Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к способу опосредованного определения концентрации рибонуклеопротеина возбудителя чумы плотоядных в сырье для вакцин по данным цикла количественной оценки при амплификации N-гена.
Чума плотоядных - высококонтагиозное вирусное заболевание, поражающее многих диких и домашних плотоядных, приводящее к высокой заболеваемости и смертности у хозяев [1]. Передача вирусных частиц происходит при контакте или вдыхании загрязненных жидкостей, хотя недавно сообщалось, что блохи являются переносчиками инфекции [2]. Проявление чумы плотоядных варьирует от легких до тяжелых симптомов в зависимости от иммунного статуса хозяина [3].
Возбудитель чумы плотоядных животных относится к порядку Mononegavirales, семейству Paramyxoviridae, подсемейству Orthoparamyxoviridae, роду Morbillivirus, виду Canine Distemper virus (CDV). [2]. CDV представляет собой оболочечный несегментированный одноцепочечный РНК-содержащий вирус длиной около 15600-15700 н.о. Он содержит геном РНК с отрицательным смыслом, который кодирует шесть белков [3, 4]. N-ген возбудителя чумы плотоядных является высококонсервативным, находится в диапазоне 108…1679 п.н. (1572 п.н.) кДНК и кодирует информацию о нуклеокапсидном белке вируса (524 а.о.).
Система мер борьбы с чумой плотоядных и ее профилактика предусматривает иммунизацию животных, а также контроль уровня напряженности поствакцинального иммунитета [4-9].
Для вакцинации животных применяют культуральные вакцины против чумы плотоядных. В процессе производства данных препаратов промышленное сырье исследуют на определение концентрации рибонуклеопротеина CDV [10, 11].
Как правило, для определения данного компонента применяют спектрометрический метод, который предусматривает процесс ультрацентрифугирования по выделению фракции рибонуклеопротеина [10] (прототип). Существенными недостатками указанного способа являются: 1) ограничения по чувствительности из-за фона анализируемого соединения; 2) трудоемкость процесса по причине использования процесса ультрацентрифугирования; 3) субъективность получаемых результатов по причине сложности отбора опалесцирующей фракции после центрифугирования в градиенте плотности хлористого цезия; 4) продолжительность проводимого анализа (не менее 48 ч); 5) высокая вероятность контаминации исследуемых образцов [8-11].
В связи с этим целесообразно провести поиск способа опосредованного определения концентрации рибонуклеопротеина возбудителя чумы плотоядных в сырье для культуральных вакцин с помощью современных методов исследования.
Предложенный способ позволяет опосредованно определять концентрацию рибонуклеопротеина CDV в производственном сырье для изготовления культуральных вакцин против CDV в течение 3 часов (быстрее в 16 раз по сравнению с прототипом); не имеет ограничений по чувствительности по причине вычитания фоновых значений; менее трудоемкий по сравнению с прототипом; высокочувствительный и объективный.
Задачей настоящего изобретения является разработка, высокочувствительного и высокоспецифичного способа опосредованного определения концентрации рибонуклеопротеина возбудителя чумы плотоядных в сырье для вакцин на основе современных методов молекулярной биологии с целью устранения вышеуказанных недостатков.
Данная задача решена благодаря созданию способа опосредованного определения концентрации рибонуклеопротеина возбудителя чумы плотоядных в сырье для вакцин по данным цикла количественной оценки при амплификации N-гена вируса, который позволяет:
1) сократить время по определению концентрации рибонуклеопротеина CDV до 3 ч (в 16 раз по сравнению с прототипом);
2) исключить вероятность контаминации;
3) повысить чувствительность и специфичность анализа;
4) исключить фактор субъективности получаемых результатов по причине использования приборного обеспечения для детекции результатов;
5) повысить достоверность проводимого анализа благодаря установлению зависимости между концентрацией рибонуклеопротеина CDV (CРНП CDV) и циклом количественной оценки ампликонов целевого участка N-гена (CQ-N), представленной в виде регрессионной функции:
CРНП CDV = - 0,2992 × CQ-N + 9,1735
с высокой достоверностью аппроксимации (R2 = 0,9992) и эффективностью амплификации (E) 99,56%.
Предложенная модель позволяет опосредованно определять концентрацию рибонуклеопротеина CDV в сырье для изготовления вакцин по данным цикла количественной оценки.
Сущность изобретения отражена на графических изображениях:
Фиг. 1 - Зависимость концентрации рибонуклеопротеина CDV и цикла количественной оценки ампликонов (n=3, отмечены точки, отображающие средние значения циклов количественной оценки).
Фиг. 2 - Дизайн оригинальных специфичных олигонуклеотидных праймеров и молекулярного зонда для разработки способа опосредованного определения концентрации рибонуклеопротеина возбудителя чумы плотоядных в сырье для вакцин по данным цикла количественной оценки при амплификации N-гена.
Сущность изобретения заключается в разработке способа опосредованного определения концентрации рибонуклеопротеина возбудителя чумы плотоядных в сырье для вакцин по данным цикла количественной оценки при амплификации N-гена.
