ПРИМЕНЕНИЕ ИНЕРТНОГО ГАЗА ДЛЯ УВЕЛИЧЕНИЯ ПРОЛИФЕРАЦИИ ФИБРОБЛАСТОВ И ВЫРАБОТКИ КОЛЛАГЕНА ПРИ ОБЛУЧЕНИИ УФ Российский патент 2023 года по МПК G09B23/28 A61N5/06 

Изобретение относится к медицине и может использоваться для увеличения пролиферации фибробластов и экспрессии генов коллагена при облучении УФ.

Известно негативное воздействие солнечного УФ на фибробласты (Bruls WA, van Weelden H, van der Leun JC. Transimission of UV-radiation through human epidermal layers as a factor influencing the minimal erythema dose. Photochemistry and Photobiology. 1984; 39:6).

Преждевременное старение кожи во многом вызвано влиянием солнечного света, обусловленное уменьшением в дерме количества фибробластов, а также снижением их функциональной активности по выработке коллагеновых и эластиновых волокон (Bonamigo RR, Dornelles SIT, editors. Dermatology in Public Health Environments: A Comprehensive Textbook. New York: Springer; 2018).

Ксенон – инертный благородный газ, абсолютно не токсичен, не вступает в реакции с биологическими молекулами, не проявляет мутагенных, тератогенных, цито- и иммунотоксических свойств. В медицине используется с 1951 г. для ингаляционного наркоза. При введении в организм газ полностью выводится в течение 4-х часов (Sanders R.D., Franks N.P., Maze M. Xenon: no stranger to anaesthesia / Brit J Anaesthesia, 2003. - V.91 (5). - P.709-717). Показан лечебный эффект газа при нейротоксичности различного генеза, болезни Паркинсона, шизофрении, ишемии головного мозга (Буров Н.Е., Потапов В.Н., Макеев Г.Н. Ксенон в анестезиологии - M., Пульс., 2000. - 356 с.; Abraini J.H., David H.N., Lemaire M. Potentially Neuroprotective and Therapeutic Properties of Nitrous Oxide and Xenon - Ann. N.Y. Acad. Sci. 2005, 1053: P.289-300). Все более широко газ применяется в субнаркотических (малых) дозах для лечебного наркоза при нейротоксичности различного генеза (Abraini J.H., David H.N., Lemaire M. Potentially Neuroprotective and Therapeutic Properties of Nitrous Oxide and Xenon - Ann. N.Y. Acad. Sci. 2005, 1053: P.289-300). Ксенон эффективен и при введении в сосуды головного мозга липосом с этим газом, это способствует значительному ускорению восстановления репарации ткани головного мозга и снижению нейротоксичности после инсульта (Britton G.L., Kim Н., Кее Р.Н. et al. In Vivo Therapeutic Gas Delivery for Neuroprotection with Echogenic Liposomes / Circulation. 2010, 122(16): 1578-1587).

Известно, что инертный газ ксенон обладает антиоксидантными свойствами.

Криптон - инертный одноатомный газ без цвета, вкуса и запаха. Получают как побочный продукт в виде криптоно-ксеноновой смеси в процессе разделения воздуха на промышленных установках. В процессе разделения воздуха методом низкотемпературной ректификации производится постоянный отбор фракции жидкого кислорода, содержащей жидкие углеводороды, криптон и ксенон (отбор фракции кислорода с углеводородами необходим для обеспечения взрывобезопасности). Для извлечения криптона и ксенона из отбираемой фракции удаляют углеводороды в каталитических печах и направляют в дополнительную ректификационную колонну для удаления кислорода, после обогащения Kr+Xe смеси до 98-99 % её повторно очищают в каталитических печах от углеводородов, а затем в блоке адсорберов, заполненных силикагелем (или другим адсорбентом). После очистки смеси газов от остатков углеводородов и влаги её закачивают в баллоны для транспортировки на установку разделения Kr и Xe (это связано с тем, что не на каждом предприятии, эксплуатирующем воздухоразделительные установки, существует установка разделения Kr и Xe).

Известна композиция, способствующая выработке коллагена (патент RU 2526199, A61K 8/44, A61Q 19/00, опубл. 20.08.2014 г.). Изобретение относится к косметической промышленности и представляет собой композицию, способствующую выработке коллагена I типа в дермальных фибробластах человека, содержащую одно или несколько соединений, выбранных из группы, состоящей из D-аспарагиновой кислоты, D-аланина и/или их солей, и одну или несколько фармацевтически приемлемых добавок. Изобретение обеспечивает расширение арсенала средств, способствующих выработке коллагена I типа в дермальных фибробластах человека.

