Способ прогнозирования риска развития кардиоваскулярной автономной нейропатии у пациентов с сахарным диабетом 2 типа на основе генотипирования полиморфизма rs8041622 (G>A) гена ANPEP Российский патент 2025 года по МПК G01N33/49 G01N27/62 C12Q1/6804 C12Q1/6872 

Изобретение относится к области медицинской диагностики, может быть использовано для прогнозирования риска развития кардиоваскулярной автономной нейропатии у пациентов с сахарным диабетом 2 типа (СД2).

Кардиоваскулярная автономная нейропатия (КАН) - это микрососудистое осложнение СД2, возникающее в результате повреждения симпатических и парасимпатических нервных волокон, которые иннервируют сердце и кровеносные сосуды и способствуют изменениям в вегетативной регуляции сердечно-сосудистой системы. КАН является важным фактором риска бессимптомной ишемии миокарда, хронической болезни почек, дисфункции миокарда, серьёзных сердечно-сосудистых заболеваний, аритмии и внезапной смерти [Duque, A., Mediano, M. F. F., De Lorenzo, A., & Rodrigues, L. F., Jr (2021). Cardiovascular autonomic neuropathy in diabetes: Pathophysiology, clinical assessment and implications. World journal of diabetes, 12(6), 855–867. https://doi.org/10.4239/wjd.v12.i6.855]. КАН встречается примерно у 20% людей с диабетом, а согласно недавним исследованиям, и при преддиабете (нарушении толерантности к глюкозе и/или нарушении уровня глюкозы натощак), что указывает на раннее вовлечение вегетативной нервной системы в патогенез данного осложнения СД2 [Eleftheriadou, A., Spallone, V., Tahrani, A. A., & Alam, U. (2024). Cardiovascular autonomic neuropathy in diabetes: an update with a focus on management. Diabetologia, 10.1007/s00125-024-06242-0. Advance online publication. https://doi.org/10.1007/s00125-024-06242-0]. Ген ANPEP кодирует фермент аминопептидазу N, одной из основных функций которой является участие в метаболизме глутатиона, а следовательно, в функционировании антиоксидантной системы организма [Barnieh, F. M., Loadman, P. M., & Falconer, R. A. (2021). Is tumour-expressed aminopeptidase N (APN/CD13) structurally and functionally unique? Biochimica et biophysica acta. Reviews on cancer, 1876(2), 188641. https://doi.org/10.1016/j.bbcan.2021.188641]. По данным ресурса GTEx Portal [https://gtexportal.org/home/], полиморфный вариант rs8041622 (G>A) гена ANPEP ассоциируется со значимым снижением экспрессии в нервной ткани (Р=0,000017) и сосудах (Р=0,00063) мРНК гена AP3S2, белковый продукт которого вовлечен в обеспечение транспорта везикул в нервных окончаниях. В этой связи носительство rs8041622 (G>A) гена ANPEP может рассматриваться как генетический фактор риска развития КАН у пациентов с СД2.

Известен способ прогнозирования риска развития кардиоваскулярной автономной нейропатии у пациентов с сахарным диабетом 1 типа (патент № MDS20150126A от 31.01.2017), включающий клиническое и параклиническое обследование, где устанавливаются следующие параметры: тяжесть диабетической нефропатии (ND), частота возникновения диабетического кетоацидоза (CAD), длительность сахарного диабета (DD), затем вычисляют дискриминантную функцию (F) согласно формуле: F=-4,972+1,767⋅ND+1,530⋅CAD+0,078⋅DD, в случае, когда F>0, прогнозируется риск возникновения кардиоваскулярной автономной нейропатии при сахарном диабете 1 типа, а когда F<0 - прогнозируется отсутствие риска возникновения нейропатии.

Однако данный способ не применяется при прогнозировании КАН у пациентов с сахарным диабетом 2 типа.

Известен способ диагностики кардиоваскулярной автономной нейропатии у больных сахарным диабетом, страдающих хронической сердечной недостаточностью (патент № RU 2336811 C1 от 27.10.2008), включающий регистрацию электрокардиограммы (ЭКГ) в состоянии покоя в течение 5 минут с последующим анализом вариабельности сердечного ритма, достигается тем, что в случае наличия у больного сахарным диабетом хронической сердечной недостаточности при анализе вариабельности сердечного ритма определяют стандартное отклонение интервалов между нормальными синусовыми кардиоциклами (SDNN) и при значении SDNN менее 33 мс диагностируют диабетическую кардиоваскулярную автономную нейропатию.

Данный метод не учитывает индивидуальных генетических особенностей пациентов, а также не включает прогнозирование развития КАН у людей, не имеющих других сердечно-сосудистых патологий.

