Способ прогнозирования риска развития хронической сердечной недостаточности у мужчин с сахарным диабетом 2 типа на основе генотипирования полиморфизма rs4932143 гена ANPEP Российский патент 2023 года по МПК G01N33/50 C12Q1/6806 C12Q1/6827 C12Q1/686 C12Q1/6876 C12Q1/6883 

Изобретение относится к области медицинской диагностики, может быть использовано для прогнозирования риска развития хронической сердечной недостаточности у мужчин Центральной России с сахарным диабетом 2 типа.

Дефицит продукции эндогенных антиоксидантов, в частности глутатиона, служит патогенетической основой как сахарного диабета 2 типа, так и развивающихся на его фоне сердечно-сосудистых заболеваний, включая хроническую сердечную недостаточность [Diabetic cardiovascular disease induced by oxidative stress / Y. Kayama, U. Raaz, A. Jagger [et al.] // International journal of molecular sciences. - 2015. - Vol. 16, Iss. 10. - P. 25234-25263; Benáková, Š. Redox homeostasis in pancreatic β-cells: from development to failure / Š. Benáková, B. Holendová, L. Plecitá-Hlavatá // Antioxidants. - 2021. - Vol. 10, Iss. 4. - Art. 526. - URL: https://doi.org/10.3390/antiox10040526]. Аминопептидаза ANPEP катализирует гидролиз глутатиона плазмы до входящих в его состав аминокислот и способствует их транспортировке внутрь клетки для участия в процессе внутриклеточной регенерации этого важнейшего антиоксиданта [Githens, S. Glutathione metabolism in the pancreas compared with that in the liver, kidney, and small intestine / S. Githens // International journal of pancreatology. - 1991. - Vol. 8, Iss. 2. - P. 97-109]. По данным транскриптомного анализа GTex Portal, полиморфный вариант rs4932143 (C>G) ассоциирован с изменением экспрессии гена ANPEP в широком спектре тканей, включая миокард, где данный ген может быть патогенетически связан с развитием хронической сердечной недостаточности на фоне сахарного диабета 2 типа [https://www.gtexportal.org].

Известен способ прогнозирования сердечной недостаточности у больных с ишемической болезнью сердца в постинфарктный период (патент RU 2269922 C1, дата публикации 20.02.2006), включающий проведение тканевой допплерэхокардиографии в покое. Анализируют изменение сегментарного времени изоволюметрического расслабления (ivrt) левого желудочка и при значении ivrt 47 мсек и ниже, прогнозируют высокий риск развития сердечной недостаточности. Однако данный метод не учитывает индивидуальных генетических особенностей пациентов с сахарным диабетом 2 типа и имеет невысокую прогностическую точность.

Известен способ прогнозирования течения хронической сердечной недостаточности (патент №2357250 от 27.05.2009), включающий определение количества CD133+-клеток в образцах цельной крови и оценку их колониеобразующей способности при культивировании in vitro. Риск развития неблагоприятного исхода - ранней смерти и/или госпитализации крайне высок, если при обследовании пациента с хронической сердечной недостаточностью представительство CD133+-клеток в цельной крови меньше или равно 1×10⁵/л и количество колониеобразующих единиц меньше или равно 2/мм². Благоприятный исход прогнозируют, если представительство CD133+-клеток в цельной крови более 1×10⁵/л и количество колониеобразующих единиц более 2/мм². Данный метод не учитывает индивидуальных генетических особенностей пациентов с сахарным диабетом 2 типа, а также их, пол, что может иметь значение для развития осложнения.

Наиболее близок по результату исследования способ прогнозирования течения хронической сердечной недостаточности по патенту на изобретение RU 2 547 575 C1 (дата публикации 10.04.2015), включающий определение полиморфизмов генов AGTR2: 1675 и GNB3: 825. При сочетании полиморфизмов генов AGTR2: 1675 и GNB3: 825 в виде гетерозигот прогнозируют неблагоприятное течение хронической сердечной недостаточности. Данное изобретение основано на результатах статистического анализа, который показал относительно невысокие значения мощности выявленной ассоциации для указанных ДНК-полиморфизмов, а также не учитывает пол пациентов.

