Способ прогнозирования риска развития синдрома диабетической стопы у жителей Центральной России с сахарным диабетом 2 типа на основе генотипирования полиморфизма rs7517862 гена ATF6 Российский патент 2024 года по МПК G01N33/48 A61B5/00 G01N33/50 C12Q1/6804 C12Q1/686 C12Q1/6876 

Изобретение относится к области медицинской диагностики, может быть использовано для прогнозирования риска развития синдрома диабетической стопы у жителей Центральной России с сахарным диабетом 2 типа.

Сахарный диабет 2 типа (СД2) является одним из наиболее распространенных метаболических нарушений во всем мире, и его развитие в первую очередь обусловлено сочетанием двух основных факторов: нарушением секреции инсулина β-клетками поджелудочной железы и неспособностью инсулинзависимых тканей реагировать на инсулин [Roden M, Shulman GI. The integrative biology of type 2 diabetes. Nature. 2019 Dec;576(7785):51-60]. Инсулин – это белковый гормон с молекулярной массой 5800 Да, который вырабатывается β-клетками поджелудочной железы, и обеспечивает регуляцию метаболизма глюкозы, жирных кислот, аминокислот. Эндоплазматический ретикулум (ЭР) является основной органеллой, ответственной за фолдинг инсулина и контроль его качества. Для поддержания гомеостаза ЭР во время стресса клетки активируют путь внутриклеточной трансдукции, называемый клеточным ответом на неупакованные белки или unfolded protein response (UPR) [Roden M, Shulman GI. The integrative biology of type 2 diabetes. Nature. 2019 Dec;576(7785):51-60. doi: 10.1038/s41586-019-1797-8]. В этом клеточном ответе принимает участие активирующий транскрипционный фактор 6, кодируемый геном ATF6, который инициирует транскрипцию генов-мишеней, а именно, генов шаперонов, ферментов модификации белков и биосинтеза липидов, компонентов ассоциированной с ЭР деградации, в результате чего увеличивается размер ЭР, активность фолдинга и деградация неправильно свернутых белков во время стресса ЭР [Haze K, Yoshida H, Yanagi H, Yura T, Mori K. Mammalian transcription factor ATF6 is synthesized as a transmembrane protein and activated by proteolysis in response to endoplasmic reticulum stress. Mol Biol Cell. 1999 Nov;10(11):3787-99. doi: 10.1091/mbc.10.11.3787; Papa F. R. Endoplasmic reticulum stress, pancreatic β-cell degeneration, and diabetes / F. R. Papa // Cold Spring Harbor perspectives in medicine. – 2012. – Vol. 2, Iss. 9. – Art. a00766.].

Согласно ресурсу GTEx portal , полиморфный вариант rs7517862 гена ATF6 снижает экспрессию ATF6 в различных тканях, что может способствовать поражению нервов и сосудов в условиях хронической гипергликемии, провоцируя развитие синдрома диабетической стопы при сахарном диабете 2 типа [Chu WS, Das SK, Wang H, Chan JC, Deloukas P, Froguel P, Baier LJ, Jia W, McCarthy MI, Ng MC, Damcott C, Shuldiner AR, Zeggini E, Elbein SC. Activating transcription factor 6 (ATF6) sequence polymorphisms in type 2 diabetes and pre-diabetic traits. Diabetes. 2007 Mar;56(3):856-62. doi: 10.2337/db06-1305].

Известен способ диагностики синдрома диабетической стопы (RU 2 750 361 C1 от 28.06.2021), включающий биохимическое исследование венозной крови у лиц с сахарным диабетом 2 типа. Согласно способу, у пациентов женского пола в возрасте 64 года и старше, страдающих сахарным диабетом 2 типа более 18 лет, при увеличении показателя креатинина 83 мкмоль/л и выше диагностируют синдром диабетической стопы.

Недостатком метода является то, что способ диагностики синдрома диабетической стопы применим только для женщин в возрасте от 64 лет и не может быть использован для мужчин и пациентов с сахарным диабетом 2 типа младше 64 лет.

