АНТИТЕЛА В7-Н4 И СПОСОБЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ Российский патент 2023 года по МПК C07K16/28 C07K16/30 A61K39/395 

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА схожие ЗАЯВКИ

По настоящей заявке испрашивается приоритет предварительной заявки на патент США № 62/620545, поданной 23 января 2018 года, содержание которой полностью включено в данную заявку посредством ссылки.

ССЫЛКА НА ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

Перечень последовательностей, представленный на рассмотрение 23 января 2019 года в виде текстового файла с названием «064467.005PCT_seqlist_ST25», созданного 23 января 2019 года и имеющего размер 357 МБ, включен в данный документ посредством ссылки в соответствии с разделом 37 Кодекса Федеральных законов и подзаконных актов США (C.F.R.) § 1,52 (e)(5).

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Изобретение в целом относится к области иммуномодуляции, и в частности - к композициям и способам модуляции трансдукции сигналов B7-H4 для усиления или ослабления иммунного ответа.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Семейство В7 играет важную роль как в положительной, так и в отрицательной регуляции иммунных ответов, путем вовлечения целого ряда различных рецепторов на лимфоцитах (Rahbar, R. et al., Cancer Immunol. Res, 3(2):184-195(2015)). Белок B7-H4 (также называемый VTCN1, или B7x, или B7S1) является членом семейства B7 и ингибирует функцию Т-клеток. Уровень экспрессии B7-H4 также повышен в ряде различных опухолей, и было предположено, что он стимулирует рост опухолей. Высокая экспрессия B7-H4 обнаруживается во многих опухолевых тканях, обеспечивая корреляцию уровня экспрессии на опухолевых клетках с неблагоприятными клинико-патологическими особенностями, включая агрессивность опухоли.

Биологическая активность B7-H4 была связана с ослабленным воспалительным ответом CD4+ Т-клеток и с корреляцией между макрофагами, ассоциированными с опухолью, экспрессирующими B7-H4, и регуляторными FoxP3+ Т-клетками (Treg) в микроокружении опухоли. Поскольку В7-Н4 экспрессируется на поверхности опухолевых клеток и макрофагов, ассоциированных с опухолью, в различных видах рака, терапевтическая блокада В7-Н4 может благоприятно изменить микроокружение опухоли, обеспечивая антиген-специфическое выведение опухолевых клеток (Podojil, JR. и Miller, SD, Immunol Rev, 276(1):40-51 (2017)).

Комплементарная ДНК (кднк), кодирующая белок B7-H4 человека, была идентифицирована и клонирована из плацентарной кднк (Sica, G. L. et al. (2003) "B7-H4, A Molecule Of The B7 Family, Negatively Regulates T Cell Immunity" («B7-H4, молекула семейства В7 отрицательно регулирует Т-клеточный иммунитет»), Immunity 18:849-861; Zang, X. et al. (2003) "B7x: A Widely Expressed B7 Family Member That Inhibits T Cell Activation" («B7x: широко экспрессирующийся член семейства B7, который ингибирует активацию Т-клеток») Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 100:10388- 10392). B7-H4 рассматривается в патентах США №№ 7931896; 7875702; 7847081; и 7622565.

Анти-B7-H4 антитела описаны в патентах США №№ 9574000; 7888477; 7737255; 7619068 и 6962980.

Белок B7-H4 человека содержит 282 аминокислотных остатка, которые были классифицированы как включающие аминотерминальный внеклеточный домен, большой гидрофобный трансмембранный домен и очень короткий внутриклеточный домен (состоящий всего из 2 аминокислотных остатков). Как и другие члены семейства B7, B7-H4 обладает парой Ig-подобных участков во внеклеточном домене. Белок B7-H4 имеет общую структуру трансмембранного белка типа I. Этот белок имеет минимальную (около 25%) гомологию с другими членами семейства B7 (Zang, X. et al. (2003) "B7x: A Widely Expressed B7 Family Member That Inhibits T Cell Activation" («B7x: широко экспрессирующийся член семейства B7, который ингибирует активацию Т-клеток»), Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 100:10388-10392).

B7-H4 также экспрессируется на макрофагах, ассоциированных с опухолью (МАО). МАО ингибируют противоопухолевый иммунный ответ посредством высвобождения гуморальных медиаторов, а также защищают опухоли от иммунного распознавания, препятствуя клеточно-опосредованному иммунному ответу посредством экспрессии на клеточной поверхности ингибирующих молекул, таких как B7-H4. Макрофаги, ассоциированные с опухолью, происходят из резидентных макрофагов или из моноцитов, мобилизованных микроокружением опухоли и поляризованных в месте опухоли. Инфильтрация опухоли макрофагами, ассоциированными с опухолью, была связана с низкой выживаемостью пациентов; а целенаправленное воздействие на макрофаги, ассоциирующиеся с опухолью, представляет собой многообещающую стратегию борьбы с раком. Уже разработано несколько подходов к решению этой задачи, включая деплетирование с помощью клодронат-содержащих липосом; ингибирование мобилизации опухоли с помощью целенаправленного воздействия CFSR-1 и CCL2; и «переобучение» посредством активации с помощью анти-CD40 антител класса М либо белка плазмы крови, являющегося гликопротеином, обогащенным гистидином (HRG), либо маннозного рецептора (Dangai, D. et al., Cancer Res, 73(15): 4820-4829 (2013)).

Поскольку при различных типах рака B7-H4 экспрессируется на опухолевых клетках и макрофагах, ассоциирующихся с опухолью, направленность терапевтических мер против B7-H4 может иметь огромные синергические результаты в благоприятном изменении микроокружения опухоли и устранении раковых клеток. Таким образом, возникает потребность в новых иммуномодуляторах В7-Н4.

Поэтому одной целью данного изобретения является создание композиций, которые ингибируют опосредованную B7-H4 трансдукцию ингибирующего сигнала, чтобы тем самым усилить или стимулировать иммунологический ответ путем ингибирования трансдукции подавляющего сигнала B7-H4. Такие композиции полезны для лечения онкологических и инфекционных заболеваний.

Другой целью данного изобретения является создание композиций, которые усиливают опосредованную B7-H4 трансдукцию ингибирующего сигнала, тем самым стимулируя ослабленный иммунологический ответ.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Приведены композиции и способы их применения для модулирования трансдукции сигналов B7-H4. Такие композиции полезны для лечения воспалительных заболеваний и поражений воспалительного характера, а также аутоиммунных заболеваний. В одном варианте реализации данного изобретения предусмотрены иммуномодулирующие агенты, которые снижают экспрессию B7-H4, связывание лиганда, сшивание, трансдукцию сигнала или их комбинацию. В одном варианте реализации данного изобретения иммуномодулирующие агенты специфически связываются с B7-H4. Иммуномодулирующими агентами могут быть антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, слитые белки, аптамеры или агенты, которые специфически связывают B7-H4 и модулируют трансдукцию сигнала посредством сигнального каскада B7-H4. Модуляция включает в себя усиление трансдукции сигнала посредством сигнального каскада B7-H4 или ингибирование трансдукции сигнала посредством сигнального каскада B7-H4.

В одном варианте реализации данного изобретения предложен способ лечения инфекции у больного, путем введения агента, который ингибирует или блокирует ослабленный иммунный ответ B7-H4, в количестве, которое эффективно увеличивает образование нейтрофилов и/или повышает врожденный иммунитет. Описанные агенты могут применяться для усиления иммунного ответа у больного, путем ингибирования B7-H4-опосредованной супрессии иммунного ответа. Иммунный ответ может быть, например, первичным иммунным ответом на антиген или усилением функции эффекторных клеток, таким как увеличение антигенспецифической пролиферации Т-клеток, усиление продуцирования цитокинов Т-клетками, стимуляция дифференцировки, увеличение количества нейтрофилов, или комбинация указанных иммунных механизмов. Иллюстративные агенты включают (i) растворимый полипептид B7-H4 или слитый белок; (ii) функцию, блокирующую анти-B7-H4 антитело; (iii) антитело, которое может применяться для деплетирования B7-H4-положительных клеток; и (iv) комбинации указанных агентов. В некоторых вариантах реализации данного изобретения иммуномодулирующий агент является антагонистом B7-H4.

В конкретных вариантах реализации данного изобретения указанный агент представляет собой белок, слитый с B7-H4, например слитый белок, который включает внеклеточный домен B7-H4 или его функциональный вариант, связанный с доменом иммуноглобулина. Иллюстративный слитый белок включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1 или ее фрагмент.

В других вариантах реализации данного изобретения указанный агент представляет собой белок B7-H4 или его функциональный фрагмент или вариант. Например, белок B7-H4 или его функциональный фрагмент, или вариант могут иметь последовательность, которая, по меньшей мере, на 80%, 90%, 95% или 100% идентична последовательности SEQ ID NO:l. В одном варианте реализации данного изобретения белки B7-H4 или полипептиды модулируют трансдукцию сигнала посредством сигнального каскада B7-H4 путем специфического связывания с лигандом B7-H4.

В других вариантах реализации данного изобретения указанный агент представляет собой растворимый белок B7-H4 или его функциональный фрагмент, или вариант. Например, растворимый белок B7-H4 может состоять из внеклеточного домена B7-H4 или его функционального фрагмента, или варианта.

Способы усиления иммунного ответа у субъекта, как правило, включают введение субъекту, который в этом нуждается, эффективного количества иммуномодулирующего агента, который уменьшает экспрессию B7-H4, связывание лиганда, сшивание, трансдукцию сигнала или их комбинацию. У такого субъекта может быть, например, рак или инфекционное заболевание.

В некоторых вариантах реализации данного изобретения такой субъект, рак или заболевание, характеризуется повышенной экспрессией B7-H4, повышенной экспрессией лиганда B7-H4 или их комбинацией. В конкретных вариантах реализации данного изобретения рак представляет собой рак яичников, рак молочной железы, рак легких, рак щитовидной железы, рак желудочно-кишечного тракта, острый миелоидный лейкоз (ОМЛ), острый лимфоидный лейкоз (олл), рак эндометрия, рак головного мозга, рак головы и шеи, рак поджелудочной железы и рак мочевого пузыря. Агент можно вводить одновременно или в комбинации с вакциной или ее компонентом.

Также предусмотрены иммуномодулирующие агенты, повышающие экспрессию B7-H4, связывание лиганда, сшивание, трансдукцию иммуносупрессирующего сигнала или их комбинацию. Такие агенты могут применяться для ослабления иммунного ответа у больного, индуцируя или усиливая иммунный ответ, ослабленный B7-H4. Иллюстративные иммуномодулирующие агенты включают функцию, активирующую анти-B7-H4 антитело или растворимый полипептид B7-H4.

Способы ослабления иммунного ответа у субъекта, как правило, включают введение субъекту, который в этом нуждается, эффективного количества иммуномодулирующего агента, который увеличивает экспрессию B7-H4, связывание лиганда, сшивание, отрицательную сигнализацию или их комбинацию. В некоторых вариантах реализации данного изобретения у такого субъекта имеется воспаление или аутоиммунное заболевание. В конкретном варианте реализации данного изобретения у такого субъекта имеется ревматоидный артрит.

В некоторых вариантах реализации данного изобретения такой субъект, или заболевание, или состояние характеризуется уменьшенной экспрессией B7-H4.

Любой из описанных способов может включать в себя введение субъекту иммуномодулирующего агента в виде монотерапии или в комбинации с одним или большим количеством дополнительных терапевтических агентов.

В одном варианте реализации данного изобретения предложен способ лечения лейкоза у больного, путем введения этому субъекту эффективного количества фармацевтической композиции, содержащей моноклональное антитело B7-H4, растворимый полипептид B7-H4, белок, слитый с B7-H4, или их комбинации, с целью ингибировать или уменьшить трансдукцию сигнала B7-H4 в лейкозных клетках и тем самым ингибировать выживание лейкозных клеток или стимулировать противоопухолевый иммунный ответ на лейкозные клетки. Указанный лейкоз может быть острым миелоидным лейкозом.

В одном варианте реализации данного изобретения предложен способ оценки или прогнозирования эффективности лечения с помощью анти-B7-H4 связывающего фрагмента молекулы путем анализа клеток субъекта, нуждающегося в лечении, с целью определить, экспрессируют ли клетки белок B7-H4, связывающие партнеры белка B7-H4, или и то, и другое. Иллюстративные клетки, которые подвергаются анализу, включают в себя (но не ограничиваются ими) раковые клетки, полученные из организма субъекта. Примеры раковых клеток включают (но не ограничиваются ими) клетки острого миелоидного лейкоза (ОМЛ), рака эндометрия, рака головного мозга, рака головы и шеи, и рака поджелудочной железы.

В одном варианте реализации данного изобретения предложено анти-B7-H4 моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, который имеет легкую цепь, последовательность которой, по меньшей мере, на 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или 100% идентична последовательности SEQ ID NO:3.

В одном варианте реализации данного изобретения предложена нуклеиновая кислота, которая кодирует легкую цепь, соответствующую последовательности SEQ ID NO:3. В другом варианте реализации данного изобретения предложена нуклеиновая кислота, последовательность которой, по меньшей мере, на 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или 100% идентична последовательности SEQ ID NO:7.

В одном варианте реализации данного изобретения предложено анти-B7-H4 моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, который имеет тяжелую цепь, последовательность которой, по меньшей мере, на 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или 100% идентична последовательности SEQ ID NO:8.

В одном варианте реализации данного изобретения предложена нуклеиновая кислота, кодирующая тяжелую цепь, соответствующую последовательности SEQ ID NO:8. В другой варианте реализации данного изобретения предложена нуклеиновая кислота, последовательность которой, по меньшей мере, на 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или 100% идентична последовательности SEQ ID NO:12.

В одном варианте реализации данного изобретения предложено анти-B7-H4 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, который имеет легкую цепь, содержащую участки, определяющие комплементарность (CDR), в соответствии с последовательностями SEQ ID NO:4, 5 и 6.

В другом варианте реализации данного изобретения предложено анти-B7-H4 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, имеющий тяжелую цепь, содержащую участки, определяющие комплементарность, в соответствии с последовательностями SEQ ID NO:9, 10 и 11.

В одном варианте реализации данного изобретения предложено анти-B7-H4 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, имеющий легкую цепь, содержащую участки, определяющие комплементарность, в соответствии с последовательностями SEQ ID NO:4, 5 и 6, и тяжелую цепь, содержащую участки, определяющие комплементарность, в соответствии с последовательностями SEQ ID NO:9, 10 и 11.

В одном варианте реализации данного изобретения предложено анти-B7-H4 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащий легкую цепь, последовательность которой, по меньшей мере, на 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или 100% идентична последовательности SEQ ID NO:3, и тяжелую цепь, последовательность которой, по меньшей мере, на 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или 100% идентична последовательности SEQ ID NO:8.

В другом варианте реализации данного изобретения предложено анти-B7-H4 моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащий легкую цепь, последовательность которой, по меньшей мере, на 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или 100% идентична последовательности SEQ ID NO:13.

В одном варианте реализации данного изобретения легкая цепь антитела содержит участки, определяющие комплементарность, с аминокислотными последовательностями, соответствующими последовательностям SEQ ID NO:14, 15 и 16.

В одном варианте реализации данного изобретения предложена тяжелая цепь антитела, последовательность которой, по меньшей мере, на 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% или 100% идентична последовательности SEQ ID NO:29.

В другом варианте реализации данного изобретения предложена тяжелая цепь антитела, содержащая участки, определяющие комплементарность, с аминокислотными последовательностями, соответствующими последовательностям SEQ ID NO:9, 11 и 30.

В одном варианте реализации данного изобретения предложено анти-B7-H4 моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащий участки, определяющие комплементарность, легкой цепи в соответствии с последовательностями SEQ ID NO:14, 15 и 16, и участки, определяющие комплементарность, тяжелой цепи в соответствии с последовательностями SEQ ID NO:9, 11 и 30.

В одном варианте реализации данного изобретения предложено анти-В7-Н4 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащий легкую цепь, последовательность которой, по меньшей мере, на 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или 100% идентична последовательности SEQ ID NO:13, и тяжелую цепь, последовательность которой, по меньшей мере, на 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или 100% идентична последовательности SEQ ID NO:29.

В одном варианте реализации данного изобретения предложена легкая цепь анти-B7-H4 антитела, последовательность которой, по меньшей мере, на 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или 100% идентична последовательности SEQ ID NO:46.

В другом варианте реализации данного изобретения предложена легкая цепь анти-B7-H4 антитела, содержащая участки, определяющие комплементарность, с аминокислотными последовательностями, соответствующими последовательностям SEQ ID NO:14, 16 и 47.

В одном варианте реализации данного изобретения предложена тяжелая цепь антитела, последовательность которой, по меньшей мере, на 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или 100% идентична последовательности SEQ ID NO:49.

В другом варианте реализации данного изобретения предложена тяжелая цепь антитела, содержащая участки, определяющие комплементарность, с аминокислотными последовательностями, соответствующими последовательностям SEQ ID NO:9, 11 и 47.

В одном варианте реализации данного изобретения предложено антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащий участки, определяющие комплементарность, легкой цепи в соответствии с последовательностями SEQ ID NO:14, 16 и 47, и участки, определяющие комплементарность, тяжелой цепи в соответствии с последовательностями SEQ ID NO:9, 11 и 50.

В одном варианте реализации данного изобретения предложено анти-В7-Н4 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащий легкую цепь, последовательность которой, по меньшей мере, на 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или 100% идентична последовательности SEQ ID NO:46, и тяжелую цепь, последовательность которой, по меньшей мере, на 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или 100% идентична последовательности SEQ ID NO:49.

В одном варианте реализации данного изобретения предложена легкая цепь антитела, последовательность которой, по меньшей мере, на 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или 100% идентична последовательности SEQ ID NO:52.

В другом варианте реализации данного изобретения легкая цепь антитела содержит участки, определяющие идентичность, с аминокислотными последовательностями, соответствующими последовательностям SEQ ID NO:53, 54 и 55.

В одном варианте реализации данного изобретения предложена тяжелая цепь антитела, последовательность которой, по меньшей мере, на 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или 100% идентична последовательности SEQ ID NO:65.

В другом варианте реализации данного изобретения предложена тяжелая цепь антитела, содержащая участки, определяющие идентичность, с аминокислотными последовательностями, соответствующими последовательностям SEQ ID NO:66, 67 и 68.

В одном из вариантов реализации изобретения предложено анти-В7-Н4 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащий участки, определяющие комплементарность, легкой цепи в соответствии с последовательностями SEQ ID NO:53, 54, и 55, и участки, определяющие комплементарность, тяжелой цепи в соответствии с последовательностями SEQ ID NO:66, 67 и 68.

В одном варианте реализации данного изобретения предложено антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащих легкую цепь, последовательность которой, по меньшей мере, на 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или 100% идентична последовательности SEQ ID NO:52, и тяжелую цепь, последовательность которой, по меньшей мере, на 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или 100% идентична последовательности SEQ ID NO:65.

В одном варианте реализации данного изобретения предложена легкая цепь антитела, последовательность которой, по меньшей мере, на 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или 100% идентична последовательности SEQ ID NO:85.

В другом варианте реализации данного изобретения предложена легкая цепь антитела, содержащая участки, определяющие идентичность, с аминокислотными последовательностями, соответствующими последовательностям SEQ ID NO:4, 86 и 87.

В одном варианте реализации данного изобретения предложена тяжелая цепь антитела, последовательность которой, по меньшей мере, на 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или 100% идентична последовательности SEQ ID NO:89.

В одном варианте реализации данного изобретения предложена тяжелая цепь антитела, содержащая участки, определяющие комплементарность, с аминокислотными последовательностями, соответствующими последовательностям SEQ ID NO:9, 90 и 91.

В другом варианте реализации данного изобретения предложено анти-B7-H4 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащий участки, определяющие комплементарность, легкой цепи в соответствии с последовательностями SEQ ID NO:4, 86 и 87, и участки, определяющие комплементарность, тяжелой цепи в соответствии с последовательностями SEQ ID NO:9, 90 и 91.

В одном варианте реализации данного изобретения предложено анти-В7-Н4 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащий легкую цепь, последовательность которой, по меньшей мере, на 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или 100% идентична последовательности SEQ ID NO:85, и тяжелую цепь, последовательность которой, по меньшей мере, на 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или 100% идентична последовательности SEQ ID NO:89.

В одном варианте реализации данного изобретения предложена легкая цепь антитела, последовательность которой, по меньшей мере, на 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или 100% идентична последовательности SEQ ID NO:93.

В другом варианте реализации данного изобретения предложена легкая цепь антитела, содержащая участки, определяющие комплементарность, с аминокислотными последовательностями, соответствующими последовательностям SEQ ID NO:94, 95 и 96.

В одном варианте реализации данного изобретения предложена тяжелая цепь антитела, последовательность которой, по меньшей мере, на 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или 100% идентична последовательности SEQ ID NO:98.

В другом варианте реализации данного изобретения предложена тяжелая цепь антитела, содержащая участки, определяющие комплементарность, с аминокислотными последовательностями, соответствующими последовательностям SEQ ID No 9, 99 и 100.

В одном варианте реализации данного изобретения предложено анти-В7-Н4 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащий участки, определяющие комплементарность, легкой цепи в соответствии с последовательностями SEQ ID NO:94, 95, и 96, и участки, определяющие комплементарность, тяжелой цепи в соответствии с последовательностями SEQ ID NO:9, 99, и 100.

В одном варианте реализации данного изобретения предложено анти-В7-Н4 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащий легкую цепь, последовательность которой, по меньшей мере, на 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или 100% идентична последовательности SEQ ID NO:93, и тяжелую цепь, последовательность которой, по меньшей мере, на 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или 100% идентична последовательности SEQ ID NO:98.

В одном варианте реализации данного изобретения предложена легкая цепь антитела, последовательность которой, по меньшей мере, на 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или 100% идентична последовательности SEQ ID NO:102.

В другом варианте реализации данного изобретения предложена легкая цепь антитела, содержащая участки, определяющие комплементарность, с аминокислотными последовательностями, соответствующими последовательностям SEQ ID NO:103, 104 и 105.

В одном варианте реализации данного изобретения предложена тяжелая цепь антитела, последовательность которой, по меньшей мере, на 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или 100% идентична последовательности SEQ ID NO:107.

В другом варианте реализации данного изобретения предложена тяжелая цепь антитела, содержащая участки, определяющие комплементарность, с аминокислотными последовательностями, соответствующими последовательностям SEQ ID NO:9, 108 и 109.

В одном варианте реализации данного изобретения анти-В7-Н4 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит участки, определяющие комплементарность, легкой цепи в соответствии с последовательностями SEQ ID NO:103, 104, и 105, и участки, определяющие комплементарность, тяжелой цепи в соответствии с последовательностями SEQ ID NO:9, 108 и 109.

В одном варианте реализации данного изобретения предложено анти-В7-Н4 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащий легкую цепь, последовательность которой, по меньшей мере, на 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или 100% идентична последовательности SEQ ID NO:102, и тяжелую цепь, последовательность которой, по меньшей мере, на 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или 100% идентична последовательности SEQ ID NO:107.

В одном варианте реализации данного изобретения предложена легкая цепь антитела, последовательность которой, по меньшей мере, на 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или 100% идентична последовательности SEQ ID NO:111.

В другом варианте реализации данного изобретения предложена легкая цепь антитела, содержащая участки, определяющие комплементарность, с аминокислотными последовательностями, соответствующими последовательностям SEQ ID NO:95, 112 и 113.

В одном варианте реализации данного изобретения предложена тяжелая цепь антитела, последовательность которой, по меньшей мере, на 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или 100% идентична последовательности SEQ ID NO:115.

В одном варианте реализации данного изобретения предложена тяжелая цепь антитела, содержащая участки, определяющие комплементарность, с аминокислотными последовательностями, соответствующими последовательностям SEQ ID NO:116, 117 и 118.

В одном варианте реализации данного изобретения анти-B7-H4 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит участки, определяющие комплементарность, легкой цепи в соответствии с последовательностями SEQ ID NO:95, 112 и 113, и участки, определяющие комплементарность, тяжелой цепи в соответствии с последовательностями SEQ ID NO:116, 117 и 118.

В одном варианте реализации данного изобретения предложено анти-В7-Н4 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащий легкую цепь, последовательность которой, по меньшей мере, на 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или 100% идентична последовательности SEQ ID NO:111, и тяжелую цепь, последовательность которой, по меньшей мере, на 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или 100% идентична последовательности SEQ ID NO:115.

В одном варианте реализации данного изобретения предложена легкая цепь антитела, последовательность которой, по меньшей мере, на 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или 100% идентична последовательности SEQ ID NO:120.

В другом варианте реализации данного изобретения предложена легкая цепь антитела, содержащая участки, определяющие комплементарность, с аминокислотными последовательностями, соответствующими последовательностям SEQ ID NO:54, 55 и 121.

В одном варианте реализации данного изобретения предложена тяжелая цепь антитела, последовательность которой, по меньшей мере, на 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или 100% идентична последовательности SEQ ID NO:123.

В другом варианте реализации данного изобретения предложена тяжелая цепь антитела, содержащая участки, определяющие комплементарность, с аминокислотными последовательностями, соответствующими последовательностям SEQ ID NO:66, 124 и 125.

В одном варианте реализации данного изобретения предложено анти-В7-Н4 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащий участки, определяющие комплементарность, легкой цепи в соответствии с последовательностями SEQ ID NO:54, 55 и 121, и участки, определяющие комплементарность, тяжелой цепи в соответствии с последовательностями SEQ ID NO:66, 124 и 125.

В одном варианте реализации данного изобретения предложено анти-В7-Н4 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащий легкую цепь, последовательность которой, по меньшей мере, на 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или 100% идентична последовательности SEQ ID NO:120, и тяжелую цепь, последовательность которой, по меньшей мере, на 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или 100% идентична последовательности SEQ ID NO:123.

В одном варианте реализации данного изобретения предложена тяжелая цепь анти-B7-H4 антитела, последовательность которой, по меньшей мере, на 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или 100% идентична последовательности SEQ ID NO:128.

В другом варианте реализации данного изобретения предложена тяжелая цепь анти-B7-H4 антитела, содержащая участки, определяющие комплементарность, с аминокислотными последовательностями, соответствующими последовательностям SEQ ID NO:9, 129 и 130.

В одном варианте реализации данного изобретения анти-B7-H4 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит участки, определяющие комплементарность, легкой цепи в соответствии с последовательностями SEQ ID NO:14, 15 и 16, и участки, определяющие комплементарность, тяжелой цепи в соответствии с последовательностями SEQ ID NO:9, 129, 130.

В одном варианте реализации данного изобретения предложено анти-В7-Н4 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащий легкую цепь, последовательность которой, по меньшей мере, на 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или 100% идентична последовательности SEQ ID NO:13, и тяжелую цепь, последовательность которой, по меньшей мере, на 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или 100% идентична последовательности SEQ ID NO:128.

В одном варианте реализации данного изобретения предложено анти-B7-H4 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащий легкую цепь с аминокислотной последовательностью, соответствующей любой из последовательностей SEQ ID NO:3, 13, 46, 52, 85, 93, 102, 111 или 120.

В другом варианте реализации данного изобретения предложено анти-B7-H4 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащий тяжелую цепь с аминокислотной последовательностью, соответствующую любой из последовательностей SEQ ID NO:8, 29, 49, 65, 89, 98, 107, 115, 123 или 128.

В одном варианте реализации данного изобретения предложено анти-B7-H4 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащий легкую цепь с аминокислотной последовательностью, соответствующей любой из последовательностей SEQ ID NO:3, 13, 46, 52, 85, 93, 102, 111 или 120, и тяжелую цепь с аминокислотной последовательностью, соответствующей любой из последовательностей SEQ ID NO:8, 29, 49, 65, 89, 98, 107, 115, 123 или 128.

Также предложено анти-B7-H4 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащий три участка, обеспечивающих комплементарность, легкой цепи с аминокислотными последовательностями, которые выбраны из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO:4, 5, 6, 14, 15, 16, 47, 53, 54, 55, 86, 87, 94, 95, 96, 103, 104, 105, 112, 113 или 121.

В одном варианте реализации данного изобретения предложено анти-B7-H4 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащий три участка, обеспечивающих комплементарность, тяжелой цепи с аминокислотными последовательностями, которые выбраны из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO:9, 10, 11, 30, 50, 66, 67, 68, 90, 91, 99, 100, 108, 109, 116, 117, 118, 124, 125, 129 или 130.

В одном варианте реализации данного изобретения предложено анти-B7-H4 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащий три участка, обеспечивающих комплементарность, легкой цепи с аминокислотными последовательностями, которые выбраны из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO:4, 5, 6, 14, 15, 16, 47, 53, 54, 55, 86, 87, 94, 95, 96, 103, 104, 105, 112, 113 и 121, и три участка, обеспечивающих комплементарность, тяжелой цепи с аминокислотными последовательностями, которые выбраны из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO:9, 10, 11, 30, 50, 66, 67, 68, 90, 91, 99, 100, 108, 109, 116, 117, 118, 124, 125, 129 и 130.

В другом варианте реализации данного изобретения предложено анти-B7-H4 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащий переменный домен легкой цепи, последовательность которой, по меньшей мере, на 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или 100% идентична любой из последовательностей SEQ ID NO:19, 20, 21, 22 или 23, и переменный домен тяжелой цепи, последовательность которой, по меньшей мере, на 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или 100% идентична любой из последовательностей SEQ ID NO:34, 35, 36 или 37.

В одном из вариантов реализации данного изобретения предложено анти-B7-H4 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащий легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, соответствующую любой из последовательностей SEQ ID NO:24, 25, 26, 27 или 28, и тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, соответствующую любой из последовательностей SEQ ID NO:38, 39, 40 или 41.

В другом варианте реализации данного изобретения предложено анти-B7-H4 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащий легкую цепь с аминокислотной последовательностью, соответствующей любой из последовательностей SEQ ID NO:24, 25, 26, 27 или 28, и тяжелую цепь с аминокислотной последовательностью, соответствующей любой из последовательностей SEQ ID NO:42, 43, 44 или 45.

Также предложено анти-B7-H4 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащий переменный домен легкой цепи, последовательность которой, по меньшей мере на 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или 100% идентична любой из последовательностей SEQ ID NO:58, 59, 60 или 61, и переменный домен тяжелой цепи, последовательность которой, по меньшей мере на 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или 100% идентична любой из последовательностей SEQ ID NO:70, 71, 72, 73 или 74.

В одном варианте реализации данного изобретения предложено анти-B7-H4 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащий легкую цепь с аминокислотной последовательностью, соответствующей любой из последовательностей SEQ ID NO:62, 63 или 64, и тяжелую цепь с аминокислотной последовательность, соответствующей любой из последовательностей SEQ ID NO:75, 76, 77, 78 или 79.

В одном варианте реализации данного изобретения предложено анти-B7-H4 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащий легкую цепь с аминокислотной последовательность, соответствующей любой из последовательностей SEQ ID NO:62, 63 или 64, и тяжелую цепь с аминокислотной последовательность, соответствующей любой из последовательностей SEQ ID NOs: 80, 81, 82, 83 или 84.

В другом варианте реализации данного изобретения предложено анти-B7-H4 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащий шесть участков определяющих комплементарность (CDR), где эти CDR включают три CDR легкой цепи полипептида, выбранного из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO:4, 5, 6, 14, 15, 16, 49, 55, 56, 57, 88, 89, 96, 97, 97, 105, 106, 107, 114, 115 или 123, или их варианта, последовательность которого, по меньшей мере, на 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, или более идентична последовательностям SEQ ID NO:4, 5, 6, 14, 15, 16, 49, 55, 56, 57, 88, 89, 96, 97, 97, 105, 106, 107, 114, 115 или 123, и три CDR тяжелой цепи полипептида, выбранного из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO:9, 10, 11, 31, 52, 68, 69, 70, 92, 93, 101, 102, 118, 119, 120, 126, 127, 131 или 132, или их варианта, последовательность которого, по меньшей мере, на 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или более идентична последовательностям SEQ ID NO:9, 10, 11, 31, 52, 68, 69, 70, 92, 93, 101, 102, 118, 119, 120, 126, 127, 131 или 132, и при этом указанное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент связывается с B7-H4.

В другом варианте реализации данного изобретения предложено анти-B7-H4 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащий две легкие цепи и две тяжелые цепи, где две легкие цепи включают полипептид, выбранный из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO:24, 25, 26, 27, 28, 62, 63 или 64, или их варианта, последовательность которого, по меньшей мере, на 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или более идентична последовательностям SEQ ID NO:24, 25, 26, 27, 28, 62, 63 или 64, а две тяжелые цепи включают полипептид, выбранный из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO:38, 39, 40, 41, 75, 76, 77, 78 или 79, или их варианта, последовательность которого, по меньшей мере, на 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или более идентична последовательностям SEQ ID NO:38, 39, 40, 41, 75, 76, 77, 78 или 79, и при этом указанное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент связывается с B7-H4.

В одном варианте реализации данного изобретения предложено анти-B7-H4 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащий две легкие цепи и две тяжелые цепи, где две легкие цепи включают полипептид, выбранный из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO:24, 25, 26, 27, 28, 62, 63 или 64, или их варианта, последовательность которого, по меньшей мере, на 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или более идентична последовательностям SEQ ID NO:24, 25, 26, 27, 28, 62, 63 или 64, а две тяжелые цепи включают полипептид, выбранный из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO:42, 43, 44, 45, 80, 81, 82, 83 или 84, или их варианта, последовательность которого, по меньшей мере, на 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или более идентична последовательностям SEQ ID NO:42, 43, 44, 45, 80, 81, 82, 83 или 84, и при этом указанное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент связывается с B7-H4.

В одном варианте реализации данного изобретения предложено анти-B7-H4 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащий две легкие цепи и две тяжелые цепи, где две легкие цепи включают полипептид, выбранный из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO:24, 25, 26, 27 или 28, или их варианта, последовательность которого, по меньшей мере, на. 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или более идентична последовательностям SEQ ID NO:24, 25, 26, 27 или 28, а две тяжелые цепи включают полипептид, выбранный из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO:38, 39, 40 или 41, или их варианта, последовательность которого, по меньшей мере, на 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или более идентична последовательностям SEQ ID NO:38, 39, 40 или 41, и при этом указанное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент связывается с B7-H4.

В другом варианте реализации данного изобретения предложено анти-B7-H4 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащий две легкие цепи и две тяжелые цепи, где две легкие цепи включают полипептид, выбранный из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO:24, 25, 26, 27 или 28, или их варианта, последовательность которого, по меньшей мере, на 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или более идентична последовательностям SEQ ID NO:24, 25, 26, 27 или 28, а две тяжелые цепи включают полипептид, выбранный из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO:42, 43, 44 или 45, или их варианта, последовательность которого, по меньшей мере, на 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или более идентична последовательностям SEQ ID NO:42, 43, 44 или 45, и при этом антитело или его антигенсвязывающий фрагмент связывается с B7-H4.

В одном варианте реализации данного изобретения предложено анти-B7-H4 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащий две легкие цепи и две тяжелые цепи, где две легкие цепи включают полипептид, выбранный из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO:62, 63 или 64, или их варианта, последовательность которого, по меньшей мере, на 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или более идентична последовательностям SEQ ID NO:62, 63 или 64, а две тяжелые цепи включают полипептид, выбранный из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO:75, 76, 77, 78 или 79, или их варианта, последовательность которого, по меньшей мере, на 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или более идентична последовательностям SEQ ID NO:75, 76, 77, 78 или 79, и при этом указанное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент связывается с B7-H4.

В другом варианте реализации данного изобретения предложено анти-B7-H4 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащий две легкие цепи и две тяжелые цепи, где две легкие цепи включают полипептид, выбранный из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO:62, 63 или 64, или их варианта, последовательность которого, по меньшей мере, на 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или более идентична последовательностям SEQ ID NO:62, 63 или 64, а две тяжелые цепи включают полипептид, выбранный из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO:80, 81, 82, 83 или 84, или их варианта, последовательность которого, по меньшей мере, на 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или более идентична последовательностям SEQ ID NO:80, 81, 82, 83 или 84, и при этом указанное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент связывается с B7-H4.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Определения

В контексте данной заявки говорится, что молекула способна «иммуноспецифически связывать» другую молекулу, если такое связывание проявляет специфичность и сродство антитела к его антигену, схожему по структуре. Считается, что антитела способны иммуноспецифически связываться с целевым участком или конформацией («эпитопом») антигена, если такое связывание включает сайт распознавания антигена молекулы иммуноглобулина. Антитело, которое иммуноспецифически связывается с определенным антигеном, может связываться с другими антигенами с более низким сродством, если другой антиген имеет некоторую последовательность или конформационное сходство, которое распознается сайтом распознавания антигена, который определяется, например, иммуноанализом, анализом с помощью системы BIACORE® или другими анализами, известными в данной области техники, но не связывается с полностью неродственным антигеном. Однако в некоторых вариантах реализации данного изобретения антитела (и их антигенсвязывающие фрагменты) не вступают в перекрестную реакцию с другими антигенами. Антитела могут также связываться с другими молекулами способом, который не является иммуноспецифическим, например, с FcR-рецепторами, благодаря связывающим доменам в других участках/доменах молекулы, которые не включают сайт распознавания антигена, например, участок Fc.

В контексте данной заявки говорится, что молекула «физиоспецифическим образом связывает» другую молекулу, если такое связывание проявляет специфичность и сродство рецептора к его связывающему лиганду, схожему по структуре. Молекула может быть способна физиоспецифическим образом связываться с несколькими другими молекулами.

В контексте данной заявки термин «антитело» обозначает молекулу иммуноглобулина, которая обладает «вариабельным участком» сайта распознавания антигена и включает антигенсвязывающие фрагменты антител. Термин «вариабельный участок» предназначен для того, чтобы отличать такой домен иммуноглобулина от доменов, которые в значительной мере являются общими для антитела (например, домен Fc антитела). Вариабельный участок включает в себя «гипервариабельную область», остатки которой отвечают за связывание антигена. Гипервариабельная область включает аминокислотные остатки из «участка, определяющего комплементарность» или «CDR» (т. е. обычно приблизительно в остатках 24-34 (LI), 50-56 (L2) и 89-97 (L3) в вариабельном домене легкой цепи и приблизительно в остатках 27-35 (HI), 50-65 (H2) и 95-102 (H3) в вариабельном домене тяжелой цепи (Rabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest («Последовательности белков, представляющих иммунологический интерес»), 5th ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)); и/или эти остатки из «гипервариабельной петли» (т. е. остатки 26-32 (LI), 50-52 (L2) и 91-96 (L3) в вариабельном домене легкой цепи и 26-32 (HI), 53-55 (H2) и 96-101 (H3) в вариабельном домене тяжелой цепи (Chothia и Lesk, 1987, J. Mol. Biol. 196:901-917). «Каркасный участок» или остатки «FR» - это остатки вариабельного домена, отличные от остатков гипервариабельной области, как определенно в данной заявке. Термин «антитело» включает в себя моноклональные антитела, мульти-специфические антитела, человеческие антитела, гуманизированные антитела, синтетические антитела, химерные антитела, верблюдизированные антитела (см., например, Muyldermans el al., 2001, Trends Biochem. Sci. 26:230; Nuttall el al., 2000, Cur. Pharm. Biotech. 1:253; Reichmann и Muyldermans, 1999, J. Immunol. Meth. 231: 25; Международная публикация № WO 94/04678 и № WO 94/25591; патент США № 6005079), одноцепочечные Fvs (scFv) (см., например, Pluckthun в the Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds. Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)), одноцепочечные антитела, дисульфид-связанные Fvs (sdFv), внутриклеточные антитела, диатела, триотела, тетратела, Bis-scFv, миниантитела, Fab2, Fab3 и анти-анти-идиотипические (анти-id) антитела (в том числе, например, анти-id и анти-анти-Id антитела к антителам). В частности, такие антитела включают молекулы иммуноглобулинов любого типа (например, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA и IgY), класса (например, IgGi, IgG2, IgG3, IgG₄, IgAi и IgA₂) или подкласса.

В контексте данной заявки термин «антигенсвязывающий фрагмент» антитела относится к одной или нескольким частям антитела, которые содержат участки, определяющие комплементарность, антитела (CDR) и дополнительно каркасные остатки, которые включают сайт распознавания антигена «вариабельного участка» антитела и проявляют способность иммуноспецифически связывать антиген. Такие фрагменты включают Fab', F(ab')₂, Fv, одноцепочечные (ScFv) и их мутанты, природные варианты и слитые белки, включая сайт распознавания антигена «вариабельного участка» антитела и гетерологичный белок (например, токсин, сайт распознавания антигена для другого антигена, фермент, рецептор или лиганд рецептора и т. д.).

В контексте данной заявки термин «фрагмент» относится к пептиду или полипептиду, включающему аминокислотную последовательность, по меньшей мере, из 5 следующих друг за другом аминокислотных остатков, по меньшей мере, из 10 следующих друг за другом аминокислотных остатков, по меньшей мере, из 15 следующих друг за другом аминокислотных остатков, по меньшей мере, из 20 следующих друг за другом аминокислотных остатков, по меньшей мере, из 25 следующих друг за другом аминокислотных остатков, по меньшей мере, из 40 следующих друг за другом аминокислотных остатков, по меньшей мере, из 50 следующих друг за другом аминокислотных остатков, по меньшей мере, из 60 следующих друг за другом аминокислотных остатков, по меньшей мере, из 70 следующих друг за другом аминокислотных остатков, по меньшей мере, из 80 следующих друг за другом аминокислотных остатков, по меньшей мере, из 90 следующих друг за другом аминокислотных остатков, по меньшей мере, из 100 следующих друг за другом аминокислотных остатков, по меньшей мере, из 125 следующих друг за другом аминокислотных остатков, по меньшей мере, из 150 следующих друг за другом аминокислотных остатков, по меньшей мере, из 175 следующих друг за другом аминокислотных остатков, по меньшей мере, из 200 следующих друг за другом аминокислотных остатков или, по меньшей мере, из 250 следующих друг за другом аминокислотных остатков.

В контексте данной заявки термин «модулировать» относится к способности изменять эффект, результат или активность (например, трансдукция сигнала). Такая модуляция может быть агонистической или антагонистической. Антагонистическая модуляция может быть частичной (т. е. ослабляющей, но не уничтожающей) или же она может полностью уничтожать такую активность (т. е. быть нейтрализующей). Модуляция может включать интернализацию рецептора после связывания антитела или уменьшения экспрессии рецептора на клетке-мишени. Агонистическая модуляция может усиливать или иным образом увеличивать или повышать активность (например, трансдукция сигнала). В дополнительном варианте реализации данного изобретения такая модуляция может изменять природу взаимодействия между лигандом и его рецептором, схожим по структуре, так, чтобы изменять природу вызванной трансдукции сигнала. Например, эти молекулы могут, связываясь с лигандом или рецептором, изменять способность таких молекул связываться с другими лигандами или рецепторами и тем самым изменять их общую активность. В некоторых вариантах реализации данного изобретения такая модуляция обеспечит, изменение измеряемой активности иммунной системы, по меньшей мере, на 10%, изменение такой активности, по меньшей мере, на 50%, или, по меньшей мере, 2-кратное, 5-кратное, 10-кратное или, по меньшей мере, 100-кратное изменение такой активности.