Технический результат заключается в получении критериев оценки риска формирования хронической сердечной недостаточности у мужчин Центральной России с сахарным диабетом 2 типа по данным о генетическом полиморфизме rs4932143 (C>G) гена ANPEP.

Технический результат достигается тем, что после экстракции ДНК проводят анализ полиморфного варианта гена аминопептидазы ANPEP rs4932143 (С>G) и прогнозируют повышенный риск формирования хронической сердечной недостаточности у мужчин Центральной России с сахарным диабетом 2 типа в случае выявления генотипов rs4932143-C/G или rs4932143-G/G, а при обнаружении генотипа rs4932143-C/С - низкий риск развития хронической сердечной недостаточности у мужчин Центральной России с сахарным диабетом 2 типа.

Изобретение поясняется следующей фигурой: дискриминация генотипов по локусу гена ANPEP rs4932143 при генотипировании на основе масс-спектрометрии: генотипы rs4932143-С/С показаны оранжевым цветом, генотипы rs4932143-С/G показаны зеленым цветом, генотипы rs4932143-G/G показаны голубым цветом.

Способ осуществляют следующим образом:

1. Выделение ДНК из периферической венозной крови. На первом этапе к 0,5 мл крови добавляли 0,5 мл PBS и центрифугировали 10 мин при 12 тыс. об/мин. Надосадочную жидкость сливали, добавляли 1 мл PBS и вновь центрифугировали при тех же условиях. Надосадочную жидкость сливали, добавляли 200 мкл ТЕ-буфера, пипетировали до растворения осадка и затем последовательно добавляли 10 мкл 1% раствора додецилсульфата натрия SDS и 5 мкл протеиназы К. Пробирки инкубировали в термостате при t=37°C 12 ч. В ходе второго этапа проводили четыре последовательных центрифугирования с фенолом и хлороформом согласно протоколу методики (10 мин, 8 тыс. об/мин), после чего ДНК осаждали ледяным раствором 95% этилового спирта и центрифугировали 10 мин при 14,3 тыс. об/мин. По испарении спирта ДНК растворяли в 100 мкл деионизированной дистиллированной воды. Получаемый раствор ДНК в воде имел чистоту в диапазоне А260/280=1,5-2,0 и среднюю концентрацию около 180-200 нг/мкл.

Экстракция геномной ДНК из цельной крови колоночным методом проводилась с помощью набора QIAamp DNA blood mini kit (QIAGEN, Германия) на автоматической станции QiaCube (QIAGEN, Германия). Роботизированный протокол продолжительностью 58 минут включал этап лизиса клеток 0,2 мл цельной крови с помощью лизирующего буфера и протеиназы К QIAGEN, инкубирование, перенос лизата в колонку, связывание ДНК с мембраной колонки, центрифугирование, двукратное промывание колонки буфером AW1 и AW2, центрифугирование колонки и, наконец, элюирование очищенной ДНК. Получаемый раствор ДНК в воде имел идеальную чистоту А260/280=1,7-1,9 и среднюю концентрацию около 40-50 нг/мкл. Экстрагированные из крови образцы ДНК хранились в морозильниках Thermo Fisher Scientific (США) при -20°С.

2. Подготовка образцов ДНК к масс-спектрометрическому анализу. Качество выделенной ДНК оценивали по степени чистоты и концентрации раствора на спектрофотометре NanoDrop (Thermo Fisher Scientific, США). Все анализируемые образцы ДНК были разведены деионизированной водой до концентрации 10 нг/мкл при А260/280=1,5-2,0.

