СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

Настоящая заявка подана в электронном виде с помощью EFS-Web и включает поданный в электронном виде список последовательностей в формате.txt. Файл.txt содержит список последовательностей, названный "PC72377-PRV2_Sequence_Listing_ST25_05142019.txt", созданный 14 мая 2019 и имеющий размер 738 КБ. Список последовательностей, содержащийся в этом файле.txt, является частью описания и включен в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме.

Область изобретения

Настоящее изобретение относится к антителам, например, полноразмерным антителам или их антигенсвязывающим фрагментам, специфически связывающимся с GUCY2c (гуанилатциклазой C) и/или CD3 (кластером дифференцировки 3). Настоящее изобретение дополнительно относится к биспецифическим антителам, специфически связывающимся с CD3 и антигеном опухолевых клеток (например, биспецифическим антителам, специфически связывающимся с CD3 и GUCY2c). Настоящее изобретение также относится к родственным молекулам, например, нуклеиновым кислотам, кодирующим такие антитела или биспецифические антитела, композициям и родственным способам, например, способам получения и очистки таких антител и биспецифических антител, и их применению в диагностике и терапии.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Злокачественные новообразования являются основной причиной смерти по всему миру, на долю которой приходится более 7 миллионов случаев смерти каждый год. Смертность от злокачественных новообразований почти всегда связана с распространением первичных опухолей до отдаленных очагов, образующих метастазы, что в конечном итоге приводит к гибели. Это особенно верно в случае злокачественных новообразований желудочно-кишечного тракта, включая аденокарциному пищевода, желудка, толстого кишечника и прямой кишки. Колоректальный рак (CRC) остается четвертым среди самых диагностируемых злокачественных новообразований и второй из основных причин гибели от злокачественных новообразований в США (Siegel RL, Miller KD, Jemal A. Cancer statistics, 2016. CA Cancer J Clin., 66:7-30, 2016). По всему миру на долю колоректального рака приходится 1,2 миллионов новых случаев и 600000 случаев гибели в год (Brenner H, Kloor M, Pox CP. Colorectal cancer. Lancet, 383:1490-502, 2014).

Гуанилатциклаза C (GUCY2c) (также известная как STAR, рецептор ST, GUC2C, GUCY2C, GC-C и GCC) является трансмембранным рецептором поверхности клетки, участвующим в поддержании жидкости кишечника, гомеостаза электролитов и пролиферации клеток (Carrithers et al., Proc Natl Acad Sci USA 100: 3018-3020, 2003; Mann et al., Biochem Biophys Res Commun 239: 463-466, 1997; Pitari et al., Proc Natl Acad Sci USA 100: 2695-2699, 2003); регистрационный номер GenBank NM.sub.-004963, и регистрационный номер GenPept NP-004954). Эта функция опосредована связыванием гуанилина (Wiegand et al. FEBS Lett. 311:150-154, 1992) и урогуанилина (Hamra et al. Proc Natl Acad Sci USA 9(22):10464-10468, 1993). GUCY2c также является рецептором термостабильного энтеротоксина (ST), являющегося пептидом, продуцируемым E. coli, а также другими организмами-возбудителями инфекций (Rao, M. C. Ciba Found. Symp. 112:74-93, 1985; Knoop F. C. and Owens, M. J. Pharmacol. Toxicol. Methods 28:67-72, 1992). Связывание ST с GUCY2c активирует сигнальный каскад, приводящий к заболеваниям кишечника, например, диареи.

GUCY2c охарактеризована как белок, участвующий в развитии злокачественных новообразований, включая колоректальный рак, рак поджелудочной железы, рак желудка, рак печени и рак пищевода (Carrithers et al., Dis Colon Rectum 39:171-181, 1996; Buc et al. Eur J Cancer 41: 1618-1627, 2005; Carrithers et al., Gastroenterology 107: 1653-1661, 1994; Urbanski et al., Biochem Biophys Acta 1245: 29-36, 1995).

Как белок поверхности клетки, GUCY2c может служить в качестве терапевтической мишени для рецептор-связывающих белков, таких как антитела или лиганды. GUCY2c экспрессируется на апикальной стороне эпителиальных клеток, выстилающих слизистую оболочку тонкого кишечника, толстого кишечника и прямой кишки (Carrithers et al., Dis Colon Rectum 39: 171-181, 1996). Экспрессия GUCY2c сохраняется после злокачественного перерождения эпителиальных клеток кишечника с экспрессией во всех первичных и метастатических колоректальных опухолях (Carrithers et al., 1996; Buc et al.; Carrithers et al., 1994). Экспрессия GUCY2c также определена в клетках пищевода, диагностируемых при пищеводе Барретта, раке пищевода и раке желудка.

Сохраняется потребность в молекулах и/или композициях, которые могут специфически направленно воздействовать и специфически связываться с метастатическими клетками колоректального рака. Существует потребность в улучшенных способах лечения индивидуумов, которые, как предполагают, страдают колоректальным раком, в особенности, индивидуумов, которые, как предполагают, страдают метастазированием клеток колоректального рака.

Разработаны различные стратегии получения биспецифических антител, которые могут рекрутировать T-клетки для опосредования уничтожения опухолевых клеток. Такие биспецифические антитела могут формировать мостик между опухолевой клеткой и эффекторной клеткой иммунной системы человека (NK-клетками, T-клетками, моноцитами, макрофагами или гранулоцитами), таким образом, делая возможным специфическое уничтожение опухолевой клетки. Хотя доказано, что такие биспецифические антитела предпочтительны для терапевтического использования, например, для терапевтических концепций в случае лечения опухолей, сохраняется потребность в биспецифических антителах, которые будут нацелены на GUCY2c-положительные опухолевые клетки, с высокой активностью и специфичностью. Такая молекула будет полезной в качестве терапевтического средства в случае злокачественных новообразований ЖКТ, при лечении злокачественных новообразований и детекции GUCY2c на клетках.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к антителам, включая биспецифические антитела, где антитела специфически связываются с GUCY2c. Изобретение дополнительно относится к биспецифическим антителам, которые могут связываться с GUCY2c и CD3.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к антителу, специфически связывающемуся с гуанилатциклазой C (GUCY2c), где антитело содержит: (a) вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую определяющую комплементарность область VH один (CDR1 VH), определяющую комплементарность область VH два (CDR2 VH) и определяющую комплементарность область VH три (CDR3 VH) последовательности VH, приведенной в SEQ ID NO: 11, 19, 26, 33, 41, 48, 52, 57, 60, 62, 64, 65, 67, 69, 71 или 73; и/или (b) вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую определяющую комплементарность область VL один (CDR1 VL), определяющую комплементарность область VL два (CDR2 VL) и определяющую комплементарность область VL три (CDR3 VL) последовательности VL, приведенной в SEQ ID NO: 92, 100, 104, 106, 112, 119, 125, 129, 134, 136, 137, 138, 140, 143, 145, 147, 150, 152, 156, 158, 160, 162, 166, 170, 171, 172, 173, 174 или 175.

В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к антителу, специфически связывающемуся с GUCY2c, где антитело содержит: (a) область VH, содержащую (i) CDR1 VH, содержащую последовательность SEQ ID NO: 12, 20, 27, 34, 42, 74, 257, 258, 259, 260 или 261; (ii) CDR2 VH, содержащую последовательность SEQ ID NO: 13, 21, 28, 35, 43, 53, 66, 68, 70, 72, 75, 262, 263, 264, 265, 266 или 267; и (iii) CDR3 VH, содержащую последовательность SEQ ID NO: 14, 22, 29, 36 или 44; и/или (b) область VL, содержащую (i) CDR1 VL, содержащую последовательность SEQ ID NO: 93, 101, 105, 107, 113, 120, 148, 153, 163 или 167; (ii) CDR2 VL, содержащую последовательность SEQ ID NO: 78, 94, 102, 108, 114, 141, 144, 146, 149, 151, 157, 159, 161, 164 или 168; и (iii) CDR3 VL, содержащую последовательность SEQ ID NO: 95, 109, 115, 121, 142, 154, 165 или 169.

