Способ прогнозирования риска развития сахарного диабета 2 типа у мужчин на основе генотипирования полиморфизма rs17526264 (A>T) гена GPX4 Российский патент 2025 года по МПК G01N33/49 G01N27/62 C12Q1/6804 C12Q1/6872 

Изобретение относится к области медицинской диагностики, может быть использовано для прогнозирования риска развития сахарного диабета 2 типа у мужчин.

Исследования последних лет показали, что нарушения редокс-гомеостаза являются ведущим механизмом развития сахарного диабета 2 типа [Ježek P, Dlasková A, Plecitá-Hlavatá L. Redox homeostasis in pancreatic β cells. Oxid Med Cell Longev. 2012;2012:932838. doi: 10.1155/2012/932838; Azarova I, Polonikov A, Klyosova E. Molecular Genetics of Abnormal Redox Homeostasis in Type 2 Diabetes Mellitus. Int J Mol Sci. 2023 Mar 1;24(5):4738. doi: 10.3390/ijms24054738]. Ген GPX4 кодирует глутатионпероксидазу 4, защищающую клетки от окислительного повреждения в условиях окислительного стресса [Ursini F, Maiorino M. Lipid peroxidation and ferroptosis: The role of GSH and GPx4. Free Radic Biol Med. 2020 May 20;152:175-185. doi: 10.1016/j.freeradbiomed.2020.02.027]. Согласно данным полного транскриптомного анализа GTex Portal [https://gtexportal.org/home/snp/rs17526264], полиморфный вариант rs17526264 (A>T) гена GPX4 ассоциирован со снижением экспрессии гена в различных тканях и органах человека, включая поджелудочную железу, и потому может рассматриваться как потенциальный генетический маркер предрасположенности к сахарному диабету 2 типа.

Известен cпособ прогнозирования риска развития сахарного диабета 2 типа, по патенту на изобретение EA030585B1 (публикация: 31.08.2018), включающий следующие этапы: определяют у пациента клинико-анамнестические и лабораторные данные, представляющие собой индекс массы тела (ИМТ); окружность талии (ОТ); наличие артериальной гипертензии (АГ); наличие сахарного диабета у близких родственников; триглицериды (ТГ); холестерин высокой плотности (ХС ЛВП); систолическое артериальное давление (САД) и/или диастолическое артериальное давление (ДАД); уровень сахара в крови, полученные значения оценивают с использованием балльной шкалы: ИМТ<25 кг/м2 - 0 баллов, 25-30 кг/м2 - 1 балл, >30 кг/м2 - 2 балла; ОТ у мужчин <94 см - 0 баллов, 94-102 см - 2 балла, >102 см - 3 балла; ОТ у женщин <80 см - 0 баллов, 80-88 см - 2 балла, >88 см - 3 балла; наличие АГ: нет - 0 баллов, да - 1 балл; наличие сахарного диабета у близких родственников: нет 0 баллов, да - 2 балла; выявление ТГ>1,7 ммоль/л: нет - 0 баллов, да - 1 балл; выявление ХС ЛВП>1,0 ммоль/л: нет - 1 балл, да - 0 баллов; показания САД>140 мм рт.ст. и/или ДАД>90 мм рт.ст.: нет - 0 баллов, да - 1 балл; уровень сахара в крови >5,6 ммоль/л: нет - 0 баллов, да - 3 балла, суммируют полученные баллы и при сумме баллов <8 прогнозируют низкий, а при сумме баллов >8 - высокий риск развития СД 2 типа у пациента в течение ближайших 10 лет.

Недостаток метода заключается в том, что он не учитывает индивидуальную генетическую предрасположенность к заболеванию и имеет ограничение прогноза риска развития сахарного диабета 2 типа во времени.

Известен способ прогнозирования развития сахарного диабета 2 типа у лиц, проживающих в Башкортостане (патент на изобретение RU 2 688 208 C1, дата публикации 21.05.2019), включающий выделение ДНК из лимфоцитов периферической венозной крови, генотипирование методом полимеразной цепной реакции синтеза ДНК, отличающийся тем, что проводят амплификацию участка rs2107538 гена хемокина CCL5 и участка rs6749704 гена хемокина CCL20 и при выявлении генотипов С/Т или Т/Т полиморфного локуса rs2107538 гена CCL5 или генотипа С/С полиморфного локуса rs6749704 гена CCL20 прогнозируют риск развития сахарного диабета 2 типа у обследуемого.

