КЛАСТЕРЫ ЗОЛОТА, КОМПОЗИЦИИ И СПОСОБЫ ЛЕЧЕНИЯ ЦЕРЕБРАЛЬНОГО ИНСУЛЬТА Российский патент 2024 года по МПК A61K31/198 A61K31/95 A61K31/401 A61K33/242 A61K38/05 A61K38/06 A61K38/07 A61K38/08 A61P9/10 B82B1/00 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

[0001] Настоящее изобретение относится к области лечения заболеваний головного мозга, в частности, к кластерам золота (AuCs), связанным с лигандами, композициям, включающим кластеры золота (AuCs), композициям, включающим кластеры золота (AuCs), связанные с лигандами, применению кластеров золота (AuCs) для получения лекарственных средств для лечения церебрального инсульта, и способам, в которых применяются кластеры золота (AuCs) и композиции для лечения церебрального инсульта.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

[0002] Инсульт происходит, когда кровеносный сосуд либо закупоривается тромбом, либо разрывается. Существует три типа инсульта: геморрагический церебральный инсульт, ишемический церебральный инсульт и транзиторная ишемическая атака (ТИА). [0003] Причиной геморрагического церебрального инсульта является разрыв кровеносного сосуда, препятствующий поступлению крови в мозг. Общие симптомы включают внезапную слабость, паралич любой части тела, нарушение речи, рвоту, трудности при ходьбе, кому, потерю сознания, скованность мышц шеи и головокружение. Специализированного лечения не существует.

[0004] Ишемический церебральный инсульт, также известный как ишемия головного мозга и церебральная ишемия, представляет собой одну из наиболее распространенных патологий у человека и является одной из ведущих причин смерти и инвалидности. На долю ишемического инсульта приходится около 87 процентов всех случаев инсульта. Ишемический церебральный инсульт является следствием закупоривания, например, тромбом или бляшкой, артерии, снабжающей кровью мозг, при этом закупоривание возникает в области шеи или в черепе и уменьшает приток крови и кислорода к мозгу, что приводит к повреждению или гибели клеток мозга. Если кровообращение не восстанавливается быстро, повреждение мозга может быть необратимым.

[0005] Характерные симптомы ишемического церебрального инсульта зависят от того, какая область мозга поражена. Общими симптомами большинства случаев ишемического церебрального инсульта являются проблемы со зрением, слабость или паралич конечностей, головокружение и вертиго, спутанность сознания, потеря координации и опущение лица с одной стороны. После появления симптомов очень важно как можно быстрее начать лечение, чтобы снизить вероятность того, что повреждения станут необратимыми.

[0006] Доступные способы лечения ишемического церебрального инсульта очень ограничены. Основным клинически доступным препаратом для лечения ишемического церебрального инсульта является тканевой активатор плазминогена (t-PA), который расщепляет тромбы, но для того, чтобы лечение было эффективным, t-PA должен быть введен внутривенно в течение четырех с половиной часов с возникновения приступа инсульта. Однако t-PA вызывает кровотечение, поэтому пациентов нельзя лечить с помощью t-PA, если у них в анамнезе есть геморрагический инсульт, кровоизлияние в мозг, а также недавняя серьезная операция или травма головы. Долгосрочное лечение включает аспирин или антикоагулянт для предотвращения дальнейшего образования тромбов.

[0007] В публикации Amani et al. говорится, что OX26@GNPs, образованные путем конъюгирования OX26-PEG с поверхностью 25 нм коллоидных наночастиц золота, значительно увеличили инфарктную ткань мозга, а свободные GNPs и PEGylated GNPs не повлияли на интенсивность инфаркта; результаты исследования показали, что OX26@GNPs не подходят для лечения церебрального инсульта.

[0008] В публикации Zheng et al. говорится, что у их модельной крысы с травмой OGD/R 20 нм Au-NPs повысили жизнеспособность клеток, уменьшили апоптоз нейронов и окислительный стресс, а также улучшили митохондриальное дыхание. Однако в исследовании Zheng et al. также продемонстрировано, что 5 нм Au-NPs показали противоположные эффекты, не подходящие для лечения церебрального инсульта. [0009] ТИА вызывается временным тромбом. Общие симптомы включают слабость, онемение или паралич одной стороны тела, неразборчивую или спутанную речь, слепоту и головокружение. Специализированного лечения не существует.

[0010] Лечение церебрального инсульта должно быть своевременным, чтобы избежать или облегчить неврологическую дисфункцию или смерть пациента в результате повреждения или гибели нервных клеток мозга, вызванных церебральной ишемией или мозговым кровоизлиянием. Специализированных лекарственных препаратов для лечения геморрагического церебрального инсульта и ТИА не существует; основной препарат, такой как t-PA для лечения ишемического церебрального инсульта, вызывает кровотечение; таким образом, только после того, как пациенту был утвержден диагноз ишемический церебральный инсульт, а не церебральный геморрагический инсульт, будет принято решение об использовании препаратов для лечения ишемического церебрального инсульта. Однако процесс утверждения диагноза отнимает драгоценное время для своевременного начала лечения ишемического церебрального инсульта. [ООН] Сохраняется потребность в эффективном способе и препаратах для лечения церебрального инсульта, особенно в препаратах, способных оказывать терапевтическое действие как на геморрагический церебральный инсульт, так и на ишемический церебральный инсульт. Поскольку причины развития геморрагического церебрального инсульта и ишемического церебрального инсульта принципиально различны, все имеющиеся разработки лекарственных средств направлены либо на геморрагический церебральный инсульт, либо на ишемический церебральный инсульт; таким образом, разработка лекарственного средства, способного лечить пациентов с церебральным инсультом, независимо от того, имеет ли пациент геморрагический церебральный инсульт или ишемический церебральный инсульт, представляет собой неразрешимую задачу или может быть охарактеризована как табу в отрасли.

РАСКРЫТИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0012] Настоящее изобретение раскрывает кластеры золота, связанные с лигандами, для применения в лечении церебрального инсульта у субъекта.

[0013] В определенных вариантах осуществления изобретения кластер золота, связанный с лигандами, используется для лечения церебрального инсульта у субъекта, где кластер золота, связанный с лигандами, включает золотое ядро и лиганд, связанный с золотым ядром; где церебральный инсульт выбран из группы, состоящей из геморрагического церебрального инсульта, ишемического церебрального инсульта и транзиторной ишемической атаки (ТИА).

[0014] В определенных вариантах осуществления изобретения кластера золота, связанного с лигандами, для применения в лечении церебрального инсульта золотое ядро имеет диаметр в интервале 0,5-3 нм.

[0015] В определенных вариантах осуществления изобретения кластера золота, связанного с лигандами, для применения в лечении церебрального инсульта золотое ядро имеет диаметр в интервале 0,5-2,6 нм.

[0016] В определенных вариантах осуществления изобретения кластер золота, связанный с лигандами, для применения в лечении церебрального инсульта представляет собой выбранный из группы, состоящей из L-цистеина и его производных, D-цистеина и его производных, цистеинсодержащих олигопептидов и их производных и других тиолсодержащих соединений.

[0017] В определенных вариантах осуществления изобретения кластера золота, связанного с лигандами, для применения в лечении церебрального инсульта L-цистеин и его производные выбирают из группы, состоящей из L-цистеина, N-изобутирил-L-цистеина (L-NIBC) и N-ацетил-L-цистеина (L-NAC) и где D-цистеин и его производные выбирают из группы, состоящей из D-цистеина, N-изобутирил-D-цистеина (D-NIBC) и N-ацетил-D-цистеина (D-NAC).

[0018] В определенных вариантах осуществления изобретения кластера золота, связанного с лигандами, для применения в лечении церебрального инсульта цистеинсодержащие олигопептиды и их производные представляют собой цистеинсодержащие дипептиды, где цистеинсодержащие дипептиды выбраны из группы, состоящей из L(D)-цистеин-L(D)-аргинин дипептида (CR), L(D)-аргинин-L(D)-цистеин дипептида (RC), L(D)-гистидин-L(D)-цистеин дипептида (НС) и L(D)-цистеин-L(D)-гистидин дипептида (СН). [0019] В определенных вариантах осуществления изобретения кластера золота, связанного с лигандами, для применения в лечении церебрального инсульта цистеинсодержащие олигопептиды и их производные представляют собой цистеинсодержащие трипептиды, где цистеинсодержащие трипептиды выбраны из группы, состоящей из глицин-L(D)-цистеин-L(D)-аргинин трипептида (GCR), L(D)-пролин-L(D)-цистеин-L(D)-аргинин трипептида (PCR), L(D)-лизин-L(D)-цистеин-L(D)-пролин трипептида (КСР) и L(D)-глутатиона (GSH).

[0020] В определенных вариантах осуществления изобретения кластера золота, связанного с лигандами, для применения в лечении церебрального инсульта цистеинсодержащие олигопептиды и их производные представляют собой цистеинсодержащие тетрапептиды, где цистеинсодержащие тетрапептиды выбраны из группы, состоящей из глицин-L(D)-серин-L(D)-цистеин-L(D)-аргининового тетрапептида (GSCR) и глицин-L(D)-цистеин-L(D)-серин-L(D)-аргининового тетрапептида (GCSR).

[0021] В определенных вариантах осуществления изобретения кластера золота, связанного с лигандами, для применения в лечении церебрального инсульта цистеинсодержащие олигопептиды и их производные представляют собой цистеинсодержащие пентапептиды, где цистеинсодержащие пентапептиды выбраны из группы, состоящей из цистеинил-аспарагинил-глутаминил-валинил-аспарагина (CDEVD) и аспаргинил-глутаминил-валинил-аспарагинил-цистеина (DEVDC).

[0022] В определенных вариантах осуществления изобретения кластера золота, связанного с лигандами, для применения в лечении церебрального инсульта другие тиолсодержащие соединения выбирают из группы, состоящей из 1-[(2S)-2-метил-3-тиол-1-оксопропил]-L(D)-пролина, тиогликолевой кислоты, меркаптоэтанола, тиофенола, D-3-троловола, N-(2-меркаптопропионил)-глицина, додецилмеркаптана, 2-аминоэтанэтиола (CSH), 3-меркаптопропионовой кислоты (МРА) и 4-меркаптобеновой кислоты (р-МВА). [0023] Задачи и преимущества от применения заявленного изобретения будут раскрыты из следующего подробного описания предпочтительных вариантов его осуществления в совокупности с прилагаемыми чертежами.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

[0024] Предпочтительные варианты осуществления настоящего изобретения будут далее описаны со ссылкой на Фигуры, на которых одинаковые ссылочные цифры обозначают одинаковые элементы.

[0025] На фиг. 1 показаны ультрафиолетово-видимые (УФ) спектры, изображения, полученные с помощью просвечивающего электронного микроскопа (ПЭМ), и диаграммы распределения размеров частиц лиганда L-NIBC, модифицированного наночастицами золота (L-NIBC-AuNPs) с различными размерами частиц; на фиг.1А показан УФ-спектр 3,6 нм L-NIBC-AuNPs; на фиг. 1 В показано ПЭМ-изображение 3,6 нм L-NIBC-AuNPs; на фиг. 1С показана диаграмма распределения частиц по размерам 3,6 нм L-NIBC-AuNPs; на фиг. 1D показан УФ-спектр 6,0 нм L-NIBC-AuNPs; на фиг. 1Е показано ПЭМ-изображение 6,0 нм L-NIBC-AuNPs; на фиг. 1F показана диаграмма распределения частиц по размерам 6,0 нм L-NIBC-AuNPs; на фиг. 1G показан УФ-спектр 10,1 нм L-NIBC-AuNPs; на фиг. 1H показано ПЭМ-изображение 10,1 нм L-NIBC-AuNPs; на фиг. 1I показана диаграмма распределения частиц по размерам 10,1 нм L-NIBC-AuNPs; на фиг. 1J показан УФ-спектр 18,2 нм L-NIBC-AuNPs; на фиг. 1K показано ПЭМ-изображение 18,2 нм L-NIBC-AuNPs; на фиг.1L показана диаграмма распределения частиц по размерам 18,2 нм L-NIBC-AuNPs.