Термин «существенно», употребляющийся в отношении связывания или проявляемого эффекта, предназначен для обозначения того, что наблюдаемый эффект является физиологически или терапевтически релевантным. Так, например, молекула способна существенно блокировать активность лиганда или рецептора, если степень блокады физиологически или терапевтически значима (например, если такая степень составляет более 60% полной блокады, более 70% полной блокады, более 75% полной блокады, более 80% полной блокады, более 85% полной блокады, более 90% полной блокады, более 95% полной блокады или более 97% полной блокады). Аналогично считается, что молекула имеет по существу ту же иммуноспецифичность и/или характеристики, что и другая молекула, если их иммуноспецифичность и характеристики более чем на 60% идентичны, более чем на 70% идентичны, более чем на 75% идентичны, более чем на 80% идентичны, более чем на 85% идентичны, более чем на 90% идентичны, более чем на 95% идентичны или более чем на 97% идентичны.

В контексте данной заявки «ко-стимулирующие» сигналы включают в себя положительные ко-стимулирующие сигналы (например, сигналы, которые приводят к усилению активности) и отрицательные ко-стимулирующие сигналы (например, сигналы, которые приводят к ингибированию активности).

Термин «производное» относится к антителу или его антигенсвязывающему фрагменту, который иммуноспецифически связывается с одной и той же мишенью родительского или эталонного антитела, но который отличается аминокислотной последовательностью от родительского или эталонного антитела или его антигенсвязывающего фрагмента за счет включения одного, двух, трех, четырех, пяти или большего количества замещений аминокислот, добавлений, делеций или модификаций относительно родительского или эталонного антитела или его антигенсвязывающего фрагмента. В некоторых вариантах реализации данного изобретения такие производные будут иметь в значительной степени одну и ту же иммуноспецифичность и/или характеристики, или одну и ту же иммуноспецифичность и характеристики, что и родительское или эталонное антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент. Замещения или добавления аминокислот в таких производных могут включать в себя аминокислотные остатки, встречающиеся в природе (т. е. кодируемые с помощью ДНК) или не встречающиеся в природе. Термин «производное» объединяет в себе, например, химерные или гуманизированные варианты, а также варианты, имеющие измененные участки CHI, шарнира, CH2, CH3 или CH4, с образованием, например, антител и т. д., имеющих вариантные Fc-участки, которые проявляют повышенные или ослабленные эффекторные или связывающие характеристики.

В контексте данной заявки «химерное антитело» представляет собой молекулу, в которой различные части антитела происходят из разных молекул иммуноглобулина, таких как антитела, имеющие вариабельный участок, происходящий из антитела, не являющегося человеческим, и константный участок иммуноглобулина человека.

В контексте данной заявки термин «гуманизированное антитело» относится к иммуноглобулину, включающему человеческий каркасный участок и один или большее количество участков, определяющих комплементарность (CDR), из иммуноглобулина, не являющегося человеческим (обычно мышиного или крысиного). Иммуноглобулин, не являющийся человеческим, обеспечивающий CDR, называется «донором», а иммуноглобулин человека, обеспечивающий каркасный участок, называется «акцептором». Константные участки не обязательно должны присутствовать, но если они имеются, то они должны быть в значительной степени идентичны константным участкам иммуноглобулина человека, то есть, быть, по меньшей мере, приблизительно на 85-99%, или приблизительно на 95% или более идентичны. Следовательно, все части гуманизированного иммуноглобулина, за исключением, возможно, CDR, в значительной степени идентичны соответствующим частям последовательностей нормального иммуноглобулина человека. Гуманизированное антитело - это антитело, включающее гуманизированную легкую цепь и гуманизированный иммуноглобулин тяжелой цепи. Например, гуманизированное антитело не будет включать типовое химерное антитело, потому что, например, весь вариабельный участок химерного антитела не является человеческим.

Термин «эндогенная концентрация» относится к уровню, на котором молекула экспрессируется в естественных условиях (т. е. в отсутствие экспрессирующих векторов или рекомбинантных промоторов) клеткой (такой клеткой может быть нормальная клетка, раковая клетка или инфицированная клетка).

В контексте данной заявки термины «лечить», «лечебный», «лечение» и «терапевтическое использование» относятся к устранению, уменьшению или снижению интенсивности одного или большего количества симптомов заболевания или нарушения. В контексте данной заявки термин «терапевтически эффективное количество» относится к такому количеству терапевтического агента, которое достаточно для того, чтобы добиться клинически значимого устранения, уменьшения или снижения интенсивности таких симптомов. Эффект является клинически значимым, если его величина достаточна для воздействия на здоровье или прогноз субъекта-реципиента. Терапевтически эффективное количество может относиться к количеству терапевтического агента, достаточному для задержки или минимизации начала заболевания, например, задержки или минимизации распространения рака. Терапевтически эффективное количество может также относиться к количеству терапевтического агента, который обеспечивает терапевтический эффект при лечении заболевания или ведении больных.

В контексте данной заявки термин «профилактическое средство» относится к средству, которое можно применить для профилактики нарушения или заболевания прежде, чем будут обнаружены какие-либо симптомы такого нарушения или заболевания. «Профилактически эффективное» количество - это количество профилактического средства, достаточное для обеспечения такой защиты. Профилактически эффективное количество также может относиться к количеству профилактического средства, которое обеспечивает профилактический эффект в предотвращении заболевания.

В контексте данной заявки термин «рак» относится к новообразованию или опухоли, возникающей в результате аномального неконтролируемого роста клеток. В контексте данной заявки рак конкретно включает в себя лейкемии и лимфомы. Термин «рак» относится к заболеванию, включающему клетки, которые способны метастазировать в отдаленные места и демонстрировать фенотипические признаки, отличающиеся от таковых у нераковых клеток, например, образование колоний в трехмерном субстрате, таком как мягкий агар, или образование трубчатых сетей или сетевидных матриц в трехмерной базальной мембране или препарате внеклеточного матрикса. Нераковые клетки не образуют колоний в мягком агаре, а образуют отчетливые сферообразных структуры в трехмерных препаратах базальной мембраны или внеклеточного матрикса.

В контексте данной заявки термин «иммунная клетка» относится к любой клетке гемопоэтического происхождения, включая (но не ограничиваясь этим) Т-клетки, в-клетки, моноциты, дендритные клетки и макрофаги.

В контексте данной заявки термин «воспалительные молекулы» относится к молекулам, которые приводят к воспалительной реакции, включая (но не ограничиваясь этим) цитокины и металлопротеазы, такие как (включая, но не ограничиваясь этим), ИЛ-lp (интерлейкин-lp), ФНО-альфа (фактор некроза опухоли-альфа), ТФР-бета (трансформирующий фактор роста-бета), ИФН-гамма (интерферон-гамма), ИЛ-18 (интерлейкин-18), ИЛ-17 (интерлейкин-17), ИЛ-6 (интерлейкин-6), ИЛ-23 (интерлейкин-23), ИЛ-22 (интерлейкин-22), ИЛ-21 (интерлейкин-21) и ММП (матриксные металлопротеиназы).

В контексте данной заявки термин «валентность» относится к целому ряду сайтов связывания, имеющихся на молекуле.

В контексте данной заявки термины «иммунологический» или «иммунный» ответ представляют собой развитие благоприятного гуморального (опосредованного антителами) и/или клеточного (опосредованного антигенспецифическими Т-клетками или продуктами их секреции) ответа, направленного против пептида у пациента-реципиента. Такой ответ может быть активным ответом, индуцированным введением иммуногена, или пассивным ответом, индуцированным введением антитела или Т-клеток, подвергшихся первичному воздействию антигена. Клеточный иммунный ответ вызывается презентированием полипептидных эпитопов в ассоциации с молекулами класса I или класса II MHC для активации антигенспецифических CD4+ Т-хелперов и/или цитотоксических CD8+ Т-клеток. Также ответ может включать активацию моноцитов, макрофагов, NK-клеток (естественных киллеров), базофилов, дендритных клеток, астроцитов, клеток микроглии, эозинофилов, активацию или мобилизацию нейтрофилов или других компонентов врожденного иммунитета. Наличие клеточно-опосредованного иммунологического ответа можно определить с помощью анализа пролиферации (CD4+ Т-клетки) или анализа ЦТЛ (цитотоксических Т-лимфоцитов). Относительный вклад гуморального и клеточного ответа в защитный или терапевтический эффект иммуногена можно определить путем раздельного выделения антител и Т-клеток у иммунизированного сингенного животного и измерения защитного или терапевтического эффекта у второго субъекта.

«Иммуногенный агент» или «иммуноген» способен индуцировать иммунологический ответ против самого себя при введении млекопитающему, необязательно в сочетании с адъювантом.

Термины «индивид», «хозяин», «субъект» и «пациент» употребляются в данной заявке взаимозаменяемо и относятся к млекопитающим, включая (но не ограничиваясь этим) людей, грызунов, таких как мыши и крысы, и других лабораторных животных.

В контексте данной заявки термин «полипептид» относится к цепи аминокислот любой длины, независимо от модификации (например, фосфорилирование или гликозилирование). Термин полипептид включает в себя белки и их фрагменты. Полипептиды могут быть «экзогенными», означая то, что они являются «гетерологичными», т.е. чужеродными для применяющейся клетки-хозяина, такими как человеческий полипептид, продуцируемый бактериальной клеткой. Полипептиды описаны в данной заявке как последовательности аминокислотных остатков. Эти последовательности записываются слева направо в направлении от аминокислотного к карбоксильному концу. В соответствии со стандартной номенклатурой аминокислотные последовательности остатков обозначаются либо трехбуквенным, либо однобуквенным кодом следующим образом: аланин (Ala, A), аргинин (Arg, R), аспарагин (Asn, N), аспарагиновая кислота (Asp, D), цистеин (Cys, C), глутамин (Gin, Q), глутаминовая кислота (Glu, E), глицин (Gly, G), гистидин (His, H), изолейцин (lie, I), лейцин (Leu, L), лизин (Lys, K), метионин (Met, M), фенилаланин (PHE, F), пролин (Pro, P), серин (Ser, S), треонин (THR, T), триптофан (TRP, W), тирозин (Tyr, Y) и валин (Val, V).

В контексте данной заявки термин «вариант» относится к полипептиду или полинуклеотиду, который отличается от эталонного полипептида или полинуклеотида, но сохраняет важнейшие свойства. Типовой вариант полипептида отличается аминокислотной последовательностью от другого, эталонного полипептида. В основном различия ограничены таким образом, что последовательности эталонного полипептида и варианта в целом близки и на многих участках идентичны. Аминокислотная последовательность варианта и эталонного полипептида могут отличаться одной или нескольким модификациям (например, замещениями, добавлениями и/или делециями). Замещенный или вставленный аминокислотный остаток может быть закодирован или не быть закодирован генетическим кодом. Вариант полипептида может встречаться в природе, такой как аллельный вариант; или это может быть вариант, о котором известно, что он не встречается в природе.

В структуру полипептидов данного изобретения могут быть внесены модификации и изменения, но полученная молекула будет иметь сходные характеристики с полипептидом (например, консервативное аминокислотное замещение). Например, некоторые аминокислоты можно заместить другими аминокислотами в определенной последовательности без заметной потери активности. Поскольку именно способность взаимодействовать и характер полипептида определяют биологическую функциональную активность этого полипептида, можно сделать определенные замещения в аминокислотных последовательностях полипептида и, тем не менее, получить полипептид с подобными свойствами.

При внесении таких изменений можно учитывать гидропатический индекс аминокислот. В целом в данной области техники понимается важность гидропатического аминокислотного индекса в придании полипептиду биологической функции взаимодействия. Известно, что некоторые аминокислоты могут быть замещены другими аминокислотами, имеющими сходный гидропатический индекс или показатель, но это приведет к получению полипептида с аналогичной биологической активностью. Каждой аминокислоте был присвоен гидропатический индекс на основе ее гидрофобности и характеристик заряда. Ниже приведены гидропатические индексы аминокислот: изолейцин (+4,5); валин (+4,2); лейцин (+3.8); фенилаланин (+2.8); цистеин/цистин (+2.5); метионин (+1.9); аланин (+1.8); глицин (-0.4); треонин (-0.7); серин (-0.8); триптофан (-0.9); тирозин (- 1.3); пролин (-1.6); гистидин (-3.2); глутамат (-3.5); глутамин (-3.5); аспартат (-3.5), аспарагин (-3,5), лизин (-3,9) и аргинин (-4,5).

Считается, что относительный гидропатический характер аминокислоты определяет вторичную структуру результирующего полипептида, который, в свою очередь, определяет взаимодействие этого полипептида с другими молекулами, такими как ферменты, субстраты, рецепторы, антитела, антигены и ко-факторы. В данной области техники известно, что аминокислоту можно заместить другой аминокислотой, имеющей аналогичный гидропатический индекс, и при этом получить функционально эквивалентный полипептид. При таких изменениях предпочтительным является замещение аминокислот, гидропатические индексы которых находятся в пределах ± 2, особо предпочтительны аминокислоты с гидропатическим индексом в пределах ± 1, а самыми предпочтительными являются аминокислоты, у которых гидропатический индекс находится в пределах ± 0,5.

Замещение подобных аминокислот также может быть произведено на основе гидрофильности, особенно в тех случаях, когда созданный таким образом биологический функциональный эквивалент полипептида или пептида предназначен для применения в иммунологических вариантах реализации данного изобретения. Аминокислотным остаткам были присвоены следующие значения гидрофильности: аргинин (+3,0); лизин (+3,0); аспартат (+3,0 ± 1); глутамат (+3,0 ± 1); серин (+0,3); аспарагин (+0,2); глутамин (+0,2); глицин (0); пролин (-0,5 ± 1); треонин (-0,4); аланин (-0,5); гистидин (-0,5); цистеин (-1,0); метионин (-1,3); валин (-1,5); лейцин (-1,8); изолейцин (-1,8); тирозин (-2,3); фенилаланин (-2,5); триптофан (-3,4). Понятно, что аминокислоту можно заместить другой аминокислотой, имеющей аналогичное значение гидрофильности, и при этом получить биологически эквивалентный и, в частности, иммунологически эквивалентный полипептид. При таких изменениях предпочтительным является замещение аминокислот, у которых значения гидрофильности находятся в пределах ± 2, особо предпочтительны аминокислоты, у которых значения гидрофильности находятся в пределах ± 1, а самыми предпочтительными являются аминокислоты, у которых гидропатический индекс находится в пределах ± 0,5.

Как было указано выше, замещения аминокислот обычно основаны на относительном подобии аминокислотных заместителей боковой цепи, например, их гидрофобности, гидрофильности, заряде, размере и тому подобном. Типовые замещения, которые учитывают различные вышеуказанные характеристики, хорошо известны специалистам в данной области техники и включают в себя (исходный остаток : типовое замещение): (Ala : Gly, Ser), (Arg : Lys), (Asn : Gln, His), (Asp : Glu, Cys, Ser), (Gin : Asn), (Glu : Asp), (Gly : Ala), (His : Asn, Gin), (He : Leu, Val), (Leu : Ile, Val), (Lys : Arg), (Met : Leu, Tyr), (Ser : Thr), (Thr : Ser), (Trp : Tyr), (Tyr : Trp, Phe) и (Val : Ile, Leu). В вариантах реализации данного изобретения, таким образом, предполагаются функциональные или биологические эквиваленты полипептида, как изложено выше. В частности, варианты реализации изобретения полипептидов могут включать варианты, последовательность которых приблизительно на 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более идентична последовательности полипептида, представляющего интерес.

Термин «процент (%) идентичности последовательности» определяется как процент нуклеотидов или аминокислот в последовательности-кандидате, которые идентичны нуклеотидам или аминокислотам в эталонной последовательности нуклеиновых кислот, после выравнивания последовательностей и введения пробелов, если это необходимо, для достижения максимального процента идентичности последовательности. Выравнивание с целью определения процента идентичности последовательности может быть достигнуто различными способами, относящимися к обычным практическим навыкам в данной области техники, например, с помощью общедоступного компьютерного программного обеспечения, такого как BLAST, BLAST-2, ALIGN, ALIGN-2, или программного обеспечение Megalign (DNASTAR). Соответствующие параметры для измерения выравнивания, включая любые алгоритмы, необходимые для достижения максимального выравнивания по всей длине сравниваемых последовательностей, можно определить известными способами.

В данном контексте процент идентичности последовательности данных нуклеотидов или аминокислотной последовательности C с данной последовательностью нуклеиновых кислот D (которую можно альтернативно сформулировать как данная последовательность С, которая имеет или содержит определенный процент идентичности последовательности с данной последовательностью D) вычисляется следующим образом:

100 х W/Z,

где W - число нуклеотидов или аминокислот, подсчитанное программой выравнивания последовательностей как идентичные совпадения в этом выравнивании C и D программы;

Z - общее число нуклеотидов или аминокислот в D. Следует иметь в виду, что там, где длина последовательности C не равна длине последовательности D, процент идентичности последовательности C c D не будет равен проценту идентичности последовательности D c C.

В контексте данной заявки термин «фармацевтически приемлемый носитель» объединяет в себе любые стандартные фармацевтические носители, такие как фосфатно-буферный физиологический раствор, вода и эмульсии, такие как эмульсия типа «масло в воде» или эмульсия типа «вода в масле», а также различные типы смачивающих агентов.

II. Композиции

Высокие уровни экспрессии B7-H4, обнаруженные в многочисленных опухолевых тканях, например, при раке яичников человека, указывают на ключевую роль B7-H4 в опосредовании иммунного подавления. Кроме того, было обнаружено, что макрофаги, ассоциированные с опухолью (Там), экспрессирующие B7-H4, подавляют ассоциированный с опухолью антигенспецифический Т-клеточный иммунитет (Kryczek, I. et al. (2006) "B7-H4 Expression Identifies A Novel Suppressive Macrophage Population In Human Ovarian Carcinoma" («экспрессия B7-H4 идентифицирует новую супрессивную популяцию макрофагов в карциноме яичников человека») J. Exp. Med. 203(4):871-881). Интенсивность экспрессии B7-H4 в МАО достоверно коррелирует с количеством регуляторных T-клеток в опухоли. Более того, B7-H4, экспрессируемый на МАО, ассоциируется с неблагоприятным исходом у пациентов (Kryczek, I. et al. (2006) "B7-H4 Expression Identifies A Novel Suppressive Macrophage Population In Human Ovarian Carcinoma" («Экспрессия B7-H4 идентифицирует новую супрессивную популяцию макрофагов в карциноме яичников человека»), J. Exp. Med. 203(4):871- 881). Кроме того, B7-H4 может экспрессироваться на супрессорных клетках миелоидного происхождения (СКМП), где он может оказывать иммуносупрессивное действие при вирусной инфекции (Garg, A et al. (2017) "Human Immunodeficiency Virus Type-1 Myeloid Derived Suppressor Cells Inhibit Cytomegalovirus Inflammation through Interleukin-27 and B7-H4" («Супрессорные клетки миелоидного происхождения при вирусе иммунодефицита человека 1-го типа ингибируют цитомегаловирусное воспаление посредством интерлейкина-27 и B7-H4») Sci. Rep. Mar 24; 7: 44485). На ряду с этим в исследовании рака матки экспрессия B7-H4 в микроокружении опухоли была связана с повышенной инфильтрацией СКМП (Vanderstraeten, A. et al. (2014), "Mapping the immunosuppressive environment in uterine tumors: implications for immunotherapy" («Картирование иммуносупрессивной среды при опухолях матки: значение для иммунотерапии»), Cancer Immunol. Immunother. Jun; 63(6):545-57). Таким образом, B7-H4 может экспрессироваться на опухолевых клетках, МАО и/или СКМП, где он может вызывать передачу иммуносупрессивных сигналов при раке.

Нейтрофилы являются основным компонентом врожденной защиты хозяина от инфекции, а также способствуют развитию аутоиммунных заболеваний и хронического воспаления. При инфекции нейтрофилы быстро мигрируют в очаги воспаления, активируются и запускают каскад защитных механизмов, включая фагоцитоз, уничтожение и дегенерацию микроорганизмов антимикробными и протеолитическими белками, а также образование активных форм кислорода. Нейтрофилы также участвуют в разрушении тканей, ремоделировании, заживлении ран и модуляции других воспалительных и адаптивных иммунных компонентов. В связи с короткой продолжительностью жизни нейтрофилов их количество во время инфекции и воспаления должно постоянно пополняться путем увеличения их образования из миелоидных клеток-предшественниц в костном мозге. B7-H4 ингибирует in vitro рост клеток-предшественниц нейтрофилов, полученных из костного мозга, что указывает на ингибирующую функцию B7-H4 в образовании нейтрофилов (Zhu, G. et al., Blood, 113: 1759-1767 (2009)). Таким образом, обеспечиваются композиции, модулирующие трансдукцию сигнала B7-H4.

Последовательности B7-H4

В одном варианте реализации данного изобретения предложены полипептиды B7-H4. Эти полипептиды могут включать в себя полноразмерную аминокислотную последовательность B7-H4 или ее фрагмент или вариант, или ее слитый белок.

В одном варианте реализации данного изобретения предложены человеческие белки B7-H4 или их полипептиды. Последовательности человеческого белка B7-H4 известны в данной области техники. Например, консенсусная последовательность белка B7-H4 такова:

1 MASLGQILFW SIISIIIILA GAIALIIGFG ISGRHSITVT TVASAGNIGE DGILSCTFEP

61 DIKLSDIVIQ WLKEGVLGLV HEFKEGKDEL SEQDEMFRGR TAVFADQVIV GNASLRLKNV

121 QLTDAGTYKC YIITSKGKGN ANLEYKTGAF SMPEWVDYN ASSETLRCEA PRWFPQPTW

181 WASQVDQGAN FSEVSNTSFE LNSENVTMKV VSVLYNVTIN NTYSCMIEND IAKATGDIKV

241 TESEIKRRSH LQLLNSKASL CVSSFFAISW ALLPLSPYLM LK

(SEQ ID NO:l, Q7Z7D3 (VTCN1_HUMAN)), где аминокислоты 1-27 являются сигнальной последовательностью (подчеркнуто в соответствии с патентной публикацией США № 2016/0039905, которая полностью включена посредством ссылки). В работе Sica et al. указывается, что аминокислоты 1-20 составляют сигнальную последовательность. Учетный номер Q7Z7D3 базы данных последовательностей белков UniProtKB указывает на то, что внеклеточный домен включает аминокислоты 25-259.

В другом варианте реализации данного изобретения предложены мышиные белки B7-H4 и полипептиды. Последовательности мышиного белка B7-H4 известны в данной области техники. Например, консенсусная последовательность мышиного белка B7-H4 такова:

MASLGQIIFWSIINIIIILAGAIALIIGFGISGKHFITVTTFTSAGNIGEDGTLSCTFEP DIKLNGIVIQWLKEGIKGLVHEFKEGKDDLSQQHEMFRGRTAVFADQVWGNASLRLKNV QLTDAGTYTCYIRTSKGKGNANLEYKTGAFSMPEINVDYNASSESLRCEAPRWFPQPTVA WASQVDQGANFSEVSNTSFELNSENVTMKWSVLYNVTINNTYSCMIENDIAKATGDIKV TDSEVKRRSQLQLLNSGPSPCVFSSAFVAGWALLSLSCCLMLR

(SEQ ID NO:2, Q7TSP5 (VTCN1_MOUSE), которая полностью включена посредством ссылки).

1. Последовательности анти-B7-H4 антител

a. Последовательности B1A1

В одном варианте реализации данного изобретения предложено мышиное моноклональное антитело, которое продуцируется клоном гибридомы В1А1, содержит две легкие цепи и две тяжелые цепи и специфически связывается с В7-Н4.

Легкая цепь

В одном варианте реализации данного изобретения предложено мышиное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, который имеет легкую цепь, последовательность которой, по меньшей мере, на 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или 100% идентична следующей аминокислотной последовательности:

DIVMTOSHKFMSTSVGDRVSITC KASODVRTAVAW YOOKPGOSPKLLIY STSYRYT GV PDRFTGSGSGTEFTFTIS SVOAEDLAVYYCOOYYVTPLTFGAGTKLELK (SEQ ID NO:3), которая специфически связывается с B7-H4.

Участки, определяющие комплементарность (CDR), из последовательности SEQ ID NO:3 выделены жирным шрифтом и подчеркнуты:

CDR1 KASQDVRTAVA (SEQ ID NO:4);

CDR2 STSYRYT (SEQ ID NO:5); и

CDR3 QQYYVTPLT (SEQ ID NO:6).

В другом варианте реализации данного изобретения предложена нуклеиновая кислота, которая кодирует легкую цепь (SEQ ID NO:3). Типовой нуклеиновой кислотой, кодирующей легкую цепь (SEQ ID NO:3), является:

GACATTGTGATGACCCAGTCTCACAAATTCATGTCCACATCAGTAGGAGACAGGGTC AGTATCACCTGCAAGGCCAGTCAGGATGTGAGAACTGCTGTAGCCTGGTATCAACA GAAACCAGGACAATCTCCTAAACTACTGATTTACTCGACATCCTACCGGTACACTGG AGTCCCTGATCGCTTCACTGGCAGTGGATCTGGGACGGAATTCACTTTCACCATCAG CAGTGTGCAGGCTGAAGACCTGGCAGTTTATTACTGTCAGCAATATTATGTTACTCC GCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAA (SEQ ID NO:7).

Тяжелая цепь

В одном варианте реализации данного изобретения предложено мышиное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, который имеет тяжелую цепь, последовательность которой, по меньшей мере, на 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или 100% идентична следующей аминокислотной последовательности:

EVOLOOSGTVLARPGASVKMSCKASGYTFT SYWMH WIKORPGOGLEWI GAIYPGNSD TKYNOKFKDKAKLTAVTSASTAYMEL SSLTNEDSAVYYCTSTVRNVMDYWGOGTSV TVSS (SEQ ID NO:8), и специфически связывается с B7-H4.

Участки, определяющие комплементарность (CDR), из последовательности SEQ ID NO:8 выделены жирным шрифтом и подчеркнуты:

CDR1 SYWMH (SEQ ID NO:9);

CDR2 AIYPGNSDTKYNQKFKDK (SEQ ID NO 10); и

CDR3 TVRNVMDY (SEQ ID NO:11).

В другом варианте реализации данного изобретения предложена нуклеиновая кислота, кодирующую тяжелую цепь (SEQ ID NO:8). Типовой нуклеиновой кислотой, кодирующей тяжелую цепь (SEQ ID NO:8), является:

GAGGTTCAGCTCCAGCAGTCTGGGACTGT GCTGGCAAGGCCTGGGGCTTC AGTGAA GATGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACCTTTACCAGCTACTGGATGCACTGGATAAA ACAGAGGCCTGGACAGGGTCTGGAATGGATTGGCGCTATTTATCCTGGAAATAGTG ATACTAAATACAACCAGAAGTTCAAGGACAAGGCCAAACTGACTGCAGTCACATCT GCCAGCACTGCCTACATGGAGCTCAGCAGCCTGACAAATGAGGACTCTGCGGTCTA TTACTGTACATCTACGGTACGGAATGTTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGT CACCGTCTCCTCA (SEQ ID NO:12).

В одном варианте реализации данного изобретения предложено антитело, в предпочтительном варианте реализации моноклональное антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, который содержит легкую цепь, содержащую участки, определяющие комплементарность, в соответствии с последовательностями SEQ ID NO:4, 5 и 6, и специфически связывается с B7-H4.

В одном варианте реализации данного изобретения предложено антитело, в предпочтительном варианте реализации моноклональное антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, который содержит тяжелую цепь, содержащую участки, определяющие комплементарность, в соответствии с последовательностями SEQ ID NO:9, 10 и 11, и специфически связывается с B7-H4.

В одном варианте реализации данного изобретения предложено антитело, в предпочтительном варианте реализации моноклональное антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, который содержит легкую цепь, содержащую участки, определяющие комплементарность, в соответствии с последовательностями SEQ ID NO:4, 5 и 6, и тяжелую цепь, содержащую участки, определяющие комплементарность, в соответствии с последовательностями SEQ ID NO:9, 10 и 11, и специфически связывается с B7-H4.

В одном варианте реализации данного изобретения предложено антитело, в предпочтительном варианте реализации моноклональное антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, который содержит легкую цепь, последовательность которой, по меньшей мере, на 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, или 100% идентична последовательности SEQ ID NO:3, и тяжелую цепь, последовательность которой, по меньшей мере, на 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или 100% идентична последовательности SEQ ID NO:8, и специфически связывается с В7-Н4.

b. последовательности B1h1

В одном варианте реализации данного изобретения мышиное моноклональное антитело продуцируется клоном гибридомы B1H1 и содержит две легкие цепи и две тяжелые цепи.

Легкая цепь

В одном варианте реализации данного изобретения предложено мышиное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, который содержит легкую цепь, последовательность которой, по меньшей мере, на 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или 100% идентична следующей аминокислотной последовательности:

EIOMTO SP SSMSASLGDRITITCOATODIVKSLNW YOOKPGKPP SFLIYYTAOLAEGVP S RFSGSGSGSDYSLTI SNLESEDFA YYCLOFYEFPPTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO:13).

Участки, определяющие комплементарность (CDR), из последовательности SEQ ID NO:13 выделены жирным шрифтом и подчеркнуты:

CDR1 QATQDIVKSLN (SEQ ID NO:14);

CDR2 YTAQLAE (SEQ ID NO:15); и

CDR3 LQFYEFPPT (SEQ ID NO:16).

В другом варианте реализации данного изобретения предложена нуклеиновая кислота, которая кодирует легкую цепь (SEQ ID NO:13).

Типовой нуклеиновой кислотой, которая кодирует легкую цепь (SEQ ID NO:13), является:

GAAATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCTATGTCTGCATCTCTGGGAGACAGAATA ACCATCACTTGCCAGGCAACTCAAGACATTGTTAAGAGTTTAAACTGGTATCAACAA AAACCAGGGAAACCCCCTTCATTCCTGATCTATTATACAGCTCAACTGGCAGAAGGG GTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGTCAGACTATTCTCTGACAATCAGC AACCTGGAGTCTGAAGATTTTGCAGACTATTACTGTCTACAGTTTTATGAGTTTCCTC CGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAA (SEQ ID NO:17).

В одном варианте реализации данного изобретения предложено моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, который содержит константный домен легкой цепи, последовательность которой, по меньшей мере, на 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или 100% идентична следующей аминокислотной последовательности:

RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQ DSKDSTYSL SSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLS SPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO:18) и специально связывается с B7-H4.

Гуманизированная легкая цепь

В одном варианте реализации данного изобретения предложено моноклональное анти-B7-H4 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, который содержит гуманизированный вариабельный домен легкой цепи, последовательность которой, по меньшей мере, на 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или 100% идентична одной из следующих аминокислотных последовательностей:

Гуманизированная B1H1 VL1:

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQATQDIVKSLNWYQQKPGKPPKFLIYYTAQLAEGVPS RFSGSGSGTDYTLTIS SLQSEDFATYYCLQFYEFPPTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO:19)

Гуманизированная B1H1 VL2:

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQATQDIVKSLNWYQQKPGKPPKFLIYYTAQLAEGVPS RFSGSGSGTDYTLTIS SLQPEDFATYYCLQFYEFPPTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO:20)

Гуманизированная B1H1 VL3:

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQATQDIVKSLNWYQQKPGKAPKFLIYYTAQLAEGVPS RFSGSGSGTDYTLTIS SLQPEDFATYYCLQFYEFPPTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO:21)

Гуманизированная B1H1 VL4:

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQATQDIVKSLNWYQQKPGKPPKFLIYYTAQLAEGVPS

RF SGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQFYEFPPTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO:22)

Гуманизированная B1H1 VL5:

DIQMTQ SPS SL SASVGDRVTITCQ ATQDIVKSLNW YQQKPGKPPKF AIYYTAQLAEGVPS RFSGSGSGTDYTLTIS SLQPEDFATYYCLQFYEFPPTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO:23)

В одном варианте реализации данного изобретения предложено моноклональное анти-B7-H4 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, который содержит гуманизированную легкую цепь, последовательность которой, по меньшей мере, на 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или 100% идентична одной из следующих аминокислотных последовательностей:

полноразмерная легкая цепь B1H1, вариант 1:

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQATQDIVKSLNWYQQKPGKPPKFLIYYTAQLAEGVPS RFSGSGSGTDYTLTISSLQSEDFATYYCLQFYEFPPTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSD EQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTL SKADYEKHKVYACEVTHQGL SSPVTK SFNRGEC (SEQ ID NO:24)

полноразмерная легкая цепь B1H1, вариант 2:

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQATQDIVKSLNWYQQKPGKPPKFLIYYTAQLAEGVPS RFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCLQFYEFPPTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSD EQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTL SKADYEKHKVYACEVTHQGL SSPVTK SFNRGEC (SEQ ID NO:25)

полноразмерная легкая цепь B1H1, вариант 3:

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQATQDIVKSLNWYQQKPGKAPKFLIYYTAQLAEGVPS RFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCLQFYEFPPTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSD EQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTL SKADYEKHKVYACEVTHQGL SSPVTK SFNRGEC (SEQ ID NO:26)

полноразмерная легкая цепь B1H1, вариант 4:

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQATQDIVKSLNWYQQKPGKPPKFLIYYTAQLAEGVPS RFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQFYEFPPTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSD EQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTL SKADYEKHKVYACEVTHQGL SSPVTK SFNRGEC (SEQ ID NO:27)

полноразмерная легкая цепь B1H1, вариант 5:

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQATQDIVKSLNWYQQKPGKPPKFLIYYTAQLAEGVPS RFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQFYEFPPTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSD EQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTL SKADYEKHKVYACEVTHQGL SSPVTK SFNRGEC (SEQ ID NO:28)

Тяжелая цепь

В одном варианте реализации данного изобретения предложено мышиное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, который содержит тяжелую цепь, последовательность которой, по меньшей мере, на 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или 100% идентична следующей аминокислотной последовательности:

EVOLOOSGTVLARPGASVKMSCKVSGYPFT SYWMHW VKORPGOGLEWI GAIYPGKS DTEYNPNFKGK AKLTAVTSATTAYMELSSLTNEDSAVYYCTS TWTHYFDY WGOGTTL TVSS (SEQ ID NO:29), и специфически связывается с B7-H4.

Участки, определяющие комплементарность (CDR), из последовательности SEQ ID NO:29 выделены жирным шрифтом и подчеркнуты:

CDR1 SYWMH (SEQ ID NO:9);

CDR2 AIYPGKSDTEYNPNFKG (SEQ ID NO:30); и

CDR3 TVRNVMDY (SEQ ID NO:11).

В другом варианте реализации данного изобретения предложена нуклеиновая кислота, кодирующую тяжелую цепь (SEQ ID NO:29). Типовой нуклеиновой кислотой, кодирующей тяжелую цепь (SEQ ID NO:29), является:

GAGGTTCAGCTCCAGCAGTCTGGGACTGTTCTGGCAAGGCCTGGGGCTTCAGTGAAG ATGTCCTGCAAGGTTTCTGGCTACCCCTTTACCAGCTACTGGATGCACTGGGTAAAA CAGAGGCCTGGACAGGGTCTGGAATGGATTGGCGCTATTTATCCTGGAAAAAGTGA CACTGAATACAACCCGAACTTCAAGGGCAAGGCCAAACTGACTGCAGTCACATCTG CCACCACTGCCTACATGGAGCTCAGCAGCCTGACAAATGAGGACTCTGCGGTCTATT ACTGTACAAGTACCTGGACCCACTACTTTGACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCA CAGTCTCCTCA (SEQ ID NO:31).

В одном варианте реализации данного изобретения предложено мышиное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, который содержит константный домен тяжелой цепи, последовательность которой, по меньшей мере, на 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или 100% идентична следующей аминокислотной последовательности:

ASTKGPSVFPLA SSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSS GLYSL SSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKP SNTKVDKKVEPKSCDKTHT CPPCPAPELLGG PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY NSTYRVV SVLTVLHQDWLNGKEYKCKV SNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQ VYTLPPSR DELTKNQVSLTCLVKGFYP SDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDK SRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO:32),

и специфически связывается с B7-H4.

Подчеркнутые и выделенные жирным шрифтом аминокислоты представляют собой аминокислоты, которые отличаются от мутантной последовательности.

В другом варианте реализации данного изобретения предложен константный домен мутантной тяжелый цепи, последовательность которой, по меньшей мере, на 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или 100% идентична следующей аминокислотной последовательности:

ASTKGPSVFPLAP SSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSS GLYSL SSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKP SNTKVDKKVEPKSCDKTHT CPPCPAPELLGG PDVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQ YNSTYRVV SVLTVLHQDWLNGKEYKCKV SNKALPLPEEKTISKAKGQPREPQ VYTLPP SRDELTKNQVSLTCLVKGFYP SDIAVEWE SNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV DKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO:33)

Подчеркнутые и выделенные жирным шрифтом аминокислоты представляют собой аминокислоты, которые отличаются от последовательности дикого типа.

Гуманизированная тяжелая цепь

В одном варианте реализации данного изобретения предложено моноклональное анти-B7-H4 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, который содержит гуманизированный вариабельный домен тяжелой цепи, последовательность которой, по меньшей мере, на 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или 100% идентична одной из следующих аминокислотных последовательностей:

Гуманизированная B1H1 VH1:

EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKVSGYPFTSYWMHWVRQAPGQGLEWIGAIYPGKSD TEYAPKFQGRVTLTADTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTSTWTHYFDYWGQGTTVTV SS (SEQ ID NO:34)

Гуманизированная B1H1 VH2:

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKVSGYPFTSYWMHWVRQAPGQGLEWMGAIYPGKS DTEYAQKFQGRVTLTADTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTSTWTHYFDYWGQGTTVT VSS (SEQ ID NO:35)

Гуманизированная B1H1 VH3:

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKVSGYPFTSYWMHWVRQAPGQGLEWMGAIYPGKS DTEYAQKFQGRVTLTADTSTSTAYMELSSLRSEDTATYYCTSTWTHYFDYWGQGTTVT VSS (SEQ ID NO:36)

Гуманизированная B1H1 VH4:

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKVSGYPFTSYYMHWVRQAPGQGLEWMGAIYPGKS DTEYAQKFQGRVTLTADTSTSTAYMELSSLRSEDTATYYCTSTWTHYFDYWGQGTTVT VSS (SEQ ID NO:37)

В одном варианте реализации данного изобретения предложено моноклональное анти-B7-H4 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, который содержит гуманизированную тяжелую цепь, последовательность которой, по меньшей мере, на 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или 100% идентична одной из следующих аминокислотных последовательностей:

Тяжелая цепь B1H1, вариант 1:

EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKVSGYPFTSYWMHWVRQAPGQGLEWIGAIYPGKSD TEYAPKFQGRVTLTADTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTSTWTHYFDYWGQGTTVTV SSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQ SSGLYSLSSVVTVPS SSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELL

GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREE QYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKV SNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQ VYTLPP SRDELTKNQVSLTCLVKGFYP SDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV DKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO:38)

Тяжелая цепь B1H1, вариант 2:

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKVSGYPFTSYWMHWVRQAPGQGLEWMGAIYPGKS DTEYAQKFQGRVTLTADTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTSTWTHYFDYWGQGTTVT VSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVL QSSGLYSL SSWT VPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPK SCDKTHTCPPCPAPEL LGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPRE EQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKV SNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQ VYTLP PSRDELTKNQVSLTCLVKGFYP SDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV DKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO:39)

Тяжелая цепь B1H1, вариант 3:

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKVSGYPFTSYWMHWVRQAPGQGLEWMGAIYPGKS DTEYAQKFQGRVTLTADTSTSTAYMELSSLRSEDTATYYCTSTWTHYFDYWGQGTTVT VSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVL QSSGLYSL SSWT VPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPK SCDKTHTCPPCPAPEL LGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPRE EQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKV SNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQ VYTLP PSRDELTKNQVSLTCLVKGFYP SDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV DKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO:40)

Тяжелая цепь B1H1, вариант 4:

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKVSGYPFTSYYMHWVRQAPGQGLEWMGAIYPGKS DTEYAQKFQGRVTLTADTSTSTAYMELSSLRSEDTATYYCTSTWTHYFDYWGQGTTVT VSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVL QSSGLYSL SSWT VPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPK SCDKTHTCPPCPAPEL LGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPRE EQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKV SNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQ VYTLP PSRDELTKNQVSLTCLVKGFYP SDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV DKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO:41)

В другом варианте реализации данного изобретения моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит гуманизированную тяжелую цепь, последовательность которой, по меньшей мере, на 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или 100% идентична одной из следующих аминокислотных последовательностей:

Тяжелая цепь B1H1, мутантный вариант 1:

EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKVSGYPFTSYWMHWVRQAPGQGLEWIGAIYPGKSD TEYAPKFQGRVTLTADTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTSTWTHYFDYWGQGTTVTV SSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQ SSGLYSLSSVVTVPS SSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELL GGPDVFLFPPKPKDTLMISRTPEVT CVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPRE EQYN STYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKV SNKALPLPEEKTISKAKGQPREPQ VYTL PPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLT VDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO:42);

Тяжелая цепь B1H1, мутантный вариант 2:

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKVSGYPFTSYWMFIWVRQAPGQGLEWMGAIYPGKS DTEYAQKFQGRVTLTADTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTSTWmYFDYWGQGTTVT VSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVL QSSGLYSL SSWT VPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPK SCDKTHTCPPCPAPEL LGGPDVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPR EEQYNSTYRVV SVLTVLHQDWLNGKEYKCKV SNKALPLPEEKTISKAKGQPREPQ VYT LPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKL TVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO:43);

Тяжелая цепь B1H1, мутантный вариант 3:

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKVSGYPFTSYWMFIWVRQAPGQGLEWMGAIYPGKS DTEYAQKFQGRVTLTADTSTSTAYMELSSLRSEDTATYYCTSTWTHYFDYWGQGTTYT VSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVL QSSGLYSL SSWT VPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPK SCDKTHTCPPCPAPEL LGGPDVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPR EEQYNSTYRVV SVLTVLHQDWLNGKEYKCKV SNKALPLPEEKTISKAKGQPREPQ VYT LPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKL TVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO:44); и

Тяжелая цепь B1H1, мутантный вариант 4:

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKVSGVPFTSYYMHWVRQAPGQGLEWMGAIYPGKS DTEYAQKFQGRVTLTADTSTSTAYMELSSLRSEDTATYYCTSTWTHYFDYWGQGTTVT

SSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTV SWNSGALTSGVHTFPAVL QSSGLYSL SSWT VPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPK SCDKTHTCPPCPAPEL LGGPDVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPR EEQYNSTYRVV SVLTVLHQDWLNGKEYKCKV SNKALPLPEEKTISKAKGQPREPQ VYT LPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKL TVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO:45).

В одном варианте реализации данного изобретения предложено анти-B7H4 антитело, в предпочтительном варианте реализации моноклональное антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, который содержит легкую цепь, имеющую участки, определяющие комплементарность (CDR), в соответствии с последовательностями SEQ ID NO:14, 15 и 16.