Наиболее похожим по результату и методу проведения исследования является способ прогнозирования риска развития диабетической дистальной полинейропатии у женщин с сахарным диабетом 2 типа на основе генотипирования полиморфизма rs7784465 гена RAC1 по патенту RU 2787273 C1 (дата публикации 09.01.2023).

Однако данный способ позволяет прогнозировать риск развития диабетической дистальной полинейропатии у женщин с сахарным диабетом 2 типа, но не пригоден для оценки риска развития КАН у пациентов с СД2.

Технический результат заключается в получении критериев оценки риска формирования кардиоваскулярной автономной нейропатии у пациентов с сахарным диабетом 2 типа на основе генотипирования полиморфизма rs8041622 (G>A) гена ANPEP.

Технический результат достигается тем, что после экстракции ДНК проводят анализ полиморфного варианта rs8041622 (G>A) гена ANPEP и прогнозируют повышенный риск формирования кардиоваскулярной автономной нейропатии у пациентов с сахарным диабетом 2 типа в случае выявления генотипа rs8041622-А/А, а при обнаружении генотипа rs8041622-G/G или rs8041622-G/A – низкий риск развития кардиоваскулярной автономной нейропатии у пациентов с сахарным диабетом 2 типа.

Способ осуществляют следующим образом:

1. Выделение ДНК из периферической венозной крови. На первом этапе к 0,5 мл крови добавляли 0,5 мл PBS и центрифугировали 10 мин при 12 тыс. об/мин. Надосадочную жидкость сливали, добавляли 1 мл PBS и вновь центрифугировали при тех же условиях. Надосадочную жидкость сливали, добавляли 200 мкл ТЕ-буфера, пипетировали до растворения осадка и затем последовательно добавляли 10 мкл 1% раствора додецилсульфата натрия SDS и 5 мкл протеиназы К. Пробирки инкубировали в термостате при t=37°C 12 ч. В ходе второго этапа проводили четыре последовательных центрифугирования с фенолом и хлороформом согласно протоколу методики (10 мин, 8 тыс. об/мин), после чего ДНК осаждали ледяным раствором 95% этилового спирта и центрифугировали 10 мин при 14,3 тыс. об/мин. По испарении спирта ДНК растворяли в 100 мкл деионизированной дистиллированной воды. Получаемый раствор ДНК в воде имел чистоту в диапазоне А260/280=1,5-2,0 и среднюю концентрацию около 180-200 нг/мкл. Экстрагированные из крови образцы ДНК хранились в морозильниках Thermo Fisher Scientific (США) при -20°С.

2. Подготовка образцов ДНК к генотипированию. Качество выделенной ДНК оценивали по степени чистоты и концентрации раствора на спектрофотометре NanoDrop (Thermo Fisher Scientific, США). Все анализируемые образцы ДНК были разведены деионизированной водой до концентрации 10 нг/мкл при А260/280=1,5-2,0.

