Область техники, к которой относится изобретение
[0001] Настоящее изобретение относится к композициям белков, имеющим активность полимеризации изопрена, и к их применениям, и в частности, к композициям белков, имеющим активность полимеризации изопрена, к содержащим их липидным мембранным структурам и клеткам, и к способам получения изопреновых полимерных соединений с их применением.
Уровень техники для изобретения
[0002] Натуральный каучук представляет собой вещество, состоящее в основном из цис-полиизопрена, содержащегося в соке каучукового дерева. Его широко используют в различных областях, таких как автомобильная и строительная промышленность, и потребность в нем возрастает во всем мире. Поскольку натуральный каучук представляет собой сельскохозяйственный продукт, собранный из каучуковых деревьев, его поставка является нестабильной, и существуют такие проблемы, как непостоянное качество, потенциально подвергая бизнес серьезному риску. По этой причине, предпринимают попытки разработки технологии для искусственного получения натурального каучука.
[0003] В Патентном документе 1 и Непатентном документе 1 описаны способы получения полиизопреноидов. Каждый из способов включает процесс связывания для связывания частицы каучука с каждым из продуктов экспрессии генов предопределенных белков (HRT1, HRTBP и REF), вовлеченных в биосинтез натурального каучука in vitro.
Список литературы
Патентный документ
[0004] [Патентный документ 1] Японский патент No. 6586693
Непатентный документ
[0005] [Непатентный документ 1] Yamashita S.et al. eLife 2016; 5: e19022. doi: 10.7554/eLife.19022
Сущность изобретения
Техническая проблема
[0006] Предшествующий уровень техники, описанный в Патентном документе 1 и Непатентном документе 1, являлся недостаточным для получения достаточного количества полиизопреноидов для практического использования. В соответствии с этой технологией, является необходимым собирать частицы каучука из растений, что делает способ сбора частиц каучука сложным, и является сложным стабилизировать качество частиц каучука, поскольку их экстрагируют из растений.
[0007] Настоящее изобретение относится к способам эффективного получения натурального каучука и его стабильной поставки, и имеет целью стабильную поставку ресурсов каучука.
Техническое решение
[0007]
[1] Композиция белков, имеющая активность полимеризации изопрена, содержащая белок(и) (B) и любой из белков (A-1) и (A-2):
(A-1) один или несколько белок(ов), выбранный из белка(ов), содержащего аминокислотную последовательность из SEQ ID NO: 6, и белка(ов), который содержит аминокислотную последовательность, имеющую 90% или более идентичность с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO: 6, и имеет такую же активность, как CPT6;
(A-2) один или несколько белок(ов), выбранный из белка(ов), содержащего аминокислотную последовательность из SEQ ID NO: 8, и белка(ов), который содержит аминокислотную последовательность, имеющую 90% или более идентичность с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO: 8, и имеет такую же активность, как CPT7; и
(B) один или несколько белок(ов), выбранный из белка(ов), содержащего аминокислотную последовательность из SEQ ID NO: 10, и белка(ов), который содержит аминокислотную последовательность, имеющую 90% или более идентичность с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO: 10, и имеет такую же активность, как CPTL.
[2] Композиция по [1], удовлетворяющая по меньшей мере одному из следующих:
белок (A-1) кодирован одним или несколькими полинуклеотидом(ами) (a-1), выбранным из полинуклеотида(ов), содержащего последовательность нуклеиновой кислоты из SEQ ID NO: 5, и полинуклеотида(ов), который содержит последовательность нуклеиновой кислоты, имеющую 90% или более идентичность с последовательностью нуклеиновой кислоты из SEQ ID NO: 5, и кодирует белок, имеющий такую же активность, как CPT6;
белок (A-2) кодирован одним или несколькими полинуклеотидом(ами) (a-2), выбранным из полинуклеотида(ов), содержащего последовательность нуклеиновой кислоты из SEQ ID NO: 7, и полинуклеотида(ов), который содержит последовательность нуклеиновой кислоты, имеющую 90% или более идентичность с последовательностью нуклеиновой кислоты из SEQ ID NO: 7, и кодирует белок, имеющий такую же активность, как CPT7; и
белок (B) кодирован одним или несколькими полинуклеотидом(ами) (b), выбранным из полинуклеотида(ов), содержащего последовательность нуклеиновой кислоты из SEQ ID NO: 9, и полинуклеотида(ов), который содержит последовательность нуклеиновой кислоты, имеющую 90% или более идентичность с последовательностью нуклеиновой кислоты из SEQ ID NO: 9, и кодирует белок, имеющий такую же активность, как CPTL.
[3] Композиция по [1] или [2], дополнительно содержащая белок семейства REF, белок семейства SRPP и белок семейства CPT, отличный от CPT6, 7 и CPTL.
[4] Композиция по [1], дополнительно содержащая по меньшей мере один из следующих:
(C) один или несколько белок(ов), выбранный из белка(ов), содержащего аминокислотную последовательность из SEQ ID NO: 2, и белка(ов), который содержит аминокислотную последовательность, имеющую 90% или более идентичность с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO: 2, и имеет такую же активность, как CPT1;
(D) один или несколько белок(ов), выбранный из белка(ов), содержащего аминокислотную последовательность из SEQ ID NO: 4, и белка(ов), который содержит аминокислотную последовательность, имеющую 90% или более идентичность с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO: 4, и имеет такую же активность, как CPT2;
(E) один или несколько белок(ов), выбранный из белка(ов), содержащего аминокислотную последовательность из SEQ ID NO: 12, и белка(ов), который содержит аминокислотную последовательность, имеющую 90% или более идентичность с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO: 12, и имеет такую же активность, как REF1;
(F) один или несколько белок(ов), выбранный из белка(ов), содержащего аминокислотную последовательность из SEQ ID NO: 14, и белка(ов), который содержит аминокислотную последовательность, имеющую 90% или более идентичность с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO: 14, и имеет такую же активность, как REF2;
(G) один или несколько белок(ов), выбранный из белка(ов), содержащего аминокислотную последовательность из SEQ ID NO: 16, и белка(ов), который содержит аминокислотную последовательность, имеющую 90% или более идентичность с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO: 16, и имеет такую же активность, как REF8; и
(H) один или несколько белок(ов), выбранный из белка(ов), содержащего аминокислотную последовательность из SEQ ID NO: 18, и белка(ов), который содержит аминокислотную последовательность, имеющую 90% или более идентичность с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO: 18 и имеет такую же активность, как SRPP1.
[5] Композиция по [4], удовлетворяющая по меньшей мере одному из следующих:
белок (C) кодирован одним или несколькими полинуклеотидом(ами) (c), выбранным из полинуклеотида(ов), содержащего последовательность нуклеиновой кислоты из SEQ ID NO: 1, и полинуклеотида(ов), который содержит последовательность нуклеиновой кислоты, имеющую 90% или более идентичность с последовательностью нуклеиновой кислоты из SEQ ID NO: 1, и кодирует белок, имеющий такую же активность, как CPT1;
белок (D) кодирован одним или несколькими полинуклеотидом(ами) (d), выбранным из полинуклеотида(ов), содержащего последовательность нуклеиновой кислоты из SEQ ID NO: 3, и полинуклеотида(ов), который содержит последовательность нуклеиновой кислоты, имеющую 90% или более идентичность с последовательностью нуклеиновой кислоты из SEQ ID NO: 3, и кодирует белок, имеющий такую же активность, как CPT2;
белок (E) кодирован одним или несколькими полинуклеотидом(ами) (e), выбранным из полинуклеотида(ов), содержащего последовательность нуклеиновой кислоты из SEQ ID NO: 11, и полинуклеотида(ов), который содержит последовательность нуклеиновой кислоты, имеющую 90% или более идентичность с последовательностью нуклеиновой кислоты из SEQ ID NO: 11, и кодирует белок, имеющий такую же активность, как REF1;
белок (F) кодирован одним или несколькими полинуклеотидом(ами) (f), выбранным из полинуклеотида(ов), содержащего последовательность нуклеиновой кислоты из SEQ ID NO: 13, и полинуклеотида(ов), который содержит последовательность нуклеиновой кислоты, имеющую 90% или более идентичность с последовательностью нуклеиновой кислоты из SEQ ID NO: 13, и кодирует белок, имеющий такую же активность, как REF2;
белок (G) кодирован одним или несколькими полинуклеотидом(ами) (g), выбранным из полинуклеотида(ов), содержащего последовательность нуклеиновой кислоты из SEQ ID NO: 15, и полинуклеотида(ов), который содержит последовательность нуклеиновой кислоты, имеющую 90% или более идентичность с последовательностью нуклеиновой кислоты из SEQ ID NO: 15, и кодирует белок, имеющий такую же активность, как REF8; и
белок (H) кодирован одним или несколькими полинуклеотидом(ами) (h), выбранным из полинуклеотида(ов), содержащего последовательность нуклеиновой кислоты из SEQ ID NO: 17, и полинуклеотида(ов), который содержит последовательность нуклеиновой кислоты, имеющую 90% или более идентичность с последовательностью нуклеиновой кислоты из SEQ ID NO: 17, и кодирует белок, имеющий такую же активность, как SRPP1.
[6] Композиция по любому из [1] - [5], где по меньшей мере один из белков (A) - (H) представляет собой белок, происходящий из каучукового дерева.
[7] Липидная мембранная структура, содержащая композицию по любому из [1] - [6] и фосфолипид.
[8] Структура по [7], представляющая собой липидную бислойную мембранную структуру.
[9] Структура по [7] или [8], представляющая собой протеолипосому.
[10] Способ получения липидной мембранной структуры по любому из [7] - [9], включающий экспрессию полинуклеотида, кодирующего белок, составляющий композицию по любому из [1] - [6], в бесклеточной системе продукции белка в присутствии сырьевого материала, содержащего фосфолипид.
[11] Способ получения липидной мембранной структуры по [10], где полинуклеотид, кодирующий белок, составляющий композицию по любому из [1] - [6], содержит (b) и любой из (a-1) и (a-2):
(a-1) один или несколько полинуклеотид(ов), выбранный из полинуклеотида(ов), содержащего последовательность нуклеиновой кислоты из SEQ ID NO: 5, и полинуклеотида(ов), который содержит последовательность нуклеиновой кислоты, имеющую 90% или более идентичность с последовательностью нуклеиновой кислоты из SEQ ID NO: 5, и кодирует белок, имеющий такую же активность, как CPT6;
(a-2) один или несколько полинуклеотид(ов), выбранный из полинуклеотида(ов), содержащего последовательность нуклеиновой кислоты из SEQ ID NO: 7, и полинуклеотида(ов), который содержит последовательность нуклеиновой кислоты, имеющую 90% или более идентичность с последовательностью нуклеиновой кислоты из SEQ ID NO: 7, и кодирует белок, имеющий такую же активность, как CPT7; и
(b) один или несколько полинуклеотид(ов), выбранный из полинуклеотида(ов), содержащего последовательность нуклеиновой кислоты из SEQ ID NO: 9, и полинуклеотида(ов), который содержит последовательность нуклеиновой кислоты, имеющую 90% или более идентичность с последовательностью нуклеиновой кислоты из SEQ ID NO: 9, и кодирует белок, имеющий такую же активность, как CPTL.
[12] Способ получения липидной мембранной структуры по [10] или [11], где полинуклеотид представляет собой полинуклеотид, кодирующий белок, составляющий композицию по [3] или [4], и содержит по меньшей мере один из следующих:
(c) один или несколько полинуклеотид(ов), выбранный из полинуклеотида(ов), содержащего последовательность нуклеиновой кислоты из SEQ ID NO: 1, и полинуклеотида(ов), который содержит последовательность нуклеиновой кислоты, имеющую 90% или более идентичность с последовательностью нуклеиновой кислоты из SEQ ID NO: 1, и кодирует белок, имеющий такую же активность, как CPT1;
(d) один или несколько полинуклеотид(ов), выбранный из полинуклеотида(ов), содержащего последовательность нуклеиновой кислоты из SEQ ID NO: 3, и полинуклеотида(ов), который содержит последовательность нуклеиновой кислоты, имеющую 90% или более идентичность с последовательностью нуклеиновой кислоты из SEQ ID NO: 3, и кодирует белок, имеющий такую же активность, как CPT2;
(e) один или несколько полинуклеотид(ов), выбранный из полинуклеотида(ов), содержащего последовательность нуклеиновой кислоты из SEQ ID NO: 11, и полинуклеотида(ов), который содержит последовательность нуклеиновой кислоты, имеющую 90% или более идентичность с последовательностью нуклеиновой кислоты из SEQ ID NO: 11, и кодирует белок, имеющий такую же активность, как REF1;
(f) один или несколько полинуклеотид(ов), выбранный из полинуклеотида(ов), содержащего последовательность нуклеиновой кислоты из SEQ ID NO: 13, и полинуклеотида(ов), который содержит последовательность нуклеиновой кислоты, имеющую 90% или более идентичность с последовательностью нуклеиновой кислоты из SEQ ID NO: 13, и кодирует белок, имеющий такую же активность, как REF2;
(g) один или несколько полинуклеотид(ов), выбранный из полинуклеотида(ов), содержащего последовательность нуклеиновой кислоты из SEQ ID NO: 15, и полинуклеотида(ов), который содержит последовательность нуклеиновой кислоты, имеющую 90% или более идентичность с последовательностью нуклеиновой кислоты из SEQ ID NO: 15, и кодирует белок, имеющий такую же активность, как REF8; и
(h) один или несколько полинуклеотид(ов), выбранный из полинуклеотида(ов), содержащего последовательность нуклеиновой кислоты из SEQ ID NO: 17, и полинуклеотида(ов), который содержит последовательность нуклеиновой кислоты, имеющую 90% или более идентичность с последовательностью нуклеиновой кислоты из SEQ ID NO: 17, и кодирует белок, имеющий такую же активность, как SRPP1.
[13] Способ получения липидной мембранной структуры по любому из [10] - [12], где сырьевой материал, содержащий фосфолипид, содержит липосому, и где липидная мембранная структура представляет собой протеолипосому.
[14] Клетка, экспрессирующая белок, составляющий композицию по любому из [1] - [5].