В одном варианте реализации данного изобретения предложено анти-B7H4 антитело, в предпочтительном варианте реализации моноклональное антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, который содержит тяжелую цепь, содержащую участки, определяющие комплементарность (CDR), в соответствии с последовательностями SEQ ID NO:9, 11 и 30.

В одном варианте реализации данного изобретения предложено анти-B7H4 антитело, в предпочтительном варианте реализации моноклональное антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, котором содержит тяжелую цепь, имеющую участки, определяющие комплементарность (CDR), в соответствии с последовательностями SEQ ID NO:9, 11 и 30.

В одном варианте реализации данного изобретения предложено анти-B7H4 антитело, в предпочтительном варианте реализации моноклональное антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащий легкую цепь, последовательность которой, по меньшей мере, на 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или 100% идентична последовательности SEQ ID NO:13, и тяжелую цепь, последовательность которой, по меньшей мере, на 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или 100% идентична последовательности SEQ ID NO:29.

В другом варианте реализации данного изобретения предложено анти-B7H4 антитело, в предпочтительном варианте реализации моноклональное антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащий вариабельный домен легкой цепи, последовательность которой, по меньшей мере, на 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или 100% идентична любой из последовательностей SEQ ID NO:19, 20, 21, 22 или 23, а также вариабельный домен тяжелой цепи, последовательность которой, по меньшей мере, на 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или 100% идентична любой из последовательностей SEQ ID NO:34, 35, 36 или 37.

В одном варианте реализации данного изобретения предложено анти-B7H4 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащий легкую цепь, аминокислотная последовательность которой соответствует любой из последовательностей SEQ ID NO:24, 25, 26, 27 или 28, и тяжелую цепь, аминокислотная последовательность которой соответствует любой из последовательностей SEQ ID NO:38, 39, 40 или 41.

В другом варианте реализации данного изобретения предложено анти-B7H4 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащий легкую цепь, аминокислотная последовательность которой соответствует любой из последовательностей SEQ ID NOs: 24, 25, 26, 27 или 28, и тяжелую цепь, аминокислотная последовательность которой соответствует любой из последовательностей SEQ ID NO:42, 43, 44 или 45.

В одном варианте реализации данного изобретения предложено анти-B7H4 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащий две легкие цепи и две тяжелые цепи, где две легкие цепи включают полипептид, выбранный из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO:24, 25, 26, 27 или 28, или их варианта, последовательность которого, по меньшей мере, на 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или более идентична последовательностям SEQ ID NO:24, 25, 26, 27 или 28, а две тяжелые цепи включают полипептид, выбранный из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO:38, 39, 40 или 41, или их варианта, последовательность которого, по меньшей мере, на 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или более идентична последовательностям SEQ ID NO:38, 39, 40 или 41, и при этом указанное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент связывается с B7-H4.

В одном варианте реализации данного изобретения предложено антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, который содержит две легкие цепи и две тяжелые цепи, где две легкие цепи включают полипептид, выбранный из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO:24, 25, 26, 27 или 28, или их варианта, последовательность которого, по меньшей мере, на 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или более идентична последовательностям SEQ ID NO:24, 25, 26, 27 или 28, а две тяжелые цепи включают полипептид, выбранный из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO:42, 43, 44 или 45, или их варианта, последовательность которого, по меньшей мере, на 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или более идентична последовательностям SEQ ID NO:42, 43, 44 или 45, и при этом указанное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент связывается с B7-H4.

Последовательности B1H3

В одном варианте реализации данного изобретения мышиное моноклональное антитело продуцируется клоном гибридомы B1H3 и содержит две легкие цепи и две тяжелые цепи, и специфически связывается с B7-H4.

Легкая цепь

В одном варианте реализации данного изобретения предложено мышиное моноклональное анти-B7-H4 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, который содержит легкую цепь, последовательность которой, по меньшей мере, на 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или 100% идентична следующей аминокислотной последовательности:

EIOMTOSPSSMSASLGDTITITC OATODIVKSLN WYOOKPGKPPSFLI YYTTOLAE GVPS R SGSGSGSDYSLTISNLDSEDF A YYCLOFYEFPPTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO:46)

Участки, определяющие комплементарность (CDR), из последовательности SEQ ID NO:46 выделены жирным шрифтом и подчеркнуты:

CDR1 QATQDIVKSLN (SEQ ID NO:14);

CDR2 YYTTQLAE (SEQ ID NO:47); и

CDR3 LQFYEFPPT (SEQ ID NO:16).

В другом варианте реализации данного изобретения предложена нуклеиновая кислота, которая кодирует легкую цепь (SEQ ID NO:46).

Типовой нуклеиновой кислотой, кодирующей легкую цепь (SEQ ID NO:46), является:

GAAATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCTATGTCTGCATCTCTGGGAGACACAATA ACCATCACTTGCCAGGCAACTCAAGACATTGTTAAGAGTTTAAACTGGTATCAACAA AAACCAGGGAAACCCCCTTCATTCCTGATCTATTATACAACTCAACTGGCAGAAGGG GTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGTCAGACTATTCTCTGACAATCAGC AACCTGGACTCTGAAGATTTTGCAGACTATTACTGTCTACAGTTTTATGAGTTTCCTC CGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAA (SEQ ID NO:48).

Тяжелая цепь

В одном варианте реализации данного изобретения предложено мышиное моноклональное анти-B7-H4 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, который содержит тяжелую цепь, последовательность которой, по меньшей мере, на 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или 100% идентична следующей аминокислотной последовательности:

EVOLOOSGTVLARPGASVKMSCKASGYTFS SYWMH WVKORPGOGLEWI GAIYPGKS DTSYNOKFOG KAKLTAVTSASTAEMELTSLTNEDSAVYYCTS TWTHYFDY WGOGTTL TVSS (SEQ ID NO:49).

Участки, определяющие комплементарность (CDR), из последовательности SEQ ID NO:49 выделены жирным шрифтом и подчеркнуты:

CDR1 SYWMH (SEQ ID NO:9);

CDR2 AIYPGKSDTEYNPNFKG (SEQ ID NO:50); и

CDR3 TVRNVMDY (SEQ ID NO:11).

В другом варианте реализации данного изобретения предложена нуклеиновая кислота, кодирующую тяжелую цепь (SEQ ID NO:49).

Типовой нуклеиновой кислотой, кодирующей тяжелую цепь (SEQ ID NO:49), является:

GAGGTTCAGCTCCAGCAGTCTGGGACTGTTCTGGCAAGGCCTGGGGCTTCAGTGAAG ATGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACCTTTTCCAGCTACTGGATGCACTGGGTAAAA CAGAGGCCTGGACAGGGTCTGGAATGGATTGGCGCTATTTATCCTGGAAAAAGTGA TACTAGCTACAACCAGAAGTTCCAGGGCAAGGCCAAACTGACTGCAGTCACATCTG CCAGCACTGCCTTCATGGAGCTCACCAGCCTGACAAATGAGGACTCTGCGGTCTATT ACTGTACAAGTACCTGGACCCACTACTTTGACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCA CAGTCTCCTCA (SEQ ID NO:51).

В одном варианте реализации данного изобретения предложено анти-B7H4 антитело, в предпочтительном варианте реализации моноклональное антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, который содержит легкую цепь, имеющую участки, определяющие комплементарность, в соответствии с последовательностями SEQ ID NO:14, 16 и 47.

В одном варианте реализации данного изобретения предложено анти-B7H4 антитело, в предпочтительном варианте реализации моноклональное антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащий тяжелую цепь, имеющую участки, определяющие комплементарность, в соответствии с последовательностями SEQ ID NO:9, 11 и 50.

В одном варианте реализации данного изобретения предложено анти-B7H4 антитело, в предпочтительном варианте реализации моноклональное антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, который содержит легкую цепь, имеющую участки, определяющие комплементарность (CDR), в соответствии с последовательностями SEQ ID NO:14, 16, и 47, и тяжелую цепь, содержащую CDR в соответствии с последовательностями SEQ ID NO:9, 11, и 50.

В одном варианте реализации данного изобретения предложено анти-B7H4 антитело, в предпочтительном варианте реализации моноклональное антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащий легкую цепь, последовательность которой, по меньшей мере, на 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или 100% идентична последовательности SEQ ID NO:46, и тяжелую цепь, последовательность которой, по меньшей мере, на 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или 100% идентична последовательности SEQ ID NO:49.

Последовательности B1H10

В одном варианте реализации данного изобретения мышиное моноклональное анти-b7h4 антитело продуцируется клоном гибридомы B1H10 и содержит две легкие цепи и две тяжелые цепи.

Легкая цепь

В одном варианте реализации данного изобретения предложено мышиное моноклональное анти-B7H4 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, который содержит легкую цепь, последовательность которой, по меньшей мере, на 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или 100% идентична следующей аминокислотной последовательности:

DIOMTOTT SSL SASLGDRVTISCRASODISNYLNW YOOKPDGTIKLLIY YTSRLHS GVPS RFSGSGSGSDYSLTISNLEOEDIATYEC OOGNTLPWT FGGGTKLEFK (SEQ ID NO:52).

Участки, определяющие комплементарность (CDR), из последовательности SEQ ID NO:52 выделены жирным шрифтом и подчеркнуты:

CDR1 RASQDISNYLN (SEQ ID NO:53);

CDR2 YTSRLHS (SEQ ID NO:54); и

CDR3 QQGNTLPWT (SEQ ID NO 55).

В другом варианте реализации данного изобретения предложена нуклеиновая кислота, которая кодирует легкую цепь (SEQ ID NO:52).

Типовой нуклеиновой кислотой, кодирующей легкую цепь (SEQ ID NO:52), является:

GATATCCAGATGACACAAACTACATCCTCCCTGTCTGCCTCTCTGGGAGACAGAGTC ACCATCAGTTGCAGGGCAAGTCAGGACATTAGCAATTATTTAAACTGGTATCAGCAG AAACCAGATGGAACTATTAAACTCCTGATCTATTACACATCAAGATTACATTCAGGA GTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGATCAGATTATTCTCTCACCATTAGC AACCTGGAGCAAGAAGATATTGCCACTTACTTTTGCCAACAGGGTAATACGCTTCCG TGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAATTCAAA (SEQ IDNO: 56).

В одном варианте реализации данного изобретения предложено моноклональное анти-B7H4 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, который содержит константный домен легкой цепи, последовательность которой, по меньшей мере, на 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или 100% идентична следующей аминокислотной последовательности:

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISNYLNWYQQKPGKTIKLLIYYTSRLHSGVPSR FSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYFCQQGNTLPWTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSD EQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTL SKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO:57)

Гуманизированная легкая цепь B1H10

В другом варианте реализации данного изобретения моноклональное анти-B7H4 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит гуманизированный вариабельный домен легкой цепи, последовательность которой, по меньшей мере, на 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или 100% идентична одной из следующих аминокислотных последовательностей:

Гуманизированная B1H10 VL1:

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISNYLNWYQQKPGKTIKLLIYYTSRLHSGVPSR FSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYFCQQGNTLPWTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO:58)

Гуманизированная B1H10 VL2:

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSRLHSGVPS RFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYFCQQGNTLPWTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO:59)

Гуманизированная B1H10 VL3:

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSRLHSGVPS RFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYFCQQGQTLPWTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO:60)

Гуманизированная B1H10 VL4:

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSRLHSGVPS RFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYFCQQGSTLPWTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO:61)

В одном варианте реализации данного изобретения предложено моноклональное анти-B7H4 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, который содержит гуманизированную легкую цепь, последовательность которой, по меньшей мере, на 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или 100% идентична одной из следующих аминокислотных последовательностей:

Гуманизированная легкая цепь B1H10, вариант 1:

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSRLHSGVPS RFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYFCQQGNTLPWTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPS DEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTL TLSKADYEKHKVYACEVTHQGL SSPVTK SFNRGEC (SEQ ID NO:62)

Гуманизированная легкая цепь B1H10, вариант 2:

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSRLHSGVPS RFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYFCQQGQTLPWTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPS DEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTL TLSKADYEKHKVYACEVTHQGL SSPVTK SFNRGEC (SEQ ID NO:63)

Гуманизированная легкая цепь B1H10, вариант 3:

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSRLHSGVPS RFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYFCQQGSTLPWTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSD EQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTL SKADYEKHKVYACEVTHQGL SSPVTK SFNRGEC (SEQ ID NO:64)

Тяжелая цепь

В одном варианте реализации данного изобретения предложено мышиное моноклональное анти-B7H4 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащий тяжелую цепь, последовательность которой, по меньшей мере, на 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или 100% идентична следующей аминокислотной последовательности:

EVOLOOSGPELVKPGASVKMSCKASGYTFT DYYMN WVROSHGKSLEWI GRVNPSNGG TNYNOKFKG KATLTVDKSLSTAYMOLSSLTSEDSAVYYCA RRHNYADF WGOGTTLTV SS (SEQ ID NO:65).

Участки, определяющие комплементарность (CDR), из последовательности SEQ ID NO:65 выделены жирным шрифтом и подчеркнуты:

CDR1 DYYMN (SEQ ID NO:66);

CDR2 RVNPSNGGTNYNQKFKG (SEQ ID NO:67); и

CDR3 RHNYADF (SEQ ID NO:68).

В другом варианте реализации данного изобретения предложена нуклеиновая кислота, кодирующая тяжелую цепь (SEQ ID NO:65). Типовой нуклеиновой кислотой, кодирующей тяжелую цепь (SEQ ID NO:65), является:

GAGGTCCAGCTGCAACAGTCTGGACCTGAGCTGGTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAA GATGTCCTGTAAGGCTTCTGGATACACATTCACTGACTACTACATGAACTGGGTGAG GCAGAGTCATGGAAAGAGCCTTGAGTGGATTGGACGTGTTAATCCTAGCAATGGTG GTACTAACTACAACCAGAAATTCAAGGGCAAGGCCACATTGACAGTAGACAAATCC CTCAGCACAGCCTACATGCAGCTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCGGTCTAT TACTGTGCAAGACGACATAACTACGCAGACTTCTGGGGCCAAGGCACCACTCTCAC AGTCTCCTCA (SEQ ID NO:69).

Гуманизированная тяжелая цепь B1H10

В одном варианте реализации данного изобретения предложено моноклональное анти-B7H4 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, который содержит гуманизированный вариант вариабельного домена тяжелой цепи, последовательность которой, по меньшей мере, на 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или 100% идентична одной из следующих аминокислотных последовательностей:

Гуманизированная B1H10VH1:

EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYMNWVRQAPGQGLEWIGRVNP SN GG TNYAQKFQGRVTLTVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARRHNYADFWGQGTTVTV SS (SEQ ID NO:70)

Гуманизированная B1H10VH2:

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYMNWVRQAPGQGLEWMGRVNPAN GGTNYAQKFQGRVTLTVDTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARRHNYADFWGQGTTV TVSS (SEQ ID NO:71)

Гуманизированная B1H10VH3:

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYMNWVRQAPGQGLEWMGRVNPSSG GTNYAQKFQGRVTLTVDTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARRHNYADFWGQGTTVT VSS (SEQ ID NO:72)

Гуманизированная B1H10VH4:

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYMNWVRQAPGQGLEWMGRVNPSNG GTNYAQKFQGRVTLTVDTSKSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARRHNYADFWGQGTTVT VSS (SEQ ID NO:73)

Гуманизированная B1H10VH5:

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYMNWVRQAPGQGLEWMGRVNPSSG GTNYAQKFQGRVTLTVDTSKSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARRHNYADFWGQGTTVT VSS (SEQ ID NO:74)

В одном варианте реализации данного изобретения предложено моноклональное анти-B7H4 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, который содержит гуманизированный вариант тяжелой цепи, последовательность которой, по меньшей мере, на 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или 100% идентична одной из следующих аминокислотных последовательностей:

Гуманизированная тяжелая цепь B1H10, вариант 1:

EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYMNWVRQAPGQGLEWIGRVNPSNGG TNYAQKFQGRVTLTVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARRHNYADFWGQGTTVTV SSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQ SSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELL GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREE QYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPP SRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV DKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO:75)

Гуманизированная тяжелая цепь B1H10, вариант 2:

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYMNWVRQAPGQGLEWMGRVNPAN GGTNYAQKFQGRVTLTVDTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARRHNYADFWGQGTTV TVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAV LQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPE LLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPR EEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYT LPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKL TVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO:76)

Гуманизированная тяжелая цепь B1H10, вариант 3:

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYMNWVRQAPGQGLEWMGRVNPSSG GTNYAQKFQGRVTLTVDTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARRHNYADFWGQGTTVT VSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVL QSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEL LGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPRE

EQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTL PPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLT VDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO:77)

Гуманизированная тяжелая цепь B1H10, вариант 4:

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYMNWVRQAPGQGLEWMGRVNPSNG

GTNYAQKFQGRVTLTVDTSKSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARRHNYADFWGQGTTVT

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYMNWVRQAPGQGLEWMGRVNPSNG GTNYAQKFQGRVTLTVDTSKSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARRHNYADFWGQGTTVT VSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVL QSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEL LGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPRE EQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTL PPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLT VDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO:78)

Гуманизированная тяжелая цепь B1H10, вариант 5:

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYMNWVRQAPGQGLEWMGRVNPSSG GTNYAQKFQGRVTLTVDTSKSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARRHNYADFWGQGTTVT VSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVL QSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEL LGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPRE EQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTL PPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLT VDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO:79)

В одном варианте реализации данного изобретения предложено моноклональное анти-B7H4 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, который содержит гуманизированный мутантный вариант тяжелой цепи, последовательность которой, по меньшей мере, на 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или 100% идентична одной из следующих аминокислотных последовательностей:

Гуманизированная мутантная тяжелая цепь B1H10, вариант 1:

EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYMNWVRQAPGQGLEWIGRVNPSNGG TNYAQKFQGRVTLTVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARRHNYADFWGQGTTVTV SSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQ SSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELL GGPDVFLFPPKPKDTLMISRTPEVT CVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPRE

EQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPLPEEKTISKAKGQPREPQVYTL PPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLT VDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO:80)

Гуманизированная мутантная тяжелая цепь B1H10, вариант 2:

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYMNWVRQAPGQGLEWMGRVNPAN GGTNYAQKFQGRVTLTVDTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARRHNYADFWGQGTTV TVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAV LQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPE LLGGPDVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKP

REEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPLPEEKTISKAKGQPREPQVY TLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSK LTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO:81)

Гуманизированная мутантная тяжелая цепь B1H10, вариант 3:

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYMNWVRQAPGQGLEWMGRVNPSSG GTNYAQKFQGRVTLTVDTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARRHNYADFWGQGTTVT VSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVL QSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEL LGGPDVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPR EEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPLPEEKTISKAKGQPREPQVYT LPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKL TVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO:82)

Гуманизированная мутантная тяжелая цепь B1H10, вариант 4:

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYMNWVRQAPGQGLEWMGRVNPSNG GTNYAQKFQGRVTLTVDTSKSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARRHNYADFWGQGTTVT VSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVL QSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEL LGGPDVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPR EEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPLPEEKTISKAKGQPREPQVYT LPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKL TVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO:83)

Гуманизированная мутантная тяжелая цепь B1H10, вариант 5:

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYMNWVRQAPGQGLEWMGRVNPSSG GTNYAQKFQGRVTLTVDTSKSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARRHNYADFWGQGTTVT VSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVL QSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEL LGGPDVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPR EEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPLPEEKTISKAKGQPREPQVYT LPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKL TVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO:84)

В одном варианте реализации данного изобретения предложено анти-B7H4 антитело, в предпочтительном варианте реализации моноклональное антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, который содержит легкую цепь, имеющую участки, определяющие комплементарность, в соответствии с последовательностями SEQ ID NO:53, 54 или 55.

В одном варианте реализации данного изобретения предложено анти-B7H4 антитело, в предпочтительном варианте реализации моноклональное антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащий тяжелую цепь, имеющую участки, определяющие комплементарность, в соответствии с последовательностями SEQ ID NO:66, 67 или 68.

В одном варианте реализации данного изобретения предложено анти-B7H4 антитело, в предпочтительном варианте реализации моноклональное антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, который содержит легкую цепь, имеющую участки, определяющие комплементарность (CDR), в соответствии с последовательностями SEQ ID NO:53, 54 или 55, и тяжелую цепь, содержащую (CDR), в соответствии с последовательностями SEQ ID NO:66, 67 или 68.

В одном варианте реализации данного изобретения предложено анти-B7H4 антитело, в предпочтительном варианте реализации моноклональное антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащий легкую цепь, последовательность которой, по меньшей мере, на 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или 100% идентична последовательности SEQ ID NO:52, и тяжелую цепь, последовательность которой, по меньшей мере, на 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или 100% идентична последовательности SEQ ID NO:65.

В другом варианте реализации данного изобретения предложено анти-B7H4 антитело, в предпочтительном варианте реализации моноклональное антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащий вариабельный домен легкой цепи, последовательность которой, по меньшей мере, на 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или 100% идентична любой из последовательностей SEQ ID NO:58, 59, 60 или 61, и вариабельный домен тяжелой цепи, последовательность которой, по меньшей мере, на 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или 100% идентична любой из последовательностей SEQ ID NO:70, 71, 72, 73 или 74.

В одном варианте реализации данного изобретения предложено анти-B7H4 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащий легкую цепь, аминокислотная последовательность которой соответствует любой из последовательностей SEQ ID NO:62, 63, или 64, и тяжелую цепь, аминокислотная последовательность которой соответствует любой из последовательностей SEQ ID NO:75, 76, 77, 78 или 79.

В другом варианте реализации данного изобретения предложено анти-B7H4 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащий легкую цепь, аминокислотная последовательность которой соответствует любой из последовательностей SEQ ID NO:62, 63 или 64, и тяжелую цепь, аминокислотная последовательность которой соответствует любой из последовательностей SEQ ID NO:80, 81, 82, 83 или 84.

В одном варианте реализации данного изобретения предложено анти-B7H4 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащий две легкие цепи и две тяжелые цепи, где две легкие цепи включают полипептид, выбранный из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO:62, 63 или 64, или их варианта, последовательность которого, по меньшей мере, на 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или более идентична последовательностям SEQ ID NO:62, 63 или 64, а две тяжелые цепи включают полипептид, выбранный из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO:75, 76, 77, 78 или 79, или их варианта, последовательность которого, по меньшей мере, на 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или более идентична последовательностям SEQ ID NO:75, 76, 77, 78 или 79.

В другом варианте реализации данного изобретения предложено анти-B7H4 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащий две легкие цепи и две тяжелые цепи, где две легкие цепи включают полипептид, выбранный из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO:62, 63 или 64, или их варианта, последовательность которого, по меньшей мере, на 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или более идентична последовательностям SEQ ID NO:62, 63 или 64, а две тяжелые цепи включают полипептид, выбранный из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO:80, 81, 82, 83 или 84, или их варианта, последовательность которого, по меньшей мере, на 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или более идентична последовательностям SEQ ID NO:80, 81, 82, 83 или 84.

Последовательности B2E6

В одном варианте реализации данного изобретения мышиное моноклональное анти-B7H4 антитело продуцируется клоном гибридомы B2E6 и содержит две легкие цепи и две тяжелые цепи.

Легкая цепь

В одном варианте реализации данного изобретения предложено мышиное моноклональное анти-B7H4 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, который содержит легкую цепь, последовательность которой, по меньшей мере, на 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или 100% идентична следующей аминокислотной последовательности:

ETYMTOSHKIMSTSVGDRYTIT CKASODVRTAVAWYOOKPGO SPKLLIS SASYOYTGV

PDRFTGSGSGTDFTFTIS SLOAEDLAVYY CHOYYNTPLTF GAGTKLELR (SEQ ID NO:85).

Участки, определяющие комплементарность (CDR), из последовательности SEQ ID NO:85 выделены жирным шрифтом и подчеркнуты:

CDR1 KASQDVRTAVA (SEQ ID NO:4);

CDR2 SASYQYT (SEQ ID NO:86); и

CDR3 HQYYNTPLT (SEQ ID NO:87).

В другом варианте реализации данного изобретения предложена нуклеиновая кислота, которая кодирует легкую цепь (SEQ ID NO:85).

Типовой нуклеиновой кислотой, кодирующей легкую цепь (SEQ ID NO:85), является:

GAAACTGTGATGACCCAGTCTCACAAAATCATGTCCACTTCAGTAGGAGACAGGGT CACCATCACCTGCAAGGCCAGTCAGGATGTGAGAACTGCTGTGGCCTGGTATCAAC AGAAACCAGGACAATCTCCTAAATTACTAATTTCCTCGGCATCCTACCAATACACTG GAGTCCCTGATCGCTTCACTGGCAGTGGATCTGGGACGGATTTCACTTTCACCATCA GCAGTTTGCAGGCTGAAGACCTGGCAGTTTATTACTGTCATCAGTATTATAATACTC CGCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAGA (SEQ ID NO:88).

ii. Тяжелая цепь

В одном варианте реализации данного изобретения предложено мышиное моноклональное анти-B7H4 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, который содержит тяжелую цепь, последовательность которой, по меньшей мере, на 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или 100% идентична следующей аминокислотной последовательности:

EVOLOOSGTVLARPGASVKMSCKASGYTFT SYWMH WVKORPGOGLEWI GAIYPGKS DTTYNOKFEG KAKLTAVTSDSTAYMDLSSLTNEDSAVYYCTS SVRNAMDY WGOGTS VTVSS (SEQ ID NO:89).

Участки, определяющие комплементарность (CDR), из последовательности SEQ ID NO:89 выделены жирным шрифтом и подчеркнуты:

CDR1 SYWMH (SEQ ID NO:9);

CDR2 AIYPGKSDTTYNQKFEG (SEQ ID NO:90); и

CDR3 SVRNAMDY (SEQ ID NO:91).

В другом варианте реализации данного изобретения предложена нуклеиновая кислота, которая кодирует тяжелую цепь (SEQ ID NO:89).Типовой нуклеиновой кислотой, кодирующей тяжелую цепь (SEQ ID NO:89), является:

GAGGTTCAGCTCCAGCAGTCTGGGACTGT GCTGGCAAGGCCTGGGGCTTC AGTGAA GATGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACCTTCACCAGCTACTGGATGCACTGGGTAAA ACAGAGGCCTGGACAGGGTCTGGAATGGATTGGCGCTATTTATCCTGGAAAAAGTG ATACTACCTACAACCAGAAGTTCGAGGGCAAGGCCAAACTGACTGCAGTCACATCT GACAGCACAGCCTACATGGATCTCAGTAGCCTGACAAATGAGGACTCTGCGGTCTAT TACTGTACATCTTCGGTTCGGAATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTC ACCGTCTCCTCA (SEQ ID NO:92).

В одном варианте реализации данного изобретения предложено анти-B7H4 антитело, в предпочтительном варианте реализации моноклональное антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, который содержит легкую цепь, имеющую участки, определяющие комплементарность, в соответствии с последовательностями SEQ ID No:4, 86 и 87.

В одном варианте реализации данного изобретения предложено анти-B7H4 антитело, в предпочтительном варианте реализации моноклональное антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащий тяжелую цепь, имеющую участки, определяющие комплементарность, в соответствии с последовательностями SEQ ID NO:9, 90 и 91.

В одном варианте реализации данного изобретения предложено анти-B7H4 антитело, в предпочтительном варианте реализации моноклональное антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, который содержит легкую цепь, имеющую участки, определяющие комплементарность, в соответствии с последовательностями SEQ ID NO:4, 86, и 87, и тяжелую цепь, имеющую участки, определяющие комплементарность, в соответствии с последовательностями SEQ ID NO:9, 90, и 91.

В одном варианте реализации данного изобретения предложено анти-B7H4 антитело, в предпочтительном варианте реализации моноклональное антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, последовательность которого, по меньшей мере, на 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или 100% идентична последовательности SEQ ID NO:85, и тяжелая цепь, последовательность которой, по меньшей мере, на 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или 100% идентична последовательности SEQ ID NO:89.

Последовательности B4B3

В одном варианте реализации данного изобретения мышиное моноклональное анти-B7H4 антитело продуцируется клоном гибридомы B4B3 и содержит две легкие цепи и две тяжелые цепи.

i. Легкая цепь

В одном варианте реализации данного изобретения предложено мышиное моноклональное анти-B7H4 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, который содержит легкую цепь, последовательность которой, по меньшей мере, на 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или 100% идентична следующей аминокислотной последовательности:

DVLMTOTPLSLPVSLGGOASISC RSSOIIVHSNGNTYLEW YLOKPGOSPKLLI YKVSNR FSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYC FOGSHVPWT FGGGTKLEIK (SEQ ID NO:93)

Участки, определяющие комплементарность (CDR), из последовательности SEQ ID NO:93 выделены жирным шрифтом и подчеркнуты:

CDR1 RSSQIIVHSNGNTYLE (SEQ ID NO:94);

CDR2 KVSNRFS (SEQ ID NO:95); и

CDR3 FQGSHVPWT (SEQ ID NO:96).

В другом варианте реализации данного изобретения предложена нуклеиновая кислота, которая кодирует легкую цепь (SEQ ID NO:93).

Типовой нуклеиновой кислотой, кодирующей легкую цепь (SEQ ID NO:93), является:

GATGTTTTGATGACCCAAACTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGGTCAAGCCT CCATCTCTTGCAGATCTAGTCAGATCATTGTACATAGTAATGGAAACACCTATTTAG AATGGTACCTGCAGAAACCAGGCCAGTCTCCAAAGCTCCTGATCTACAAAGTTTCCA ACCGATTTTCTGGGGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCA CACTCAAGATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATCTGGGAGTTTATTACTGCTTTCAAG GTTCACATGTTCCGTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAA (SEQ ID NO: 97).

ii. Тяжелая цепь

В одном варианте реализации данного изобретения предложено мышиное моноклональное анти-B7H4 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, который содержит тяжелую цепь, последовательность которой, по меньшей мере, на 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или 100% идентична следующей аминокислотной последовательности:

OVOLOOPGAELVKPGASVKLSCKASGYTFI SYWMHW VKORPGOGLEWI GEIDPSDSY TYYNOKFKGKATLTVDKSSSTAYMOL SSLTSEP SAVYYCARRKT WDWYFDVWGAG TTVTVSS (SEQ ID NO:98).

Участки, определяющие комплементарность (CDR), из последовательности SEQ ID NO:98 выделены жирным шрифтом и подчеркнуты:

CDR1 SYWMH (SEQ ID NO:9);

CDR2 EIDPSDSYTYYNQKFKG (SEQ ID NO:99); и

CDR3 RKTWDWYFDV (SEQ ID NO:100).

В другом варианте реализации данного изобретения предложена нуклеиновая кислота, которая кодирует тяжелую цепь (SEQ ID NO:98).Типовой нуклеиновой кислотой, кодирующей тяжелую цепь (SEQ ID NO:98), является:

CAGGTCCAGCTGCAGCAGCCTGGGGCTGAACTGGTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAA GCTGTCCTGCAAGGCTTCTGGATACACCTTCATTAGCTACTGGATGCACTGGGTGAA GCAGAGGCCTGGACAAGGCCTTGAGTGGATCGGAGAGATTGATCCTTCTGATAGTT ATACTTACTACAATCAAAAGTTCAAGGGCAAGGCCACATTGACTGTAGACAAATCCT CCAGCACAGCCTACATGCAACTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCGGTCTATT ACTGTGCAAGAAGGAAAACCTGGGACTGGTACTTCGATGTCTGGGGCGCAGGGACC ACGGTCACCGTCTCCTCA (SEQ ID NO:101).

В одном варианте реализации данного изобретения предложено анти-B7H4 антитело, в предпочтительном варианте реализации моноклональное антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, который содержит легкую цепь, имеющую участки, определяющие комплементарность, в соответствии с последовательностями SEQ ID NO:94, 95 и 96.

В одном варианте реализации данного изобретения предложено анти-B7H4 антитело, в предпочтительном варианте реализации моноклональное антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, который содержит тяжелую цепь, имеющую участки, определяющие комплементарность, в соответствии с последовательностями SEQ ID NO:9, 99 и 100.

В одном варианте реализации данного изобретения предложено анти-B7H4 антитело, в предпочтительном варианте реализации моноклональное антитело, или антигенсвязывающий фрагмент, который содержит легкую цепь, имеющую участки, определяющие комплементарность, в соответствии с последовательностями SEQ ID NO:94, 95 и 96, и тяжелую цепь, имеющую участки, определяющие комплементарность, в соответствии с последовательностями SEQ ID NO:9, 99 и 100.

В одном варианте реализации данного изобретения предложено анти-B7H4 антитело, в предпочтительном варианте реализации моноклональное антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, который содержит легкую цепь, последовательность которой, по меньшей мере, на 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или 100% идентична последовательности SEQ ID NO:93, и тяжелую цепь, последовательность которой, по меньшей мере, на 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или 100% идентична последовательности SEQ ID NO:98.

Последовательности B4E11

В одном варианте реализации данного изобретения мышиное моноклональное анти-B7H4 антитело продуцируется клоном гибридомы B4E11 и содержит две легкие цепи и две тяжелые цепи.

i. Легкая цепь

В одном варианте реализации данного изобретения предложено мышиное моноклональное анти-B7H4 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, который содержит легкую цепь, последовательность которой, по меньшей мере, на 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или 100% идентична следующей аминокислотной последовательности:

DIVMT OSHKFMSTS VGDRYTIT CKASOD VSTA VAWY OOKPGO SPKLLIS SASYRYTGV PDRFTGSGSGTDFTFTISSVOAEDLAVYYC OOHYSTPT FGGGTKLEIR (SEQ ID NO:102).

Участки, определяющие комплементарность (CDR), из последовательности SEQ ID NO:102 выделены жирным шрифтом и подчеркнуты:

CDR1 KASQDVSTAVA (SEQ ID NO:103);

CDR2 SASYRYT (SEQ ID NO:104); и

CDR3 QQHYSTPT (SEQ ID NO:105).

В другом варианте реализации данного изобретения предложена нуклеиновая кислота, которая кодирует легкую цепь (SEQ ID NO:102).

Типовой нуклеиновой кислотой, кодирующей легкую цепь (SEQ ID NO:102), является:

GACATTGTGATGACCCAGTCTCACAAATTCATGTCCACATCAGTAGGAGACAGGGTC ACTATCACCTGCAAGGCCAGTCAGGATGTGAGTACTGCTGTAGCCTGGTATCAACAG AAACCAGGACAGTCTCCTAAACTACTGATTTCCTCGGCATCCTACCGGTACACTGGA GTCCCTGATCGCTTCACTGGCAGTGGATCTGGGACGGATTTCACTTTCACCATCAGC

AGTGTGCAGGCTGAAGACCTGGCAGTTTATTACTGTCAGCAACATTATAGTACTCCG ACGTTCGGT GGAGGC ACCAAGCTGGAAAT CAGA (SEQ ID NO:106).

ii. Тяжелая цепь

В одном варианте реализации данного изобретения предложено мышиное моноклональное анти-B7H4 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, который содержит тяжелую цепь, последовательность которой, по меньшей мере, на 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или 100% идентична следующей аминокислотной последовательности:

EVOLOOSGTVLARPGASVKMSCKASGYTFT SYWMH WVKERPGOGLEWI GAIYPGDSD TRYNOKFKG RAKLTAVTSANTAYMELSSLTNDDSAVFYCTC TTAGVLDY WGOGTSV

TVSS (SEQ ID NO:107).

Участки, определяющие комплементарность (CDR), из последовательности SEQ ID NO:107 выделены жирным шрифтом и подчеркнуты:

CDR1 SYWMH (SEQ ID NO:9);

CDR2 AIYPGDSDTRYNQKFKG (SEQ ID NO:108); и

CDR3 TTAGVLDY (SEQ ID NO:109).

В другом варианте реализации данного изобретения предложена нуклеиновая кислота, которая кодирует тяжелую цепь (SEQ ID NO:107).Типовой нуклеиновой кислотой, кодирующей тяжелую цепь (SEQ ID NO:107), является:

GAGGTTC AGCTCC AGCAGTCTGGGACTGT GCTGGC AAGGCCTGGGGCTTC AGTGAA GATGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACCTTTACCAGCTACTGGATGCACTGGGTAAA AGAGAGGCCTGGAC AGGGTCTGGAAT GGATT GGCGCT ATTTATCCTGGAGAT AGTG ATACTAGGTATAATCAGAAGTT CAAGGGC AGGGCC AAACTGACTGC AGTCACATCT GCCAACACTGCCTACATGGAGCTCAGCAGCCTGACAAATGATGACTCTGCGGTCTTC TACTGTACATGTACTACGGCTGGTGTTTTGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTC ACCGTCTCCTCA (SEQ ID NO:110).

В одном варианте реализации данного изобретения предложено анти-B7H4 антитело, в предпочтительном варианте реализации моноклональное антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, который содержит легкую цепь, имеющую участки, определяющие комплементарность, в соответствии с последовательностями SEQ ID NO:103, 104 и 105.

В одном варианте реализации данного изобретения предложено анти-B7H4 антитело, в предпочтительном варианте реализации моноклональное антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, который содержит тяжелую цепь, имеющую участки, определяющие комплементарность, в соответствии с последовательностями SEQ ID NO:9, 108 и 109.

В одном варианте реализации данного изобретения предложено анти-B7H4 антитело, в предпочтительном варианте реализации моноклональное антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, который содержит легкую цепь, имеющую участки, определяющие комплементарность, в соответствии с последовательностями SEQ ID NO:103, 104 и 105, а также тяжелую цепь, имеющую участки, определяющие комплементарность, в соответствии с последовательностями SEQ ID NO:9, 108 и 109.

В одном варианте реализации данного изобретения предложено анти-B7H4 антитело, в предпочтительном варианте реализации моноклональное антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, который содержит легкую цепь, последовательность которой, по меньшей мере, на 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или 100% идентична последовательности SEQ ID NO:102, и тяжелую цепь, последовательность которой, по меньшей мере, на 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или 100% идентична последовательности SEQ ID NO:107.

Последовательности B6C8

В одном варианте реализации данного изобретения мышиное моноклональное анти- B7H4 антитело продуцируется клоном гибридомы B6С8 и содержит две легкие цепи и две тяжелые цепи.

Легкая цепь

В одном варианте реализации данного изобретения предложено мышиное моноклональное анти-B7H4 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, который содержит легкую цепь, последовательность которой, по меньшей мере, на 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или 100% идентична следующей аминокислотной последовательности:

DVVMTOTPLSLPVSLGDOASISC TSSOSIVHGNGNTYLEW YLOKPGOSPKLLI YKVSNR

F SGVPDRF SGSGSGTDF TLKI SR E AEDLGV YYCFOGSHVPYTF GGGTKLEIK

(SEQ ID NO:111).

Участки, определяющие комплементарность (CDR), из последовательности SEQ ID NO:111 выделены жирным шрифтом и подчеркнуты:

CDR1 TSSQSIVHGNGNTYLE (SEQ ID NO:112);

CDR2 KVSNRFS (SEQ ID NO:95); и

CDR3 FQGSHVPYT (SEQ ID NO:113).

В другом варианте реализации данного изобретения предложена нуклеиновая кислота, которая кодирует легкую цепь (SEQ ID NO:111).

Типовой нуклеиновой кислотой, кодирующей легкую цепь (SEQ ID NO:111), является:

GATGTTGTGATGACCCAAACTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGATCAGGCC TCCATCTCTTGCACATCTAGTCAGAGCATTGTACATGGTAATGGAAACACCTATTTA GAATGGTACCTGCAGAAGCCAGGCCAGTCTCCAAAGCTCCTGATCTACAAAGTTTCC AACCGATTTTCTGGGGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTC ACACTCAAGATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATCTGGGAGTTTATTACTGCTTTCAA GGTTCACATGTTCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAA

(SEQ ID NO:114).

ii. Тяжелая цепь

В одном варианте реализации данного изобретения предложено мышиное моноклональное анти-B7H4 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, который содержит тяжелую цепь, последовательность которой, по меньшей мере, на 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или 100% идентична следующей аминокислотной последовательности:

OVOLOOPGAELVKPGASVKLSCKASGYSFTSYWMNWVKORPGRGLEWIGRIHPSDSE

THYNOKFKSK ATLTVDKSSSTAYIOL SSLTSEP SAVYFCARYGLFYGNDGYAMDHWG

QGTSVTVSS (SEQ ID NO:115).

Участки, определяющие комплементарность (CDR), из последовательности SEQ ID NO:115 выделены жирным шрифтом и подчеркнуты:

CDR1 SYWMN (SEQ ID NO:116);

CDR2 RIHPSDSETHYNQKFKS (SEQ ID NO:117); и

CDR3 YGLFYGNDGYAMDH (SEQ ID NO:118)

В другом варианте реализации данного изобретения предложена нуклеиновая кислота, которая кодирует тяжелую цепь (SEQ ID NO:115).Типовой нуклеиновой кислотой, кодирующей тяжелую цепь (SEQ ID NO:115), является:

CAGGTCC AACTGC AGCAGCCTGGGGCTGAACTGGT GAAGCCTGGGGCTTC AGTGAA GCTGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACTCTTTCACCAGCTACTGGATGAACTGGGTGAA GCAGAGGCCTGGACGAGGCCTCGAGT GGATTGGAAGGATTC ATCCTTCTGAT AGTG AAACTCACTACAATCAAAAGTTCAAGAGCAAGGCCACACTGACTGTAGACAAATCC TCCAGCACAGCCTACATCCAACTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCGGTCTAT TTTTGTGCAAGATACGGGCTCTTCTATGGTAACGACGGATATGCTATGGACCACTGG GGTCAAGGA ACCTCAG (SEQ ID NO:119).

В одном варианте реализации данного изобретения предложено анти-B7H4 антитело, в предпочтительном варианте реализации моноклональное антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, который содержит легкую цепь, имеющую участки, определяющие комплементарность, в соответствии с последовательностями SEQ ID NO:97, 116 и 117.

В одном варианте реализации данного изобретения предложено анти-B7H4 антитело, в предпочтительном варианте реализации моноклональное антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, который содержит тяжелую цепь, имеющую участки, определяющие комплементарность, в соответствии с последовательностями SEQ ID NO:118, 119 и 120.

В одном варианте реализации данного изобретения предложено анти-B7H4 антитело, в предпочтительном варианте реализации моноклональное антитело или антигенсвязывающий фрагмент, который содержит легкую цепь, имеющую участки, определяющие комплементарность, в соответствии с последовательностями SEQ ID NO:97, 114 и 115, и тяжелую цепь, имеющую участки, определяющие комплементарность, в соответствии с последовательностями SEQ ID NO:118, 119 и 120.

В одном варианте реализации данного изобретения предложено анти-B7H4 антитело, в предпочтительном варианте реализации моноклональное антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, который содержит легкую цепь, последовательность которой, по меньшей мере, на 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или 100% идентична последовательности SEQ ID NO:l13, и тяжелую цепь, последовательность которой, по меньшей мере, на 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или 100% идентична последовательности SEQ ID NO:117.

i. Последовательности B9H1

В одном варианте реализации данного изобретения мышиное моноклональное анти- B7H4 антитело продуцируется клоном гибридомы B9H1 и содержит две легкие цепи и две тяжелые цепи.