Заявляемый способ основан на: 1) твердофазной экстракции РНК возбудителя CDV; 2) обратной транскрипции и амплификации специфического фрагмента N-гена кДНК CDV с применением оригинальных специфических праймеров и молекулярного зонда, меченого флуоресцентным красителем FAM; 3) детектировании ПЦР-продуктов с помощью флуоресцентного свечения и отображения накопления сигнала в виде сигмоидного графика; 4) определении значений циклов количественной оценки CQ-N; 5) расчете концентрации рибонуклеопротеина CDV c применением следующей регрессионной функции:
CРНП CDV = - 0,2992 × CQ-N + 9,1735
с высокой достоверностью аппроксимации (R2 = 0,9992) и эффективностью амплификации (E) 99,56% (фиг. 1).
В настоящее время обратная транскрипция и ПЦР в режиме реального времени используется для выявления нуклеиновой кислоты и генотипирования возбудителя чумы плотоядных. Для количественной оценки рибонуклеопротеина CDV в промышленном сырье для изготовления вакцин против данного заболевания данный метод с применением разработанной системы оригинальных олигонуклеотидов ранее не применялся. Таким образом, сведений об аналогах предлагаемого способа опосредованного определения концентрации рибонуклеопротеина возбудителя чумы плотоядных в сырье для вакцин по данным цикла количественной оценки при амплификации N-гена нет.
Разработанный способ опосредованного определения концентрации рибонуклеопротеина возбудителя чумы плотоядных в сырье для вакцин по данным цикла количественной оценки при амплификации N-гена по сравнению с прототипом отличается более высокой чувствительностью и специфичностью, быстротой выполнения анализа и снижением риска контаминации исследуемых образцов.
В отличие от прототипа разработанный способ включает следующие этапы анализа: 1) выделение РНК из исследуемых образцов; 2) обратная транскрипция и ПЦР в режиме реального времени при амплификации специфического фрагмента N-гена кДНК CDV с применением оригинальных специфичных праймеров и молекулярного зонда; 3) детектирование ампликонов с помощью флуоресцентного свечения и отображения накопления сигнала в виде сигмоидного графика; 4) определение значений циклов количественной оценки CQ-N; 5) расчет концентрации рибонуклеопротеина CDV с применением регрессионной функции, отраженной выше.
Применение предложенного способа позволит сократить время проведения анализа промышленного сырья при изготовлении культуральных вакцин против CDV по определению концентрации рибонуклеопротеина до 3 ч; исключить вероятность контаминации; повысить чувствительность и специфичность анализа; исключить фактор субъективности получаемых результатов по причине наличия приборного обеспечения для детекции результатов; повысить достоверность проводимого анализа благодаря установлению зависимости между концентрацией рибонуклеопротеина CDV и циклом количественной оценки ампликонов целевого участка N-гена. Исходя их этого, актуально применять разработанный способ для опосредованного определения концентрации рибонуклеопротеина возбудителя чумы плотоядных в сырье для вакцин по данным цикла количественной оценки при амплификации N-гена.
Ключевым элементом заявляемого способа является определение циклов количественной оценки для ампликонов целевого участка N-гена (CQ-N) и расчет концентрации рибонуклеопротеина CDV в сырье для культуральных вакцин с использованием разработанной квадратичной функции.
Сопоставительный анализ с прототипами позволяет сделать вывод, что новизна и изобретательский уровень заявляемого изобретения заключается в применении обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции с использованием разработанных оригинальных специфичных олигонуклеотидов, рассчитанных на целевой участок N-гена кДНК CDV, и разработанной функции второй степени зависимости CРНП CDV и CQ-N (фиг. 1).
Технический результат изобретения заключается в том, что разработанный способ дает возможность: 1) повысить чувствительность и специфичность за счет применения высокоспецифичных оригинальных праймеров и молекулярного зонда, рассчитанных для целевого участка N-гена кДНК CDV; 2) увеличить достоверность проводимого анализа благодаря подбору оптимальных температурного и временного режимов термоциклирования; 3) в 16 раз быстрее по сравнению с прототипом опосредованно определять концентрацию рибонуклеопротеина CDV в сырье для культуральных вакцин.
С целью определения концентрации рибонуклеопротеина CDV в сырье для культуральных вакцин по данным цикла количественной оценки для ампликонов целевого участка N-гена отдельно подготавливают положительный контрольный образец. Для этого проводят репродукцию CDV в монослойной культуре клеток почки африканской зеленой мартышки (Vero) до получения 95-100% поражения клеток в течение 72 ч.
Полученную вируссодержащую суспензию после культивирования подвергают центрифугированию при 3000 g в течение 5 минут. Супернатант отбирают для последующих исследований. Проводят ультрацентрифугирование в ступенчатом градиенте хлорида цезия (CsCl) (15-25%) при 50000 g в течение 2,5 ч при температуре 15±1°С. Опалесцирующий слой отбирают в отдельный пенициллиновый флакон, переносят в центрифужные пробирки, доливают объем пробирок с помощью 1/15 М фосфатного буферного раствора. Осаждают рибонуклеопротеин для очищения от остатков хлористого цезия с помощью центрифугирования при 60 000 g в течение 1 ч при 15±1°С. Полученный осадок растворяют в необходимом количестве буферного 1/15 М фосфатного буферного раствора.