[15] Клетка по [14], содержащая единицу экспрессии, содержащую полинуклеотид, который кодирует каждый из белков в композиции белков по любому из [1] - [6].
[16] Клетка по [14] или [15], где полинуклеотид содержит (b) и любой из (a-1) и (a-2):
(a-1) один или несколько полинуклеотид(ов), выбранный из полинуклеотида(ов), содержащего последовательность нуклеиновой кислоты из SEQ ID NO: 5, и полинуклеотида(ов), который содержит последовательность нуклеиновой кислоты, имеющую 90% или более идентичность с последовательностью нуклеиновой кислоты из SEQ ID NO: 5, и кодирует белок, имеющий такую же активность, как CPT6;
(a-2) один или несколько полинуклеотид(ов), выбранный из полинуклеотида(ов), содержащего последовательность нуклеиновой кислоты из SEQ ID NO: 7, и полинуклеотида(ов), который содержит последовательность нуклеиновой кислоты, имеющую 90% или более идентичность с последовательностью нуклеиновой кислоты из SEQ ID NO: 7, и кодирует белок, имеющий такую же активность, как CPT7; и
(b) один или несколько полинуклеотид(ов), выбранный из полинуклеотида(ов), содержащего последовательность нуклеиновой кислоты из SEQ ID NO: 9, и полинуклеотида(ов), который содержит последовательность нуклеиновой кислоты, имеющую 90% или более идентичность с последовательностью нуклеиновой кислоты из SEQ ID NO: 9, и кодирует белок, имеющий такую же активность, как CPTL.
[17] Клетка по любому из [14] - [16], где полинуклеотид представляет собой полинуклеотид, кодирующий белок, составляющий композицию по [3] или [4], и дополнительно содержит по меньшей мере один из следующих:
(c) один или несколько полинуклеотид(ов), выбранный из полинуклеотида(ов), содержащего последовательность нуклеиновой кислоты из SEQ ID NO: 1, и полинуклеотида(ов), который содержит последовательность нуклеиновой кислоты, имеющую 90% или более идентичность с последовательностью нуклеиновой кислоты из SEQ ID NO: 1, и кодирует белок, имеющий такую же активность, как CPT1;
(d) один или несколько полинуклеотид(ов), выбранный из полинуклеотида(ов), содержащего последовательность нуклеиновой кислоты из SEQ ID NO: 3, и полинуклеотида(ов), который содержит последовательность нуклеиновой кислоты, имеющую 90% или более идентичность с последовательностью нуклеиновой кислоты из SEQ ID NO: 3, и кодирует белок, имеющий такую же активность, как CPT2;
(e) один или несколько полинуклеотид(ов), выбранный из полинуклеотида(ов), содержащего последовательность нуклеиновой кислоты из SEQ ID NO: 11, и полинуклеотида(ов), который содержит последовательность нуклеиновой кислоты, имеющую 90% или более идентичность с последовательностью нуклеиновой кислоты из SEQ ID NO: 11, и кодирует белок, имеющий такую же активность, как REF1;
(f) один или несколько полинуклеотид(ов), выбранный из полинуклеотида(ов), содержащего последовательность нуклеиновой кислоты из SEQ ID NO: 13, и полинуклеотида(ов), который содержит последовательность нуклеиновой кислоты, имеющую 90% или более идентичность с последовательностью нуклеиновой кислоты из SEQ ID NO: 13, и кодирует белок, имеющий такую же активность, как REF2;
(g) один или несколько полинуклеотид(ов), выбранный из полинуклеотида(ов), содержащего последовательность нуклеиновой кислоты из SEQ ID NO: 15, и полинуклеотида(ов), который содержит последовательность нуклеиновой кислоты, имеющую 90% или более идентичность с последовательностью нуклеиновой кислоты из SEQ ID NO: 15, и кодирует белок, имеющий такую же активность, как REF8; и
(h) один или несколько полинуклеотид(ов), выбранный из полинуклеотида(ов), содержащего последовательность нуклеиновой кислоты из SEQ ID NO: 17, и полинуклеотида(ов), который содержит последовательность нуклеиновой кислоты, имеющую 90% или более идентичность с последовательностью нуклеиновой кислоты из SEQ ID NO: 17, и кодирует белок, имеющий такую же активность, как SRPP1.
[18] Клетка по любому из [14] - [17], где единица экспрессии представляет собой гетерологичную единицу экспрессии.
[19] Клетка по [14], содержащая липидную мембранную структуру по [9].
[20] Способ получения клетки по [14], включающий взаимодействие клетки с липидной мембранной структурой по [9].
[21] Способ получения изопренового полимерного соединения, включающий проведение реакции полимеризации изопрена с использованием по меньшей мере одной, выбранной из композиции по любому из [1] - [6], структуры по любому из [7] - [9] и клетки по любому из [14] - [19].
[22] Способ получения по [21], где реакцию полимеризации изопрена проводят с использованием низкомолекулярного аллильного соединения в качестве субстрата.
[23] Набор для получения изопренового полимерного соединения, содержащий:
низкомолекулярное аллильное соединение; и
по меньшей мере одну, выбранную из композиции по любому из [1] - [6], структуры по любому из [7] - [9] и клетки по любому из [14] - [19].
[24] Способ получения каучука, включающий получение каучука с использованием изопренового полимерного соединения, полученного посредством способа получения по [21] или [22].
Обеспечивающие преимущество эффекты изобретения
[0009] По настоящему изобретению ожидают эффективное получение и стабильную поставку натурального каучука, таким образом, стабильную поставку ресурсов каучука, потребность в котором растет во всем мире.
Описание вариантов осуществления
[0010] [Композиция белков]
(Активность полимеризации изопрена)
Композиция белков по настоящему изобретению имеет активность полимеризации изопрена. Активность полимеризации изопрена, как правило, относится к активности, которая напрямую или опосредованно стимулирует реакцию полимеризации изопрена для получения изопренового полимерного соединения. Реакция полимеризации изопрена, как правило, представляет собой реакцию полимеризации изопрена в живых организмах. Примеры субстратов включают низкомолекулярные аллильные соединения, такие как изопентенилдифосфат (IPP), фарнезилдифосфат (FPP), диметилаллилдифосфат (DMAPP), геранилдифосфат (GPP) и геранилгеранилдифосфат (GGPP).
Примеры организмов включают каучуковые деревья (растения, способные продуцировать натуральный каучук), такие как растения рода Hevea (например, гевея бразильская (Hevea brasiliensis), Hevea benthamiana, Hevea guianensis), растения рода Ficus (например, фикус каучуконосный (Ficus elastica), фикус лировидный каучуконосный (Ficus lyrata) и фикус Бенджамина каучуконосный (Ficus benjamina), и организм не является ограниченным вышеуказанными растениями. Примеры организмов также включают клетки растений, клетки животных и микроорганизмы.
[0011] (Белок, составляющий композицию белков)
(Белки (A) и (B))
Композиция белков содержит белок(и) (B) и по меньшей мере один из белков (A-1) и (A-2):
(A-1) один или несколько белок(ов), выбранный из белка(ов), содержащего аминокислотную последовательность из SEQ ID NO: 6, и белка(ов), который содержит аминокислотную последовательность, имеющую 90% или более идентичность с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO: 6, и имеет такую же активность, как CPT6;
(A-2) один или несколько белок(ов), выбранный из белка(ов), содержащего аминокислотную последовательность из SEQ ID NO: 8, и белка(ов), который содержит аминокислотную последовательность, имеющую 90% или более идентичность с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO: 8, и имеет такую же активность, как CPT7; и
(B) один или несколько белок(ов), выбранный из белка(ов), содержащего аминокислотную последовательность из SEQ ID NO: 10, и белка(ов), который содержит аминокислотную последовательность, имеющую 90% или более идентичность с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO: 10, и имеет такую же активность, как CPTL.
[0012] Аминокислотные последовательности из SEQ ID NO: 6, 8 и 10 представляют собой аминокислотные последовательности цис-пренилтрансферазы (CPT) 6, CPT7 и CPTL, соответственно, происходящих из гевеи бразильской (Hevea brasiliensis).
[0013] Также, белки (A-1), (A-2) и (B) могут представлять собой белки, кодируемые полинуклеотидами (a-1), (a-2) и (b), кодирующими (A-1), (A-2) и (B), соответственно:
(a-1) один или несколько полинуклеотид(ов), выбранный из полинуклеотида(ов), содержащего последовательность нуклеиновой кислоты из SEQ ID NO: 5, и полинуклеотида(ов), который содержит последовательность нуклеиновой кислоты, имеющую 90% или более идентичность с последовательностью нуклеиновой кислоты из SEQ ID NO: 5, и кодирует белок, имеющий такую же активность, как CPT6;
(a-2) один или несколько полинуклеотид(ов), выбранный из полинуклеотида(ов), содержащего последовательность нуклеиновой кислоты из SEQ ID NO: 7, и полинуклеотида(ов), который содержит последовательность нуклеиновой кислоты, имеющую 90% или более идентичность с последовательностью нуклеиновой кислоты из SEQ ID NO: 7, и кодирует белок, имеющий такую же активность, как CPT7; и
(b) один или несколько полинуклеотид(ов), выбранный из полинуклеотида(ов), содержащего последовательность нуклеиновой кислоты из SEQ ID NO: 9, и полинуклеотида(ов), который содержит последовательность нуклеиновой кислоты, имеющую 90% или более идентичность с последовательностью нуклеиновой кислоты из SEQ ID NO: 9, и кодирует белок, имеющий такую же активность, как CPTL.
[0014] Последовательности нуклеиновой кислоты из SEQ ID NO: 5, 7 и 9 представляют собой полноразмерные последовательности нуклеиновой кислоты CPT6, CPT7 и CPTL, соответственно, происходящие из гевеи бразильской (Hevea brasiliensis).
[0015] (Другие белки)
Композиция белков может содержать второй (другой) белок(и), в дополнение к белкам (A-1), (A-2) и (B). Примеры другого белка(ов) включают белки, ответственные собственно за реакцию полимеризации изопрена in vivo, и белки, как известно, вспомогательные в реакции полимеризации. Примеры первых включают семейства CPT, отличные от CPT6, CPT7 и CPTL. Примеры последних включают по меньшей мере один, выбранный из семейства фактора элонгации каучука (REF) и семейства белка малых частиц каучука (SRPP). Среди них, по меньшей мере один из белков (C) - (H) является предпочтительным:
(C) один или несколько белок(ов), выбранный из белка(ов), содержащего аминокислотную последовательность из SEQ ID NO: 2, и белка(ов), который содержит аминокислотную последовательность, имеющую 90% или более идентичность с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO: 2, и имеет такую же активность, как CPT1;
(D) один или несколько белок(ов), выбранный из белка(ов), содержащего аминокислотную последовательность из SEQ ID NO: 4, и белка(ов), который содержит аминокислотную последовательность, имеющую 90% или более идентичность с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO: 4, и имеет такую же активность, как CPT2;
(E) один или несколько белок(ов), выбранный из белка(ов), содержащего аминокислотную последовательность из SEQ ID NO: 12, и белка(ов), который содержит аминокислотную последовательность, имеющую 90% или более идентичность с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO: 12, и имеет такую же активность, как REF1;
(F) один или несколько белок(ов), выбранный из белка(ов), содержащего аминокислотную последовательность из SEQ ID NO: 14, и белка(ов), который содержит аминокислотную последовательность, имеющую 90% или более идентичность с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO: 14, и имеет такую же активность, как REF2;
(G) один или несколько белок(ов), выбранный из белка(ов), содержащего аминокислотную последовательность из SEQ ID NO: 16, и белка(ов), который содержит аминокислотную последовательность, имеющую 90% или более идентичность с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO: 16, и имеет такую же активность, как REF8; и
(H) один или несколько белок(ов), выбранный из белка(ов), содержащего аминокислотную последовательность из SEQ ID NO: 18, и белка(ов), который содержит аминокислотную последовательность, имеющую 90% или более идентичность с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO: 18, и имеет такую же активность, как SRPP1.
Аминокислотные последовательности из SEQ ID NO: 2, 4, 12, 14, 16 и 18 включают зрелые белки CPT1, CPT2, REF1, REF2, REF8 и SRPP1, соответственно, происходящие из гевеи бразильской (Hevea brasiliensis).
[0016] Также, белки (C) - (H) могут представлять собой белки, кодируемые полинуклеотидами (c) - (h), кодирующими (C) - (H), соответственно:
(c) один или несколько полинуклеотид(ов), выбранный из полинуклеотида(ов), содержащего последовательность нуклеиновой кислоты из SEQ ID NO: 1, и полинуклеотида(ов), который содержит последовательность нуклеиновой кислоты, имеющую 90% или более идентичность с последовательностью нуклеиновой кислоты из SEQ ID NO: 1, и кодирует белок, имеющий такую же активность, как CPT1;
(d) один или несколько полинуклеотид(ов), выбранный из полинуклеотида(ов), содержащего последовательность нуклеиновой кислоты из SEQ ID NO: 3, и полинуклеотида(ов), который содержит последовательность нуклеиновой кислоты, имеющую 90% или более идентичность с последовательностью нуклеиновой кислоты из SEQ ID NO: 3, и кодирует белок, имеющий такую же активность, как CPT2;
(e) один или несколько полинуклеотид(ов), выбранный из полинуклеотида(ов), содержащего последовательность нуклеиновой кислоты из SEQ ID NO: 11, и полинуклеотида(ов), который содержит последовательность нуклеиновой кислоты, имеющую 90% или более идентичность с последовательностью нуклеиновой кислоты из SEQ ID NO: 11, и кодирует белок, имеющий такую же активность, как REF1;
(f) один или несколько полинуклеотид(ов), выбранный из полинуклеотида(ов), содержащего последовательность нуклеиновой кислоты из SEQ ID NO: 13, и полинуклеотида(ов), который содержит последовательность нуклеиновой кислоты, имеющую 90% или более идентичность с последовательностью нуклеиновой кислоты из SEQ ID NO: 13, и кодирует белок, имеющий такую же активность, как REF2;
(g) один или несколько полинуклеотид(ов), выбранный из полинуклеотида(ов), содержащего последовательность нуклеиновой кислоты из SEQ ID NO: 15, и полинуклеотида(ов), который содержит последовательность нуклеиновой кислоты, имеющую 90% или более идентичность с последовательностью нуклеиновой кислоты из SEQ ID NO: 15, и кодирует белок, имеющий такую же активность, как REF8; и
(h) один или несколько полинуклеотид(ов), выбранный из полинуклеотида(ов), содержащего последовательность нуклеиновой кислоты из SEQ ID NO: 17, и полинуклеотида(ов), который содержит последовательность нуклеиновой кислоты, имеющую 90% или более идентичность с последовательностью нуклеиновой кислоты из SEQ ID NO: 17, и кодирует белок, имеющий такую же активность, как SRPP1.