3. Анализ полиморфизма rs4932143 гена ANPEP - генотипирование методом матрично-активированной лазерной десорбционно-ионизационной масс-спектрометрии MALDI-TOF. Использовали следующие последовательности праймеров: прямой F: 5`- ACGTTGGATGACAGGCCTCATCTCTGACTC-3`, обратный R: 5`- ACGTTGGATGAACATTCCTTCCGAGGCAAC-3`, праймер удлинения E: 5`- GCAACAGCCACATCT-3`. Для приготовления ПЦР-микса (в расчете на один спектральный чип) в центрифужную микропробирку вносили 80,6 мкл ddH2O, 50,4 мкл 10x буфера, 40,3 мкл MgCl₂ (концентрация 25 ммоль/л), 10,1 мкл смеси дНТФ (концентрация 25 ммоль/л), 100,8 мкл смеси ПЦР-праймеров (концентрация 0,5 мкмоль/л) и 20,16 мкл HotStartTaq полимеразы (концентрация 5 ЕД/мкл). Смесь вортексировали и раскапывали в 96-луночный ПЦР-планшет по 3 мкл в лунку, после чего с помощью восьмиканального дозатора вносили по 2 мкл ДНК (концентрация 10 нг/мкл). Планшет заклеивали, центрифугировали 20 сек при 1000 об/мин и загружали в термоциклер CFX96 Bio-Rad на 125 мин при следующем режиме: денатурация 2 мин при 95°С, амплификация 44 цикла, состоящая из денатурации 30 сек при 95°С, отжига 30 сек при 56°С и элонгации 60 сек при 72°С. После чего пробы инкубировали 5 мин при 72°С. Не прореагировавшие в ходе ПЦР дНТФ удаляли с помощью реакции SAP (shrimp alkaline phosphatase), в ходе которой щелочная фосфатаза креветки гидролизовала дНТФ до нуклеозидов и фосфатов. Для приготовления SAP-микса в микропробирке смешивали 161,6 мкл ddH2O, 18 мкл 10хTS буфера и 31,7 мкл SAP фермента. Далее вносили по 2 мкл SAP-смеси в каждую лунку, планшет заклеивали, центрифугировали 20 сек при 1000 об/мин и загружали в термоциклер CFX96 Bio-Rad на 55 мин при следующем режиме: 45 мин при 37°С и 10 мин при 85°С. Для проведения третьей реакции iPLEX готовили Е-праймер-микс из расчета 8,8 мкл праймеров Е1-Е9, 11,7 мкл праймеров Е10-Е18, 14,6 мкл праймеров Е19-Е27, 17,5 мкл праймеров Е28-Е35 и 45,1 мкл ddH2O. После масс-спектрометрической оценки интенсивности пиков Е-праймеров в полученной смеси, в микс добавляли Е-праймеры в количествах, необходимых для достижения одинаковой интенсивности сигнала. Для приготовления iPLEX-микса в микропробирке смешивали 65,4 мкл ddH2O, 21,2 мкл iPLEX буфера, 21,2 мкл терминирующей смеси, 99,3 мкл Е-праймер-микса и 4,33 мкл iPLEX-фермента, вортексировали и раскапывали в лунки по 2 мкл. Планшет заклеивали, центрифугировали 20 секунд при 1000 об/мин и загружали в термоциклер CFX96 Bio-Rad на 135 мин при следующем режиме: денатурация 30 сек при 94°С, затем 40 циклов, состоящие из денатурации 5 сек при 94°С, отжига 5 сек при 52°С, элонгации 5 сек при 80°С, с последующим инкубированием в течение 3 мин при 72°С. По завершении реакции iPLEX, планшет охлаждали до +4°С, добавляли по 30 мкл воды во все лунки, центрифугировали 1 мин при 1000 об/мин и загружали в масс-спектрометр. Ввиду того, что небольшие полярные молекулы и положительно заряженные катионы натрия и калия могут образовывать аддукты с олигонуклеотидами и создавать серию контаминантных пиков, ампликоны были подвергнуты роботизированному обессоливанию путем их обработки смолой SpectroCLEAN (Agena Bioscience). Перенос образцов на спектральный чип с матрицей для ионизации осуществлялся в автоматическом режиме на рабочей станции Nanodispenser. Пример кластерного распределения генотипов по SNP rs4932143 в результате масс-спектрометрического анализа на геномном масс-спектрометре MassArray analyzer 4 (Agena Bioscience) показан на фигуре 1.