Недостаток метода заключается в том, что он может быть использован только для жителей Башкортостана и непригоден для прогнозирования риска развития сахарного диабета 2 типа у жителей других регионов России ввиду имеющихся межэтнических генетических различий в частотах минорных аллелей однонуклеотидных полиморфизмов и величин неравновесия по сцеплению между ними.

Известен способ прогнозирования риска развития сахарного диабета 2 типа у больных гипертонической болезнью по патенту на изобретение RU 2521202 (дата публикации 27.06.2014), включающий забор образца периферической венозной крови, выделение ДНК и анализ полиморфизма гена лимфотоксина α (+250G/A Ltα), по результатам которого прогнозируют риск развития сахарного диабета 2 типа у больных гипертонической болезнью: высокий - в случае обнаружения аллеля +250G Ltα, низкий - в случае обнаружения генотипа +250А/A Ltα.

Однако данный способ не пригоден для выявления предрасположенности к развитию сахарного диабета 2 типа у лиц без гипертонической болезни.

Наиболее близок по результату исследования способ прогнозирования риска развития сахарного диабета 2 типа у жителей Центральной России на основе генотипирования полиморфизма rs11073891 гена ANPEP (патент на изобретение RU2803636C1, дата публикации 18.09.2023), включающий забор образца периферической венозной крови и экстракцию ДНК с последующим анализом полиморфного варианта гена аминопептидазы ANPEP rs11073891 (А>С). Прогнозируют повышенный риск развития сахарного диабета 2 типа в случае выявления генотипа rs11073891-А/А, а при обнаружении генотипов rs11073891-А/С или rs11073891-С/С - низкий риск развития сахарного диабета 2 типа.

Однако данный способ не учитывает пол пациентов.

Технический результат заключается в получении критериев оценки риска развития сахарного диабета 2 типа у мужчин по данным о генетическом полиморфизме rs17526264 (A>T) гена GPX4.

Технический результат достигается тем, что после экстракции ДНК проводят анализ полиморфного варианта rs17526264 (A>T) гена GPX4 и прогнозируют повышенный риск развития сахарного диабета 2 типа в случае выявления генотипов rs17526264-A/T или rs17526264-T/T, а при обнаружении генотипа rs17526264-A/A - низкий риск развития сахарного диабета 2 типа у мужчин.

Способ осуществляют следующим образом:

1. Выделение ДНК из периферической венозной крови. На первом этапе к 0,5 мл крови добавляли 0,5 мл PBS и центрифугировали 10 мин при 12 тыс. об/мин. Надосадочную жидкость сливали, добавляли 1 мл PBS и вновь центрифугировали при тех же условиях. Надосадочную жидкость сливали, добавляли 200 мкл ТЕ-буфера, пипетировали до растворения осадка и затем последовательно добавляли 10 мкл 1% раствора додецилсульфата натрия SDS и 5 мкл протеиназы К. Пробирки инкубировали в термостате при t=37°C 12 ч. В ходе второго этапа проводили четыре последовательных центрифугирования с фенолом и хлороформом согласно протоколу методики (10 мин, 8 тыс. об/мин), после чего ДНК осаждали ледяным раствором 95% этилового спирта и центрифугировали 10 мин при 14,3 тыс. об/мин. По испарении спирта ДНК растворяли в 100 мкл деионизированной дистиллированной воды. Получаемый раствор ДНК в воде имел чистоту в диапазоне А260/280=1,5-2,0 и среднюю концентрацию около 180-200 нг/мкл. Экстрагированные из крови образцы ДНК хранились в морозильниках Thermo Fisher Scientific (США) при -20°С.

2. Подготовка образцов ДНК к генотипированию. Качество выделенной ДНК оценивали по степени чистоты и концентрации раствора на спектрофотометре NanoDrop (Thermo Fisher Scientific, США). Все анализируемые образцы ДНК были разведены деионизированной водой до концентрации 10 нг/мкл при А260/280=1,5-2,0.