3. Анализ полиморфизма rs8041622 (G>A) гена ANPEP - генотипирование методом MALDI-TOF с использованием технологии iPLEХ. Использовали следующие последовательности праймеров: прямой F: 5'-ACGTTGGATGGCTTGCAGGAAGGCTTCTTA-3', обратный R: 5'-ACGTTGGATGAGAGGCGGCAGGTATTTGTG-3', праймер удлинения E: 5'-aattTGTGAACTGAAGGGACAC-3'. Праймеры для iPLEX генотипирования были синтезированы в ЗАО «Евроген» (г. Москва). Для приготовления ПЦР-микса (в расчете на один спектральный чип) в центрифужную микропробирку вносили 92,16 мкл ddH2O, 57,6 мкл 10x буфера, 46,1 мкл MgCl2 (концентрация 25 ммоль/л), 11,5 мкл смеси дНТФ (концентрация 25 ммоль/л), 115,2 мкл смеси ПЦР-праймеров (концентрация 0,5 мкмоль/л) и 23 мкл HotStartTaq полимеразы (концентрация 5 ЕД/мкл). Смесь вортексировали и раскапывали в 96-луночный ПЦР-планшет по 3 мкл в лунку, после чего с помощью восьмиканального дозатора вносили по 2 мкл ДНК (концентрация 10 нг/мкл). Планшет заклеивали, центрифугировали 20 сек при 1000 об/мин и загружали в термоциклер CFX96 Bio-Rad на 125 мин при следующем режиме: денатурация 2 мин при 95°С, амплификация 44 цикла, состоящая из денатурации 30 сек при 95°С, отжига 30 сек при 56°С и элонгации 60 сек при 72°С. После чего пробы инкубировали 5 мин при 72°С. Не прореагировавшие в ходе ПЦР дНТФ удаляли с помощью реакции SAP (shrimp alkaline phosphatase), в ходе которой щелочная фосфатаза креветки гидролизовала дНТФ до нуклеозидов и фосфатов. Для приготовления SAP-микса в микропробирке смешивали 176,3 мкл ddH2O, 19,6 мкл 10хTS буфера и 34,6 мкл SAP фермента. Далее вносили по 2 мкл SAP-смеси в каждую лунку, планшет заклеивали, центрифугировали 20 сек при 1000 об/мин и загружали в термоциклер CFX96 Bio-Rad на 55 мин при следующем режиме: 45 мин при 37°С и 10 мин при 85°С. Для проведения третьей реакции iPLEX готовили Е-праймер-микс из расчета 7 мкл праймеров Е1-Е9, 9,3 мкл праймеров Е10-Е18, 11,7 мкл праймеров Е19-Е26, 14 мкл праймеров Е27-Е34 и 47,8 мкл ddH2O. После масс-спектрометрической оценки интенсивности пиков Е-праймеров в полученной смеси, в микс добавляли Е-праймеры в количествах, необходимых для достижения одинаковой интенсивности сигнала. Для приготовления iPLEX-микса в микропробирке смешивали 71,3 мкл ddH2O, 23 мкл iPLEX буфера, 23 мкл терминирующей смеси, 108,3 мкл Е-праймер-микса и 4,7 мкл iPLEX-фермента, вортексировали и раскапывали в лунки по 2 мкл. Планшет заклеивали, центрифугировали 20 секунд при 1000 об/мин и загружали в термоциклер CFX96 Bio-Rad на 135 мин при следующем режиме: денатурация 30 сек при 94°С, затем 40 циклов, состоящие из денатурации 5 сек при 94°С, отжига 5 сек при 52°С, элонгации 5 сек при 80°С, с последующим инкубированием в течение 3 мин при 72°С. По завершении реакции iPLEX, планшет охлаждали до +4°С, добавляли по 30 мкл воды во все лунки, центрифугировали 1 мин при 1000 об/мин и загружали в масс-спектрометр. Статистические расчеты проводили с помощью программы SNPStats (Solé, X., Guinó, E., Valls, J., Iniesta, R., & Moreno, V. (2006). SNPStats: a web tool for the analysis of association studies. Bioinformatics, 22(15), 1928-1929).

4. Прогнозирование повышенного риска развития кардиоваскулярной автономной нейропатии у пациентов с сахарным диабетом 2 типа в случае выявления генотипа rs8041622-А/А и пониженного риска развития кардиоваскулярной автономной нейропатии у пациентов с сахарным диабетом 2 типа при выявлении генотипов rs8041622-G/G или rs8041622-G/A.

Возможность использования предложенного способа для определения риска развития кардиоваскулярной автономной нейропатии у пациентов с сахарным диабетом 2 типа подтверждает анализ результатов наблюдений 1564 пациентов с СД2, у 532 из которых установлена КАН. В исследование включались лица славянской национальности Центральной России. Диагноз СД2 и КАН был установлен врачами ОБУЗ ГК БСМП на основе клинического и лабораторно-инструментального обследования. Установлено, что генотип rs8041622-А/А в 4,5 раза чаще встречался у пациентов с КАН (0,9%) по сравнению с больными СД2 без КАН (0,2%) (таблица 1).

Таблица 1

Ассоциация полиморфного варианта rs8041622 гена ANPEP с кардиоваскулярной автономной нейропатией у пациентов с сахарным диабетом 2 типа

Ген
SNP ID Генотип, аллель Больные с СД2, n (%) Р¹ OR (95% CI)² Без КАН
(n=325) С КАН
(n=133) ANPEP rs8041622 (G>A) G/G-G/A 869 (99,8%) 527 (99,1%) 0,01 1,00 A/A 2 (0,2%) 5 (0,9%) 5,53 (1,04-29,32) ¹ Уровень значимости ассоциации с поправками на ковариаты – возраст и индекс массы тела;
² Отношения шансов и 95% доверительный интервал с поправками на ковариаты – пол, возраст и индекс массы тела.
СД2 – сахарный диабет 2 типа; КАН – кардиоваскулярная автономная нейропатия.

В качестве примеров конкретного применения разработанного способа приведено генетическое обследование русских пациентов, уроженцев Центральной России и не являющихся родственниками между собой: проведено генетическое обследование по локусу rs8041622 (G>A) гена ANPEP.