[0017] Последовательности нуклеиновой кислоты из SEQ ID NO: 1, 3, 11, 13, 15 и 17 представляют собой полноразмерные последовательности нуклеиновой кислоты CPT1, CPT2, REF1, REF2, REF8 и SRPP1, соответственно, происходящие из гевеи бразильской (Hevea brasiliensis).
Композиция белков, предпочтительно, содержит два, три, четыре или пять, или более белков (C) - (H), более предпочтительно, содержит комбинацию по меньшей мере одного из (C) и (D), и по меньшей мере одного из (E) - (H), и еще более предпочтительно, содержит все.
[0018] (% идентичности)
Идентичность последовательностей аминокислот и нуклеотидов может составлять 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%, или более. Идентичность можно определять в условиях по умолчанию с использованием, например, NCBI BLAST (см. http://www.ncbi.nlm.nih.gov).
[0019] (Активность, которой обладает мутантный белок)
Термин «имеющий некоторую активность», как каждый белок, означает имеющий 50% или более, 60% или более, 70% или более, 80% или более, 90% или более, 95% или более, или 100% от активности каждого белка, измеренной в таких же условиях.
[0020] (Мутация)
Вышеуказанные белки могут иметь мутации, вводимые в участок в каталитическом домене и в участок вне каталитического домена, при условии, что они сохраняют некоторую активность. Специалист в данной области может определять положение аминокислотного остатка, в котором мутацию можно вводить в белок, с сохранением в то же время целевой активности. Например, специалист в данной области может 1) сравнивать аминокислотные последовательности (например, аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 6 или 8, и аминокислотные последовательности других белков, вовлеченных в реакцию полимеризации изопрена) множества белков, имеющих сходную активность, 2) идентифицировать относительно консервативную область(и) и область(и), не консервативные, и затем 3) прогнозировать области, способные и неспособные играть важные роли в функции, из относительно консервативной области(ей) и области(ей), не консервативных, для распознавания корреляции структуры и/или функции и определения области(ей), в которую можно вводить мутацию.
[0021] Мутация, вводимая в белок, может представлять собой замену аминокислотного остатка на другой аминокислотный остаток, предпочтительно, замену на аминокислотный остаток, имеющий сходную боковую цепь. Примеры классификации аминокислот по аминокислотным остаткам со сходными боковыми цепями включают: аминокислоты с основными боковыми цепями, такие как лизин, аргинин и гистидин; аминокислоты с кислыми боковыми цепями, такие как аспарагиновая кислота и глутаминовая кислота; аминокислоты с незаряженными полярными боковыми цепями, такие как аспарагин, глутамин, серин, треонин, тирозин и цистеин; аминокислоты с неполярными боковыми цепями, такие как глицин, аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин и триптофан; аминокислоты с бета-разветвленными боковыми цепями, такие как лейцин, валин и изолейцин; аминокислоты с ароматическими боковыми цепями, такие как тирозин и фенилаланин, триптофан и гистидин; аминокислоты с содержащими гидроксильную группу боковыми цепями (например, содержащими спирт, фенокси-группу боковыми цепями), такие как серин, треонин и тирозин; и аминокислоты с содержащими серу боковыми цепями, такие как цистеин и метионин.
[0022] Последовательности нуклеиновой кислоты можно модифицировать для оптимизации кодонного состава. Оптимизация кодонного состава в настоящем описании относится к модификации, включающей оптимизацию экспрессии в целевой определенной клетке без изменения последовательности кодированного полипептида. Специалист в данной области может понимать частоту использования кодонов в клетке, подлежащей трансдукции, и легко определять последовательность, полученную после оптимизации, с использованием вырожденности генетического кода. Примеры целевых клеток включают микроорганизмы, такие как E. coli, клетки растений и клетки животных.
[0023] (Модификация белка)
Каждый из белков, составляющий композицию белков, может иметь метку для очистки на C-конце. Примеры метки для очистки включают гистидиновые метки; эпитопы HA, FLAG, V5 и myc; связывающий хитин белок (CBP); связывающий мальтозу белок (MBP); глутатион-S-трансферазу (GST); и метки Strep. Композиция белков может содержать другие факторы, напрямую или опосредованно вовлеченные в реакцию полимеризации изопрена, в дополнение к перечисленным выше.
[0024] (Липидная мембранная структура)
Липидная мембранная структура по настоящему изобретению представляет собой структуру, включающую липидные мембраны, которая содержит вышеуказанную композицию белков. Использование липидной мембранной структуры позволяет композиции белков способствовать активности полимеризации изопрена и достигать эффективной полимеризации изопрена.
[0025] Липидная мембрана может представлять собой монослойную мембрану или бислойную мембрану. Примеры структуры монослойной мембраны включают частицы каучука (частицы, экстрагированные из латекса, происходящего из каучукового дерева). Примеры структуры бислойной мембраны включают протеолипосомы и искусственные модели липидной мембраны. Искусственные модели липидной мембраны могут состоять из любых, или и тех и других, из природных липидов и синтетических липидов, и не являются конкретно ограниченными. Липидная мембранная структура, предпочтительно, представляет собой структуру бислойной мембраны, более предпочтительно, протеолипосомы.
[0026] (Протеолипосома)
В настоящем описании, протеолипосома относится к искусственной везикуле, в которой белок является инкапсулированным или связанным с частью липидного бислоя липосомы. В настоящем описании, липосома относится к искусственной везикуле, в которой водный компонент (обычно вода) захватывается в пространство, сформированное липидной бислойной мембраной. Липидная бислойная мембрана, как правило, состоит из липид(а), такого как фосфолипид. Пример фосфолипида включает фосфатидилэтаноламин, фосфатидилхолин, фосфатидилсерин, кардиолипин или их комбинации. Пример липида, отличного от фосфолипида, включает триацилглицерин, воски, сфинголипиды и стеролы, и их сложные эфиры с жирными кислотами, или их комбинации. Липид, составляющий липидную бислойную мембрану, предпочтительно, включает биогенный фосфолипид, более предпочтительно, включает происходящий из сои фосфолипид.
[0027] Размер липосомы не является конкретно ограниченным, но, как правило, составляет 50-300 нм в диаметре. Липосома может являться природной или синтетической, и, предпочтительно, представляет собой первую, более предпочтительно, липосому, происходящую из растения, такого как соя. Синтезированная липосома может представлять собой, например, липосому на основе полиалкиленгликоля.
[0028] Форма композиции белков в мембранной липидной структуре не является конкретно ограниченной, но подразумевают, что она представляет собой форму, в которой композиция белков является связанной с гидрофильными группами фосфолипидов на поверхности липосомы (некоторые могут быть погружены во внутреннюю часть мембраны), в случае липосомы.
[0029] (Способ получения)
Способ получения мембранной липидной структуры может представлять собой способ, включающий экспрессию полинуклеотида, кодирующего белок, составляющий композицию, в бесклеточной системе продукции белка в присутствии исходных материалов, включающих, например, фосфолипиды.
[0030] Исходные материалы, включающие фосфолипиды, включают липосому, если мембранная структура представляет собой протеолипосому. Липосома, предпочтительно, представляет собой природную липосому, как описано выше, и предпочтительно, липосому, происходящую из растения, такого как соя.
[0031] Способ получения протеолипосомы, предпочтительно, включает экспрессию единицы экспрессии, содержащей полинуклеотид, в бесклеточной системе продукции белка в присутствии липосомы.
[0032] Единица экспрессии содержит по меньшей мере полинуклеотиды, кодирующие белки, содержащиеся в композиции белков. Полинуклеотиды относятся к полинуклеотидам, кодирующим белки, составляющим композицию белков, включают (b) и любой из (a-1) и (a-2), описанных выше, и дополнительно включают по меньшей мере один из (c) - (h) по необходимости. Единица экспрессии типично включает промотор. Это позволяет эффективную продукцию продукта экспрессии полинуклеотида, кодируемого полинуклеотидами. Примеры промотора включают промотор tac, промотор lac, промотор trp, промотор trc, промотор T7, промотор T5, промотор T3 и промотор SP6, и могут включать энхансер. Промотор является связанным с полинуклеотидом в форме, способной к его экспрессии. Например, промотор может являться связанным с вышележащей (5')-стороны кодирующей последовательности. Единица экспрессии может представлять собой ДНК или РНК, но предпочтительно, представляет собой ДНК. Единица экспрессии может содержать такие факторы, как терминаторы, участки связывания рибосом, гены устойчивости к лекарственному средству, сигналы процессинга РНК, последовательности, улучшающие эффективность трансляции, последовательности, улучшающие стабильность белка, и последовательности, улучшающие секрецию белка.
[0033] Бесклеточную систему продукции белка, предпочтительно, осуществляют с использованием экстракта клеток (например, экстракта зародышей пшеницы, экстракта E. coli, экстракта ретикулоцитов кролика и экстракта клеток насекомых) посредством способа бислоя-диализа и можно осуществлять с использованием набора для бесклеточной экспрессии белка, коммерчески доступного.
[0034] Является возможным использование другой системы построения белков, такой как искусственная модель липидной мембраны, вместо липосомы. Композицию белков в искусственной модели липидной мембраны можно формировать в соответствии с общепринятым способом. Искусственная модель липидной мембраны может состоять из любых, или и тех и других, из природных липидов, синтетических липидов, и не является конкретно ограниченной.
[0035] (Клетка)
Клетка по настоящему изобретению представляет собой клетку, которая экспрессирует каждый из белков, составляющих композицию белков (белки (A) и (B), и по меньшей мере один белок из (C) - (H), по необходимости). Примеры клетки включают клетки микроорганизмов, таких как E. coli и дрожжи, клетки растений и клетки животных.
[0036] Клетка, предпочтительно, содержит единицу экспрессии, содержащую полинуклеотид(ы). Единица экспрессии является такой же, как объяснено для протеолипосомы. Единица экспрессии, которая может содержаться в клетках, предпочтительно, представляет собой гетерологичную единицу экспрессии. Гетерологичная единица экспрессии в настоящем описании относится к единице экспрессии, в которой по меньшей мере один из полинуклеотидов, кодирующий каждый из белков, и промотор, содержащийся в норме, не являются присущими клетке-хозяину. Предпочтительно, оба не являются присущими клетке-хозяину.
[0037] Способ получения клетки может представлять собой способ трансформации с использованием экспрессирующего вектора, содержащего единицу экспрессии, которая содержит полинуклеотид, кодирующий каждый из белков, например, составляющих вышеуказанные композиции белков. Поскольку композиция белков содержит по меньшей мере два белка, как описано выше, экспрессирующий вектор может представлять собой один (содержащий единицу экспрессии, содержащую полинуклеотиды, кодирующие все белки) или два, или более (содержащие единицу экспрессии, содержащую полинуклеотиды для каждого или для каждых нескольких). Экспрессирующий вектор может представлять собой интегрирующий вектор или неинтегрирующий вектор. В экспрессирующем векторе, полинуклеотид(ы) могут быть помещены под контроль конститутивного промотора или индуцируемого промотора.
[0038] Хозяина можно трансформировать с использованием экспрессирующего вектора посредством одного или нескольких хорошо известного способа(ов). Примеры таких способов включают способ с использованием фосфата кальция, способ с использованием липосом, способ с использованием DEAE-декстрана, способ электропорации и способ с использованием пушки для частиц (генной пушки). Трансформацию можно осуществлять посредством способа инфекции для введения в клетки бактерий с использованием фагового вектора, в дополнение к плазмидному вектору.
[0039] Клетка может также представлять собой клетку, содержащую протеолипосому, описанную выше. Протеолипосому, предпочтительно, получают из природной липосомы. Это способствует взаимодействию с мембраной клетки. Клетку, содержащую протеолипосому, можно получать посредством взаимодействия протеолипосомы с мембраной клетки. Примеры способов взаимодействия включают адсорбцию или связывание липосомы с поверхностью клетки, поглощение липосомы клеткой (эндоцитоз или фагоцитоз), и слияние липидной бислойной мембраны липосомы с мембраной клетки.
[0040] [Способ получения изопренового полимерного соединения]
Вышеуказанные композицию белков, протеолипосому и клетки можно использовать для получения изопренового полимерного соединения.
[0041] При получении изопренового полимерного соединения, низкомолекулярное аллильное соединение используют в качестве субстрата для проведения реакции полимеризации изопрена. Примеры низкомолекулярного аллильного соединения включают изопренилдифосфат и фарнезилдифосфат, оба из которых предпочтительно используют. Условия, такие как температура реакции и время реакции, можно устанавливать соответствующим образом. Типичным изопреновым полимерным соединением является цис-полиизопрен, который можно использовать в качестве сырьевого материала для каучука. Другие примеры изопренового полимерного соединения включают долихол, полипренол и их производные, которые имеют физиологическую активность (например, иммунную активность, противовирусную активность и антиоксидантную активность) в организме, и которые, таким образом, можно использовать в качестве материалов для фармацевтических средств и продуктов диетического питания. Их можно также использовать в качестве добавки (например, пластификатора, улучшающего сочетаемость средства) для продуктов каучука.
[0042] [Набор для получения изопренового полимерного соединения]
Вышеуказанные композицию белков, протеолипосому и клетки можно использовать в качестве набора для получения изопренового полимерного соединения. Набор, как правило, содержит низкомолекулярное аллильное соединение в качестве субстрата. Набор может дополнительно содержать реакционный сосуд и необходимые реагенты.