[0026] На фиг. 2 показаны УФ спектры, изображения, полученные с помощью ПЭМ, и диаграммы распределения частиц по размерам кластеров золота, связанных с лигандом L-NIBC (L-NIBC-AuCs) с различными размерами частиц; на фиг.2А показан УФ-спектр 1,1 нм L-NIBC-AuCs; на фиг. 2В показано ПЭМ-изображение 1,1 нм L-NIBC-AuCs; на фиг. 2С показана диаграмма распределения частиц по размерам 1,1 нм L-NIBC-AuCs; на фиг. 2D показан УФ-спектр 1,8 нм L-NIBC-AuCs; на фиг. 2Е показано ПЭМ-изображение 1,8 нм L-NIBC-AuCs; на фиг. 2F показана диаграмма распределения частиц по размерам 1,8 нм L-NIBC-AuCs; на фиг. 2G показан УФ-спектр 2,6 нм L-NIBC-AuCs; на фиг. 2Н показано ПЭМ-изображение 2,6 нм L-NIBC-AuCs; на фиг. 2I показана диаграмма распределения частиц по размерам 2,6 нм L-NIBC-AuCs.

[0027] На фиг. 3 показаны инфракрасные области спектра L-NIBC-AuCs 1,1 нм, 1,8 нм и 2,6 нм.

[0028] На фиг. 4 показаны УФ, ИК, ПЭМ и диаграммы распределения частиц по размерам кластеров золота, связанных с лигандом CR (CR-AuCs); на фиг. 4А показан УФ-спектр CR-AuCs; на фиг. 4 В показан ИК-спектр CR-AuCs; на фиг. 4С показано ПЭМ-изображение CR-AuCs; на фиг. 4D показана диаграмма распределения частиц по размерам CR-AuCs.

[0029] На фиг. 5 показаны УФ, ИК, ПЭМ и диаграммы распределения частиц по размерам кластеров золота, связанных с RC (RC-AuCs); на фиг. 5А показан УФ-спектр RC-AuCs; на фиг. 5В показан ИК-спектр RC-AuCs; на фиг.5С показано ПЭМ-изображение RC-AuCs; на фиг. 5D показана диаграмма распределения частиц по размерам RC-AuCs.

[0030] На фиг.6 показаны УФ, ИК, ПЭМ и диаграммы распределения частиц по размерам кластеров золота, связанных с лигандом 1-[(28)-2-метил-3-тиол-1-оксопропил]-L-пролина (т.е. Cap-связанных кластеров золота (Cap-AuCs)); на фиг.6А показан УФ-спектр Сар-AuCs; на фиг. 6В показан ИК-спектр Cap-AuCs; на фиг. 6С показано ПЭМ-изображение Cap-AuCs; на фиг. 6D показана диаграмма распределения частиц по размерам Cap-AuCs.

[0031] На фиг. 7 показаны УФ, ИК, ПЭМ и диаграммы распределения частиц по размерам кластеров золота, связанных с лигандом GSH (GSH-AuCs); на фиг. 7А показан УФ-спектр GSH-AuCs; на фиг. 7В показан ИК-спектр GSH-AuCs; на фиг. 7С показано ПЭМ-изображение GSH-AuCs; на фиг. 7D показана диаграмма распределения частиц по размерам GSH-AuCs.

[0032] На фиг. 8 показаны УФ, ИК, ПЭМ и диаграммы распределения частиц по размерам кластеров золота, связанных с лигандом D-NIBC (D-NIBC-AuCs); на фиг. 8А показан УФ-спектр D-NIBC-AuCs; на фиг. 8В показан ИК-спектр D-NIBC-AuCs; на фиг. 8С показано ПЭМ-изображение D-NIBC-AuCs; на фиг. 8D показана диаграмма распределения частиц по размерам D-NIBC-AuCs.

[0033] На фиг. 9 показаны УФ, ИК, ПЭМ и диаграммы распределения частиц по размерам кластеров золота, связанных с лигандом L-цистеином (L-Cys-AuCs); на фиг. 9А показан УФ-спектр L-Cys-AuCs; на фиг. 9 В показан ИК-спектр L-Cys-AuCs; на фиг. 9С показано ПЭМ-изображение L-Cys-AuCs; на фиг. 9D показана диаграмма распределения частиц по размерам L-Cys-AuCs.

[0034] На фиг. 10 показаны УФ, ИК, ПЭМ и диаграммы распределения частиц по размерам кластеров золота, связанных с лигандом 2-аминоэтантиолом (CSH-AuCs); на фиг. 10А показан УФ-спектр CSH-AuCs; на фиг. 10 В показан ИК-спектр CSH-AuCs; на фиг. 10С показано ПЭМ-изображение CSH-AuCs; на фиг. 10D показана диаграмма распределения частиц по размерам CSH-AuCs.

[0035] На фиг. 11 показаны УФ, ИК, ПЭМ и диаграммы распределения частиц по размерам кластеров золота, связанных с лигандом 3-меркаптопропионовой кислоты (MPA-AuCs); на фиг. 11А показан УФ-спектр MPA-AuCs; на фиг. 11В показан ИК-спектр MPA-AuCs; на фиг. 11С показано ПЭМ-изображение MPA-AuCs; на фиг. 11D показана диаграмма распределения частиц по размерам MPA-AuCs.

[0036] На фиг. 12 показаны УФ, ИК, ПЭМ и диаграммы распределения частиц по размерам кластеров золота, связанных с лигандом 4-меркаптобензойной кислоты (p-MBA-AuCs); на фиг. 12А показан УФ-спектр p-MBA-AuCs; на фиг. 12В показан ИК-спектр p-MBA-AuCs; на фиг. 12С показано ПЭМ-изображение p-MBA-AuCs; на фиг. 12D показана диаграмма распределения частиц по размерам p-MBA-AuCs.

[0037] На фиг. 13 показаны УФ, ПЭМ и диаграммы распределения частиц по размерам кластеров золота, связанных с лигандом 4-цистеинил-аспарагинил-глутаминил-валинин-аспарагина (CDEVD) (CDEVD-AuCs); на фиг. 13А показан УФ-спектр CDEVD-AuCs; на фиг. 13 В показано ПЭМ-изображение CDEVD-AuCs; на фиг. 13С показана диаграмма распределения частиц по размерам CDEVD-AuCs.

[0038] На фиг. 14 показаны УФ, ПЭМ и диаграммы распределения частиц по размерам кластеров золота, связанных с лигандом 4-аспарагинил-глутаминил-валинил-аспарагинил-цистеина (DEVDC) (DEVDC-AuCs); на фиг. 14А показан УФ-спектр DEVDC-AuCs; на фиг. 14 В показано ПЭМ-изображение DEVDC-AuCs; на фиг. 14С показана диаграмма распределения частиц по размерам DEVDC-AuCs.

[0039] На фиг. 15 показана оценка рефлекторного поведения крыс в каждой группе (на гистограмме в каждой временной точке слева направо: группа плацебо (пустая), группа модельного контроля, группа А1 с низкой дозировкой, группа А1 с высокой дозировкой, группа А2 с низкой дозировкой, группа А2 с высокой дозировкой, группа A3 с низкой дозировкой, группа A3 с высокой дозировкой, группа А4 с низкой дозировкой, группа А4 с высокой дозировкой, группа В1 с низкой дозировкой, группа В1 с высокой дозировкой, группа В2 с низкой дозировкой и группа В2 с высокой дозировкой).

[0040] На фиг. 16 показан процент поражения головного мозга крыс в каждой группе (на гистограмме слева направо: группа плацебо (пустая), группа модельного контроля, группа А1 с низкой дозировкой, группа А1 с высокой дозировкой, группа А2 с низкой дозировкой, группа А2 с высокой дозировкой, группа A3 с низкой дозировкой, группа A3 с высокой дозировкой, группа А4 с низкой дозировкой, группа А4 с высокой дозировкой, группа В1 с низкой дозировкой, группа В1 с высокой дозировкой, группа В2 с низкой дозировкой и группа В2 с высокой дозировкой).

[0041] На фиг. 17 показаны примерные изображения окрашивания ТТС тканей мозга крыс после введения препаратов золотого кластера и наночастиц золота; на фиг. 17А показано примерное изображение окрашивания ТТС группы плацебо; на фиг. 17 В показано примерное изображение окрашивания ТТС группы модельного контроля; на фиг. 17С показано примерное изображение окрашивания ТТС группы А1 с низкой дозировкой; на фиг. 17D показано примерное изображение окрашивания ТТС группы А1 с высокой дозировкой; на фиг. 17Е показано примерное изображение окрашивания ТТС группы В1 с низкой дозировкой; на фиг.17F показано примерное изображение окрашивания ТТС группы В1 с высокой дозировкой.

[0042] На фиг. 18 показаны результаты оценки неврологических показателей mNSS в разное время после завершения моделирования, где NC: группа нормального контроля; SHAM: группа плацебо; IVH: группа модельного контроля; AL: группа введения препарата А в низкой дозировке; АН: группа введения препарата А в высокой дозировке; BL: группа введения препарата В в низкой дозировке; ВН: группа введения препарата В в высокой дозировке. На фиг. 18А показаны показатели неврологические показатели mNSS через 12 часов после моделирования; на фиг. 18 В показаны неврологические показатели mNSS через 1 день после моделирования; на фиг. 18С показаны неврологические показатели mNSS через 2 дня после моделирования; на фиг. 18D показаны неврологические показатели mNSS через 4 дня после моделирования; на фиг. 18Е показаны неврологические показатели mNSS через 7 дней после моделирования. ***: По сравнению с группой IVH, Р<0,001.

[0043] На фиг. 19 показано содержание Evans Blue в супернатантах гомогенатов ткани мозга крыс всех групп при измерении проницаемости гематоэнцефалического барьера (ГЭБ) методом окрашивания Evans Blue, где NC: нормальная контрольная группа; SHAM: группа плацебо; IVH: группа модельного контроля; AL: группа введения препарата А в низкой дозировке; АН: группа введения препарата А в высокой дозировке. *: По сравнению с крысами группы IVH, Р<0,05; **: По сравнению с крысами группы IVH, Р<0,01; ***: По сравнению с крысами группы IVH, Р<0,001.

[0044] На фиг. 20 показано содержание воды в тканях мозга крыс, измеренное методом сухой/мокрый вес, где NC: группа нормального контроля; SHAM: группа плацебо; IVH: группа модельного контроля; AL: группа введения препарата А в низкой дозировке; АН: группа введения препарата А в высокой дозировке. *: По сравнению с крысами группы IVH, Р<0,05; **: По сравнению с крысами группы IVH, Р<0,01; ***: По сравнению с крысами группы IVH, Р<0,001.

[0045] На фиг. 21 показаны примеры изображений окрашивания Н&Е тканей мозга в различных группах; на фиг. 21А: группа NC; на фиг. 21В: группа SHAM; на фиг. 21С: группа IVH; на фиг. 21D: группа AL; на фиг. 21Е: группа АН.

[0046] На фиг. 22 показаны примеры изображений иммунофлуоресцентного окрашивания iNOS тканей мозга крыс; на фиг.22А: группа NC; на фиг. 22 В: группа SHAM; на фиг. 22С: группа IVH; на фиг. 22D: группа AL; на фиг. 22Е: группа АН.

[0047] На фиг. 23 показана экспрессия белка ММР9 в тканях мозга крыс в каждой группе в эксперименте WB, где NC: группа нормального контроля; SHAM: группа плацебо; IVH: группа модельного контроля; AL: группа введения препарата А в низкой дозировке; АН: группа введения препарата А в высокой дозировке. На фиг. 23А показано, что полосы белка ММР9 были обнаружены в 6 параллельных образцах; на фиг. 23 В показана относительная экспрессия белка ММР9 (GAPDH в качестве сравнения). По сравнению с группой IVH, *, Р<0,05.