В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к антителу, где: (a) область VH содержит (i) CDR1 VH, содержащую последовательность SEQ ID NO: 74; (ii) CDR2 VH, содержащую последовательность SEQ ID NO: 75; и (iii) CDR3 VH, содержащую последовательность SEQ ID NO: 29; и/или (b) область VL содержит (i) CDR1 VL, содержащую последовательность SEQ ID NO: 148; (ii) CDR2 VL, содержащую последовательность SEQ ID NO: 149; и (iii) CDR3 VL, содержащую последовательность SEQ ID NO: 142.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к антителу, где: (a) область VH содержит SEQ ID NO: 11, 19, 26, 33, 41, 48, 52, 57, 60, 62, 64, 65, 67, 69, 71 или 73; и/или (b) область VL содержит SEQ ID NO: 92, 100, 104, 106, 112, 119, 125, 129, 134, 136, 137, 138, 140, 143, 145, 147, 150, 152, 156, 158, 160, 162, 166, 170, 171, 172, 173, 174 или 175.

В еще одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к антителу, где область VH содержит последовательность SEQ ID NO: 73; и где область VL содержит последовательность SEQ ID NO: 147.

В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к антителу, где область VH содержит последовательность SEQ ID NO: 73 или ее вариант с одной или несколькими консервативными аминокислотными заменами в остатках, не находящихся в области VH; и/или где область VL содержит последовательность SEQ ID NO: 147 или ее вариант с одной или несколькими консервативными аминокислотными заменами в аминокислотах, не находящихся в области VL.

В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к антителу, связывающемуся с GUCY2c и содержащему: CDR1 VL против GUCY2c, содержащую аминокислоты, имеющие последовательность RASESV-X_L1.30-X_L1.30a-YG-X_L1.30d-SLLQ; CDR2 VL против GUCY2c, содержащую аминокислоты, имеющие последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 149; CDR3 VL против GUCY2c, содержащую аминокислоты, имеющие последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 142; CDR1 VH против GUCY2c, содержащую аминокислоты, имеющие последовательность GFTFS-X_H1.31-X_H1.32-WMH; CDR2 VH против GUCY2c, содержащую аминокислоты, имеющие последовательность EIK- X_H2.52A-X_H2.53-X_H2.54-X_H2.55-X_H2.56-X_H2.57-NVHEKFKD; и CDR3 VH против GUCY2c, содержащую аминокислоты, имеющие последовательность T-X_H3.96-X_H3.97-X_H3.98-X_H3.99-X_H3.100-G-X_H3.100B-WF-X_H3.100E-X_H3.101-V, где каждый из X_L1.30, X_L1.30a, X_L1.30d, X_H1.31, X_H1.32, X_H2.52A, X_H2.53, X_H2.54, X_H2.55, X_H2.56, X_H2.57, X_H3.96, X_H3.97, X_H3.98, X_H3.99, X_H3.100, X_H3.100B, X_H3.100E и X_H3.101независимо представляет собой аминокислотный остаток из столбцов 4 и 5 таблиц 42A и 42B.

В одном из аспектов X_L1.30 является D, N или S; X_L1.30a является Y, W или I; X_L1.30d является T, S или H; X_H1.31 является S, R, W, Y, A, H, P, Y, T, N, K, D, G или V; X_H1.32 является Y, R, L, T, K, P, I, N, M, V или S; X_H2.52A является P, T или V; X_H2.53 является S, A, L или R; X_H2.54является N, T, R, H, K, M, S, A, Y, T или I; X_H2.55 является E, R, K, N, Y, G, L, A, M, S, H, D или Q; X_H2.56 является L, W, Y, F, V, I, N или H; X_H2.57 является T, M, S, L, N, Q или V; X_H3.96 является I, F или K; X_H3.97 является T, V, L, I, M, F, Y или A; X_H3.98 является T, N, R, G, L или I; X_H3.99 является T, K, L, W, A, S, M, P, N или R; X_H3.100 является E, G, A, H, S, D, T, R, Q, K, Y, L или M; X_H3.100B является Y или H; X_H3.100E является F или L; и X_H3.101 является D, Y, E или S.

В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к антителу, где антитело выбрано из группы, состоящей из Fab-фрагмента, Fab'-фрагмента, F(ab’)_2-фрагмента, Fd-фрагмента, Fv-фрагмента, одноцепочечного Fv-фрагмента (scFv), стабилизированного дисульфидными связями Fv-фрагмента (dsFv), однодоменного антитела (dAb), моноклонального антитела, химерного антитела, биспецифического антитела, триспецифического антитела, полиспецифического антитела, биспецифического гетеродимерного диатело, биспецифического гетеродимерного IgG, поликлонального антитела, меченого антитела, гуманизированного антитела, антитела человека и их фрагментов.

В другом варианте осуществления антитело по настоящему изобретению дополнительно содержит человеческий или гуманизированный каркас VH и человеческий или гуманизированный каркас VL. В некоторых вариантах осуществления каркас VH содержит последовательность SEQ ID NO: 5, 6, 7, 8, 15, 16, 17, 18, 23, 24, 25, 30, 31, 32, 37, 38, 39, 40, 45, 46, 47, 49, 50, 51, 54, 55, 56, 58, 59, 61 или 63; и/или каркас VL содержит последовательность SEQ ID NO: 80, 81, 82, 83, 86, 87, 88, 89, 96, 97, 98, 99, 103, 110, 111, 116, 117, 118, 122, 123, 124, 126, 127, 128, 130, 131, 132, 133, 135, 139 или 155.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к выделенному моноклональному антителу человека, связывающемуся с эпитопом на внеклеточном домене GUCY2c, где эпитоп содержит по меньшей мере один аминокислотный остаток, выбранный из аминокислотных остатков R73, S74, S75, T76, E78, G79, L80, L82, L83, R84 или I86 SEQ ID NO: 406.

В одном из аспектов эпитоп содержит по меньшей мере два, по меньшей мере три, по меньшей мере четыре, по меньшей мере пять, по меньшей мере шесть, по меньшей мере семь, по меньшей мере восемь, по меньшей мере девять или по меньшей мере десять аминокислотных остатков, выбранных из аминокислотных остатков R73, S74, S75, T76, E78, G79, L80, L82, L83, R84 или I86 SEQ ID NO: 406. В другом аспекте эпитоп содержит аминокислотные остатки R73, S74, S75, T76, E78, G79, L80, L82, L83, R84 или I86 SEQ ID NO: 406. В дополнительном аспекте эпитоп содержит аминокислоты, имеющие последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 406. В дополнительном аспекте эпитоп является функциональным эпитопом.

В другом аспекте выделенное антитело человека и контакты аминокислот эпитопа GUCY2c находятся в пределах 3,8 ангстрем, что определяют посредством кристаллографии. В рамках изобретения термин "в пределах 3,8 ангстрем" означает, что контакты составляют 3,8 ангстрем или менее.

В одном из аспектов антитело по настоящему изобретению является биспецифическим антителом. В другом аспекте настоящее изобретение относится к биспецифическому антителу, специфически связывающемуся с GUCY2c и CD3, где биспецифическое антитело содержит первую полипептидную цепь и вторую полипептидную цепь.

В одном из вариантов осуществления (a) первая полипептидная цепь содержит в направлении от N-конца к C-концу: (i) домен 1, содержащий VL антитела против GUCY2c (VL против GUCY2c) и VH антитела против CD3 (VH против CD3), и (ii) первый способствующий гетеродимеризации домен; и (b) вторая полипептидная цепь содержит в направлении от N-конца к C-концу: (i) домен 2, содержащий VL антитела против CD3 (VL против CD3) и VH антитела против GUCY2c (VH против GUCY2c), и (ii) второй способствующий гетеродимеризации домен; где VL против GUCY2c и VH против GUCY2c образуют домен, специфически связывающийся с GUCY2c; и VL против CD3 и VH против CD3 образуют домен, специфически связывающийся с CD3.

В другом варианте осуществления (a) первая полипептидная цепь содержит в направлении от N-конца к C-концу: (i) домен 1, содержащий VL против CD3 и VH против GUCY2c, и (ii) первый способствующий гетеродимеризации домен; и (b) вторая полипептидная цепь содержит в направлении от N-конца к C-концу: (i) домен 2, содержащий VL против GUCY2c и VH против CD3, и (ii) второй способствующий гетеродимеризации домен; где VL против GUCY2c и VH против GUCY2c образуют домен, специфически связывающийся с GUCY2c; и VL против CD3 и VH против CD3 образуют домен, специфически связывающийся с CD3.

