Способ прогнозирования риска развития синдрома диабетической стопы у жителей Центральной России с сахарным диабетом 2 типа на основе генотипирования полиморфизма rs3810252 гена DNAJB1 Российский патент 2025 года по МПК G01N33/52 G01N33/49 C12Q1/6804 C12Q1/6827 C12Q1/6876 C12Q1/6883 

Изобретение относится к области медицинской диагностики, может быть использовано для прогнозирования риска развития синдрома диабетической стопы у жителей Центральной России с сахарным диабетом 2 типа.

Сахарный диабет 2 типа (СД2) - это метаболическое заболевание, прогрессирующее в своем распространении во всем мире. По прогнозам последнего издания Международного диабетического атласа число зарегистрированных случаев сахарного диабета (СД) возрастет на 84% к 2045 году, принимая за точку отсчета 2021 год, когда в мире насчитывалось 527 миллионов человек с СД в возрасте 20-79 лет [Sun H., Saeedi P., Karuranga S., Pinkepank M., Ogurtsova K., Duncan B.B., Stein C., Basit A., Chan J.C.N., Mbanya J.C., Pavkov M.E., Ramachandaran A., Wild S.H., James S., Herman W.H., Zhang P., Bommer C., Kuo S., Boyko E.J., Magliano D.J. IDF Diabetes Atlas: Global, regional and country-level diabetes prevalence estimates for 2021 and projections for 2045 // Diabetes Res Clin Pract. 2022. Vol. 183. Р. 109119. doi: 10.1016]. В Российской Федерации на момент 1 января 2024 года на учете состояло 5,21 миллионов больных, при этом на долю СД2 приходилось 92,3% пациентов (https://sd.diaregistry.ru/). СД2 характеризуется развитием инсулинорезистентности и дис- и гипофункцией β-клеток островков Лангерганса поджелудочной железы. Наличие СД2 в анамнезе пациента сопряжено с развитием многих осложнений, в том числе связанных с сердечно-сосудистой и нервной системами. К поздним осложнениям относится синдром диабетической стопы (СДС), проявляющийся в язвенно-некротическом поражении кожи, костей, суставного аппарата стоп по причине нарушения циркуляции крови и деструкции нервных волокон и окончаний.

При СД2 на клеточном уровне отмечается стресс эндоплазматического ретикулума. Он обусловлен нарушением протеостаза и перегрузкой комплекса в связи с его участием в активации клеточного ответа на неупакованные белки. Белок DNAJB1, у человека кодирующийся как HSP40 (белок теплового шока 40 кДа 1), соответствует гену DNAJB1 и участвует в ряде важных клеточных событий, таких как упаковка синтезированных белков, сборка белковых олигомеров, кроме того, он также активирует белок HSPA1A, стабилизируя сборку секретированных белков и катализируя дезагрегацию.

Ген DNAJB1 локализуется в 19 хромосоме генома человека. Согласно данным биоинформатического анализа, проведенного при помощи онлайн-ресурса GTEx Portal [URL: https://www.gtexportal.org], генотип rs3810252-G/G ассоциирован с уменьшением числа сплайсинговых форм протеинкиназы N1 (PKN1) в цельной крови (P=7,85×10^-8). Известно, что при фосфорилировании данной протеинкиназы, она может способствовать передачи сигналов инсулина в актиновый цитоскелет [Dong L.Q., Landa L.R., Wick M.J., Zhu L., Mukai H., Ono Y., Liu F. Phosphorylation of protein kinase N by phosphoinositide-dependent protein kinase-1 mediates insulin signals to the actin cytoskeleton. Proc Natl Acad Sci U S A. 2000 May 9; 97(10): 5089-94. doi: 10.1073/pnas.090491897. PMID: 10792047; PMCID: PMC25786]. При протеолитической активации протеинкиназы N1 возможна активация апоптоза [Takahashi M, Mukai H, Toshimori M, Miyamoto M, Ono Y. Proteolytic activation of PKN by caspase-3 or related protease during apoptosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 1998 Sep 29; 95(20):11566-71. doi: 10.1073/pnas.95.20.11566. PMID: 9751706; PMCID: PMC21681].

Известен способ прогнозирования развития диабетической стопы (RU 2 686 951 C1, дата публикации 06.05.2019). Он основан на исследовании состояния микроциркуляторного русла методом лазерной допплеровской флоуметрии (ЛДФ). Показатели ЛДФ измеряют на тыле стопы, рассчитывают прогностический коэффициент DS по формуле: DS=1,2-0,38×М+0,02×Kv-0,125, где М - показатель микроциркуляции, характеризующий поток эритроцитов в единицу времени через единицу объема ткани (пф. ед.), Kv - коэффициент вариации, отражающий соотношение между перфузией ткани и величиной ее изменчивости (%). При коэффициенте DS более 1,0 прогнозируют развитие диабетической стопы.