[0048] На фиг. 24 показан уровень MDA в тканях мозга крыс в каждой группе, где NC: группа нормального контроля; SHAM: группа плацебо; IVH: группа модельного контроля; AL: группа введения препарата А в низкой дозировке; АН: группа введения препарата А в высокой дозировке. ***: По сравнению с группой IVH, Р<0,001; **: По сравнению с группой IVH, P<0,01.

[0049] На фиг. 25 показан уровень SOD в тканях мозга крыс в каждой группе, где NC: группа нормального контроля; SHAM: группа плацебо; IVH: группа модельного контроля; AL: группа введения препарата А в низкой дозировке; АН: группа введения препарата А в высокой дозировке. ***: По сравнению с группой IVH, Р<0,001.

[0050] На фиг. 26 показаны результаты исследования ультратонких срезов ткани мозга с помощью просвечивающего электронного микроскопа; на фиг. 26А: группа NC; на фиг. 26В: группа SHAM; на фиг. 26С: группа IVH; на фиг. 26D: группа AL; на фиг .26Е: группа АН.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ВАРИАНТОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ

[0051] Следующее подробное описание некоторых вариантов осуществления изобретения даст возможность лучше понять настоящее изобретение.

[0052] По всему тексту данной заявки, где есть ссылки на публикации, полные описания этих публикаций включены в эту заявку в виде ссылок для более полного раскрытия уровня техники, к которому относится данное изобретение.

[0053] В настоящем документе «введение» означает пероральное («ро») введение, введение в виде суппозитория, местное введение, внутривенное («iv»), внутрибрюшинное («ip»), внутримышечное («im»), интралезиональное, интрагиппокампальное, интрацеребровентрикулярное, интраназальное или подкожное («sc») введение, или имплантацию субъекту устройства замедленного высвобождения, например, мини-осмотического насоса или разъедаемого имплантата. Введение осуществляется любым способом, включая парентеральный и трансмукозальный (например, пероральный, назальный, вагинальный, ректальный или трансдермальный). Парентеральное введение включает, в частности, внутривенное, внутримышечное, внутриартериальное, внутрикожное, подкожное, внутрибрюшинное, внутрижелудочковое и внутричерепное. Другие способы введения включают, не ограничиваясь, использование липосомальных составов, внутривенную инфузию, трансдермальные пластыри и т.д.

[0054] Под «системным введением» и «системно вводимым» понимается способ введения соединения или композиции млекопитающему таким образом, что соединение или композиция доставляются к участкам тела, включая целевой участок фармацевтического воздействия, через систему кровообращения. Системное введение включает, не ограничиваясь, пероральное, интраназальное, ректальное и парентеральное (т.е. введение не через пищеварительный тракт, а внутримышечно, внутривенно, внутриартериально, трансдермально и подкожно) введение, с оговоркой, что в настоящем документе системное введение не включает прямое введение в участок мозга не через систему кровообращения, например, интратекальное введение и внутричерепное введение.

[0055] Под «процессом лечения» и «лечением» в настоящем документе понимается замедление возникновения, приостановление или обращение вспять прогрессирования, облегчение или предотвращение заболевания или состояния, к которому применяется данный термин, или одного или нескольких симптомов такого заболевания или состояния. [0056] Под «пациентом», «субъектом» или «индивидуумом» взаимозаменяемо понимается млекопитающее, например, человек или другое млекопитающее, включая приматов (например, макак, обыкновенных шимпанзе, понго), одомашненных млекопитающих (например, кошачьи, собачьи), сельскохозяйственное млекопитающее (например, бычьи, овиные, свиные, лошадиные) и лабораторных млекопитающих или грызунов (например, крысиные, мышиные, зайцеобразные, хомяковые, морские свинки).

[0057] Кластеры золота (AuCs) - это особая форма золота, существующая между атомами золота и наночастицами золота. AuCs имеют размер менее 3 нм и состоят всего из нескольких сотен атомов золота, что приводит к разрушению гранецентрированной кубической структуры наночастиц золота. В результате AuCs проявляют молекулоподобные дискретные электронные свойства с четко выраженным промежутком HOMO-LUMO в отличие от непрерывных или квазинепрерывных энергетических уровней наночастиц золота. Это приводит к исчезновению эффекта поверхностного плазмонного резонанса и соответствующей полосы поглощения плазмонного резонанса (520±20 нм) в УФ спектре, которой обладают обычные наночастицы золота. [0058] Настоящее изобретение раскрывает AuC, связанный с лигандами. [0059] В определенных вариантах осуществления изобретения AuC, связанный с лигандами, включает лиганд и золотое ядро, где лиганд связан с золотым ядром. Связывание лигандов с золотым ядром означает, что лиганды образуют стабильные в растворе комплексные соединения с золотым ядром посредством ковалентной связи, водородной связи, электростатической силы, гидрофобной силы, силы Ван-дер-Ваальса и т.д. В определенных вариантах осуществления диаметр золотого ядра составляет от 0,5 до 3 нм. В определенных вариантах осуществления диаметр золотого ядра составляет 0,5-2,6 нм.

[0060] В определенных вариантах осуществления изобретения АиС, связанный с лигандами, представляет собой тиолсодержащее соединение или олигопептид. В определенных вариантах осуществления лиганд связывается с золотым ядром с образованием АиС, связанного с лигандом, через связь Au-S.

[0061] В определенных вариантах осуществления изобретения лиганд представляет собой, не ограничиваясь, L-цистеин, D-цистеин или производное цистеина. В определенных вариантах осуществления производное цистеина представляет собой N-изобутирил-L-цистеин (L-NIBC), N-изобутирил-D-цистеин (D-NIBC), N-ацетил-L-цистеин (L-NAC) или N-ацетил-D-цистеин (D-NAC).

[0062] В определенных вариантах осуществления лиганд представляет собой, не ограничиваясь, цистеинсодержащий олигопептид и его производные. В определенных вариантах осуществления цистеинсодержащий олигопептид представляет собой цистеинсодержащий дипептид. В определенных вариантах осуществления изобретения цистеинсодержащий дипептид представляет собой L(D)-цистеин-L(D)-аргинин дипептид (CR), L(D)-аргинин-L(D)-цистеин дипептид (RC) или L(D)-цистеин-L-гистидин дипептид (СН). В определенных вариантах осуществления цистеинсодержащий олигопептид представляет собой цистеинсодержащий трипептид. В определенных вариантах осуществления изобретения цистеинсодержащий трипептид представляет собой глицин-L(D)-цистеин-L(D)-аргинин трипептид (GCR), L(D)-пролин-L(D)-цистеин-L(D)-аргинин трипептид (PCR) или L(D)-глутатион (GSH). В определенных вариантах осуществления цистеинсодержащий олигопептид представляет собой цистеинсодержащий тетрапептид. В определенных вариантах осуществления изобретения цистеинсодержащий тетрапептид представляет собой глицин-L(D)-серин-L(D)-цистеин-L(D)-аргинин тетрапептид (GSCR) или глицин-L(D)-цистеин-L(D)-серин-L(D)-аргинин тетрапептид (GCSR). В определенных вариантах осуществления цистеинсодержащий олигопептид представляет собой цистеинсодержащий пентапептид. В определенных вариантах осуществления изобретения цистеинсодержащий пентапептид представляет собой цистеинил-аспарагинил-глутаминил-валинил-аспарагин (CDEVD) или аспарагинил-глутаминил-валинил-аспарагинил-цистеин (DEVDC).

[0063] В определенных вариантах осуществления изобретения лиганд представляет собой тиолсодержащее соединение. В определенных вариантах осуществления тиолсодержащее соединение представляет собой 1-[(2S)-2-метил-3-тиол-1-оксопропил]-L(D)-пролин, тиогликолевую кислоту, меркаптоэтанол, тиофенол, D-3-троловол, додецилмеркаптан, 2-аминоэтанэтиол (CSH), 3-меркаптопропионовую кислоту (МРА) или 4-меркаптобеновую кислоту (р-МВА).

[0064] Настоящее изобретение раскрывает фармацевтическую композицию для лечения церебрального инсульта, где церебральный инсульт выбран из группы, состоящей из геморрагического церебрального инсульта, ишемического церебрального инсульта и транзиторной ишемической атаки (ТИА). В определенных вариантах осуществления субъектом является человек. В определенных вариантах осуществления субъектом является домашнее животное, например, собака.

[0065] В определенных вариантах осуществления фармацевтическая композиция включает АиС, связанный с лигандами, как описано выше, и фармацевтически приемлемый эксципиент. В определенных вариантах осуществления эксципиент представляет собой фосфатно-буферный раствор или физиологический солевой раствор.

[0066] Настоящее изобретение раскрывает применение вышеописанных AuCs, связанных с лигандами, для получения лекарственного средства для лечения церебрального инсульта, где церебральный инсульт выбран из группы, состоящей из геморрагического церебрального инсульта, ишемического церебрального инсульта и транзиторной ишемической атаки (ТИА).

[0067] Настоящее изобретение раскрывает применение описанных выше AuCs, связанных с лигандами, для лечения субъекта с церебральным инсультом или способ лечения субъекта с церебральным инсультом с использованием описанных выше AuCs, связанных с лигандами, где церебральный инсульт выбран из группы, состоящей из геморрагического церебрального инсульта, ишемического церебрального инсульта и транзиторной ишемической атаки (ТИА). В определенных вариантах осуществления способ лечения включает введение субъекту фармацевтически эффективного количества AuCs, связанных с лигандами. Фармацевтически эффективное количество может быть определено с помощью обычных исследований in vivo. В определенных вариантах осуществления изобретения фармацевтически эффективное количество AuCs, связанных с лигандами, составляет по меньшей мере 0,001 мг/кг/день, 0,005 мг/кг/день, 0,01 мг/кг/день, 0,05 мг/кг/ день, 0,1 мг/кг/день, 0,5 мг/кг/день, 1 мг/кг/день, 2 мг/кг/день, 3 мг/кг/день, 4 мг/кг/день, 5 мг/кг/день, 6 мг/кг/день, 7 мг/кг/день, 8 мг/кг/день, 9 мг/кг/день, 10 мг/кг/день, 15 мг/кг/ день, 20 мг/кг/день, 30 мг/кг/день, 40 мг/кг/день, 50 мг/кг/день, 60 мг/кг/день, 70 мг/кг/ день, 80 мг/кг/день или 100 мг/кг/день.