В другом варианте осуществления (a) первая полипептидная цепь содержит в направлении от N-конца к C-концу: (i) домен 1, содержащий VH против GUCY2c и VL против CD3, и (ii) первый способствующий гетеродимеризации домен; и (b) вторая полипептидная цепь содержит в направлении от N-конца к C-концу: (i) домен 2, содержащий VH против CD3 и VL против GUCY2c, и (ii) второй способствующий гетеродимеризации домен; где VH против GUCY2c и VL против GUCY2c образуют домен, специфически связывающийся с GUCY2c; и VH против CD3 и VL против CD3 образуют домен, специфически связывающийся с CD3.

В дополнительном варианте осуществления (a) первая полипептидная цепь содержит в направлении от N-конца к C-концу: (i) домен 1, содержащий VH против CD3 и VL против GUCY2c, и (ii) первый способствующий гетеродимеризации домен; и (b) вторая полипептидная цепь содержит в направлении от N-конца к C-концу: (i) домен 2, содержащий VH против GUCY2c и VL против CD3, и (ii) второй способствующий гетеродимеризации домен, где VL против GUCY2c и VH против GUCY2c образуют домен, специфически связывающийся с GUCY2c; и VL против CD3 и VH против CD3 образуют домен, специфически связывающийся с CD3.

В некоторых вариантах осуществления описанного выше каждый из первого способствующего гетеродимеризации домена и второго способствующего гетеродимеризации домена содержит домен CH2 и домен CH3, где аминокислотную последовательность каждого из домена CH2 и/или домена CH3 модифицируют для регуляции гетеродимеризации и/или стабилизации биспецифического антитела.

В некоторых таких вариантах осуществления аминокислотная последовательность домена CH2 и/или домена CH3 содержит по меньшей мере одну аминокислотную модификацию, где: (a) домен CH3 первого способствующего гетеродимеризации домена образует выступ; и (b) домен CH3 второго способствующего гетеродимеризации домена образует впадину.

В другом таком варианте осуществления домен CH3 первого способствующего гетеродимеризации домена содержит мутации Y349C и/или T366W; и домен CH3 второго способствующего гетеродимеризации домена содержит мутации S354C, T366S, L368A и/или Y407V (нумерация в соответствии с индексом EU).

В конкретном варианте осуществления описанного выше первый способствующий гетеродимеризации домен содержит последовательность SEQ ID NO: 188; где второй способствующий гетеродимеризации домен содержит последовательность SEQ ID NO: 189.

В дополнительных вариантах осуществления VL против GUCY2c и VH против CD3 соединяют посредством глицин-серинового линкера; и VL против CD3 и VH против GUCY2c соединяют посредством глицин-серинового линкера. В некоторых таких вариантах осуществления глицин-сериновый линкер является линкером 1, содержащим последовательность SEQ ID NO: 190. В других вариантах осуществления глицин-серин линкер является линкером 2, содержащим последовательность SEQ ID NO: 191.

В дополнительных вариантах осуществления описанного выше домен 1 ковалентно связан с первым способствующим гетеродимеризации доменом посредством цистеинового линкера; и домен 2 ковалентно связан со вторым способствующим гетеродимеризации доменом посредством цистеинового линкера; где цистеиновый линкер содержит по меньшей мере пять аминокислот. В некоторых таких вариантах осуществления цистеиновый линкер является линкером 3, содержащим последовательность SEQ ID NO: 192.

В некоторых вариантах осуществления первая полипептидная цепь ковалентно связана со второй полипептидной цепью посредством по меньшей мере одной дисульфидной связи. В некоторых таких вариантах осуществления по меньшей мере одна дисульфидная связь образуется между линкером 3 первой полипептидной цепи и линкером 3 второй полипептидной цепи. В другом таком варианте осуществления по меньшей мере одна дисульфидная связь образуется между первым способствующим гетеродимеризации доменом и вторым способствующий гетеродимеризации доменом. В конкретных вариантах осуществления, каждая дисульфидная связь образуется посредством связывания двух остатков цистеина.

В дополнительных вариантах осуществления любого из описанных выше биспецифическое антитело по настоящему изобретению содержит (a) CDR1 VH против GUCY2c, содержащую последовательность SEQ ID NO: 12, 20, 27, 34, 42, 74, 257, 258, 259, 260 или 261; (b) CDR2 VH против GUCY2c, содержащую последовательность SEQ ID NO: 13, 21, 28, 35, 43, 53, 66, 68, 70, 72, 75, 262, 263, 264, 265, 266 или 267; (c) CDR3 VH против GUCY2c, содержащую последовательность SEQ ID NO: 14, 22, 29, 36 или 44; (d) CDR1 VL против GUCY2c, содержащую последовательность SEQ ID NO: 93, 101, 105, 107, 113, 120, 148, 153, 163 или 167; (e) CDR2 VL против GUCY2c, содержащую последовательность SEQ ID NO: 78, 94, 102, 108, 114, 141, 144, 146, 149, 151, 157, 159, 161, 164 или 168; и (f) CDR3 VL против GUCY2c, содержащую последовательность SEQ ID NO: 95, 109, 115, 121, 142, 154, 165 или 169.

В конкретном варианте осуществления биспецифическое антитело по настоящему изобретению содержит (a) CDR1 VH против GUCY2c, содержащую последовательность SEQ ID NO: 74 или 259; (b) CDR2 VH против GUCY2c, содержащую последовательность SEQ ID NO: 75 или 267; (c) CDR3 VH против GUCY2c, содержащую последовательность SEQ ID NO: 29; (d) CDR1 VL против GUCY2c, содержащую последовательность SEQ ID NO: 148; (e) CDR2 VL против GUCY2c, содержащую последовательность SEQ ID NO: 149; и (f) CDR3 VL против GUCY2c, содержащую последовательность SEQ ID NO: 142.

В конкретных вариантах осуществления, биспецифическое антитело содержит: (a) область VH против GUCY2c, содержащую последовательность SEQ ID NO: 73; и (b) область VL против GUCY2c, содержащую последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 147.

В дополнительных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к биспецифическим антителам, содержащим (a) CDR1 VH против CD3, содержащую последовательность SEQ ID NO: 2, 268 или 277; (b) CDR2 VH против CD3, содержащую последовательность SEQ ID NO: 3, 10, 269 или 270; (c) CDR3 VH против CD3, содержащую последовательность SEQ ID NO: 4; (d) CDR1 VL против CD3, содержащую последовательность SEQ ID NO: 77, 85, 91, 278, 279 или 280; (e) CDR2 VL против CD3, содержащую SEQ ID NO: 78, или 281; и (f) CDR3 VL против CD3, содержащую последовательность SEQ ID NO: 79.

В конкретном варианте осуществления настоящее изобретение относится к биспецифическому антителу, содержащему (a) CDR1 VH против CD3, содержащую последовательность SEQ ID NO: 2 или 268; (b) CDR2 VH против CD3, содержащую последовательность SEQ ID NO: 10 или 270; (c) CDR3 VH против CD3, содержащую последовательность SEQ ID NO: 4; (d) CDR1 VL против CD3, содержащую последовательность SEQ ID NO: 91; (e) CDR2 VL против CD3, содержащую последовательность SEQ ID NO: 78; и (f) CDR3 VL против CD3, содержащую последовательность SEQ ID NO: 79.

В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к биспецифическому антителу, содержащему: (a) область VH против CD3, содержащую последовательность SEQ ID NO: 1, 9 или 273; и (b) область VL против CD3, содержащую последовательность SEQ ID NO: 76, 84, 90, 274, 275 или 276. В конкретном варианте осуществления биспецифическое антитело по настоящему изобретению содержит: (a) область VH против CD3, содержащую последовательность SEQ ID NO: 9; и (b) область VL против CD3, содержащую последовательность SEQ ID NO: 90.