Существенным недостатком метода является то, что он не предназначен исключительно для 2 типа сахарного диабета, а применяется для всех типов, а также не рассчитан на уникальность генетического статуса пациента при наличии патологии.

Схожим по методу исследования является способ прогнозирования риска развития диабетической дистальной полинейропатии у женщин с сахарным диабетом 2 типа на основе генотипирования полиморфизма rs7784465 гена RAC1 (RU 2787273 C1, дата публ. 09.01.2023), включающий забор образца периферической венозной крови. После экстракции ДНК проводят анализ полиморфного варианта гена малой ГТФ-азы RAC1 rs7784465 (T>C) и прогнозируют повышенный риск формирования диабетической дистальной полинейропатии у женщин с сахарным диабетом 2 типа в случае выявления аллеля rs7784465-C, а при обнаружении генотипа rs7784465-Т/Т - низкий риск развития диабетической дистальной полинейропатии у женщин с сахарным диабетом 2 типа.

Однако данный способ не способен выявить предрасположенность к синдрому диабетической стопы, а также специфичен только для женщин.

Известен способ прогнозирования тяжелого течения диабетической полинейропатии (ДПН) и развития синдрома диабетической стопы (СДС) (RU 2687978 C1, дата публ. 17.05.2019). Он предполагает исследование у пациентов с сахарным диабетом сывороточного уровня тропомиозинового рецептора киназы (TrkB) методом твердофазного иммуноферментного анализа, дополнительно определяют уровень гликированного гемоглобина в крови. В последующем высчитывают коэффициент по формуле регрессионной модели K=0,3*HbA1C+0,4*TrkB, где K - коэффициент, 0,3 - константа регрессии, HbAlC - уровень гликированного гемоглобина, 0,4 - константа регрессии, TrkB - сывороточный уровень тропомиозинового рецептора киназы типа В. Коэффициент K>5 свидетельствует о высокой вероятности тяжелого течения диабетической полинейропатии и высоком риске развития синдрома диабетической стопы. Использование данного способа позволяет прогнозировать тяжесть течения диабетической полинейропатии за счет определения степени компенсации углеводного обмена, что исключает возможность выявления иной неврологической патологии, сопровождающейся демиелинизирующим процессом, а также позволяет принять заблаговременные терапевтические меры по предотвращению данных осложнений.

Недостатком метода является расчет на оценку как вероятности тяжелого течения ДПН, что не позволяет спрогнозировать риск развития СДС у пациентов с установленным 2 типом сахарного диабета.

Наиболее похожим по результату и методу проведения исследования является способ прогнозирования риска развития синдрома диабетической стопы у жителей Центральной России с сахарным диабетом 2 типа на основе генотипирования полиморфизма rs7517862 гена ATF6 по патенту RU 2811753 C1 (дата публ. 16.01.2024). Его воспроизведение достигается выделением ДНК и проводением анализа полиморфного варианта гена активирующего фактора транскрипции 6 ATF6 rs7517862 (G>С). В случае выявления генотипа rs7517862-С/С прогнозируют высокий риск развития синдрома диабетической стопы у жителей Центральной России с сахарным диабетом 2 типа.

Однако данный способ позволяет прогнозировать риск развития синдрома диабетической стопы на основе генотипирования полиморфизма гена ATF6, что может быть специфично не для всех пациентов.

Технический результат заключается в получении критериев оценки риска формирования синдрома диабетической стопы у жителей Центральной России с сахарным диабетом 2 типа по данным о генетическом полиморфизме rs3810252 (A>G) гена DNAJB1.

Технический результат достигается тем, что после экстракции ДНК проводят анализ полиморфного варианта rs3810252 (A>G) гена DNAJB1 и прогнозируют повышенный риск формирования синдрома диабетической стопы у жителей Центральной России с сахарным диабетом 2 типа при выявления генотипа rs3810252-G/G, а при обнаружении генотипов rs3810252-A/A или rs3810252-A/G - низкий риск развития синдрома диабетической стопы у жителей Центральной России с сахарным диабетом 2 типа.