Статистические расчеты проводили с помощью программы SNPStats (Solé, X., Guinó, E., Valls, J., Iniesta, R., & Moreno, V. (2006). SNPStats: a web tool for the analysis of association studies. Bioinformatics, 22(15), 1928-1929).

4. Прогнозирование повышенного риска формирования хронической сердечной недостаточности у мужчин Центральной России с сахарным диабетом 2 типа в случае выявления генотипов rs4932143-C/G или rs4932143-G/G и пониженного риска развития хронической сердечной недостаточности у мужчин Центральной России с сахарным диабетом 2 типа при выявлении генотипа rs4932143-C/С.

Возможность использования предложенного способа для определения риска развития хронической сердечной недостаточности у мужчин подтверждает анализ результатов наблюдений 423 пациентов с СД2, у 280 из которых установлена хроническая сердечная недостаточность. В исследование включались лица славянской национальности Центральной России. Диагноз СД2 и ХСН был установлен врачами ОБУЗ ГК БСМП на основе клинического и лабораторно-инструментального обследования. Установлено, что генотип rs4932143-С/С значимо чаще встречался у мужчин без хронической сердечной недостаточности (61,5%) по сравнению с больными СД2, имеющими данное осложнение основного заболевания (48,6%). Генотипы rs4932143-C/G и rs4932143-G/G значимо чаще встречались у пациентов с СД2 и хронической сердечной недостаточностью (51,4%) по сравнению с больными СД2 без данного осложнения (38,5%). Носительство генотипов rs4932143-C/G и rs4932143-G/G ANPEP ассоциировалось с повышенным риском развития хронической сердечной недостаточности: OR=1,71, 95% CI 1,09-2,69, P=0,02 (таблица 1).

Таблица 1
Ассоциация полиморфного варианта rs4932143 гена ANPEP с хронической сердечной недостаточностью у мужчин с сахарным диабетом 2 типа Ген
SNP ID Гено-
тип, аллель Больные с СД2,
n (%) Р¹ OR (95% CI)² Без ХСН
(n=143) С ХСН
(n=280) ANPEP
rs4932143 С>G C/C 88 (61,5%) 136 (48,6%) 0,02 1,00 C/G-G/G 55 (38,5%) 144 (51,4%) 1,71 (1,09-2,69) G 22,0% 29,6% 0,02 1,49 (1,07-2,07) ¹Уровень значимости ассоциации с поправками на ковариаты - возраст и индекс массы тела;
²Отношения шансов и 95% доверительный интервал с поправками на ковариаты - возраст и индекс массы тела.
СД2 - сахарный диабет 2 типа; ХСН - хроническая сердечная недостаточность.

В качестве примеров конкретного применения разработанного способа приведено генетическое обследование русских пациентов, уроженцев Центральной России и не являющихся родственниками между собой: проведено генетическое обследование по локусу rs4932143 (С>G) гена ANPEP.

Пациент М., 50 лет, находился на стационарном лечении в ОБУЗ КГКБ СМП г. Курска с 26.09.2019 г. по 09.10.2019 г. Диагноз: сахарный диабет, 2 тип, стадия декомпенсации от 26.09.2019 г., стадия компенсации от 09.10.2019 г. Индивидуальный целевой уровень HbA1c<7,0%. Целевой уровень гликемии плазмы натощак <7,0%. Целевой уровень гликемии плазмы натощак <7,0 ммоль/л, через 2 ч после еды <9,0 ммоль/л. У пациента была взята венозная кровь, при генотипировании полиморфного локуса rs4932143 (С>G) был выявлен генотип rs4932143-С/С ANPEP, что позволило отнести пациента в группу больных с низким риском развития хронической сердечной недостаточности. Эхокардиографическое исследование не выявило наличие у мужчины хронической сердечной недостаточности.