[0043] [Способ получения каучука]
Изопреновое полимерное соединение, полученное посредством вышеуказанного способа получения изопренового полимерного соединения, можно использовать для получения каучука. Способ и условия для получения каучука из изопренового полимерного соединения могут находиться в соответствии с общепринятым способом, например, таким как способ пластификации изопренового полимерного соединения, перекрестного сшивания и затем отливки. Примеры добавок, которые можно использовать по необходимости, включают упрочняющие средства, связывающие силан средства, наполнители, вулканизующие средства, ускорители вулканизации, вспомогательные средства для ускорителей вулканизации, масла, отверждающиеся смолы, воски, замедляющие старение средства и окрашивающие средства. Эти добавки добавляют на соответствующих стадиях. Полученный каучук можно использовать для различных применений, например, шин, строительных материалов, спортивных товаров и автомобильных деталей.
[Примеры]
[0044] Примеры 1-11
(1) Получение гена белка биосинтеза натурального каучука
Семь белков (CPT1, CPT2, CPTL, REF1, REF2, REF8 и SRPP1), способных к продукции в латексе с высокими выходами, были выбраны из базы данных «Rubber Database» (http://Matsui-lab.riken.jp/rubber/home.html). Два белка (CPT6 и CPT7) также были выбраны по филогенетическому анализу.
[0045] ПЦР проводили с использованием плазмид, содержащих гены, кодирующие белки, или их кДНК, в качестве матриц, для получения генов CPT1, CPT2, CPT6, CPT7, CPTL, REF1, REF2, REF8 и SRPP1. ПЦР проводили в соответствии с инструкциями для ДНК-полимеразы PrimeSTAR Max (Takara Bio Inc.) или готовой смеси для ПЦР KOD One (TOYOBO CO., LTD.). Участок расщепления для рестрикционного фермента и последовательность метки His добавляли к праймеру по необходимости.
[0046] Следующие наборы праймеров использовали для получения генов CPT1, CPT2, CPT6, CPT7, CPTL, REF1, REF2, REF8 и SRPP1: набор из праймеров 1 и 2, набор из праймеров 3 и 4, набор из праймеров 5 и 6, набор из праймеров 7 и 8, набор из праймеров 9 и 10, набор из праймеров 11 и 12, набор из праймеров 13 и 14, набор из праймеров 15 и 16, и набор из праймеров 17 и 18, соответственно.
[0047] (Набор праймеров для получения гена CPT1)
Праймер 1: 5'-atggaattatacaacggtg-3' (SEQ ID NO: 19)
Праймер 2: 5'-atctcgagttaatgatgatgatgatgatgttttaag-3' (SEQ ID NO: 20)
[0048] (Набор праймеров для получения гена CPT2)
Праймер 3: 5'-atggaaatatatacgggtcag-3' (SEQ ID NO: 21)
Праймер 4: 5'-atctcgagttaatgatgatgatgatgatgttttaaatattc-3' (SEQ ID NO: 22)
[0049] (Набор праймеров для получения гена CPT6)
Праймер 5: 5'-atggaaaaacatagcagtag-3' (SEQ ID NO: 23)
Праймер 6: 5'-atctcgagttatataactgatgctttttc-3' (SEQ ID NO: 24)
[0050] (Набор праймеров для получения гена CPT7)
Праймер 7: 5'-atgcaatccttgcacttg-3' (SEQ ID NO: 25)
Праймер 8: 5'-atctcgagttatgtaagtcgtctaccatag-3' (SEQ ID NO: 26)
[0051] (Набор праймеров для получения гена CPTL)
Праймер 9: 5'-atggatttgaaacctgg-3' (SEQ ID NO: 27)
Праймер 10: 5'-atctcgagttaatgatgatgatgatgatgtgtac-3' (SEQ ID NO: 28)
[0052] (Набор праймеров для получения гена REF1)
Праймер 11: 5'-atggctgaaggtgaagaagaggtgaatatc-3' (SEQ ID NO: 29)
Праймер 12: 5'-atctcgagtcacccatctccatatagcac-3' (SEQ ID NO: 30)
[0053] (Набор праймеров для получения гена REF2)
Праймер 13: 5'-atggctgaagacgaagacaaccaacaag-3' (SEQ ID NO: 31)
Праймер 14: 5'-atctcgagtcaattctctccataaaacac-3' (SEQ ID NO: 32)
[0054] (Набор праймеров для получения гена REF8)
Праймер 15: 5'-atggctgaagggaaagaaaacgagaatttc-3' (SEQ ID NO: 33)
Праймер 16: 5'-atctcgagttactctgcactttccttcac-3' (SEQ ID NO: 34)
[0055] (Набор праймеров для получения гена SRPP1)
Праймер 17: 5'-atggctgaagaggtggaggaagagaggc-3' (SEQ ID NO: 35)
Праймер 18: 5'-atctcgagttatgatgcctcatctccaaac-3' (SEQ ID NO: 36)
[0056] Для каждого гена, полученного способом, описанным выше, идентифицировали последовательность, и идентифицировали полноразмерную последовательность нуклеиновой кислоты и аминокислотную последовательность. SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15 и 17 представляют собой последовательности нуклеиновой кислоты генов CPT1, CPT2, CPT6, CPT7, CPTL, REF1, REF2, REF8 и SRPP1, соответственно. SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16 и 18 представляют собой аминокислотные последовательности для генов CPT1, CPT2, CPT6, CPT7, CPTL, REF1, REF2, REF8 и SRPP1, соответственно.
[0057] (2) Получение плазмид для бесклеточного синтеза белка
Каждый из продуктов реакций ПЦР для генов, полученных в вышеуказанном (1), обрабатывали с использованием рестрикционного фермента XhoI, участок для которого добавляли в праймер. Комбинации, перечисленные в таблице 1, были выбраны для вставки в вектор для бесклеточной экспрессии pEU-E01-MCS, обработанный с использованием рестрикционных ферментов EcoRV и XhoI, для получения плазмид для бесклеточного синтеза белка.
[0058] (3) Трансформация E. coli
Полученные плазмиды трансформировали в E. coli JM 109. Трансформант культивировали в среде LB с агаром, содержащей ампициллин, для отбора трансформанта, в который была введена целевая плазмида, посредством ПЦР колоний.
[0059] (4) Получение плазмиды для бесклеточного синтеза белка
E. coli, трансформированную плазмидой, содержащей целевой ген, культивировали в жидкой среде LB при 37°C в течение ночи. Бактериальные клетки собирали для выделения плазмид. Плазмиды выделяли с использованием набора для выделения плазмид в мини-масштабе FastGene (Nippon Genetics Co., Ltd.). Отсутствие мутаций в последовательности гена, вставленной в выделенную плазмиду, подтверждали посредством анализа секвенирования.
[0060] (5) Трансформация E. coli
Плазмиду, полученную как выше, использовали для трансформации E. coli JM109. Трансформант культивировали в среде LB с агаром, содержащей ампициллин.
[0061] (6) Выделение плазмиды для бесклеточного синтеза белка
E. coli, трансформированную плазмидой, содержащей целевой ген, культивировали в жидкой среде LB при 37°C в течение ночи. Бактериальные клетки собирали для выделения плазмиды. Плазмиду выделяли с использованием набора для выделения плазмид в миди-масштабе QIAGEN (QIAGEN) и доводили до 1 мкг/мкл.
[0062] (7) Синтез мембранного белка (протеолипосомы) в присутствии липосомы посредством способа бислоя-диализа
Липидную бислойную мембрану (липосому: приблизительно несколько сотен нм в диаметре) получали с использованием происходящих из сои фосфолипидов. Бесклеточный синтез белка проводили в условиях добавления липосомы, в соответствии с протоколом, поставленным с набором для экспрессии ProteoLiposome BD (CellFree Sciences Co., Ltd.). Плазмиды для экспрессии девяти белков, используемые в качестве матриц, получали при 1 мкг/мкл и использовали в соответствии с комбинациями, перечисленными в таблице 1, в эквивалентном соотношении, так что суммарный объем составлял приблизительно 13 мкл. Например, в примере 3, 1,5 мкл для каждого из 9 видов, 13,5 мкл всего, добавляли в реакционную систему для транскрипции. После завершения реакции синтеза, простую очистку протеолипосом с 9 белками, связанными с липосомами, проводили в соответствии с предоставленным протоколом, и синтез подтверждали посредством SDS-PAGE.
[0063] (8) Измерение активности полимеризации изопрена
Активность полимеризация изопрена синтезированных в бесклеточной системе белков определяли посредством следующего способа.
Трис-HCl (pH 7,5) при конечной концентрации 50 мМ смешивали с MgCl2 при конечной концентрации 10 мМ, DTT при конечной концентрации 2 мМ, фарнезилдифосфатом (FPP) при конечной концентрации 10 мкМ, 14C-изопентенилдифосфатом (14C-IPP) (специфическая активность: 1,48-2,22 ГБк/ммоль) при конечной концентрации 50 мкМ и 5 мкл протеолипосомы для получения 100 мкл реакционного раствора. Реакционному раствору позволяли подвергаться реакции при 30°C в течение 24 часов.
[0064] После реакции, добавляли 200 мкл насыщенного солевого раствора, и продукт реакции экстрагировали с использованием 300 мкл насыщенного водой н-бутанола. 400 мкл 2 М NaCl добавляли к собранному слою насыщенного водой н-бутанола для суспендирования, для сбора слоя насыщенного водой н-бутанола. К 50 мкл собранного раствора, добавляли 5 мл раствора Clear sol II (Nacalai Tesque, Inc.) и хорошо перемешивали. Раствор смеси использовали для измерения радиоактивности (dpm) с использованием жидкостного сцинтилляционного счетчика (LSC-8000, Aloka Co., Ltd.). Реакционную систему без добавления протеолипосомы использовали в качестве отрицательного контроля. В таблице 1 представлены результаты для протеолипосомы, содержащей различные белки.
[0065] (9) Радиограмма TLC продукта реакции полимеризации изопрена
Органический слой выпаривали из насыщенного водой раствора в н-бутаноле, собранного, как выше, с использованием центробежного испарителя. 1,5 мл реакционного раствора получали посредством смешивания ацетата натрия (pH 5,5) при конечной концентрации 100 мМ с кислой фосфатазой при конечной концентрации 1 ед. и 1 мл метанола, полученного из картофеля, и затем позволяли прохождение реакции при 37°C в течение 17 часов.
[0066] После реакции, 500 мкл гексана добавляли для экстракции. Полученный слой гексана концентрировали досуха с использованием центробежного испарителя. Высушенный материал повторно растворяли в 10 мкл гексана, и все количество раствора наносили пятнами на пластину для TLC (Merck, стеклянная пластина для TLC RP-18F254S 5×10 см). Пятна, проявленные посредством ацетона:воды=19:1, подвергали экспонированию света на рентгенографической пластине и визуализировали с использованием сканера (Typhoon FLA9500).
[0067] Сравнительный пример 1 (отрицательный контроль)
Проводили такие же операции, как в примере, описанном выше, за исключением того, что протеолипосому не добавляли.
[0068] Сравнительные примеры 2-9 (отличные от отрицательного контроля)
Плазмиды для бесклеточного синтеза белков получали при 1 мкг/мкл. Суммарное количество плазмид в реакции составляло 13,5 мкл, и каждую плазмиду добавляли в одинаковом количестве. Затем, проводили такие же операции, как в примере, описанном выше.
[0069] [Таблица 1]
[0070] Как явно показано в таблице 1, радиоактивность в каждом примере была выше, чем в сравнительных примерах, выявляя, что продукт (предположительно имеющий молекулярную массу 1000-2000) был синтезирован. Для комбинации CPT6 и CPTL в примере 1, и комбинации CPT7 и CPTL в примере 2 показана более высокая радиоактивность, чем в сравнительных примерах, демонстрирующая, что каждая комбинация имеет активность полимеризации изопрена. Кроме того, для других комбинаций белков в примерах 3-11 также показана более высокая радиоактивность, чем в сравнительных примерах. Для некоторых из них показана более высокая радиоактивность, чем в примерах 1 и 2, демонстрирующая, что белки, отличные от CPT6, 7 и CPTL, также являются способными стимулировать активность полимеризации изопрена.
Эти результаты выявили, что настоящее изобретение обеспечивает эффективную продукцию натурального каучука.