[0068] Следующие примеры приведены исключительно с целью демонстрации основных положений настоящего изобретения; они ни в коем случае не предназначены для ограничения объема настоящего изобретения. [0069] Варианты осуществления

[0070] Вариант осуществления 1. Получение AuCs, связанных с лигандами

[0071] 1.1 Растворяют HAuCl₄ в метаноле, воде, этаноле, н-пропаноле или этилацетате для получения раствора А, в котором концентрация HAuCl₄ составляет 0,01~0,03М;

[0072] 1.2 Растворяют лиганд в растворителе, чтобы получить раствор В, в котором концентрация лиганда составляет 0,01-0,18 М; лиганд включает, не ограничиваясь, L-цистеин, D-цистеин и другие производные цистеина, такие как N-изобутирил-L-цистеин (L-NIBC), N-изобутирил-D-цистеин (D-NIBC), N-ацетил-L-цистеин (L-NAC) и N-ацетил-D-цистеин (D-NAC), цистеинсодержащие олигопептиды и их производные, включая, не ограничиваясь, дипептиды, трипептид, тетрапептид, пентапептид и другие пептиды, содержащие цистеин, такие как L(D)-цистеин-L(D)-аргинин дипептид (CR), L(D)-аргинин-L(D)-цистеин дипептид (RC), L(D)-цистеин-L(D)-гистидин (СН), глицин-L(D)-цистеин-L(D)-аргинин трипептид (GCR), L(D)-пролин-L(D)-цистеин-L(D)-аргинин трипептид (PCR), L(D)-глутатион (GSH), глицин-L(D)-серин-L(D)-цистеин-L(D)-аргинин тетрапептид (GSCR), глицин-L(D)-цистеин-L(D)-серин-L(D)-аргинин тетрапептид (GCSR), цистеин-аспарагинил-глутаминил-валинил-аспарагин (CDEVD) и аспарагинил-глутаминил-валинин-аспарагинил-цистеин (DEVDC), и другие тиолсодержащие соединения, такие как одно или более из 1-[(2S)-2-метил-3-тиол-1-оксопропил]-L(D)-пролина, тиогликолевой кислоты, меркаптоэтанола, тиофенола, D-3-троловола, додецилмеркаптана, 2-аминоэтанэтиола (CSH), 3-меркаптопропионовой кислоты (МРА) и 4-меркаптобеновой кислоты (р-МВА); растворитель представляет собой один или более из метанола, этилацетата, воды, этанола, н-пропанола, пентана, муравьиной кислоты, уксусной кислоты, диэтилового эфира, ацетона, анизола, 1-пропанола, 2-пропанола, 1-бутанола, 2-бутанол, пентанол, бутилацетат, трибутилметиловый эфир, изопропилацетат, диметилсульфоксид, этилформиат, изобутилацетат, метилацетат, 2-метил-1-пропанол и пропилацетат;

[0073] 1.3 Смешивают раствор А и раствор В так, чтобы мольное соотношение между HAuCl₄ и лигандом составляло 1:(0,01~100), перемешивают в ледяной бане в течение 0,1~48 ч, добавляют 0,025~0,8 М раствора NaBH4 в воде, этаноле или метаноле, продолжают перемешивание в ледяной водяной бане и проводят реакцию в течение 0,1~12 ч. Мольное соотношение между NaBH₄ и лигандом составляет 1:(0,01~100);

[0074] 1.4 Используя ультрафильтрационные трубки MWCO 3K~30K, центрифугируют реакционный раствор при 8000~17500 об/мин по градиенту в течение 10~100 мин после окончания реакции для получения осадка AuCs, связанных с лигандами, с различным средним размером частиц. Апертура фильтрационных мембран для ультрафильтрационных трубок с различными MWCO непосредственно определяет размер AuCs, связанных с лигандами, которые могут пройти через мембраны. По желанию этот этап может быть пропущен;

[0075] 1.5 Растворяют осадок AuCs, связанных с лигандами, в различных средних размерах частиц, полученных на этапе (1.4), в воде, помещают его в диализный мешок и диализируют в воде при комнатной температуре в течение 1~7 дней;

[0076] 1.6 Проводят сублимационную сушку AuCs, связанных с лигандами, в течение 12~24 ч после диализа для получения порошкообразного или флокулирующего вещества, т.е. AuCs, связанных с лигандами.

[0077] Авторами было неожиданно обнаружено, что размер частиц порошкообразного или флокулянтного вещества, полученного вышеописанным способом, составляет менее 3 нм (в целом распределяется в пределах 0,5-2,6 нм). Очевидный пик поглощения при 520 нм отсутствует.Было установлено, что полученный порошок или флок является AuCs, связанными с лигандами.

[0078] Вариант осуществления 2. Получение и характеристики AuCs, связанных с различными лигандами

[0079] 2.1 Получение AuCs, связанных с L-NIBC, т.е. L-NIBC-AuCs

[0080] На примере лиганда L-NIBC подробно описано получение и характеристики AuCs, связанных с лигандом L-NIBC.

[0081] 2.1.1 Взвешивают 1,00 г HAuCl₄ и растворяют в 100 мл метанола для получения 0,03 М раствора А;

[0082] 2.1.2 Взвешивают 0,57 г L-NIBC и растворяют его в 100 мл ледяной уксусной кислоты (уксусной кислоты) для получения 0,03 М раствора В;

[0083] 2.1.3 Отмеряют 1 мл раствора А, смешивают его с 0,5 мл, 1 мл, 2 мл, 3 мл, 4 мл или 5 мл раствора В соответственно (т.е. мольное соотношение между HAuCl₄ и L-NIBC составляет 1:0,5, 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5 соответственно), проводят реакцию в ледяной бане при перемешивании в течение 2 ч, быстро добавляют 1 мл свежеприготовленного 0,03 М (приготовленного путем взвешивания 11,3 мг NaBH₄ и растворения его в 10 мл этанола) этанольного раствора NaBH4, когда раствор из ярко-желтого становится бесцветным, продолжают реакцию в течение 30 мин после того, как раствор станет темно-коричневым, и добавляют 10 мл ацетона для завершения реакции.

[0084] 2.1.4 После проведения реакции реакционный раствор подвергают градиентному центрифугированию для получения порошка L-NIBC-AuCs с различными размерами частиц. Специфический способ: после завершения реакции реакционный раствор переносят в ультрафильтрационную пробирку с MWCO 30К и объемом 50 мл, центрифугируют при 10000 об/мин в течение 20 мин, а ретентат во внутренней пробирке растворяют в сверхчистой воде для получения порошка с размером частиц около 2,6 нм. Затем смешанный раствор во внешней пробирке переносят в ультрафильтрационную пробирку объемом 50 мл с MWCO 10K и центрифугируют при 13000 об/мин в течение 30 мин. Ретентат во внутренней пробирке растворяют в сверхчистой воде для получения порошка с размером частиц около 1,8 нм. Затем смешанный раствор во внешней пробирке переносят в ультрафильтрационную пробирку объемом 50 мл с MWCO 3K и центрифугируют при 17 500 об/мин в течение 40 мин. Ретентат во внутренней пробирке растворяют в сверхчистой воде для получения порошка с размером частиц около 1,1 нм. [0085] 2.1.5 Осаждают порошок трех различных размеров частиц, полученных градиентным центрифугированием, удаляют растворитель, высушивают сырой продукт N2, растворяют его в 5 мл сверхчистой воды, помещают в диализный мешок (MWCO составляет 3KDa), помещают диализный мешок в 2 л сверхчистой воды, воду меняют каждые два дня, проводят диализ в течение 7 дней, подвергают сублимационной сушке и сохраняют для дальнейшего использования.

[0086] 2.2 Характеристика L-NIBC-AuCs

[0087] Эксперимент по определению характеристик был проведен для полученного выше порошка (L-NIBC-AuCs). Между тем наночастицы золота, модифицированные лигандом L-NIBC (L-NIBC-AuNPs), используются как контроль. Способ получения наночастиц золота с лигандом L-NIBC приведен в источнике (W. Yan, L. Xu, С.Xu, W. Ma, H. Kuang, L. Wang and N. A. Kotov, Journal of the American Chemical Society 2012, 134, 15114; X. Yuan, B. Zhang, Z. Luo, Q. Yao, D. T. Leong, N. Yan and J. Xie, Angewandte Chemie International Edition 2014, 53,4623).

[0088] 2.2.1 Исследование морфологии с помощью просвечивающего электронного микроскопа (ПЭМ)

[0089] Тестовые порошки (образец L-NIBC-AuCs и образец L-NIBC-AuNPs) были растворены в сверхчистой воде до 2 мг/л в качестве образцов, а затем тестовые образцы были подготовлены методом висячей капли. Более конкретно, 5 мкл образцов капали на ультратонкую углеродную пленку, испаряли естественным образом до исчезновения капли воды, а затем наблюдали морфологию образцов с помощью полевой эмиссионной ПЭМ высокого разрешения JEM-2100F STEM/EDS.

[0090] Четыре ПЭМ-изображения L-NIBC-AuNPs показаны на фиг. 1В, фиг. 1Е, фиг. 1H и фиг. 1K фиг. 1; три ПЭМ-изображения L-NIBC-AuCs показаны на фиг. 2 В, фиг. 2Е и фиг. 2Н фиг. 2.

[0091] Изображения на фиг. 2 показывают, что каждый из образцов L-NIBC-AuCs имеет однородный размер частиц и хорошую дисперсность, а средний диаметр L-NIBC-AuCs (относится к диаметру золотого ядра) составляет 1,1 нм, 1,8 нм и 2,6 нм соответственно, что соответствует результатам на фиг. 2С, фиг .2F и фиг. 2I фиг. 2. Для сравнения образцы L-NIBC-AuNPs имеют больший размер частиц. Их средний диаметр (относится к диаметру золотого ядра) составляет 3,6 нм, 6,0 нм, 10,1 нм и 18,2 нм соответственно, что соответствует результатам на фиг. 1С, фиг. 1F, фиг. 1I и фиг. 1L фиг. 1.

[0092] 2.2.2 Ультрафиолетовые (УФ) - видимые (vis) спектры поглощения

[0093] Тестовые порошки (образец L-NIBC-AuCs и образец L-NIBC-AuNPs) были растворены в сверхчистой воде до концентрации 10 мг⋅л^-1, после чего при комнатной температуре были измерены УФ спектры поглощения. Диапазон измерения составлял 190-1100 нм, кювета для образца представляла собой стандартную кварцевую ячейку с оптическим путем 1 см, а контрольная кювета была заполнена сверхчистой водой.

[0094] УФ спектры поглощения четырех образцов L-NIBC-AuNPs различных размеров показаны на фиг. 1А, фиг.1D, фиг. 1G и фиг. 1J фиг. 1, а статистическое распределение размеров частиц показано на фиг. 1С, фиг. 1F, фиг. 1I и фиг. 1L фиг .1; УФ спектры поглощения трех образцов L-NIBC-AuCs различных размеров показаны на фиг. 2А, фиг. 2D и фиг. 2G фиг. 2, а статистическое распределение размеров частиц показано на фиг. 2С, фиг. 2F и фиг. 2I фиг. 2.

[0095] На фиг. 1 показано, что благодаря эффекту поверхностного плазмона L-NIBC-AuNPs наблюдался пик поглощения при длине волны около 520 нм. Положение пика поглощения зависит от размера частиц. При размере частиц 3,6 нм УФ пик поглощения появляется при 516 нм; когда размер частиц составляет 6,0 нм, УФ пик поглощения появляется при 517 нм; когда размер частиц составляет 10,1 нм, УФ пик поглощения появляется при 520 нм, а когда размер частиц составляет 18,2 нм, пик поглощения появляется при 523 нм. Ни один из четырех образцов не имеет пика поглощения выше 560 нм.

[0096] На фиг. 2 показано, что в УФ-спектрах поглощения трех образцов L-NIBC-AuCs с различными размерами частиц пик поглощения поверхностного плазмонного эффекта при 520 нм исчез, а два очевидных пика поглощения появились выше 560 нм, и положения пиков поглощения немного изменялись в зависимости от размеров частиц AuCs. Это объясняется тем, что AuCs проявляют молекулоподобные свойства из-за распада гранецентрированной кубической структуры, что приводит к разрыву в плотности соединений AuCs, расщеплению энергетического уровня, исчезновению эффекта плазмонного резонанса и появлению нового пика поглощения в длинноволновом направлении. Можно сделать вывод, что все три образца порошка с разным размером частиц, полученные выше, представляют собой AuCs, связанные с лигандами.

[0097] 2.2.3 Инфракрасная спектроскопия с преобразованием Фурье

[0098] Инфракрасные спектры измерялись на инфракрасном спектрометре с преобразованием Фурье VERTEX80V фирмы Bruker в режиме полного отражения в твердом порошке в высоком вакууме. Диапазон сканирования составляет 4000-400 см^-1, число сканирований - 64. Для примера взяты образцы L-NIBC-AuCs, тестовые образцы представляли собой сухой порошок L-NIBC-AuCs с тремя различными размерами частиц, а контрольный образец представлял собой чистый порошок L-NIBC. Результаты показаны на фиг. 3.

[0099] На фиг. 3 показан инфракрасный спектр L-NIBC-AuCs с различными размерами частиц. По сравнению с чистым L-NIBC (кривая внизу), S-H валентные колебания L-NIBC-AuCs с различными размерами частиц полностью исчезли при 2500-2600 см^-1, в то время как другие характерные пики L-NIBC по-прежнему наблюдались, что подтверждает, что молекулы L-NIBC были успешно связаны с поверхностью AuCs через связь Au-S. На фигуре также видно, что инфракрасный спектр AuCs, связанных с лигандами, не зависит от их размера.