В готовой суспензии определяют концентрацию рибонуклеопротеина CDV с помощью спектрометрического метода и подтверждают чистоту с помощью вертикального гель-электрофореза в 12%-ном полиакриламидном геле. В итоге получают охарактеризованный положительный контрольный образец, который вместе с исследуемыми пробами используют в дальнейшей работе.
На следующем этапе исследования составляют контрольную панель положительных стандартов рибонуклеопротеина CDV, в качестве которых используют очищенные препараты со следующими концентрациями аналита: 0,01; 1,0; 2,0; 3,0; 4,0; 5,0; 6,0; 7,0; 8,0 мкг/мл. Отрицательным контролем служит суспензия клеток линии Vero, не контаминированная микроорганизмами.
Из всех стандартных положительных и отрицательного контролей, а также тестируемых проб промышленного сырья выделяют нуклеиновую кислоту с применением набора «РИБО-сорб» (ООО «Интерлабсервис») в соответствии с инструкцией производителя.
Проводят обратную транскрипцию для получения комплементарной ДНК (кДНК) CDV и ПЦР в режиме реального времени. Для этого готовят реакционную смесь, рецептура которой представлена в таблице 1. Дизайн олигонуклеотидов отражен в таблице 2. Расчет праймеров и зонда осуществляли на основании нуклеотидной последовательности N-гена возбудителя чумы плотоядных. Термодинамические показатели для олигонуклеотидов отражены в таблице 3.
В качестве гомологичных участку N-гена CDV используют следующие олигонуклеотиды:
CDV-N-F113-праймер с дизайном 5'-TAGCCTTCTCAAGAGCCTCACAT-3'
CDV-N-R216-праймер 5'-GCTTGAATCACCCGGGATTAGGAC-3'
CDV-N-P168-FAM/RTQ-1-зонд с дизайном 5'-FAM-GCCTCGGGCTCCGGAGGA-RTQ-1-3' (фиг. 2), в концентрации 6 пМ на реакцию. Для формирования нуклеотидных цепей продуктов реакции применяют дезоксирибонуклеозидтрифосфаты с их суммарной концентрацией в реакционной смеси 2,8 мМ. В качестве основы используют буферный раствор (5-кратный), содержание которого составляет 20% от общего объема реакционной смеси. Буферный раствор включает в свой состав ионы калия (К+) (5⋅10−2 M) и диметилсульфооксид (DMSO) (3 %). DMSO включают в реакционную смесь для сведения к минимуму неспецифического связывания олигонуклеотидов. В смесь также добавляют 3,3 мМ хлорида магния. В качестве катализатора обратной транскрипции применяют AMV-ревертазу (1 е.а.), для реакции амплификации - Taq-ДНК-зависимую ДНК-полимеразу (1 е.а.). Элюаты суммарной РНК каждого образца добавляют к реакционной смеси по 5 мкл. Итоговый объем смеси для проведения одной реакции составляет 25 мкл.
Олигонуклеотиды подбирали в соответствии с рядом общих правил, которые отражены в работах B. Deiman и R. Sooknanan [12, 13]. Длины прямого, обратного праймеров и зонда составляют 23, 24, 18 н.о., что соответствует требованиям (20-30 н.о.). Молекулярный вес олигонуклеотидов равен 6943,6; 7328,8; 5541,6, соответственно. Праймеры и зонд очищены в полиакриламидном геле и с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии, соответственно. Нуклеотидная последовательность зонда не комплементарна олигонуклеотидным праймерам. Отсутствуют 4 и более подряд одинаковых нуклеотидов в цепи праймеров и зонда. Флуорофор FAM присоединен к 5'-концу, а гаситель флуоресценции RHQ1 - к 3'-концу. Данные условия соответствуют требованиям, предъявляемым к олигонуклеотидным праймерам и молекулярному зонду, которые участвуют в реакции амплификации. В качестве флуоресцентного красителя был выбран FAM с длиной волны максимальной флуоресценцией 520 нм. Для тушения свечения использовали гаситель флуоресценции RHQ1 с длиной волны максимального поглощения при 520 нм и возможном диапазоне гашения 470-570 нм. Таким образом, была выбрана подходящая пара «флуорофор-гаситель».
При анализе нуклеотидных последовательностей олигонуклеотидов установили, что для праймеров и зонда не характерно образование «шпилек», а также не выявлено 3'-комплементарности и сайтов, отжигающих сами на себя при условии, когда минимальное количество пар оснований, необходимое для димеризации праймера и минимальное количество пар оснований, необходимое для образования шпильки - 4.
Проведено определение температур плавления (Tm) для олигонуклеотидов методом, учитывающим концентрации ионов K+ и диметилсульфооксида (DMSO).