Пациент Ф., 54 года, находился на стационарном лечении в ОБУЗ КГКБ СМП г. Курска с 28.09.2017 г. по 07.10.2017 г. Диагноз: сахарный диабет, 2 тип, стадия декомпенсации от 28.09.2017 г., фаза компенсации от 07.10.2017 г. Кетонурия. Индивидуальный целевой уровень HbA1c<7,0%. Целевой уровень гликемии плазмы натощак <7,0 ммоль/л, через 2 ч после еды <9,0 ммоль/л. У пациента была взята венозная кровь, при генотипировании полиморфного локуса rs4932143 (С>G) был выявлен генотип rs4932143-С/G ANPEP, что позволило отнести пациента в группу больных с высоким риском развития хронической сердечной недостаточности. Эхокардиографическое исследование подтвердило наличие у мужчины хронической сердечной недостаточности.

Пациент Б., 46 лет, находился на стационарном лечении в ОБУЗ КГКБ СМП г. Курска с 26.02.2019 г. по 07.03.2019 г. Диагноз: сахарный диабет, 2 тип, стадия декомпенсации от 26.02.2019 г., фаза компенсации от 07.03.2019 г. Индивидуальный целевой уровень HbA1c<7,0%. Целевой уровень гликемии плазмы натощак <7,0 ммоль/л, через 2 ч после еды <9,0 ммоль/л. У пациента была взята венозная кровь, при генотипировании полиморфного локуса rs4932143 (С>G) был выявлен генотип rs4932143- G/G ANPEP, что позволило отнести пациента в группу больных с высоким риском развития хронической сердечной недостаточности. Эхокардиографическое исследование подтвердило наличие у мужчины хронической сердечной недостаточности.

Применение данного способа позволит на доклиническом этапе формировать среди мужчин группы риска и своевременно реализовывать в этих группах необходимые лечебно-профилактические мероприятия по предупреждению развития хронической сердечной недостаточности у мужчин Центральной России с сахарным диабетом 2 типа.

Резюме

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что генотипы rs4932143-С/G и rs4932143-G/G ANPEP являются генетическим фактором риска развития хронической сердечной недостаточности у мужчин с сахарным диабетом 2 типа (OR=1,71).

Использование предложенного способа позволит прогнозировать развитие хронической сердечной недостаточности у мужчин с сахарным диабетом 2 типа, что даст возможность осуществлять мероприятия по профилактике данного осложнения - диспансерное наблюдение, регулярный осмотр кардиолога, контроль уровня глюкозы в крови, регулярные физические упражнения.

Изобретение относится к медицине, а именно к медицинской диагностике, и может быть использовано для прогнозирования риска развития хронической сердечной недостаточности у мужчин с сахарным диабетом 2 типа. Осуществляют забор образца периферической венозной крови и экстракцию ДНК. Проводят анализ полиморфного варианта гена аминопептидазы ANPEP rs4932143 (С>G). В случае выявления генотипов C/G или G/G прогнозируют повышенный риск формирования хронической сердечной недостаточности. При обнаружении генотипа C/С прогнозируют низкий риск. Способ обеспечивает получение новых критериев оценки риска формирования хронической сердечной недостаточности у мужчин Центральной России с сахарным диабетом 2 типа по данным о генетическом полиморфизме rs4932143 (C>G) гена ANPEP. 1 ил., 1 табл., 3 пр.

Способ прогнозирования риска развития хронической сердечной недостаточности у мужчин с сахарным диабетом 2 типа, включающий забор образца периферической венозной крови, отличающийся тем, что после экстракции ДНК проводят анализ полиморфного варианта гена аминопептидазы ANPEP rs4932143 (С>G) и прогнозируют повышенный риск формирования хронической сердечной недостаточности у мужчин Центральной России с сахарным диабетом 2 типа в случае выявления генотипов rs4932143-C/G или rs4932143-G/G, а при обнаружении генотипа rs4932143-C/С – низкий риск развития хронической сердечной недостаточности у мужчин Центральной России с сахарным диабетом 2 типа.