3. Анализ полиморфизма rs17526264 (A>T) гена GPX4 - генотипирование методом матрично-активированной лазерной десорбционно-ионизационной масс-спектрометрии MALDI-TOF. Использовали следующие последовательности праймеров: прямой F: 5`- ACGTTGGATGGTATTCTCAGGTTGTCTGGC-3`, обратный R: 5`- ACGTTGGATGATGCTCGCTTGTGTCTAGG-3`, праймер удлинения E: 5`- tACTGCGCTGCCTCCCG-3`. Для приготовления ПЦР-микса (в расчете на один спектральный чип) в центрифужную микропробирку вносили 80,6 мкл ddH2O, 50,4 мкл 10x буфера, 40,3 мкл MgCl₂ (концентрация 25 ммоль/л), 10,1 мкл смеси дНТФ (концентрация 25 ммоль/л), 100,8 мкл смеси ПЦР-праймеров (концентрация 0,5 мкмоль/л) и 20,16 мкл HotStartTaq полимеразы (концентрация 5 ЕД/мкл). Смесь вортексировали и раскапывали в 96-луночный ПЦР-планшет по 3 мкл в лунку, после чего с помощью восьмиканального дозатора вносили по 2 мкл ДНК (концентрация 10 нг/мкл). Планшет заклеивали, центрифугировали 20 сек при 1000 об/мин и загружали в термоциклер CFX96 Bio-Rad на 125 мин при следующем режиме: денатурация 2 мин при 95°С, амплификация 44 цикла, состоящая из денатурации 30 сек при 95°С, отжига 30 сек при 56°С и элонгации 60 сек при 72°С. После чего пробы инкубировали 5 мин при 72°С. Не прореагировавшие в ходе ПЦР дНТФ удаляли с помощью реакции SAP (shrimp alkaline phosphatase), в ходе которой щелочная фосфатаза креветки гидролизовала дНТФ до нуклеозидов и фосфатов. Для приготовления SAP-микса в микропробирке смешивали 161,6 мкл ddH2O, 18 мкл 10хTS буфера и 31,7 мкл SAP фермента. Далее вносили по 2 мкл SAP-смеси в каждую лунку, планшет заклеивали, центрифугировали 20 сек при 1000 об/мин и загружали в термоциклер CFX96 Bio-Rad на 55 мин при следующем режиме: 45 мин при 37°С и 10 мин при 85°С. Для проведения третьей реакции iPLEX готовили Е-праймер-микс из расчета 8,8 мкл праймеров Е1-Е9, 11,7 мкл праймеров Е10-Е18, 14,6 мкл праймеров Е19-Е27, 17,5 мкл праймеров Е28-Е35 и 45,1 мкл ddH2O. После масс-спектрометрической оценки интенсивности пиков Е-праймеров в полученной смеси, в микс добавляли Е-праймеры в количествах, необходимых для достижения одинаковой интенсивности сигнала. Для приготовления iPLEX-микса в микропробирке смешивали 65,4 мкл ddH2O, 21,2 мкл iPLEX буфера, 21,2 мкл терминирующей смеси, 99,3 мкл Е-праймер-микса и 4,33 мкл iPLEX-фермента, вортексировали и раскапывали в лунки по 2 мкл. Планшет заклеивали, центрифугировали 20 секунд при 1000 об/мин и загружали в термоциклер CFX96 Bio-Rad на 135 мин при следующем режиме: денатурация 30 сек при 94°С, затем 40 циклов, состоящие из денатурации 5 сек при 94°С, отжига 5 сек при 52°С, элонгации 5 сек при 80°С, с последующим инкубированием в течение 3 мин при 72°С. По завершении реакции iPLEX, планшет охлаждали до +4°С, добавляли по 30 мкл воды во все лунки, центрифугировали 1 мин при 1000 об/мин и загружали в масс-спектрометр. Ввиду того, что небольшие полярные молекулы и положительно заряженные катионы натрия и калия могут образовывать аддукты с олигонуклеотидами и создавать серию контаминантных пиков, ампликоны были подвергнуты роботизированному обессоливанию путем их обработки смолой SpectroCLEAN (Agena Bioscience). Перенос образцов на спектральный чип с матрицей для ионизации осуществлялся в автоматическом режиме на рабочей станции Nanodispenser. Статистические расчеты проводили с помощью программы PLINK (Solé, X., Guinó, E., Valls, J., Iniesta, R., & Moreno, V. (2006). SNPStats: a web tool for the analysis of association studies. Bioinformatics, 22(15), 1928-1929).