Физические, термодинамические константы и расчет температур плавления (Tm) разработанных олигонуклеотидных праймеров и зонда представлены в таблице 3, из которой следует, что энтропия, энергия Гиббса и энтальпия для прямого праймера составили 179,8 ккал/моль, 29,6 ккал/моль, 467,9 кал/(K⋅моль), соответственно. Энтропия, энергия Гиббса и энтальпия для обратного праймера составили 202,3 ккал/моль, 32,3 ккал/моль, 531,7 кал/(K⋅моль), соответственно. Энтропия, энергия Гиббса и энтальпия для молекулярного зонда составили 165,0 ккал/моль, 28,3 ккал/моль, 424,4 кал/(K⋅моль), соответственно [14, 15]. Полученные значения использовались для расчета температур плавления методом ближайших соседей представленных олигонуклеотидов. Tm для прямого и обратного праймеров составили по 57°С, для зонда - 58°С.
Экспериментально температуру отжига определяли по кривым плавления гетеродимера олигонуклеотида и матрицы с помощью модели фолдинга с использованием программного обеспечения Hybrid. В результате проведения эксперимента было выявлено, что температура отжига рассматриваемых олигонуклеотидов составляет 61°С. Для проведения реакции амплификации было решено проводить гибридизацию праймеров и зонда с участком N-гена кДНК CDV при температуре 61°С.
Последовательности оригинальных олигонуклеотидов проверили на наличие нежелательных совпадений с другими последовательностями нуклеиновых кислот с использованием Банка данных последовательности нуклеиновых кислот вируса бешенства. Последовательности праймеров и зонда также проанализировали на наличие внутренних вторичных структур с помощью программы сворачивания нуклеиновых кислот с помощью программы Mfold [16, 17]. Выявлено, что для разработанных олигонуклеотидов нежелательных совпадений с другими последовательностями нуклеиновых кислот, а также наличия внутренних вторичных структур не обнаружено.
Проведение обратной транскрипции и реакции амплификации в режиме реального времени осуществляли в детектирующем термоциклере любой марки при температурных и временных параметрах, сведения о которых представлены в таблице 4.
Обратную транскрипцию проводят при температуре 50°С в течение 10 минут. Перед проведением реакции амплификации осуществляют предварительный прогрев смеси при температуре 95°С в течение 3 минут для активации фермента Taq-ДНК-полимеразы и инактивации AMV-ревертазы. Амплификация включает в себя 3 подэтапа: денатурацию, отжиг олигонуклеотидов, элонгацию. Денатурацию проводят при температуре 95°С в течение 10 с, отжиг праймеров и зонда и элонгацию - при температуре 61°С в течение 30 с. Количество циклов ПЦР в режиме реального времени составляют 40.
Результаты ПЦР анализируют, оценивая и сравнивая графики накопления флуоресцентного сигнала по значениям циклов количественной оценки CQ-N, определенных с помощью пересечения пороговой линии и сигмоидной функции вида Fl = f (CQ-N). Учет результатов в реакции происходит на каждом цикле. Прибор определяет уровень флуоресценции и строит кинетическую кривую в координатах: уровень флуоресценции - цикл реакции амплификации. При наличии в исследуемой пробе специфической кДНК-матрицы сигмоида имеет экспоненциальную зависимость. Положительными считаются пробы, которым соответствуют сигмоидные графики, полученные при анализе флуоресценции красителя FAM, входящего в состав молекулярного зонда. Пробы оцениваются как отрицательные, если при их анализе отсутствует экспоненциальная кривая.
На следующем этапе анализа устанавливают зависимость между циклом количественной оценки и концентрацией рибонуклеопротеина CDV в не инактивированном сырье для вакцин. Оценивают величину эффективности реакции амплификации, а также достоверность аппроксимации (R2). На основе разработанной квадратичной модели рассчитывают значение концентрации рибонуклеопротеина CDV в не инактивированном сырье для вакцин.
Сущность предлагаемого изобретения пояснена примерами его использования, которые не ограничивают объем изобретения.
Пример 1. Получение положительного контрольного образца для выявления зависимости между циклом количественной оценки и концентрацией рибонуклеопротеина CDV в не инактивированном сырье для культуральных вакцин.
Для получения положительного контрольного образца проводили репродукцию CDV в монослойной перевиваемой клеточной линии Vero до получения 95-100% поражения клеток в течение 72 ч.
Полученную вируссодержащую суспензию после культивирования подвергали центрифугированию при 3000 g в течение 5 минут. Супернатант отбирали для последующих исследований. Проводили ультрацентрифугирование в ступенчатом градиенте хлорида цезия (CsCl) (15-25%) при 50000 g в течение 2,5 ч при температуре 15±1°С. Опалесцирующий слой отбирали в отдельный пенициллиновый флакон, переносили в центрифужные пробирки, доливали объем пробирок с помощью 1/15 М фосфатного буферного раствора. Осаждали рибонуклеопротеин для очищения от остатков хлористого цезия с помощью центрифугирования при 60 000 g в течение 1 ч при 15±1°С. Полученный осадок растворяли в необходимом количестве буферного 1/15 М фосфатного буферного раствора.