Известен состав для коррекции дефектов кожи, включающий гиалуроновую кислоту и глицерин, согласно изобретению, дополнительно содержит пальмитоил дипептид-5 диаминобутироил гидрокситреонин, пальмитоил дипептид-5 диаминогидроксибутират, пальмитоил трипептид-5, рекомбинантный фактор роста фибробластов основной, рекомбинантный эпидермальный фактор роста и питательную среду DMEM F12, причем компоненты в составе находятся в определенном соотношении, масс. % (патент RU 2659959, A61K 8/73, A61K 8/34, A61K 8/64, A61K 8/96, A61Q 19/08, опубл. 04.07.2018 г.). Изобретение обеспечивает выработку собственных компонентов, а именно гиалуроновой кислоты, коллагена и эластина, при этом обладает сильным антиоксидантным свойством и выраженным длительным эффектом коррекции кожных дефектов кожи.

Также известна трансдермальная диффузия ксенона из его водных и масляных растворов (Verkhovskiy, A. Transdermal delivery of xenon from lipophilic solution and water/ Alexander Yu. Verkhovskiy, Dmitriy N. Atochin, Sergey N. Udintsev, Sergey I. Tverdokhlebov, Yana Anfinogenova and Vladimir Yu. Serebrov //Dermatology Aspects 2015, doi: 10.7243/2053-5309-3-2;

Verkhovsky, A. Transdermal diffusion of xenon in vitro using diffusion cells / A. Verkhovsky, E. Petrov // AIP Conference Proceedings: Proceedings of the 5th International Scientific Conference "New Operational Technologies", Tomsk, 29–30 сентября 2015 года. – Tomsk: American Institute of Physics Inc., 2015. – P. 030012. – DOI 10.1063/1.4936007. – EDN WVYWTL).

Техническая задача изобретения заключается в новом применении инертного газа для увеличения пролиферации фибробластов в культуре и выработки коллагена in vitro, при этом в качестве инертного газа используют ксенон или криптон.

Применение инертного газа по заявленному изобретению также возможно при облучении ультрафиолетовым облучением.

Преимущества изобретения поясняются результатами следующего эксперимента.

Пример 1

В качестве клеточной линии использовали фибробласты китайского хомячка (линия СНО), полученные из Российской коллекции клеточных культур позвоночных Института цитологии РАН (Санкт-Петербург). Клетки инкубировали в питательной среде F12 («Панэко», Россия) с добавлением 10% инактивированной телячьей сыворотки («HyClone», США) и антибиотиками: пенициллином - 5000 ед/мл и стрептомицином - 5000 мкг/мл («Панэко», Россия). Клетки инкубировали при 37°С, 5% уровне СО₂ во влажной среде в чашках Петри.

Для оценки клеточной пролиферации использовали метод оценки в режиме реального времени с помощью системы iCelligence (RTCA Roche, Швейцария). Система автоматически рассчитывает клеточный индекс, свидетельствующий об уровне пролиферативной активности клеток. Для этого в специализированные планшеты с электродом добавляли клеточную суспензию в расчете 70 тысяч клеток на лунку.

Всего в испытании было 6 групп.

Группа 1 – контрольная,

Группа 2 – с добавлением ксенона в питательную среду,

Группа 3 - с добавлением криптона в питательную среду,

Группа 4 - контрольная группа с обработкой УФ облучения,

Группа 5 - с добавлением ксенона и УФ облучением,

Группа 6 - группа с добавлением криптона и УФ облучением.

В группах с ксеноном или криптоном (группа 2, 3, 5 и 6) через 48 часов после начала эксперимента проводили смену питательной среды F12 на среду, содержащую ксенон или криптон, соответственно. В данном эксперименте содержание ксенона в питательной среде составляло 5,6 об. %, а криптона - 0,6 об.%. В контрольных группах 1 и 4 проводили смену питательной среды на обычную среду F12, не содержащую инертные газы ксенон или криптон также через 48 часов. Для изучения влияния ксенона или криптона на пролиферацию фибробластов при облучении клеток УФ в эффективном спектральном диапазоне (280– 400 нм), через 70 часов в группах 4, 5 и 6 проводили облучение клеток УФ на расстоянии 5 см.

Таблица 1 – Клеточный индекс фибробластов хомячка в группах 1 и 2.

Время, ч Контроль, группа 1 Ксенон, группа 2 Криптон, группа 3 24 4,55 4,51 4,53 48 5,89 6,72 6,35 72 5,84 6,67 6,41 96 3,55 3,57 3,51

Полученные результаты свидетельствуют о том, что введение к питательной среде ксенона или криптона стимулирует клеточную пролиферацию в группах 2 и 3 через 48 и 72 часа.

Таблица 2 – Клеточный индекс фибробластов хомячка в группах 3 и 4.