Легкая цепь

В одном варианте реализации данного изобретения предложено мышиное моноклональное анти-B7H4 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, который содержит легкую цепь, последовательность которой, по меньшей мере, на 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или 100% идентична следующей аминокислотной последовательности:

DIOMTOTT SSL SASLGDRVTISC RASODISF YLNW YOOKPDGT VKLLIYYTSRLHS GVPS

RF SGSGSGTDYSLTISNLEOEDIATYE COOGNTLPWTF GGGTKLEIK (SEQ ID NO:120).

Участки, определяющие комплементарность (CDR), из последовательности SEQ ID NO:120 выделены жирным шрифтом и подчеркнуты:

CDR1 RASQDISFYLN (SEQ ID NO:121);

CDR2 YTSRLHS (SEQ ID NO:54); и

CDR3 QQGNTLPWT (SEQ ID N0 55).

В другом варианте реализации данного изобретения предложена нуклеиновая кислота, которая кодирует легкую цепь (SEQ ID NO:120).

Типовой нуклеиновой кислотой, кодирующей легкую цепь (SEQ ID NO:120), является:

GATATCCAGATGACACAGACTACATCCTCCCTGTCTGCCTCTCTGGGAGACAGAGTC ACCATCAGTTGCAGGGCAAGTCAGGACATTAGCTTTTATTTAAACTGGTATCAGCAG AAACCAGATGGAACTGTTAAACTCCTGATCTACTACACATCAAGATTACACTCAGGA GTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGAACAGATTATTCTCTCACCATTAGC AACCTGGAGCAAGAAGATATTGCCACTTACTTTTGCCAACAGGGTAATACACTTCCG TGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAA (SEQ ID NO:122).

Тяжелая цепь

В одном варианте реализации данного изобретения предложено мышиное моноклональное анти-B7H4 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, который содержит тяжелую цепь, последовательность которой, по меньшей мере, на 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или 100% идентична следующей аминокислотной последовательности:

EVOLOOSGPELVKPGASVKMSCKASGYTFT DYYMN WVKOSHGKSLEWI GRVNPSNG

GTS YNOKFKGK ATLTVDKSL SAAYMOLN SLTSEP SAVYYCARRHNYPD YWGOGTTL

TVSS (SEQ ID NO:123).

Участки, определяющие комплементарность (CDR), из последовательности SEQ ID NO:123 выделены жирным шрифтом и подчеркнуты:

CDR1 DYYMN (SEQ ID NO:66);

CDR2 RVNPSNGGTSYNQKFKG (SEQ ID NO:124); и

CDR3 RHNYPDY (SEQ ID NO:125).

В другом варианте реализации данного изобретения предложена нуклеиновая кислота, которая кодирует тяжелую цепь (SEQ ID NO:125).Типовой нуклеиновой кислотой, кодирующей тяжелую цепь (SEQ ID NO:125), является:

GAGGTCCAGCTGCAACAGTCTGGACCTGAACTGGTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAA GATGTCCTGTAAGGCTTCTGGATACACATTCACTGACTACTACATGAACTGGGTGAA GCAGAGTC ATGGAAAGAGCCTTGAGTGGATT GGACGT GTTAATCCT AGCAATGGT G GTACTAGCTACAACCAGAAGTTC AAGGGC AAGGCC ACATTGAC AGTAGACAAATCC CTCAGCGCAGCCTATATGCAGCTCAACAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCGGTCTAT TACTGTGCAAGAAGGCATAACTACCCTGACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCAC AGTCTCCTCA (SEQ ID NO:126).

В одном варианте реализации данного изобретения предложено анти-B7H4 антитело, в предпочтительном варианте реализации моноклональное антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, который содержит легкую цепь, имеющую участки, определяющие комплементарность, в соответствии с последовательностями SEQ ID NO:54, 55 и 121.

В одном варианте реализации данного изобретения предложено анти-B7H4 антитело, в предпочтительном варианте реализации моноклональное антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, который содержит тяжелую цепь, имеющую участки, определяющие комплементарность, в соответствии с последовательностями SEQ ID NO:66, 124 и 125.

В одном варианте реализации данного изобретения предложено анти-B7H4 антитело, в предпочтительном варианте реализации моноклональное антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, который содержит легкую цепь, имеющую участки, определяющие комплементарность, в соответствии с последовательностями SEQ ID NO:54, 55 и 121, и тяжелую цепь, имеющую участки, определяющие комплементарность, в соответствии с последовательностями SEQ ID NO:66, 124 и 125.

В одном варианте реализации данного изобретения предложено анти-B7H4 антитело, в предпочтительном варианте реализации моноклональное антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, который содержит легкую цепь, последовательность которой, по меньшей мере, на 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или 100% идентична последовательности SEQ ID NO:120, и тяжелая цепь, последовательность которой, по меньшей мере, на 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или 100% идентична последовательности SEQ ID NO:123.

Последовательности B10D7

В одном варианте реализации данного изобретения мышиное моноклональное анти-B7H4 антитело продуцируется клоном гибридомы B10D7 и содержит две легкие цепи и две тяжелые цепи.

Легкая цепь

В одном варианте реализации данного изобретения предложено мышиное моноклональное анти-B7H4 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, который содержит легкую цепь, последовательность которой, по меньшей мере, на 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или 100% идентична следующей аминокислотной последовательности:

EIOMTO SP SSMSASLGDRITITCOATODIVKSLNW YOOKPGKPP SFLIYYTAOLAEGVP S RFSGSGSGSDYSLTI SNLESEDF ADYYCLOF YEFPPTF GGGTKLEIK (SEQ ID NO:13).

Участки, определяющие комплементарность (CDR), из последовательности SEQ ID NO:13 выделены жирным шрифтом и подчеркнуты:

CDR1 QATQDIVKSLN (SEQ ID NO:14);

CDR2 YTAQLAE (SEQ ID NO:15); и

CDR3 LQFYEFPPT (SEQ ID NO:16).

В другом варианте реализации данного изобретения предложена нуклеиновая кислота, которая кодирует легкую цепь (SEQ ID NO:13).

Типовой нуклеиновой кислотой, кодирующей легкую цепь (SEQ ID NO:13), является:

GAAATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCTATGTCTGCATCTCTGGGAGACAGAATA ACCATCACTTGCCAGGCAACTCAAGACATTGTTAAGAGTTTAAACTGGTATCAACAA AAACCAGGGAAACCCCCTTCATTCCTGATCTATTATACAGCTCAACTGGCAGAAGGG GTCCCGTCAAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGTCAGACTATTCTCTGACAATCAGC AACCTGGAGTCTGAAGATTTTGCAGACTATTACTGTCTACAGTTTTATGAGTTTCCTC CGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAA (SEQ ID NO:127).

Тяжелая цепь

В одном варианте реализации данного изобретения предложено мышиное моноклональное анти-B7H4 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, который содержит тяжелую цепь, последовательность которой, по меньшей мере, на 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или 100% идентична следующей аминокислотной последовательности:

EVOLOOSGTVLARPGASVKMSCKASGYPFT SYWMHW VKORPGOGLEWI GAIYPGNSD TRYNPNFKG KANLTAVTSATTAYMELSSLTNEESAVYYCTS TWTHYFDY WGOGTTLT

VSS (SEQ ID NO:128).

Участки, определяющие комплементарность (CDR), из последовательности SEQ ID NO:128 выделены жирным шрифтом и подчеркнуты:

CDR1 SYWMH (SEQ ID NO:9);

CDR2 AIYPGNSDTRYNPNFKG (SEQ ID NO:129); и

CDR3 TWTHYFDY (SEQ ID NO:130).

В другом варианте реализации данного изобретения предложена нуклеиновая кислота, которая кодирует тяжелую цепь (SEQ ID NO:128).Типовой нуклеиновой кислотой, кодирующей тяжелую цепь (SEQ ID NO:128), является:

GAGGTTC AGCTCC AGCAGTCTGGGACTGT GCTGGC AAGGCCTGGGGCTTC AGTGAA GATGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACCCCTTTACCAGCTACTGGATGCACTGGGTAAA GCAGAGGCCTGGACAGGGTCTGGAATGGATTGGCGCTATTTATCCTGGAAATAGTG ATACTAGGTACAACCCGAATTTCAAGGGCAAGGCCAACCTGACTGCAGTCACATCT GCCACCACTGCCTACATGGAGCTCAGCAGCCTGACAAATGAGGAATCTGCGGTCTA TTACTGTACAAGTACCTGGACCCACTACTTTGACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCT CACAGTCTCCTCA (SEQ ID NO:131).

В одном варианте реализации данного изобретения предложено анти-B7H4 антитело, в предпочтительном варианте реализации моноклональное антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, который содержит легкую цепь, имеющую участки, определяющие комплементарность, в соответствии с последовательностями SEQ ID NO:14, 15 и 16.

В одном варианте реализации данного изобретения предложено анти-B7H4 антитело, в предпочтительном варианте реализации моноклональное антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, который содержит тяжелую цепь, имеющую участки, определяющие комплементарность, в соответствии с последовательностями SEQ ID NO:9, 129 и 130.

В одном варианте реализации данного изобретения предложено анти-B7H4 антитело, в предпочтительном варианте реализации моноклональное антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, который содержит легкую цепь, имеющую участки, определяющие комплементарность, в соответствии с последовательностями SEQ ID NO:14, 15 и 16, и тяжелую цепь, имеющую участки, определяющие комплементарность, в соответствии с последовательностями SEQ ID NO:9, 129 и 130.

В одном варианте реализации данного изобретения предложено анти-B7H4 антитело, в предпочтительном варианте реализации моноклональное антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, который содержит легкую цепь, последовательность которой, по меньшей мере, на 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или 100% идентична последовательности SEQ ID NO:13, и тяжелую цепь, последовательность которой, по меньшей мере, на 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или 100% идентична последовательности SEQ ID NO:128.

2. Композиции антител

Описанные молекулы, связывающие B7-H4, могут быть антителами или их антигенсвязывающими фрагментами. Описанные антитела и их антигенсвязывающие фрагменты включают нативный иммуноглобулин (т.е. интактное антитело) любого класса, его фрагменты и синтетические белки, содержащие, по меньшей мере, антигенсвязывающий вариабельный домен антитела. В некоторых вариантах реализации данного изобретения описанная молекула содержит как легкую цепь антитела, так и, по меньшей мере, вариабельный домен тяжелой цепи антитела. В других вариантах реализации данного изобретения такие молекулы могут дополнительно включать одну или несколько участков CHi, шарнир, CH2, CH3 и CH4 тяжелой цепи (особенно участки CHi и шарнир, или участки CHi, шарнир и CH2, или участки CHi, шарнир, CH2 и CH3). Антитело может быть выбрано из любого класса иммуноглобулинов, включая IgM, IgG, IgD, IgA и IgE, и любого изотипа, включая IgGi, IgG2, IgG3 и IgG4. В некоторых вариантах реализации данного изобретения константный домен представляет собой комплемент-фиксирующий константный домен, где желательно, чтобы указанное антитело проявляло цитотоксическую активность, и относилось, как правило, к классу IgGi. В других вариантах реализации данного изобретения, где такая цитотоксическая активность нежелательна, константный домен может относиться к классу IgG2 или IgG4. Указанное антитело может включать последовательности из более чем одного класса или изотипа, а выбор конкретных константных доменов для оптимизации требуемых эффекторных функций относится к обычным практическим навыкам в данной области техники.

Указанные вариабельные домены различаются среди антител последовательностями и применяются для специфичного связывания каждого конкретного антитела с его конкретным антигеном. Однако обычно вариабельность не распределяется равномерно по вариабельным доменам антител. Она, как правило, концентрируется в трех сегментах, называемых участками, определяющими комплементарность (CDR), или гипервариабельными участками как в легкой цепи, так и в тяжелой цепи вариабельных доменов. Наиболее сохранные части вариабельных доменов называются каркасными участками (FR). Вариабельные домены нативных тяжелых и легких цепей состоят из четырех участков FR (в основном принимающих конфигурацию складчатого бета-слоя), соединенных тремя участками CDR, которые образуют петли, соединяющие, а в некоторых случаях образующие, часть структуры складчатого бета-слоя. Участки CDR в каждой цепи удерживаются вместе в непосредственной близости участками FR и вместе с участками CDR из другой цепи способствуют образованию антигенсвязывающего сайта антител.

Также описаны фрагменты антител, обладающих биоактивностью. Указанные фрагменты (независимо от того, присоединены ли они к другим последовательностям или нет) включают инсерции, делеции, замещения или другие выбранные модификации определенных участков или конкретных аминокислотных остатков, при условии, что активность этого фрагмента существенно не изменяется или не нарушается по сравнению с немодифицированным антителом или фрагментом антитела.

Также могут быть адаптированы способы получения одноцепочечных антител, специфичных к B7-H4. Способы получения одноцепочечных антител хорошо известны специалистам в данной области техники. Одноцепочечное антитело можно создать путем совместного слияния вариабельных доменов тяжелой и легкой цепи с помощью короткого пептидного линкера, тем самым воссоздавая антигенсвязывающий сайт на одной молекуле. Одноцепочечные вариабельные фрагменты антител (scfv), в которых С-конец одного вариабельного домена связан с N-концом другого вариабельного домена через пептид, состоящий из остатков 15-25 аминокислот, или линкер, были разработаны без существенного нарушения связывания антигена или специфичности связывания. Линкер выбирают таким образом, чтобы позволить тяжелой цепи и легкой цепи связываться вместе в правильной конформационной ориентации.

Двухвалентные одноцепочечные вариабельные фрагменты (di-scfv) можно искусственно создавать путем соединения двух фрагментов scfv. Это можно сделать путем получения однопептидной цепи с двумя участками VH и двумя участками VL, что дает тандемные фрагменты scfv. Фрагменты scfv также можно создать с помощью линкерных пептидов, которые слишком коротки для того, чтобы два вариабельных участка свернулись вместе (около пяти аминокислот), вынуждая фрагменты scfv димеризоваться. Этот тип известен как диатела. Было показано, что диатела имеют константы диссоциации до 40 раз ниже, чем соответствующие фрагменты scfv, что означает то, что они обладают гораздо более высоким сродством к своей мишени. Еще более короткие линкеры (одна или две аминокислоты) приводят к образованию тримеров (триател или триотел). Были также созданы тетратела. Они демонстрируют еще более высокое сродство к своим мишеням, чем диатела.

В одном варианте реализации данного изобретения предложено моноклональное антитело, полученное из достаточно однородной популяции антител (т.е. отдельные антитела внутри популяции идентичны за исключением возможных естественных мутаций, которые могут присутствовать в небольшой субпопуляции молекул антител). Моноклональные антитела включают «химерные» антитела, в которых часть тяжелой и/или легкой цепи идентична или гомологична соответствующим последовательностям в антителах, полученных из определенного вида или принадлежащих к определенному классу или подклассу антител, тогда как остальная часть цепи (цепей) идентична или гомологична соответствующим последовательностям в антителах, полученных из другого вида или принадлежащих к другому классу или подклассу антител, а также фрагменты таких антител, поскольку они проявляют желаемую антагонистическую активность.

В одном варианте реализации данного изобретения предложены антитела и их антигенсвязывающие фрагменты, специфически связывающиеся с человеческим B7-H4.

В одном варианте реализации данного изобретения предложены антитела, продуцируемые гибридомой из группы, состоящей из B1A1, B1H1, B1H3, B1H10, B2E6, B4B2, B4E11, B6C8, B9H1 и b10d7.

a. Антитела

Иммуномодулирующим агентом может быть антитело. Пригодные для этой цели антитела известны в данной области техники или могут быть получены специалистом в данной области техники. Последовательности нуклеиновых кислот и полипептидов для B7-H4 известны в данной области техники, а типовые белковые последовательности приведены выше. Указанные последовательности могут быть применены (как рассмотрено более подробно ниже) специалистом в данной области техники для получения антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, специфичного к B7-H4. Таким образом, антитело или антигенсвязывающий фрагмент могут быть агонистом или антагонистом сигнальной системы B7-H4.

Активность (агонистическая или антагонистическая) антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, которая специфична к B7-H4, может быть определена с помощью функциональных анализов, известных в данной области техники, которые рассмотренные ниже. Как правило, эти анализы включают определение того, увеличивает ли антитело или его антигенсвязывающий фрагмент (т. е. агонист) или уменьшает (т. е. антагонист) передачу сигналов посредством B7-H4. Поскольку трансдукция сигнала B7-H4 приводит к подавлению иммунного ответа, B7-H4, имеющий агонистический эффект, вызывает подавленный или ослабленный иммунный ответ. Передача сигналов B7-H4, имеющего антагонистический эффект, ингибирует ослабленный иммунный ответ, что приводит к общему усилению иммунного ответа.

В некоторых вариантах реализации данного изобретения описанные антитела и их антигенсвязывающие фрагменты иммуноспецифически связываются с B7-H4. В некоторых вариантах реализации данного изобретения антитело связывается с внеклеточным доменом B7-H4.

Например, предлагаются молекулы, которые могут иммуноспецифически связываться с B7-H4:

(I) расположенным на поверхности клетки (особенно живой клетки);

(II) расположенным на поверхности клетки (особенно живой клетки) в эндогенной концентрации;

(III) расположенным на поверхности живой клетки, и которые модулируют связывание между B7-H4 и его лигандом;

(IV) расположенным на поверхности живой клетки, и которые уменьшают или ингибируют иммуносупрессию, вызванную B7-H4;

(V) расположенным на поверхности живой клетки, и которые индуцируют или усиливают иммуносупрессию, вызванную B7-H4;

(VI) расположенным на поверхности живой клетки, где эта клетка является опухолевой клеткой;

(VII) комбинации I-IV и VI;

(VIII) комбинации I-III и V-IV; и

(IX) расположенным на поверхности живых раковых клеток миелоидного или лимфоидного происхождения (AML или ALL), и усиливают апоптоз и дифференцировку, которая приводит к снижению самообновления стволовых раковых клеток.

В некоторых вариантах реализации данного изобретения эти молекулы способны индуцировать антителозависимую клеточную цитотоксичность (АЗКЦ), комплемент-зависимую цитотоксичность (КЗЦ) или клеточный апоптоз посредством других механизмов клеток, экспрессирующих B7-H4.

Для получения антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, который специфически связывается с B7-H4, могут применяться очищенные белки, полипептиды, фрагменты, слияния или эпитопы с B7-H4, или экспрессированные полипептиды из последовательностей их нуклеиновых кислот. Антитела или их антигенсвязывающие фрагменты можно получить любыми приемлемыми способами, известными в данной области техники, такими как способы, более подробно представленные ниже.

i. Человеческие и гуманизированные антитела

Многие антитела, не являющиеся человеческими (например, полученные от мышей, крыс или кроликов), являются естественными антигенами у человека и, таким образом, могут вызывать нежелательные иммунные реакции при введении людям. Поэтому использование человеческих или гуманизированных антител в этих способах служит уменьшению вероятности того, что антитело, вводимое человеку, вызовет нежелательный иммунный ответ.

Могут использоваться трансгенные животные (например, мыши), способные при иммунизации продуцировать полный спектр человеческих антител в отсутствие эндогенного продуцирования иммуноглобулинов. Например, было описано, что гомозиготная делеция гена участка присоединения тяжелой цепи антитела (J(H)) у мышей-мутантов химерной и зародышевой линий приводит к полному ингибированию продуцирования эндогенных антител. Перенос человеческой генетической информации иммуноглобулинов зародышевой линии у таких мутантных мышей зародышевой линии приведет к выработке человеческих антител при стимуляции антигена.

Дополнительно антитела генерируются в других видах и «гуманизируются» для введения человеку. Гуманизированные формы антител, не являющиеся человеческими (например, мышиных), представляют собой химерные иммуноглобулины, цепи иммуноглобулинов или их фрагменты (такие как Fv, Fab, Fab’, F(ab’)₂ или другие антигенсвязывающие последовательности антител), которые содержат минимальную последовательность, полученную из иммуноглобулина, не являющегося человеческим. Гуманизированные антитела включают человеческие иммуноглобулины (антитела-реципиенты), в которых остатки из участков, определяющих комплементарность (CDR), антитела-реципиента заменяются остатками из CDR вида, не относящегося к человеку (донорскими антителами), такими как мыши, крысы или кролика, обладающими желаемой специфичностью, аффинностью и способностью. В некоторых случаях остатки каркаса Fv иммуноглобулина человека заменяются соответствующими остатками, не являющихся человеческими. Гуманизированные антитела могут также содержать остатки, которые не обнаружены ни в антителе-реципиенте, ни в импортированных последовательностях CDR или каркаса. В целом гуманизированное антитело будет содержать практически все, по меньшей мере, из одного, а, как правило, из двух вариабельных доменов, в которых все или практически все участки CDR соответствуют участкам, иммуноглобулина, не являющегося человеческим, а все или практически все участки FR являются участками консенсусной последовательности иммуноглобулина человека. Оптимально гуманизированное антитело также будет содержать, по меньшей мере, часть константного участка иммуноглобулина (Fc), как правило, участка человеческого иммуноглобулина.

Способы гуманизации антител, не являющихся человеческими, хорошо известны в данной области техники. Как правило, гуманизированное антитело имеет один или несколько аминокислотных остатков, введенных в него из источника, который не является человеческим. Эти аминокислотные остатки, не являющиеся человеческими, часто называют «импортными» остатками, которые обычно взяты из области «импортного» вариабельного домена. Технологии гуманизации антител обычно включают использование технологии рекомбинантной ДНК для манипулирования последовательностью ДНК, кодирующей одну или несколько полипептидных цепей молекулы антитела. Гуманизация может фактически осуществляться путем замены участков CDR или последовательностей участков CDR грызунов соответствующими последовательностями человеческого антитела. Соответственно, гуманизированная форма антитела, не являющегося человеческим, (или его фрагмент) представляет собой химерное антитело или фрагмент, в котором значительно меньше интактного человеческого вариабельного домена было заменено соответствующей последовательностью из вида, не относящегося к человеческому. На практике гуманизированные антитела обычно представляют собой человеческие антитела, в которых некоторые остатки CDR и, возможно, некоторые остатки FR замещаются остатками из аналогичных мест в антителах грызунов.

Выбор вариабельных доменов человека, как легких, так и тяжелых, для использования при создании гуманизированных антител очень важен для снижения антигенности. Согласно способу «максимального соответствия» последовательность вариабельного домена антитела грызуна экранируется от всего банка известных последовательностей вариабельного домена человека. Затем человеческая последовательность, наиболее близкая к последовательности грызуна принимается в качестве человеческого каркаса (FR) для гуманизированного антитела. В другом способе используется определенная структура, полученная из консенсусной последовательности всех антител человека определенной подгруппы легких или тяжелых цепей. Один и тот же каркас можно использовать для нескольких различных гуманизированных антител.

Также важно, чтобы антитела были гуманизированы с сохранением высокого сродства к антигену и других благоприятных биологических свойств. Для достижения этой цели гуманизированные антитела могут быть получены путем анализа родительских последовательностей и различных концептуальных гуманизированных продуктов с использованием трехмерных моделей родительских и гуманизированных последовательностей. Трехмерные модели иммуноглобулинов широко распространены и знакомы специалистам в данной области техники. Имеются компьютерные программы, иллюстрирующие и отображающие вероятные трехмерные конформационные структуры выбранных кандидатных последовательностей иммуноглобулина. Изучение этих проявлений позволяет проанализировать вероятную роль фрагментов молекулы в функционировании кандидатной последовательности иммуноглобулина, т.е. проанализировать фрагменты молекулы, влияющие на способность кандидатного иммуноглобулина связывать свой антиген. Таким образом, фрагменты молекулы FR можно выбрать и объединить из консенсусной и импортной последовательности так, чтобы достичь желаемой характеристики антитела, такой как повышенное сродство к целевому антигену(ам). В целом остатки участка CDR непосредственно и весьма значительно влияют на связывание антигена.

Антитело может быть связано с субстратом или мечено обнаруживаемым фрагментом молекулы, или может быть, как связано, так и мечено. Обнаруживаемые фрагменты, рассматриваемые в данных композициях, включают флуоресцентные, ферментативные и радиоактивные маркеры.

ii. Одноцепочечные антитела

Способы получения одноцепочечных антител хорошо известны специалистам в данной области техники. Одноцепочечное антитело создается путем слияния вместе вариабельных доменов тяжелой и легкой цепей с помощью короткого пептидного линкера, тем самым восстанавливая антигенсвязывающий сайт на одной молекуле. Одноцепочечные вариабельные фрагменты антител (scfv), в которых с-конец одного вариабельного домена связан с N-концом другого вариабельного домена через 15-25 аминокислотных пептидов или линкеров, были созданы без существенного нарушения связывания антигена или специфичности связывания. Линкер выбирают таким образом, чтобы позволить тяжелой цепи и легкой цепи связываться вместе в правильной конформационной ориентации. Эти фрагменты Fv не имеют константных участков (Fc), присутствующих в тяжелых и легких цепях нативного антитела.

Моновалентные антитела

Для получения моновалентных антител также пригодны способы in vitro. Расщепление антител для получения их фрагментов, в частности фрагментов Fab, может быть выполнено с использованием обычных методик, известных в данной области техники. Например, расщепление может быть выполнено с помощью папаина. Расщепление антител папаином обычно приводит к образованию двух идентичных антигенсвязывающих фрагментов, называемых фрагментами Fab, каждый из которых имеет один антигенсвязывающий центр и остаточный фрагмент Fc. Обработка пепсином дает фрагмент, называемый фрагментом F(ab’)₂, который имеет два антигенсвязывающих центра и способен сшивать антиген.

Фрагменты Fab, образующиеся при расщеплении антитела, также содержат константные домены легкой цепи и первый константный домен тяжелой цепи. Фрагменты Fab’ отличаются от фрагментов Fab добавлением нескольких остатков на карбоксильном конце домена тяжелой цепи, включая один или большее количество остатков цистеина из области шарнира антитела. Фрагмент F(ab’)₂ представляет собой двухвалентный фрагмент, состоящий из двух фрагментов Fab’, соединенных дисульфидным мостиком в области шарнира. Fab’-SH - это обозначение в данной заявке для Fab’, в котором остаток (остатки) цистеина константных доменов несет свободную тиоловую группу. Фрагменты антител первоначально были получены в виде пар фрагментов Fab’, между которыми имеются шарнирные остатки цистеина. Известны и другие химические соединения фрагментов антител.

Гибридные антитела

Антитело может быть гибридным антителом. В гибридных антителах одна пара тяжелых и легких цепей гомологична паре таких цепей, которая обнаружена в антителе напротив одного эпитопа, в то время как другая пара тяжелых и легких цепей гомологична паре, найденной в антителе напротив другого эпитопа. Результатом этого является свойство многофункциональной валентности, т. е. способности связывать одновременно, по меньшей мере, два различных эпитопа. Такие гибриды можно создавать путем слияния гибридом, продуцирующих соответствующие компонентные антитела, или рекомбинантными способами. Конечно, такие гибриды, также можно создавать с помощью химерных цепей.

Конъюгаты или слияния фрагментов антител

Целевую функцию антитела можно использовать в терапевтических целях путем соединения антитела или его фрагмента с терапевтическим агентом. Такое соединение антитела или фрагмента (например, по меньшей мере, части константного участка иммуноглобулина (Fc)) с терапевтическим агентом можно получить путем создания иммуноконъюгата или путем создания слитого белка, содержащего антитело или фрагмент антитела и терапевтический агент.

Такое соединение антитела или фрагмента с терапевтическим агентом можно получить путем создания иммуноконъюгата или путем создания слитого белка, или путем связывания антитела или фрагмента с нуклеиновой кислотой, такой как малая интерферирующая РНК (миРНК), содержащей антитело или фрагмент антитела и терапевтический агент.

В некоторых вариантах реализации данного изобретения антитело модифицируют с целью изменить его период полужизни. В некоторых вариантах реализации данного изобретения желательно увеличить период полужизни антитела так, чтобы оно находилось в общем кровотоке или в месте лечения в течение более длительных периодов времени. Например, может быть желательным поддержание титров антитела в общем кровотоке или в месте, в котором проводится лечению, в течение длительного времени. Антитела можно искусственно создавать с вариантами Fc, которые продлевают период полужизни антитела, например, с помощью технологии продления периода полужизни антител Xtend™ (Xencor, г. Монровия, штат Калифорния, США). В других вариантах реализации данного изобретения период полужизни антитела к ДНК уменьшается с целью сокращается возможных побочных эффектов. Описанные конъюгаты могут применяться для модификации данного биологического ответа. Фрагмент молекулы лекарственного вещества не должен рассматриваться как ограниченный до классических химических терапевтических агентов. Например, фрагмент молекулы лекарственного вещества может представлять собой белок или полипептид, обладающий желаемой биологической активностью. Такие белки могут включать, например, токсин, такой как абрин, рицин а, экзотоксин синегнойной палочки или дифтерийный токсин.

Типовые антитела B7H4

В данной заявке описаны типовые антитела B7H4 или антигенсвязывающие фрагменты. Антитела могут включать одну или большее количество тяжелых цепей и одну или большее количество легких цепей B1H1 или B1H10 мышиного антитела B7H4, не являющегося человеческим. В некоторых вариантах реализации данного изобретения антитело B7H45 включает в себя некоторые или все участки, определяющие комплементарность (CDR), легкой цепи, весь вариабельный участок легкой цепи, некоторые или все CDR тяжелой цепи, весь вариабельный участок тяжелой цепи, или их сочетание в любых мышиных антителах B1H1 или B1H10, не являющихся человеческими, к антителу B7H4. Ниже описаны типовые комбинации.

Анти-B7H4 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, имеющий легкую цепь с аминокислотной последовательностью, соответствующей последовательности SEQ ID NO:24, и тяжелую цепь с аминокислотной последовательность, соответствующей последовательности SEQ ID NO:38.

Анти-B7H4 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, имеющий легкую цепь с аминокислотной последовательностью, соответствующей последовательности SEQ ID NO:24, и тяжелую цепь с аминокислотной последовательностью, соответствующей последовательности SEQ ID NO:39.

Анти-B7H4 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, имеющий легкую цепь с аминокислотной последовательностью, соответствующую последовательности SEQ ID NO:24, и тяжелую цепь с аминокислотной последовательностью, соответствующей последовательности SEQ ID NO:40.

Анти-B7H4 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, имеющий легкую цепь с аминокислотной последовательностью, соответствующей последовательности SEQ ID NO:24, и тяжелую цепь с аминокислотной последовательностью, соответствующей последовательности SEQ ID NO:41.

Анти-B7H4 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, имеющий легкую цепь с аминокислотной последовательностью, соответствующей последовательности SEQ ID NO:24, и тяжелую цепь с аминокислотной последовательность, соответствующей последовательности SEQ ID NO:42.

Анти-B7H4 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент с легкой цепью, содержащей аминокислотную последовательность, соответствующую последовательности SEQ ID NO:24, и тяжелой цепью, имеющую аминокислотную последовательность, соответствующую последовательности SEQ ID NO:43.

Анти-B7H4 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент с легкой цепью, содержащей аминокислотную последовательность, соответствующую последовательности SEQ ID NO:24, и тяжелой цепью, содержащей аминокислотную последовательность, соответствующую последовательности SEQ ID NO:44.

Анти-B7H4 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент с легкой цепью, имеющей аминокислотную последовательность, соответствующую последовательности SEQ ID NO:24, и тяжелой цепью, имеющей аминокислотную последовательность, соответствующую последовательности SEQ ID NO:45.

Анти-B7H4 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент с легкой цепью, имеющей аминокислотную последовательность, соответствующую последовательности SEQ ID NO:25, и тяжелой цепью, имеющей аминокислотную последовательность, соответствующую последовательности SEQ ID NO:38.

Анти-B7H4 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент с легкой цепью, имеющей аминокислотную последовательность, соответствующую последовательности SEQ ID NO:25, и тяжелой цепью, имеющей аминокислотную последовательность, соответствующую последовательности SEQ ID NO:39.

Анти-B7H4 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент с легкой цепью, имеющей аминокислотную последовательность, соответствующую последовательности SEQ ID NO:25, и тяжелой цепью, имеющей аминокислотную последовательность, соответствующую последовательности SEQ ID NO:40.

Анти-B7H4 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент с легкой цепью, имеющей аминокислотную последовательность, соответствующую последовательности SEQ ID NO:25, и тяжелой цепью, имеющей аминокислотную последовательность, соответствующую последовательности SEQ ID NO:41.

Анти-B7H4 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент с легкой цепью, имеющей аминокислотную последовательность, соответствующую последовательности SEQ ID NO:25, и тяжелой цепью, имеющей аминокислотную последовательность, соответствующую последовательности SEQ ID NO:42.

Анти-B7H4 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент с легкой цепью, имеющей аминокислотную последовательность, соответствующую последовательности SEQ ID NO:25, и тяжелой цепью, имеющей аминокислотную последовательность, соответствующую последовательности SEQ ID NO:43.

Анти-B7H4 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент с легкой цепью, имеющей аминокислотную последовательность, соответствующую последовательности SEQ ID NO:25, и тяжелой цепью, имеющей аминокислотную последовательность, соответствующую последовательности SEQ ID NO:44.

Анти-B7H4 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент с легкой цепью, имеющей аминокислотную последовательность, соответствующую последовательности SEQ ID NO:25, и тяжелой цепью, имеющей аминокислотную последовательность, соответствующую последовательности SEQ ID NO:45.

Анти-B7H4 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент с легкой цепью, имеющей аминокислотную последовательность, соответствующую последовательности SEQ ID NO:26, и тяжелой цепью, имеющей аминокислотную последовательность, соответствующую последовательности SEQ ID NO:38.

Анти-B7H4 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент с легкой цепью, имеющей аминокислотную последовательность, соответствующую последовательности SEQ ID NO:26, и тяжелой цепью, имеющей аминокислотную последовательность, соответствующую последовательности SEQ ID NO:39.

Анти-B7H4 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент с легкой цепью, имеющей аминокислотную последовательность, соответствующую последовательности SEQ ID NO:26, и тяжелой цепью, имеющей аминокислотную последовательность, соответствующую последовательности SEQ ID NO:40.

Анти-B7H4 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент с легкой цепью, имеющей аминокислотную последовательность, соответствующую последовательности SEQ ID NO:26, и тяжелой цепью, имеющей аминокислотную последовательность, соответствующую последовательности SEQ ID NO:41.

Анти-B7H4 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент с легкой цепью, имеющей аминокислотную последовательность, соответствующую последовательности SEQ ID NO:26, и тяжелой цепью, имеющей аминокислотную последовательность, соответствующую последовательности SEQ ID NO:42.

Анти-B7H4 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент с легкой цепью, имеющей аминокислотную последовательность, соответствующую последовательности SEQ ID NO:26, и тяжелой цепью, имеющей аминокислотную последовательность, соответствующую последовательности SEQ ID NO:43.

Анти-B7H4 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент с легкой цепью, имеющей аминокислотную последовательность, соответствующую последовательности SEQ ID NO:26, и тяжелой цепью, имеющей аминокислотную последовательность, соответствующую последовательности SEQ ID NO:44.

Анти-B7H4 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент с легкой цепью, имеющей аминокислотную последовательность, соответствующую последовательности SEQ ID NO:26, и тяжелой цепью, имеющей аминокислотную последовательность, соответствующую последовательности SEQ ID NO:45.

Анти-B7H4 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент с легкой цепью, имеющей аминокислотную последовательность, соответствующую последовательности SEQ ID NO:27, и тяжелой цепью, имеющей аминокислотную последовательность, соответствующую последовательности SEQ ID NO:38.

Анти-B7H4 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент с легкой цепью, имеющей аминокислотную последовательность, соответствующую последовательности SEQ ID NO:27, и тяжелой цепью, имеющей аминокислотную последовательность, соответствующую последовательности SEQ ID NO:39.

Анти-B7H4 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент с легкой цепью, имеющей аминокислотную последовательность, соответствующую последовательности SEQ ID NO:27, и тяжелой цепью, имеющей аминокислотную последовательность, соответствующую последовательности SEQ ID NO:40.

Анти-B7H4 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент с легкой цепью, имеющей аминокислотную последовательность, соответствующую последовательности SEQ ID NO:27, и тяжелой цепью, имеющей аминокислотную последовательность, соответствующую последовательности SEQ ID NO:41.

Анти-B7H4 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент с легкой цепью, имеющей аминокислотную последовательность, соответствующую последовательности SEQ ID NO:27, и тяжелой цепью, имеющей аминокислотную последовательность, соответствующую последовательности SEQ ID NO:42.

Анти-B7H4 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент с легкой цепью, имеющей аминокислотную последовательность, соответствующую последовательности SEQ ID NO:27, и тяжелой цепью, имеющей аминокислотную последовательность, соответствующую последовательности SEQ ID NO:43.

Анти-B7H4 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент с легкой цепью, имеющей аминокислотную последовательность, соответствующую последовательности SEQ ID NO:27, и тяжелой цепью, имеющей аминокислотную последовательность, соответствующую последовательности SEQ ID NO:44.

Анти-B7H4 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент с легкой цепью, имеющей аминокислотную последовательность, соответствующую последовательности SEQ ID NO:27, и тяжелой цепью, имеющей аминокислотную последовательность, соответствующую последовательности SEQ ID NO:45.

Анти-B7H4 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент с легкой цепью, имеющей аминокислотную последовательность, соответствующую последовательности SEQ ID NO:28, и тяжелой цепью, имеющей аминокислотную последовательность, соответствующую последовательности SEQ ID NO:38.

Анти-B7H4 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент с легкой цепью, имеющей аминокислотную последовательность, соответствующую последовательности SEQ ID NO:28, и тяжелой цепью, имеющей аминокислотную последовательность, соответствующую последовательности SEQ ID NO:39.

Анти-B7H4 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент с легкой цепью, имеющей аминокислотную последовательность, соответствующую последовательности SEQ ID NO:28, и тяжелой цепью, имеющей аминокислотную последовательность, соответствующую последовательности SEQ ID NO:40.

Анти-B7H4 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент с легкой цепью, имеющей аминокислотную последовательность, соответствующую последовательности SEQ ID NO:28, и тяжелой цепью, имеющей аминокислотную последовательность, соответствующую последовательности SEQ ID NO:41.

Анти-B7H4 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент с легкой цепью, имеющей аминокислотную последовательность, соответствующую последовательности SEQ ID NO:28, и тяжелой цепью, имеющей аминокислотную последовательность, соответствующую последовательности SEQ ID NO:42.

Анти-B7H4 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент с легкой цепью, имеющей аминокислотную последовательность, соответствующую последовательности SEQ ID NO:28, и тяжелой цепью, имеющей аминокислотную последовательность, соответствующую последовательности SEQ ID NO:43.

Анти-B7H4 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент с легкой цепью, имеющей аминокислотную последовательность, соответствующую последовательности SEQ ID NO:28, и тяжелой цепью, имеющей аминокислотную последовательность, соответствующую последовательности SEQ ID NO:44.

Анти-B7H4 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент с легкой цепью, имеющей аминокислотную последовательность, соответствующую последовательности SEQ ID NO:28, и тяжелой цепью, имеющей аминокислотную последовательность, соответствующую последовательности SEQ ID NO:45.

2. Белки и полипептиды

a. Белковые и полипептидные композиции

Иммуномодулирующим агентом может быть белок, полипептид или слитый белок. Например, иммуномодулирующим агентом может быть выделенный или рекомбинантный белок или полипептид, его функциональный фрагмент, вариант, или их белок, слитый с B7-H4.

Указанный белок или полипептид, или его функциональный фрагмент, вариант, или их слитый белок может быть агонистом или антагонистом. Например, в некоторых вариантах реализации данного изобретения антагонистом B7-H4 является полипептид B7-H4 или его фрагмент, или слитый белок, который связывается с лигандом B7-H4. Указанный полипептид может быть растворимым фрагментом, например внеклеточным доменом B7-H4, или его функциональным фрагментом, или его слитым белком. В некоторых вариантах реализации данного изобретения растворимый лиганд B7-H4 может служить агонистом, увеличивая трансдукцию сигнала через B7-H4.

Активность (т.е. агонистическая или антагонистическая) белка или полипептида B7-H4, или любого его фрагмента, варианта или слитого белка может быть определена с помощью функциональных анализов, которые известны в данной области техники и включают анализы, представленные ниже. Как правило, анализы включают определение того, увеличивает ли белок, полипептид или его фрагмент, вариант или слитый белок (т.е. агонист) или уменьшает (т.е. антагонист) передачу сигналов через рецептор B7-H4. В некоторых вариантах реализации данного изобретения анализ включает определение того, увеличивает ли его белок, полипептид или его фрагмент, вариант или слитый белок (т.е. агонист) или уменьшает (т.е. антагонист) иммунный ответ, связанный с B7-H4. Как правило, эти анализы включают определение того, увеличивает ли белок, полипептид или его фрагмент, вариант или слитый белок (т.е. агонист) или уменьшает (т.е. антагонист) передачу сигнала через B7-H4. В некоторых вариантах реализации данного изобретения анализ включает определение того, уменьшает ли белок, полипептид или его фрагмент, вариант или слитый белок (т.е. агонист) или увеличивает (т.е. антагонист) иммунный ответ, ингибируемый B7-H4. В некоторых вариантах реализации данного изобретения анализ включает определение того, увеличивает ли белок, полипептид или его фрагмент, вариант или слитый белок (т.е. антагонист) апоптоз и дифференцировку клеток острого миелоидного лейкоза и клеток острого лимфобластного лейкоза, приводящую к снижению способности к самообновлению стволовых клеток AML и ALL.

Последовательности нуклеиновых кислот и полипептидов для B7-H4 известны в данной области техники, а типовые последовательности белков и пептидов приведены выше. Указанные последовательности могут применяться, как представлено более подробно ниже, одним из специалистов в данной области техники для получения любого белка или полипептида B7-H4, или любого его фрагмента, варианта или слитого белка. В целом белки, полипептиды, их фрагменты, варианты и слияния в B7-H4 экспрессируются из нуклеиновых кислот, которые включают последовательности, кодирующие сигнальную последовательность. Указанная сигнальная последовательность обычно отщепляется от незрелого полипептида для получения зрелого полипептида, не имеющего сигнальной последовательности. Сигнальная последовательность может быть заменена сигнальной последовательностью другого полипептида с помощью стандартных методов молекулярной биологии для воздействия на уровни экспрессии, секрецию, растворимость или другие свойства белков B7-H4 полипептида с описанной сигнальной последовательностью или без нее. Понятно, что в некоторых случаях зрелый белок, поскольку он известен или описан в данной области техники (т.е. белковая последовательность без сигнальной последовательности), является гипотетическим зрелым белком. При нормальной клеточной экспрессии сигнальная последовательность может быть удалена клеточной пептидазой для получения зрелого белка. Последовательность зрелого белка может быть определена или подтверждена с помощью способов, известных в данной области техники.

i. Фрагменты

В контексте данной заявки, фрагмент B7-H4 относится к любой разновидности полипептида, который, по меньшей мере, на одну аминокислоту короче полноразмерного белка. Полезные фрагменты включают в себя фрагменты, которые сохраняют способность связываться со своим естественным лигандом или лигандами. У полипептида, который является фрагментом любого полноразмерного B7-H4, как правило, имеется, по меньшей мере, 20 процентов, 30 процентов, 40 процентов, 50 процентов, 60 процентов, 70 процентов, 80 процентов, 90 процентов, 95 процентов, 98 процентов, 99 процентов, 100 процентов или даже более 100 процентов способности связывать свой естественный лиганд соответственно по сравнению с полноразмерным белком.