[0100] AuCs, связанные с другими лигандами, были получены способом, аналогичным описанному выше, за исключением того, что растворитель для раствора В, соотношение подачи между HAuCl₄ и лигандом, время проведения реакции и количество добавленного NaBH₄ были слегка скорректированы. Например, когда в качестве лиганда используют L-цистеин, D-цистеин, N-изобутирил-L-цистеин (L-NIBC) или N-изобутирил-D-цистеин (D-NIBC), в качестве растворителя выбирают уксусную кислоту; когда в качестве лиганда используют дипептид CR, дипептид RC или 1-[(2S)-2-метил-3-тиол-1-оксопропил]-L-пролин, в качестве растворителя выбирают воду, и проч.; другие стадии аналогичны, поэтому дальнейшие сведения здесь не приводятся.

[0101] В рамках настоящего изобретения вышеописанным способом была получена серия AuCs, связанных с лигандами. Лиганды и характеристики способа получения приведены в таблице 1.

[0102] Таблица 1. Характеристики получения AuCs, связанных с различными лигандами, согласно настоящему изобретению

[0103] Образцы, перечисленные в Таблице 1, были получены вышеуказанными способами. Характеристики одиннадцати (11) различных AuCs, связанных с лигандами, показаны на фиг.4 (CR-AuCs), на фиг. 5 (RC-AuCs), на фиг. 6 (Cap-AuCs) (Сар обозначает l-[(2S)-2-метил-3-тиол-1-оксопропил]-L-пролин), на фиг. 7 (GSH-AuCs), на фиг. 8 (D-NIBC-AuCs), на фиг. 9 (L-Cys-AuCs), на фиг. 10 (CSH-AuCs), на фиг. 11 (MPA-AuCs), на фиг. 12 (р-МВА-AuCs), на фиг. 13 (CDEVD-AuCs) и на фиг. 14 (DEVDC-AuCs).

[0104] Результаты показывают, что диаметры AuCs, связанных с различными лигандами, полученными из таблицы 1, составляют менее 3 нм. Ультрафиолетовые спектры также показывают исчезновение пика при 520±20 нм и появление пика поглощения в других положениях. Положение пика поглощения может меняться в зависимости от лигандов и размеров частиц, равно как и от структуры. В определенных случаях пик поглощения отсутствует, в основном из-за образования смесей AuCs с различными размерами и структурами частиц или некоторых специальных AuCs, которые перемещают положение пика поглощения за пределы УФ-спектра. Между тем инфракрасные спектры с преобразованием Фурье также показывают исчезновение инфракрасного пика поглощения тиола лиганда (между пунктирными линиями на фиг. 4В - фиг. 8В), в то время как другие инфракрасные характеристические пики сохраняются, предположительно потому, что все молекулы лиганда были успешно связаны с атомами золота с образованием AuCs, связанных с лигандами, и в настоящем изобретении были успешно получены AuCs, связанные с лигандами, перечисленными в таблице 1.

[0105] Вариант осуществления 3. Проведение исследования ишемического церебрального инсульта на животной модели

[0106] 3.1 Тестовые образцы [0107] Кластеры золота:

[0108] А1: кластеры золота, связанные с лигандом L-NIBC (L-NIBC-AuCs), распределение по размерам в диапазоне 0,5-3,0 нм;

[0109] А2: кластеры золота, связанные с лигандом L-цистеином (L-Cys-AuCs), распределение по размерам в диапазоне 0,5-3,0 нм;

[ОНО] A3: кластеры золота, связанные с лигандом N-ацетил-L-цистеином (L-NAC-AuCs), распределение по размерам в диапазоне 0,5-3,0 нм; и

[0111] А4: кластеры золота, связанные с лигандом DEVDC (DEVDC-AuCs), распределение по размерам в диапазоне 0,5-3,0 нм. [0112] Наночастицы золота:

[0113] В1: наночастицы золота, связанные с L-NIBC (L-NIBC-AuNPs), диапазон распределения по размерам 6,1±1,5 нм; и

[0114] В2: наночастицы золота, связанные с L-NAC (L-NAC-AuNPs), диапазон распределения по размерам 9,0±2,4 нм.

[0115] Все тестовые образцы были получены в соответствии с описанным выше способом с небольшими изменениями, и их качество было оценено с помощью описанных выше способов.

[0116] 3.2 Протоколы исследований

[0117] 3.2.1 Создание модели окклюзии средней мозговой артерии (ОСМА) у крыс и введение исследуемых веществ

[0118] Самцы крыс Sprague Dawley (SD) класса SPF (220-260 г) были приобретены у Shanghai Shrek Experimental Animal Co., Ltd. Все крысы прошли 7-дневный период адаптации к условиям окружающей среды перед началом исследования. Крысы были случайным образом разделены на 14 групп (n=10), включая группу плацебо, группу модельного контроля, группу низкой (2 мг/кг массы тела крысы) и высокой дозировок (10 мг/кг массы тела крысы) препаратов кластера золота Al, А2, A3 и А4, а также группу низкой (2 мг/кг массы тела крысы) и высокой дозировки (10 мг/кг массы тела крысы) наночастиц золота В1 и В2. В день проведения исследования крысам вводили в качестве наркоза 10% хлоралгидрат (350 мг/кг массы тела). Правая общая сонная артерия, внутренняя сонная артерия и наружная сонная артерия были открыты через срединный разрез. Во внутреннюю сонную артерию (ВСА) вводили шов на 18 мм±0,5 мм через наружную сонную артерию (НСА), пока не блокировалось регионарное кровоснабжение СМА, что приводило к церебральному инфаркту. Через 1,5 ч шов снимали до входа в ВСА для реперфузии. Показатели мозгового кровообращения (CBF) до операции и после эмболизации измеряли с помощью флоуметра. Животные, у которых CBF постоянно снижались (rCBF≥70%), считались результативной моделью окклюзии средней мозговой артерии (ОСМА). После реперфузии крысам внутрибрюшинно вводили лекарства или растворители (физиологический раствор) в течение 0 ч, 24 ч, 48 ч и 72 ч соответственно. Неврологические показатели поведения оценивались через 0, 24, 48, 72 и 96 часов. Исследование было прекращено через 96 часов после проведения операции. Забор образцов мозга и окрашивание ТТС проводили после эвтаназии. Были сделаны снимки срезов мозга и рассчитан процент площади церебрального инфаркта.

[0119] 3.2.2 Оценка неврологических показателей

[0120] 0 баллов: нет отличий от обычных крыс; 1 балл: разгибание правой передней лапы не прямое, голова запрокидывается на противоположную сторону; 2 балла: ходьба прерывистыми кругами на открытом пространстве; 3 балла: ходьба непрерывными кругами на открытом пространстве; 4 балла: потеря сознания при ходьбе, заваливание на одну сторону; 5 баллов: смерть.

[0121] 3.2.3 Область поражения головного мозга (окрашивание ТТС)

[0122] Крысам проводили эвтаназию посредством ингаляции углекислого газа. Мозг извлекали и помещали в ванночку для коронального среза (2 мм). Окрашивание проводили 2% ТТС в темноте при комнатной температуре. После фотографирования площадь поражения головного мозга измеряли с помощью программы ImageJ. Процент площади поражения мозга (%)=(площадь контралатерального полушария - (площадь ипсилатерального полушария - площадь поражения мозга))/площадь контралатерального полушария × 100%. [0123] 3.2.4 Статистический анализ

[0124] Статистический анализ проводился с помощью программы Graph Pad Prism Software 7.0 (Калифорния, США). Данные были выражены как среднее±статистическая ошибка, статистический анализ проводился с помощью теста Даннетта. Р<0,05 означает статистическую значимость. [0125]

3.3 Результаты

[0126] 3.3.1 Мозговое кровообращение в зоне ишемического поражения головного мозга [0127] Снижение мозгового кровообращения у крыс более чем на 70% (снижение мозгового кровообращения, rCBF≥70%) свидетельствует об успешном создании модели ОСМА. Во всех остальных группах, за исключением группы плацебо, показатель rCBF был более 70%, в среднем около 80%, что свидетельствует об успешном создании модели ОСМА.

[0128] 3.3.2 Влияние исследуемых препаратов на неврологические показатели у крыс [0129] На фиг. 15 показана оценка неврологических показателей у крыс в каждой группе (на гистограмме в каждой временной точке слева направо: группа плацебо (пустая), группа модельного контроля, группа А1 с низкой дозировкой, группа А1 с высокой дозировкой, группа А2 с низкой дозировкой, группа А2 с высокой дозировкой, группа A3 с низкой дозировкой, группа A3 с высокой дозировкой, группа А4 с низкой дозировкой, группа А4 с высокой дозировкой, группа В1 с низкой дозировкой, группа В1 с высокой дозировкой, группа В2 с низкой дозировкой и группа В2 с высокой дозировкой). У крыс в группе плацебо были обычные неврологические показатели, и оценка результатов была равна 0; крысы в группе модельного контроля показали серьезные поведенческие функциональные дефекты через 0 ч, 24 ч, 48 ч, 72 ч и 96 ч после операции (по сравнению с группой плацебо, Р<0,001, ###). По сравнению с контрольной группой неврологические показатели в группах A1, А2, A3, А4 с низкой дозировкой и группах с высокой дозировкой не имели значительного улучшения через 24 часа после проведения операции. Через 48 часов после операции неврологические показатели в группах A1, А2, A3 и А4 с низкой дозировкой и группах с высокой дозировкой начали снижаться, но статистической разницы не было (по сравнению с контрольной группой, Р>0,05). Через 72 часа после операции неврологические показатели у животных, получавших четыре вида препаратов, еще больше снизились, причем у группы А1 с низкой дозировкой, группы А1 с высокой дозировкой и группы А2 с высокой дозировкой наблюдались значительные отличия (по сравнению с контрольной группой, Р<0,05, *). Через 96 часов после операции наблюдались значительные отличия для всех групп с низкими дозировками и групп с высокими дозировками указанных четырех препаратов (по сравнению с контрольной группой, Р<0,05, *). Данные результаты свидетельствуют о том, что все четыре препарата кластера золота могут значительно улучшить неврологические показатели после поражения головного мозга, вызванного ишемическим инсультом, и этот эффект в определенной степени зависит от дозировки.

[0130] По сравнению с контрольной модельной группой в группах с низкой и высокой дозировками наночастиц золота В1 и В2 не наблюдалось значительного улучшения неврологических показателей у модельных крыс МАСО через 24 ч, 48 ч, 72 ч и 96 ч после операции, что указывает на то, что наночастицы золота не могут в значительной степени восстановить поведенческие функции, вызванные ишемическим церебральным инсультом.

[0131] 3.3.3.3 Влияние каждого из препаратов на площадь поражения головного мозга у модельных крыс МАСО

[0132] На фиг. 16 показан процент площади поражения головного мозга крыс в каждой группе (на гистограмме слева направо: группа плацебо (пустая), группа модельного контроля, группа А1 с низкой дозировкой, группа А1 с высокой дозировкой, группа А2 с низкой дозировкой, группа А2 с высокой дозировкой, группа A3 с низкой дозировкой, группа A3 с высокой дозировкой, группа А4 с низкой дозировкой, группа А4 с высокой дозировкой, группа В1 с низкой дозировкой, группа В1 с высокой дозировкой, группа В2 с низкой дозировкой и группа В2 с высокой дозировкой). В группе плацебо мозговая ткань была в норме, инфаркта не наблюдалось; площадь очага поражения составила 0%. Площадь поражения головного мозга в группе модельного контроля составила 44,7%±4,5% (Р<0,001, ###). По сравнению с контрольной группой процент площади поражения головного мозга в группах Al, А2, A3, А4 с низкой и высокой дозировками явно снизился, но в группах с низкой дозировкой существенной разницы не было, в то время как в группах с высокой дозировкой была обнаружена существенная разница (по сравнению с контрольной группой, Р<0,05, *). Если взять в качестве примера группу А1, то площадь очага поражения в группе с низкой дозировкой уменьшилась с 44,7±4,5% до 36,0±4,0% (по сравнению с контрольной группой, Р>0,05), а в группе с высокой дозировкой уменьшилась до 27,8±3,4%>(по сравнению с контрольной группой, Р<0,05, *).