В готовой суспензии определяли концентрацию рибонуклеопротеина CDV с помощью спектрометрического метода (прототип). По данным прототипного способа анализа концентрация рибонуклеопротеина CDV составляла 3550 мкг/мл. Проводили вертикальный белковый гель-электрофорез в 12%-ном полиакриламидном геле, содержащем додецилсульфат натрия, для оценки степени чистоты положительного контрольного препарата. Из результатов гель-электрофореза следует, что получен чистый препарат рибонуклеопротеина CDV. Из данного препарата с помощью 1/15 М фосфатного буферного раствора приготовили положительный контрольный образец с концентрацией рибонуклеопротеина CDV 5,0 мкг/мл. Таким образом, получили охарактеризованный положительный контрольный образец, который вместе с исследуемыми пробами использовали в дальнейшей работе.
Пример 2. Выражение функции зависимости концентрации
рибонуклеопротеина CDV в сырье для изготовления культуральных вакцин и цикла количественной оценки.
Для выражения функции зависимости концентрации рибонуклеопротеина CDV в сырье для изготовления вакцин и цикла количественной оценки составляли контрольную панель положительных стандартов рибонуклеопротеина CDV, в качестве которых использовали очищенные препараты со следующими концентрациями аналита: 0,01; 1,0; 2,0; 3,0; 4,0; 5,0; 6,0; 7,0; 8,0 мкг/мл. В качестве отрицательного контроля применяли суспензию клеток линии Vero, не контаминированную микроорганизмами.
Из всех стандартных положительных и отрицательного контролей, а также тестируемых проб промышленного сырья выделяли нуклеиновую кислоту, провели обратную транскрипцию и ПЦР в режиме реального времени, как описано выше.
Результаты ПЦР анализировали, оценивали и сравнивали графики накопления флуоресцентного сигнала по значениям циклов количественной оценки CQ-N, определенных с помощью пересечения пороговой линии и сигмоидной функции вида Fl = f (CQ-N). Устанавливали зависимость между циклом количественной оценки и концентрацией рибонуклеопротеина CDV в сырье для вакцины в процессе построения графика квадратичной функции. Полученные данные отражены на фиг. 1 и выражены в виде квадратичной функции:
CРНП CDV = - 0,2992 × CQ-N + 9,1735
с высокой достоверностью аппроксимации (R2 = 0,9992) и эффективностью амплификации (E) 99,56%, что соответствовало общепринятым требованиям, предъявляемым к молекулярно-биологическим тест-системам [18].
Пример 3. Апробация способа опосредованного определения концентрации рибонуклеопротеина возбудителя чумы плотоядных в сырье для вакцин по данным цикла количественной оценки при амплификации N-гена.
Для анализа использовали 6 суспензий культурального CDV со следующими концентрациями рибонуклеопротеина: 0,50; 1,20; 2,50; 3,90; 5,65; 7,50 мкг/мл, соответственно (пробы № 1-6). В качестве положительного контроля применяли суспензию рибонуклеопротеина CDV с концентрацией аналита 8,00 мкг/мл. Отрицательным контролем служила суспензия клеток линии Vero, не контаминированную микроорганизмами. Испытуемые пробы и контрольные образцы исследовали в пяти повторностях. Все этапы исследования проводили, как представлено выше.
По результатам исследования определили, что средние значения циклов количественной оценки для проб № 1-6 составляли 28,92±0,02, 26,58±0,01, 22,20±0,02, 17,66±0,01, 11,78±0,01, 5,49±0,01, соответственно. Пользуясь разработанной квадратичной функцией, рассчитали средние значения концентрации рибонуклеопротеина CDV для проб № 1-6, которые составили 0,52; 1,22; 2,53; 3,89; 5,65; 7,53 мкг/мл, соответственно (различия не существенны, n = 5, p<0,005). Для положительного контроля значение CQ-N составило 3,92±0,01, что соответствовало концентрации рибонуклеопротеина CDV, равной 8,00 мкг/мл. Для отрицательного контроля логистическая кривая не была сформирована, что означало отсутствие CDV в данном контроле.
Таким образом, разработанный способ позволяет опосредованно определять концентрацию рибонуклеопротеина возбудителя чумы плотоядных в сырье для вакцин по данным цикла количественной оценки при амплификации N-гена.
Пример 4. Определение степени достоверности способа опосредованного определения концентрации рибонуклеопротеина возбудителя чумы плотоядных в сырье для вакцин по данным цикла количественной оценки при амплификации N-гена.
Для подтверждения степени достоверности использовали 500 суспензий культурального вируса чумы плотоядных с концентрациями рибонуклеопротеина 0,01-8,00 мкг/мл. Анализ проводили, в трех повторностях.
Интерпретацию результатов проводили, пользуясь разработанной квадратичной функцией, представленной выше, с получением значений концентрации рибонуклеопротеина для каждой из 500 проб. Для положительного контроля значение цикла количественной оценки составило 3,92±0,01, что соответствовало концентрации рибонуклеопротеина CDV, равному 8,00 мкг/мл. Для отрицательных контролей сигмоида не была сформирована, что означало отсутствие в нем CDV.