4. Прогнозирование повышенного риска развития сахарного диабета 2 типа у мужчин в случае выявления генотипов rs17526264-A/T или rs17526264-T/T и пониженного риска развития этого заболевания при выявлении генотипа rs17526264-A/A.

Возможность использования предложенного способа для определения риска развития сахарного диабета 2 типа у мужчин подтверждает анализ результатов наблюдений 1187 мужчин, у 573 из которых установлен сахарный диабет 2 типа. В исследование включались лица славянской национальности Центральной России. Диагноз СД2 был установлен врачами-эндокринологами ОБУЗ ГК БСМП на основе клинического и лабораторно-инструментального обследования. Установлено, что носительство генотипов rs17526264-А/Т и rs17526264-Т/Т (OR=1,58, 95% CI 1,08-2,31, P=0,021) ассоциировалось с повышенным риском развития сахарного диабета 2 типа (таблица 1).

Таблица 1

Ассоциация полиморфного варианта rs17526264 (A>T) гена GPX4

с риском развития сахарного диабета 2 типа у мужчин

Ген
SNP ID Генотип, аллель n (%) Р_perm¹ OR (95% CI)² Контроль
(n=614) Пациенты с СД2 (n=573) GPX4
rs17526264 (A>T) A/A 556 (90,5%) 502 (87,6%) 0,021 1,58 (1,08-2,31) A/T 58 (9,4%) 67 (11,7%) T/T 0 (0%) 4 (0,7%) Т 4,7% 6,5% 0,054 1,41 (0,99-2,01) ¹Уровень значимости ассоциации;
²Отношения шансов и 95% доверительный интервал. Жирным выделены статистически значимые значения Р и OR (95% CI), аддитивная модель.

В качестве примеров конкретного применения разработанного способа приведено генетическое обследование мужчин славянского происхождения, уроженцев Центральной России и не являющихся родственниками между собой: проведено генетическое обследование по локусу rs17526264 (A>T) гена GPX4.

Донор-доброволец К.В., мужчина 48 лет обратился в ОБУЗ «Курская областная клиническая станция переливания крови» комитета здравоохранения Курской области 29.06.2016 г. для сдачи крови. Пациенту было предложено принять участие в научном исследовании для выявления генетической предрасположенности к сахарному диабету 2 типа. У мужчины была взята венозная кровь, при генотипировании полиморфного локуса rs17526264 (A>T) гена GPX4 был выявлен генотип rs17526264-А/А гена GPX4, что позволило отнести мужчину в группу лиц с низким риском развития сахарного диабета 2 типа. Анализ крови подтвердил факт отсутствия нарушений углеводного обмена: концентрация глюкозы крови натощак 4,1 ммоль/л, гликированный гемоглобин 5,0%, что соответствует норме. Дальнейшее наблюдение не выявило диагноз сахарного диабета 2 типа.

Пациенту Б.А., мужчине 54 лет, при прохождении профилактического осмотра на базе поликлиники ОБУЗ «Курской городской клинической больницы скорой медицинской помощи» 17.09.2016 г. было предложено пройти тестирование на предмет предрасположенности к сахарному диабету 2 типа. У мужчины была взята венозная кровь, при генотипировании полиморфного варианта rs17526264 (A>T) гена GPX4 был выявлен генотип rs17526264-А/Т гена GPX4, что позволило отнести пациента в группу лиц с высоким риском развития сахарного диабета 2 типа. Тем не менее, профилактические мероприятия по увеличению физической активности и формированию приверженности к здоровому питанию с целью нормализации массы тела мужчиной не проводились. С жалобами на сухость во рту, жажду до 3-4 л в сутки, увеличение диуреза до 2,5 л в сутки, учащенное мочеиспускание, слабость, головные боли, снижение остроты зрения 14.01.2018 г. пациент Б.А. был доставлен бригадой скорой медицинской помощи в эндокринологическое отделение ОБУЗ КГКБ СМП г. Курска, где получал стационарное лечение по 29.01.2018 г. При поступлении концентрация глюкозы крови составила 9,6 ммоль/л, гликированный гемоглобин 11,1%. Клинический диагноз: сахарный диабет, 2 тип, впервые выявленный, фаза декомпенсации от 14.01.2018 г., фаза компенсации от 29.01.2018 г. Индивидуальный целевой уровень HbA1c<7,0%. Целевой уровень гликемии плазмы натощак <7,0 ммоль/л, через 2 ч после еды <9,0 ммоль/л.