[0133] На фиг. 17 представлены примерные изображения окрашивания ТТС тканей мозга крыс с ОСМА после введения препаратов кластеров золота А1 и наночастиц золота В1. На фиг. 17, фиг. 17А: группа плацебо; фиг. 17 В: группа модельного контроля; фиг. 17С: группа с низкой дозировкой А1; фиг. 17D: группа с высокой дозировкой А1; фиг. 17Е: группа с низкой дозировкой В1; фиг. 17F: группа с высокой дозировкой В1. Как видно из фиг. 17, у крыс в группе плацебо не развился инфаркт головного мозга, в то время как в группе модельного контроля наблюдался обширный инфаркт головного мозга (белая часть справа). Площадь поражения головного мозга после введения низкой дозировки препарата А1 уменьшилась (белая часть с правой стороны уменьшилась), в то же время площадь поражения головного мозга значительно уменьшилась при введении высокой дозировки препарата А1 (белая часть с правой стороны значительно уменьшилась), в то время как введение низкой и высокой дозировки препарата В1 не оказало никакого влияния на площадь поражения головного мозга (белая часть с правой стороны не уменьшилась). А2, A3 и А4 показали схожий с А1 эффект в уменьшении площади инфаркта, в то время как В2 был схож с В1 отсутствием уменьшения площади инфаркта.

[0134] Другие AuCs, связанные с лигандами, оказывают аналогичное действие при лечении ишемического церебрального инсульта, но их действие варьируется в определенных пределах. В данном разделе они не будут описаны подробно.

[0135] Вариант осуществления 4. Исследования геморрагического церебрального инсульта на модельных животных

[0136] 4.1. Материалы и способы

[0137] 4.1.1. Тестовые препараты

[0138] Препарат А: нанокластеры золота, модифицированные L-NIBC (L-NIBC-AuCs), диаметр золотых ядер в интервале 0,5-3,0 нм;

[0139] Препарат В: нанокластеры золота, модифицированные L-Cys (L-Cys-AuCs), диаметр золотых ядер в интервале 0,5-3,0 нм.

[0140] 4.1.2 Животные и их распределение по группам

[0141] 140 самок крыс SD (8-недельного возраста, 190-220 г) были адаптационно выведены в SPF в течение 7 дней и затем случайным образом распределены по семи группам:

[0142] (1) Группа нормального контроля (NC), 20 крыс, средняя масса тела 214,0±5,1 г; [0143] (2) Группа плацебо (SHAM), 20 крыс, средняя масса тела 213,5±6,5 г;

[0144] (3) Группа модельного контроля (IVH), 20 крыс, средняя масса тела 214,7±6,1 г;

[0145] (4) Группа с введением препарата А в низкой дозировке (4 мг/кг массы тела) (AL), 20 крыс, средняя масса тела 212,5±7,3 г;

[0146] (5) Группа введения препарата А в высокой дозировке (10 мг/кг массы тела) (АН), 20 крыс, средняя масса тела 212,1±6,8 г;

[0147] (6) Группа введения препарата В в низкой дозировке (4 мг/кг массы тела) (BL), 20 крыс, средняя масса тела 213,2±6,3 г; и

[0148] (7) Группа введения препарата В в высокой дозировке (10 мг/кг массы тела) (ВН), 20 крыс, средняя масса тела 211,2±7,1 г.

[0149] Существенной разницы в массе тела крыс в разных группах не было.

[0150] 4.1.3 Моделирование, введение препарата и протокол исследования

[0151] Создание модели внутрижелудочкового кровоизлияния (ВЖК) у крыс

[0152] Крысам в группе ВЖК и в каждой группе введения лекарственного препарата была сделана анестезия путем внутрибрюшинной инъекции 2% барбитурата (50 мг/кг). После анестезии кожу головы дезинфицировали; крыс фиксировали на стереолокаторе в лежачем положении. Регулируя стереолокатор, резцы крыс фиксировали на резцовом крючке так, чтобы передний и задний роднички находились на одном уровне. Затем регулировали и фиксировали ушной стержень, чтобы убедиться, что голова крыс не двигается. После дезинфекции кожи головы и меха крыс кожу надрезали в середине головы крысы, а надкостницу удаляли 3% перекисью водорода, обнажая передний и задний роднички и корональный шов. Небольшое отверстие диаметром около 1 мм было просверлено стоматологическим бором на 0,2 мм позади переднего родничка и на 3 мм к средней линии без повреждения твердой мозговой оболочки и тканей мозга. Затем хвост крысы промывали теплой водой температуры 40°С. После гиперемии хвост крысы дезинфицировали этанолом, и 50 мкл артериальной крови без антикоагулянтов брали с помощью шприца объемом 1 мл. Шприц с кровью фиксировали на стереолокаторе. Микрошприц вводился на глубину 6 мм через отверстие, и аутологичная артериальная кровь вводилась дважды; равномерно вводилось 10 мкл артериальной крови; введение крови прекращалось на 2 минуты; затем снова равномерно и медленно вводилось 40 мкл артериальной крови; игла оставалась на 4 минуты; игла выводилась примерно на 2,0 мм; игла снова останавливалась на 4 минуты; затем медленно выводился шприц полностью. После наложения швов на разрез стерильный ватный шарик использовали для компресса и остановки кровотечения. Крыс проверяли ежедневно для наблюдения за заживлением раны и развитием возможной инфекции.

[0153] После пробуждения крыс наблюдали за их поведением. Для оценки моделирования поведения крыс использовался неврологический показатель mNSS. После операции препарат вводили ежедневно путем внутрибрюшинной инъекции в первый, второй, третий, четвертый, пятый, шестой и седьмой день, где доза для группы AL и группы АН составляла 4 и 10 мг/кг массы тела соответственно. Крысам в группе NC и группе SHAM внутрибрюшинно вводили одинаковый объем нормального физиологического раствора в соответствующие временные точки. Всех крыс оценивали по показателю mNSS через 12 ч, 24 ч, 3 дня, 5 дней и 7 дней после введения инъекции внутрибрюшинно.

[0154] 4.1.4. Измерение проницаемости гематоэнцефалического барьера с помощью окрашивания Голубым Эванса

[0155] Исследуемым крысам внутривенно вводили краситель Голубой Эванса (0,5%), при этом глаза и кожа крыс становились синими. Через 0,5 ~ 1 час крыс усыпляли и извлекали ткани мозга. Ткани мозга помещали в центрифужную пробирку объемом 1,5 мл, добавляли 1 мл PBS, быстро гомогенизировали ткани мозга с помощью гомогенизатора тканей и центрифугировали. Брали супернатант, добавляли такое же количество трихлоруксусной кислоты и инкубировали при 4°С. Центрифугировали в течение 15 мин. Брали надосадочную жидкость и измеряли значение абсорбции (OD) при 620 нм с помощью спектрофотометра. Одновременно измеряли значения OD эталонного красителя Голубой Эванса с известными различными градиентами и строили стандартную кривую. Рассчитывали содержание красителя Голубой Эванса в исследуемых образцах в соответствии со стандартной кривой.

[0156] 4.1.5. Измерение содержания воды в мозге

[0157] Применяется метод сухого/мокрого веса. Через 24 часа после перенесенной ишемии-реперфузии крыс проводили чрезмерной анестезии. После декапитации головной мозг извлекали, удаляли обонятельную луковицу, мозжечок и нижнюю часть ствола мозга, отделяли левое и правое полушария головного мозга, сразу взвешивали, чтобы записать их вес во влажном состоянии; затем сушили ткани мозга в электрической печи при температуре 110°С в течение 24 часов, а затем сразу взвешивали высушенные ткани мозга, чтобы записать их вес в сухом состоянии. Рассчитывали содержание воды в мозге (%)=(влажный вес-сухой вес)/влажный вес × 100%.

[0158] 4.1.6. Окрашивание Н&Е

[0159] Ткани мозга были извлечены и помещены в заливочную емкость. Последовательно выполнялись этапы дегидратации, обеспечения прозрачности, погружения в воск, заливки, нарезки и запекания, а затем проводилось окрашивание Н&Е: вынимание срезов из печи, обработка срезов ксилолом дважды по 15 минут каждый раз, затем обработка срезов 100%, 95%, 80% и 70% этанолом соответственно по 5 минут, затем обработка срезов сверхчистой водой дважды по 5 минут каждый раз для завершения этапа депарафинизации; окрашивание срезов гематоксилиновым красителем в течение 5 минут и промывание срезов сверхчистой водой 3 раза; после того, как ядра клеток окрасились в синий цвет при промывании водопроводной водой в течение 10 минут, проводится окрашивание срезов 0,5% эозином в течение 5 минут, промывание срезов водопроводной водой в течение 5 раз, сушка срезов в печи при температуре 60°С и окончательное запечатывание срезов нейтральной смолой. Оптический микроскоп использовался для наблюдения и сбора изображений при 200-кратном поле зрения. [0160] 4.1.7 Иммунофлуоресцентное (ИФ) окрашивание

[0161] Ткани мозга крысы были извлечены и помещены в заливочные емкости. Последовательно выполнялись этапы дегидратации, удаления примесей, погружения в воск, заливки, нарезки и запекания. Срезы вынимали из печи и депарафинировали. Затем проводились этапы восстановления антигена, очистки, обеспечения проницаемости, обработки первым антителом к iNOS, вторым антителом к козьему антикролику и окрашивания DAPI. Последними этапами были сушка и герметизация. Флуоресцентный микроскоп использовался для наблюдения и сбора изображений при 200-кратном поле зрения.

[0162] 4.1.8 Вестерн-блот (ВБ)

[0163] Сначала были подготовлены образцы белка. Доставали замороженные ткани из холодильника, взвешивали соответствующее количество ткани, добавляли буфер для лизиса, содержащий ингибитор протеазы в соотношении 1:9, встряхивали при 4°С до тех пор, пока все кусочки ткани не были раздроблены. Образцы помещали на лед на 20 мин, центрифугировали при 12000 об/мин при 4°С в течение 20 мин и отбирали супернатант.Набор для определения концентрации белка ВСА использовался в каждом образце. Корректировали концентрацию белка в соответствии с результатами определения концентрации, чтобы обеспечить постоянство концентрации белка в разных группах. После кипячения при 95°С в течение 5 мин образец загружали, а оставшиеся образцы хранили при -80°С.

[0164] Затем проводили ВБ согласно следующим этапам:

[0165] Приготовление электрофоретического геля: после очистки и сушки стеклянных пластин их закрепляют на гелеобразователе; затем начинают готовить разделительный гель, заливая разделительный гель в зазор стеклянных пластин до нужного уровня, и покрывают разделительный гель безводным этанолом до полной полимеризации геля. Выливают безводный этанол, осторожно промывают его двойной дистиллированной водой, а затем отсасывают, чтобы затем высушить фильтровальной бумагой. Затем добавляют концентрационный гель до соответствующего уровня и устанавливают гребенку. После того как концентрационный гель полностью полимеризовался гребенку убирают.

[0166] Электрофорез: обработанные образцы загружали в общем количестве 40 мкг на лунку. Электрофорез проводили при 80 В для концентрационного геля, 120 В для разделительного геля и постоянном питании; положение белков-мишеней определяли в соответствии с относительным положением молекулярного веса маркеров предварительного окрашивания и белков-мишеней. Когда белок-мишень находился в положении наилучшего разрешения в нижней 1/3 разделительного геля, разделение с помощью электрофореза прекращалось.