В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к биспецифическому антителу, содержащему: CDR1 VL против GUCY2c, содержащую аминокислоты, имеющие последовательность RASESV-X_L1.30-X_L1.30a-YG-X_L1.30d-SLLQ; CDR2 VL против GUCY2c, содержащую аминокислоты, имеющие последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 149; CDR3 VL против GUCY2c, содержащую аминокислоты, имеющие последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 142; CDR1 VH против GUCY2c, содержащую аминокислоты, имеющие последовательность GFTFS-X_H1.31-X_H1.32-WMH; CDR2 VH против GUCY2c, содержащую аминокислоты, имеющие последовательность EIK-X_H2.52A-X_H2.53-X_H2.54-X_H2.55-X_H2.56-X_H2.57-NVHEKFKD; и CDR3 VH против GUCY2c, содержащую аминокислоты, имеющие последовательность T-X_H3.96-X_H3.97-X_H3.98-X_H3.99-X_H3.100-G-X_H3.100B-WF-X_H3.100E-X_H3.101-V, где каждый из X_L1.30, X_L1.30a, X_L1.30d, X_H1.31, X_H1.32, X_H2.52A, X_H2.53, X_H2.54, X_H2.55, X_H2.56, X_H2.57, X_H3.96, X_H3.97, X_H3.98, X_H3.99, X_H3.100, X_H3.100B, X_H3.100E и X_H3.101независимо представляет собой аминокислотный остаток в соответствии со столбцами 4 и 5 таблиц 42A и 42B.

В одном из аспектов X_L1.30 является D, N или S; X_L1.30a является Y, W или I; X_L1.30d является T, S или H; X_H1.31 является S, R, W, Y, A, H, P, Y, T, N, K, D, G или V; X_H1.32 является Y, R, L, T, K, P, I, N, M, V или S; X_H2.52A является P, T или V; X_H2.53 является S, A, L или R; X_H2.54является N, T, R, H, K, M, S, A, Y, T или I; X_H2.55 является E, R, K, N, Y, G, L, A, M, S, H, D или Q; X_H2.56 является L, W, Y, F, V, I, N или H; X_H2.57 является T, M, S, L, N, Q или V; X_H3.96 является I, F или K; X_H3.97 является T, V, L, I, M, F, Y или A; X_H3.98 является T, N, R, G, L или I; X_H3.99 является T, K, L, W, A, S, M, P, N или R; X_H3.100 является E, G, A, H, S, D, T, R, Q, K, Y, L или M; X_H3.100B является Y или H; X_H3.100E является F или L; и X_H3.101 является D, Y, E или S.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к биспецифическому антителу, связывающемуся с эпитопом на внеклеточном домене GUCY2c, где эпитоп содержит по меньшей мере один аминокислотный остаток, выбранный из аминокислотных остатков R73, S74, S75, T76, E78, G79, L80, L82, L83, R84 или I86 SEQ ID NO: 406.

В одном из аспектов эпитоп содержит по меньшей мере два, по меньшей мере три, по меньшей мере четыре, по меньшей мере пять, по меньшей мере шесть, по меньшей мере семь, по меньшей мере восемь, по меньшей мере девять или по меньшей мере десять аминокислотных остатков, выбранных из аминокислотных остатков R73, S74, S75, T76, E78, G79, L80, L82, L83, R84 или I86 SEQ ID NO: 406. В другом аспекте эпитоп содержит аминокислотные остатки R73, S74, S75, T76, E78, G79, L80, L82, L83, R84 или I86 SEQ ID NO: 406. В дополнительном аспекте эпитоп содержит аминокислоты, имеющие последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 406. В дополнительном аспекте эпитоп является функциональным эпитопом.

В другом аспекте выделенное антитело человека и контакты аминокислот эпитопа GUCY2c находятся в пределах 3,8 ангстрем, что определяют посредством кристаллографии.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к биспецифическому антителу, специфически связывающемуся с GUCY2c и конкурирующему за связывание с биспецифическим антителом, представленным в настоящем описании.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к биспецифическому антителу, специфически связывающемуся с GUCY2c и CD3, где биспецифическое антитело содержит первую полипептидную цепь и вторую полипептидную цепь, и где: (a) первая полипептидная цепь содержит следующие области в следующем порядке в направлении от N-конца к C-концу: VL антитела против GUCY2c (VL против GUCY2c) (SEQ ID NO: 147) - линкер 1 (SEQ ID NO: 190) - VH антитела против CD3 (VH против CD3) (SEQ ID NO: 9) - линкер 3 (SEQ ID NO: 192) - первый способствующий гетеродимеризации домен (SEQ ID NO: 188); и (b) вторая полипептидная цепь содержит следующие области в следующем порядке в направлении от N-конца к C-концу: VL антитела против CD3 (VL против CD3) (SEQ ID NO: 90) - линкер 2 (SEQ ID NO: 191) - VH антитела против GUCY2c (VH против GUCY2c) (SEQ ID NO: 73) - линкер 3 (SEQ ID NO: 192) - второй способствующий гетеродимеризации домен (SEQ ID NO: 189); где VL против GUCY2c и VH против GUCY2c образуют домен, специфически связывающийся с GUCY2c; и VL против CD3 и VH против CD3 образуют домен, специфически связывающийся с CD3; где линкер 3 первой полипептидной цепи и линкер 3 второй полипептидной цепи ковалентно связаны друг с другом двумя дисульфидными связями; где каждый из первого способствующего гетеродимеризации домена и второго способствующего гетеродимеризации домена содержит домен CH2 и домен CH3; где домен CH3 первого способствующего гетеродимеризации домена образует выступ, и домен CH3 второго способствующего гетеродимеризации домена образует впадину; где по меньшей мере одна дисульфидная связь образуется между доменом CH3 первого способствующего гетеродимеризации домена и доменом CH3 второго способствующего гетеродимеризации домена.

В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к биспецифическому антителу, дополнительно содержащему человеческий или гуманизированный каркас VH и человеческий или гуманизированный каркас VL. В некоторых таких вариантах осуществления биспецифическое антитело является гуманизированным антителом. В конкретных вариантах осуществления каркас VH содержит последовательность SEQ ID NO: 5, 6, 7, 8, 15, 16, 17, 18, 23, 24, 25, 30, 31, 32, 37, 38, 39, 40, 45, 46, 47, 49, 50, 51, 54, 55, 56, 58, 59, 61 или 63; и/или каркас VL содержит последовательность SEQ ID NO: 80, 81, 82, 83, 86, 87, 88, 89, 96, 97, 98, 99, 103, 110, 111, 116, 117, 118, 122, 123, 124, 126, 127, 128, 130, 131, 132, 133, 135, 139 или 155.

В одном из аспектов биспецифическое антитело по настоящему изобретению специфически связывается с GUCY2c и CD3, где биспецифическое антитело содержит первую полипептидную цепь и вторую полипептидную цепь, где первую полипептидную цепь получают с помощью экспрессирующего вектора с регистрационным номером ATCC PTA-124944 и вторую полипептидную цепь получают с помощью экспрессирующего вектора с регистрационным номером ATCC PTA-124943.

В конкретных вариантах осуществления антитело или биспецифическое антитело по настоящему изобретению (a) связывается с внеклеточным доменом GUCY2c человека; (b) демонстрирует увеличенное время полужизни в сыворотке или опухоли от 30 мин до 100 дней; и/или (c) демонстрирует более низкое значение EC₅₀ от 0,0001 нМ до 100 нМ в присутствии повышенных уровней экспрессии GUCY2c или повышенных уровней плотности рецептора.

Настоящее изобретение дополнительно относится к фармацевтической композиции, содержащей терапевтически эффективное количество антитела или биспецифического антитела, представленного в настоящем описании, и фармацевтически приемлемый носитель.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу лечения GUCY2c-ассоциированного нарушения у нуждающегося в этом пациента, включающему введение пациенту антитела против GUCY2c по настоящему изобретению. Настоящее изобретение также относится к способу лечения GUCY2c-ассоциированного нарушения у нуждающегося в этом пациента, включающему введение пациенту биспецифического антитела по настоящему изобретению. Настоящее изобретение дополнительно относится к способу лечения GUCY2c-ассоциированного нарушения у нуждающегося в этом пациента, включающему введение пациенту фармацевтической композиции, содержащей антитело против GUCY2c или биспецифическое антитело, представленное в настоящем описании. В некоторых таких вариантах осуществления GUCY2c-ассоциированное нарушение является злокачественным новообразованием. В конкретных вариантах осуществления злокачественное новообразование является злокачественным новообразованием пищеварительной системы, выбранным из группы, состоящей из злокачественного новообразования пищевода, желудка, тонкого кишечника, толстого кишечника, прямой кишки, анального канала, печени, желчного пузыря, аппендикса, желчных протоков и поджелудочной железы.