Известен способ прогнозирования развития синдрома диабетической стопы у женщин с СД2 (RU 2 791 697 C1, дата публикации 13.03.2023). Для этого у пациентов женского пола с СД2 определяют возраст, длительность сахарного диабета, тип нарушения пищевого поведения (ПП), индексы вазодилатации в эндотелиальном (Kэ) и нейрогенном диапазоне (Kn). При сочетании таких факторов, как возраст старше 56,3 лет, стаж диабета более 9,1 лет, Ке ниже 0,86 и Кn ниже 1,6, показатель ограничительного пищевого поведения выше 3,11 - прогнозируют риск развития синдрома диабетической стопы у женщин с сахарным диабетом 2 типа.

Данное изобретение позволяет проводить диагностику только у пациентов женского пола, что является существенным недостатком.

Известен способ прогнозирования тяжелого течения диабетической полинейропатии и развития синдрома диабетической стопы (RU 2687978 C1, дата публикации 17.05.2019), включающий исследование сывороточного уровня тропомиозинового рецептора киназы (TrkB) методом твердофазного иммуноферментного анализа у пациента с сахарным диабетом, дополнительно определяют уровень гликированного гемоглобина в крови. В последующем высчитывают коэффициент по формуле регрессионной модели K=0,3*HbA1C+0,4*TrkB, где K - коэффициент, 0,3 - константа регрессии, HbAlC - уровень гликированного гемоглобина, 0,4 - константа регрессии, TrkB - сывороточный уровень тропомиозинового рецептора киназы типа В. Коэффициент K>5 свидетельствует о высокой вероятности тяжелого течения диабетической полинейропатии и высоком риске развития синдрома диабетической стопы.

Данный метод не является специфичным для сахарного диабета 2 типа и не учитывает генетико-этнические особенности пациентов.

Наиболее близок по результату исследования способ прогнозирования риска развития диабетической ангиопатии нижних конечностей у больных сахарным диабетом 2 типа по патенту на изобретение RU 2507520 C1 (дата публикации 20.02.2014). Данный способ включает выделение ДНК из периферической венозной крови, анализ полиморфизма -308G/A гена фактора некроза опухоли α и при выявлении аллеля -308A TNFα прогнозируют повышенный риск развития ангиопатии нижних конечностей у больных сахарным диабетом 2 типа.

Однако данный способ выявляет предрасположенность к развитию диабетической ангиопатии нижних конечностей, а не синдрома диабетической стопы у больных с сахарным диабетом 2 типа.

Технический результат заключается в получении критериев оценки риска формирования синдрома диабетической стопы у жителей Центральной России с сахарным диабетом 2 типа по данным о генетическом полиморфизме rs7517862 (G>C) гена ATF6.

Технический результат достигается тем, что после экстракции ДНК проводят анализ полиморфного варианта гена ATF6 rs7517862 (G>С) и прогнозируют повышенный риск формирования синдрома диабетической стопы у жителей Центральной России с сахарным диабетом 2 типа при выявления генотипа rs7517862-С/С, а при обнаружении генотипов rs7517862-G/G или rs7517862-G/C – низкий риск развития синдрома диабетической стопы у жителей Центральной России с сахарным диабетом 2 типа.

Способ осуществляют следующим образом:

1. Выделение ДНК из периферической венозной крови. На первом этапе к 0,5 мл крови добавляли 0,5 мл PBS и центрифугировали 10 мин при 12 тыс. об/мин. Надосадочную жидкость сливали, добавляли 1 мл PBS и вновь центрифугировали при тех же условиях. Надосадочную жидкость сливали, добавляли 200 мкл ТЕ-буфера, пипетировали до растворения осадка и затем последовательно добавляли 10 мкл 1% раствора додецилсульфата натрия SDS и 5 мкл протеиназы К. Пробирки инкубировали в термостате при t=37˚C 12 ч. В ходе второго этапа проводили четыре последовательных центрифугирования с фенолом и хлороформом согласно протоколу методики (10 мин, 8 тыс. об/мин), после чего ДНК осаждали ледяным раствором 95% этилового спирта и центрифугировали 10 мин при 14,3 тыс. об/мин. По испарении спирта ДНК растворяли в 100 мкл деионизированной дистиллированной воды. Получаемый раствор ДНК в воде имел чистоту в диапазоне А260/280=1,5-2,0 и среднюю концентрацию около 180-200 нг/мкл.