Способ осуществляют следующим образом:

1. Выделение ДНК из периферической венозной крови. На первом этапе к 0,5 мл крови добавляли 0,5 мл PBS и центрифугировали 10 мин при 12 тыс. об/мин. Надосадочную жидкость сливали, добавляли 1 мл PBS и вновь центрифугировали при тех же условиях. Надосадочную жидкость сливали, добавляли 200 мкл ТЕ-буфера, пипетировали до растворения осадка и затем последовательно добавляли 10 мкл 1% раствора додецилсульфата натрия SDS и 5 мкл протеиназы К. Пробирки инкубировали в термостате при t=37°C 12 ч. В ходе второго этапа проводили четыре последовательных центрифугирования с фенолом и хлороформом согласно протоколу методики (10 мин, 8 тыс. об/мин), после чего ДНК осаждали ледяным раствором 95% этилового спирта и центрифугировали 10 мин при 14,3 тыс. об/мин. По испарении спирта ДНК растворяли в 100 мкл деионизированной дистиллированной воды. Получаемый раствор ДНК в воде имел чистоту в диапазоне А260/280=1,5-2,0 и среднюю концентрацию около 180-200 нг/мкл.

Экстракция геномной ДНК из цельной крови колоночным методом проводилась с помощью набора QIAamp DNA blood mini kit (QIAGEN, Германия) на автоматической станции QiaCube (QIAGEN, Германия). Роботизированный протокол продолжительностью 58 минут включал этап лизиса клеток 0,2 мл цельной крови с помощью лизирующего буфера и протеиназы к QIAGEN, инкубирование, перенос лизата в колонку, связывание ДНК с мембраной колонки, центрифугирование, двукратное промывание колонки буфером AW1 и AW2, центрифугирование колонки и, наконец, элюирование очищенной ДНК. Получаемый раствор ДНК в воде имел идеальную чистоту А260/280=1,7-1,9 и среднюю концентрацию около 40-50 нг/мкл. Экстрагированные из крови образцы ДНК хранились в морозильниках Thermo Fisher Scientific (США) при -20°С.

2. Подготовка образцов ДНК к масс-спектрометрическому анализу. Качество выделенной ДНК оценивали по степени чистоты и концентрации раствора на спектрофотометре NanoDrop (Thermo Fisher Scientific, США). Все анализируемые образцы ДНК были разведены деионизированной водой до концентрации 10 нг/мкл при А260/280=1,5-2,0.

3. Анализ полиморфизма гена DNAJB1 - генотипирование методом матрично-активированной лазерной десорбционно-ионизационной масс-спектрометрии MALDI-TOF. Использовали следующие последовательности праймеров: прямой F: 5'- ACGTTGGATGTTGTGCATATCAGTCCCACC -3', обратный R: 5'- ACGTTGGATGAGCAGCAAAGCTCAAGGTTC -3', праймер удлинения E: 5'- ttccgGCAGAGGGGCAAACT -3'. Для приготовления ПЦР-микса (в расчете на один спектральный чип) в центрифужную микропробирку вносили 80,6 мкл ddH2O, 50,4 мкл 10× буфера, 40,3 мкл MgCl2 (концентрация 25 ммоль/л), 10,1 мкл смеси дНТФ (концентрация 25 ммоль/л), 100,8 мкл смеси ПЦР-праймеров (концентрация 0,5 мкмоль/л) и 20,16 мкл HotStartTaq полимеразы (концентрация 5 ЕД/мкл). Смесь вортексировали и раскапывали в 96-луночный ПЦР-планшет по 3 мкл в лунку, после чего с помощью восьмиканального дозатора вносили по 2 мкл ДНК (концентрация 10 нг/мкл). Планшет заклеивали, центрифугировали 20 сек при 1000 об/мин и загружали в термоциклер CFX96 Bio-Rad на 125 мин при следующем режиме: денатурация 2 мин при 95°С, амплификация 44 цикла, состоящая из денатурации 30 сек при 95°С, отжига 30 сек при 56°С и элонгации 60 сек при 72°С. После чего пробы инкубировали 5 мин при 72°С. Не прореагировавшие в ходе ПЦР дНТФ удаляли с помощью реакции SAP (shrimp alkaline phosphatase), в ходе которой щелочная фосфатаза креветки гидролизовала дНТФ до нуклеозидов и фосфатов. Для приготовления SAP-микса в микропробирке смешивали 161,6 мкл ddH2O, 18 мкл 10×TS буфера и 31,7 мкл SAP фермента. Далее вносили по 2 мкл SAP-смеси в каждую лунку, планшет заклеивали, центрифугировали 20 сек при 1000 об/мин и загружали в термоциклер CFX96 Bio-Rad на 55 мин при следующем режиме: 45 мин при 37°С и 10 мин при 85°С. Для проведения третьей реакции iPLEX готовили Е-праймер-микс из расчета 8,8 мкл праймеров Е1-Е9, 11,7 мкл праймеров Е10-Е18, 14,6 мкл праймеров Е19-Е27, 17,5 мкл праймеров Е28-Е35 и 45,1 мкл ddH2O. После масс-спектрометрической оценки интенсивности пиков Е-праймеров в полученной смеси, в микс добавляли Е-праймеры в количествах, необходимых для достижения одинаковой интенсивности сигнала. Для приготовления iPLEX-микса в микропробирке смешивали 65,4 мкл ddH2O, 21,2 мкл iPLEX буфера, 21,2 мкл терминирующей смеси, 99,3 мкл Е-праймер-микса и 4,33 мкл iPLEX-фермента, вортексировали и раскапывали в лунки по 2 мкл. Планшет заклеивали, центрифугировали 20 секунд при 1000 об/мин и загружали в термоциклер CFX96 Bio-Rad на 135 мин при следующем режиме: денатурация 30 сек при 94°С, затем 40 циклов, состоящие из денатурации 5 сек при 94°С, отжига 5 сек при 52°С, элонгации 5 сек при 80°С, с последующим инкубированием в течение 3 мин при 72°С. По завершении реакции iPLEX, планшет охлаждали до +4°С, добавляли по 30 мкл воды во все лунки, центрифугировали 1 мин при 1000 об/мин и загружали в масс-спектрометр. Ввиду того, что небольшие полярные молекулы и положительно заряженные катионы натрия и калия могут образовывать аддукты с олигонуклеотидами и создавать серию контаминантных пиков, ампликоны были подвергнуты роботизированному обессоливанию путем их обработки смолой SpectroCLEAN (Agena Bioscience). Перенос образцов на спектральный чип с матрицей для ионизации осуществлялся в автоматическом режиме на рабочей станции Nanodispenser.