Данные, полученные с помощью разработанного способа (табл. 5), коррелировали со значениями стандартов на 99,61-100,00% для 8,0-5,0 мкг/мл (n=100), на 99,11-99,60% для 4,9-2,0 мкг/мл (n=100), на 98,74-99,10% для 1,9-0,3 мкг/мл (n=100), на 97,02-98,73% для 0,29-0,01 мкг/мл (n=100), на 95,99-97,01% для концентрации менее 0,01 мкг/мл (n=100).
Аналитическая чувствительность составила не менее 0,01 мкг/мл с достоверностью определения концентрации рибонуклеопротеина CDV, равно 95,99%. Таким образом, полученные результаты свидетельствовали о высокой степени точности разработанного способа опосредованного определения концентрации рибонуклеопротеина возбудителя чумы плотоядных в сырье для вакцин по данным цикла количественной оценки при амплификации N-гена.
Пример 5. Определение специфичности разработанного способа опосредованного определения концентрации рибонуклеопротеина возбудителя чумы плотоядных в сырье для вакцин по данным цикла количественной оценки при амплификации N-гена.
Для исследования специфичности разработанного способа опосредованного определения концентрации рибонуклеопротеина возбудителя чумы плотоядных в сырье для вакцин по данным цикла количественной оценки при амплификации N-гена, исследовали суспензии вируса ящура серотипа Азия-1, а также возбудителей парвовирусного энтерита собак, коронавируса собак, калицивирусной инфекции кошек, бешенства. Количество инфекционных доз вирусов в суспензиях составляло не менее 4,0 lg ТЦД50/см3 или 4,0 lg ККИД50/см3. Исследования проводили в 5 повторностях.
Этапы исследования проводили, как описано выше. Для проб, содержащих другие вирусы, не наблюдалось формирования графиков экспоненты, и они не выходили за пороговый уровень флуоресцентного сигнала (0,005 у.е.). Таким образом, разработанный способ является специфичным по отношению к возбудителю чумы плотоядных и может быть использован для опосредованного определения концентрации рибонуклеопротеина возбудителя чумы плотоядных в сырье для культуральных вакцин по данным цикла количественной оценки при амплификации целевого участка N-гена.
Пример 6. Определение диагностических показателей разработанного способа опосредованного определения концентрации рибонуклеопротеина возбудителя чумы плотоядных в сырье для вакцин по данным цикла количественной оценки при амплификации N-гена.
Для определения диагностической чувствительности разработанного способа анализировали 350 культуральных суспензий CDV с разными значениями концентрации рибонуклеопротеина (0,01-8,00 мкг/мл). Данные пробы являлись заведомо положительными. Постановку обратной транскрипции и ПЦР в режиме реального времени проводили, как отражено выше. С помощью разработанного способа (предлагаемое изобретение) определили, что из 350 исследуемых образцов в 347 пробах концентрация определена верно, в 3 - отличия были существенными (концентрация 0,01 мкг/мл).
Для исследования специфичности метода тестировали 200 отрицательных суспензий клеток линии Vero, не содержащих CDV. В результате исследования с помощью разработанного способа (предлагаемое изобретение) определили, что все 200 проб были отрицательными. Пользуясь представленными выше статистическими методами анализа определили, что в 95%-ном доверительном интервале диагностическая чувствительность (DSe) составила 97,54-99,82%, диагностическая специфичность (DSp) - 98,17-100,00%, k-критерий - 0,988; общая точность (DAc) - 98,42-99,89%.
Основными преимуществами предлагаемого изобретения является сокращение времени проведения анализа промышленного сырья для изготовления вакцин против CDV по определению концентрации рибонуклеопротеина CDV вируса до 3 часов (в 16 раз быстрее по сравнению с прототипом); исключение вероятности контаминации; повышение аналитической, диагностической чувствительности и специфичности анализа; исключение фактора субъективности получаемых результатов за счет использования приборного обеспечения для детекции результатов; повышение достоверности проводимого анализа благодаря установлению зависимости между концентрацией рибонуклеопротеина CDV и циклом количественной оценки ампликонов целевого участка N-гена, представленной в виде регрессионной функции:
CРНП CDV = - 0,2992 × CQ-N + 9,1735 с достоверностью аппроксимации (R2), равной 0,9992 и эффективностью амплификации (E), равной 99,56%.
Предложенная модель позволяет быстро опосредованно определять концентрацию рибонуклеопротеина CDV в сырье при изготовлении культуральных вакцин по данным цикла количественной оценки для ампликонов целевого участка N-гена.
Источники информации, принятые во внимание при составлении описания изобретения к заявке на выдачу патента РФ на изобретение «Способ опосредованного определения концентрации рибонуклеопротеина возбудителя чумы плотоядных в сырье для вакцин по данным цикла количественной оценки при амплификации N-гена»:
Elia G, et al. Virological and serological findings in dogs with naturally occurring distemper. J. Virol. Methods. 2015;213:123-130.
Rendon-Marin S, Budaszewski RF, Canal CW, Ruiz-Saenz J. Tropism and molecular pathogenesis of canine distemper virus. Virol. J. 2019;16:30.
Beineke A, Puff C, Seehusen F, Baumgartner W. Pathogenesis and immunopathology of systemic and nervous canine distemper. Vet. Immunol. Immunopathol. 2009;127:1-18.