Время, ч Контроль-УФ, группа 4 Ксенон, группа 5 Криптон, группа 6 24 4,52 4,50 4,55 48 5,59 6,85 6,38 70 (УФ облучение) 4,89 6,08 5,58 72 5,04 6,73 6,43 96 3,12 3,48 3,24

Полученные данные свидетельствуют о том, что введение к питательной среде ксенона или криптона стимулирует клеточную пролиферацию в группах 5 и 6 через 48 часов. Затем, через 70 часов УФ облучение показывает резкое снижение клеточного индекса, который значительно быстрее восстанавливается через 72 часа в группах 5 и 6, чем в группе 4.

Таким образом, добавление ксенона или криптона в питательную среду стимулирует клеточную пролиферацию как в группе без облучения, так и в группе с облучением УФ.

Пример 2

Для оценки влияния инертных газов на выработку коллагена фибробластами в обычных условиях и при УФ облучении, также в качестве клеточной линии использовали фибробласты китайского хомячка (линия СНО), полученные из Российской коллекции клеточных культур позвоночных Института цитологии РАН (Санкт-Петербург). Клетки инкубировали в питательной среде F12 («Панэко», Россия) с добавлением 10% инактивированной телячьей сыворотки («HyClone», США) и антибиотиками: пенициллином - 5000 ед/мл и стрептомицином - 5000 мкг/мл («Панэко», Россия). Клетки инкубировали при 37°С, 5% уровне СО₂ во влажной среде в чашках Петри.

В 6-луночные планшеты добавляли клеточную суспензию в расчете 200 тысяч клеток на лунку. Всего было 6 групп в исследовании. Использовали питательные среды с инертными газами в группах 2, 3, 5 и 6, которые применяли в предыдущем в эксперименте.

Группа 1 – контрольная,

Группа 2 – с добавлением ксенона в питательную среду,

Группа 3 – с добавлением криптона в питательную среду.

Группа 4 - контрольная группа с УФ облучением,

Группа 5 – группа с добавлением ксенона и УФ облучением.

Группа 6 - группа с добавлением криптона и УФ облучением.

В группах 2, 3, 5 и 6 через 24 часа после начала эксперимента проводили смену питательной среды F12 на среду, содержащую ксенон или криптон, соответственно. В контрольных группах 1 и 4 проводили смену питательной среды на обычную среду F12, не содержащую инертные газы ксенон или криптон также через 24 часа. УФ облучение клеток проводили в том же эффективном спектральном диапазоне (280– 400 нм) на расстоянии 5 см еще через сутки.

Во всех группах проводили оценку экспрессии генов коллагена 1 (Col1a1), 2 (Col1a2), 3 (Col3a1) и 4 (Col4a1, Col4a4) методом ПЦР через 72 часа после обработки клеток.

Таблица 3 - Результаты ПЦР эксперимента во всех группах.

Название группы Col1a1 Col1a2 Col3a1 Col4a1 Col4a4 Контроль, группа 1 0,44332643 0,49200955 0,49182264 0,47184665 0,49278219 Ксенон,
группа 2 0,51258534 0,53526053 0,54125905 0,4613325 0,53594548 Криптон, группа 3 0,50276625 0,52525551 0,52123565 0,4714528 0,52764849 Контроль+УФ, группа 4 0,46152199 0,49072764 0,5139519 0,45167311 0,50955559 Ксенон+УФ, группа 5 0,49788617 0,55391219 0,571384 0,46968956 0,52366877 Криптон+УФ, группа 6 0,48768719 0,53563220 0,56678433 0,45758694 0,51556989

Полученные данные свидетельствуют о том, что заметно возрастает экспрессия генов Col1a1, Col1a2, Col3a1, Col4a4 в группах 2 и 3, 5 и 6 по сравнению с контрольными группами 1 и 4. Экспрессия генов коллагена Col4a1 практически не меняется в данном исследовании. Статистически значимые отличия (р <0,05) от групп контроля показаны на Фиг. 1

Таким образом, ксенон или криптон увеличивает экспрессию генов синтеза коллагена, в том числе при облучении УФ.

Изобретение относится к медицине и может быть использовано для увеличения пролиферации фибробластов в культуре и выработки коллагена in vitro. Применение включает использование инертного газа, при этом в качестве инертного газа используют ксенон или криптон. Применение инертного газа по заявленному изобретению также возможно при воздействии ультрафиолетового облучения. Использование изобретения позволяет достичь увеличения клеточной пролиферации и экспрессии генов синтеза коллагена. 1 з.п. ф-лы, 3 табл., 2 пр.

1. Применение инертного газа для увеличения пролиферации фибробластов в культуре и выработки коллагена in vitro, при этом в качестве инертного газа используют ксенон или криптон.

2. Применение инертного газа по п.1 при воздействии ультрафиолетовым облучением.