Пациентка Б., женщина 52 года, находилась на стационарном лечении в ОБУЗ КГКБ СМП г. Курска с 22.09.2016 г. по 03.10.2016 г. Диагноз: сахарный диабет, 2 тип, стадия декомпенсации от 22.09.2016 г., стадия компенсации от 03.10.2016 г. Индивидуальный целевой уровень HbA1c<7,0%. Целевой уровень гликемии плазмы натощак <7,0 ммоль/л, через 2 ч после еды <9,0 ммоль/л. У пациентки была взята венозная кровь, при генотипировании полиморфного локуса rs8041622 (G>A) был выявлен генотип rs8041622-А/А ANPEP, что позволило отнести пациента в группу больных с высоким риском развития кардиоваскулярной автономной нейропатии. Назначена консультация невролога и кардиолога. При углубленном обследовании пациентки выявлена кардиоваскулярная автономная нейропатия.

Пациентка З., женщина 43 лет, находилась на стационарном лечении в ОБУЗ КГКБ СМП г. Курска с 25.12.2015 г. по 05.01.2016 г. Диагноз: сахарный диабет, 2 тип, стадия декомпенсации от 25.12.2015 г., фаза компенсации от 05.01.2016 г. Индивидуальный целевой уровень HbA1c<7,0%. Целевой уровень гликемии плазмы натощак <7,0 ммоль/л, через 2 ч после еды <9,0 ммоль/л. У пациентки была взята венозная кровь, при генотипировании полиморфного локуса rs8041622 (G>A) был выявлен генотип rs8041622-G/А ANPEP, что позволило отнести пациента в группу больных с низким риском развития кардиоваскулярной автономной нейропатии. Углубленное обследование пациентки не выявило наличие признаков КАН. Регулярные обследования невролога и кардиолога не выявили КАН по настоящее время.

Пациентка Д., женщина 46 лет, находилась на стационарном лечении в ОБУЗ КГКБ СМП г. Курска с 01.04.2016 г. по 13.04.2016 г. Диагноз: сахарный диабет, 2 тип, стадия декомпенсации от 01.04.2016 г., стадия субкомпенсации от 13.04.2016 г. Индивидуальный целевой уровень HbA1c<7,0%. Целевой уровень гликемии плазмы натощак <7,0 ммоль/л, через 2 ч после еды <9,0 ммоль/л. У пациентки была взята венозная кровь, при генотипировании полиморфного локуса rs8041622 (G>A) был выявлен генотип rs8041622-G/G ANPEP, что позволило отнести пациента в группу больных с низким риском развития кардиоваскулярной автономной нейропатии. Углубленное обследование пациентки не выявило наличие признаков КАН. Регулярные обследования кардиолога и невролога не выявили КАН по настоящее время.

Применение данного способа позволит на доклиническом этапе формировать среди пациентов с СД2 группы риска и своевременно реализовывать в этих группах необходимые лечебно-профилактические мероприятия по предупреждению развития кардиоваскулярной автономной нейропатии.

Резюме

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что носительство генотипа rs8041622-А/A ANPEP является генетическим фактором риска развития кардиоваскулярной автономной нейропатии у пациентов с сахарным диабетом 2 типа (OR=5,53).

Использование предложенного способа позволит прогнозировать развитие кардиоваскулярной автономной нейропатии у пациентов с сахарным диабетом 2 типа, что даст возможность осуществлять мероприятия по профилактике данного осложнения – диспансерное наблюдение, регулярный осмотр кардиолога, невролога, регулярные физические упражнения.

Изобретение относится к медицине, а именно к клинической лабораторной диагностике, и может быть использовано для прогнозирования риска развития кардиоваскулярной автономной нейропатии у пациентов с сахарным диабетом 2 типа. Осуществляют забор образца периферической венозной крови. После экстракции ДНК проводят анализ полиморфного варианта rs8041622 (G>A) гена ANPEP. В случае выявления генотипа rs8041622-А/А прогнозируют повышенный риск развития кардиоваскулярной автономной нейропатии. При обнаружении генотипа rs8041622-G/G или rs8041622-G/A прогнозируют низкий риск развития кардиоваскулярной автономной нейропатии. Способ обеспечивает получение новых критериев оценки риска формирования кардиоваскулярной автономной нейропатии у пациентов с сахарным диабетом 2 типа на основе генотипирования полиморфизма rs8041622 (G>A) гена ANPEP. 1 табл., 3 пр.

Способ прогнозирования риска развития кардиоваскулярной автономной нейропатии у пациентов с сахарным диабетом 2 типа, включающий забор образца периферической венозной крови, отличающийся тем, что после экстракции ДНК проводят анализ полиморфного варианта rs8041622 (G>A) гена ANPEP и прогнозируют повышенный риск формирования кардиоваскулярной автономной нейропатии у пациентов с сахарным диабетом 2 типа в случае выявления генотипа rs8041622-А/А, а при обнаружении генотипа rs8041622-G/G или rs8041622-G/A – низкий риск развития кардиоваскулярной автономной нейропатии у пациентов с сахарным диабетом 2 типа.