[0071] SEQ ID NO: 1: Последовательность нуклеиновой кислоты CPT1
SEQ ID NO: 2: Аминокислотная последовательность CPT1
SEQ ID NO: 3: Последовательность нуклеиновой кислоты CPT2
SEQ ID NO: 4: Аминокислотная последовательность CPT2
SEQ ID NO: 5: Последовательность нуклеиновой кислоты CPT6
SEQ ID NO: 6: Аминокислотная последовательность CPT6
SEQ ID NO: 7: Последовательность нуклеиновой кислоты CPT7
SEQ ID NO: 8: Аминокислотная последовательность CPT7
SEQ ID NO: 9: Последовательность нуклеиновой кислоты CPTL
SEQ ID NO: 10: Аминокислотная последовательность CPTL
SEQ ID NO: 11: Последовательность нуклеиновой кислоты REF1
SEQ ID NO: 12: Аминокислотная последовательность REF1
SEQ ID NO: 13: Последовательность нуклеиновой кислоты REF2
SEQ ID NO: 14: Аминокислотная последовательность REF2
SEQ ID NO: 15: Последовательность нуклеиновой кислоты REF8
SEQ ID NO: 16: Аминокислотная последовательность REF8
SEQ ID NO: 17: Последовательность нуклеиновой кислоты SRPP1
SEQ ID NO: 18: Аминокислотная последовательность SRPP1
SEQ ID NO: 19: Праймер 1 (для получения гена CPT1)
SEQ ID NO: 20: Праймер 2 (для получения гена CPT1)
SEQ ID NO: 21: Праймер 3 (для получения гена CPT2)
SEQ ID NO: 22: Праймер 4 (для получения гена CPT2)
SEQ ID NO: 23: Праймер 5 (для получения гена CPT6)
SEQ ID NO: 24: Праймер 6 (для получения гена CPT6)
SEQ ID NO: 25: Праймер 7 (для получения гена CPT7)
SEQ ID NO: 26: Праймер 8 (для получения гена CPT7)
SEQ ID NO: 27: Праймер 9 (для получения гена CPTL)
SEQ ID NO: 28: Праймер 10 (для получения гена CPTL)
SEQ ID NO: 29: Праймер 11 (для получения гена REF1)
SEQ ID NO: 30: Праймер 12 (для получения гена REF1)
SEQ ID NO: 31: Праймер 13 (для получения гена REF2)
SEQ ID NO: 32: Праймер 14 (для получения гена REF2)
SEQ ID NO: 33: Праймер 15 (для получения гена REF8)
SEQ ID NO: 34: Праймер 16 (для получения гена REF8)
SEQ ID NO: 35: Праймер 17 (для получения гена SRPP1)
SEQ ID NO: 36: Праймер 18 (для получения гена SRPP1)
--->
СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> Sumitomo Riko Company Limited
<120> КОМПОЗИЦИЯ БЕЛКОВ С АКТИВНОСТЬЮ ПОЛИМЕРИЗАЦИИ ИЗОПРЕНА И ЕЕ
ПРИМЕНЕНИЕ
<130> PSJA-22474
<140> PCT/JP2021/038921
<141> 2021-10-21
<150> JP 2020-183088
<151> 2020-10-30
<160> 36
<170> PatentIn версии 3.5
<210> 1
<211> 873
<212> ДНК
<213> Hevea brasiliensis
<400> 1
atggaattat acaacggtga gaggccaagt gtgttcagac ttttagggaa gtatatgaga 60
aaagggttat atagcatcct aacccagggt cccatcccta ctcatattgc cttcatattg 120
gatggaaaca ggaggtttgc taagaagcat aaactgccag aaggaggtgg tcataaggct 180
ggatttttag ctcttctgaa cgtactaact tattgctatg agttaggagt gaaatatgcg 240
actatctatg cctttagcat cgataatttt cgaaggaaac ctcatgaggt tcagtacgta 300
atggatctaa tgctggagaa gattgaaggg atgatcatgg aagaaagtat catcaatgca 360
tatgatattt gcgtacgttt tgtgggtaac ctgaagcttt taagtgagcc agtcaagacc 420
gcagcagata agattatgag ggctactgcc aacaattcca aatgtgtgct tctcattgct 480
gtatgctata cttcaactga tgagatcgtg catgctgttg aagaatcctc tgaattgaac 540
tccaatgaag tttgtaacaa tcaagaattg gaggaggcaa atgcaactgg aagcggtact 600
gtgattcaaa ttgagaacat ggagtcgtat tctggaataa aacttgtaga ccttgagaaa 660
aacacctaca taaatcctta tcctgatgtt ctgattcgaa cttctgggga gacccgtctg 720
agcaactact tactttggca gactactaat tgcatactgt attctcctca tgcactgtgg 780
ccagagattg gtcttcgaca cgtggtgtgg gcagtaatta actgccaacg tcattattct 840
tacttggaga aacataagga atacttaaaa taa 873
<210> 2
<211> 290
<212> PRT
<213> Hevea brasiliensis
<400> 2
Met Glu Leu Tyr Asn Gly Glu Arg Pro Ser Val Phe Arg Leu Leu Gly
1 5 10 15
Lys Tyr Met Arg Lys Gly Leu Tyr Ser Ile Leu Thr Gln Gly Pro Ile
20 25 30
Pro Thr His Ile Ala Phe Ile Leu Asp Gly Asn Arg Arg Phe Ala Lys
35 40 45
Lys His Lys Leu Pro Glu Gly Gly Gly His Lys Ala Gly Phe Leu Ala
50 55 60
Leu Leu Asn Val Leu Thr Tyr Cys Tyr Glu Leu Gly Val Lys Tyr Ala
65 70 75 80
Thr Ile Tyr Ala Phe Ser Ile Asp Asn Phe Arg Arg Lys Pro His Glu
85 90 95
Val Gln Tyr Val Met Asp Leu Met Leu Glu Lys Ile Glu Gly Met Ile
100 105 110
Met Glu Glu Ser Ile Ile Asn Ala Tyr Asp Ile Cys Val Arg Phe Val
115 120 125
Gly Asn Leu Lys Leu Leu Ser Glu Pro Val Lys Thr Ala Ala Asp Lys
130 135 140
Ile Met Arg Ala Thr Ala Asn Asn Ser Lys Cys Val Leu Leu Ile Ala
145 150 155 160
Val Cys Tyr Thr Ser Thr Asp Glu Ile Val His Ala Val Glu Glu Ser
165 170 175
Ser Glu Leu Asn Ser Asn Glu Val Cys Asn Asn Gln Glu Leu Glu Glu
180 185 190
Ala Asn Ala Thr Gly Ser Gly Thr Val Ile Gln Ile Glu Asn Met Glu
195 200 205
Ser Tyr Ser Gly Ile Lys Leu Val Asp Leu Glu Lys Asn Thr Tyr Ile
210 215 220
Asn Pro Tyr Pro Asp Val Leu Ile Arg Thr Ser Gly Glu Thr Arg Leu
225 230 235 240
Ser Asn Tyr Leu Leu Trp Gln Thr Thr Asn Cys Ile Leu Tyr Ser Pro
245 250 255
His Ala Leu Trp Pro Glu Ile Gly Leu Arg His Val Val Trp Ala Val
260 265 270
Ile Asn Cys Gln Arg His Tyr Ser Tyr Leu Glu Lys His Lys Glu Tyr
275 280 285
Leu Lys
290
<210> 3
<211> 891
<212> ДНК
<213> Hevea brasiliensis
<400> 3
atggaaatat atacgggtca gaggccaagt gtgtttagaa tttttgggaa atacatgaga 60
aaagggttat atagcatcct aacccaaggt cccatcccta ctcatcttgc cttcataatg 120
gatggaaacc ggaggtttgc taagaagcac aaaatgaaag aagcagaagg ttataaggca 180
ggatatttag ctcttctgag aacactaact tattgctatg agttgggagt gaggtatgta 240
accatttatg cctttagcat tgataatttt cgaaggcaac ctcgtgaggt tcagtgcgta 300
atgaatctaa tgatggagaa gattgaagag attatcgtgg aagaaagtat catgaatgca 360
tatgatgttg gcgtacgtat tgtgggtaac ctgaatcttt tagatgagcc aatcaggatc 420
gcagcagaaa agattatgag ggctactgcc aataattcca ggtttgtgct tctcattgct 480
gtagcctata gttcaactga tgagatcgtg catgctgttg aagaatcctc taaagacaaa 540
ttgaactcca atgaagtttg caacaatggg attgaagctg aacaagaatt taaggaggca 600
aacggaactg gaaacagtgt gattccagtt cagaagacgg agtcatattc tggaataaat 660
cttgcagacc ttgagaaaaa cacctacgta aatcctcatc ctgatgtctt gattcgaact 720
tctgggttga gccgtctaag taactaccta ctttggcaga ctagtaattg catactgtat 780
tctccttttg cactgtggcc agagattggt ctcaggcact tggtatggac agtaatgaac 840
ttccaacgtc atcattctta tttggagaag cataaggaat atttaaaata a 891
<210> 4
<211> 296
<212> PRT
<213> Hevea brasiliensis
<400> 4
Met Glu Ile Tyr Thr Gly Gln Arg Pro Ser Val Phe Arg Ile Phe Gly
1 5 10 15
Lys Tyr Met Arg Lys Gly Leu Tyr Ser Ile Leu Thr Gln Gly Pro Ile
20 25 30
Pro Thr His Leu Ala Phe Ile Met Asp Gly Asn Arg Arg Phe Ala Lys
35 40 45
Lys His Lys Met Lys Glu Ala Glu Gly Tyr Lys Ala Gly Tyr Leu Ala
50 55 60
Leu Leu Arg Thr Leu Thr Tyr Cys Tyr Glu Leu Gly Val Arg Tyr Val
65 70 75 80
Thr Ile Tyr Ala Phe Ser Ile Asp Asn Phe Arg Arg Gln Pro Arg Glu
85 90 95
Val Gln Cys Val Met Asn Leu Met Met Glu Lys Ile Glu Glu Ile Ile
100 105 110
Val Glu Glu Ser Ile Met Asn Ala Tyr Asp Val Gly Val Arg Ile Val
115 120 125
Gly Asn Leu Asn Leu Leu Asp Glu Pro Ile Arg Ile Ala Ala Glu Lys
130 135 140
Ile Met Arg Ala Thr Ala Asn Asn Ser Arg Phe Val Leu Leu Ile Ala
145 150 155 160
Val Ala Tyr Ser Ser Thr Asp Glu Ile Val His Ala Val Glu Glu Ser
165 170 175
Ser Lys Asp Lys Leu Asn Ser Asn Glu Val Cys Asn Asn Gly Ile Glu
180 185 190
Ala Glu Gln Glu Phe Lys Glu Ala Asn Gly Thr Gly Asn Ser Val Ile
195 200 205
Pro Val Gln Lys Thr Glu Ser Tyr Ser Gly Ile Asn Leu Ala Asp Leu
210 215 220
Glu Lys Asn Thr Tyr Val Asn Pro His Pro Asp Val Leu Ile Arg Thr
225 230 235 240
Ser Gly Leu Ser Arg Leu Ser Asn Tyr Leu Leu Trp Gln Thr Ser Asn
245 250 255
Cys Ile Leu Tyr Ser Pro Phe Ala Leu Trp Pro Glu Ile Gly Leu Arg
260 265 270
His Leu Val Trp Thr Val Met Asn Phe Gln Arg His His Ser Tyr Leu
275 280 285
Glu Lys His Lys Glu Tyr Leu Lys
290 295
<210> 5
<211> 1122
<212> ДНК
<213> Hevea brasiliensis
<400> 5
atggaaaaac atagcagtag tagagtgagt gagctgtttg gaaatttggg tagttttatt 60
agaatttgca tatttcgtgt gttatccatg ggacccatcc ccaatcattt tgccttcata 120
atggatggaa atcggaggta tgctaagaag gagaacatga aaaaaggggc aggtcatagg 180
gctggattct tagctcttat atccatactt aagtactgct atgaattggg agtgaagtat 240
gtaacaattt acgcctttag cattgataat ttcaaaagga gtcctgatga agttaaggac 300
ctgatggatc tgatgctaga aaagattgag gatttgctga gggacgaaag cattgtgaac 360
caatatggaa tcagagtata ttttataggt aatttgaaac ttttgagtga aactgtgagg 420
attgcagcag aaaaggttat gaaagctact gccaaaaaca ccaattgtac ccttttaatc 480
tgcgtagcct atacgtcacg tgatgagatt gtacatgctg ttcaagtttc atgtaaaaat 540
aaacaggagg aaattcaacc attgagcttt tgtaaagcta ataatgatgc cattgaagaa 600
gtagaggata ataagaaggt taatggagtc atcccatttg tttttttaga atcccagaaa 660
gatgaagcag gcaaatctca agcaacaatg gcaagtgtaa cctgcagttg tctggctaga 720
ggagttgaag ggggtggcaa caaaaatagc atggttgttc gtgctgtccg aggatcctat 780
gaagataaat gggataactg tcaagcaatg atggaaaata gaactggcaa tggtgtgact 840
ttatctgaag agagtgagaa tatgcaggga gagtgttcta tcataaagct agtagacatt 900
gagaaacaga tgtacatggc tgtagctcct gaacctgaca tccttattcg aagttctgga 960
gagtcccgcc tgagtaactt cctactttgg cagaccagtg agtgccagtt atattctcca
1020
gatgcattgt ggccagaaat tggtttatgg cacttggtgt gggcagtatt aaacttccaa
1080
cgaaaccatg cttatttgga aaagaaaaag catcagttat aa 1122
<210> 6
<211> 373
<212> PRT
<213> Hevea brasiliensis
<400> 6
Met Glu Lys His Ser Ser Ser Arg Val Ser Glu Leu Phe Gly Asn Leu
1 5 10 15
Gly Ser Phe Ile Arg Ile Cys Ile Phe Arg Val Leu Ser Met Gly Pro
20 25 30
Ile Pro Asn His Phe Ala Phe Ile Met Asp Gly Asn Arg Arg Tyr Ala
35 40 45
Lys Lys Glu Asn Met Lys Lys Gly Ala Gly His Arg Ala Gly Phe Leu
50 55 60
Ala Leu Ile Ser Ile Leu Lys Tyr Cys Tyr Glu Leu Gly Val Lys Tyr
65 70 75 80
Val Thr Ile Tyr Ala Phe Ser Ile Asp Asn Phe Lys Arg Ser Pro Asp
85 90 95
Glu Val Lys Asp Leu Met Asp Leu Met Leu Glu Lys Ile Glu Asp Leu
100 105 110
Leu Arg Asp Glu Ser Ile Val Asn Gln Tyr Gly Ile Arg Val Tyr Phe
115 120 125
Ile Gly Asn Leu Lys Leu Leu Ser Glu Thr Val Arg Ile Ala Ala Glu
130 135 140
Lys Val Met Lys Ala Thr Ala Lys Asn Thr Asn Cys Thr Leu Leu Ile
145 150 155 160
Cys Val Ala Tyr Thr Ser Arg Asp Glu Ile Val His Ala Val Gln Val
165 170 175
Ser Cys Lys Asn Lys Gln Glu Glu Ile Gln Pro Leu Ser Phe Cys Lys
180 185 190
Ala Asn Asn Asp Ala Ile Glu Glu Val Glu Asp Asn Lys Lys Val Asn
195 200 205
Gly Val Ile Pro Phe Val Phe Leu Glu Ser Gln Lys Asp Glu Ala Gly
210 215 220
Lys Ser Gln Ala Thr Met Ala Ser Val Thr Cys Ser Cys Leu Ala Arg
225 230 235 240
Gly Val Glu Gly Gly Gly Asn Lys Asn Ser Met Val Val Arg Ala Val
245 250 255
Arg Gly Ser Tyr Glu Asp Lys Trp Asp Asn Cys Gln Ala Met Met Glu
260 265 270
Asn Arg Thr Gly Asn Gly Val Thr Leu Ser Glu Glu Ser Glu Asn Met
275 280 285
Gln Gly Glu Cys Ser Ile Ile Lys Leu Val Asp Ile Glu Lys Gln Met