Фрагменты B7-H4 включают неклеточные фрагменты. Неклеточные полипептиды могут быть фрагментами полноразмерных трансмембранных полипептидов, которые могут быть отделены, секретированы или иным образом извлечены из продуцирующих клеток. Неклеточные фрагменты полипептидов могут включать в себя некоторые или все внеклеточные домены полипептида и не содержать некоторых или всех внутриклеточных и/или трансмембранных доменов полноразмерного белка. В одном варианте реализации данного изобретения фрагменты полипептида включают весь внеклеточный домен полноразмерного белка. В других вариантах реализации данного изобретения неклеточные фрагменты полипептидов включают фрагменты внеклеточного домена, которые сохраняют биологическую активность полноразмерного белка. Внеклеточный домен может включать 1, 2, 3, 4 или 5 смежных аминокислот из трансмембранного домена и/или 1, 2, 3, 4 или 5 следующих друг за другом аминокислот из сигнальной последовательности. Альтернативно внеклеточный домен может иметь 1, 2, 3, 4, 5 или более аминокислот, удаленных из C-конца, N-конца или обоих. В некоторых вариантах реализации данного изобретения внеклеточный домен является единственным функциональным доменом фрагмента (например, домен связывания лиганда).

ii. Варианты

Также предложены варианты В7-Н4 и их фрагменты. В некоторых вариантах реализации данного изобретения такой вариант, по меньшей мере, на 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99 процентов идентичен любому из последовательности SEQ ID NO:1. Полезные варианты включают варианты, которые увеличивают биологическую активность, как указано в любом из описанных в данной заявке анализов, или которые увеличивают период полужизни или стабильность белка. Белок и полипептиды B7-H4, и их фрагменты, варианты и слитые белки можно искусственно создать для повышения биологической активности. Например, в некоторых вариантах реализации данного изобретения полипептид B7-H4, белок или его фрагмент, вариант или слияние были модифицированы, по меньшей мере, замещением, делецией или инсерцией одной аминокислоты, которая усиливает их функцию.

Наконец, вариантные полипептиды могут быть искусственно созданы так, чтобы иметь увеличенный период полужизни по сравнению с диким типом. Эти варианты, как правило, модифицируются с целью противостоять ферментативному распаду. Типовые модификации включают модифицированные аминокислотные остатки и модифицированные пептидные связи, которые устойчивы к ферментативному распаду. Для достижения этой цели в данной области техники известны различные модификации. Указанные варианты могут быть модифицированы с целю согласования влияния сродства к рецептору на период полужизни белков, полипептидов, их фрагментов или слияний при сывороточном и эндосомальном рН.

iii. Слитые белки

Слитые полипептиды содержат первый компонент слияния, включающий весь или часть полипептида B7-H4, слитый со вторым полипептидом непосредственно или через линкерную пептидную последовательность, которая сливается со вторым полипептидом. Дополнительно слитые белки содержат домен, который функционирует для димеризации или мультимеризации двух или более слитых белков. Домен линкерного пептида/полипептида может быть либо отдельным доменом, либо альтернативно может содержаться в одном из других доменов (в первом полипептиде или втором полипептиде) слитого белка. Аналогично домен, который функционирует для димеризации или мультимеризации слитых белков, может быть либо отдельным доменом, либо альтернативно может содержаться в одном из других доменов (в первом полипептиде, втором полипептиде или домене линкерного пептида/полипептида) слитого белка. В одном варианте реализации данного изобретения домен димеризации/мультимеризации и домен линкерного пептида/полипептида являются одинаковыми.

Белки слияния, описанные в данной заявке, имеют формулу I:

N-R1-R2-R3-C

где «N» представляет собой N-конец слитого белка, «C» представляет собой C-конец слитого белка. В некоторых вариантах реализации данного изобретения «Ri» представляет собой полипептид или белок B7-H4, или его фрагмент или вариант, «R2» является дополнительным доменом линкерного пептида/полипептида, а «R3» является вторым полипептидом. Альтернативно, R₃ может быть полипептидом или белком B7-H4, или его фрагментом или вариантом, а Ri может быть вторым полипептидом. В некоторых вариантах реализации данного изобретения полипептид B7-H4 представляет собой внеклеточный домен или его фрагмент, такой как Ig-подобный домен C2, или участок, заключенный в каркас из остатков цистеина, которые образуют дисульфидную связь, как указывалось выше.

Димеризация или мультимеризация может происходить между двумя или среди большего количества слитых белков посредством доменов димеризации или мультимеризации. Альтернативно димеризация или мультимеризация слитых белков может происходить путем химического сшивания. Образующиеся димеры или мультимеры могут быть гомодимерными/гомомультимерными или гетеродимерными/гетеромультимерными.

В некоторых вариантах реализации данного изобретения слитый белок включает внеклеточный домен антитела B7-H4 или его фрагмент или вариант, сплавленный с участком Ig Fc. Рекомбинантные белки, слитые с Ig, могут быть получены путем слияния кодирующего участка указанного внеклеточного домена какого-либо внеклеточного домена или его фрагмента или варианта с участком Fc человеческого IgGl, IgG2, IgG3 или IgG4, или мышиного IgG2a, или другого пригодного домена Ig, как описано ранее (Chapoval, et al., Methods Mol.Med.,45:247-255 (2000)).

iv. Модификации полипептидов

Полипептиды и слитые белки могут быть модифицированы функциональными химическими группами, которые могут присутствовать в полипептидах в нормальной клеточной среде, например, при фосфорилировании, метилировании, амидировании, сульфатировании, ацилировании, гликозилировании, сумоилировании и убиквитилировании. Слитые белки также могут быть модифицированы с помощью метки, способной обеспечить обнаруживаемый сигнал, прямо или косвенно, включая (но не ограничиваясь этим) радиоизотопы и флуоресцентные соединения.

Полипептиды и слитые белки также могут быть модифицированы функциональными химическими группами, которые обычно не добавляются к полипептидам в клеточной среде. Например, описанные слитые белки также могут быть модифицированы путем ковалентного присоединения полимерных цепей, включая (но не ограничиваясь этим) полимерные цепи полиэтиленгликоля (ПЭГ) (т.е. пегилирование). Конъюгация макромолекул с ПЭГ появилась в последнее время как эффективная стратегия изменения фармакокинетического (ФК) профиля различных лекарственных средств и тем самым повышения их терапевтического потенциала. Конъюгация ПЭГ увеличивает задержку лекарственных средств в кровотоке путем защиты от ферментативного распада, замедления фильтрации почками и уменьшения выработки нейтрализующих антител. Кроме того, ПЭГ-конъюгаты могут применяться для обеспечения мультимеризации слитых белков.

Модификации могут быть введены в молекулу путем взаимодействия целевых аминокислотных остатков полипептида с органическим дериватизирующим агентом, который способен вступать в реакцию с выбранными боковыми цепями или концевыми остатками. Другой модификацией является циклизация белка.

Примеры химических производных полипептидов включают лизинильные и аминотерминальные остатки, образующие производные с ангидридами янтарной кислоты или других карбоновых кислот. Следствием получения производных с циклическим ангидридом карбоновой кислоты является реверсирование заряда лизинильных остатков. Другие пригодные реактивы для получения производных аминосодержащих остатков включают имидоэфиры, такие как метилпиколинимидат, пиридоксальфосфат, пиридоксаль, хлорборгидрид, тринитробензолсульфоновая кислота, о-метилизомочевина. 2,4-пентандион, и катализируемую трансаминазой реакцию с глиоксилатом. Карбоксильные боковые группы, аспартил или глутамил, могут быть избирательно модифицированы реакцией с карбодиимидами (R-N=C=N-R'), такими как 1-циклогексил-3-(2-морфолинил-(4-этил) карбодиимид или 1-этил-3-(4-азония-4,4-диметилпентил) карбодиимид. Кроме того, остатки аспартил и глутамил могут быть преобразованы в остатки аспарагинил и глутаминил путем реакции с аммиаком. Слитые белки могут также включать одну или несколько D-аминокислот, которые заменены на одну или большее количество L-аминокислот.

v. Модифицированная связывающая способность

Связывающая способность белков, полипептидов, их фрагментов, вариантов и слияний соответствует дозе и схеме введения. В одном варианте реализации данного изобретения описанные белки, полипептиды, их фрагменты, варианты и слияния обладают свойством связываться с лигандом B7-H4, которое демонстрирует больший срок или более высокий процент заполнения связывающего сайта (например, на лиганде) по сравнению с другими молекулами рецептора, которые связываются с ним. В других вариантах реализации данного изобретения описанные белки, полипептиды, их фрагменты, варианты и слияния имеют пониженную аффинность связывания с лигандом В7-Н4 по сравнению с белком дикого типа.

В некоторых вариантах реализации данного изобретения белки, полипептиды, их фрагменты, варианты и слияния имеют относительно высокую аффинность к лиганду B7-H4 и поэтому могут иметь относительно медленную скорость диссоциации. В других вариантах реализации данного изобретения белки, полипептиды, их фрагменты, варианты и слияния вводят периодически в течение нескольких дней, недель или месяцев для ослабления иммунных ответов, которым дают возможность восстановиться прежде, чем будет сделано очередное введение, что может служить для изменения иммунного ответа, не включая или не выключая полностью иммунный ответ, и во избежание долгосрочных побочных эффектов.

3. Изолированные Молекулы Нуклеиновых Кислот

В данной заявке описаны изолированные последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие белки, полипептиды, их фрагменты, варианты и слияния. В контексте данной заявки «изолированная нуклеиновая кислота» относится к нуклеиновой кислоте, которая отделена от других молекул нуклеиновых кислот, присутствующих в геноме млекопитающего, включая нуклеиновые кислоты, которые обычно расположены на концах одной или обеих сторон нуклеиновой кислоты в геноме млекопитающего. Термин «изолированная» в контексте данной заявки в отношении нуклеиновых кислот, также включает комбинацию с любой неприродной последовательностью нуклеиновых кислот, поскольку такие неприродные последовательности не встречаются в природе и не имеют непосредственно следующих друг за другом последовательностей в природном геноме.

Изолированная нуклеиновая кислота может быть, например, молекулой ДНК при условии, что одна из последовательностей нуклеиновых кислот, обычно обнаруживаемых непосредственно на концах этой молекулы ДНК в природном геноме, удалена или отсутствует. Таким образом, изолированная нуклеиновая кислота включает в себя без каких-либо ограничений молекулу ДНК, которая существует как отдельная молекула, независимая от других последовательностей (например, химически синтезированная нуклеиновая кислота или комплементарная ДНК (кДНК), или фрагмент геномной ДНК, полученный полимеразной цепной реакцией (ПЦР) или обработкой эндонуклеазы рестрикции), а также рекомбинантную ДНК, которая включена в вектор, автономно реплицирующуюся плазмиду, вирус (например, ретровирус, лентивирус, аденовирус или вирус герпеса) или в геномную ДНК прокариоты или эукариоты. Кроме того, изолированная нуклеиновая кислота может включать в себя искусственно созданную нуклеиновую кислоту, такую как молекула рекомбинантной ДНК, которая является частью гибридной или слитой нуклеиновой кислоты. Нуклеиновая кислота, существующая среди сотен или миллионов других нуклеиновых кислот, например, в банке кднк или геномном банке, или на гелевой пластинке, содержащей рестрикционные фрагменты геномной ДНК, не должна рассматриваться как изолированная нуклеиновая кислота.

Нуклеиновые кислоты, кодирующие белки, полипептиды, их фрагменты, варианты и слияния, могут быть оптимизированы для экспрессии в выбранном хозяине экспрессии. Кодоны можно заменить альтернативными кодонами, кодирующими одну и ту же аминокислоту, чтобы объяснить различия в использовании кодонов у млекопитающего, от которого получена последовательность нуклеиновой кислоты, и у хозяина экспрессии.

Таким образом, нуклеиновые кислоты можно синтезировать с помощью предпочитаемых кодонов хозяина экспрессии.

Нуклеиновые кислоты могут иметь смысловую или антисмысловую ориентацию, или могут быть комплементарными с референтной последовательностью, кодирующей полипептид или белок B7-H4. Нуклеиновые кислоты могут быть аналогами ДНК, РНК или нуклеиновых кислот. Аналоги нуклеиновых кислот могут быть модифицированы в остатке основания, остатке сахаров или фосфатном остове. Такая модификация может улучшить, например, стабильность, гибридизацию или растворимость нуклеиновой кислоты. Модификации в остатке основания могут включать дезоксиуридин для дезокситимидина и 5-метил-2’-дезоксицитидин или 5-бром-2’-дезоксицитидин для дезоксицитидина. Модификации остатка сахаров могут включать модификацию 2’-гидроксила рибозного сахара с образованием 2’-0-метиловых или 2’-0-аллильных сахаров. Дезоксирибозофосфатный остов может быть модифицирован для получения морфолинонуклеиновых кислот, в которых каждая остаток основная связан с шестичленным морфолиновым кольцом или пептидными нуклеиновыми кислотами, в которых дезоксифосфатный остов заменяется псевдопептидным остовом, а четыре основания сохраняются. См., например, работу Summerton и Weller (1997) Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 7: 187-195; и работу Hyrup et al. (1996) Bioorgan. Med. Chem. 4:5-23. Кроме того, дезоксифосфатный остов может быть заменен, например, фосфоротиоатным или фосфородитиоатным остовом, фосфороамидитным или алкилфосфотриэфирным остовом.

Нуклеиновые кислоты, кодирующие полипептиды, можно ввести субъектам, которые в этом нуждаются. Доставка нуклеиновых кислот включает введение «чужеродных» нуклеиновых кислот в клетку и, в конечном счете, в живое животное. Композиции и способы доставки нуклеиновых кислот субъекту известны в данной области техники (см. Understanding Gene Therapy («Понимание генной терапии»), Lemoine, N. R., ed., BIOS Scientific Publishers, Oxford, 2008).

4. Векторы и клетки хозяина

Также предложены векторы, кодирующие белки, полипептиды, их фрагменты, варианты и слияния. Нуклеиновые кислоты, такие как описанные выше, можно вставлять в векторы для экспрессии в клетках. В контексте данной заявки «вектор» - это репликон, такой как плазмида, фаг, вирус или космид, в который можно вставить другой сегмент ДНК, чтобы вызвать репликацию вставленного сегмента. Векторы могут быть экспрессирующими векторами. «Экспрессирующий вектор» - это вектор, который включает в себя одну или большее количество управляющих последовательностей экспрессии, а «последовательность, управляющая экспрессией» - это последовательность ДНК, которая контролирует и регулирует транскрипцию и/или трансляцию другой последовательности ДНК.

Нуклеиновые кислоты в векторах могут быть функционально связаны с одной или несколькими последовательностями, управляющими экспрессией. В контексте данной заявки термин «функционально связанный» означает включенный в генетическую конструкцию так, что последовательности, управляющие экспрессией, эффективно управляют экспрессией кодирующей последовательности, представляющей интерес. Примеры последовательностей, управляющих экспрессией, включают промоторы, энхансеры и участки окончания транскрипции. Промотор - это последовательность, управляющая экспрессией, состоящая из участка молекулы ДНК, как правило, в пределах 100 нуклеотидов выше точки, в которой начинается транскрипция (обычно вблизи места (сайта) инициации РНК-полимеразы II). Чтобы взять кодирующую последовательность под контроль промотора, необходимо расположить сайт инициации трансляции трансляционной рамки считывания полипептида ниже промотора на расстоянии от одного до приблизительно пятидесяти нуклеотидов. Энхансеры обеспечивают специфичность экспрессии в том, что касается времени, местоположения и уровня. В отличие от промоторов, энхансеры могут функционировать, находясь на различных расстояниях от места транскрипции. Энхансер также может быть расположен ниже места инициации транскрипции. Кодирующая последовательность «функционально связана» и находится «под контролем» последовательностей, управляющих экспрессией в клетке, когда РНК-полимераза способна транскрибировать кодирующую последовательность в информационную РНК (иРНК), которая затем может быть транслирована в белок, кодируемый кодирующей последовательностью.

Пригодные экспрессирующие векторы включают в себя без каких-либо ограничений плазмиды и вирусные векторы, полученные, например, из бактериофага, бакуловирусов, вируса табачной мозаики, вирусов герпеса, цитомегаловируса, ретровирусов, вирусов осповакцины, аденовирусов и аденоассоциированных вирусов. Коммерчески доступными являются множество векторов и экспрессирующих систем таких компаний как Novagen (Мэдисон, штат Висконсин, США), Clontech (Пало-Альто, штат Калифорния, США), Stratagene (Ла-Холья, штат Калифорния, США) и Invitrogen Life Technologies (Карлсбад, штат Калифорния, США).

Экспрессирующий вектор может содержать последовательность меток. Последовательности меток, как правило, экспрессируются как слияние с кодируемым полипептидом. Такие метки могут быть вставлены в любом месте внутри полипептида, включая или карбоксильный конец, или амино-конец. Примеры полезных меток включают (но не ограничиваются ими) зеленый флуоресцентный белок (GFP), глутатион-S-трансферазу (GST), полигистидин, c-myc, гемагглютинин, метку Flag™ (Kodak, Нью-Хевен, штат Коннектикут, США), мальтозу-е-связывающий белок и белок А. В одном варианте реализации данного изобретения молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая один из описанных полипептидов, присутствует в векторе, содержащем нуклеиновые кислоты, которые кодируют один или несколько доменов константного участка тяжелой цепи Ig, например, имеющий аминокислотную последовательность, соответствующую шарнирному участку, участкам СН2 и СН3 цепи Cγl иммуноглобулина человека.

Векторы, содержащие нуклеиновые кислоты, которые должны экспрессироваться, могут быть перенесены в клетки хозяина. Термин «клетка хозяина» включает прокариотические и эукариотические клетки, в которые может быть введен рекомбинантный экспрессирующий вектор. В контексте данной заявки термины «трансформированный» и «трансфицированный» означают введение молекулы нуклеиновой кислоты (например, вектора) в клетку с помощью одной из ряда технологий. Хотя эти технологии не ограничиваются какой-то конкретной технологией, целый ряд их хорошо известны в данной области техники. Прокариотические клетки могут быть преобразованы с помощью нуклеиновых кислот, например, электропорацией или трансформацией, опосредованной хлористым кальцием. Нуклеиновые кислоты могут быть трансфицированы в клетки млекопитающих с помощью технологий, включающих, например, ко-преципитацию фосфата кальция, DEAE-декстран-опосредованную трансфекцию, липофекцию, электропорацию или микроинъекцию. Клетки хозяина (например, прокариотическая клетка или эукариотическая клетка, такая как клетка CHO) можно применять, например, для получения белков, полипептидов, их фрагментов, вариантов и слияний, описанных в данной заявке.

Описанные векторы можно применять для экспрессии белков, полипептидов, их фрагментов, вариантов и слияний в клетках. Типовой вектор включает в себя аденовирусный вектор, но не ограничивается им. Один подход к решению задачи включает перенос нуклеиновых кислот в первичные клетки в культуре с последующей аутологичной трансплантацией трансформированных клеток ex vivo в хозяина, или системно, или в конкретный орган или ткань. Методы ex vivo могут включать, например, этапы сбора клеток у субъекта, культивирования клеток, трансдукции их с помощью экспрессирующего вектора и поддержания клеток в условиях, пригодных для экспрессии кодируемых полипептидов. Эти методы известны в области молекулярной биологии. Этап трансдукции может быть выполнен любыми стандартными средствами, используемыми для генной терапии ex vivo, включая, например, фосфат кальция, липофекцию, электропорацию, вирусную инфекцию и биолистический перенос генов. Альтернативно можно применять липосомы или полимерные микрочастицы. Клетки, которые были успешно трансдуцированы, можно выбрать, например, для экспрессии кодирующей последовательности или гена лекарственной устойчивости. Затем клетки могут быть облучены смертельной дозой радиации (при желании) и введены или имплантированы субъекту. В одном варианте реализации данного изобретения экспрессирующие векторы, содержащие нуклеиновые кислоты, кодирующие слитые белки, трансфицируются в клетки, которые вводятся нуждающемуся в этом субъекту.

Терапия нуклеиновыми кислотами in vivo может осуществляться путем прямого переноса функционально активной ДНК в соматическую ткань или орган млекопитающего in vivo. Например, нуклеиновые кислоты, кодирующие полипептиды, описанные в данной заявке, можно вводить непосредственно в лимфоидные ткани. Альтернативно специфическое целенаправленное воздействие на лимфоидную ткань может быть достигнуто с помощью транскрипционных регуляторных элементов, специфических для лимфоидной ткани (TRE), таких как транскрипционные регуляторные элементы (TRE), специфические для B-лимфоцитов, T-лимфоцитов или дендритных клеток. В данной области техники известны транскрипционные регуляторные элементы (TRE), специфические для лимфоидной ткани.

Нуклеиновые кислоты также можно вводить in vivo с помощью вирусных механизмов. Молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие слитые белки, могут быть упакованы в ретровирусные векторы с помощью упаковочных клеточных линий, которые продуцируют ретровирусы с дефектной репликацией, как хорошо известно в данной области техники. Можно применять и другие вирусные векторы, в том числе рекомбинантные аденовирусы и вирус осповакцины, которые можно сделать нереплицирующими. Кроме голой ДНК или РНК, или вирусным векторам, в качестве векторов могут применяться искусственно созданные бактерии.

Нуклеиновые кислоты могут также доставляться другими носителями, включая липосомы, полимерные микро- и наночастицы и поликатионы, такие как азиалогликопротеин/полилизин.

Кроме переноса генов in vivo, опосредованного вирусами и носителями, для прямого переноса ДНК можно применять физические средства, хорошо известные в данной области техники, включая введение плазмидной ДНК и перенос генов, опосредованный бомбардировкой частицами.

5. Малые молекулы

Иммуномодулирующим агентом может быть малая молекула. Малые молекулы-агонисты и антагонисты B7-H4 известны в данной области техники или могут быть идентифицированы с помощью обычных методов скрининга.

В некоторых вариантах реализации данного изобретения скрининговые анализы могут включать случайный поиск больших банков тестируемых соединений. Альтернативно эти анализы можно применить, чтобы сконцентрироваться на конкретных классах соединений, которые потенциально могут вызывать модуляции уровня В7-Н4. Анализы могут включать определение сигнальной активности B7-H4 или ингибирующего ответа, опосредованного B7-H4. Другие анализы могут включать определение транскрипции или трансляции нуклеиновых кислот, уровней информационной РНК (иРНК), стабильности иРНК, дегенерация иРНК, скорости транскрипции и скорости трансляции.

C. Фармацевтические композиции

Предложены фармацевтические композиции, включающие описанные иммуномодулирующие агенты. Фармацевтические композиции, содержащие иммуномодулирующие агенты, можно вводить парентерально (в виде внутримышечных, внутрибрюшинных, внутривенных (в/в) или подкожных инъекций), трансдермально (или пассивно, или с помощью ионофореза или электропорации) или трансмукозально (назально, вагинально, ректально или сублингвально), или с помощью биоразлагаемых вставок; они могут быть изготовлены в виде лекарственных форм, удобных для каждого пути введения.

В некоторых способах in vivo композиции, описанные в данной заявке, вводятся субъекту в терапевтически эффективном количестве. В контексте данной заявки термин «эффективное количество» или «терапевтически эффективное количество» означает дозировку, достаточную для лечения, ингибирования или облегчения одного или большего количества симптомов заболевания, лечение которого проводится, или для обеспечения иным способом желаемого фармакологического и/или физиологического эффекта. Точная дозировка будет варьировать в зависимости от целого ряда факторов, таких как переменные, зависящие от субъекта (например, возраст, состояние иммунной системы и т. д.), заболевания и проводимого лечения.

Для описанных иммуномодулирующих агентов, по мере проведения дальнейших исследований, появится информация относительно соответствующих уровней дозировки для лечения различных патологических состояний у различных пациентов, а правильную дозировку сможет установить обычный квалифицированный работник с учетом терапевтического контекста, возраста и общего состояния здоровья реципиента. Выбранная дозировка зависит от желаемого терапевтического эффекта, от пути введения и от продолжительности желаемого лечения. Описанные иммуномодулирующие агенты млекопитающим обычно вводят в дозе от 0,001 до 20 мг/кг массы тела ежедневно. В целом для внутривенной инъекции или инфузии дозировка может быть ниже.

В определенных вариантах реализации данного изобретения иммуномодулирующий агент вводят локально, например, путем инъекции непосредственно в участок, который подвергается лечению. Как правило, инъекция вызывает повышенную локальную концентрацию композиции иммуномодулирующего агента, которая выше концентрации, которая может быть достигнута при системном введении. Композиции иммуномодулирующих агентов могут быть объединены с матрицей, как описано выше, с целью помочь создать повышенную локальную концентрацию полипептидных композиций за счет уменьшения пассивной диффузии полипептидов из участка, который подвергается лечению.

1. Лекарственные формы для парентерального введения

В некоторых вариантах реализации данного изобретения описанные в данной заявке композиции, включая композиции, содержащие пептиды и полипептиды, вводят в виде водного раствора путем парентеральной инъекции. Лекарственная форма также может быть в виде суспензии или эмульсии. В целом предлагающиеся фармацевтические композиции включают эффективное количество пептида или полипептида, и дополнительно включают фармацевтически приемлемые разбавители, консерванты, солюбилизаторы, эмульгаторы, адъюванты и/или носители. Данные композиции дополнительно могут включать одно (или большее количество) из следующих веществ: разбавители, стерильная вода, забуференный физиологический раствор различного буферного состава (например, Tris-HCl, ацетат, фосфат), различного показателя рН и ионной силы раствора; и примеси, такие как детергенты и солюбилизирующие агенты (например, TWEEN 20 (полисорбат-20), TWEEN 80 (полисорбат-80)), антиоксиданты (например, аскорбиновая кислота, метабисульфит натрия), консерванты (например, тимерсол, бензиловый спирт) и наполнители (например, лактоза, маннит). Примерами неводных растворителей или наполнителей являются пропиленгликоль, полиэтиленгликоль, растительные масла, такие как оливковое масло и кукурузное масло, желатин и инъекционные органические сложные эфиры, такие как этилолеат. Данные лекарственные формы могут быть лиофилизированы и повторно растворены/восстановлены непосредственно перед введением. Такую лекарственную форму можно стерилизовать, например, фильтрованием через фильтр, задерживающий бактерии, введением в данные композиции стерилизующих агентов, облучением данных композиций или нагреванием данных композиций.

2. Лекарственные формы для перорального приема

В вариантах реализации данного изобретения имеются композиции, приготовленные для пероральной доставки. Твердые пероральные лекарственные формы в целом описаны в книге Remington Pharmaceutical Sciences («фармацевтические науки»), 18-е издание. 1990 (Mack Publishing Co. Easton Pa. 18042) в главе 89. Твердые лекарственные формы включают таблетки, капсулы, пилюли, троше или таблетки для рассасывания, облатки, микросферы, порошки или гранулы, или включение указанного материала в аэрозольные препараты полимерных соединений, таких как полимолочная кислота, полигликолевая кислота и т.д., или в липосомы. Такие композиции могут влиять на физическое состояние, стабильность, скорость высвобождения in vivo и скорость выведения in vivo описанных композиций. См., например, книгу Remington Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. (1990, Mack Publishing Co., Easton, Pa. 18042), страницы 1435-1712, которые включены в данную заявку посредством ссылки. Данные композиции могут быть приготовлены в жидкой форме или могут быть в высушенной порошкообразной форме (например, лиофилизированной). Для приготовления данных композиций можно применить липосомальную или протеиноидную инкапсуляцию. Можно применить липосомальную инкапсуляцию, и можно получить производные липосом с различными полимерами (например, патент США № 5013556). Также см. книгу Marshall, K. In: Modem Pharmaceutics («Современная фармацевтика»), изданная G. S. Banker и C. T. Rhodes, глава 10, 1979. Обычно данная лекарственная форма будет включать пептид (или его химически модифицированные формы) и инертные ингредиенты, которые защищают пептид в желудочной среде и высвобождают биологически активный материал в кишечнике.

Указанные агенты могут быть химически модифицированы так, чтобы пероральная доставка такого производного была эффективной. В целом рассматриваемая химическая модификация представляет собой присоединение, по меньшей мере, одного фрагмента к самой молекуле компонента, где этот фрагмент делает возможным попадание в кровоток из желудка или кишечника, или поглощение непосредственно слизистой оболочкой кишечника. Также желательно увеличение общей стабильности компонента или компонентов и увеличение времени циркуляции в организме. Типовой химической модификацией для фармацевтического применения является пегилирование. Другие фрагменты, которые можно применять, включают: пропиленгликоль, сополимеры этиленгликоля и пропиленгликоля, карбоксиметилцеллюлозу, декстран, поливиниловый спирт, поливиниловый пирролидон, полипролин, поли-1,3-диоксолан и поли-1,3,6-тиоксокан [см., например, работу Abuchowski и Davis (1981) "Soluble Polymer-Enzyme Adducts" in Enzymes as Drugs («Растворимые продукты присоединения полимер-фермент в ферментах как лекарственные средства») под редакцией Hocenberg и Roberts (Wiley-Interscience: New York, NY.), стр. 367-383; и книгу Newmark, et al. (1982) J. Appl. Biochem («Прикладная биохимия») 4:185-189].

В другом варианте реализации данного изобретения предложены жидкие лекарственные формы для перорального приема, включая фармацевтически приемлемые эмульсии, растворы, суспензии и сиропы, которые могут содержать другие компоненты, включая инертные разбавители; адъюванты, такие как смачивающие агенты, эмульгирующие и суспендирующие агенты; и подслащивающие, ароматизирующие агенты и отдушки.

Желательными могут быть лекарственные формы для перорального приема с регулируемым высвобождением. Указанный агент может быть включен в инертную матрицу, которая допускает высвобождение либо с помощью диффузионного, либо выщелачивающего механизма, например, камеди. Также в лекарственную форму могут быть включены медленно разлагающиеся матрицы. Другая форма регулируемого высвобождения основана на терапевтической системе Oros (Alza Corp.), т.е. лекарственное средство заключено в полупроницаемую мембрану, которая позволяет воде входить и выталкивать лекарственное вещество через единственное небольшое отверстие за счет осмотического эффекта.

Для пероральных лекарственных форм местом высвобождения может быть желудок, тонкая кишка (двенадцатиперстная кишка, тощая кишка или подвздошная кишка) или толстая кишка. В некоторых вариантах реализации данного изобретения высвобождение будет предотвращать вредное воздействие среды желудка либо путем защиты агента (или производного), либо за счет высвобождения агента (или производного) за пределами среды желудка, например в кишечнике. Для обеспечения полной резистентности к воздействию среды желудка необходимо покрытие, непроницаемое, по меньшей мере, при рН 5,0. Примерами наиболее распространенных инертных ингредиентов, использующихся в качестве энтеральных покрытий, являются тримеллитат ацетата целлюлозы (CAT), гидроксипропилметилцеллюлозы фталат (HPMCP), HPMCP 50, HPMCP 55, поливинилацетата фталат (PVAP), Eudragit L30D™ (Эудрагит), Aquateric™ (Акватерик), фталат ацетата целлюлозы (CAP), Eudragit L™ , Eudragit S™ и Shellac™ (Шеллак). Эти покрытия можно применять в качестве смешанных пленок.

3. Лекарственные формы для местного применения

Описанные иммуномодулирующие агенты могут применяться местно. Для большинства пептидных препаратов местное применение не является эффективным, хотя оно может быть эффективным, особенно если применяется на слизистые легких, носа, полости рта (сублигвально, буккально), влагалища или прямой кишки.

Композиции могут доставляться в легкие во время вдоха и проникать через эпителий, выстилающий легкие, попадая в кровоток при доставке либо в виде аэрозоля, либо высушенных распылением частиц, имеющих аэродинамический диаметр менее 5 мкм.

Для доставки лекарственных средств в легкие можно применять широкий спектр механических устройств, включая (но не ограничиваясь этим) небулайзеры, дозированные ингаляторы и порошковые ингаляторы; все они знакомы специалистам в данной области техники. Некоторые конкретные примеры коммерчески доступных устройств - это небулайзер Ultravent (Mallinckrodt Inc., Сент-Луис, штат Миссури, США); небулайзер Acorn II (Marquest Medical Products, Энглвуд, штат Колорадо, США); дозированный ингалятор Ventolin (Glaxo Inc., Research Triangle Park, Северная Каролина) и порошковый ингалятор Spinhaler (Fisons Corp., Бедфорд, штат Массачусетс, США). Компании Nektar, Alkermes и Mannkind имеют ингаляционные порошковые препараты инсулина, одобренные или проходящие клинические испытания, где эта технология может быть применена к лекарственным формам, описанным в данной заявке.

Лекарственные формы для введения на слизистую оболочку обычно представляют собой высушенные распылением частицы лекарственного средства, которые могут быть помещены в таблетку, гель, капсулу, суспензию или эмульсию. Применяются стандартные фармацевтические наполнители, имеющиеся в любой лекарственной форме.

Также могут быть приготовлены трансдермальные препараты. Обычно это мази, лосьоны, спреи или пластыри, которые можно приготовить по стандартной технологии. Трансдермальные лекарственные формы могут потребовать включения усилителей проникновения через кожу.

4. Полимерные матрицы с регулируемой доставкой

Иммуномодулирующие агенты, описанные в данной заявке, также можно вводить в лекарственные формы с регулируемым высвобождением. Полимерные устройства с регулируемым высвобождением могут быть изготовлены для длительного системного высвобождения после имплантации полимерного устройства (стержень, цилиндр, пленка, диск) или инъекции (микрочастицы). Матрица может быть в виде микрочастиц, таких как микросферы, где агент диспергирован внутри твердой полимерной матрицы или микрокапсул, в которых ядро состоит из другого материала, отличающегося от полимерной оболочки, а пептид диспергирован или суспендирован в ядре, которое может быть жидким или твердым по своей природе. Микрочастицы, микросферы и микрокапсулы применяются взаимозаменяемо, если только это особо не оговорено в данной заявке. Альтернативно полимер может быть отлит в виде тонкой пластины или пленки размером от нанометров до четырех сантиметров из порошка, полученного измельчением или другими стандартными методами, или даже в виде геля, такого как гидрогель.

Для доставки слитых полипептидов или нуклеиновых кислот, кодирующих слитые полипептиды, можно использовать либо небиоразлагаемые, либо биоразлагаемые матрицы, хотя в некоторых вариантах реализации данного изобретения предпочтительны биоразлагаемые матрицы. Такими матрицами могут быть природные или синтетические полимеры, хотя в некоторых вариантах реализации данного изобретения предпочтительны синтетические полимеры из-за лучших характеристик динамики разлагаемости и высвобождения. Полимер выбирают, исходя из периода, в течение которого требуется высвобождение. В некоторых случаях линейное высвобождение может быть наиболее полезным, хотя в других случаях импульсное высвобождение или «массивное высвобождение» может дать более существенные результаты. Полимер может быть в форме гидрогеля (обычно поглощающего до 90% массы воды) и может быть дополнительно сшит с многовалентными ионами или полимерами.

Указанные матрицы могут быть сформированы испарением растворителя, распылительной сушкой, экстракцией растворителем и другими способами, известными специалистам в данной области техники. Биоразлагаемые микросферы могут быть получены с помощью любого способа, созданного для изготовления микросфер для доставки лекарственного вещества, например, как описано в работах Mathiowitz и Langer, J. Controlled Release («Регулируемое высвобождение»), 5:13-22 (1987); Mathiowitz, et al., Reactive Polymers («Реактивные полимеры»), 6:275-283 (1987), и Mathiowitz, et al., J. Appl. Polymer Sci. («Прикладная наука о полимерах»), 35:755-774 (1988).

Указанные устройства могут быть изготовлены для местного высвобождения с целью лечения области имплантации или инъекции - что обычно обеспечивает дозировку, которая намного меньше, чем дозировка для лечения всего организма - или для системной доставки. Их можно имплантировать или ввести подкожно, в мышцу, жировую ткань или проглотить.

Способы получения

A. Способы получения антител

Антитела могут быть получены в клеточной культуре, в фаге или в различных животных, включая (но не ограничиваясь этим) коров, кроликов, коз, мышей, крыс, хомяков, морских свинок, овец, собак, кошек, мартышек, шимпанзе, человекообразных обезьян. Поэтому в одном варианте реализации данного изобретения антитело является антителом млекопитающего. Фаговые технологии могут применяться для выделения исходного антитела или для создания вариантов с измененными характеристиками специфичности или авидности. Такие технологии являются обычными и хорошо известны в данной области техники. В одном варианте реализации данного изобретения антитело получают рекомбинантными способами, известными в данной области техники. Например, рекомбинантное антитело может быть получено путем трансфекции клетки-хозяина с помощью вектора, содержащего последовательность ДНК, кодирующую это антитело. Один или большее количество векторов могут быть использованы для трансфекции последовательности ДНК, экспрессирующей, по меньшей мере, один участок VL и один участок VH в клетке хозяина. Типовые описания рекомбинантных способов создания и продуцирования антител представлены в работах Delves, Antibody Production: Essential Techniques («Продуцирование антител, важнейшие технологии») (Wiley, 1997); Shephard, et al., Monoclonal Antibodies («Моноклональные антитела») (Oxford University Press, 2000); Goding, Principles and Practice («Божественность, принципы и практика») (Academic Press, 1993); Current Protocols in Immunology («Современные протоколы в иммунологии») (John Wiley & Sons, последнее издание).

Описанные антитела могут быть модифицированы рекомбинантными способами для повышения большей эффективности антитела при опосредовании желаемой функции. Таким образом, в рамках данного изобретения антитела могут быть модифицированы путем замещения с помощью рекомбинантных способов. Как правило, такие замещения будут консервативными замещениями. Например, по меньшей мере, одна аминокислота в константном участке антитела может быть заменена другим остатком. См., например, ET.S патент № 5,624,821, патент США № 6194551, Приложение № WO 9958572; и работу Angal, et al., Mol. Immunol.(«Молекулярная иммунология») 30:105-08 (1993). Модификация аминокислот включает в себя делеции, добавления и замещения аминокислот. В некоторых случаях такие изменения производятся для ослабления нежелательной активности, например комплементзависимой цитотоксичности. Часто на антителах ставят метку путем присоединения, либо ковалентно, либо нековалентно, вещества, которое обеспечивает обнаруживаемый сигнал. Известно большое разнообразие меток и технологий конъюгации, которые известны и широко освещаются как в научной, так и в патентной литературе. Эти антитела могут быть проверены на связывание с белками, полипептидами или слитыми белками B7-H4. См., например, Antibody Engineering: A Practical Approach («Техника создания искусственных антител: Практический подход») (Oxford University Press. 1996).

Например, пригодные антитела с желаемой биологической активностью могут быть идентифицированы с помощью анализов in vitro, включающих (но не ограничивающихся ими) анализы на пролиферацию, миграцию, адгезию, рост на мягком агаре, ангиогенез, межклеточную коммуникацию, апоптоз, транспорт, трансдукцию сигнала, и анализов in vivo, таких как анализ на ингибирование роста опухоли. Антитела, предложенные в данной заявке, также могут быть полезны в диагностике. В качестве иммобилизованных или не нейтрализующих антител, они могут быть проверены на способность связываться со специфическим антигеном без ингибирования рецепторсвязывающей или биологической активности антигена. В качестве нейтрализующих антител, указанные антитела могут быть полезны в конкурентных анализах связывания.

Антитела, которые могут применяться в описанных композициях и способах, включают интактный иммуноглобулин (т. е. интактное антитело) любого класса, его фрагменты и синтетические белки, содержащие, по меньшей мере, антигенсвязывающий вариабельный домен антитела. Вариабельные домены различаются среди антител последовательностью и используются в специфичном связывании каждого конкретного антитела с его конкретным антигеном. Однако вариабельность обычно распределяется неравномерно среди вариабельных доменов антител. Как правило, она концентрируется в трех сегментах, называемых участками, определяющими комплементарность (CDR), или гипервариабельными участками как в легкой цепи, так и в тяжелой цепи вариабельных доменов. Наиболее сохранившиеся части вариабельных доменов называются каркасом (FR). Вариабельные домены нативных тяжелых и легких цепей состоят из четырех каркасных участков (FR), в значительной степени принимающих конфигурацию складчатого бета-слоя, соединенного тремя участками CDR, которые образуют петли, соединяющие, а в некоторых случаях и образующие часть структуры складчатого бета-слоя. Участки CDR в каждой цепи удерживаются вместе в непосредственной близости каркасными участками (FR) и вместе с участками CDR из другой цепи способствуют образованию антигенсвязывающего сайта антител.

Также описаны фрагменты антител, обладающих биоактивностью. Эти фрагменты, независимо от того, присоединены ли они к другим последовательностям или нет, включают инсерции, делеции, замещения или другие выбранные модификации определенных участков или конкретных аминокислотных остатков, при условии, что активность данного фрагмента существенно не изменяется или не нарушается по сравнению с немодифицированным антителом или фрагментом антитела.

Также могут быть адаптированы технологии для получения одноцепочечных антител, специфичных антигенному пептиду. Способы получения одноцепочечных антител хорошо известны специалистам в данной области техники. Одноцепочечное антитело может быть создано путем совместного слияния вариабельных доменов тяжелой и легкой цепи с помощью короткого пептидного линкера, тем самым восстанавливая антигенсвязывающий сайт на одной молекуле. Одноцепочечные вариабельные фрагменты антител (scfv), в которых с-конец одного вариабельного домена связан с N-концом другого вариабельного домена через 15-25 аминокислотных пептидов или линкеров, были созданы без существенного нарушения связывания антигена или специфичности связывания. Линкер выбирается так, чтобы позволить тяжелой цепи и легкой цепи связываться вместе в правильной конформационной ориентации.

Двухвалентные одноцепочечные вариабельные фрагменты (di-scfv) могут быть искусственно созданы за счет соединения двух scfv. Это может быть достигнуто путем продуцирования одной пептидной цепи с двумя участками VH и двумя участками VL, что дает тандемные scfv. Фрагменты scfv также могут быть спроектированы с линкерными пептидами, которые слишком коротки для того, чтобы два вариабельных участка свернулись вместе (около пяти аминокислот), заставляя фрагменты scfv димеризоваться. Этот тип известен как диатела. Было показано, что диатела имеют константы диссоциации до 40 раз ниже, чем соответствующие фрагменты scfv; это означает, что они имеют гораздо более высокое сродство к своей мишени. Еще более короткие линкеры (одна или две аминокислоты) приводят к образованию тримеров (триател или триотел). Также были созданы тетратела. Они демонстрируют еще более высокое сродство к своим мишеням, чем диатела.