Han G-Z, Liu X-P, Li S-S. Cross-species recombination in the haemagglutinin gene of canine distemper virus. Virus Res. 2008;136:198-201.
Lempp C, et al. New aspects of the pathogenesis of canine distemper leukoencephalitis. Viruses. 2014;6:2571-2601.
Anis E, Holford AL, Galyon GD, Wilkes RP. Antigenic analysis of genetic variants of canine distemper virus. Vet. Microbiol. 2018;219:154-160.
Carina R, et al. Virus isolation and full-length genome sequencing of a representative canine distemper virus wild type strain of the South America 2 clade. J. Virol. Methods. 2020;279:113857.
Freitas LA, Leme RA, Saporiti V, Alfieri AA, Alfieri AF. Molecular analysis of the full-length F gene of Brazilian strains of canine distemper virus shows lineage co-circulation and variability between field and vaccine strains. Virus. Res. 2019;264:8-15.
Sarute N, et al. Molecular typing of canine distemper virus strains reveals the presence of a new genetic variant in South America. Virus Gene. 2014;48:474-478.
Martella V, Elia G, Buonavoglia C. Canine distemper virus. Vet Clin North Am Small Anim Pract. 2008 Jul;38(4):787-97, vii-viii.
Loots AK, Mitchell E, Dalton DL, Kotzé A, Venter EH. Advances in canine distemper virus pathogenesis research: a wildlife perspective. J Gen Virol. 2017 Mar;98(3):311-321. doi: 10.1099/jgv.0.000666. Epub 2017 Apr 1. PMID: 27902345.
Deiman B., van Aarle P., Sillekens P. Characteristics and applications of nucleic acid sequence based amplification // Mol. Biotech. - 2002. - Vol. 20. - P. 163-179.
Sooknanan R., van Gemen B., Malek L. Nucleis acid sequence-based amplification // Molecular methods for virus detection-London: Academic press, 1995. - P. 261-285.
SantaLucia J. J., Hicks D. The thermodynamics of DNA structural motifs // Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure: journal. - 2004. - Vol. 33. - P. 11-14.
Молекулярный олигокалькулятор. [Электронный ресурс] / URL: http://www.bio.bsu.by/molbiol/oligocalc.html. (Дата обращения: 20.08.2023).
Nicolas von Ahsen, Carl T. Wittwer, Ekkehard Schütz. Oligonucleotide melting temperatures under pcr conditions: nearest-neighbor corrections for Mg2+, deoxynucleotide triphosphate, and dimethyl sulfoxide concentrations with comparison to alternative empirical formulas (англ.) // Clinical Chemistry: journal. - 2001. - Vol. 47, no. 11. - P. 1956-1961.
SantaLucia J. J. A unified view of polymer, dumbbell, and oligonucleotide DNA nearest-neighbor thermodynamics (англ.) // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America: journal. - 1998. - Vol. 95, no. 4. - P. 1460-1465.
Vallat B. OIE Quality Standard and Guidelines for Veterinary Laboratories:Infectious Diseases. - 2nd ed. - Paris, France, 2008. - 67 p.
Таблица 1
Состав смеси компонентов для обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции в режиме реального времени для опосредованного определения концентрации рибонуклеопротеина возбудителя чумы плотоядных в сырье для вакцин по данным цикла количественной оценки при амплификации N-гена (предлагаемое изобретение)
(dATP, 25 мМ)
(dGTP, 25 мМ)
(dCTP, 25 мМ)
(dTTP, 25 мМ)
Примечание: объем вносимого элюата РНК - 5 мкл, объем реакционной смеси - 25 мкл.
Таблица 2
Дизайн оригинальных олигонуклеотидов для разработки способа опосредованного определения концентрации рибонуклеопротеина возбудителя чумы плотоядных в сырье для вакцин по данным цикла количественной оценки при амплификации N-гена (предлагаемое изобретение)
Таблица 3
Физические, термодинамические параметры и температура плавления олигонуклеотидов для опосредованного определения концентрации рибонуклеопротеина возбудителя чумы плотоядных в сырье для вакцин
- на основе статистического метода ближайших соседей
Примечание: термодинамические параметры оригинальных олигонуклеотидов рассчитаны при условии: концентрация NaCl 1 М,
температура 25°С,
водородный показатель (рН) 7,0,
* - расчет показателей проводили без учета модификаций на 5'- и 3'-концах.