290 295 300
Tyr Met Ala Val Ala Pro Glu Pro Asp Ile Leu Ile Arg Ser Ser Gly
305 310 315 320
Glu Ser Arg Leu Ser Asn Phe Leu Leu Trp Gln Thr Ser Glu Cys Gln
325 330 335
Leu Tyr Ser Pro Asp Ala Leu Trp Pro Glu Ile Gly Leu Trp His Leu
340 345 350
Val Trp Ala Val Leu Asn Phe Gln Arg Asn His Ala Tyr Leu Glu Lys
355 360 365
Lys Lys His Gln Leu
370
<210> 7
<211> 939
<212> ДНК
<213> Hevea brasiliensis
<400> 7
atgcaatcct tgcacttggc cctccctctc cctttttaca acactctaac tcctcaaaaa 60
cacaaacact tcctttctcc cgatgccaga actaatacac gcccaattca ccgccttctc 120
ggggccaaaa cagacgtagc tgtcaaacag gaggaaacta ttgctgtaag caccggagac 180
tcgcccaaga ctgaaccttt gccggagggg ctccggggag agttgatgcc acggcatgtc 240
gccgtgatca tggacggcaa tgggaggtgg gcccagctgc gaggtcagat ggcatcgatg 300
ggtcatcagg ctggtgcacg gtctttgctg gagatcgtgc agctttcttg tcaatggggg 360
attaaagttc ttagcgtttt tgcgttttct tgcgataatt ggactaggcc caaagtcgtg 420
caggtggaga ttgatttctt gatgagtttg ttcgaaagcg tgttaaagtc agagatggat 480
aaatttgtga gggaaggtat tcgaatctct gtgatcgggg actcatcaag gcttccacag 540
tctttgcaaa gattaataaa tgaagtggag gagaccacca gaaatttctc gaaactgcac 600
cttctagtgg cggttagcta cagtggaaag tatgatgttg taaaagcatg caaaagtatt 660
gcttgtctgg taaaggatgg tgttattgaa ccagaagaca ttagcgaaag cctaattgag 720
caggagttgg aaacaaattg ctccgagttt ccctcccctg atttattaat ccgaactagt 780
ggtgaactta gaattagcaa cttcttgcta tggcagttgg cctacactga acttttcttt 840
gcggaagaac tctggcctga ttttggaaaa actggattca tagaggcctt aacttcatac 900
caacaaaggc aaagacgcta tggtagacga cttacataa 939
<210> 8
<211> 312
<212> PRT
<213> Hevea brasiliensis
<400> 8
Met Gln Ser Leu His Leu Ala Leu Pro Leu Pro Phe Tyr Asn Thr Leu
1 5 10 15
Thr Pro Gln Lys His Lys His Phe Leu Ser Pro Asp Ala Arg Thr Asn
20 25 30
Thr Arg Pro Ile His Arg Leu Leu Gly Ala Lys Thr Asp Val Ala Val
35 40 45
Lys Gln Glu Glu Thr Ile Ala Val Ser Thr Gly Asp Ser Pro Lys Thr
50 55 60
Glu Pro Leu Pro Glu Gly Leu Arg Gly Glu Leu Met Pro Arg His Val
65 70 75 80
Ala Val Ile Met Asp Gly Asn Gly Arg Trp Ala Gln Leu Arg Gly Gln
85 90 95
Met Ala Ser Met Gly His Gln Ala Gly Ala Arg Ser Leu Leu Glu Ile
100 105 110
Val Gln Leu Ser Cys Gln Trp Gly Ile Lys Val Leu Ser Val Phe Ala
115 120 125
Phe Ser Cys Asp Asn Trp Thr Arg Pro Lys Val Val Gln Val Glu Ile
130 135 140
Asp Phe Leu Met Ser Leu Phe Glu Ser Val Leu Lys Ser Glu Met Asp
145 150 155 160
Lys Phe Val Arg Glu Gly Ile Arg Ile Ser Val Ile Gly Asp Ser Ser
165 170 175
Arg Leu Pro Gln Ser Leu Gln Arg Leu Ile Asn Glu Val Glu Glu Thr
180 185 190
Thr Arg Asn Phe Ser Lys Leu His Leu Leu Val Ala Val Ser Tyr Ser
195 200 205
Gly Lys Tyr Asp Val Val Lys Ala Cys Lys Ser Ile Ala Cys Leu Val
210 215 220
Lys Asp Gly Val Ile Glu Pro Glu Asp Ile Ser Glu Ser Leu Ile Glu
225 230 235 240
Gln Glu Leu Glu Thr Asn Cys Ser Glu Phe Pro Ser Pro Asp Leu Leu
245 250 255
Ile Arg Thr Ser Gly Glu Leu Arg Ile Ser Asn Phe Leu Leu Trp Gln
260 265 270
Leu Ala Tyr Thr Glu Leu Phe Phe Ala Glu Glu Leu Trp Pro Asp Phe
275 280 285
Gly Lys Thr Gly Phe Ile Glu Ala Leu Thr Ser Tyr Gln Gln Arg Gln
290 295 300
Arg Arg Tyr Gly Arg Arg Leu Thr
305 310
<210> 9
<211> 774
<212> ДНК
<213> Hevea brasiliensis
<400> 9
atggatttga aacctggagc tggagggcag agagttaatc gtttagtgga tccgattagt 60
tatcattttc ttcaatttct gtggcgtact ctacatcttc ttgtcagctt atggtacctt 120
caagttagta tggtccaaat gatcgaaggc tttctaatct ctagtggact tgtgaaacgc 180
tatggagccc tcgatattga caaggtccgg taccttgcca ttgtggtaga tagtgaagaa 240
gcttaccaaa tttctaaagt tattcagctt ttgaaatggg tggaagatat gggtgtgaaa 300
catttatgcc tctatgattc aaaaggagtt ctcaagacaa acaagaaaac catcatggag 360
agtttgaaca atgctatgcc atttgaggaa gcagttgaaa aagatgtttt actggaccag 420
aaacagatga ctgtggaatt tgcttccagc tccgatggaa aggaagcaat aaccagggca 480
gctaacgtac tctttatgaa gtatttgaag tatgctaaaa ctggtgtagg aaaggaagaa 540
ccatgcttta cagaagatca aatggatgag gcactaaaag ctataggtta caaagggccg 600
gaacctgact tgctattaat ttatggacct gttagatgcc atctaggttt ctcaccgtgg 660
agacttcgat atactgagat ggtgcatatg ggacccttga ggtacatgaa cctcggttca 720
ctaaaaaagg ccattcacag gttcacaaca gtgcagcaaa attatggtac ataa 774
<210> 10
<211> 257
<212> PRT
<213> Hevea brasiliensis
<400> 10
Met Asp Leu Lys Pro Gly Ala Gly Gly Gln Arg Val Asn Arg Leu Val
1 5 10 15
Asp Pro Ile Ser Tyr His Phe Leu Gln Phe Leu Trp Arg Thr Leu His
20 25 30
Leu Leu Val Ser Leu Trp Tyr Leu Gln Val Ser Met Val Gln Met Ile
35 40 45
Glu Gly Phe Leu Ile Ser Ser Gly Leu Val Lys Arg Tyr Gly Ala Leu
50 55 60
Asp Ile Asp Lys Val Arg Tyr Leu Ala Ile Val Val Asp Ser Glu Glu
65 70 75 80
Ala Tyr Gln Ile Ser Lys Val Ile Gln Leu Leu Lys Trp Val Glu Asp
85 90 95
Met Gly Val Lys His Leu Cys Leu Tyr Asp Ser Lys Gly Val Leu Lys
100 105 110
Thr Asn Lys Lys Thr Ile Met Glu Ser Leu Asn Asn Ala Met Pro Phe
115 120 125
Glu Glu Ala Val Glu Lys Asp Val Leu Leu Asp Gln Lys Gln Met Thr
130 135 140
Val Glu Phe Ala Ser Ser Ser Asp Gly Lys Glu Ala Ile Thr Arg Ala
145 150 155 160
Ala Asn Val Leu Phe Met Lys Tyr Leu Lys Tyr Ala Lys Thr Gly Val
165 170 175
Gly Lys Glu Glu Pro Cys Phe Thr Glu Asp Gln Met Asp Glu Ala Leu
180 185 190
Lys Ala Ile Gly Tyr Lys Gly Pro Glu Pro Asp Leu Leu Leu Ile Tyr
195 200 205
Gly Pro Val Arg Cys His Leu Gly Phe Ser Pro Trp Arg Leu Arg Tyr
210 215 220
Thr Glu Met Val His Met Gly Pro Leu Arg Tyr Met Asn Leu Gly Ser
225 230 235 240
Leu Lys Lys Ala Ile His Arg Phe Thr Thr Val Gln Gln Asn Tyr Gly
245 250 255
Thr
<210> 11
<211> 528
<212> ДНК
<213> Hevea brasiliensis
<400> 11
atggctgaag gtgaagaaga ggtgaatatc caagaagagg caaataaagg agaggagaat 60
ccccaagaag aggcgaatat ccaagaagag acgaataaag gagaggagaa tatccaagaa 120
gaggcgaata tcgaagaaga ggctaataag gaggaagaga gcctaaagta tttggatttt 180
gtgcaagcgg ctacagttta tgccagggct tctttctcaa agctctacct ttttgccaag 240
gacaagtctg gtccattcaa gcctggcgtc aatactgttg agagtaggtt taagagcgtg 300
gttagacccg tctataataa gttccaacct gttcccaaca aggttctcaa gtttgcagac 360
cgtagggttg atgcatatgt cactgtttta gatcgcattg ttcctccaat tgtcaagcgg 420
gcatctatcc aagcttattc agtagcccca ggagctgctc gtgctgtggc ttcttatttg 480
cctttgcata ccaagagact ttttaaggtg ctatatggag atgggtga 528
<210> 12
<211> 175
<212> PRT
<213> Hevea brasiliensis
<400> 12
Met Ala Glu Gly Glu Glu Glu Val Asn Ile Gln Glu Glu Ala Asn Lys
1 5 10 15
Gly Glu Glu Asn Pro Gln Glu Glu Ala Asn Ile Gln Glu Glu Thr Asn
20 25 30
Lys Gly Glu Glu Asn Ile Gln Glu Glu Ala Asn Ile Glu Glu Glu Ala
35 40 45
Asn Lys Glu Glu Glu Ser Leu Lys Tyr Leu Asp Phe Val Gln Ala Ala
50 55 60
Thr Val Tyr Ala Arg Ala Ser Phe Ser Lys Leu Tyr Leu Phe Ala Lys
65 70 75 80
Asp Lys Ser Gly Pro Phe Lys Pro Gly Val Asn Thr Val Glu Ser Arg
85 90 95
Phe Lys Ser Val Val Arg Pro Val Tyr Asn Lys Phe Gln Pro Val Pro
100 105 110
Asn Lys Val Leu Lys Phe Ala Asp Arg Arg Val Asp Ala Tyr Val Thr
115 120 125
Val Leu Asp Arg Ile Val Pro Pro Ile Val Lys Arg Ala Ser Ile Gln
130 135 140
Ala Tyr Ser Val Ala Pro Gly Ala Ala Arg Ala Val Ala Ser Tyr Leu
145 150 155 160
Pro Leu His Thr Lys Arg Leu Phe Lys Val Leu Tyr Gly Asp Gly
165 170 175
<210> 13
<211> 417
<212> ДНК
<213> Hevea brasiliensis
<400> 13
atggctgaag acgaagacaa ccaacaaggg cagggggagg ggttaaaata tttgggtttt 60
gtgcaagacg cggcaactta tgctgtgact accttctcaa acgtctatct ttttgccaaa 120
gacaaatctg gtccactgca gcctggtgtc gatatcattg agggtccggt gaagaacgtg 180
gctgtacctc tctataatag gttcagttat attcccaatg gagctctcaa gtttgtagac 240
agcacggttg ttgcatctgt cactattata gatcgctctc ttcccccaat tgtcaaggac 300
gcatctatcc aagttgtttc agcaattcga gctgccccag aagctgctcg ttctctggct 360
tcttctttgc ctgggcagac caagatactt gctaaggtgt tttatggaga gaattga 417
<210> 14
<211> 138
<212> PRT
<213> Hevea brasiliensis
<400> 14
Met Ala Glu Asp Glu Asp Asn Gln Gln Gly Gln Gly Glu Gly Leu Lys
1 5 10 15
Tyr Leu Gly Phe Val Gln Asp Ala Ala Thr Tyr Ala Val Thr Thr Phe
20 25 30
Ser Asn Val Tyr Leu Phe Ala Lys Asp Lys Ser Gly Pro Leu Gln Pro
35 40 45
Gly Val Asp Ile Ile Glu Gly Pro Val Lys Asn Val Ala Val Pro Leu
50 55 60
Tyr Asn Arg Phe Ser Tyr Ile Pro Asn Gly Ala Leu Lys Phe Val Asp
65 70 75 80
Ser Thr Val Val Ala Ser Val Thr Ile Ile Asp Arg Ser Leu Pro Pro
85 90 95
Ile Val Lys Asp Ala Ser Ile Gln Val Val Ser Ala Ile Arg Ala Ala
100 105 110
Pro Glu Ala Ala Arg Ser Leu Ala Ser Ser Leu Pro Gly Gln Thr Lys
115 120 125
Ile Leu Ala Lys Val Phe Tyr Gly Glu Asn
130 135
<210> 15
<211> 354
<212> ДНК
<213> Hevea brasiliensis
<400> 15
atggctgaag ggaaagaaaa cgagaatttc caacaagagg ctaatgagca ggaagagaag 60
ctaaagtatt tggaatttgt acaagcgact acagataatg ctgtaactgc cctctcaaac 120
atttaccttt atgccaagga caattctggt ccgttgaagc ctggggtcga gactattgag 180
ggtgtggcaa agaccgtggt tattccggcc agtaaaattc ccactgaagc tatcaagttt 240
gcagacagag cggtggatgc atctttcact actctacaaa acattgttcc ctcagttctc 300
aagcagttgc ctacccaagc ttgcgatact agtgtgaagg aaagtgcaga gtaa 354
<210> 16
<211> 117
<212> PRT
<213> Hevea brasiliensis
<400> 16
Met Ala Glu Gly Lys Glu Asn Glu Asn Phe Gln Gln Glu Ala Asn Glu
1 5 10 15
Gln Glu Glu Lys Leu Lys Tyr Leu Glu Phe Val Gln Ala Thr Thr Asp
20 25 30
Asn Ala Val Thr Ala Leu Ser Asn Ile Tyr Leu Tyr Ala Lys Asp Asn
35 40 45
Ser Gly Pro Leu Lys Pro Gly Val Glu Thr Ile Glu Gly Val Ala Lys
50 55 60
Thr Val Val Ile Pro Ala Ser Lys Ile Pro Thr Glu Ala Ile Lys Phe
65 70 75 80
Ala Asp Arg Ala Val Asp Ala Ser Phe Thr Thr Leu Gln Asn Ile Val
85 90 95
Pro Ser Val Leu Lys Gln Leu Pro Thr Gln Ala Cys Asp Thr Ser Val
100 105 110
Lys Glu Ser Ala Glu
115
<210> 17
<211> 615
<212> ДНК
<213> Hevea brasiliensis
<400> 17
atggctgaag aggtggagga agagaggcta aagtatttgg attttgtgcg agcggctgga 60
gtttatgctg tagattcttt ctcaactctc tacctttatg ccaaggacat atctggtcca 120
ttaaaacctg gtgtcgatac tattgagaat gtggtgaaga ccgtggttac tcctgtttat 180
tatattcccc ttgaggctgt caagtttgta gacaaaacgg tggatgtatc ggtcactagc 240
ctagatggcg ttgttccccc agttatcaag caggtgtctg cccaaactta ctcggtagct 300
caagatgctc caagaattgt tcttgatgtg gcttcttcag ttttcaacac tggtgtgcag 360
gaaggcgcaa aagctctgta cgctaatctt gaaccaaaag ctgagcaata tgcggtcatt 420
acctggcgtg ccctcaataa gctgccacta gttcctcaag tggcaaatgt agttgtgcca 480
accgctgttt atttctctga aaagtacaac gatgttgttc gtggcactac tgagcaggga 540
tatagagtgt cctcttattt gcctttgttg cccactgaga aaattactaa ggtgtttgga 600
gatgaggcat cataa 615
<210> 18
<211> 204
<212> PRT
<213> Hevea brasiliensis
<400> 18
Met Ala Glu Glu Val Glu Glu Glu Arg Leu Lys Tyr Leu Asp Phe Val
1 5 10 15