Экстракция геномной ДНК из цельной крови колоночным методом проводилась с помощью набора QIAamp DNA blood mini kit (QIAGEN, Германия) на автоматической станции QiaCube (QIAGEN, Германия). Роботизированный протокол продолжительностью 58 минут включал этап лизиса клеток 0,2 мл цельной крови с помощью лизирующего буфера и протеиназы к QIAGEN, инкубирование, перенос лизата в колонку, связывание ДНК с мембраной колонки, центрифугирование, двукратное промывание колонки буфером AW1 и AW2, центрифугирование колонки и, наконец, элюирование очищенной ДНК. Получаемый раствор ДНК в воде имел идеальную чистоту А260/280=1,7-1,9 и среднюю концентрацию около 40-50 нг/мкл. Экстрагированные из крови образцы ДНК хранились в морозильниках Thermo Fisher Scientific (США) при -20˚С.

2. Подготовка образцов ДНК к масс-спектрометрическому анализу. Качество выделенной ДНК оценивали по степени чистоты и концентрации раствора на спектрофотометре NanoDrop (Thermo Fisher Scientific, США). Все анализируемые образцы ДНК были разведены деионизированной водой до концентрации 10 нг/мкл при А260/280=1,5-2,0.

3. Анализ полиморфизма гена ATF6 - генотипирование методом матрично-активированной лазерной десорбционно-ионизационной масс-спектрометрии MALDI-TOF. Использовали следующие последовательности праймеров: прямой F: 5`- ACGTTGGATGCTCGGCAGAGTAAGTCCTAA -3`, обратный R: 5`- ACGTTGGATGAAACCCCACCTCTAGTAATC -3`, праймер удлинения E: 5`- GGCAGAGTAAGTCCTAAATAAATGTT -3`. Для приготовления ПЦР-микса (в расчете на один спектральный чип) в центрифужную микропробирку вносили 80,6 мкл ddH2O, 50,4 мкл 10x буфера, 40,3 мкл MgCl2 (концентрация 25 ммоль/л), 10,1 мкл смеси дНТФ (концентрация 25 ммоль/л), 100,8 мкл смеси ПЦР-праймеров (концентрация 0,5 мкмоль/л) и 20,16 мкл HotStartTaq полимеразы (концентрация 5 ЕД/мкл). Смесь вортексировали и раскапывали в 96-луночный ПЦР-планшет по 3 мкл в лунку, после чего с помощью восьмиканального дозатора вносили по 2 мкл ДНК (концентрация 10 нг/мкл). Планшет заклеивали, центрифугировали 20 сек при 1000 об/мин и загружали в термоциклер CFX96 Bio-Rad на 125 мин при следующем режиме: денатурация 2 мин при 95°С, амплификация 44 цикла, состоящая из денатурации 30 сек при 95°С, отжига 30 сек при 56°С и элонгации 60 сек при 72°С. После чего пробы инкубировали 5 мин при 72°С. Не прореагировавшие в ходе ПЦР дНТФ удаляли с помощью реакции SAP (shrimp alkaline phosphatase), в ходе которой щелочная фосфатаза креветки гидролизовала дНТФ до нуклеозидов и фосфатов. Для приготовления SAP-микса в микропробирке смешивали 161,6 мкл ddH2O, 18 мкл 10хTS буфера и 31,7 мкл SAP фермента. Далее вносили по 2 мкл SAP-смеси в каждую лунку, планшет заклеивали, центрифугировали 20 сек при 1000 об/мин и загружали в термоциклер CFX96 Bio-Rad на 55 мин при следующем режиме: 45 мин при 37°С и 10 мин при 85°С. Для проведения третьей реакции iPLEX готовили Е-праймер-микс из расчета 8,8 мкл праймеров Е1-Е9, 11,7 мкл праймеров Е10-Е18, 14,6 мкл праймеров Е19-Е27, 17,5 мкл праймеров Е28-Е35 и 45,1 мкл ddH2O. После масс-спектрометрической оценки интенсивности пиков Е-праймеров в полученной смеси, в микс добавляли Е-праймеры в количествах, необходимых для достижения одинаковой интенсивности сигнала. Для приготовления iPLEX-микса в микропробирке смешивали 65,4 мкл ddH2O, 21,2 мкл iPLEX буфера, 21,2 мкл терминирующей смеси, 99,3 мкл Е-праймер-микса и 4,33 мкл iPLEX-фермента, вортексировали и раскапывали в лунки по 2 мкл. Планшет заклеивали, центрифугировали 20 секунд при 1000 об/мин и загружали в термоциклер CFX96 Bio-Rad на 135 мин при следующем режиме: денатурация 30 сек при 94°С, затем 40 циклов, состоящие из денатурации 5 сек при 94°С, отжига 5 сек при 52°С, элонгации 5 сек при 80°С, с последующим инкубированием в течение 3 мин при 72°С. По завершении реакции iPLEX, планшет охлаждали до +4˚С, добавляли по 30 мкл воды во все лунки, центрифугировали 1 мин при 1000 об/мин и загружали в масс-спектрометр. Ввиду того, что небольшие полярные молекулы и положительно заряженные катионы натрия и калия могут образовывать аддукты с олигонуклеотидами и создавать серию контаминантных пиков, ампликоны были подвергнуты роботизированному обессоливанию путем их обработки смолой SpectroCLEAN (Agena Bioscience). Перенос образцов на спектральный чип с матрицей для ионизации осуществлялся в автоматическом режиме на рабочей станции Nanodispenser.