[0167] Мембранный транспорт: замачивают разрезанные мембраны PVDF в метаноле на 10с, а затем помещают их в новый раствор для мембранного транспорта для дальнейшего применения. Удаляют гель, вырезают полосу-мишень по Маркеру, промывают дистиллированной водой; вырезают такого же размера PVDF пленку и фильтровальную бумагу с PAGE гелем, и замачивают PVDF пленку и фильтровальную бумагу в буфере для электропереноса. В соответствии с порядком черная пластина - волокнистый мат -фильтровальная бумага - гель - PVDF мембрана - фильтровальная бумага - волокнистый мат - белая пластина, размещая их последовательно, зажимают пластины, помещают в аппарат для переноса мембран, соединяя черную сторону пластины с черным отрицательным полюсом. Заполняют бак электропереноса буфером для переноса мембраны и начинают перенос мембраны. Процесс проводили при температуре 4°С (ледяная баня), а условия составляли 200 мА, 90 мин (мембрана 0,45 мкм) или 200 мА, 60 мин (мембрана 0,2 мкм).

[0168] Блокирование: Мембраны промывали в TBST 3 раза и затем блокировали раствором TBST, содержащим 5% молока, в течение 2 ч на виброплощадке при комнатной температуре.

[0169] Первичное антитело: разбавляют соответствующее первичное антитело в TBST, содержащем 3% BSA, погружают PVDF мембрану в раствор для инкубации первичного антитела и инкубируют в течение ночи при 4°С. ММР9 был разбавлен 1:1000, a iNOS -1:2000. После инкубации мембрану PVDF промывали в TBST 3 раза, по 10 мин/раз, для удаления избытка первичного антитела.

[0170] Вторичное антитело: разбавляют HRP-меченное вторичное антитело (1:5000) блокирующим раствором, погружают мембрану PVDF в раствор для инкубации вторичного антитела и инкубируют при комнатной температуре в течение 1 ч. После инкубации мембрану PVDF промывают TBST 3 раза, 10 мин/раз, для удаления избытка вторичного антитела.

[0171] Выдержка: смешивают усиливающий раствор со стабильным раствором пероксидазы в соотношении 1:1 из набора ECL для приготовления рабочего раствора, капают соответствующее количество рабочего раствора на пленку PVDF и экспонируют ее с помощью автоматической системы анализа хемилюминесцентных изображений.

[0172] Регенерация мембраны путем элюирования: после выдержки промывают мембрану PVDF с помощью TBST 3 раза, 5 мин/раз, погружают мембрану PVDF в раствор для регенерации мембраны путем добавления соответствующего количества раствора и элюируют на виброплощадке при комнатной температуре в течение 20 минут. После элюирования полностью промывают PVDF мембрану с помощью TBST в течение 3 раз, 5 мин/раз, для удаления избытка раствора для регенерации мембраны.

[0173] Процесс второго блокирования, инкубации внутреннего контроля, связывания вторичных антител и экспонирования был таким же, как и вышеописанный опыт, где и Р-тубулин, и GAPDH были разведены в соотношении 1:5000.

[0174] Результаты выдержки были проанализированы с помощью программного обеспечения Image J.

[0175] 4.1.9 Анализ перекисного окисления липидов

[0176] Подготовка образцов: добавляют PBS в ткани (w/v: 1:9), проводят полную гомогенизацию, инкубируют на льду в течение 10 мин, центрифугируют при 4000 об/мин в течение 10 мин и отбирают супернатант для анализа.

[0177] Для анализа использовался набор для определения малондиальдегида (МДА). В соответствии с инструкциями были подготовлены пустая пробирка, стандартная пробирка, измерительная пробирка и контрольная пробирка. Определялось значение абсорбции (OD) при 532 нм. Содержание МДА в супернатанте рассчитывали следующим образом: Содержание МДА (нмоль/мл)=(измеренное OD - контрольное OD)/(стандартное OD -нулевое OD) × Стандартная концентрация (10 нмоль/мл).

[0178] 4.1.10 Определение индекса супероксиддисмутазы (СОД)

[0179] Подготовка образцов: добавляют PBS в ткани (в/в: 1:9), проводят полную гомогенизацию, инкубируют на льду в течение 10 мин, центрифугируют при 4000 об/мин в течение 10 мин и отбирают супернатант для анализа.

[0180] Для анализа использовали набор SOD в соответствии с инструкцией. Расчет проводили по следующей формуле: Скорость ингибирования СОД (%)=((OD контрольной лунки - OD контрольной пустой лунки) - (OD измерительной лунки - OD измерительной пустой лунки)) / (OD контрольной лунки - OD контрольной пустой лунки) × 100%; Активность СОД (U / мгпрот)=Скорость ингибирования СОД ÷ 50% × Коэффициент разбавления реакционной системы ÷ Концентрация белка образца (мгпрот / мл).

[0181] 4.1.11 Электронно-микроскопическое исследование

[0182] Берут блоки тканей объемом около 1 кубического миллиметра. После фиксации, дегидратации, заливки и отверждения тканевые блоки нарезали ультратонким слайсером на срезы толщиной 70 нм. Затем срезы дважды окрашивали 2% уранилацетатом и цитратом свинца. Для наблюдения и фотографирования использовался просвечивающий электронный микроскоп.

[0183] 4.2 Результаты

[0184] На фиг. 18 показаны результаты оценки неврологических показателей функции mNSS в разное время после завершения моделирования, где NC: группа нормального контроля; SHAM: группа плацебо; IVH: группа модельного контроля; AL: группа введения препарата А в низкой дозировке; АН: группа введения препарата А в высокой дозировке; BL: группа введения препарата В в низкой дозировке; ВН: группа введения препарата В в высокой дозировке.

[0185] Как показано на фиг. 18А, результаты свидетельствуют, что через 12 часов после моделирования средние показатели mNSS составили: группа нормального контроля (NC) (0,0±0,0), группа плацебо (SHAM) (0,0±0,0), группа модельного контроля (IVH) (14. 7±1,2), группа введения препарата А в низкой дозировке (AL) (14,7±1,0), группа введения препарата А в высокой дозировке (АН) (14,4±1,1) и группа введения препарата В в низкой дозировке (BL) (14,7±1,3), группа введения препарата В в высокой дозировке (ВН) (14,7±1,1). По сравнению с группой IVH наблюдались значительные отличия для группы NC и группы SHAM (Р<0,001, * * *), в то время как для других групп не было отмечено значительных отличий по сравнению с группой IVH.

[0186] Как показано на фиг. 18 В, результаты свидетельствуют, что в первый день после моделирования средние неврологические показатели mNSS составляют: группа NC (0,0±0,0), группа SHAM (0,0±0,0), группа IVH (14,3±1,3), группа AL (14,6±1,1), группа АН (14,3±1,0), группа BL (14,9±0,9), группа ВН (14,3±1,0). По сравнению с группой IVH наблюдались значительные отличия для группы NC и группы SHAM и группы IVH (Р<0,001, * * *), в то время как для других групп не было отмечено значительных отличий по сравнению с группой IVH.

[0187] Как показано на фиг. 18С, результаты свидетельствуют, что на второй день после моделирования средние неврологические показатели по шкале mNSS составляют: группа NC (0,0±0,0), группа SHAM (0,0±0,0), группа IVH (11,0±0,9), группа AL (8,6±1,5), группа АН (7,7±1,7), группа BL (9,9±1,8), группа ВН (10,2±1,9). По сравнению с группой IVH наблюдались значительные отличия для группы NC, группы SHAM, группы AL и группы АН (Р<0,001, * * *). Однако по сравнению с группой IVH группы BL и ВН не показали существенных отличий, несмотря на то, что их показатели mNSS ниже, чем у группы IVH.

[0188] Как показано на фиг. 18D, результаты свидетельствуют, что на четвертый день после моделирования средние неврологические показатели по шкале mNSS составляют: группа NC (0,0±0,0), группа SHAM (0,0±0,0), группа IVH (8,0±1,5), группа AL (6,0±1,8), группа АН (6,1±1,7), группа BL (7,2±1,8), группа ВН (7,0±1,8). По сравнению с группой IVH группы BL и ВН не показали существенных отличий, но все остальные группы показали существенные отличия (Р<0,001, * * *).

[0189] Как показано на фиг. 18Е, результаты свидетельствуют, что на седьмой день после моделирования средние неврологические показатели по шкале mNSS составляют: группа NC (0,0±0,0), группа SHAM (0,0±0,0), группа IVH (5,4±1,7), группа AL (2,9±0,9), группа АН (2,8±1,0), группа BL (4,5±1,8), группа ВН (4,1±1,6). По сравнению с группой IVH группы BL и ВН не показали существенных отличий, но все остальные группы показали существенные отличия (Р<0,001, * * *).

[0190] Эти результаты показывают, что различные дозировки препарата А могут значительно улучшить неврологические показатели mNSS крыс IVH со второго дня после моделирования, что указывает на то, что препарат А имеет отличный эффект в лечении крыс IVH. Однако, начиная со второго дня, показатель mNSS препарата В был ниже, чем у группы IVH, но существенной разницы не было (Р>0,05), что указывает на то, что препарат В неэффективен в лечении крыс модели IVH.

[0191] Для дальнейшего изучения терапевтического эффекта препарата А на крысах модели IVH было проведено исследование различных аспектов.

[0192] На фиг. 19 показаны результаты окрашивания Голубым Эванса для измерения проницаемости гематоэнцефалического барьера (ВВВ). Видно, что после окрашивания Голубым Эванса его содержание в группе IVH было значительно выше, чем в группах NC и SHAM (Р<0,001, * * *). Содержание Голубого Эванса в тканях мозга крыс в группе с низкой дозировкой (AL) и в группе с высокой дозировкой (АН) было значительно ниже, чем в группе IVH (Р<0,05, *; Р<0,01, **). Результаты показывают, что моделирование IVH приводит к значительному увеличению проницаемости гематоэнцефалического барьера у крыс, а введение как низкой, так и высокой дозировки препарата А может значительно улучшить повышенную проницаемость гематоэнцефалического барьера, вызванную моделированием IVH.

[0193] Отек мозга, вызванный моделированием IVH, является основной причиной повышения внутричерепного давления, мозговой грыжи и смерти животного.

Использование метода сухого/мокрого веса для определения содержания воды в ткани мозга крысы позволяет оценить развитие отека мозга крысы. На фиг. 20 показаны результаты измерения содержания воды в тканях мозга крыс методом сухого/мокрого веса. В результате анализа было установлено, что содержание воды в тканях мозга в группе NC и группе SHAM было значительно ниже, чем у крыс модели IVH (Р<0,001, * * *), а содержание воды в тканях мозга в группе введения препарата А в низкой дозировке (AL) и группе введения в высокой дозировке (АН) также было значительно ниже, чем в группе IVH (Р<0. 05, *; Р<0,01, **). Эти результаты показывают, что как низкодозированное, так и высокодозированное введение препарата А может значительно облегчить отек мозга, вызванный моделированием IVH, и улучшить состояние животных.

[0194] На фиг. 21 показаны примерные изображения окрашивания Н&Е. Результаты показали, что в группе NC (фиг. 21 А) имелись некоторые разрывы вокруг кровеносных сосудов и клеток, в группе SHAM (фиг. 21 В) - легкое повреждение, а в группе IVH - явное увеличение разрывов вокруг кровеносных сосудов и клеток, с клеточной дегенерацией и вакуолями, что указывает на тяжелое повреждение мозга (фиг. 21С). Введение препарата А в низкой дозировке (AL) (рис. 21D) и высокой дозировке (АН) (рис. 21Е) может значительно уменьшить травму головного мозга крыс модели IVH.

[0195] Вызванная травмой синтаза оксида азота (iNOS) экспрессируется после травмы мозга. На фиг .22 показаны примерные изображения иммунофлуоресцентного окрашивания iNOS в тканях мозга крыс.Видно, что положительная экспрессия iNOS в группе IVH (фиг. 22С) была относительно выше. Экспрессия iNOS в других группах, включая группу NC (фиг. 22А), группу SHAM (фиг. 22 В), группу AL (фиг. 22D) и группу АН (фиг. 22Е), была снижена в разной степени по сравнению с группой IVH. Это указывает на то, что экспрессия iNOS в тканях мозга крыс повышается после моделирования IVH, а введение препарата А в низких и высоких дозировках может снизить экспрессию iNOS, оказывая протекторное действие на поврежденный мозг.