Статистические расчеты проводили с помощью программы SNPStats (Solé, X., Guinó, E., Valls, J., Iniesta, R., & Moreno, V. (2006). SNPStats: a web tool for the analysis of association studies. Bioinformatics, 22(15), 1928-1929).

4. Прогнозирование повышенного риска формирования синдрома диабетической стопы в случае выявления генотипа rs3810252-G/G DNAJB1, и пониженного риска развития этого осложнения сахарного диабета 2 типа при выявлении генотипов rs3810252-A/G или rs3810252-A/A гена DNAJB1.

Возможность использования предложенного способа для определения риска развития синдрома диабетической стопы у жителей Центральной России подтверждает анализ результатов наблюдений 1579 пациентов с СД2, у 105 из которых установлен синдром диабетической стопы. В исследование включались лица славянской национальности Центральной России. Диагноз СД2 был установлен врачами-эндокринологами ОБУЗ КГК БСМП на основе клинического и лабораторно-инструментального обследования. Установлено, что генотипы rs3810252-A/G или rs3810252-A/A значимо чаще встречались у пациентов без синдрома диабетической стопы (93%) по сравнению с больными СД2, имеющими данное осложнение основного заболевания (76%). Носительство генотипа rs3810252-G/G DNAJB1 ассоциировалось с повышенным риском развития синдрома диабетической стопы: OR=3,23, 95% CI 1,37-7,62, P=0,01 (табл. 1).

Таблица 1

Ассоциация полиморфного варианта rs3810252 гена DNAJB1 с синдромом диабетической стопы у пациентов с сахарным диабетом 2 типа

Ген
(SNP ID) Генотип Больные с СД2, n (%) Р¹ OR
(95% CI)² Без синдрома диабетической стопы
(n=115) С синдромом диабетической стопы
(n=1298) DNAJB1 rs3810252 A>G A/A 905 (69,7) 61 (58,1) 0,01 1,00 A/G 360 (27,7) 37 (35,2) 1,52 (0,99-2,34) G/G 33 (2,5) 7 (6,7) 3,23 (1,37-7,62) ¹Уровень значимости ассоциации с поправками на ковариаты - возраст, пол и индекс массы тела; ²Отношения шансов и 95% доверительный интервал с поправками на ковариаты - возраст, пол и индекс массы тела.

В качестве примеров конкретного применения разработанного способа приведено генетическое обследование пациентов Центральной России, не являющихся родственниками между собой: проведено генетическое обследование по локусу rs3810252 (A>G) гена DNAJB1.