Настоящее изобретение дополнительно относится к способу лечения GUCY2c-ассоциированного нарушения у нуждающегося в этом пациента, включающему введение пациенту биспецифического антитела, представленного в настоящем описании, или фармацевтической композиции, содержащей биспецифическое антитело, представленное в настоящем описании, где ответ цитолитических T-клеток активирован.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к антителу, биспецифическому антителу или фармацевтической композиции, представленной в настоящем описании, для применения в терапии. Настоящее изобретение дополнительно относится к антителу или биспецифическому антителу, представленному в настоящем описании, для применения в производстве лекарственного средства для применения в терапии. В некоторых вариантах осуществления терапия представляет собой лечение GUCY2c-ассоциированного нарушения. В конкретных вариантах осуществления GUCY2c-ассоциированное нарушение является злокачественным новообразованием. В некоторых вариантах осуществления злокачественное новообразование является злокачественным новообразованием пищеварительной системы, выбранным из группы, состоящей из злокачественного новообразования пищевода, желудка, тонкого кишечника, толстого кишечника, прямой кишки, анального канала, печени, желчного пузыря, аппендикса, желчных протоков и поджелудочной железы. В конкретных вариантах осуществления с помощью терапии активируют ответ цитолитических T-клеток.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к полинуклеотиду, кодирующему антитело или биспецифическое антитело, представленное в настоящем описании. В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к вектору, содержащему полинуклеотиды, представленные в настоящем описании. В еще одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к клетке-хозяину, содержащей векторы, представленные в настоящем описании. В некоторых таких вариантах осуществления клетка-хозяин рекомбинантно продуцирует антитело или биспецифическое антитело, представленное в настоящем описании. В конкретных вариантах осуществления клетка-хозяин выбрана из группы, состоящей из линий бактериальных клеток, линий клеток млекопитающего, линий клеток насекомых и линий дрожжевых клеток. В конкретном варианте осуществления линия клеток млекопитающего является линией клеток CHO. В одном из вариантов осуществления антитело или биспецифическое антитело получают с использованием бесклеточной системы синтеза белка in vitro.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к способу получения антитела против GUCY2c или биспецифического антитела, представленного в настоящем описании, включающему культивирование клетки-хозяина в условиях, приводящих к продукции антитела против GUCY2c или биспецифического антитела, представленного в настоящем описании, и очистку антитела или биспецифического антитела от супернатанта культуры.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к применению антитела против GUCY2c, биспецифического антитела, фармацевтической композиции, полинуклеотида, вектора или клетки-хозяина, представленных в настоящем описании, в производстве лекарственного средства для лечения GUCY2c-ассоциированного нарушения.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к композиции, содержащей биспецифические антитела по изобретению и второе терапевтическое средство.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к композиции, содержащей биспецифические антитела по изобретению и противодиарейное средство.

В одном из аспектов противодиарейное средство включает, в качестве неограничивающих примеров, субгаллат висмута, Lactobacillus acidophilus, Saccharomyces boulardii, лоперамид/симетикон, атропин/дифеноксилат, атропин/ дифеноксин, лиофилизат Saccharomyces boulardii, Lactobacillus acidophilus, лоперамид, субсалицилат висмута, Lactobacillus acidophilus/Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus rhamnosus, аттапульгит, крофелемер, фторхинолон, антибиотик или октреотид.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к применению композиции, содержащей биспецифическое антитело против GUCY2c и противодиарейное средство, представленное в настоящем описании, в производстве лекарственного средства для лечения GUCY2c-ассоциированного нарушения.

Другие варианты осуществления будут очевидны из следующего подробного описания. Если аспекты или варианты осуществления изобретения описаны в терминах группы Маркуша или другого группирования альтернатив, настоящее изобретение относится не только ко всей группе, указанной в целом, но также и к каждому члену группы по отдельности и всем возможным подгруппам основной группы, а также к основной группе, в которой отсутствует один или более из членов группы. Настоящее изобретение также предусматривает конкретное исключение одного или более из любых членов групп в описываемом в заявке изобретении.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

На фигурах 1A, 1B, 1C и 1D показаны схемы четырех альтернативных представлений биспецифических антител против CD3-GUCY2c, содержащих первый способствующий гетеродимеризации домен и второй способствующий гетеродимеризации домен, содержащий Fc-цепь, оптимизированную для связывания с помощью "выступа-во-впадину".

На фигуре 2 показано связывание биспецифических антител (A) GUCY2C-0247 и (B) GUCY2C-1608 с опухолевыми клетками T84 с использованием анализ на основе проточной цитометрии.

На фигуре 3 показан анализ на основе проточной цитометрии для определения связывания биспецифических антител (A) GUCY2C-0247 и (B) GUCY2C-1608 с наивными T-клетками человека.

На фигуре 4A показаны GUCY2C-1608 и GUCY2C-0247, рекрутирующие наивные T-клетки человека для индуцирования уничтожения опухолевых клеток T84. На фигуре 4B показана GUCY2C-1608-опосредованная активность цитотоксических T-клеток, наблюдаемая в GUCY2c-экспрессирующих линиях опухолевых клеток, LS1034. На фигуре 4C показана GUCY2C-1608-опосредованная активность цитотоксических T-клеток, наблюдаемая в GUCY2c-экспрессирующей линии опухолевых клеток LS174T. На фигуре 4D показано, что не наблюдали активности при использовании GUCY2C-1608 в GUCY2c-отрицательной линии клеток.

На фигурах 5A-5F показан анализ in vitro высвобождения цитокинов, индуцируемого после GUCY2C-1608-опосредованного рекрутирования наивных T-клеток человека к GUCY2c-экспрессирующим клеткам T84. При анализе на основе Luminex выявляли положительную регуляцию ИФН-гамма человека (фигура 5A), ИЛ-10 (фигура 5B), ИЛ-2 (фигура 5C), ИЛ-4 (фигура 5D), ИЛ-6 (фигура 5E) и ФНО-альфа (фигура 5F).

На фигуре 6 показано дозозависимое ингибирование роста опухоли посредством GUCY2C-0247 в опухолевом ксенотрансплантате линии клеток колоректальной карциномы T84 в модели адоптивного переноса.

На фигуре 7 показано дозозависимое ингибирование роста опухоли посредством GUCY2C-0247 в опухолевом ксенотрансплантате линии клеток колоректальной карциномы HT55 в модели адоптивного переноса.

На фигуре 8 показано дозозависимое ингибирование роста опухоли посредством GUCY2C-1608 в опухолевом ксенотрансплантате линии клеток колоректальной карциномы HT55 в модели адоптивного переноса.

На фигуре 9 показано дозозависимое ингибирование роста опухоли посредством биспецифических антител против GUCY2c, GUCY2C-0247 и GUCY2C-1608, в опухолевом ксенотрансплантате линии клеток колоректального рака LS1034 в модели адоптивного переноса.

На фигуре 10 показано ингибирование роста опухоли посредством биспецифических антител против GUCY2c, GUCY2C-0074, GUCY2C-0098 и GUCY2C-0105, в опухолевом ксенотрансплантате линии клеток колоректального рака LS1034 в модели адоптивного переноса.

На фигуре 11 показано дозозависимое ингибирование роста опухоли посредством GUCY2C-0098 в опухолевом ксенотрансплантате, полученном из пациента с колоректальной карциномой, PDX-CRX-11201 в модели адоптивного переноса.

На фигуре 12 показано дозозависимое ингибирование роста опухоли посредством GUCY2C-1608 в опухолевом ксенотрансплантате, полученном из пациента с колоректальной карциномой, PDX-CRX-11201 в модели адоптивного переноса.