Arg Ala Ala Gly Val Tyr Ala Val Asp Ser Phe Ser Thr Leu Tyr Leu
20 25 30
Tyr Ala Lys Asp Ile Ser Gly Pro Leu Lys Pro Gly Val Asp Thr Ile
35 40 45
Glu Asn Val Val Lys Thr Val Val Thr Pro Val Tyr Tyr Ile Pro Leu
50 55 60
Glu Ala Val Lys Phe Val Asp Lys Thr Val Asp Val Ser Val Thr Ser
65 70 75 80
Leu Asp Gly Val Val Pro Pro Val Ile Lys Gln Val Ser Ala Gln Thr
85 90 95
Tyr Ser Val Ala Gln Asp Ala Pro Arg Ile Val Leu Asp Val Ala Ser
100 105 110
Ser Val Phe Asn Thr Gly Val Gln Glu Gly Ala Lys Ala Leu Tyr Ala
115 120 125
Asn Leu Glu Pro Lys Ala Glu Gln Tyr Ala Val Ile Thr Trp Arg Ala
130 135 140
Leu Asn Lys Leu Pro Leu Val Pro Gln Val Ala Asn Val Val Val Pro
145 150 155 160
Thr Ala Val Tyr Phe Ser Glu Lys Tyr Asn Asp Val Val Arg Gly Thr
165 170 175
Thr Glu Gln Gly Tyr Arg Val Ser Ser Tyr Leu Pro Leu Leu Pro Thr
180 185 190
Glu Lys Ile Thr Lys Val Phe Gly Asp Glu Ala Ser
195 200
<210> 19
<211> 19
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Праймер 1 для амплификации CPT1
<400> 19
atggaattat acaacggtg 19
<210> 20
<211> 36
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Праймер 2 для амплификации CPT1
<400> 20
atctcgagtt aatgatgatg atgatgatgt tttaag 36
<210> 21
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Праймер 3 для амплификации CPT2
<400> 21
atggaaatat atacgggtca g 21
<210> 22
<211> 41
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Праймер 4 для амплификации CPT2
<400> 22
atctcgagtt aatgatgatg atgatgatgt tttaaatatt c 41
<210> 23
<211> 20
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Праймер 5 для амплификации CPT6
<400> 23
atggaaaaac atagcagtag 20
<210> 24
<211> 29
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Праймер 6 для амплификации CPT6
<400> 24
atctcgagtt atataactga tgctttttc 29
<210> 25
<211> 18
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Праймер 7 для амплификации CPT7
<400> 25
atgcaatcct tgcacttg 18
<210> 26
<211> 30
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Праймер 8 для амплификации CPT7
<400> 26
atctcgagtt atgtaagtcg tctaccatag 30
<210> 27
<211> 17
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Праймер 9 для амплификации CPTL
<400> 27
atggatttga aacctgg 17
<210> 28
<211> 34
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Праймер 10 для амплификации CPTL
<400> 28
atctcgagtt aatgatgatg atgatgatgt gtac 34
<210> 29
<211> 30
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Праймер 11 для амплификации REF1
<400> 29
atggctgaag gtgaagaaga ggtgaatatc 30
<210> 30
<211> 29
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Праймер 12 для амплификации REF1
<400> 30
atctcgagtc acccatctcc atatagcac 29
<210> 31
<211> 28
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Праймер 13 для амплификации REF2
<400> 31
atggctgaag acgaagacaa ccaacaag 28
<210> 32
<211> 29
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Праймер 14 для амплификации REF2
<400> 32
atctcgagtc aattctctcc ataaaacac 29
<210> 33
<211> 30
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Праймер 15 для амплификации REF8
<400> 33
atggctgaag ggaaagaaaa cgagaatttc 30
<210> 34
<211> 29
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Праймер 16 для амплификации REF8
<400> 34
atctcgagtt actctgcact ttccttcac 29
<210> 35
<211> 28
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Праймер 17 для амплификации SRPP1
<400> 35
atggctgaag aggtggagga agagaggc 28
<210> 36
<211> 30
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Праймер 18 для амплификации SRPP1
<400> 36
atctcgagtt atgatgcctc atctccaaac 30
<---
| название | год | авторы | номер документа |
|---|---|---|---|
| КОМПОЗИЦИИ И СПОСОБЫ РЕДАКТИРОВАНИЯ ГЕНОВ | 2019 |
|
RU2804665C2 |
| СКОНСТРУИРОВАННЫЕ ПЕСТИЦИДНЫЕ БЕЛКИ И СПОСОБЫ КОНТРОЛЯ ВРЕДИТЕЛЕЙ РАСТЕНИЙ | 2017 |
|
RU2817591C2 |
| СКОНСТРУИРОВАННЫЕ ПЕСТИЦИДНЫЕ БЕЛКИ И СПОСОБЫ КОНТРОЛЯ ВРЕДИТЕЛЕЙ РАСТЕНИЙ | 2017 |
|
RU2816526C2 |
| ИНСЕКТИЦИДНЫЕ БЕЛКИ И СПОСОБЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ | 2016 |
|
RU2740312C2 |
| ДИСПЛЕЙ ИНТЕГРАЛЬНОГО МЕМБРАННОГО БЕЛКА НА ВНЕКЛЕТОЧНЫХ ОБОЛОЧЕЧНЫХ ВИРИОНАХ ПОКСВИРУСА | 2017 |
|
RU2759846C2 |
| Выделенная нуклеиновая кислота, которая кодирует слитый белок на основе FVIII-BDD и гетерологичного сигнального пептида, и ее применение | 2022 |
|
RU2818229C2 |
| КОНСТРУКТЫ Т-КЛЕТОЧНОГО РЕЦЕПТОРА И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ | 2019 |
|
RU2785954C2 |
| КОМПОЗИЦИИ И СПОСОБЫ КОНТРОЛЯ ВРЕДИТЕЛЕЙ РАСТЕНИЙ | 2015 |
|
RU2745322C2 |
| АМИНОАЦИЛ-тРНК-СИНТЕТАЗА ДЛЯ ЭФФЕКТИВНОГО ВВЕДЕНИЯ ПРОИЗВОДНОГО ЛИЗИНА В БЕЛОК | 2020 |
|
RU2799794C2 |
| Вакцина на основе AAV5 для индукции специфического иммунитета к вирусу SARS-CoV-2 и/или профилактики коронавирусной инфекции, вызванной SARS-CoV-2 | 2020 |
|
RU2760301C1 |
Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение раскрывает композицию белков, которая имеет каталитическую активность в реакции полимеризации изопрена и содержит белок(и) (B), имеющий такую же активность, как CPTL, и любой из белков (A-1), имеющего такую же активность, как CPT6, и (A-2), имеющего такую же активность, как CPT7. Изобретение также относится к липидной мембранной структуре, содержащей указанную композицию белков, к способу ее получения и к клетке, экспрессирующей белок, составляющий указанную композицию. Изобретение может быть использовано при получении натурального каучука. 5 н. и 14 з.п. ф-лы, 11 пр., 1 табл.
1. Композиция белков, которая имеет каталитическую активность в полимеризации изопрена, где композиция белков содержит:
белок(и) (B), белки (A-1) и по меньшей мере один из белков (E), (G) и (H); или
белок(и) (В) и белок(и) (A-2):
(A-1) один или несколько белок(ов), выбранный из белка(ов), содержащего аминокислотную последовательность из SEQ ID NO: 6, и белка(ов), который содержит аминокислотную последовательность, имеющую 90% или более идентичность с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO: 6, и имеет такую же активность, как cis-пренилтрансфераза 6 (CPT6);
(A-2) один или несколько белок(ов), выбранный из белка(ов), содержащего аминокислотную последовательность из SEQ ID NO: 8, и белка(ов), который содержит аминокислотную последовательность, имеющую 90% или более идентичность с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO: 8, и имеет такую же активность, как cis-пренилтрансфераза 7 (CPT7); и
(B) один или несколько белок(ов), выбранный из белка(ов), содержащего аминокислотную последовательность из SEQ ID NO: 10, и белка(ов), который содержит аминокислотную последовательность, имеющую 90% или более идентичность с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO: 10, и имеет такую же активность, как cis-пренилтрансфераза L (CPTL);
(E) один или несколько белок(ов), выбранный из белка(ов), содержащего аминокислотную последовательность из SEQ ID NO: 12, и белка(ов), который содержит аминокислотную последовательность, имеющую 90% или более идентичность с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO: 12, и имеет такую же активность, как фактор элонгации каучука 1 (REF1);
(G) один или несколько белок(ов), выбранный из белка(ов), содержащего аминокислотную последовательность из SEQ ID NO: 16, и белка(ов), который содержит аминокислотную последовательность, имеющую 90% или более идентичность с аминокислотной последовательностью из ID NO: 16, и имеет такую же активность, как фактор элонгации каучука 8 (REF8); и
(H) один или несколько белок(ов), выбранный из белка(ов), содержащего аминокислотную последовательность из SEQ ID NO: 18, и белка(ов), который содержит аминокислотную последовательность, имеющую 90% или более идентичность с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO: 18, и имеет такую же активность, как белок малых частиц каучука 1 (SRPP1).
2. Композиция по п. 1, удовлетворяющая по меньшей мере одному из следующих:
белок (A-1) закодирован одним или несколькими полинуклеотидом(ами) (a-1), выбранным из полинуклеотида(ов), содержащего последовательность нуклеиновой кислоты из SEQ ID NO: 5, и полинуклеотида(ов), который содержит последовательность нуклеиновой кислоты, имеющую 90% или более идентичность с последовательностью нуклеиновой кислоты из SEQ ID NO: 5, и кодирует белок, имеющий такую же активность, как CPT6;
белок (A-2) закодирован одним или несколькими полинуклеотидом(ами) (a-2), выбранным из полинуклеотида(ов), содержащего последовательность нуклеиновой кислоты из SEQ ID NO: 7, и полинуклеотида(ов), который содержит последовательность нуклеиновой кислоты, имеющую 90% или более идентичность с последовательностью нуклеиновой кислоты из SEQ ID NO: 7, и кодирует белок, имеющий такую же активность, как CPT7; и
белок (B) закодирован одним или несколькими полинуклеотидом(ами) (b), выбранным из полинуклеотида(ов), содержащего последовательность нуклеиновой кислоты из SEQ ID NO: 9, и полинуклеотида(ов), который содержит последовательность нуклеиновой кислоты, имеющую 90% или более идентичность с последовательностью нуклеиновой кислоты из SEQ ID NO: 9, и кодирует белок, имеющий такую же активность, как CPTL;
белок (E) закодирован одним или несколькими полинуклеотидом(ами) (e), выбранным из полинуклеотида(ов), содержащего последовательность нуклеиновой кислоты из SEQ ID NO: 11, и полинуклеотида(ов), который содержит последовательность нуклеиновой кислоты, имеющую 90% или более идентичность с последовательностью нуклеиновой кислоты из SEQ ID NO: 11, и кодирует белок, имеющий такую же активность, как REF1;
белок (G) закодирован одним или несколькими полинуклеотидом(ами) (g), выбранным из полинуклеотида(ов), содержащего последовательность нуклеиновой кислоты из SEQ ID NO: 15, и полинуклеотида(ов), который содержит последовательность нуклеиновой кислоты, имеющую 90% или более идентичность с последовательностью нуклеиновой кислоты из SEQ ID NO: 15, и кодирует белок, имеющий такую же активность, как REF8; и
белок (H) закодирован одним или несколькими полинуклеотидом(ами) (h), выбранным из полинуклеотида(ов), содержащего последовательность нуклеиновой кислоты из SEQ ID NO: 17, и полинуклеотида(ов), который содержит последовательность нуклеиновой кислоты, имеющую 90% или более идентичность с последовательностью нуклеиновой кислоты из SEQ ID NO: 17, и кодирует белок, имеющий такую же активность, как SRPP1.