Статистические расчеты проводили с помощью программы SNPStats (Solé, X., Guinó, E., Valls, J., Iniesta, R., & Moreno, V. (2006). SNPStats: a web tool for the analysis of association studies. Bioinformatics, 22(15), 1928-1929).

4. Прогнозирование повышенного риска формирования синдрома диабетической стопы в случае выявления генотипа rs7517862-С/С ATF6, и пониженного риска развития этого осложнения сахарного диабета 2 типа при выявлении генотипов rs7517862-G/G или rs7517862-G/C гена ATF6.

Возможность использования предложенного способа для определения риска развития синдрома диабетической стопы у жителей Центральной России подтверждает анализ результатов наблюдений 1579 пациентов с СД2, у 105 из которых установлен синдром диабетической стопы. В исследование включались лица славянской национальности Центральной России. Диагноз СД2 был установлен врачами-эндокринологами ОБУЗ КГК БСМП на основе клинического и лабораторно-инструментального обследования. Установлено, что генотипы rs7517862-G/G и rs7517862-G/С значимо чаще встречались у пациентов без синдрома диабетической стопы (93%) по сравнению с больными СД2, имеющими данное осложнение основного заболевания (76%). Носительство генотипа rs7517862-С/С ATF6 ассоциировалось с повышенным риском развития синдрома диабетической стопы: OR=4,02, 95% CI 1,76-9,16, P=0,0033 (таблица 1).

Таблица 1

Ассоциация полиморфного варианта rs7517862 гена ATF6 с синдромом диабетической стопы у пациентов с сахарным диабетом 2 типа

Ген
(SNP ID) Гено-
тип Больные с СД2, n (%) Р¹ OR
(95% CI)² Без синдрома диабетической стопы
(n=115) С синдромом диабетической стопы
(n=1239) ATF6 rs7517862 G>С G/G-G/C 1222 (97,9) 91 (91,9) 0,0033 1,00 C/C 26 (2,1) 8 (8,1) 4,02 (1,76-9,16) ¹Уровень значимости ассоциации с поправками на ковариаты – возраст, пол и индекс массы тела;
²Отношения шансов и 95% доверительный интервал с поправками на ковариаты – возраст, пол и индекс массы тела.

В качестве примеров конкретного применения разработанного способа приведено генетическое обследование пациентов Центральной России, не являющихся родственниками между собой: проведено генетическое обследование по локусу rs7517862 (G>С) гена ATF6.

Пациентка С., 67 лет, находилась на стационарном лечении в ОБУЗ КГКБ СМП г. Курска с 09.10.2018 по 19.10.2018. Диагноз: сахарный диабет, 2 тип, фаза декомпенсации 09.10.2018, фаза компенсации от 19.10.2018. Индивидуальный целевой уровень HbA1c<7,5%. Целевой уровень гликемии плазмы натощак <7,5 ммоль/л, через 2 ч после еды <11,0 ммоль/л. У пациентки была взята венозная кровь, при генотипировании полиморфного локуса rs7517862 (G>С) был выявлен генотип rs7517862-С/G ATF6, что позволило отнести пациентку в группу больных с низким риском развития синдрома диабетической стопы. Дальнейшее наблюдение не подтвердило диагноз синдром диабетической стопы.