Моноклональное антитело получают из достаточно однородной популяции антител, т. е. индивидуальные антитела внутри популяции идентичны, не считая антител с возможными естественными мутациями, которые могут присутствовать в небольшой субпопуляции молекул антитела. Моноклональные антитела включают «химерные» антитела, в которых часть тяжелой и/или легкой цепи идентична или гомологична соответствующим последовательностям в антителах, полученных из определенного вида или принадлежащих к определенному классу или подклассу антител, тогда как остальная часть цепи(ей) идентична или гомологична соответствующим последовательностям в антителах, полученных из другого вида или принадлежащих к другому классу, или подклассу антител, а также фрагменты таких антител, если они проявляют желаемую антагонистическую активность.

Моноклональные антитела можно получить с помощью любой процедуры, в которой продуцируются моноклональные антитела. В гибридомном способе мышь или другое подходящее животное-хозяин, как правило, иммунизируют иммунизирующим агентом для выделения лимфоцитов, которые продуцируют или способны продуцировать антитела, которые будут специфически связываться с иммунизирующим агентом. Альтернативно лимфоциты могут быть иммунизированы in vitro.

Также антитела можно получить способами рекомбинантной ДНК. ДНК, кодирующая описанные антитела, может быть легко выделена и секвенирована с помощью обычных процедур (например, с помощью олигонуклеотидных зондов, способных специфически связываться с генами, кодирующими тяжелые и легкие цепи мышиных антител). Банки антител или активных фрагментов антител также можно сформировать и отсортировать с помощью технологий фагового дисплея.

В данной области техники также известны способы получения антител с помощью белковой химии. Один из способов получения белков, содержащих антитела, заключается в соединении двух или большего количества пептидов или полипептидов вместе с помощью технологий белковой химии. Например, пептиды или полипептиды могут быть химически синтезированы с применением имеющегося в настоящее время лабораторного оборудования с использованием либо химии Fmoc (9-флуоренилметилоксикарбонил), либо химии Boc (трет-бутилоксикарбоноил). (Applied Biosystems («Прикладная биохимия»), Inc., Фостер-Сити, штат Калифорния, США). Специалист в данной области техники может легко оценить, что пептид или полипептид, соответствующий антителу, например, может быть синтезирован с помощью стандартных химических реакций. Например, пептид или полипептид могут быть синтезированы и не отщеплены от смолы для синтеза, тогда как другой фрагмент антитела может быть синтезирован и впоследствии отщеплен от смолы, тем самым обнажая терминальную группу, которая функционально заблокирована на другом фрагменте. Эти два фрагмента посредством реакции конденсации пептидов могут быть ковалентно соединены через пептидную связь на их карбоксильных и амино-концах соответственно с образованием антитела или его фрагмента. Альтернативно пептид или полипептид синтезируются независимо in vivo, как описано выше. После выделения эти независимые пептиды или полипептиды могут быть соединены с образованием антитела или его антигенсвязывающего фрагмента посредством аналогичных реакций конденсации пептидов.

Например, ферментативное лигирование клонированных или синтетических пептидных сегментов позволяет соединять относительно короткие пептидные фрагменты для получения более крупных пептидных фрагментов, полипептидов или целых белковых доменов. Альтернативно нативное химическое лигирование синтетических пептидов может применяться для конструирования длинных синтетических пептидов или полипептидов из более коротких пептидных фрагментов. Этот способ включает в себя двухступенчатую химическую реакцию. Первая стадия - это хемоселективная реакция незащищенного синтетического пептида альфа-тиоэфира с другим незащищенным пептидным сегментом, содержащим цис-аминотерминальный остаток, с получением связанного с тиоэфиром интермедиата в качестве исходного ковалентного продукта. Этот интермедиат, не изменяя условий реакции, подвергается спонтанной быстрой внутримолекулярной реакции с образованием нативной пептидной связи в месте лигирования.

B. Способы получения белков

Описанные белки, полипептиды, их фрагменты, варианты и слияния можно получить с помощью обычных способов, известных в данной области техники. Изолированные слитые белки можно получить, например, путем химического синтеза или рекомбинантного продуцирования в клетке хозяина. Для рекомбинантного продуцирования белка, полипептида, его фрагмента, варианта или слияния нуклеиновая кислота, содержащая нуклеотидную последовательность, кодирующую белок, полипептид, его фрагмент, вариант или слияние, может применяться для трансформации, трансдукции или трансфекции бактериальной или эукариотической клетки хозяина (например, клетки насекомого, дрожжей или млекопитающего). В целом конструкции нуклеиновых кислот включают регуляторную последовательность, функционально связанную с нуклеотидной последовательностью, кодирующей белок, полипептид, его фрагмент, вариант или слияние. Регуляторные последовательности (также называемые в данной заявке экспрессирующими управляющими последовательностями), как правило, не кодируют генный продукт, а вместо этого влияют на экспрессию последовательностей нуклеиновых кислот, с которыми они функционально связаны.

Полезные прокариотические и эукариотические системы для экспрессии и продуцирования полипептидов хорошо известны в данной области техники, включают, например, штаммы кишечной палочки, такие как BL-21, и культивируемые клетки млекопитающих, такие как клетки CHO.

В эукариотических клетках хозяина для экспрессии слитых белков можно применять ряд экспрессирующих систем на основе вируса. Вирусные экспрессирующие системы хорошо известны в данной области техники и включают (но не ограничиваются ими) бакуловирусные векторы, векторы SV40, ретровирусные векторы или вирусные векторы не основе осповакцины.

Клеточные линии млекопитающих, стабильно экспрессирующие белки, полипептиды, их фрагменты, варианты или слияния можно продуцировать с помощью экспрессирующих векторов с соответствующими управляющими элементами и селективным маркером. Например, экспрессирующие векторы эукариот pCR3.1 (Invitrogen Life Technologies) и p91023(B) (см. работу Wong et al. (1985) Science 228: 810-815) подходят для экспрессии белков, полипептидов, их фрагментов, вариантов или слияний, например, в клетках яичников китайского хомяка (CHO), клетках COS-1, клетках эмбриональной почки человека 293, клетках NIH3T3, клетках BHK21, клетках MDCK и клетках сосудистого эндотелия человека (HUVEC). Дополнительные пригодные экспрессирующие системы включают систему экспрессии гена GS Gene Expression System™, которую можно приобрести через компанию Lonza Group Ltd.

После введения экспрессирующего вектора путем электропорации, липофекции, ко-преципитации фосфата кальция или хлорида кальция, декстрана DEAE, или другого пригодного метода трансфекции можно выбрать стабильные клеточные линии (например, путем метаболического отбора или выявления устойчивости к антибиотикам: G418, канамицину или гигромицину). Трансфицированные клетки можно культивировать так, что экспрессируется полипептид, представляющий интерес; этот полипептид может быть восстановлен, например, из супернатанта клеточной культуры или из лизированных клеток. Альтернативно белок, полипептид, его фрагмент, вариант или слияние можно получить путем (а) лигирования амплифицированных последовательностей в экспрессирующий вектор млекопитающих, такой как pcDNA3 (Invitrogen Life Technologies); и (b) транскрибирования и трансляции in vitro с помощью экстракта зародышей пшеницы или лизата ретикулоцитов кролика.

Белки, полипептиды, их фрагменты, варианты или слияния можно выделить с помощью, например, хроматографических способов, таких как аффинная хроматография, ионообменная хроматография, хроматография гидрофобного взаимодействия, ионообменная хроматография с DEAE, гель-фильтрация и хроматография с гидроксилапатитом. В некоторых вариантах реализации данного изобретения белки, полипептиды, их фрагменты, варианты или слияния могут быть искусственно созданы так, чтобы содержать дополнительный домен, содержащий аминокислотную последовательность, которая позволяет захватывать полипептиды на матрицу аффинности. Например, слитый с Fc полипептид в супернатанте клеточной культуры или цитоплазматическом экстракте можно выделить с помощью колонки белка A. Кроме того, для облегчения очистки полипептидов можно использовать такие метки, как c-myc, гемагглютинин, полигистидин или Flag™ (Kodak). Такие метки можно вставлять в любом месте в полипептиде, в том числе на карбоксильном или амино-конце. Другие слияния, которые могут быть полезными, включают ферменты, которые помогают в обнаружении полипептида, такие как щелочная фосфатаза. Также для очистки полипептидов можно применять иммуноаффинную хроматографию. Можно дополнительно искусственно создать слитые белки так, чтобы они содержали секреторный сигнал (если секреторный сигнал еще не присутствует), который заставляет клетки, в которых он продуцируется, секретировать белки, полипептиды, их фрагменты, варианты или слияния. Затем секретируемые белки, полипептиды, их фрагменты, варианты и слияния можно беспрепятственно выделить из клеточной среды.

C. Способы получения отдельных молекул нуклеиновых кислот

Отдельные молекулы нуклеиновых кислот можно получить с помощью стандартных технологий, включая без каких-либо ограничений общеизвестные технологии молекулярного клонирования и химического синтеза нуклеиновых кислот. Например, технологии полимеразной цепной реакции (ПЦР) можно применять для получения изолированной нуклеиновой кислоты, кодирующей вариантный полипептид. ПЦР - это технология, в которой происходит ферментативная амплификация целевых нуклеиновых кислот. Как правило, информацию о последовательности с концов участка, представляющего интерес, или за его пределами можно использовать для проектирования олигонуклеотидных праймеров, идентичных по последовательности противоположным нитям шаблона, который подвергается амплификации. ПЦР можно применять для амплификации конкретных последовательностей ДНК, а также РНК, включая последовательности общей геномной ДНК или общей клеточной РНК. Длина праймеров, как правило, составляет от 14 до 40 нуклеотидов, но может варьировать от 10 нуклеотидов до сотен нуклеотидов. Общие технологии ПЦР описаны, например, в книге PCR Primer: A Laboratory Manual («ПЦР праймер: Лабораторное руководство») ed. Dieffenbach and Dveksler, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995. При использовании РНК в качестве источника шаблона для синтеза нити комплементарной ДНК (кднк) можно применить обратную транскриптазу. Для получения отдельных нуклеиновых кислот также можно применять лигазную цепную реакцию, амплификацию смещения нитей, самоподдерживающуюся репликацию последовательностей или амплификацию на основе последовательностей нуклеиновых кислот. См., например, работы Lewis (1992) Genetic Engineering News («Новости генной инженерии») 12:1; Guatelli et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1874-1878; и Weiss (1991) Science 254: 1292-1293.

Отдельные нуклеиновые кислоты могут быть химически синтезированы либо в виде одной молекулы нуклеиновой кислоты, либо в виде серии олигонуклеотидов (например, с помощью фосфорамидитной технологии для автоматизированного синтеза ДНК в направлении от 3’ до 5’). Например, можно синтезировать одну или большее количество пар длинных олигонуклеотидов (например, >100 нуклеотидов), содержащих желаемую последовательность, где каждая пара содержит короткий сегмент комплементарности (например, около 15 нуклеотидов), так что при гибридизации пары олигонуклеотидов образуется дуплекс. ДНК-полимеразу можно применять для расширения олигонуклеотидов, в результате которого образуется одна двухцепочечная молекула нуклеиновой кислоты на олигонуклеотидную пару, которую затем можно лигировать в вектор. Отдельные нуклеиновые кислоты также могут быть получены путем мутагенеза. Нуклеиновые кислоты, кодирующие белки, могут быть мутированы с помощью стандартных технологий, включая олигонуклеотид-направленный мутагенез и/или сайт-направленный мутагенез с помощью ПЦР. См. Short Protocols in Molecular Biology («Короткие протоколы в молекулярной биологии»). Глава 8, Green Publishing Associates and John Wiley & Sons, под редакцией Ausubel et al., 1992.

IV. Анализы и скрининг антител

Анализы для скрининга антител включают:

1. Анализ аффинности связывания B7-H4-Fc с лигандами в сравнении с B7-H4.

2. Функциональные анализы для подтверждения того, что В7-Н4-Fc препятствует передаче сигнала клетками, экспрессирующими В7-Н4. Для этих анализов могут применяться репортерные клетки или первичные клетки B7-H4+, которые являются еще одним возможным вариантом.

Для формирования высокоаффинных моноклональных антител (mAb) к B7-H4 запатентованными способами иммунизации можно применять мышей с дефицитом B7-H4 («выбивание гена») или мышей дикого типа. Для формирования моноклональных антител с целью преодоления «толерантности» могут использоваться мыши NZB/WF1, склонные к аутоиммунным заболеваниям.

1. Фаза I скрининга: Связывание моноклональных антител (mAb) с клеточными линиями, трансфицированными для экспрессии B7-H4 на поверхности клеток. Кроме того, моноклональные антитела должны обладать способностью связывать эндогенно экспрессируемый B7-H4 на поверхности первичных субпопуляций клеток человека. Эти моноклональные антитела должны быть высоко специфичны к B7-H4. Скрининг антитела может быть проведен с помощью иммуноферментного анализа (ИФА) с очищенным белком В7-Н4 для выявления анти-В7-Н4 антител.

2. Фаза II скрининга: B7-H4- специфические моноклональные атитела должны блокировать связывание B7-H4 с его лигандами и/или клетками-мишенями.

3. Фаза III скрининга: Функциональные анализы для подтверждения того, что моноклональные антитела к B7-H4 или комбинация моноклональных антител модулируют передачу сигналов В7-Н4. В этих анализах будут использоваться клеточные линии, которые экспрессируют эндогенный B7-H4, или первичные клетки, такие как человеческие моноциты, макрофаги и субпопуляции дендритных клеток, с целью оценить функцию в присутствии моноклональных антител к B7-H4. Кроме того, могут использоваться линии репортерных клеток для определения того, изменяются ли сигнальные каскады, такие как NFkB (репортерный nfkb) или NFAT (репортерный NFAT), после культивирования с моноклональными антителами к B7-H4.

4. Фаза IV скрининга: Функциональные анализы для определения способности моноклональных антител к В7-Н4 индуцировать с помощью других механизмов антитело-зависимую клеточную цитотоксичность (АЗКЦ), комплемент-зависимую цитотоксичность (КЗЦ) или клеточный апоптоз клеточных линий, экспрессирующих В7-Н4. В частности, моноклональные антитела к B7-H4 будут протестированы на деплетирующую способность одним из этих способов лейкозные клеточные линии, которые, как известно, экспрессируют B7-H4 на поверхности клеток. Моноклональные антитела к B7-H4 также могут быть искусственно созданы для деплетирования клеток, экспрессирующих B7-H4, и протестированы известными способами, как описано далее в данном документе.

5. Фаза V скрининга: Функциональные анализы для определения способности моноклональных антител к B7-H4 доставлять или индуцировать отрицательный сигнал (агонист) через B7-H4 в клетки, экспрессирующие B7-H4, для ингибирования клеточной функции. Клеточные линии, эндогенно экспрессирующие B7-H4, или трансфектанты клеточных линий будут оцениваться на предмет изменений фенотипа и выживаемости после культивирования с моноклональными антителами к B7-H4. В других анализах репортерные клеточные линии будут использоваться для определения в моноклональных антителах к B7-H4 модулирующих положительных сигнальных каскадов, таких как NF-kB (репортерный NF-kB), или других известных клеточных сигнальных репортеров. Также будет проведена оценка индуцирования апоптоза в клеточных линиях.

Анализы фазы II и III могут применяться для прогнозирования концентраций моноклональных антител к B7-H4, необходимых для блокирования физиологического уровня лигандов in vivo.

V. Способ применения

Антагонисты или агонисты B7-H4 могут применяться для модуляции иммунных реакций у субъектов, нуждающихся в таком лечении.

Ниже подробно рассматриваются типовые способы применения.

A. Стимуляция иммунного ответа

1.Терапевтические стратегии

Приводятся методы индуцирования или усиления иммунного ответа у субъекта. Как правило, эти методы включают введение субъекту эффективного количества иммуномодулирующего агента или клеток, подвергшихся первичному воздействию иммуномодулирующего антигена ex vivo. Иммунный ответ может быть, например, первичным иммунным ответом на антиген или усилением эффекторной функции клеток, такой как увеличение антигенспецифической пролиферации Т-клеток, увеличение продуцирования цитокинов Т-клетками, стимулирование дифференцировки или их комбинация. В некоторых вариантах реализации данного изобретения указанный агент может усиливать развитие интактных Т-клеток в Thl, Thl7, Th22, или других клеток, которые секретируют или заставляют другие клетки секретировать воспалительные молекулы, включая (но не ограничиваясь этим) ИЛ-lp, ФНО-альфа, ТФР-бета, ИФН-гамма, ИЛ-17, ИЛ-6, ИЛ-23, ИЛ-22, ИЛ-21 и матриксные металлопротеиназы (ММП). В некоторых вариантах реализации данного изобретения указанный агент может уменьшать или ингибировать активность регуляторных T-клеток (Treg), уменьшать продуцирование цитокинов, таких как ИЛ-10 из Treg, уменьшать дифференцировку Treg, уменьшать количество Treg, уменьшать соотношение Treg в популяции иммунных клеток или уменьшать выживаемость Treg. Иммуномодулирующее средство может быть введено субъекту, который в этом нуждается, в эффективном количестве для преодоления истощения Т-клеток и/или анергии Т-клеток. Преодоление истощения Т-клеток или анергии Т-клеток может быть определено путем измерения функции Т-клеток известными способами.

Эти способы могут быть применены in vivo или ex vivo как терапевтические способы стимулирования иммунного ответа. Таким образом, в некоторых вариантах реализации данного изобретения данный агент или нуклеиновая кислота, кодирующая этот агент, вводится непосредственно субъекту. В некоторых вариантах реализации данного изобретения данный агент или нуклеиновая кислота, кодирующая этот агент, контактирует с клетками (например, иммунными клетками) ex vivo, и субъекту вводятся обработанные клетки (например, адоптивный перенос). В целом описанные иммуномодулирующие агенты могут применяться для лечения субъекта, имеющего или предрасположенного к любому заболеванию или нарушению, на которое иммунная система субъекта дает иммунный ответ. Эти агенты могут вызывать более сильный иммунный ответ. Описанные композиции полезны для стимуляции или усиления иммунных реакций с участием Т-клеток.

Иммуномодулирующие агенты, использующиеся для усиления иммунного ответа, как правило, являются агентами, которые снижают экспрессию B7-H4, связывание лиганда, сшивание, отрицательную сигнализацию или их комбинацию. Например, агент может быть антагонистом B7-H4, таким как антагонист (блокирующий) анти-B7-H4 антитела, или его антигенсвязывающего фрагмента. Таким агентом также может быть полипептид B7-H4, например, растворимый полипептид, или его слитый белок, который может служить ловушечным рецептором для одного или нескольких лигандов или рецепторов B7-H4.

Блокада B7-H4, например, с помощью функции, блокирующей анти-B7-H4 антитела, может быть агентом, альтернативным или комплементарным растворимым полипептидам B7-H4 и слитым белкам. Например, в некоторых вариантах реализации данного изобретения блокада B7-H4 сочетается с ловушечным рецептором, таким как растворимый B7-H4 или его слитый белок. Это комбинированное лечение (например, блокада B7-H4-Fc и B7-H4) может быть комплементарным.

В некоторых вариантах реализации данного изобретения терапия, стимулирующая иммунный ответ (например, при лечении рака или инфекций), включает деплетирование клеток B7-H4+.

Создание и идентификация деплетирующих моноклональных антител к В7-Н4 могут быть выполнены в соответствии с известными способами искусственного создания и скрининга, включая способы, которые представлены в данной заявке. См., например, работу Reff, et al., Blood («Кровь»). Vol.83, № 2, 1994: стр. 435-445, в которой описано получение анти-CD20 химерного антитела, которое связывается с человеческим Clq и опосредует комплемент-зависимый лизис клеток (КЗЛК) в присутствии человеческого комплемента и антитело-зависимую клеточную цитотоксичность (АЗКЦ) с помощью человеческих эффекторных клеток. Ритуксимаб (Rituximab) разрушает в-клетки и поэтому используется для лечения заболеваний, которые характеризуются гиперактивностью, дисфункцией или чрезмерным количеством В-клеток. К другим антителам, деплетирующим в-клетки, относится окрелизумаб (ocrelizumab) и офатумумаб (ofatumumab). В другом примере антитела к CD3 могут преимущественно нацеливаться и деплетировать активированные эффекторные Т-клетки, сохраняя при этом регуляторные клетки CD4⁺Foxp3⁺. Антитела кратковременно деплетируют Т-клетки, хотя они или совсем не проявляют или проявляют незначительную комплементзависимую и антителозависимую клеточную цитотоксичность. Было показано, что перенаправленный лизис клеток обусловлен способностью сшивать молекулы CD3, экспрессирующиеся двумя различными клетками (цитотоксическими CD8+ Т-клетками с одной стороны и другими целевыми Т-клетками с другой), однако деплетирование Т-клеток в основном является результатом AICD (рассмотрено в You, Front Immunol. 2015; 6: 242).

Субъекту, который нуждается в усилении у него иммунного ответа, может быть введен агент, который ингибирует или блокирует иммунный ответ, ослабленный B7-H4, в количестве, эффективном для увеличения поглощения антигена антигенпрезентирующими клетками (АПК).

2. Субъекты, подвергающиеся лечению

а. Лечение рака

Описанные композиции и способы могут быть применены для лечения онкологических заболеваний. Как правило, агенты используются для стимуляции или усиления иммунного ответа на рак у субъекта путем введения субъекту количества иммуномодулирующего агента, который уменьшает экспрессию B7-H4, связывание лиганда, сшивание, отрицательную сигнализацию или их комбинацию. В процессе своего развития раковые клетки приобретают характерный набор функциональных возможностей, хотя и посредством различных механизмов. Такие возможности включают в себя утрату клетками способности к апоптозу, самодостаточность в том, что касается сигналов роста, нечувствительность к сигналам анти-роста, инвазию тканей/метастазирование, безграничный репликационный потенциал и устойчивый ангиогенез. Термин «раковая клетка» должен охватывать как предраковые, так и злокачественные раковые клетки. В некоторых вариантах реализации данного изобретения рак относится к доброкачественной опухоли, которая остается локализованной. В других вариантах реализации данного изобретения рак относится к злокачественной опухоли, которая инвазировала и разрушила соседние структуры тела, и распространилась на отдаленные участки. В других же вариантах реализации данного изобретения рак ассоциируется с конкретным антигеном рака (например, антигеном панкарциномы (KS 1/4), антигеном карциномы яичников (CA125), простатоспецифическим антигеном (PSA), карциноэмбриональным антигеном (CEA), CD 19, CD20, HER2/neu и т.д.).

Способы и композиции, описанные в данной заявке, полезны для лечения или профилактики различных видов рака или других аномальных пролиферативных заболеваний, включая (но не ограничиваясь этим) следующие: карцинома, включая рак мочевого пузыря, молочной железы, толстой кишки, почек, печени, легких, яичников, поджелудочной железы, желудка, шейки матки, щитовидной железы и кожи; включая плоскоклеточный рак; лимфоидные гемобластозы, включая лейкоз, острый лимфоцитарный лейкоз, острый лимфобластный лейкоз, В-клеточная лимфома, Т-клеточная лимфома, лимфома Беркитта; миелоидные гемобластозы, в том числе острые и хронические миелолейкозы и промиелоцитарные лейкозы; опухоли мезенхимального происхождения, в том числе фибросаркома и рабдомиоскаркома; другие опухоли, в том числе меланома, семинома, тератокарцинома, нейробластома и глиома; опухоли центральной и периферической нервной системы, в том числе астроцитома, нейробластома, глиома и шванномы; опухоли мезенхимального происхождения, в том числе фибросаркома, рабдомиоскарама и остеосаркома; и другие опухоли, включая меланому, пигментную ксеродерму, кератоакантому, семиному, фолликулярный рак щитовидной железы и тератокарциному.

Виды рака, вызванные аберрациями в апоптозе, также можно лечить описанными способами и композициями. Такие виды рака могут включать (но не ограничиваться этим) фолликулярные лимфомы, карциномы с мутациями р53, гормонозависимые опухоли молочной железы, предстательной железы и яичников, а также предраковые поражения, такие как семейный аденоматозный полипоз и миелодиспластические синдромы. В конкретных вариантах реализации данного изобретения этими способами и композициями лечат или предотвращают злокачественные или диспластические изменения (такие как метаплазии и дисплазии) или гиперпролиферативные нарушения в яичниках, мочевом пузыре, молочной железе, толстой кишке, легких, коже, поджелудочной железе или матке. В других конкретных вариантах реализации данного изобретения с помощью этих способов и композиций лечат или предотвращают саркому, меланому или лейкоз.

Описанные композиции и способы особенно полезны для лечения раковых заболеваний, связанных с клетками, экспрессирующими аномально высокие уровни B7-H4.

Конкретные раковые заболевания и родственные нарушения, которые можно лечить или предупреждать способами и композициями, описанными в данной заявке, включают (но не ограничиваются этим) лейкозы, включая (но не ограничиваясь этим) острый лейкоз, острый лимфоцитарный лейкоз, острые миелоцитарные лейкозы, такие как миелобластный, промиелоцитарный, миеломоноцитарный, моноцитарный, эритролейкоз, лейкозы и миелодиспластический синдром, хронические лейкозы, включая (но не ограничиваясь этим), хронический миелоцитарный (гранулоцитарный) лейкоз, хронический лимфолейкоз, волосатоклеточный лейкоз; истинная полицитемия; лимфомы, включая (но не ограничиваясь этим) ходжкинскую лимфому или неходжкинскую лимфому (например, диффузную В-крупноклеточную лимфому (DLBCL), не экспрессирующую киназу анапластической лимфомы (ALK) (ALK-отрицательную DLBCL); диффузную В-крупноклеточную лимфому (DLBCL), экспрессирующую киназу анапластической лимфомы (ALK) (ALK-положительную DLBCL); анапластическую крупноклеточную лимфому (ALCL), экспрессирующую киназу анапластической лимфомы (ALK) (AKL-положительную ALCL), острую миелоидную лимфому (AML)); множественные миеломы, включая (но не ограничиваясь этим) вялотекущую множественную миелому, несекреторную миелому, остеосклеротическую миелому, плазмоклеточный лейкоз, солитарную плазмоцитому и экстрамедуллярные плазмоцитомы; макроглобулинемию Вальденстрема; моноклональную гаммопатию неопределенного значения; доброкачественную моноклональную гаммопатию; болезнь тяжелой цепи; саркомы костей и соединительной ткани, включая (но не ограничиваясь этим) саркому костей, остеосаркому, хондросаркому, саркому Юинга, злокачественную гигантоклеточную опухоль, фибросаркому костей, хордому, периостальную саркому, саркому мягких тканей, ангиосаркому (гемангиосаркому), фибросаркому, саркому Капоши, лейомиосаркому, липосаркому, лимфангиосаркому, неврилеммому, рабдомиосаркому, синовиальную саркому; опухоли головного мозга, включая (но не ограничиваясь этим) глиому, астроцитому, глиому ствола мозга, эпендимому, олигодендроглиому, неглиальные опухоли, невриному слухового нерва, краниофарингиому, медуллобластому, менингиому, пинеоцитому, пинеобластому, первичную лимфому головного мозга; рак молочной железы, включая (но не ограничиваясь этим), аденокарциному, лобулярную (мелкоклеточную) карциному, внутрипротоковую карциному, медуллярный рак молочной железы, муцинозный рак молочной железы, тубулярный рак молочной железы, папиллярный рак молочной железы, болезнь Педжета и воспалительный рак молочной железы; рак надпочечников, включая (но не ограничиваясь этим) феохромоцитому и адренокортикальную карциному; рак щитовидной железы, включая (но не ограничиваясь этим) папиллярный или фолликулярный рак щитовидной железы, медуллярный рак щитовидной железы и анапластический рак щитовидной железы; рак поджелудочной железы, включая (но не ограничиваясь этим) инсулиному, гастриному, глюкагоному, випому, соматостатин-секретирующую опухоль и карциноидную или островковую клеточную опухоль; рак гипофиза, включая (но не ограничиваясь этим) болезнь Кушинга, пролактин-секретирующую опухоль, акромегалию и несахарный диабет; рак глаз, включая (но не ограничиваясь этим) меланому глаз, такую как меланома радужки, меланому хориоидеи, меланому цилиарного тела и ретинобластому; рак влагалища, включая (но не ограничиваясь этим) плоскоклеточный рак, аденокарциному и меланому; рак вульвы, включая (но не ограничиваясь этим) плоскоклеточный рак, меланому, аденокарциному, базально-клеточный рак, саркому и болезнь Педжета; рак шейки матки, включая (но не ограничиваясь этим) плоскоклеточную карциному и аденокарциному; рак матки, включая (но не ограничиваясь этим) карцинома эндометрия и саркому матки; рак яичников, включая (но не ограничиваясь этим) эпителиальную карциному яичников, пограничную опухоль, опухоль зародышевых клеток и стромальную опухоль; рак пищевода, включая (но не ограничиваясь этим) плоскоклеточный рак, аденокарциному, аденоидно-кистозную карциному, мукоэпидермоидную карциному, аденосквамозную карциному, саркому, меланому, плазмоцитому, веррукозную карциному и овсяноклеточную (мелкоклеточную) карциному; рак желудка, включая (но не ограничиваясь этим) аденокарциному с образованием некротичесих язв (полипоидную), изъязвляющую, поверхностно распространяющуюся, диффузно распространяющуюся, злокачественную лимфому, липосаркому, фибросаркому и карциносаркому; рак толстой кишки; рак прямой кишки; рак печени, включая (но не ограничиваясь этим) гепатоцеллюлярную карциному и гепатобластому, рак желчного пузыря, включая (но не ограничиваясь этим) аденокарциному; холангиокарциномы, включая (но не ограничиваясь этим) папиллярную, узловую и диффузную; рак легких, включая (но не ограничиваясь этим) немелкоклеточный рак легких, плоскоклеточную карциному (эпидермоидную карциному), аденокарциному, крупноклеточный рак и мелкоклеточный рак легких; рак яичек, включая (но не ограничиваясь этим) герминому, семиному, анапластическую, классическую (типичную), сперматоцитарную, несеминому, эмбриональную карциному, тератомукарциному, хориокарциному (опухоль желточного мешка); рак предстательной железы, включая (но не ограничиваясь этим) аденокарциному, лейомиосаркому и рабдомиосаркому; рак полового члена; рак полости рта, включая (но не ограничиваясь этим) плоскоклеточную карциному; базальный рак; рак слюнных желез, включая (но не ограничиваясь этим) аденокарциному, мукоэпидермоидную карциному и аденокистозную карциному; рак глотки, включая (но не ограничиваясь этим) плоскоклеточный рак и веррукозный рак; рак кожи, включая (но не ограничиваясь этим) базально-клеточную карциному, плоскоклеточную карциному и меланому, поверхностно распространяющуюся меланому, узловую меланому, злокачественную меланому лентиго, акральную лентигинозную меланому; рак почек, включая (но не ограничиваясь этим) почечно-клеточный рак, аденокарциному, гипернефрому, фибросаркому, переходно-клеточный рак (почечная лоханка и/или мочеточник); опухоль Вильмса; рак мочевого пузыря, включая (но не ограничиваясь этим) переходно-клеточную карциному, плоскоклеточный рак, аденокарциному, карциносаркому. Кроме того, к раковым заболеваниям относятся миксосаркома, остеогенная саркома, эндотелиосаркома, лимфангиоэндотелиосаркома, мезотелиома, синовиома, гемангиобластома, эпителиальная карцинома, цистаденокарцинома, бронхогенная карцинома, карцинома потовых желез, карцинома сальных желез, папиллярная карцинома и папиллярная аденокарцинома (обзор таких заболеваний см. в работах Fishman et al., 1985, Medicine, 2d ed., J.B. Lippincott Co., Philadelphia and Murphy et al., 1997, Informed Decisions: The Complete Book of Cancer Diagnosis, Treatment, and Recovery («Обоснованные решения: Полная книга по диагностике рака, лечению и восстановлению»), Viking Penguin, Penguin Books U.S.A., Inc., United States of America).

b. Лечение инфекций

Описанные композиции и способы могут применяться для лечения инфекций и инфекционных заболеваний. Как правило, указанные агенты применяются для стимуляции или усиления иммунного ответа на агент, вызывающий инфекцию у субъекта, путем введения этому субъекту некоторого количества иммуномодулирующего агента, который уменьшает экспрессию B7-H4, связывание лиганда, сшивание, передачу отрицательного сигнала или их комбинацию. Этот способ может облегчить один или большее количество симптомов инфекции.

Нейтрофилы являются основным компонентом врожденной защиты хозяина от инфекции, а также способствуют развитию аутоиммунных заболеваний и хронического воспаления. При инфекции нейтрофилы быстро мигрируют в очаги воспаления, активируются и запускают каскад защитных механизмов, включая фагоцитоз, уничтожение и дегенерацию микроорганизмов антимикробными и протеолитическими белками, а также генерацию активных форм кислорода. Нейтрофилы также участвуют в разрушении тканей, ремоделировании, заживлении ран и модуляции других воспалительных и адаптивных иммунных компонентов. В связи с короткой продолжительностью жизни нейтрофилов их количество должно постоянно пополняться во время инфекции и воспаления путем увеличения их образования из миелоидных клеток-предшественниц в костном мозге. B7-H4 ингибирует in vitro рост клеток-предшественниц нейтрофилов, полученных из костного мозга, что указывает на ингибирующую функцию B7-H4 в образовании нейтрофилов (Zhu, G. et al., Blood («Кровь»), 113: 1759-1767 (2009)).

В одном варианте реализации данного изобретения предложен способ лечения инфекции у больного, путем введения агента, который ингибирует или блокирует иммунный ответ, ослабленный B7-H4, в количестве, эффективном для образования нейтрофилов и/или повышения врожденного иммунитета.

Инфекция или заболевание может быть вызвано бактерией, вирусом, простейшим, гельминтом или другим микробным патогеном, который проникает внутриклеточно и атакуется, в частности, цитотоксическими Т-лимфоцитоами.

Инфекция или инфекционное заболевание может быть острыми или хроническими. Острая инфекция - это, как правило, инфекция короткой продолжительности. Во время острой микробной инфекции иммунные клетки начинают экспрессировать иммуномодулирующие рецепторы. Соответственно, в некоторых вариантах реализации данного изобретения этот способ включает усиление стимулирующего иммунного ответа на острую инфекцию.

Инфекция может быть вызвана, например, микроорганизмами (но не ограничивается этим) Candida albicans, Listeria monocytogenes, Streptococcus pyogenes, Streptococcus pneumoniae, Neisseria meningitidis, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa или Mycobacterium.

В некоторых вариантах реализации данного изобретения описанные композиции применяются для лечения хронических инфекций, например инфекций, при которых произошло истощение Т-клеток или анергия Т-клеток, в результате чего инфекция остается в организме хозяина в течение длительного времени.

Типовыми инфекциями, которые подвергаются лечению, являются хронические инфекции, вызываемые вирусом гепатита, вирусом иммунодефицита человека (HIV), человеческим Т-лимфотрофным вирусом (HTLV), вирусом герпеса, вирусом Эпштейна-Барра или вирусом папилломы человека.

Поскольку излечение от вирусных инфекций происходит, прежде всего, благодаря действию Т-клеток, увеличение активности Т-клеток было бы терапевтически полезно в ситуациях, когда для животного или человека необходимо более быстрое или полное выведение инфекционного вирусного агента из организма. Таким образом, описанные композиции можно вводить для лечения местных или системных вирусных инфекций, включая (но не ограничиваясь этим) иммунодефицит (например, HIV), папиллому (например, HPV), герпес (например, HSV), энцефалит, грипп (например, человеческий вирус гриппа типа А), простуду (например, риновирус человека) и другие вирусные инфекции, вызванные, например, HTLV, вирусом гепатита, респираторно-синцитиальным вирусом, вирусом осповакцины и вирусом бешенства. Эти молекулы можно вводить местно для лечения вирусных заболеваний кожи, таких как герпетические поражения или опоясывающий лишай, или генитальные бородавки. Эти молекулы также можно вводить системно для лечения системных вирусных заболеваний, включая (но не ограничиваясь этим) СПИД, грипп, простуду или энцефалит.

Репрезентативные инфекции, которые можно лечить, включают (но не ограничиваются этим) инфекции, вызванные микроорганизмами, включая (но не ограничиваясь этим) Actinomyces, Anabaena, Bacillus, Bacteroides, Bordetella, Borrelia, Campylobacter, Caulobacter, Chlamydia, Chlorobium, Chromatium, Clostridium, Corynebacterium, Cytophaga, Deinococcus, Escherichia, Francisella, Halobacterium, Heliobacter, Haemophilus, Hemophilus influenza типа B (HIB), Hyphomicrobium, Legionella, Leptspirosis, Listeria, Meningococcus A, B и с, Methanobacterium, Micrococcus, Mycoplasma, Myxococcus, Neisseria, Nitrobacter, Oscillatoria, Prochloron, Proteus, Pseudomonas, Phodospirillum, Rickettsia, Salmonella, Shigella, Spirillum, Spirochaeta, Staphylococcus, Streptococcus, Streptomyces, Sulfolobus, Thermoplasma, Thiobacillus и Treponema, Vibrio, Yersinia, Cryptococcus neoformans, Histoplasma capsulatum, Candida albicans, Candida tropicalis, Nocardia asteroides, Rickettsia ricketsii, Rickettsia typhi, Mycoplasma pneumoniae, Chlamydial psittaci, Chlamydial trachomatis, Plasmodium falciparum, Trypanosoma brucei, Entamoeba histolytica, Toxoplasma gondii, Trichomonas vaginalis и Schistosoma mansoni.

Другие микроорганизмы, которые можно лечить с помощью описанных композиций и способов, включают бактерии, такие как Klebsiella, Serratia, Pasteurella; патогены, связанные с холерой, столбняком, ботулизмом, сибирской язвой, чумой и болезнью Лайма; или грибковые или паразитарные патогены, такие как Candida (albicans, krusei, glabrata, tropicalis и др.), Genus Mucorales (mucor, absidia, rhizophus), Sporothrix (schenkii), Blastomyces (dermatitidis), Paracoccidioides (brasiliensis), Coccidioides (immitis) и Histoplasma (capsulatuma), Entamoeba, histolytica, Balantidium coli, Naegleriafowleri, Acanthamoeba sp., Giardia lambia, Cryptosporidium sp., Pneumocystis carinii, Plasmodium vivax, Babesia microti, Trypanosoma brucei, Trypanosoma cruzi, Toxoplasma gondi и др., Sporothrix, Blastomyces, Paracoccidioides, Coccidioides, Histoplasma, Entamoeba, Histolytica, Balantidium, Naegleria, Acanthamoeba, Giardia, Cryptosporidium, Pneumocystis, Plasmodium, Babesia или Trypanosoma и др.

B. Ингибирование иммунного ответа

1. Терапевтические стратегии

Предложены способы ослабления или ингибирования иммунного ответа у субъекта. Как правило, эти способы включают введение субъекту эффективного количества иммуномодулирующего агента или клеток, подвергшихся первичному воздействию иммуномодулирующего агента ex vivo. Иммунный ответ может представлять собой, например, первичный иммунный ответ на антиген или увеличение эффекторной функции клеток, такой как увеличение антигенспецифической пролиферации Т-клеток, усиление продуцирования цитокинов Т-клетками, стимулирование дифференцировки, или их комбинацию. Таким образом, в некоторых вариантах реализации данного изобретения данный агент уменьшает пролиферацию Т-клеток, продуцирование Т-клеточных цитокинов, дифференцировку Т-клеток или комбинацию этих механизмов. В некоторых вариантах реализации данного изобретения данный агент может ослаблять развитие интактных Т-клеток в Thl, Thl7, Th22 или других клеток, которые секретируют или заставляют другие клетки секретировать воспалительные молекулы, включая (но не ограничиваясь этим)ИЛ-lp, ФНО-aльфа, ТФР-бета, ИФН-гамма, ИЛ-17, ИЛ-6, ИЛ-23, ИЛ-22, ИЛ-21 и матриксные металлопротеиназы (ММП). В некоторых вариантах реализации данного изобретения данный агент может увеличивать или стимулировать активность регуляторных Т-клеток (Treg), увеличивать продуцирование цитокинов, таких как ИЛ-10 из Treg, увеличивать дифференцировку Treg, увеличивать количество Treg, увеличивать соотношение Treg в популяции иммунных клеток или увеличивать выживаемость Treg.

Эти способы можно применять in vivo или ex vivo как виды лечения, ингибирующие иммунный ответ. Таким образом, в некоторых вариантах реализации данного изобретения данный агент или нуклеиновая кислота, кодирующая агент, вводится непосредственно субъекту. В некоторых вариантах реализации данного изобретения данный агент или нуклеиновая кислота, кодирующая агент, контактирует с клетками (например, иммунными клетками) ex vivo, и субъекту вводятся обработанные клетки (например, адоптивный перенос). В целом, описанные иммуномодулирующие агенты могут применяться для лечения субъекта, имеющего или предрасположенного к любому заболеванию или нарушению, на которое иммунная система субъекта дает гиперактивный или неадекватный иммунный ответ. Данные агенты могут вызывать менее сильный иммунный ответ. Описанные композиции полезны для ослабления или ингибирования иммунных реакций с участием Т-клеток.

Иммуномодулирующие агенты, используемые для ослабления иммунного ответа, как правило, являются агентами, которые усиливают экспрессию B7-H4, связывание лиганда, сшивание, передачу отрицательного сигнала или их комбинацию. Например, данный агент может быть агонистом B7-H4, таким как агонистическое (стимулирующее) анти-B7-H4 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент.

a. Воспалительные реакции

Описанные композиции и способы могут применяться для лечения воспаления. Как правило, данные агенты применяются для снижения или ингибирования иммунного ответа у субъекта путем введения некоторого количества иммуномодулирующего агента, который усиливает экспрессию B7-H4, связывание лиганда, сшивание, передачу отрицательного сигнала или их комбинацию. Данный способ может ослабить или усилить симптомы воспаления. Воспаление может быть острым, хроническим или хроническим рецидивирующим.