[0196] Желатиназа В (ММР9) отсутствует или имеет низкую экспрессию в нормальной ткани мозга. Однако после травмы мозга, вызванной моделированием IVH, ММР9 может играть важную роль в процессе ангиогенного отека мозга и других повреждений мозга, разрушая гематоэнцефалический барьер. На фиг.23 показана экспрессия белка ММР9 в тканях мозга крыс в каждой группе. На фиг. 23А показаны полосы белка ММР9 в шести параллельных образцах, полученных в результате ВБ-теста, а на фиг. 23В - относительная экспрессия белка ММР9 (с GAPDH в качестве эталона). Видно, что относительная экспрессия ММР9 в тканях мозга группы NC, группы SHAM, группы AL и группы АН была значительно ниже, чем в группе IVH (Р<0,05, *). Эти результаты показывают, что как низкие, так и высокие дозировки препарата А могут значительно снизить повышенную экспрессию белка ММР9, вызванную травмой мозга у модельных крыс, что указывает на то, что препарат А оказывает протекторное действие на поврежденный мозг.

[0197] Малондиальдегид (МДА) является конечным продуктом реакции перекисного окисления между свободными радикалами и ненасыщенными жирными кислотами клеточной мембраны. Он является важным биомаркером окислительного повреждения липидов. Он может косвенно отражать степень повреждения перекисного окисления тканей. Его уровень тесно связан с тяжестью клинических симптомов в патогенезе инсульта и имеет важное клиническое значение при диагностике, лечении и прогнозировании инсульта. На фиг. 24 показана выраженность МДА в тканях мозга крыс в каждой группе. Видно, что выраженность МДА в группах NC, SHAM, AL и АН значительно ниже, чем в группе IVH, что указывает на то, что травма мозга, полученная в результате моделирования IVH, вызывает значительное увеличение выраженности МДА в мозге (Р<0,001, * * * в группе NC и группе SHAM по сравнению с группой IVH), в то время как низкие и высокие дозировки введения препарата А могут значительно уменьшить выраженность МДА, связанную с травмой мозга (по сравнению с группой IVH, Р<0,01, * * * и 0,001, ***, соответственно).

[0198] Супероксиддисмутаза (СОД) является наиболее эффективным ферментом, уничтожающим свободные радикалы в организме. Вырабатываемая организмом СОД может отражать ситуацию со свободными радикалами в организме. Некоторые исследования показали, что выраженность и активность СОД в тканях мозга при геморрагическом инсульте значительно ниже, чем в нормальных тканях мозга. На фиг. 25 показан уровень экспрессии СОД в тканях мозга крыс в каждой группе. Результаты показали, что уровень экспрессии СОД в группах NC, SHAM, AL и АН был значительно выше, чем в группе IVH, что указывает на то, что травма мозга, полученная в результате моделирования IVH, вызвала значительное снижение экспрессии СОД в мозге (по сравнению с группой IVH, как группа NC, так и группа SHAM: Р<0,001, * * *), в то время как низкие и высокие дозы введения препарата А могут значительно повысить экспрессию СОД в мозге (по сравнению с группой IVH, Р<0,001, * * *).

[0199] На фиг. 26 показаны результаты исследования ультратонких срезов ткани мозга с помощью просвечивающего электронного микроскопа.

[0200] Как показано на фиг. 26А, в группе NC морфология глиальных клеток была нормальной или слегка неправильной; ядро (N) было неправильной овальной формы; митохондрии (М) в цитоплазме были короткие круглые или короткие палочковидные, структурно неповрежденные, слегка размытый внутренний гребень; и эндоплазматический ретикулум (ER) был с небольшим расширением.

[0201] Как показано на фиг. 26 В, в группе SHAM морфология глиальных клеток была слегка неправильной; ядро (N) было овальным; митохондрии (М) в цитоплазме имели форму гантели с размытым внутренним гребнем; эндоплазматический ретикулум (ER) был слегка расширен.

[0202] Как показано на фиг. 26С, в группе IVH морфология глиальных клеток была неправильной; ядро (N) было неправильной формы; митохондрии (М) в цитоплазме были круглыми и явно раздутыми; эндоплазматический ретикулум (ER) был явно расширен; и были видны тела аутофагии (АР); что показывает, что моделирование IVH приводит к серьезным повреждениям клеток ткани мозга.

[0203] Как показано на фиг. 26D, в группе А1 морфология глиальных клеток была немного неправильной; ядро (N) было овальным; митохондрии (М) в цитоплазме были круглыми или овальными, слегка раздутыми, некоторые внутренние гребни были сломаны; эндоплазматический ретикулум (ER) был слегка расширен, и было видно небольшое количество липофусцина (L); что показывает, что введение препарата А в низкой дозировке может облегчить или восстановить повреждения клеток ткани мозга, вызванные моделированием IVH.

[0204] Как показано на фиг. 26Е, в группе АН морфология глиальных клеток была в основном правильной или слегка неправильной; ядро (N) было овальным; митохондрии (М) в цитоплазме были овальными или длинными палочковидными, с четким внутренним гребнем и неповрежденной структурой; эндоплазматический ретикулум (ER) был слегка расширен; и небольшое количество липофусцина (L) можно было увидеть в некоторых частях; это показывает, что введение препарата А в высокой дозировке может улучшить или восстановить повреждения клеток ткани мозга, вызванные моделированием IVH, и что существуют незначительные отличия клеток ткани мозга между группой NC и группой АН.

[0205] Приведенные выше результаты показывают, что кластер золота с L-NIBC в качестве лиганда обладает неожиданным терапевтическим эффектом при лечении геморрагического инсульта, а также может быть использован при разработке терапевтических препаратов для лечения геморрагического инсульта.

[0206] Хотя настоящее изобретение было описано со ссылкой на конкретные варианты осуществления, подразумевается, что варианты осуществления являются иллюстративными и что объем изобретения этим не ограничивается. Альтернативные варианты осуществления настоящего изобретения будут очевидны тем, кто обладает обычными навыками в области, к которой относится настоящее изобретение. Такие альтернативные варианты осуществления считаются включенными в объем настоящего изобретения. Соответственно, объем настоящего изобретения определяется прилагаемой формулой изобретения и подтверждается приведенным выше описанием.

Ссылки

1. Амани X, Мостафави Е, Махмуд Реза Алебуех MP, Арзаги X, Акбарзадех А, Пазоки-Торуди X, Вебстер Ти Джей. Представляют ли наноносители коллоидного золота эффективную диагностику или лечение ишемического инсульта? Int J Nanomedicine. 7 октября 2019; 14:8013-8031.

2. Чжэн И, By И, Лю И, Гуо 3, Бай Т, Чжоу П, By Ж, Ян Ц, Лю 3, Лу X. Внутреннее воздействие наночастиц золота на кислородно-глюкозное голодание/реперфузионное повреждение в нейронах коры головного мозга крыс.Neurochem Res. Июль 2019; 44(7):1549-1566.

Изобретение относится к области лечения заболеваний головного мозга. Раскрыто применение кластера золота, связанного с лигандом, для лечения церебрального инсульта у субъекта, где кластер золота, связанный с лигандом, включает золотое ядро и лиганд, связанный с золотым ядром, при этом церебральный инсульт выбран из группы, состоящей из церебрального геморрагического инсульта и транзиторной ишемической атаки (ТИА); золотое ядро имеет диаметр в диапазоне 0,5-3 нм; лиганд представляет собой один, выбранный из группы, состоящей из L-цистеина и его производных, D-цистеина и его производных, цистеинсодержащих олигопептидов и их производных, и других тиолсодержащих соединений; L-цистеин и его производные выбраны из группы, состоящей из L-цистеина, N-изобутирил-L-цистеина (L-NIBC) и N-ацетил-L-цистеина (L-NAC), и где D-цистеин и его производные выбраны из группы, состоящей из D-цистеина, N-изобутирил-D-цистеина (D-NIBC) и N-ацетил-D-цистеина (D-NAC); цистеинсодержащие олигопептиды и их производные представляют собой цистеинсодержащие дипептиды, цистеинсодержащие трипептиды, цистеинсодержащие тетрапептиды или цистеинсодержащие пентапептиды; и где другие тиолсодержащие соединения выбраны из группы, состоящей из 1-[(2S)-2-метил-3-тиол-1-оксопропил]-L(D)-пролина, тиогликолевой кислоты, меркаптоэтанола, тиофенола, D-3-троловола, N-(2-меркаптопропионил)-глицина, додецилмеркаптана, 2-аминоэтанэтиола (CSH), 3-меркаптопропионовой кислоты (MPA) и 4-меркаптобеновой кислоты (p-MBA). Изобретение обеспечивает разработку лекарственного средства, способного лечить пациентов с церебральным инсультом. 5 з.п ф-лы, 26 ил., 1 табл., 4 пр.

1. Применение кластера золота, связанного с лигандом, для лечения церебрального инсульта у субъекта, где кластер золота, связанный с лигандом, включает:

золотое ядро; и

лиганд, связанный с золотым ядром,

при этом церебральный инсульт выбран из группы, состоящей из церебрального геморрагического инсульта и транзиторной ишемической атаки (ТИА);

при этом золотое ядро имеет диаметр в диапазоне 0,5-3 нм;

где лиганд представляет собой один, выбранный из группы, состоящей из L-цистеина и его производных, D-цистеина и его производных, цистеинсодержащих олигопептидов и их производных, и других тиолсодержащих соединений;

L-цистеин и его производные выбраны из группы, состоящей из L-цистеина, N-изобутирил-L-цистеина (L-NIBC) и N-ацетил-L-цистеина (L-NAC), и где D-цистеин и его производные выбраны из группы, состоящей из D-цистеина, N-изобутирил-D-цистеина (D-NIBC) и N-ацетил-D-цистеина (D-NAC);

цистеинсодержащие олигопептиды и их производные представляют собой цистеинсодержащие дипептиды, цистеинсодержащие трипептиды, цистеинсодержащие тетрапептиды или цистеинсодержащие пентапептиды;

и где другие тиолсодержащие соединения выбраны из группы, состоящей из 1-[(2S)-2-метил-3-тиол-1-оксопропил]-L(D)-пролина, тиогликолевой кислоты, меркаптоэтанола, тиофенола, D-3-троловола, N-(2-меркаптопропионил)-глицина, додецилмеркаптана, 2-аминоэтанэтиола (CSH), 3-меркаптопропионовой кислоты (MPA) и 4-меркаптобеновой кислоты (p-MBA).

2. Применение по п. 1, где золотое ядро имеет диаметр в диапазоне 0,5-2,6 нм.

3. Применение по п. 1, где цистеинсодержащие дипептиды выбраны из группы, состоящей из L(D)-цистеин-L(D)-аргинин дипептида (CR), L(D)-аргинин-L(D)-цистеин дипептида (RC), L(D)-гистидин-L(D)-цистеин дипептида (HC) и L(D)-цистеин-L(D)-гистидин дипептида (CH).

4. Применение по п. 1, где цистеинсодержащие трипептиды выбраны из группы, состоящей из глицин-L(D)-цистеин-L(D)-аргинин трипептида (GCR), L(D)-пролин-L(D)-цистеин-L(D)-аргинин трипептида (PCR), L(D)-лизин-L(D)-цистеин-L(D)-пролин трипептида (KCP) и L(D)-глутатиона (GSH).

5. Применение по п. 1, где цистеинсодержащие тетрапептиды выбраны из группы, состоящей из глицин-L(D)-серин-L(D)-цистеин-L(D)-аргининового тетрапептида (GSCR) и глицин-L(D)-цистеин-L(D)-серин-L(D)-аргининового тетрапептида (GCSR).

6. Применение по п. 1, где цистеинсодержащие пентапептиды выбраны из группы, состоящей из цистеинил-аспарагинил-глутаминил-валинил-аспарагина (CDEVD) и аспаргинил-глутаминил-валинил-аспарагинил-цистеина (DEVDC).