На фигуре 13 показано ингибирование роста опухоли посредством GUCY2C-0240 в опухолевом ксенотрансплантате, полученном из пациента с колоректальной карциномой, PDX-CRX-11201 в модели адоптивного переноса.

На фигуре 14 показано ингибирование роста опухоли посредством GUCY2C-0098 в опухолевом ксенотрансплантате, полученном из пациента с колоректальной карциномой, PDX-CRX-12213 в модели адоптивного переноса.

На фигуре 15 показано ингибирование роста опухоли посредством GUCY2C-0247 в опухолевом ксенотрансплантате, полученном из пациента с колоректальной карциномой, PDX-CRX-24225 в модели адоптивного переноса.

На фигуре 16 показана характеризация способности к индуцированию цГМФ и нейтрализации биспецифического антитела против GUCY2c-CD3 в клетках T84.

На фигуре 17 показан анализ LC/MS GUCY2C-1608 после очистки.

На фигуре 18 показана опосредованная T-клетками цитотоксичность биспецифического антитела против GUCY2C с вариантами против CD3. Биспецифические антитела против GUCY2c с разными вариантами CD3 рекрутируют наивные T-клетки человека для индуцирования уничтожения опухолевых клеток T84.

На фигуре 19 показан анализ DELFIA ELISA конкуренции за пептид ECD GUCY2c.

На фигуре 20 показан конкурентный DELFIA ELISA с использованием антитела MS20.

На фигуре 21 показаны подробности области связывания между пептидом GUCY2c и пептидом scFv GUCY2C-1608 при кристаллографии.

На фигуре 22 показана кристаллическая структура двух антигенсвязывающих участков на биспецифическом антителе против GUCY2c-CD3, где показано, что они разделены приблизительно 70 Å и находятся на противоположных сторонах молекулы, прямо напротив друг друга.

На фигуре 23 показаны результаты комбинированных исследований с использованием антитела против VEGF и акситиниба, демонстрировавших аддитивное ингибирование роста опухоли в комбинации с биспецифическим антителом против GUCY2c-CD3.

На фигуре 24 показаны результаты комбинированных исследований с использованием антитела против PD1, демонстрировавшего аддитивное ингибирование роста опухоли в комбинации с биспецифическим антителом против GUCY2c-CD3.

На фигуре 25 показаны результаты комбинированных исследований с использованием антитела против PD-L1, демонстрировавшего аддитивное ингибирование роста опухоли в комбинации с биспецифическим антителом против GUCY2c-CD3.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Представленное в настоящем описании изобретение относится к антителам, специфически связывающимся с GUCY2c (например, GUCY2c человека, GUCY2c мыши, GUCY2c крысы, GUCY2c яванского макака). Кроме того, представленное в настоящем описании изобретение относится к биспецифическим антителам, специфически связывающимся с CD3 (например, CD3 человека) и опухолевым антигеном (например, GUCY2c). Изобретение также относится к полинуклеотидам, кодирующим эти антитела, композициям, содержащим эти антитела, и способам получения и применения этих антител. Изобретение дополнительно относится к способам лечения состояния, ассоциированного с экспрессией GUCY2c, у индивидуума, такого как злокачественное новообразование, с использованием антител (например, антитела против GUCY2, антитела против CD3 или биспецифического антитела), как представлено в настоящем описании.

Общие способы

В практическом осуществлении настоящего изобретения, если не указано иначе, используют общепринятые способы молекулярной биологии (включая рекомбинантные способы), микробиологии, клеточной биологии, биохимии и иммунологии, известные специалистам в этой области. Такие способы полностью описаны в литературе, такой как, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, второе издание (Sambrook et al., 1989) Cold Spring Harbor Press; Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, ed., 1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J.E. Cellis, ed., 1998) Academic Press; Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed., 1987); Introduction to Cell and Tissue Culture (J.P. Mather and P.E. Roberts, 1998) Plenum Press; Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J.B. Griffiths, and D.G. Newell, eds., 1993-1998) J. Wiley and Sons; Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir and C.C. Blackwell, eds.); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.M. Miller and M.P. Calos, eds., 1987); Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel et al., eds., 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction (Mullis et al., eds., 1994); Current Protocols in Immunology (J.E. Coligan et al., eds., 1991); Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999); Immunobiology (C.A. Janeway and P. Travers, 1997); Antibodies (P. Finch, 1997); Antibodies: a practical approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989); Monoclonal antibodies: a practical approach (P. Shepherd and C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000); Using antibodies: a laboratory manual (E. Harlow and D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999); Antibodies (M. Zanetti and J.D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995). В некоторых случаях, термины с общепринято понятным значением определяют в настоящем описании для ясности и/или для справки, и включение таких определений в настоящее описание не следует обязательно истолковывать как существенное различие по сравнению со значением, как правило, общепринято понятным в этой области.

Настоящее изобретение далее будет подробно описано со ссылкой на следующие определения и примеры. Все патенты и публикации, включая все последовательности, описанные в таких патентах и публикациях, упоминаемых в настоящем описании, специально включены в него в качестве ссылок.

Определения

В основном, если не указано иначе, все специальные термины, обозначения и другие научные термины или терминология, используемые в настоящем описании, должны иметь значение, общепринято понятное специалистам в области, к которой относится настоящее изобретение. Например, термин "и/или", как используют в такой фразе, как "A и/или B", в настоящем описании, предназначен для включения A и B; A или B; A (в отдельности); и B (в отдельности). Аналогично, термин "и/или", как используют в такой фразе, как "A, B и/или C", предназначен для включения каждого из следующих вариантов осуществления: A, B и C; A, B или C; A или C; A или B; B или C; A и C; A и B; B и C; A (в отдельности); B (в отдельности) и C (в отдельности).

В рамках изобретения термины в единственном числе включают соответствующее множественное число, если контекст четко не указывает на иное.

В рамках изобретения числовые диапазоны включают числа, определяющие диапазон.

Термин "приблизительно" и т.п., когда он предшествует списку числовых значений или диапазону, относится к каждому отдельному значению в списке или диапазоне независимо, как если бы каждому отдельному значению в списке или диапазоне непосредственно предшествовал этот термин. Термины означают, что значения, к которым они относятся, являются точными, близкими или схожими с ними. Например, в некоторых вариантах осуществления термин "приблизительно" конкретное значение может означать значение, составляющее 99%, 95% или 90% от того значения. Например, выражение "приблизительно 100" включает 99 и 101 и все значения между ними (например, 99,1, 99,2, 99,3, 99,4, 99,5 и т.д.). В качестве другого примера, если температура составляет 70°C, "приблизительно" 70°C могут составлять 69°C, 66°C или 63°C. Следует понимать, что они являются исключительно примерами.

В рамках изобретения термин "в пределах 3,8 ангстрем" означает, что контакты составляют 3,8 ангстрем или менее, что определяют посредством кристаллографии.

В рамках изобретения нуклеиновые кислоты записывают слева направо в 5'-3' направлении; аминокислотные последовательности записывают слева направо в ориентации от амино- к карбокси-концу, соответственно. Практикующие специалисты могут найти определения и специальные термины в Sambrook et al., 1 989, и Ausubel FM et al., 1993. Следует понимать, что настоящее изобретение не ограничено конкретной описанной методологией, способами и реагентами, т.к. их можно варьировать.

Термины "полипептид", "олигопептид", "пептид" и "белок" используют в настоящем описании взаимозаменяемо для обозначения цепей аминокислот любой длины, предпочтительно, относительно коротких (например, 10-100 аминокислот). Цепь может являться линейной или разветвленной, может содержать модифицированные аминокислоты и/или может прерываться не-аминокислотами. Термины также включают аминокислотную цепь, модифицированную природно или посредством вмешательства; например, посредством образования дисульфидной связи, гликозилирования, липидирования, ацетилирования, фосфорилирования или любой другой манипуляции или модификации, такой как конъюгация с компонентом-меткой. В определение также включены, например, полипептиды, содержащие один или более аналогов аминокислот (включая, например, неприродные аминокислоты и т.д.), а также другие модификации, известные в этой области. Следует понимать, что полипептиды могут находиться в форме отдельных цепей или ассоциированные цепи. Предпочтительно, используют полипептиды млекопитающих (полипептиды, исходно полученные из организма млекопитающего), более предпочтительно - напрямую секретируемые в среду.