В некоторых вариантах реализации данного изобретения иммуномодулирующие агенты замедляют работу иммунной системы. Например, агент можно применять для регулирования гипервоспалительной реакции, вызывающей повреждение здоровых тканей. Соответственно, в некоторых вариантах реализации данного изобретения указанные агенты вводят субъекту, у которого имеется гипервоспалительная реакция. В таких случаях для субъекта может быть полезным регулирование чрезмерных иммунных реакций.

b. Воспалительные и аутоиммунные заболевания/нарушения

Агенты, которые усиливают экспрессию B7-H4, связывание лигандов, сшивание, передачу отрицательного сигнала или их комбинацию, также могут применяться для лечения воспалительных или аутоиммунных заболеваний и нарушений. Репрезентативные воспалительные или аутоиммунные заболевания/нарушения включают (но не ограничиваются этим) ревматоидный артрит, системная красная волчанка, очаговая алопеция, анкилозирующий спондилоартрит, антифосфолипидный синдром, аутоиммунная болезнь Аддисона, аутоиммунная гемолитическая анемия, аутоиммунный гепатит, аутоиммунная болезнь внутреннего уха, аутоиммунный лимфопролиферативный синдром (alps), аутоиммунная тромбоцитопеническая пурпура (ATP), болезни Бехчета, буллезный пемфигоид, кардиомиопатия, дерматит при целиакальной спру, синдром хронической усталости и иммунной дисфункции (синдром CFIDS), хроническая воспалительная демиелинизирующая полиневропатия, рубцовый пемфигоид, холодовая агглютининовая болезнь, синдром Crest, болезнь Крона, болезнь Дего, дерматомиозит, ювенильный дерматомиозит, дискоидная волчанка, эссенциальная смешанная криоглобулинемия, фибромиалгия - фибромиозит, болезнь Грейва, болезнь Гийена-Барре, тиреоидит Хашимото, идиопатический легочный фиброз, идиопатическая тромбоцитопеническая пурпура (ITP), IgA-нефропатия, инсулинозависимый диабет (тип I), ювенильный артрит, болезнь Меньера, смешанные заболевания соединительной ткани, рассеянный склероз, миастения гравис, пузырчатка обыкновенная, пернициозная анемия, узелковый полиартериит, полихондрит, полигландулярные синдромы, ревматическая полимиалгия, полимиозит и дерматомиозит, первичная агаммаглобулинемия, первичный билиарный цирроз, псориаз, болезнь Рейно, синдром Рейтера, ревматизм, саркоидоз, склеродермия, синдром Шегрена, синдром мышечной скованности, артериит Такаясу, височный артериит/гигантоклеточный артериит, язвенный колит, увеит, васкулит, витилиго и гранулематоз Вегенера.

В некоторых вариантах реализации данного изобретения воспаление или аутоиммунное заболевание вызвано патогеном или является результатом инфекции.

VI. Комбинированные виды лечения

Описанные иммуномодулирующие агенты могут вводиться субъекту, который в этом нуждается, в виде монотерапии или в комбинации с одним или несколькими дополнительными терапевтическими агентами. В некоторых вариантах реализации данного изобретения иммуномодулирующий агент и дополнительный терапевтический агент вводят по отдельности, но одновременно. Иммуномодулирующий агент и дополнительный терапевтический агент также могут вводиться в составе одной композиции. В других вариантах реализации данного изобретения иммуномодулирующий агент и второй терапевтический агент вводят отдельно и в разное время, но в рамках одной схемы лечения.

Субъекту может быть введен первый терапевтический агент за 1, 2, 3, 4, 5, 6 или более часов, или за 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или более дней до введения второго терапевтического агента. В некоторых вариантах реализации данного изобретения субъекту можно вводить одну или большее количество доз первого агента за 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 14, 21, 28, 35 или 48 дней до первого введения второго агента. Иммуномодулирующий агент может быть первым или вторым терапевтическим агентом.

Иммуномодулирующий агент и дополнительный терапевтический агент могут быть введены как часть схемы лечения. Например, если первый терапевтический агент можно вводить субъекту каждый четвертый день, то второй терапевтический агент можно вводить в первый, второй, третий или четвертый день, или их комбинацию. Первый терапевтический агент или второй терапевтический агент можно вводить повторно в течение всей схемы лечения.

Иллюстративные молекулы включают (но не ограничиваются этим) цитокины, химиотерапевтические агенты, радионуклиды, другие иммунотерапевтические препараты, ферменты, антибиотики, противовирусные препараты (особенно ингибиторы протеаз, в виде монотерапии или в комбинации с нуклеозидами для лечения ВИЧ или гепатита В или с), антипаразитарные (против гельминтов, простейших), факторы роста, ингибиторы роста, гормоны, антагонисты гормонов, антитела и их биологически активные фрагменты (включая гуманизированные, одноцепочечные и химерные антитела), антигенные и вакцинные препараты (включая адъюванты), пептидные лекарственные препараты, противовоспалительные, лиганды, которые связываются с Toll-подобными рецепторами (включая, но не ограничиваясь этим, CpG-олигонуклеотиды) для активации системы врожденного иммунитете, молекулы, которые мобилизуют и оптимизируют систему приобретенного иммунитета, другие молекулы, которые активируют или повышают активность цитотоксических Т-лимфоцитов, естественных киллеров и Т-хелперов, а также другие молекулы, которые деактивируют или понижают активность супрессорных или регуляторных Т-клеток.

Дополнительные терапевтические агенты подбирают в зависимости от состояния, нарушения или заболевания, которое подвергается лечению. Например, иммуномодулирующий агент может быть введен совместно с одним или несколькими дополнительными агентами, которые действуют для усиления или стимулирования иммунного ответа, или ослабления или ингибирования иммунного ответа.

A. Усиление иммунных ответов

1. Противомикробные препараты

Например, иммуномодулирующий агент B7-H4 может применяться для выполнения предупредительной или профилактической роли в лечении и профилактике заболевания, как указано выше, а также в схеме лечения тяжелых травм, таких как обширный ожог, открытый перелом кости, травматическая ампутация конечности или другие раны. Таким образом, иммуномодулирующие агенты B7-H4 могут вводиться субъекту в комбинации с противомикробными препаратами, такими как антибиотик, противогрибковый препарат, противовирусный, противопаразитарный или эфирное масло.

В некоторых вариантах реализации данного изобретения субъекту вводят иммуномодулирующий агент В7-Н4 и/или противомикробный препарат при поступлении в стационар для предотвращения дальнейших бактериальных, грибковых или вирусных осложнений. Данный антибиотик может быть нацелен на патогенные микроорганизмы, а иммуномодулирующий агент B7-H4 может стимулировать иммунную систему для обеспечения усиленного ответа с целью лечение или предотвращения дальнейшей инфекции или инфекционного заболевания.

2. Химиотерапевтические агенты

Иммуномодулирующие агенты B7-H4 могут быть объединены с одним или большим количеством химиотерапевтических агентов и про-апоптотических агентов. Репрезентативные химиотерапевтические агенты включают (но не ограничиваются этим) амсакрин, блеомицин, бусульфан, капецитабин, карбоплатин, кармустин, хлорамбуцил, цисплатин, кладрибин, клофарабин, крисантаспаза, циклофосфамид, цитарабин, дакарбазин, дактиномицин, даунорубицин, доцетаксел, доксорубицин, эпирубицин, этопозид, флударабин, фторурацил, гемцитабин, гидроксикарбамид, идарубицин, ифосфамид, иринотекан, лейковорин, липосомальный доксорубицин, липосомальный даунорубицин, ломустин, мелфалан, меркаптопурин, месна, метотрексат, митомицин, митоксантрон, оксалиплатин, паклитаксел, пеметрексед, пентостатин, прокарбазин, ралтитрексед, сатраплатин, стрептозоцин, тегафур-урацил, темозоломид, тенипозид, тиотепа, тиогуанин, топотекан, треосульфан, винбластин, винкристин, виндезин, винорелбин или их комбинация. Репрезентативные про-апоптотические агенты включают (но не ограничиваются этим) флударабинетауроспорин, циклогексимид, актиномицин D, лактозилцерамид, 15d-PGJ(2) и их комбинации.

3. Другие иммуномодуляторы

a. Антагонисты PD-1

В некоторых вариантах реализации данного изобретения иммуномодулирующие агенты B7-H4 вводят совместно с антагонистом PD-1. PD-1 (от англ. “programmed death” - запрограммированная смерть), является членом семейства рецепторов CD28, которые обеспечивают отрицательный иммунный ответ при индуцировании на Т-клетках. Контакт между PD-1 и одним из его лигандов (B7-H1 или B7-DC) индуцирует ингибирующий ответ, который уменьшает размножение Т-клеток и/или силу и/или продолжительность ответа Т-клеток. Подходящие антагонисты PD-1 описаны в патентах США №№ 8114845, 8609089 и 8709416, которые специально включены в данную заявку посредством ссылки в полном объеме, и включают соединения или агенты, которые либо связываются с лигандом PD-1 и блокируют его с целью помешать или ингибировать связывание лиганда с рецептором PD-1, либо связываются непосредственно с рецептором PD-1 и блокируют его, не индуцируя трансдукцию ингибирующего сигнала через рецептор PD-1.

В некоторых вариантах реализации данного изобретения антагонист рецептора PD-1 связывается непосредственно с рецептором PD-1, не инициируя трансдукции ингибирующего сигнала, а также связывается с лигандом рецептора PD-1 для уменьшения или ингибирования трансдукции лигандом сигнала через рецептор PD-1. За счет уменьшения числа и/или количества лигандов, которые связываются с рецептором PD-1 и запускают трансдукцию ингибирующего сигнала, меньшее количество клеток ослабляется отрицательным сигналом, подаваемым трансдукцией сигнала PD-1, и может быть достигнут более сильный иммунный ответ.

Считается, что передача сигнала PD-1 управляется связыванием с лигандом PD-1 (таким как B7-H1 или B7-DC) в непосредственной близости от пептидного антигена, представленного основным комплексом гистосовместимости (MHC) (см., например, работу Freeman, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A, 105:10275-10276 (2008)). Поэтому белки, антитела или малые молекулы, которые предотвращают ко-лигирование PD-1 и TCR на мембране Т-клеток, также являются полезными антагонистами PD-1.

В некоторых вариантах реализации данного изобретения антагонисты рецептора PD-1 являются малыми молекулами-антагонистами или антителами, которые уменьшают или препятствуют трансдукции сигнала рецептора PD-1 путем связывания с лигандами PD-1 или с самим PD-1, особенно в тех случаях, когда после такого связывания не происходит совместное лигирование PD-1 с TCR, тем самым не вызывая трансдукции ингибирующего сигнала через рецептор PD-1. Другие антагонисты PD-1, предусмотренные способами данного изобретения, включают антитела, которые связываются с PD-1 или лигандами PD-1, и другие антитела.

Подходящие анти-PD-1 антитела включают (но не ограничиваются этим) антитела, которые описаны в следующих публикациях:

PCT/IL03/00425 (Hardy et al., WO/2003/099196)

PCT/JP2006/309606 (Korman et al., WO/2006/121168)

PCT/US2008/008925 (Li et al., WO/2009/014708)

PCT/JP03/08420 (Honjo et al., WO/2004/004771)

PCT/JP04/00549 (Honjo et al., WO/2004/072286)

PCT/IB2003/006304 (Collins et al., WO/2004/056875)

PCT/US2007/088851 (Ahmed et al., WO/2008/083174)

PCT/US2006/026046 (Korman et al., WO/2007/005874)

PCT/US2008/084923 (Terrett et al., WO/2009/073533)

Berger et al., Clin. Cancer Res., 14:30443051 (2008).

Конкретным примером анти-PD-1 антитела является антитело, описанное в Kosak, US 20070166281 (опубликовано 19 июля 2007 года) в параграфе 42), человеческое антитело к PD-1, которое в некоторых вариантах реализации данного изобретения вводят в дозе 3 мг/кг.

Иллюстративные антитела к B7-Hl включают (но не ограничиваются этим) антитела, которые описаны в следующих публикациях:

PCT/US06/022423 (WO/2006/133396, опубликовано 14 декабря 2006 г.)

PCT/US07/088851 (WO/2008/083174, опубликовано 10 июля 2008 г.)

US 2006/0110383 (опубликовано 25 мая 2006 г.)

Конкретным примером анти-B7-Hl антитела является антитело, описанное в (WO/2007/005874, опубликовано 11 января 2007 г.)), человеческое анти-B7-Hl антитело.

Дополнительные анти-PD-1 и анти-В7-Hl антитела, описанные в 2014/0044738, которые включены целиком в данную заявку посредством ссылки.

Для анти-B7-DC антител: см. 7,411,051, 7,052,694, 7,390,888 и патентную заявку США № 2006/0099203.

Другие иллюстративные антагонисты рецепторов PD-1 включают (но не ограничиваются этим) полипептиды B7-DC, включая гомологи и их варианты, а также активные фрагменты любых из вышеперечисленных, и слитые белки, которые включают любой из них. В некоторых вариантах реализации данного изобретения слитый белок включает растворимую часть B7-DC, связанную с Fc-частью антитела, такого как человеческий IgG, и не включает полностью или частично трансмембранную часть человеческого B7-DC.

Антагонист PD-1 может также быть фрагментом B7-H1 млекопитающего, например, мыши или примата, такого как человек, где фрагмент связывается с PD-1 и блокирует его, но не приводит к трансдукции ингибирующего сигнала через PD-1. Эти фрагменты также могут быть частью слитого белка, например белка, слитого с Ig.

Другие полезные антагонисты полипептидов PD-1 включают антагонисты, которые связываются с лигандами рецептора PD-1. Лиганды включают белок рецептора PD-1 или его растворимые фрагменты, которые могут связываться с лигандами PD-1, такими, как B7-H1 или B7-DC, и предотвращать связывание с эндогенным рецептором PD-1, тем самым предотвращая трансдукцию ингибирующего сигнала. Также было показано, что B7-H1 связывает белок B7.1 (Butte et al., Immunity, Vol. 27, pp. 111-122, (2007)). Такие фрагменты также включают растворимую часть ECD белка PD-1, который включает мутации, такие как мутация A99L, которая увеличивает связывание с природными лигандами (Molnar et al., PNAS, 105: 10483-10488 (2008)). также полезны B7-1 или его растворимые фрагменты, которые могут связываться с лигандом B7-H1 и предотвращать связывание с эндогенным рецептором PD-1, тем самым предотвращая трансдукцию ингибирующего сигнала.

Антисмысловые нуклеиновые кислоты PD-1 и B7-H1 как ДНК, так и РНК, а также молекулы малой интерферирующей РНК (миРНК) также могут быть антагонистами PD-1. Такие антисмысловые молекулы предотвращают экспрессию PD-1 на Т-клетках, а также продуцирование Т-клеточных лигандов, таких как B7-H1, PD-L1 и/или PD-L2. Например, малая интерферирующая РНК (миРНК) (например, длиной около 21 нуклеотида, которая специфична для гена, кодирующего PD-1, или кодирующего лиганд PD-1, и олигонуклеотиды которой можно легко приобрести на коммерческой основе), образующая комплекс с носителями, такими как полиэтиленимин (см. Cubillos-Ruiz et al., J. Clin. Invest. 119(8): 2231-2244 (2009), легко захватывается клетками, которые экспрессируют PD-1, а также лигандами PD-1, и снижает экспрессию этих рецепторов и лигандов для получения снижения трансдукции ингибирующего сигнала в Т-клетках, тем самым активируя Т-клетки.

b. Антагонисты CTLA4

Другие молекулы, пригодные для опосредования эффектов Т-клеток в иммунном ответе, также рассматриваются в качестве дополнительных терапевтических агентов. В некоторых вариантах реализации данного изобретения такая молекула является антагонистом CTLA4, например антагонистическим анти-CTLA4 антителом. Пример анти-CTLA4 антитела, предусмотренного для применения в способах данного изобретения, включает антитело, описанное в PCT/US2006/043690 (Fischkoff et al., wo/2007/056539).

Дозировки для анти-PD-1, анти-B7-Hl и анти-CTLA4 антител известны в данной области техники и могут находиться в диапазоне, например, от 0,1 до 100 мг/кг, или в более коротких диапазонах: от 1 до 50 мг/кг или от 10 до 20 мг/кг. Соответствующая доза для человека может составлять от 5 до 15 мг/кг, где доза 10 мг/кг антитела (например, человеческого анти-PD-1 антитела) является конкретным вариантом реализации изобретения.

Конкретными примерами анти-CTLA4 антитела, пригодным для способов данного изобретения, являются ипилимумаб, человеческое анти-CTLA4 антитело, вводимое в дозе, например, приблизительно 10 мг/кг, и Тремелимумаб, человеческое анти-CTLA4 антитело, вводимое в дозе, например, приблизительно 15 мг/кг. См. также работу Sammartino, et al., Clinical Kidney Journal, 3(2): 135-137 (2010), опубликованную в интернете в декабре 2009 года.

В других вариантах реализации данного изобретения антагонист представляет собой малую молекулу. Было показано, что ряд мелких органических соединений связывается с лигандом B7-1 для предотвращения связывания с CTLA4 (см. работу Erbe et al., J. Biol. Chem., 277:7363-7368 (2002)). Такие мелкие органические соединения можно вводить отдельно или вместе с анти-CTLA4 антителом для уменьшения трансдукции ингибирующего сигнала Т-клеток.

4. Потенцирующие агенты

В некоторых вариантах реализации данного изобретения дополнительные терапевтические агенты включают потенцирующий агент. Потенцирующий агент действует для повышения эффективности регулятора, активирующего иммунный ответ, возможно, с помощью более чем одного механизма, хотя точный механизм действия не является существенным для широкого практического применения данного изобретения.

В некоторых вариантах реализации данного изобретения потенцирующим агентом является циклофосфамид. Циклофосфамид (CTX, Cytoxan® или Neosar®) является оксазафосфориновым лекарственным средством, аналоги которого включают ифосфамид (IFO, Ifex), перфосфамид, трофосфамид (trofosfamide; Ixoten) и их фармацевтически приемлемые соли, сольваты, пролекарства и метаболиты (заявка на патент США 2007/0202077, которая полностью включена). Ифосфамид (MITOXANA®) является структурным аналогом циклофосфамида, а его механизм действия считается идентичным или во многом сходным с механизмом действия циклофосфамида. Перфосфамид (4-гидропероксициклофосфамид) и трофосфамид также являются алкилирующими агентами, которые структурно связаны с циклофосфамидом. Например, перфосфамид алкилирует ДНК, тем самым ингибируя репликацию ДНК и синтез РНК и белка. Были разработаны и оценены новые производные оксазафосфоринов с целью улучшения селективности и реакции при сниженной токсичности хозяина (Liang J., Huang M., Duan W., Yu XQ, Zhou S. Design of new oxazaphosphorine anticancer drugs («Разработка новых оксазафосфориновых противоопухолевых препаратов»). Curr Pharm Des. 2007;13(9):963-78. Review). К ним относятся мафосфамид (NSC 345842), глюфосфамид (D19575, бета-D-глюкозилизофосфорамидный иприт), S-(-)-бромфосфамид (CBM-11), NSC 612567 (альдофосфамид пергидротиазин) и NSC 613060 (альдофосфамид тиазолидин). Мафосфамид - это аналог оксазафосфорина, представляющий собой химически стабильную соль 4-тиоэтансульфоновой кислоты 4-гидрокси-CPA. Глуфосфамид - это производное IFO, в котором изофосфорамидный иприт, алкилирующий метаболит IFO, гликозидно связан с молекулой бета-D-глюкозы. Дополнительные аналоги циклофосфамида описаны в патенте США 5190929, называемом «Аналоги циклофосфамида, полезные в качестве противоопухолевых агентов», который полностью включен в данный документ посредством ссылки.

Хотя CTX сам по себе нетоксичен, некоторые его метаболиты являются цитотоксическими алкилирующими агентами, которые индуцируют сшивание ДНК, а в более высоких дозах - разрывы нитей. Многие клетки устойчивы к CTX, потому что они экспрессируют высокие уровни детоксицирующего фермента альдегиддегидрогеназы (ALDH). CTX нацелен на пролиферирующие лимфоциты, поскольку лимфоциты (но не гемопоэтические стволовые клетки) экспрессируют только низкие уровни ALDH, а делящиеся клетки весьма чувствительны к агентам, алкилирующим ДНК.

Низкие дозы CTX (< 200 мг/кг) могут оказывать иммуностимулирующее действие, включая стимуляцию противоопухолевого иммунного ответа у людей и у мышиных моделей рака (Brode & Cooke CritRev. Immunol. 28:109-126 (2008)). Такие низкие дозы являются субтерапевтическими и не обладают прямой противоопухолевой активностью. Напротив, высокие дозы CTX подавляют противоопухолевый ответ. Роль CTX в потенцировании противоопухолевого иммунного ответа может объясняться несколькими механизмами: (а) деплетирование CD4+CD25+FoxP3+Treg (и особенно пролиферирующих регуляторных Т-клеток (Treg), которые могут быть особенно супрессивными); (b) деплетирование В-лимфоцитов; (c) индуцирование оксида азота (NO), приводящее к подавлению роста опухолевых клеток; (d) мобилизация и увеличение образования CD1 lb+Gr-l+ СКМП. Эти первичные эффекты имеют многочисленные вторичные эффекты; например, после деплетирования регуляторных Т-клеток макрофаги продуцируют больше ИФН-γ и меньше ИЛ-10. Было также показано, что CTX индуцирует экспрессию ИФН типа I и способствует гомеостатической пролиферации лимфоцитов.

Деплетирование Treg чаще всего упоминается как механизм, с помощью которого CTX потенцирует противоопухолевый иммунный ответ. Этот вывод частично основан на результатах экспериментов по адоптивной передаче. В модели опухоли AB1-HA лечение CTX на 9-й день дает показатель излечения 75%. Перенос очищенной Treg на 12-й день почти полностью ингибировал ответ CTX (van der Most et al. Cancer Immunol. Immunother. 58:1219-1228 (2009). Аналогичный результат наблюдался и в модели опухоли HHD2: адоптивный перенос CD4+CD25+ Treg после предварительной обработки CTX устранял терапевтический ответ на вакцину (Taieb, J. J. Immunol. 176:2722-2729 (2006)).

Многочисленные клинические испытания на людях показали, что в низкой дозе CTX является безопасным, хорошо переносимым и эффективным агентом, стимулирующим противоопухолевые иммунные ответы (Bas, & Mastrangelo Cancer Immunol. Immunother. 47:1-12 (1998)).

Оптимальной дозой CTX для потенцирования противоопухолевого иммунного ответа является такая доза, которая снижает общее количество Т-клеток за счет снижения количества регуляторных Т-клеток ниже нормального уровня, являясь субтерапевтической (см. работу Machiels et al. Cancer Res. 61: 3689-3697 (2001)).

В клинических испытаниях на людях, где CTX использовался в качестве иммунопотенцирующего агента, обычно использовалась доза 300 мг/м². Для среднего мужчины (рост 183 см (6 футов), вес 78 кг (170 фунтов) с площадью поверхности тела 1,98 м²) доза 300 мг/м² составляет 8 мг/кг, или 624 мг общего белка. В мышиных моделях рака эффективность была замечена в дозах от 15 до 150 мг/кг, что составляет от 0,45 до 4,5 мг общего белка у мыши весом 30 г (Machiels et al. Cancer Res. 61:3689-3697 (2001), Hengst et al. Cancer Res. 41:2163-2167 (1981), Hengst Cancer Res. 40:2135-2141 (1980)).

Для более крупных млекопитающих, таких как примат, например, человек, пациент, такие дозы в мг/м² могут применяться, но также могут применяться единичные дозы, вводимые за определенный период времени. Такие единичные дозы могут вводиться ежедневно в течение определенного периода времени, например до 3 дней, или до 5 дней, или до 7 дней, или до 10 дней, или до 15 дней, или до 20 дней, или до 25 дней; все интервалы специально предусмотрены данным изобретением. Та же схема может быть применена и для других потенцирующих агентов, описанных в данной заявке.

В других вариантах реализации данного изобретения потенцирующий агент представляет собой агент, снижающий активность и/или количество регуляторных Т-лимфоцитов (Т-reg), такой как Сунитиниб (SUTENT®), анти-ТФР-p или Иматиниб (GLEEVAC®). Описанная схема лечения может также включать введение адъюванта.

Полезные потенцирующие агенты также включают ингибиторы митоза, такие как паклитаксол, ингибиторы ароматазы (например, летрозол) и ингибиторы ангиогенеза (ингибиторы VEGF, например Авастин, VEGF-Trap) (см., например, Li et al. Vascular endothelial growth factor blockade reduces intratumoral regulatory T cells and enhances the efficacy of a GM-CSF-secreting cancer immunotherapy («Блокада сосудистого эндотелиального фактора роста уменьшает количество интратуморальных регуляторных Т-клеток и повышает эффективность иммунотерапии рака, секретирующего GM-CSF»). Clin Cancer Res. 2006 Nov 15; 12(22):6808-16.)) антрациклины, оксалиплатин, доксорубицин, антагонисты TLR4 и антагонисты ИЛ-18.

B. Ослабление иммунного ответа

1. Иммуносупрессоры

В некоторых вариантах реализации данного изобретения иммунный ответ или воспалительное/аутоиммунное заболевание/нарушение лечат введением субъекту иммуномодулирующего агента B7-H4 и второго агента, который является иммуносупрессором. Иммуносупрессивные агенты включают (но не ограничиваются этим) антитела к другим поверхностным маркерам лимфоцитов (например, CD40, альфа-4-интегрин) или к цитокинам, слитым белкам (например, CTLA-4-Ig (Оренсия®), TNFR-Ig (Энбрел®)), блокаторы ФНО-альфа, такие как Энбрел, Ремикейд, Цимзия и Хумира, циклофосфамид (СТХ) (т.е. Эндоксан®, Цитоксан®, Неосар®, Прокситокс®, Ревиммун™), метотрексат (MTX) (т.е. Ревматрекс®, Трексалл®), белимумаб (т. е. Бенлиста®) или другие иммуносупрессивные агенты (например, циклоспорин А, соединения класса FK506, соединения рапамицина или стероиды), препараты, обладающие антипролиферативным действием, цитостатики или другие соединения, которые могут способствовать иммуносупрессии.

Терапевтическим агентом может быть слитый белок CTLA-4, такой как CTLA-4-Ig (абатацепт). Слитые белки CTLA-4-Ig конкурируют с ко-стимулирующим рецептором CD28 на Т-клетках за связывание с CD80/CD86 (B7-1/B7-2) на антигенпрезентирующих клетках и, таким образом, функционируют для ингибирования активации Т-клеток. В другом варианте реализации данного изобретения терапевтическим агентом является слитый белок CTLA-4-Ig, известный как белатацепт. Белатацепт содержит две замещенные аминокислоты (L104E и A29Y), которые заметно увеличивают его авидность по отношению к CD86 in vivo. В другом варианте реализации данного изобретения терапевтическим агентом является Maxy-4.

В другом варианте реализации данного изобретения терапевтическим агентом является циклофосфамид (CTX). Циклофосфамид (международное непатентованное название для Эндоксана®, Цитоксана®, Неосара®, Процитокса®, Ревиммуна™), также известный как цитофосфан, является агентом, алкилирующим азотный иприт, из группы оксазофоринов. Его применяют для лечения различных видов рака и некоторых аутоиммунных заболеваний. Циклофосфамид (CTX) является основным лекарственным препаратом, применяющимся при диффузном пролиферативном гломерулонефрите у пациентов с почечной волчанкой.

Этот терапевтический агент может быть введен в эффективном количестве для снижения уровня аутоантител к двухцепочечной ДНК (анти-ds ДНК) в крови или сыворотке крови и/или для уменьшения протеинурии у пациента, который в этом нуждается.

В другом варианте реализации данного изобретения терапевтический агент увеличивает количество аденозина в сыворотке крови, см., например, WO 08/147482. Например, вторым терапевтическим агентом может быть CD73-Ig, рекомбинантный CD73 или другой агент (например, цитокин или моноклональное антитело, или малая молекула), который увеличивает экспрессию CD73, см., например, WO 04/084933. В другом варианте реализации данного изобретения терапевтическим агентом является интерферон-бета.

Терапевтическим агентом может быть малая молекула, которая ингибирует или уменьшает дифференцировку, пролиферацию, активность и/или продуцирование цитокинов и/или секрецию клетками Thl, Thl7, Th22 и/или другими клетками, которые секретируют или заставляют другие клетки секретировать воспалительные молекулы, включая (но не ограничиваясь этим) ИЛ-lp, ФНО-aльфа, ТФР-бета, ИФН-гамма, ИЛ-18, ИЛ-17, ИЛ-6, ИЛ-23, ИЛ-22, ИЛ-21 и матриксные металлопротеиназы (ММП). В другом варианте реализации данного изобретения терапевтический агент представляет собой малую молекулу, которая взаимодействует с регуляторными Т-клетками (T-reg), повышает активность T-reg, способствует секреции или усиливает секрецию ИЛ-10 регуляторными Т-клетками, увеличивает количество T-reg, увеличивает подавляющую способность T-reg или комбинации вышесказанного.

В некоторых вариантах реализации данного изобретения композиция увеличивает активность или выработку T-reg. Иллюстративные агенты, повышающие активность T-reg, включают (но не ограничиваются этим) глюкокортикоид флутиказон, сальметероал, антитела к ИЛ-12, ИФН-y и ИЛ-4, витамин D3 и дексаметазон, и их комбинации.

В некоторых вариантах реализации данного изобретения терапевтический агент представляет собой антитело, например, блокирующее функции антитело к провоспалительной молекуле, такой как ИЛ-6, ИЛ-23, ИЛ-22 или ИЛ-21.

В контексте данной заявки термин «соединение рапамицина» включает нейтральное трициклическое соединение рапамицин, производные рапамицина, аналоги рапамицина и другие макролидные соединения, которые, как полагают, обладают тем же механизмом действия, что и рапамицин (например, ингибирование цитокиновой функции). Термин «соединения рапамицина» включает соединения, имеющие структурное сходство с рапамицином, например соединения с аналогичной макроциклической структурой, которые были модифицированы для повышения их терапевтической эффективности. Иллюстративные соединения рапамицина известны в данной области техники (см., например, W095122972, WO 95116691, WO 95104738, патенты США №№ 6015809; 5989591; патенты США №№ 5567709; 5559112; 5530006; 5484790; 5385908; 5202332; 5162333; 5780462; 5120727).

Термин «соединения класса FK506» включает fk506 и производные, а также аналоги FK506, например, соединения со структурным сходством с FK506, например, соединения со сходной макроциклической структурой, которые были модифицированы для повышения их терапевтической эффективности. Примеры соединений класса FK506 включают, например, соединения, которые описаны в WO 00101385. В некоторых вариантах реализации данного изобретения термин «соединение рапамицина», употребляющийся в данной заявке, не включает соединения класса fk506.

2. Противовоспалительные

Другие пригодные терапевтические агенты включают (но не ограничиваются этим) противовоспалительные агенты. Противовоспалительный агент может быть нестероидным, стероидным или их комбинацией. В одном варианте реализации данного изобретения предложены композиции для перорального приема, содержащие приблизительно от 1% (от общей массы композиции) до приблизительно 5% (от общей массы композиции), чаще всего приблизительно 2,5% (от общей массы композиции), или противовоспалительный агент. Репрезентативные примеры нестероидных противовоспалительных агентов включают без каких-либо ограничений оксикамы, такие как пироксикам, изоксикам, теноксикам, судоксикам; салицилаты, такие как аспирин, дисальцид, бенорилат, трилизат, сафаприн, солприн, дифлунисал и фендосал; производные уксусной кислоты, такие как диклофенак, фенклофенак, индометацин, сулиндак, толметин, изоксепак, фурофенак, тиопинак, зидометацин, ацематацин, фентиазак, зомепирак, клинданак, оксепинак, фелбин и кеторолак; фенаматы, такие как мефенамовая, меклофенамовая, флуфенамовая, нифлумовая и толфенамовая кислоты; и производные пропионовой кислоты, такие как ибупрофен, напроксен, беноксапрофен, флурбипрофен, кетопрофен, фенопрофен, фенбуфен, индопропфен, пирпрофен, карпрофен, оксапрозин, пранопрофен, миропрофен, тиоксапрофен, супрофен, альминопрофен и тиапрофен; пиразолы, такие как фенилбутазон, оксифенбутазон, фепразон, азапропазон и триметазон. Также могут применяться смеси этих нестероидных противовоспалительных агентов.

Репрезентативные примеры стероидных противовоспалительных препаратов включают без какого-либо ограничения кортикостероиды, такие как гидрокортизон, гидроксил-триамцинолон, альфа-метилдексаметазон, дексаметазон фосфат, дипропионаты беклометазона, клобетазола валерат, дезонид, дезоксиметазон, дезоксикортикостерона ацетат, дексаметазон, дихлоризон, дифлоразона диацетат, дифлукортолона валерат, флуадренолон, флуклоролона ацетонид, флудрокортизон, флуметазона пивалат, флуоцинолона ацетонид, флуоцинонид, флукортина бутилэфиры, флуокортолон, флупреднидена (флупреднилидена) ацетат, флурандренолон, хальцинонид, гидрокортизона ацетат, гидрокортизона бутират, метилпреднизолон, триамцинолона ацетонид, кортизон, кортодоксон, флуцетонид, флудрокортизон, дифлуорозона диацетат, флурадренолон, флукрокортизон, дифлоразона диацетат, флурадренолона ацетонид, медризон, амцинафел, амцинафид, бетаметазон и остальные его эфиры, хлорпреднизон, хлорпреднизона ацетат, клокортелон, клескинолон, дихлоризон, дифлурпреднат, флуклоронид, флунизолид, флуорометолон, флуперолон, флупреднизолон, гидрокортизона валерат, гидрокортизона циклопентилпропионат, гидрокортамат, мепреднизон, параметазон, преднизолон, преднизон, беклометазона дипропионат, триамцинолон и их смеси.

VII. Наборы

Описанные иммуномодулирующие агенты В7-Н4 могут быть упакованы в герметически закрытый контейнер, такой как ампула или саше, с указанием количества. Такой агент может поставляться в виде сухого стерилизованного лиофилизированного порошка или безводного концентрата в герметично закрытом контейнере и может быть восстановлен, например, водой или физиологическим раствором до соответствующей концентрации для введения субъекту. Например, указанный агент может поставляться в виде сухого стерильного лиофилизированного порошка в герметично закрытом контейнере с однократной дозировкой, по меньшей мере, 5 мг, или, по меньшей мере, 10 мг, по меньшей мере 15 мг, по меньшей мере 25 мг, по меньшей мере 35 мг, по меньшей мере 45 мг, по меньшей мере 50 мг или, по меньшей мере, 75 мг. Лиофилизированный агент может храниться при температуре от 2 до 8°C в оригинальном контейнере и обычно вводится в течение 12 часов, или в течение 6 часов, или в течение 5 часов, или в течение 3 часов, или в течение 1 часа после восстановления.

В альтернативном варианте реализации данного изобретения данный агент может поставляться в жидком виде в герметично закрытом контейнере с указанием количества и концентрации. В некоторых вариантах реализации данного изобретения жидкая форма агента может поставляться в герметично закрытом контейнере, включающем, по меньшей мере 1 мг/мл или по меньшей мере 2,5 мг/мл, по меньшей мере 5 мг/мл, по меньшей мере 8 мг/мл, по меньшей мере 10 мг/мл, по меньшей мере 15 мг/мл, по меньшей мере 25 мг/мл, по меньшей мере 50 мг/мл, по меньшей мере 100 мг/мл, по меньшей мере 150 мг/мл, по меньшей мере 200 мг/мл агента.

Также предлагаются фармацевтические упаковки и наборы, включающие один или несколько контейнеров, наполненных агентом. Кроме того, в фармацевтическую упаковку или набор также могут быть включены один или большее количество других профилактических или терапевтических агентов, применимых для лечения заболевания. Фармацевтическая упаковка или набор также может включать один или большее количество контейнеров, заполненных одним или несколькими ингредиентами описанных фармацевтических композиций. Дополнительно к такому контейнеру(ам) может быть приложен информационный листок в форме, предписанной государственным органом, регулирующим производство, применение или продажу лекарственных препаратов или биологических продуктов, который отражает одобрение данным органом производства, применения или продажи для введения человеку.

Также предлагаются комплекты, предназначенные для вышеописанных способов. Варианты реализации изобретения обычно включают один или несколько иммуномодулирующих агентов B7-H4. В конкретных вариантах реализации данного изобретения набор также включает один или большее количество других профилактических или терапевтических агентов, применимых для лечения рака, в одном или большем количестве контейнеров. В других вариантах реализации данного изобретения набор также включает одно или несколько противовоспалительных средств, применимых для лечения воспалительных и аутоиммунных заболеваний, в одном или большем количестве контейнеров.

Если не определено иное, все технические и научные термины в контексте данной заявки имеют те же значения, что и значения, обычно понимаемые специалистом в области техники, к которой относится описанное изобретение. Публикации, процитированные в данной заявке, и материалы, для которых они цитируются, специально включены в него посредством ссылки.

Специалисты в данной области техники определят или способны установить с помощью не более чем обычных экспериментов многие эквиваленты конкретных вариантов реализации изобретения, описанного в данной заявке. Подразумевается, что такие эквиваленты подпадают под указанную ниже формулу изобретения.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> NextCure, Inc.

Лангерман, Соломан (Langermann, Soloman)

Лью, Линда (Liu, Linda)

Флиз, Даллас Б. (Flies, Dallas B)

<120> Антитела B7-H4 и способы их применения

<130> 064467.005PCT

<150> 62/620,545

<151> 2018-01-23

<160> 131

<170> PatentIn, версия 3.5

<210> 1

<211> 282

<212> Белок

<213> Человек разумный (Homo sapiens)

<400> 1

Met Ala Ser Leu Gly Gln Ile Leu Phe Trp Ser Ile Ile Ser Ile Ile

1 5 10 15

Ile Ile Leu Ala Gly Ala Ile Ala Leu Ile Ile Gly Phe Gly Ile Ser

20 25 30

Gly Arg His Ser Ile Thr Val Thr Thr Val Ala Ser Ala Gly Asn Ile

35 40 45

Gly Glu Asp Gly Ile Leu Ser Cys Thr Phe Glu Pro Asp Ile Lys Leu

50 55 60

Ser Asp Ile Val Ile Gln Trp Leu Lys Glu Gly Val Leu Gly Leu Val

65 70 75 80

His Glu Phe Lys Glu Gly Lys Asp Glu Leu Ser Glu Gln Asp Glu Met

85 90 95

Phe Arg Gly Arg Thr Ala Val Phe Ala Asp Gln Val Ile Val Gly Asn

100 105 110

Ala Ser Leu Arg Leu Lys Asn Val Gln Leu Thr Asp Ala Gly Thr Tyr

115 120 125

Lys Cys Tyr Ile Ile Thr Ser Lys Gly Lys Gly Asn Ala Asn Leu Glu

130 135 140

Tyr Lys Thr Gly Ala Phe Ser Met Pro Glu Val Asn Val Asp Tyr Asn

145 150 155 160

Ala Ser Ser Glu Thr Leu Arg Cys Glu Ala Pro Arg Trp Phe Pro Gln

165 170 175

Pro Thr Val Val Trp Ala Ser Gln Val Asp Gln Gly Ala Asn Phe Ser

180 185 190

Glu Val Ser Asn Thr Ser Phe Glu Leu Asn Ser Glu Asn Val Thr Met

195 200 205

Lys Val Val Ser Val Leu Tyr Asn Val Thr Ile Asn Asn Thr Tyr Ser

210 215 220

Cys Met Ile Glu Asn Asp Ile Ala Lys Ala Thr Gly Asp Ile Lys Val

225 230 235 240

Thr Glu Ser Glu Ile Lys Arg Arg Ser His Leu Gln Leu Leu Asn Ser

245 250 255

Lys Ala Ser Leu Cys Val Ser Ser Phe Phe Ala Ile Ser Trp Ala Leu

260 265 270

Leu Pro Leu Ser Pro Tyr Leu Met Leu Lys

275 280

<210> 2

<211> 283

<212> Белок

<213> Мышь домовая (Mus musculus)

<400> 2

Met Ala Ser Leu Gly Gln Ile Ile Phe Trp Ser Ile Ile Asn Ile Ile

1 5 10 15

Ile Ile Leu Ala Gly Ala Ile Ala Leu Ile Ile Gly Phe Gly Ile Ser

20 25 30

Gly Lys His Phe Ile Thr Val Thr Thr Phe Thr Ser Ala Gly Asn Ile

35 40 45

Gly Glu Asp Gly Thr Leu Ser Cys Thr Phe Glu Pro Asp Ile Lys Leu

50 55 60

Asn Gly Ile Val Ile Gln Trp Leu Lys Glu Gly Ile Lys Gly Leu Val

65 70 75 80

His Glu Phe Lys Glu Gly Lys Asp Asp Leu Ser Gln Gln His Glu Met

85 90 95

Phe Arg Gly Arg Thr Ala Val Phe Ala Asp Gln Val Val Val Gly Asn

100 105 110

Ala Ser Leu Arg Leu Lys Asn Val Gln Leu Thr Asp Ala Gly Thr Tyr

115 120 125

Thr Cys Tyr Ile Arg Thr Ser Lys Gly Lys Gly Asn Ala Asn Leu Glu

130 135 140

Tyr Lys Thr Gly Ala Phe Ser Met Pro Glu Ile Asn Val Asp Tyr Asn

145 150 155 160

Ala Ser Ser Glu Ser Leu Arg Cys Glu Ala Pro Arg Trp Phe Pro Gln

165 170 175

Pro Thr Val Ala Trp Ala Ser Gln Val Asp Gln Gly Ala Asn Phe Ser

180 185 190

Glu Val Ser Asn Thr Ser Phe Glu Leu Asn Ser Glu Asn Val Thr Met

195 200 205

Lys Val Val Ser Val Leu Tyr Asn Val Thr Ile Asn Asn Thr Tyr Ser

210 215 220

Cys Met Ile Glu Asn Asp Ile Ala Lys Ala Thr Gly Asp Ile Lys Val

225 230 235 240

Thr Asp Ser Glu Val Lys Arg Arg Ser Gln Leu Gln Leu Leu Asn Ser

245 250 255

Gly Pro Ser Pro Cys Val Phe Ser Ser Ala Phe Val Ala Gly Trp Ala

260 265 270

Leu Leu Ser Leu Ser Cys Cys Leu Met Leu Arg

275 280

<210> 3

<211> 107

<212> Белок

<213> Мышь домовая (Mus musculus)

<400> 3

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Arg Thr Ala

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Thr Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala

65 70 75 80

Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Val Thr Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys

100 105

<210> 4

<211> 11

<212> Белок

<213> Мышь домовая (Mus musculus)

<400> 4

Lys Ala Ser Gln Asp Val Arg Thr Ala Val Ala

1 5 10

<210> 5

<211> 7

<212> Белок

<213> Мышь домовая (Mus musculus)

<400> 5

Ser Thr Ser Tyr Arg Tyr Thr

1 5

<210> 6

<211> 9

<212> Белок

<213> Мышь домовая (Mus musculus)

<400> 6

Gln Gln Tyr Tyr Val Thr Pro Leu Thr

1 5

<210> 7

<211> 321

<212> ДНК

<213> Мышь домовая (Mus musculus)

<400> 7

gacattgtga tgacccagtc tcacaaattc atgtccacat cagtaggaga cagggtcagt 60

atcacctgca aggccagtca ggatgtgaga actgctgtag cctggtatca acagaaacca 120

ggacaatctc ctaaactact gatttactcg acatcctacc ggtacactgg agtccctgat 180

cgcttcactg gcagtggatc tgggacggaa ttcactttca ccatcagcag tgtgcaggct 240

gaagacctgg cagtttatta ctgtcagcaa tattatgtta ctccgctcac gttcggtgct 300

gggaccaagc tggagctgaa a 321

<210> 8

<211> 117

<212> Белок

<213> Мышь домовая (Mus musculus)

<400> 8

Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Thr Val Leu Ala Arg Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Trp Met His Trp Ile Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Ser Asp Thr Lys Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Asp Lys Ala Lys Leu Thr Ala Val Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Asn Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Ser Thr Val Arg Asn Val Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 9