Пациент М., 57 лет, находился на стационарном лечении в ОБУЗ Курской городской клинической больнице Скорой медицинской помощи г. Курска с 20.11.2018 по 29.11.2018. Диагноз: сахарный диабет, 2 тип, фаза декомпенсации 20.11.2018, фаза компенсации от 29.11.2018. Индивидуальный целевой уровень HbA1c<8,0%. Целевой уровень гликемии плазмы натощак <8,0 ммоль/л, через 2 ч после еды <11,0 ммоль/л. У пациента была взята венозная кровь, при генотипировании полиморфного локуса rs3810252 (A>G) был обнаружен генотип rs3810252-А/А DNAJB1, что позволило отнести пациента в группу больных с низким риском развития синдрома диабетической стопы. Дальнейшее наблюдение не подтвердило диагноз синдром диабетической стопы.

Пациент К., 68 лет, находился на стационарном лечении в ОБУЗ в ОБУЗ Курской городской клинической больнице Скорой медицинской помощи г. Курска с 13.02.2019 по 27.02.2019. Диагноз: сахарный диабет, 2 тип, фаза декомпенсации от 13.02.2019, фаза компенсации от 27.02.2019. Индивидуальный целевой уровень HbA1c<7,5%. Целевой уровень гликемии плазмы натощак <7,5 ммоль/л, через 2 ч после еды <11,0 ммоль/л. У пациента была взята венозная кровь, при генотипировании полиморфного локуса rs3810252 (A>G) был выявлен генотип rs3810252-А/G DNAJB1, что позволило отнести пациента в группу больных с низким риском развития синдрома диабетической стопы. Дальнейшее наблюдение не подтвердило диагноз синдром диабетической стопы.

Пациентка Р., 74 года, находилась на стационарном лечении в ОБУЗ Курской городской клинической больнице Скорой медицинской помощи г. Курска с 23.04.2018 по 03.05.2018. Диагноз: сахарный диабет, 2 тип, фаза декомпенсации от 23.04.2018, фаза компенсации от 02.05.2017. Индивидуальный целевой уровень HbA1c<8,0%. Целевой уровень гликемии плазмы натощак <8,5 ммоль/л, через 2 ч после еды <11,5 ммоль/л. У пациентки Р. была взята венозная кровь, при генотипировании полиморфного локуса rs3810252 (A>G) был выявлен генотип rs3810252 -G/G DNAJB1, что позволило отнести пациентку в группу больных с высоким риском развития синдрома диабетической стопы. Углубленное неврологическое исследование подтвердило наличие у женщины данного заболевания.

Применение данного способа позволит на доклиническом этапе формировать среди больных диабетом 2 типа группы риска и своевременно реализовывать в этих группах необходимые углубленные исследования, а также лечебные и профилактические мероприятия по предупреждению развития синдрома диабетической стопы.

Резюме

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что генотип rs3810252-G/G гена DNAJB1 является генетическим фактором риска развития синдрома диабетической стопы у пациентов с сахарным диабетом 2 типа (OR=3,23).

Использование предложенного способа позволит прогнозировать развитие синдрома диабетической стопы у пациентов с сахарным диабетом 2 типа, что даст возможность осуществлять мероприятия по предупреждению развития данного заболевания и его профилактике - диспансерное наблюдение, регулярный осмотр невролога, контроль уровня глюкозы в крови, нормализацию массы тела, достаточную физическую активность, правильное питание с ежедневным включением в рацион свежих овощей и фруктов и ограничением рафинированных углеводов и жиров.

Изобретение относится к медицине, а именно к медицинской диагностике, и может быть использовано для прогнозирования риска развития синдрома диабетической стопы у жителей Центральной России с сахарным диабетом 2 типа. Осуществляют забор образца периферической венозной крови. После экстракции ДНК проводят анализ полиморфного варианта rs3810252 (A>G) гена DNAJB1. В случае выявления генотипа rs3810252-G/G прогнозируют повышенный риск формирования синдрома диабетической стопы. При обнаружении генотипов rs3810252-A/A или rs3810252-A/G прогнозируют низкий риск развития синдрома диабетической стопы. Способ обеспечивает получение новых критериев оценки риска формирования синдрома диабетической стопы у жителей Центральной России с сахарным диабетом 2 типа по данным о генетическом полиморфизме rs3810252 (A>G) гена DNAJB1. 1 табл., 3 пр.

Способ прогнозирования риска развития синдрома диабетической стопы у жителей Центральной России с сахарным диабетом 2 типа, включающий забор образца периферической венозной крови, отличающийся тем, что после экстракции ДНК проводят анализ полиморфного варианта гена DNAJB1 rs3810252 (A>G) и прогнозируют повышенный риск формирования синдрома диабетической стопы у жителей Центральной России с сахарным диабетом 2 типа в случае выявления генотипа rs3810252-G/G, а при обнаружении генотипов rs3810252-A/A или rs3810252-A/G – низкий риск развития синдрома диабетической стопы у жителей Центральной России с сахарным диабетом 2 типа.