"Антитело" является молекулой иммуноглобулина, способной специфически связываться с мишенью, такой как углевод, полинуклеотид, липид, полипептид и т.д., с помощью по меньшей мере одного участка распознавания антигена, находящегося в вариабельной области молекулы иммуноглобулина. В рамках изобретения термин включает поликлональное антитело, моноклональное антитело, химерное антитело, биспецифическое антитело, антитело с двойной специфичностью, бифункциональное антитело, триспецифическое антитело, полиспецифическое антитело, биспецифическое гетеродимерное диатело, биспецифическое гетеродимерное IgG, меченое антитело, гуманизированное антитело, антитело человека и их фрагменты (такие как Fab, Fab’, F(ab’)₂, Fv), одноцепочечные (ScFv) и доменные антитела (включая, например, антитела акул и Верблюдовых), слитые белки, содержащие антитело, и любую другую модифицированную конфигурацию молекулы иммуноглобулина, содержащей участок распознавания антигена. Антитело включает антитело любого класса, такого как IgG, IgA или IgM (или их подкласса), и антитело может не принадлежать к какому-либо конкретному классу. В зависимости от аминокислотной последовательности константной области тяжелых цепей антитела иммуноглобулины можно приписывать к разным классам. Существует пять основных классов иммуноглобулинов: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, и некоторые из них можно дополнительно разделять на подклассы (изотипы), например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и IgA2. Константные области тяжелой цепи, соответствующие разным классам иммуноглобулинов, названы альфа, дельта, эпсилон, гамма и мю, соответственно. Структуры субъединиц и трехмерные конфигурации разных классов иммуноглобулинов хорошо известны. Настоящее изобретение также включает "аналоги антител", другие неантительные белковые каркасы, например, слитые белки и/или иммуноконъюгаты, в которых для обеспечения специфического связывания антигена используют CDR. Антитела по изобретению можно получать из любого биологического вида, включая, в качестве неограничивающих примеров, мышь, человека, верблюда, ламу, рыбу, акулу, козу, кролика, курицу и корову.

Термин "антитело" дополнительно включает иммуноглобулиновые молекулы, содержащие четыре полипептидные цепи, две тяжелые цепи (H) и две легкие цепи (L), соединенные друг с другом дисульфидными связями, а также их мультимеры (например, IgM). Каждая тяжелая цепь содержит вариабельную область тяжелой цепи (сокращенно обозначаемую в настоящем описании как VR HC или VH) и константную область тяжелой цепи. Термин "вариабельная область" антитела относится к вариабельной области легкой цепи антитела или вариабельной области тяжелой цепи антитела в отдельности или в комбинации. Константная область тяжелой цепи содержит три домена, CH1, CH2 и CH3. Домены CH1 и CH2 соединены шарнирной областью. Каждая легкая цепь содержит вариабельную область легкой цепи (сокращенно обозначаемую в настоящем описании как VR LC или VL) и константную область легкой цепи. Константная область легкой цепи содержит один домен (CL1). Области VH и VL можно дополнительно разделять на области гипервариабельности, обозначаемые как определяющие комплементарность области (CDR), перемежающие с областями, являющимися более консервативными, обозначаемыми как каркасные области (FR). Каждая VH и VL состоит из трех CDR и четырех FR, расположенных от амино-конца к карбокси-концу в следующем порядке: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. В разных вариантах осуществления изобретения FR антитела против CD3 (или его антигенсвязывающей части) могут являться идентичными последовательностям зародышевой линии человека или природно или искусственно модифицированными. Консенсусную аминокислотную последовательность можно определять посредством параллельного анализа двух или более CDR. CDR в каждой цепи удерживаются в непосредственной близости с помощью FR и вместе с CDR другой цепи участвуют в образовании антигенсвязывающего участка антитела.

В рамках изобретения термин "антигенсвязывающий фрагмент", или "фрагмент антитела", или "антигенсвязывающая часть" относится к одному или более фрагментам антитела, сохраняющим способность специфически связываться с антигеном. Примеры связывающих фрагментов, включенных в термин "антигенсвязывающий фрагмент" антитела, включают (i) вариабельный домен тяжелой цепи антитела (VH), и/или вариабельный домен легкой цепи антитела (VL), или пару VH/VL, полученную из полноразмерных антител или фрагментов антител, таких как домен VH и/или домен VL; (ii) Fab-фрагмент, моновалентный фрагмент, состоящий из доменов VL, VH, CL и CH1; (iii) Fab'-фрагмент, по существу, являющийся Fab с частью шарнирной области (например, Fundamental Immunology, Paul ed., 3.sup.rd ed.1993); (iv) F(ab')₂-фрагмент, бивалентный фрагмент, содержащий два Fab-фрагмента, соединенных дисульфидным мостиком в шарнирной области; (v) Fd-фрагмент, состоящий из доменов VH и CH1; (vi) Fv-фрагмент, состоящий из доменов VL и VH одного плеча антитела; (vii) одноцепочечный F-фрагмента (scFv), отдельная белковая цепь, в которой области VL и VH спариваются с образованием моновалентных молекулы (например, Bird et al. (1988) Science 242:423-426; и Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883); (viii) стабилизированный дисульфидными связями Fv-фрагмент (dsFv), Fv со сконструированной межмолекулярной дисульфидной связью для стабилизации пары VH-VL; (ix) антитело из отдельного вариабельного домена (sdAb или dAb) (например, Ward et al., (1989) Nature 341:544-546), состоящее из вариабельного домена тяжелой цепи и лишенное легкой цепи; (x) определяющую комплементарность область (CDR) и любые их производные.

В рамках изобретения "антигенсвязывающий фрагмент" антитела может содержать по меньшей мере один вариабельный домен. Вариабельный домен может иметь любой размер или аминокислотную композицию и, как правило, будет содержать по меньшей мере одну CDR, смежную или находящуюся в рамке считывания с одной или более каркасными последовательностями. В рамках изобретения "антигенсвязывающий фрагмент антитела" может содержать гомодимер или гетеродимер (или другой мультимер) любой из конфигураций вариабельной области и константного домена, указанных ниже, в нековалентной связи друг с другом и/или с одной или более мономерными областями VH или VL (например, с помощью дисульфидных связей). Например, вариабельная область может являться димерной и содержать димеры VH-VH, VH-VL или VL-VL. Конфигурации вариабельных и константных доменов, которые можно обнаружить в антигенсвязывающем фрагменте антитела по настоящему изобретению, включают: VH-CH1; VH-CH2; VH-CH3; VH-CH1-CH2; VH-CH1-CH2-CH3; VH-CH2-CH3; VH-VL-CL, VH-VL-CH1, VH-VL-CH2; VH-CL; VL-CH1; VL-CH2; VL-CH3; VL-CH1-CH2; VL-CH1-CH2-CH3; VL-CH2-CH3 и VL-CL. Вариабельные области и константные домены можно связывать друг с другом напрямую или с помощью полной или частичной шарнирной или линкерной области. Шарнирная область может состоять из по меньшей мере 2 (например, 5, 10, 15, 20, 40, 60 или более) аминокислот, что приводит к гибкому или полугибкому связыванию между смежными вариабельными областями и/или константными доменами в одной полипептидной молекуле.

В рамках изобретения "связывающий домен" содержит любую область полипептида (например, антитела), отвечающую за селективное связывание с интересующей молекулой (например, антигеном, лигандом, рецептором, субстратом или ингибитором). Примеры связывающих доменов включают вариабельную область антитела, рецептор-связывающий домен, лиганд-связывающий домен и ферментативный домен.

В рамках изобретения термин "акцепторный каркас человека" является каркасом, содержащим аминокислотную последовательность каркаса вариабельной области легкой цепи (VL) или каркаса вариабельной области тяжелой цепи (VH), полученную из каркаса иммуноглобулина человека или консенсусного каркаса человека, как определено ниже. Акцепторный каркас человека, "полученный из" каркаса иммуноглобулина человека или консенсусного каркаса человека, может содержать ту же аминокислотную последовательность или может содержать модификации аминокислотной последовательности. В некоторых вариантах осуществления количество аминокислотных модификаций составляет 10 или менее, 9 или менее, 8 или менее, 7 или менее, 6 или менее, 5 или менее, 4 или менее, 3 или менее или 2 или менее. В некоторых вариантах осуществления акцепторный каркас VL человека является идентичным по последовательности в отношении последовательности каркаса VL иммуноглобулина человека или консенсусной каркасной последовательности человека.