Пациент П.., 65 лет, находился на стационарном лечении в ОБУЗ КГКБ СМП г. Курска с 24.01.2019 по 04.02.2019. Диагноз: сахарный диабет, 2 тип, фаза декомпенсации от 04.02.2019, фаза компенсации от 04.02.2019. Индивидуальный целевой уровень HbA1c<7,5%. Целевой уровень гликемии плазмы натощак <7,5 ммоль/л, через 2 ч после еды <10,0 ммоль/л. У пациента была взята венозная кровь, при генотипировании полиморфного локуса rs7517862 (G>С) был выявлен генотип rs7517862-С/С ATF6, что позволило отнести пациента в группу больных с высоким риском развития синдрома диабетической стопы. Углубленное неврологическое исследование подтвердило наличие у мужчины данного заболевания.

Пациентка Ш., 83 года, находилась на стационарном лечении в ОБУЗ КГКБ СМП г. Курска с 22.02.2017 по 03.07.2017. Диагноз: сахарный диабет, 2 тип, фаза декомпенсации от 22.02.2017, фаза компенсации от 07.03.2017. Индивидуальный целевой уровень HbA1c<8,0%. Целевой уровень гликемии плазмы натощак <8,0 ммоль/л, через 2 ч после еды <11,0 ммоль/л. У пациентки Ш. была взята венозная кровь, при генотипировании полиморфного локуса rs7517862 (G>С) был выявлен генотип rs7517862-G/G ATF6, что позволило отнести пациентку в группу больных с низким риском развития синдрома диабетической стопы. Дальнейшее наблюдение не подтвердило диагноз синдром диабетической стопы.

Применение данного способа позволит на доклиническом этапе формировать среди больных диабетом 2 типа группы риска и своевременно реализовывать в этих группах необходимые лечебно-профилактические мероприятия по предупреждению развития синдрома диабетической стопы.

Резюме

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что генотип rs7517862-С/С гена ATF6 является генетическим фактором риска развития синдрома диабетической стопы у пациентов с сахарным диабетом 2 типа (OR=4,02).

Использование предложенного способа позволит прогнозировать развитие синдрома диабетической стопы у пациентов с сахарным диабетом 2 типа, что даст возможность осуществлять мероприятия по профилактике данного заболевания – диспансерное наблюдение, регулярный осмотр невролога, контроль уровня глюкозы в крови, нормализацию массы тела, достаточную физическую активность, правильное питание с ежедневным включением в рацион свежих овощей и фруктов и ограничением рафинированных углеводов и жиров.

Изобретение относится к области медицины и предназначено для прогнозирования риска развития синдрома диабетической стопы у жителей Центральной России с сахарным диабетом 2 типа. Осуществляют выделение ДНК и проводят анализ полиморфного варианта гена активирующего фактора транскрипции 6 ATF6 rs7517862 (G>С). В случае выявления генотипа rs7517862-С/С прогнозируют высокий риск развития синдрома диабетической стопы у жителей Центральной России с сахарным диабетом 2 типа. Предлагаемое изобретение обеспечивает возможность осуществления профилактических мероприятий синдрома диабетической стопы у больных сахарным диабетом 2 типа из группы риска. 1 табл., 1 пр.

Способ прогнозирования риска развития синдрома диабетической стопы у жителей Центральной России с сахарным диабетом 2 типа, включающий забор образца периферической венозной крови, отличающийся тем, что после экстракции ДНК проводят анализ полиморфного варианта гена ATF6 rs7517862 (G>C) и прогнозируют повышенный риск формирования синдрома диабетической стопы у жителей Центральной России с сахарным диабетом 2 типа в случае выявления генотипа rs7517862-C/С, а при обнаружении генотипов rs7517862-G/C или rs7517862-G/G – низкий риск развития синдрома диабетической стопы у жителей Центральной России с сахарным диабетом 2 типа.