Пациент К.А., мужчина 33 лет, проходил медосмотр в поликлинике ОБУЗ «Курской городской клинической больницы скорой медицинской помощи» 04.09.2016 г. Мужчине было предложено пройти тестирование на предмет предрасположенности к сахарному диабету 2 типа. У мужчины была взята венозная кровь, при генотипировании полиморфного варианта rs17526264 (A>T) гена GPX4 был выявлен генотип rs17526264-Т/Т гена GPX4, что позволило отнести пациента в группу лиц с высоким риском развития сахарного диабета 2 типа. Тем не менее, профилактические мероприятия по увеличению физической активности и формированию приверженности к здоровому питанию с целью нормализации массы тела мужчиной не проводились. С жалобами на транзиторную сухость во рту, эпизодические боли ноющего характера в верхних отделах живота, головокружение, слабость, парестезии в ногах 06.12.2017 г. пациент К.А. был доставлен бригадой скорой медицинской помощи в эндокринологическое отделение ОБУЗ КГКБ СМП г. Курска, где получал стационарное лечение по 18.12.2017 г. При поступлении концентрация глюкозы крови составила 7,2 ммоль/л, гликированный гемоглобин 8,3%. Клинический диагноз: сахарный диабет, 2 тип, фаза декомпенсации от 06.12.2017 г., фаза компенсации от 18.12.2017 г. Индивидуальный целевой уровень HbA1c<6,5%. Целевой уровень гликемии плазмы натощак <6,5 ммоль/л, через 2 ч после еды <8,0 ммоль/л.

Применение данного способа позволит на доклиническом этапе формировать среди мужчин группы риска и своевременно реализовывать в этих группах необходимые лечебно-профилактические мероприятия по предупреждению развития сахарного диабета 2 типа.

Резюме

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что носительство генотипов rs17526264-А/Т и rs17526264-Т/Т GPX4 является генетическим фактором риска развития сахарного диабета 2 типа (OR=1,58, Р=0,021) у мужчин.

Использование предложенного способа позволит прогнозировать развитие сахарного диабета 2 типа у мужчин, что даст возможность осуществлять мероприятия по профилактике данного заболевания - регулярный контроль уровня глюкозы в крови, нормализацию массы тела, достаточную физическую активность, правильное питание с ежедневным включением в рацион свежих овощей и фруктов и ограничением рафинированных углеводов и жиров.

Изобретение относится к медицине, а именно к клинической лабораторной диагностике, и может быть использовано для прогнозирования риска развития сахарного диабета 2 типа у мужчин. Осуществляют забор образца периферической венозной крови. После экстракции ДНК проводят анализ полиморфного варианта rs17526264 (A>T) гена GPX4. В случае выявления генотипов rs17526264-A/T или rs17526264-T/T прогнозируют повышенный риск развития сахарного диабета 2 типа. При обнаружении генотипа rs17526264-A/A прогнозируют низкий риск развития сахарного диабета 2 типа. Способ обеспечивает получение новых критериев оценки риска развития сахарного диабета 2 типа у мужчин на основе генотипирования полиморфного варианта rs17526264 (A>T) гена GPX4. 1 табл., 3 пр.

Способ прогнозирования риска развития сахарного диабета 2 типа у мужчин, включающий забор образца периферической венозной крови, отличающийся тем, что после экстракции ДНК проводят анализ полиморфного варианта rs17526264 (A>T) гена GPX4 и прогнозируют повышенный риск развития сахарного диабета 2 типа в случае выявления генотипов rs17526264-A/T или rs17526264-T/T, а при обнаружении генотипа rs17526264-A/A – низкий риск развития сахарного диабета 2 типа у мужчин.