-изобутирил-L-цистеина (L-NIBC) и N-ацетил-L-цистеина (L-NAC), и где D-цистеин и его производные выбирают из группы, состоящей из D-цистеина, N-изобутирил-D-цистеина (D-NIBC) и N-ацетил-D-цистеина (D-NAC).

4. Применение по п. 1, где цистеинсодержащие олигопептиды и их производные представляют собой цистеинсодержащие дипептиды, цистеинсодержащие трипептиды или цистеинсодержащие тетрапептиды.

5. Применение по п. 4, где цистеинсодержащие дипептиды выбирают из группы, состоящей из L(D)-цистеил-L(D)-аргинин дипептида (CR), L(D)-аргинил-L(D)-цистеин дипептида (RC), L(D)-гистидил-L(D)-цистеин дипептида (HC) и L(D)-цистеил-L(D)-гистидин дипептида (CH).

6. Применение по п. 4, где цистеинсодержащие трипептиды выбирают из группы, состоящей из глицил-L(D)-цистеил-L(D)-аргинин трипептида (GCR), L(D)-пролил-L(D)-цистеил-L(D)-аргинин трипептида (PCR), L(D)-лизил-L(D)-цистеил-L(D)-пролин трипептида (KCP) и L(D)-глутатиона (GSH).

7. Применение по п. 4, где цистеинсодержащие тетрапептиды выбирают из группы, состоящей из глицил-L(D)-серил-L(D)-цистеил-L(D)-аргинин тетрапептида (GSCR) и глицил-L(D)-цистеил-L(D)-серил-L(D)-аргинин тетрапептида (GCSR).

8. Применение по п. 1, где другие тиолсодержащие соединения выбирают из группы, состоящей из 1-[(2S)-2-метил-3-тиол-1-оксопропил]-L(D)-пролина, тиогликолевой кислоты, меркаптоэтанола, тиофенола, D-3-троловола, N-(2-меркаптопропионил)-глицина и додецилмеркаптана.