Таблица 4
Временные и температурные режимы обратной транскрипции и реакции амплификации для опосредованного определения концентрации рибонуклеопротеина возбудителя чумы плотоядных в сырье для вакцин по данным цикла количественной оценки при амплификации N-гена (предлагаемое изобретение)
Таблица 5
Достоверность опосредованного определения концентрации рибонуклеопротеина возбудителя чумы плотоядных в сырье для вакцин по данным цикла количественной оценки при амплификации N-гена (предлагаемое изобретение) (n=3 для каждой пробы)
--->
<?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?>
<!DOCTYPE ST26SequenceListing SYSTEM "ST26SequenceListing_V1_3.dtd" PUBLIC "-
//WIPO//DTD Sequence Listing 1.3//EN">
<ST26SequenceListing productionDate="2024-08-16" softwareVersion="2.1.2"
softwareName="WIPO Sequence" fileName="CDV RNP.xml" dtdVersion="V1_3">
<ApplicationIdentification>
<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>
<ApplicationNumberText>0</ApplicationNumberText>
<FilingDate>2024-08-16</FilingDate>
</ApplicationIdentification>
<ApplicantFileReference>565</ApplicantFileReference>
<EarliestPriorityApplicationIdentification>
<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>
<ApplicationNumberText>0</ApplicationNumberText>
<FilingDate>2024-08-16</FilingDate>
</EarliestPriorityApplicationIdentification>
<ApplicantName languageCode="ru">ФГБУ "Федеральный центр охраны здоровья
животных" (ФГБУ "ВНИИЗЖ")</ApplicantName>
<ApplicantNameLatin> Federal State-Financed Institution Federal Centre for
Animal Health (FGBI ARRIAH)</ApplicantNameLatin>
<InventionTitle languageCode="ru">Способ опосредованного определения концентрации
рибонуклеопротеина возбудителя чумы плотоядных в сырье для вакцин по данным цикла
количественной оценки при амплификации N-гена
</InventionTitle>
<SequenceTotalQuantity>3</SequenceTotalQuantity>
<SequenceData sequenceIDNumber="1">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>23</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..23</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q1">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>CDV</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>tagccttctcaagagcctcacat</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="2">
<INSDSeq><INSDSeq_length>24</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..24</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q2">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>CDV</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>gcttgaatcacccgggattaggac</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="3">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>18</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..18</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q3">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>CDV</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>gcctcgggctccggagga</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
</ST26SequenceListing>
<---
Настоящее изобретение относится к области биотехнологии. Описан способ опосредованного определения концентрации рибонуклеопротеина возбудителя чумы плотоядных в сырье для культуральных вакцин по данным цикла количественной оценки при амплификации целевого участка N-гена. Основными преимуществами предлагаемого изобретения является сокращение времени проведения анализа промышленного сырья для изготовления культуральных вакцин против CDV по определению концентрации рибонуклеопротеина CDV вируса до 3 часов; исключение вероятности контаминации; повышение аналитической, диагностической чувствительности и специфичности анализа; исключение фактора субъективности получаемых результатов за счет использования приборного обеспечения для детекции результатов; повышение достоверности проводимого анализа благодаря установлению зависимости между концентрацией рибонуклеопротеина CDV и циклом количественной оценки ампликонов целевого участка N-гена, представленной в виде регрессионной функции с высокими значениями достоверности аппроксимации и эффективности реакции амплификации. 2 з.п. ф-лы, 2 ил., 5 табл., 6 пр.
1. Способ опосредованного определения концентрации рибонуклеопротеина возбудителя чумы плотоядных в сырье для вакцин по данным цикла количественной оценки при амплификации N-гена, предлагающий амплификацию специфического фрагмента N-гена к ДНК возбудителя CDV с применением следующих специфичных олигонуклеотидов:
CDV-N-F113-праймер с дизайном
5'-TAGCCTTCTCAAGAGCCTCACAT-3'
CDV-N-R216-праймер
5'-GCTTGAATCACCCGGGATTAGGAC-3'
CDV-N-P168-FAM/RTQ-1-зонд с дизайном
5'-FAM- GCCTCGGGCTCCGGAGGA-RTQ-1-3',
и определение значений цикла количественной оценки с применением регрессионной функции:
CРНП CDV = - 0,2992 × CQ-N + 9,1735
с высокой достоверностью аппроксимации R2 = 0,9992 и эффективностью амплификации E = 99,56%.
2. Способ по п. 1, где его аналитическая чувствительность составила не менее 0,01 мкг/мл с достоверностью определения концентрации рибонуклеопротеина 95,99%, в 95%-ном доверительном интервале диагностическая чувствительность составила 97,54-99,82%, диагностическая специфичность – 98,17-100,00%, k-критерий – 0,988, общая точность – 98,42-99,89%.
3. Способ по п. 1, где время проведения анализа сокращается в 16 раз.
| Набор специфических олигодезоксирибонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченого зонда к фрагменту гена nucleocapsid protein (N) Canine morbillivirus (Canine Distemper Virus, CDV) для детекции Чумы плотоядных (болезнь Карре, чумка) у собак - ПЦР тест-система в режиме реального времени | 2022 |
|
RU2803069C1 |
| Шляпный очистительный валик к чесальной машине | 1932 |
|
SU34354A1 |
| Martella V, Elia G, Buonavoglia C | |||
| Canine distemper virus | |||
| Vet Clin North Am Small Anim Pract | |||
| Станок для изготовления деревянных ниточных катушек из цилиндрических, снабженных осевым отверстием, заготовок | 1923 |
|
SU2008A1 |
| Fei Chen et al., Canine distemper virus N protein induces autophagy to facilitate viral replication, BMC Vet Res | |||
| Электромагнитный прерыватель | 1924 |
|
SU2023A1 |