<211> 5

<212> Белок

<213> Мышь домовая (Mus musculus)

<400> 9

Ser Tyr Trp Met His

1 5

<210> 10

<211> 18

<212> Белок

<213> Мышь домовая (Mus musculus)

<400> 10

Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Ser Asp Thr Lys Tyr Asn Gln Lys Phe Lys

1 5 10 15

Asp Lys

<210> 11

<211> 8

<212> Белок

<213> Мышь домовая (Mus musculus)

<400> 11

Thr Val Arg Asn Val Met Asp Tyr

1 5

<210> 12

<211> 351

<212> ДНК

<213> Мышь домовая (Mus musculus)

<400> 12

gaggttcagc tccagcagtc tgggactgtg ctggcaaggc ctggggcttc agtgaagatg 60

tcctgcaagg cttctggcta cacctttacc agctactgga tgcactggat aaaacagagg 120

cctggacagg gtctggaatg gattggcgct atttatcctg gaaatagtga tactaaatac 180

aaccagaagt tcaaggacaa ggccaaactg actgcagtca catctgccag cactgcctac 240

atggagctca gcagcctgac aaatgaggac tctgcggtct attactgtac atctacggta 300

cggaatgtta tggactactg gggtcaagga acctcagtca ccgtctcctc a 351

<210> 13

<211> 107

<212> Белок

<213> Мышь домовая (Mus musculus)

<400> 13

Glu Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Met Ser Ala Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Arg Ile Thr Ile Thr Cys Gln Ala Thr Gln Asp Ile Val Lys Ser

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Pro Pro Ser Phe Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Thr Ala Gln Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Ser Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Ser

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Asp Tyr Tyr Cys Leu Gln Phe Tyr Glu Phe Pro Pro

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 14

<211> 11

<212> Белок

<213> Мышь домовая (Mus musculus)

<400> 14

Gln Ala Thr Gln Asp Ile Val Lys Ser Leu Asn

1 5 10

<210> 15

<211> 7

<212> Белок

<213> Мышь домовая (Mus musculus)

<400> 15

Tyr Thr Ala Gln Leu Ala Glu

1 5

<210> 16

<211> 9

<212> Белок

<213> Мышь домовая (Mus musculus)

<400> 16

Leu Gln Phe Tyr Glu Phe Pro Pro Thr

1 5

<210> 17

<211> 321

<212> ДНК

<213> Мышь домовая (Mus musculus)

<400> 17

gaaatccaga tgacccagtc tccatcctct atgtctgcat ctctgggaga cagaataacc 60

atcacttgcc aggcaactca agacattgtt aagagtttaa actggtatca acaaaaacca 120

gggaaacccc cttcattcct gatctattat acagctcaac tggcagaagg ggtcccatca 180

aggttcagtg gcagtgggtc tgggtcagac tattctctga caatcagcaa cctggagtct 240

gaagattttg cagactatta ctgtctacag ttttatgagt ttcctccgac gttcggtgga 300

ggcaccaagc tggaaatcaa a 321

<210> 18

<211> 107

<212> Белок

<213> Мышь домовая (Mus musculus)

<400> 18

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

1 5 10 15

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

20 25 30

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

35 40 45

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

50 55 60

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

65 70 75 80

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

85 90 95

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

100 105

<210> 19

<211> 107

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический

<400> 19

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Thr Gln Asp Ile Val Lys Ser

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Pro Pro Lys Phe Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Thr Ala Gln Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Phe Tyr Glu Phe Pro Pro

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 20

<211> 107

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический

<400> 20

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Thr Gln Asp Ile Val Lys Ser

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Pro Pro Lys Phe Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Thr Ala Gln Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Phe Tyr Glu Phe Pro Pro

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 21

<211> 107

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический

<400> 21

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Thr Gln Asp Ile Val Lys Ser

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Phe Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Thr Ala Gln Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Phe Tyr Glu Phe Pro Pro

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 22

<211> 107

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический

<400> 22

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Thr Gln Asp Ile Val Lys Ser

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Pro Pro Lys Phe Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Thr Ala Gln Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Phe Tyr Glu Phe Pro Pro

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 23

<211> 107

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический

<400> 23

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Thr Gln Asp Ile Val Lys Ser

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Pro Pro Lys Phe Ala Ile

35 40 45

Tyr Tyr Thr Ala Gln Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Phe Tyr Glu Phe Pro Pro

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 24

<211> 214

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический

<400> 24

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Thr Gln Asp Ile Val Lys Ser

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Pro Pro Lys Phe Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Thr Ala Gln Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Phe Tyr Glu Phe Pro Pro

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 25

<211> 214

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический

<400> 25

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Thr Gln Asp Ile Val Lys Ser

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Pro Pro Lys Phe Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Thr Ala Gln Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Phe Tyr Glu Phe Pro Pro

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 26

<211> 214

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический

<400> 26

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Thr Gln Asp Ile Val Lys Ser

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Phe Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Thr Ala Gln Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Phe Tyr Glu Phe Pro Pro

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 27

<211> 214

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический

<400> 27

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Thr Gln Asp Ile Val Lys Ser

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Pro Pro Lys Phe Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Thr Ala Gln Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Phe Tyr Glu Phe Pro Pro

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 28

<211> 214

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический

<400> 28

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Thr Gln Asp Ile Val Lys Ser

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Pro Pro Lys Phe Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Thr Ala Gln Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Phe Tyr Glu Phe Pro Pro

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 29

<211> 117

<212> Белок

<213> Мышь домовая (Mus musculus)

<400> 29

Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Thr Val Leu Ala Arg Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Pro Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Lys Ser Asp Thr Glu Tyr Asn Pro Asn Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Lys Leu Thr Ala Val Thr Ser Ala Thr Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Asn Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Ser Thr Trp Thr His Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr

100 105 110

Leu Thr Val Ser Ser

115

<210> 30

<211> 17

<212> Белок

<213> Мышь домовая (Mus musculus)

<400> 30

Ala Ile Tyr Pro Gly Lys Ser Asp Thr Glu Tyr Asn Pro Asn Phe Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 31

<211> 351

<212> ДНК

<213> Мышь домовая (Mus musculus)

<400> 31

gaggttcagc tccagcagtc tgggactgtt ctggcaaggc ctggggcttc agtgaagatg 60

tcctgcaagg tttctggcta cccctttacc agctactgga tgcactgggt aaaacagagg 120

cctggacagg gtctggaatg gattggcgct atttatcctg gaaaaagtga cactgaatac 180

aacccgaact tcaagggcaa ggccaaactg actgcagtca catctgccac cactgcctac 240

atggagctca gcagcctgac aaatgaggac tctgcggtct attactgtac aagtacctgg 300

acccactact ttgactactg gggccaaggc accactctca cagtctcctc a 351

<210> 32

<211> 330

<212> Белок

<213> Мышь домовая (Mus musculus)

<400> 32

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu

225 230 235 240

Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

325 330

<210> 33

<211> 330

<212> Белок

<213> Мышь домовая (Mus musculus)

<400> 33

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Asp Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Ala Leu Pro Leu Pro Glu Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu

225 230 235 240

Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

325 330

<210> 34

<211> 117

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический

<400> 34

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Pro Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Lys Ser Asp Thr Glu Tyr Ala Pro Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Ser Thr Trp Thr His Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 35

<211> 117

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический

<400> 35

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Pro Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Lys Ser Asp Thr Glu Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Ser Thr Trp Thr His Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 36

<211> 117

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический

<400> 36

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Pro Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Lys Ser Asp Thr Glu Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Ser Thr Trp Thr His Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 37

<211> 117

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический

<400> 37

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Pro Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Lys Ser Asp Thr Glu Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Ser Thr Trp Thr His Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 38

<211> 447

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический

<400> 38

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Pro Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Lys Ser Asp Thr Glu Tyr Ala Pro Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Ser Thr Trp Thr His Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu

115 120 125

Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys

130 135 140

Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser

145 150 155 160

Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser

165 170 175

Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser

180 185 190

Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn

195 200 205

Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His

210 215 220

Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val

225 230 235 240

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr

245 250 255

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu

260 265 270

Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys

275 280 285

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser

290 295 300

Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

305 310 315 320

Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile

325 330 335

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro

340 345 350

Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu

355 360 365

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn

370 375 380

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser

385 390 395 400

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

405 410 415

Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

420 425 430

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

435 440 445

<210> 39

<211> 447

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический

<400> 39

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Pro Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Lys Ser Asp Thr Glu Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Ser Thr Trp Thr His Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu

115 120 125

Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys

130 135 140

Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser

145 150 155 160

Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser

165 170 175

Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser

180 185 190

Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn

195 200 205

Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His

210 215 220

Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val

225 230 235 240

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr

245 250 255

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu

260 265 270

Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys

275 280 285

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser

290 295 300

Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

305 310 315 320

Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile

325 330 335

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro

340 345 350

Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu

355 360 365

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn

370 375 380

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser

385 390 395 400

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

405 410 415

Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

420 425 430

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

435 440 445

<210> 40

<211> 447

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический

<400> 40

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Pro Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Lys Ser Asp Thr Glu Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Ser Thr Trp Thr His Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu

115 120 125

Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys

130 135 140

Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser

145 150 155 160

Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser

165 170 175

Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser

180 185 190

Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn

195 200 205

Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His

210 215 220

Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val

225 230 235 240

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr

245 250 255

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu

260 265 270

Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys

275 280 285

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser

290 295 300

Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

305 310 315 320

Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile

325 330 335

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro

340 345 350

Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu

355 360 365

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn

370 375 380

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser

385 390 395 400

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

405 410 415

Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

420 425 430

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

435 440 445

<210> 41

<211> 447

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический

<400> 41

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Pro Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Lys Ser Asp Thr Glu Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Ser Thr Trp Thr His Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu

115 120 125

Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys

130 135 140

Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser

145 150 155 160

Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser

165 170 175

Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser

180 185 190

Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn

195 200 205

Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His

210 215 220

Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val

225 230 235 240

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr

245 250 255

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu

260 265 270

Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys

275 280 285

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser

290 295 300

Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

305 310 315 320

Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile

325 330 335

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro

340 345 350

Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu

355 360 365

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn

370 375 380

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser

385 390 395 400

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

405 410 415

Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

420 425 430

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

435 440 445

<210> 42

<211> 447

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический

<400> 42

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Pro Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Lys Ser Asp Thr Glu Tyr Ala Pro Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Ser Thr Trp Thr His Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu

115 120 125

Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys

130 135 140

Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser

145 150 155 160

Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser

165 170 175

Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser

180 185 190

Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn

195 200 205

Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His

210 215 220

Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Asp Val

225 230 235 240

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr

245 250 255

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu

260 265 270

Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys

275 280 285

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser

290 295 300

Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

305 310 315 320

Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Leu Pro Glu Glu Lys Thr Ile

325 330 335

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro

340 345 350

Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu

355 360 365

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn

370 375 380

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser

385 390 395 400

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

405 410 415

Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

420 425 430

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

435 440 445

<210> 43

<211> 447

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический

<400> 43

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Pro Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Lys Ser Asp Thr Glu Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Ser Thr Trp Thr His Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu

115 120 125

Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys

130 135 140

Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser

145 150 155 160

Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser

165 170 175

Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser

180 185 190

Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn

195 200 205

Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His

210 215 220

Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Asp Val

225 230 235 240

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr

245 250 255

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu

260 265 270

Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys

275 280 285

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser

290 295 300

Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

305 310 315 320

Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Leu Pro Glu Glu Lys Thr Ile

325 330 335

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro

340 345 350

Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu

355 360 365

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn

370 375 380

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser

385 390 395 400

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

405 410 415

Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

420 425 430

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

435 440 445

<210> 44

<211> 447

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический

<400> 44

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Pro Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Lys Ser Asp Thr Glu Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Ser Thr Trp Thr His Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu

115 120 125

Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys

130 135 140

Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser

145 150 155 160

Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser

165 170 175

Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser

180 185 190

Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn

195 200 205

Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His

210 215 220

Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Asp Val

225 230 235 240

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr

245 250 255

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu

260 265 270

Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys

275 280 285

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser

290 295 300

Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

305 310 315 320

Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Leu Pro Glu Glu Lys Thr Ile

325 330 335

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro

340 345 350

Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu

355 360 365

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn

370 375 380

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser

385 390 395 400

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

405 410 415

Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

420 425 430

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

435 440 445

<210> 45

<211> 447

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический

<400> 45

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Pro Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Lys Ser Asp Thr Glu Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Ser Thr Trp Thr His Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu

115 120 125

Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys

130 135 140

Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser

145 150 155 160

Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser

165 170 175

Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser

180 185 190

Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn

195 200 205

Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His

210 215 220

Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Asp Val

225 230 235 240

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr

245 250 255

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu

260 265 270

Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys

275 280 285

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser

290 295 300

Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

305 310 315 320

Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Leu Pro Glu Glu Lys Thr Ile

325 330 335

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro

340 345 350

Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu

355 360 365

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn

370 375 380

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser

385 390 395 400

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

405 410 415

Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

420 425 430

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

435 440 445

<210> 46

<211> 107

<212> Белок

<213> Мышь домовая (Mus musculus)

<400> 46

Glu Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Met Ser Ala Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Thr Ile Thr Ile Thr Cys Gln Ala Thr Gln Asp Ile Val Lys Ser

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Pro Pro Ser Phe Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Thr Thr Gln Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Ser Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Asp Ser

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Asp Tyr Tyr Cys Leu Gln Phe Tyr Glu Phe Pro Pro

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 47

<211> 8

<212> Белок

<213> Мышь домовая (Mus musculus)

<400> 47

Tyr Tyr Thr Thr Gln Leu Ala Glu

1 5

<210> 48

<211> 321

<212> ДНК

<213> Мышь домовая (Mus musculus)

<400> 48

gaaatccaga tgacccagtc tccatcctct atgtctgcat ctctgggaga cacaataacc 60

atcacttgcc aggcaactca agacattgtt aagagtttaa actggtatca acaaaaacca 120

gggaaacccc cttcattcct gatctattat acaactcaac tggcagaagg ggtcccatca 180

aggttcagtg gcagtgggtc tgggtcagac tattctctga caatcagcaa cctggactct 240

gaagattttg cagactatta ctgtctacag ttttatgagt ttcctccgac gttcggtgga 300

ggcaccaagc tggaaatcaa a 321

<210> 49

<211> 117

<212> Белок

<213> Мышь домовая (Mus musculus)

<400> 49

Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Thr Val Leu Ala Arg Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Lys Ser Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Lys Ala Lys Leu Thr Ala Val Thr Ser Ala Ser Thr Ala Phe

65 70 75 80

Met Glu Leu Thr Ser Leu Thr Asn Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Ser Thr Trp Thr His Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr

100 105 110

Leu Thr Val Ser Ser

115

<210> 50

<211> 17

<212> Белок

<213> Мышь домовая (Mus musculus)

<400> 50

Ala Ile Tyr Pro Gly Lys Ser Asp Thr Glu Tyr Asn Pro Asn Phe Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 51

<211> 351

<212> ДНК

<213> Мышь домовая (Mus musculus)

<400> 51

gaggttcagc tccagcagtc tgggactgtt ctggcaaggc ctggggcttc agtgaagatg 60

tcctgcaagg cttctggcta caccttttcc agctactgga tgcactgggt aaaacagagg 120

cctggacagg gtctggaatg gattggcgct atttatcctg gaaaaagtga tactagctac 180

aaccagaagt tccagggcaa ggccaaactg actgcagtca catctgccag cactgccttc 240

atggagctca ccagcctgac aaatgaggac tctgcggtct attactgtac aagtacctgg 300

acccactact ttgactactg gggccaaggc accactctca cagtctcctc a 351

<210> 52

<211> 107

<212> Белок

<213> Мышь домовая (Mus musculus)

<400> 52

Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Ile Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Ser Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Trp

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Phe Lys

100 105

<210> 53

<211> 11

<212> Белок

<213> Мышь домовая (Mus musculus)

<400> 53

Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Asn

1 5 10

<210> 54

<211> 7

<212> Белок

<213> Мышь домовая (Mus musculus)

<400> 54

Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser

1 5

<210> 55

<211> 9

<212> Белок

<213> Мышь домовая (Mus musculus)

<400> 55

Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Trp Thr

1 5

<210> 56

<211> 321

<212> ДНК

<213> Мышь домовая (Mus musculus)

<400> 56

gatatccaga tgacacaaac tacatcctcc ctgtctgcct ctctgggaga cagagtcacc 60

atcagttgca gggcaagtca ggacattagc aattatttaa actggtatca gcagaaacca 120

gatggaacta ttaaactcct gatctattac acatcaagat tacattcagg agtcccatca 180

aggttcagtg gcagtgggtc tggatcagat tattctctca ccattagcaa cctggagcaa 240

gaagatattg ccacttactt ttgccaacag ggtaatacgc ttccgtggac gttcggtgga 300

ggcaccaagc tggaattcaa a 321

<210> 57

<211> 214

<212> Белок

<213> Мышь домовая (Mus musculus)

<400> 57

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Thr Ile Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Trp

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 58

<211> 107

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический

<400> 58

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Thr Ile Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Trp

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 59

<211> 107

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический

<400> 59

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Trp

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 60

<211> 107

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический

<400> 60

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Gln Thr Leu Pro Trp

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 61

<211> 107

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический

<400> 61

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Ser Thr Leu Pro Trp

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 62

<211> 214

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический

<400> 62

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Trp

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 63

<211> 214

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический

<400> 63

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Gln Thr Leu Pro Trp

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 64

<211> 214

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический

<400> 64

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Ser Thr Leu Pro Trp

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 65

<211> 116

<212> Белок

<213> Мышь домовая (Mus musculus)

<400> 65

Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Arg Val Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Leu Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Arg His Asn Tyr Ala Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

<210> 66

<211> 5

<212> Белок

<213> Мышь домовая (Mus musculus)

<400> 66

Asp Tyr Tyr Met Asn

1 5

<210> 67

<211> 17

<212> Белок

<213> Мышь домовая (Mus musculus)

<400> 67

Arg Val Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 68

<211> 7

<212> Белок

<213> Мышь домовая (Mus musculus)

<400> 68

Arg His Asn Tyr Ala Asp Phe

1 5

<210> 69

<211> 348

<212> ДНК

<213> Мышь домовая (Mus musculus)

<400> 69

gaggtccagc tgcaacagtc tggacctgag ctggtgaagc ctggggcttc agtgaagatg 60

tcctgtaagg cttctggata cacattcact gactactaca tgaactgggt gaggcagagt 120

catggaaaga gccttgagtg gattggacgt gttaatccta gcaatggtgg tactaactac 180

aaccagaaat tcaagggcaa ggccacattg acagtagaca aatccctcag cacagcctac 240

atgcagctca gcagcctgac atctgaggac tctgcggtct attactgtgc aagacgacat 300

aactacgcag acttctgggg ccaaggcacc actctcacag tctcctca 348

<210> 70

<211> 116

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический

<400> 70

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Arg Val Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Arg His Asn Tyr Ala Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

<210> 71

<211> 116

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический

<400> 71

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Arg Val Asn Pro Ala Asn Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Arg His Asn Tyr Ala Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

<210> 72

<211> 116

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический

<400> 72

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Arg Val Asn Pro Ser Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Arg His Asn Tyr Ala Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

<210> 73

<211> 116

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический

<400> 73

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Arg Val Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Arg His Asn Tyr Ala Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

<210> 74

<211> 116

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический

<400> 74

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Arg Val Asn Pro Ser Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Arg His Asn Tyr Ala Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

<210> 75

<211> 446

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический

<400> 75

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Arg Val Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Arg His Asn Tyr Ala Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala

115 120 125

Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu

130 135 140

Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly

145 150 155 160

Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser

165 170 175

Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu

180 185 190

Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr

195 200 205

Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr

210 215 220

Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe

225 230 235 240

Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro

245 250 255

Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val

260 265 270

Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr

275 280 285

Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val

290 295 300

Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys

305 310 315 320

Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser

325 330 335

Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro

340 345 350

Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val

355 360 365

Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly

370 375 380

Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp

385 390 395 400

Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp

405 410 415

Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His

420 425 430

Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

435 440 445

<210> 76

<211> 446

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический

<400> 76

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Arg Val Asn Pro Ala Asn Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Arg His Asn Tyr Ala Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala

115 120 125

Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu

130 135 140

Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly

145 150 155 160

Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser

165 170 175

Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu

180 185 190

Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr

195 200 205

Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr

210 215 220

Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe

225 230 235 240

Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro

245 250 255

Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val

260 265 270

Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr

275 280 285

Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val

290 295 300

Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys

305 310 315 320

Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser

325 330 335

Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro

340 345 350

Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val

355 360 365

Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly

370 375 380

Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp

385 390 395 400

Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp

405 410 415

Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His

420 425 430

Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

435 440 445

<210> 77

<211> 446

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический

<400> 77

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Arg Val Asn Pro Ser Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Arg His Asn Tyr Ala Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala

115 120 125

Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu

130 135 140

Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly

145 150 155 160

Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser

165 170 175

Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu

180 185 190

Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr

195 200 205

Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr

210 215 220

Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe

225 230 235 240

Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro

245 250 255

Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val

260 265 270

Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr

275 280 285

Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val

290 295 300

Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys

305 310 315 320

Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser

325 330 335

Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro

340 345 350

Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val

355 360 365

Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly

370 375 380

Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp

385 390 395 400

Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp

405 410 415

Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His

420 425 430

Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

435 440 445

<210> 78

<211> 446

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический

<400> 78

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Arg Val Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Arg His Asn Tyr Ala Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala

115 120 125

Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu

130 135 140

Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly

145 150 155 160

Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser

165 170 175

Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu

180 185 190

Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr

195 200 205

Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr

210 215 220

Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe

225 230 235 240

Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro

245 250 255

Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val

260 265 270

Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr

275 280 285

Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val

290 295 300

Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys

305 310 315 320

Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser

325 330 335

Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro

340 345 350

Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val

355 360 365

Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly

370 375 380

Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp

385 390 395 400

Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp

405 410 415

Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His

420 425 430

Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

435 440 445

<210> 79

<211> 446

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический

<400> 79

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Arg Val Asn Pro Ser Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Arg His Asn Tyr Ala Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala

115 120 125

Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu

130 135 140

Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly

145 150 155 160

Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser

165 170 175

Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu

180 185 190

Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr

195 200 205

Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr

210 215 220

Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe

225 230 235 240

Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro

245 250 255

Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val

260 265 270

Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr

275 280 285

Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val

290 295 300

Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys

305 310 315 320

Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser

325 330 335

Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro

340 345 350

Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val

355 360 365

Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly

370 375 380

Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp

385 390 395 400

Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp

405 410 415

Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His

420 425 430

Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

435 440 445

<210> 80

<211> 446

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический

<400> 80

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Arg Val Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Arg His Asn Tyr Ala Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala

115 120 125

Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu

130 135 140

Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly

145 150 155 160

Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser

165 170 175

Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu

180 185 190

Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr

195 200 205

Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr

210 215 220

Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Asp Val Phe

225 230 235 240

Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro

245 250 255

Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val

260 265 270

Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr

275 280 285

Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val

290 295 300

Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys

305 310 315 320

Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Leu Pro Glu Glu Lys Thr Ile Ser

325 330 335

Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro

340 345 350

Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val

355 360 365

Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly

370 375 380

Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp

385 390 395 400

Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp

405 410 415

Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His

420 425 430

Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

435 440 445

<210> 81

<211> 446

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический

<400> 81

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Arg Val Asn Pro Ala Asn Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Arg His Asn Tyr Ala Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala

115 120 125

Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu

130 135 140

Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly

145 150 155 160

Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser

165 170 175

Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu

180 185 190

Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr

195 200 205

Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr

210 215 220

Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Asp Val Phe

225 230 235 240

Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro

245 250 255

Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val

260 265 270

Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr

275 280 285

Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val

290 295 300

Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys

305 310 315 320

Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Leu Pro Glu Glu Lys Thr Ile Ser

325 330 335

Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro

340 345 350

Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val

355 360 365

Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly

370 375 380

Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp

385 390 395 400

Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp

405 410 415

Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His

420 425 430

Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

435 440 445

<210> 82

<211> 446

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический

<400> 82

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Arg Val Asn Pro Ser Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Arg His Asn Tyr Ala Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala

115 120 125

Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu

130 135 140

Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly

145 150 155 160

Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser

165 170 175

Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu

180 185 190

Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr

195 200 205

Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr

210 215 220

Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Asp Val Phe

225 230 235 240

Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro

245 250 255

Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val

260 265 270

Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr

275 280 285

Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val

290 295 300

Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys

305 310 315 320

Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Leu Pro Glu Glu Lys Thr Ile Ser

325 330 335

Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro

340 345 350

Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val

355 360 365

Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly

370 375 380

Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp

385 390 395 400

Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp

405 410 415

Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His

420 425 430

Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

435 440 445

<210> 83

<211> 446

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический

<400> 83

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Arg Val Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Arg His Asn Tyr Ala Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala

115 120 125

Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu

130 135 140

Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly

145 150 155 160

Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser

165 170 175

Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu

180 185 190

Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr

195 200 205

Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr

210 215 220

Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Asp Val Phe

225 230 235 240

Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro

245 250 255

Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val

260 265 270

Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr

275 280 285

Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val

290 295 300

Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys

305 310 315 320

Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Leu Pro Glu Glu Lys Thr Ile Ser

325 330 335

Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro

340 345 350

Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val

355 360 365

Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly

370 375 380

Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp

385 390 395 400

Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp

405 410 415

Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His

420 425 430

Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

435 440 445

<210> 84

<211> 446

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетический

<400> 84

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Arg Val Asn Pro Ser Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Arg His Asn Tyr Ala Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala

115 120 125

Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu

130 135 140

Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly

145 150 155 160

Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser

165 170 175

Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu

180 185 190

Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr

195 200 205

Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr

210 215 220

Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Asp Val Phe

225 230 235 240

Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro

245 250 255

Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val

260 265 270

Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr

275 280 285

Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val

290 295 300

Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys

305 310 315 320

Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Leu Pro Glu Glu Lys Thr Ile Ser

325 330 335

Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro

340 345 350

Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val

355 360 365

Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly

370 375 380

Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp

385 390 395 400

Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp

405 410 415

Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His

420 425 430

Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

435 440 445

<210> 85

<211> 107

<212> Белок

<213> Мышь домовая (Mus musculus)

<400> 85

Glu Thr Val Met Thr Gln Ser His Lys Ile Met Ser Thr Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Arg Thr Ala

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Ser Ser Ala Ser Tyr Gln Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala

65 70 75 80

Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys His Gln Tyr Tyr Asn Thr Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Arg

100 105

<210> 86

<211> 7

<212> Белок

<213> Мышь домовая (Mus musculus)

<400> 86

Ser Ala Ser Tyr Gln Tyr Thr

1 5

<210> 87

<211> 9

<212> Белок

<213> Мышь домовая (Mus musculus)

<400> 87

His Gln Tyr Tyr Asn Thr Pro Leu Thr

1 5

<210> 88

<211> 321

<212> ДНК

<213> Мышь домовая (Mus musculus)

<400> 88

gaaactgtga tgacccagtc tcacaaaatc atgtccactt cagtaggaga cagggtcacc 60

atcacctgca aggccagtca ggatgtgaga actgctgtgg cctggtatca acagaaacca 120

ggacaatctc ctaaattact aatttcctcg gcatcctacc aatacactgg agtccctgat 180

cgcttcactg gcagtggatc tgggacggat ttcactttca ccatcagcag tttgcaggct 240

gaagacctgg cagtttatta ctgtcatcag tattataata ctccgctcac gttcggtgct 300

gggaccaagc tggagctgag a 321

<210> 89

<211> 117

<212> Белок

<213> Мышь домовая (Mus musculus)

<400> 89

Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Thr Val Leu Ala Arg Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Lys Ser Asp Thr Thr Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Glu Gly Lys Ala Lys Leu Thr Ala Val Thr Ser Asp Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Asp Leu Ser Ser Leu Thr Asn Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Ser Ser Val Arg Asn Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 90

<211> 17

<212> Белок

<213> Мышь домовая (Mus musculus)

<400> 90

Ala Ile Tyr Pro Gly Lys Ser Asp Thr Thr Tyr Asn Gln Lys Phe Glu

1 5 10 15

Gly

<210> 91

<211> 8

<212> Белок

<213> Мышь домовая (Mus musculus)

<400> 91

Ser Val Arg Asn Ala Met Asp Tyr

1 5

<210> 92

<211> 351

<212> ДНК

<213> Мышь домовая (Mus musculus)

<400> 92

gaggttcagc tccagcagtc tgggactgtg ctggcaaggc ctggggcttc agtgaagatg 60

tcctgcaagg cttctggcta caccttcacc agctactgga tgcactgggt aaaacagagg 120

cctggacagg gtctggaatg gattggcgct atttatcctg gaaaaagtga tactacctac 180

aaccagaagt tcgagggcaa ggccaaactg actgcagtca catctgacag cacagcctac 240

atggatctca gtagcctgac aaatgaggac tctgcggtct attactgtac atcttcggtt 300

cggaatgcta tggactactg gggtcaagga acctcagtca ccgtctcctc a 351

<210> 93

<211> 112

<212> Белок

<213> Мышь домовая (Mus musculus)

<400> 93

Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Gly Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ile Ile Val His Ser

20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly

85 90 95

Ser His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 94

<211> 16

<212> Белок

<213> Мышь домовая (Mus musculus)

<400> 94

Arg Ser Ser Gln Ile Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu

1 5 10 15

<210> 95

<211> 7

<212> Белок

<213> Мышь домовая (Mus musculus)

<400> 95

Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser

1 5

<210> 96

<211> 9

<212> Белок

<213> Мышь домовая (Mus musculus)

<400> 96

Phe Gln Gly Ser His Val Pro Trp Thr

1 5

<210> 97

<211> 336

<212> ДНК

<213> Мышь домовая (Mus musculus)

<400> 97

gatgttttga tgacccaaac tccactctcc ctgcctgtca gtcttggagg tcaagcctcc 60

atctcttgca gatctagtca gatcattgta catagtaatg gaaacaccta tttagaatgg 120

tacctgcaga aaccaggcca gtctccaaag ctcctgatct acaaagtttc caaccgattt 180

tctggggtcc cagacaggtt cagtggcagt ggatcaggga cagatttcac actcaagatc 240

agcagagtgg aggctgagga tctgggagtt tattactgct ttcaaggttc acatgttccg 300

tggacgttcg gtggaggcac caagctggaa atcaaa 336

<210> 98

<211> 119

<212> Белок

<213> Мышь домовая (Mus musculus)

<400> 98

Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ile Ser Tyr

20 25 30

Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Glu Ile Asp Pro Ser Asp Ser Tyr Thr Tyr Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Arg Lys Thr Trp Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly

100 105 110

Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 99

<211> 17

<212> Белок

<213> Мышь домовая (Mus musculus)

<400> 99

Glu Ile Asp Pro Ser Asp Ser Tyr Thr Tyr Tyr Asn Gln Lys Phe Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 100

<211> 10

<212> Белок

<213> Мышь домовая (Mus musculus)

<400> 100

Arg Lys Thr Trp Asp Trp Tyr Phe Asp Val

1 5 10

<210> 101

<211> 357

<212> ДНК

<213> Мышь домовая (Mus musculus)

<400> 101

caggtccagc tgcagcagcc tggggctgaa ctggtgaagc ctggggcttc agtgaagctg 60

tcctgcaagg cttctggata caccttcatt agctactgga tgcactgggt gaagcagagg 120

cctggacaag gccttgagtg gatcggagag attgatcctt ctgatagtta tacttactac 180

aatcaaaagt tcaagggcaa ggccacattg actgtagaca aatcctccag cacagcctac 240

atgcaactca gcagcctgac atctgaggac tctgcggtct attactgtgc aagaaggaaa 300

acctgggact ggtacttcga tgtctggggc gcagggacca cggtcaccgt ctcctca 357

<210> 102

<211> 106

<212> Белок

<213> Мышь домовая (Mus musculus)

<400> 102

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Ser Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala

65 70 75 80

Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Thr

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Arg

100 105

<210> 103

<211> 11

<212> Белок

<213> Мышь домовая (Mus musculus)

<400> 103

Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala Val Ala

1 5 10

<210> 104

<211> 7

<212> Белок

<213> Мышь домовая (Mus musculus)

<400> 104

Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr

1 5

<210> 105

<211> 8

<212> Белок

<213> Мышь домовая (Mus musculus)

<400> 105

Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Thr

1 5

<210> 106

<211> 318

<212> ДНК

<213> Мышь домовая (Mus musculus)

<400> 106

gacattgtga tgacccagtc tcacaaattc atgtccacat cagtaggaga cagggtcact 60

atcacctgca aggccagtca ggatgtgagt actgctgtag cctggtatca acagaaacca 120

ggacagtctc ctaaactact gatttcctcg gcatcctacc ggtacactgg agtccctgat 180

cgcttcactg gcagtggatc tgggacggat ttcactttca ccatcagcag tgtgcaggct 240

gaagacctgg cagtttatta ctgtcagcaa cattatagta ctccgacgtt cggtggaggc 300

accaagctgg aaatcaga 318

<210> 107

<211> 116

<212> Белок

<213> Мышь домовая (Mus musculus)

<400> 107

Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Thr Val Leu Ala Arg Pro Gly Ala Ser

1 5 10 15

Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Trp

20 25 30

Met His Trp Val Lys Glu Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly

35 40 45

Ala Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Asn Gln Lys Phe Lys

50 55 60

Gly Arg Ala Lys Leu Thr Ala Val Thr Ser Ala Asn Thr Ala Tyr Met

65 70 75 80

Glu Leu Ser Ser Leu Thr Asn Asp Asp Ser Ala Val Phe Tyr Cys Thr

85 90 95

Cys Thr Thr Ala Gly Val Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

<210> 108

<211> 17

<212> Белок

<213> Мышь домовая (Mus musculus)

<400> 108

Ala Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Asn Gln Lys Phe Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 109

<211> 8

<212> Белок

<213> Мышь домовая (Mus musculus)

<400> 109

Thr Thr Ala Gly Val Leu Asp Tyr

1 5

<210> 110

<211> 351

<212> ДНК

<213> Мышь домовая (Mus musculus)

<400> 110

gaggttcagc tccagcagtc tgggactgtg ctggcaaggc ctggggcttc agtgaagatg 60

tcctgcaagg cttctggcta cacctttacc agctactgga tgcactgggt aaaagagagg 120

cctggacagg gtctggaatg gattggcgct atttatcctg gagatagtga tactaggtat 180

aatcagaagt tcaagggcag ggccaaactg actgcagtca catctgccaa cactgcctac 240

atggagctca gcagcctgac aaatgatgac tctgcggtct tctactgtac atgtactacg 300

gctggtgttt tggactactg gggtcaagga acctcagtca ccgtctcctc a 351

<210> 111

<211> 112

<212> Белок

<213> Мышь домовая (Mus musculus)

<400> 111

Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Thr Ser Ser Gln Ser Ile Val His Gly

20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly

85 90 95

Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 112

<211> 16

<212> Белок

<213> Мышь домовая (Mus musculus)

<400> 112

Thr Ser Ser Gln Ser Ile Val His Gly Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu

1 5 10 15

<210> 113

<211> 9

<212> Белок

<213> Мышь домовая (Mus musculus)

<400> 113

Phe Gln Gly Ser His Val Pro Tyr Thr

1 5

<210> 114

<211> 336

<212> ДНК

<213> Мышь домовая (Mus musculus)

<400> 114

gatgttgtga tgacccaaac tccactctcc ctgcctgtca gtcttggaga tcaggcctcc 60

atctcttgca catctagtca gagcattgta catggtaatg gaaacaccta tttagaatgg 120

tacctgcaga agccaggcca gtctccaaag ctcctgatct acaaagtttc caaccgattt 180

tctggggtcc cagacaggtt cagtggcagt ggatcaggga cagatttcac actcaagatc 240

agcagagtgg aggctgagga tctgggagtt tattactgct ttcaaggttc acatgttccg 300

tacacgttcg gaggggggac caagctggaa ataaaa 336

<210> 115

<211> 123

<212> Белок

<213> Мышь домовая (Mus musculus)

<400> 115

Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Arg Ile His Pro Ser Asp Ser Glu Thr His Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Ser Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Ile Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Tyr Gly Leu Phe Tyr Gly Asn Asp Gly Tyr Ala Met Asp His

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 116

<211> 5

<212> Белок

<213> Мышь домовая (Mus musculus)

<400> 116

Ser Tyr Trp Met Asn

1 5

<210> 117

<211> 17

<212> Белок

<213> Мышь домовая (Mus musculus)

<400> 117

Arg Ile His Pro Ser Asp Ser Glu Thr His Tyr Asn Gln Lys Phe Lys

1 5 10 15

Ser

<210> 118

<211> 14

<212> Белок

<213> Мышь домовая (Mus musculus)

<400> 118

Tyr Gly Leu Phe Tyr Gly Asn Asp Gly Tyr Ala Met Asp His

1 5 10

<210> 119

<211> 355

<212> ДНК

<213> Мышь домовая (Mus musculus)

<400> 119

caggtccaac tgcagcagcc tggggctgaa ctggtgaagc ctggggcttc agtgaagctg 60

tcctgcaagg cttctggcta ctctttcacc agctactgga tgaactgggt gaagcagagg 120

cctggacgag gcctcgagtg gattggaagg attcatcctt ctgatagtga aactcactac 180

aatcaaaagt tcaagagcaa ggccacactg actgtagaca aatcctccag cacagcctac 240

atccaactca gcagcctgac atctgaggac tctgcggtct atttttgtgc aagatacggg 300

ctcttctatg gtaacgacgg atatgctatg gaccactggg gtcaaggaac ctcag 355

<210> 120

<211> 107

<212> Белок

<213> Мышь домовая (Mus musculus)

<400> 120

Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Phe Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Trp

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 121

<211> 11

<212> Белок

<213> Мышь домовая (Mus musculus)

<400> 121

Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Phe Tyr Leu Asn

1 5 10

<210> 122

<211> 321

<212> ДНК

<213> Мышь домовая (Mus musculus)

<400> 122

gatatccaga tgacacagac tacatcctcc ctgtctgcct ctctgggaga cagagtcacc 60

atcagttgca gggcaagtca ggacattagc ttttatttaa actggtatca gcagaaacca 120

gatggaactg ttaaactcct gatctactac acatcaagat tacactcagg agtcccatca 180

aggttcagtg gcagtgggtc tggaacagat tattctctca ccattagcaa cctggagcaa 240

gaagatattg ccacttactt ttgccaacag ggtaatacac ttccgtggac gttcggtgga 300

ggcaccaagc tggaaatcaa a 321

<210> 123

<211> 116

<212> Белок

<213> Мышь домовая (Mus musculus)

<400> 123

Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Tyr Met Asn Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Arg Val Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Leu Ser Ala Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Arg His Asn Tyr Pro Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

<210> 124

<211> 17

<212> Белок

<213> Мышь домовая (Mus musculus)

<400> 124

Arg Val Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 125

<211> 7

<212> Белок

<213> Мышь домовая (Mus musculus)

<400> 125

Arg His Asn Tyr Pro Asp Tyr

1 5

<210> 126

<211> 348

<212> ДНК

<213> Мышь домовая (Mus musculus)

<400> 126

gaggtccagc tgcaacagtc tggacctgaa ctggtgaagc ctggggcttc agtgaagatg 60

tcctgtaagg cttctggata cacattcact gactactaca tgaactgggt gaagcagagt 120

catggaaaga gccttgagtg gattggacgt gttaatccta gcaatggtgg tactagctac 180

aaccagaagt tcaagggcaa ggccacattg acagtagaca aatccctcag cgcagcctat 240

atgcagctca acagcctgac atctgaggac tctgcggtct attactgtgc aagaaggcat 300

aactaccctg actactgggg ccaaggcacc actctcacag tctcctca 348

<210> 127

<211> 320

<212> ДНК

<213> Мышь домовая (Mus musculus)

<400> 127

gaaatccaga tgacccagtc tccatcctct atgtctgcat ctctgggaga cagaataacc 60

atcacttgcc aggcaactca agacattgtt aagagtttaa actggtatca acaaaaacca 120

gggaaacccc cttcattcct gatctattat acagctcaac tggcagaagg ggtcccgtca 180

aggttcagtg gcagtgggtc tgggtcagac tattctctga caatcagcaa cctggagtct 240

gaagattttg cagactatta ctgtctacag ttttatgagt ttcctccgac gttcggtgga 300

ggcaccaagc tggaaatcaa 320

<210> 128

<211> 117

<212> Белок

<213> Мышь домовая (Mus musculus)

<400> 128

Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Thr Val Leu Ala Arg Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Pro Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Ser Asp Thr Arg Tyr Asn Pro Asn Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Asn Leu Thr Ala Val Thr Ser Ala Thr Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Asn Glu Glu Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Ser Thr Trp Thr His Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr

100 105 110

Leu Thr Val Ser Ser

115

<210> 129

<211> 17

<212> Белок

<213> Мышь домовая (Mus musculus)

<400> 129

Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Ser Asp Thr Arg Tyr Asn Pro Asn Phe Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 130

<211> 8

<212> Белок

<213> Мышь домовая (Mus musculus)

<400> 130

Thr Trp Thr His Tyr Phe Asp Tyr

1 5

<210> 131

<211> 351

<212> ДНК

<213> Мышь домовая (Mus musculus)

<400> 131

gaggttcagc tccagcagtc tgggactgtg ctggcaaggc ctggggcttc agtgaagatg 60

tcctgcaagg cttctggcta cccctttacc agctactgga tgcactgggt aaagcagagg 120

cctggacagg gtctggaatg gattggcgct atttatcctg gaaatagtga tactaggtac 180

aacccgaatt tcaagggcaa ggccaacctg actgcagtca catctgccac cactgcctac 240

atggagctca gcagcctgac aaatgaggaa tctgcggtct attactgtac aagtacctgg 300

acccactact ttgactactg gggccaaggc accactctca cagtctcctc a 351

<---

Группа изобретений относится к биотехнологии. Представлены: анти-B7-H4 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент и его применение, фармацевтическая композиция, увеличивающая иммунный ответ, содержащая анти-B7H4 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, нуклеиновая кислота, кодирующая антитело или его антигенсвязывающий фрагмент. Также раскрыты вектор экспрессии, содержащий нуклеиновую кислоту и клетка-хозяин для получения антитела. Применение изобретения позволяет повысить иммунный ответ у пациента, страдающего раком. 6 н. и 5 з.п. ф-лы.

1. Анти-B7-H4 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащее:

(a) легкую цепь с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:63; и

(b) тяжелую цепь с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:81.

2. Фармацевтическая композиция, увеличивающая иммунный ответ, содержащая анти-B7H4 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.1 и фармацевтически приемлемый носитель.

3. Нуклеиновая кислота, кодирующая антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.1.

4. Вектор экспрессии, содержащий нуклеиновую кислоту по п.3.

5. Клетка-хозяин для получения антитела по п.1, содержащая нуклеиновую кислоту по п.3 или вектор по п.4.

6. Применение анти-B7H4 антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по п.1 или фармацевтической композиции по п.2 в способе повышения иммунного ответа у пациента, включающем введение указанному пациенту указанного антитела, антигенсвязывающего фрагмента или фармацевтической композиции.

7. Применение по п.6, где способ повышает иммунный ответ и пациент страдает раком.

8. Применение по п.6, где рак представляет собой рак яичников, легких или желудочно-кишечного тракта.

9. Применение по п.6, где способ повышает иммунный ответ, и пациент страдает инфекционным заболеванием.

10. Применение по п.6, где способ повышает иммунный ответ, и пациенту вводят фармацевтическую композицию одновременно с вакциной или ее компонентом.

11. Применение по любому из пп.6-10, где способ включает введение пациенту второго терапевтического агента.