3. Композиция по п. 1 или 2, где композиция содержит дополнительно к белку(ам) (B), белку(ам) (A-1) и по меньшей мере одному из белков (E), (G) и (H) белок семейства REF, отличный от REF1 и 8, белок семейства SRPP, отличный от SRPP1, и белок семейства CPT, отличный от CPT6, 7 и CPTL.
4. Композиция по п. 3, дополнительно содержащая по меньшей мере один из следующих:
(C) один или несколько белок(ов), выбранный из белка(ов), содержащего аминокислотную последовательность из SEQ ID NO: 2, и белка(ов), который содержит аминокислотную последовательность, имеющую 90% или более идентичность с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO: 2, и имеет такую же активность, как cis-пренилтрансфераза 1 (CPT1);
(D) один или несколько белок(ов), выбранный из белка(ов), содержащего аминокислотную последовательность из SEQ ID NO: 4, и белка(ов), который содержит аминокислотную последовательность, имеющую 90% или более идентичность с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO: 4, и имеет такую же активность, как cis-пренилтрансфераза 2 (CPT2); и
(F) один или несколько белок(ов), выбранный из белка(ов), содержащего аминокислотную последовательность из SEQ ID NO: 14, и белка(ов), который содержит аминокислотную последовательность, имеющую 90% или более идентичность с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO: 14, и имеет такую же активность, как фактор элонгации каучука 2 (REF2).
5. Композиция по п. 4, удовлетворяющая по меньшей мере одному из следующих:
белок (C) закодирован одним или несколькими полинуклеотидом(ами) (c), выбранным из полинуклеотида(ов), содержащего последовательность нуклеиновой кислоты из SEQ ID NO: 1, и полинуклеотида(ов), который содержит последовательность нуклеиновой кислоты, имеющую 90% или более идентичность с последовательностью нуклеиновой кислоты из SEQ ID NO: 1, и кодирует белок, имеющий такую же активность, как CPT1;
белок (D) закодирован одним или несколькими полинуклеотидом(ами) (d), выбранным из полинуклеотида(ов), содержащего последовательность нуклеиновой кислоты из SEQ ID NO: 3, и полинуклеотида(ов), который содержит последовательность нуклеиновой кислоты, имеющую 90% или более идентичность с последовательностью нуклеиновой кислоты из SEQ ID NO: 3, и кодирует белок, имеющий такую же активность, как CPT2; и
белок (F) закодирован одним или несколькими полинуклеотидом(ами) (f), выбранным из полинуклеотида(ов), содержащего последовательность нуклеиновой кислоты из SEQ ID NO: 13, и полинуклеотида(ов), который содержит последовательность нуклеиновой кислоты, имеющую 90% или более идентичность с последовательностью нуклеиновой кислоты из SEQ ID NO: 13, и кодирует белок, имеющий такую же активность, как REF2.
6. Композиция по п. 1 или 2, содержащая белок(и) (B), белок(и) (A-2), белок семейства REF, отличный от REF1 и 8, белок семейства SRPP, отличный от SRPP1, и белок семейства CPT, отличный от CPT6, 7 и CPTL.
7. Композиция по п. 6, дополнительно содержащая по меньшей мере одно из следующего:
(C) один или несколько белок(ов), выбранный из белка(ов), содержащего аминокислотную последовательность из SEQ ID NO: 2, и белка(ов), который содержит аминокислотную последовательность, имеющую 90% или более идентичность с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO: 2, и имеет такую же активность, как cis-пренилтрансфераза 1 (CPT1);
(D) один или несколько белок(ов), выбранный из белка(ов), содержащего аминокислотную последовательность из SEQ ID NO: 4, и белка(ов), который содержит аминокислотную последовательность, имеющую 90% или более идентичность с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO: 4, и имеет такую же активность, как cis-пренилтрансфераза 2 (CPT2);
(E) один или несколько белок(ов), выбранный из белка(ов), содержащего аминокислотную последовательность из SEQ ID NO: 12, и белка(ов), который содержит аминокислотную последовательность, имеющую 90% или более идентичность с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO: 12, и имеет такую же активность, как REF1;
(F) один или несколько белок(ов), выбранный из белка(ов), содержащего аминокислотную последовательность из SEQ ID NO: 14, и белка(ов), который содержит аминокислотную последовательность, имеющую 90% или более идентичность с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO: 14, и имеет такую же активность, как фактор элонгации каучука 2 (REF2);
(G) один или несколько белок(ов), выбранный из белка(ов), содержащего аминокислотную последовательность из SEQ ID NO: 16, и белка(ов), который содержит аминокислотную последовательность, имеющую 90% или более идентичность с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO: 16, и имеет такую же активность, как REF8; и
(H) один или несколько белок(ов), выбранный из белка(ов), содержащего аминокислотную последовательность из SEQ ID NO: 18, и белка(ов), который содержит аминокислотную последовательность, имеющую 90% или более идентичность с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO: 18, и имеет такую же активность, как SRPP1.
8. Композиция по п. 7, где у композиции выполняется одно из следующего:
белок (C) закодирован одним или несколькими полинуклеотидом(ами) (c), выбранным из полинуклеотида(ов), содержащего последовательность нуклеиновой кислоты из SEQ ID NO: 1, и полинуклеотида(ов), который содержит последовательность нуклеиновой кислоты, имеющую 90% или более идентичность с последовательностью нуклеиновой кислоты из SEQ ID NO: 1, и кодирует белок, имеющий такую же активность, как CPT1;
белок (D) закодирован одним или несколькими полинуклеотидом(ами) (d), выбранным из полинуклеотида(ов), содержащего последовательность нуклеиновой кислоты из SEQ ID NO: 3, и полинуклеотида(ов), который содержит последовательность нуклеиновой кислоты, имеющую 90% или более идентичность с последовательностью нуклеиновой кислоты из SEQ ID NO: 3, и кодирует белок, имеющий такую же активность, как CPT2;
белок (E) закодирован одним или несколькими полинуклеотидом(ами) (e), выбранным из полинуклеотида(ов), содержащего последовательность нуклеиновой кислоты из SEQ ID NO: 11, и полинуклеотида(ов), который содержит последовательность нуклеиновой кислоты, имеющую 90% или более идентичность с последовательностью нуклеиновой кислоты из SEQ ID NO: 11, и кодирует белок, имеющий такую же активность, как REF1;
белок (F) закодирован одним или несколькими полинуклеотидом(ами) (f), выбранным из полинуклеотида(ов), содержащего последовательность нуклеиновой кислоты из SEQ ID NO: 13, и полинуклеотида(ов), который содержит последовательность нуклеиновой кислоты, имеющую 90% или более идентичность с последовательностью нуклеиновой кислоты из SEQ ID NO: 13, и кодирует белок, имеющий такую же активность, как REF2;
белок (G) закодирован одним или несколькими полинуклеотидом(ами) (g), выбранным из полинуклеотида(ов), содержащего последовательность нуклеиновой кислоты из SEQ ID NO: 15, и полинуклеотида(ов), который содержит последовательность нуклеиновой кислоты, имеющую 90% или более идентичность с последовательностью нуклеиновой кислоты из SEQ ID NO: 15, и кодирует белок, имеющий такую же активность, как REF8; и
белок (H) закодирован одним или несколькими полинуклеотидом(ами) (h), выбранным из полинуклеотида(ов), содержащего последовательность нуклеиновой кислоты из SEQ ID NO: 17, и полинуклеотида(ов), который содержит последовательность нуклеиновой кислоты, имеющую 90% или более идентичность с последовательностью нуклеиновой кислоты из SEQ ID NO: 17, и кодирует белок, имеющий такую же активность, как SRPP1.
9. Композиция по п. 1 или 2, где по меньшей мере один из белков (A)-(H) представляет собой белок, происходящий из каучукового дерева.
10. Липидная мембранная структура, содержащая композицию по п. 1 или 2 и фосфолипид, где структура представляет собой липидную бислойную мембранную структуру и имеет каталитическую активность в полимеризации изопрена.
11. Структура по п. 10, представляющая собой протеолипосому.
12. Клетка, экспрессирующая белок, составляющий композицию по п. 1 или 2, где клетка содержит единицу экспрессии, содержащую полинуклеотид, который кодирует каждый из белков в композиции белков по п. 1 или 2, и имеет каталитическую активность в полимеризации изопрена.
13. Клетка по п. 12, где полинуклеотид содержит:
(b), (a-1) и по меньшей мере один из (e), (g) и (h); или
(b) и (a-2):
(a-1) один или несколько полинуклеотид(ов), выбранный из полинуклеотида(ов), содержащего последовательность нуклеиновой кислоты из SEQ ID NO: 5, и полинуклеотида(ов), который содержит последовательность нуклеиновой кислоты, имеющую 90% или более идентичность с последовательностью нуклеиновой кислоты из SEQ ID NO: 5, и кодирует белок, имеющий такую же активность, как CPT6;
(a-2) один или несколько полинуклеотид(ов), выбранный из полинуклеотида(ов), содержащего последовательность нуклеиновой кислоты из SEQ ID NO: 7, и полинуклеотида(ов), который содержит последовательность нуклеиновой кислоты, имеющую 90% или более идентичность с последовательностью нуклеиновой кислоты из SEQ ID NO: 7, и кодирует белок, имеющий такую же активность, как CPT7; и
(b) один или несколько полинуклеотид(ов), выбранный из полинуклеотида(ов), содержащего последовательность нуклеиновой кислоты из SEQ ID NO: 9, и полинуклеотида(ов), который содержит последовательность нуклеиновой кислоты, имеющую 90% или более идентичность с последовательностью нуклеиновой кислоты из SEQ ID NO: 9, и кодирует белок, имеющий такую же активность, как CPTL;
(e) один или несколько полинуклеотид(ов), выбранный из полинуклеотида(ов), содержащего последовательность нуклеиновой кислоты из SEQ ID NO: 11, и полинуклеотида(ов), который содержит последовательность нуклеиновой кислоты, имеющую 90% или более идентичность с последовательностью нуклеиновой кислоты из SEQ ID NO: 11, и кодирует белок, имеющий такую же активность, как REF1;
(g) один или несколько полинуклеотид(ов), выбранный из полинуклеотида(ов), содержащего последовательность нуклеиновой кислоты из SEQ ID NO: 15, и полинуклеотида(ов), который содержит последовательность нуклеиновой кислоты, имеющую 90% или более идентичность с последовательностью нуклеиновой кислоты из SEQ ID NO: 15, и кодирует белок, имеющий такую же активность, как REF8; и
(h) один или несколько полинуклеотид(ов), выбранный из полинуклеотида(ов), содержащего последовательность нуклеиновой кислоты из SEQ ID NO: 17, и полинуклеотида(ов), который содержит последовательность нуклеиновой кислоты, имеющую 90% или более идентичность с последовательностью нуклеиновой кислоты из SEQ ID NO: 17, и кодирует белок, имеющий такую же активность, как SRPP1.
14. Клетка по п. 12, где полинуклеотид представляет собой полинуклеотид, кодирующий белок, составляющий композицию по п. 3, и дополнительно содержит по меньшей мере один из следующих:
(c) один или несколько полинуклеотид(ов), выбранный из полинуклеотида(ов), содержащего последовательность нуклеиновой кислоты из SEQ ID NO: 1, и полинуклеотида(ов), который содержит последовательность нуклеиновой кислоты, имеющую 90% или более идентичность с последовательностью нуклеиновой кислоты из SEQ ID NO: 1, и кодирует белок, имеющий такую же активность, как CPT1;
(d) один или несколько полинуклеотид(ов), выбранный из полинуклеотида(ов), содержащего последовательность нуклеиновой кислоты из SEQ ID NO: 3, и полинуклеотида(ов), который содержит последовательность нуклеиновой кислоты, имеющую 90% или более идентичность с последовательностью нуклеиновой кислоты из SEQ ID NO: 3, и кодирует белок, имеющий такую же активность, как CPT2; и
(f) один или несколько полинуклеотид(ов), выбранный из полинуклеотида(ов), содержащего последовательность нуклеиновой кислоты из SEQ ID NO: 13, и полинуклеотида(ов), который содержит последовательность нуклеиновой кислоты, имеющую 90% или более идентичность с последовательностью нуклеиновой кислоты из SEQ ID NO: 13, и кодирует белок, имеющий такую же активность, как REF2.
15. Клетка по п. 12, где единица экспрессии представляет собой гетерологичную единицу экспрессии.
16. Клетка по п. 12, содержащая липидную мембранную структуру по п. 10.
17. Способ получения изопренового полимерного соединения, включающий проведение реакции полимеризации изопрена с использованием по меньшей мере одной, выбранной из композиции по п. 1 или 2, структуры по п. 10 и клетки по п. 12.
18. Способ получения по п. 17, где реакцию полимеризации изопрена проводят с использованием низкомолекулярного аллильного соединения в качестве субстрата.
19. Способ получения каучука, включающий получение каучука с использованием изопренового полимерного соединения, полученного посредством способа получения по п. 17.
| WO 2017002818 A1, 05.01.2017 | |||
| Трансформант для экспрессии цис-пренилтрансферазы и рецептора Nogo-B | 2015 |
|
RU2682047C2 |
| WO 2012148253 A1, 01.11.2012 | |||
| US 20180371501 A1, 27.12.2018 | |||
| Автомобиль-сани, движущиеся на полозьях посредством устанавливающихся по высоте колес с шинами | 1924 |
|
SU2017A1 |
| УСОВЕРШЕНСТВОВАННЫЕ ЛИПОСОМЫ И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ | 2008 |
|
RU2482837C2 |