В рамках изобретения термин "аффинно зрелое" антитело относится к антителу с одной или более модификациями в одной или более вариабельных областях, включающих CDR и FR, по сравнению с родительским антителом, не имеющим таких модификаций, и где такие модификации приводят к улучшению аффинности антитела к антигену.

В рамках изобретения термин "Fc-область", "Fc-домен", "Fc-цепь" или аналогичные термины используют для определения C-концевой области тяжелой цепи IgG. Fc-область IgG содержит два константных домена, CH2 и CH3. Домен CH2 Fc-области IgG человека, как правило, располагается от аминокислоты 231 до аминокислоты 340 в соответствии с системой нумерации индекса EU или от аминокислоты 244 до аминокислоты 360 в соответствии с системой нумерации Kabat. Домен CH3 Fc-области IgG человека, как правило, располагается от аминокислоты 341 до аминокислоты 447 в соответствии с системой нумерации индекса EU или от аминокислоты 361 до аминокислоты 478 в соответствии с системой нумерации Kabat. Домен CH2 Fc-области IgG человека (также обозначаемый как домен "Cγ 2") является уникальным в том, что он не спарен тесно с другим доменом. Вместо этого, две N-связанных разветвленных углеводных цепи расположены между двумя доменами CH2 интактного нативного IgG. Fc-область может содержать нативные последовательности Fc или варианты последовательности Fc. Хотя границы последовательности Fc тяжелой цепи иммуноглобулина могут варьироваться, последовательность Fc тяжелой цепи IgG человека, как правило, определяют как располагающуюся от аминокислотного остатка приблизительно в положении Cys226 или приблизительно положении Pro230 до карбокси-конца последовательности Fc. Если в настоящем описании не указано иначе, нумерацию аминокислотных остатков в Fc-области или константной области осуществляют в соответствии с системой нумерации EU, также обозначаемой как индекс EU, как описано в Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991.

В некоторых вариантах осуществления Fc-цепь начинается в шарнирной области непосредственно выше участка расщепления папаином и заканчивается на C-конце антитела. Таким образом, полная Fc-цепь содержит по меньшей мере шарнирный домен, домен CH2 и домен CH3. В некоторых вариантах осуществления Fc-цепь содержит по меньшей мере один из: шарнирного домена (например, верхней, средней и/или нижней шарнирной области), домена CH2, домена CH3, домена CH4 или его варианта, части или фрагмента. В некоторых вариантах осуществления Fc-домен содержит полную Fc-цепь (т.е. шарнирный домен, домен CH2 и домен CH3). В некоторых вариантах осуществления Fc-цепь содержит шарнирный домен (или его часть), слитый с доменом CH3 (или его частью). В некоторых вариантах осуществления Fc-цепь содержит домен CH2 (или его часть), слитый с доменом CH3 (или его частью). В некоторых вариантах осуществления Fc-цепь состоит из домена CH3 или его частью. В некоторых вариантах осуществления Fc-цепь состоит из шарнирного домена (или его части) и домена CH3 (или его части). В некоторых вариантах осуществления Fc-цепь состоит из домена CH2 (или его части) и домена CH3. В некоторых вариантах осуществления Fc-цепь состоит из шарнирного домена (или его части) и домена CH2 (или его части). В некоторых вариантах осуществления в Fc-цепи отсутствует по меньшей мере часть домена CH2 (например, весь домен CH2 или его часть). Термин "Fc-цепь" в основном, относится к полипептиду, содержащему всю Fc-цепь тяжелой цепи иммуноглобулина или его часть. Это включает, в качестве неограничивающих примеров, полипептиды, содержащие полные домен CH1, шарнирный домен, домены CH2 и/или CH3, а также фрагменты таких пептидов, содержащие только, например, шарнирный домен, домен CH2 и домен CH3. Fc-цепь можно получать из иммуноглобулина любого биологического вида и/или любого подтипа, включая, в качестве неограничивающих примеров, антитело IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgD, IgA, IgE или IgM человека. Fc-домен включает нативные молекулы Fc и варианты молекул Fc. Как и в случае вариантов Fc и нативных Fc, термин "Fc-цепь" включает молекулы в мономерной или мультимерной форме, отщеплена ли она от целого антитела или получена другими способами. В некоторых вариантах осуществления Fc-цепь содержит карбокси-концевые части обеих тяжелых цепей, удерживаемые вместе посредством дисульфидных связей. В некоторых вариантах осуществления Fc-цепь состоит из домена CH2 и домена CH3.

В этой области термины "Fc-рецептор" и "FcR" используют для описания рецептора, связывающегося с Fc-областью антитела. Предпочтительным FcR является нативная последовательность FcR человека. Кроме того, предпочтительным FcR является FcR, связывающийся с антителом IgG (гамма-рецептор), и включает рецепторы подклассов FcγRI, FcγRII и FcγRIII, включая аллельные варианты и альтернативно сплайсированные формы этих рецепторов. Рецепторы FcγRII включают FcγRIIA ("активирующий рецептор") и FcγRIIB ("ингибирующий рецептор"), имеющие схожие аминокислотные последовательности, отличающиеся, главным образом, своими цитоплазматическими доменами. Обзор FcR см. в Ravetch and Kinet, Ann. Rev. Immunol., 9:457-92, 1991; Capel et al., Immunomethods, 4:25-34, 1994; и de Haas et al., J. Lab. Clin. Med., 126:330-41, 1995. Термин "FcR" также включает неонатальный рецептор FcRn, отвечающий за перенос материнских IgG в плод (Guyer et al., J. Immunol., 117:587, 1976; и Kim et al., J. Immunol., 24:249, 1994).

"Нативная последовательность Fc-области" или "Fc-область дикого типа" содержит аминокислотную последовательность, идентичную аминокислотной последовательности Fc-области, обнаруживаемой в природе. Термин Fc IgG "дикого типа" человека означает последовательность аминокислот, встречающуюся в природе в популяции людей. Разумеется, как и последовательность Fc может немного варьироваться среди индивидуумов, можно осуществлять одно или более изменений в последовательности дикого типа, и она все равно будет входить в объем изобретения. Например, Fc-область может содержать дополнительные изменения, не относящиеся к настоящему изобретению, такие как мутация в участке гликозилирования, включение неприродной аминокислоты или мутация "выступ-во-впадину".

"Вариант Fc-области" или "вариант Fc-цепи" содержит аминокислотную последовательность, отличающуюся от нативной последовательности Fc-области по меньшей мере одной аминокислотной модификацией, но сохраняющую по меньшей мере одну эффекторную функцию нативной последовательности Fc-области. В некоторых вариантах осуществления вариант Fc-цепи имеет по меньшей мере одну замену аминокислоты по сравнению с нативной последовательностью Fc-цепи или Fc-области родительского полипептида, например, от приблизительно одной до приблизительно десяти замен аминокислот, и предпочтительно - от приблизительно одной до приблизительно пяти замен аминокислот в нативной последовательности Fc-цепи или Fc-цепи родительского полипептида. В настоящем описании вариант Fc-цепи, предпочтительно, будет иметь по меньшей мере приблизительно 80% идентичности последовательности в отношении нативной последовательности Fc-цепи и/или Fc-цепи родительского полипептида, и наиболее предпочтительно - по меньшей мере, приблизительно 90% идентичности последовательности, более предпочтительно - по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 96%, по меньшей мере приблизительно 97%, по меньшей мере приблизительно 98%, по меньшей мере приблизительно 99% идентичности последовательности.

В рамках изобретения термин "эффекторные функции" относится к видам биологической активности, приписываемым Fc-цепи (нативной последовательности Fc-цепи или аминокислотной последовательности варианта Fc-цепи) антитела и варьируется в зависимости от изотипа антитела. Примеры эффекторных функций антител включают: связывание C1q и обусловленную комплементом цитотоксичность; связывание Fc-рецептора; антителозависимую клеточную цитотоксичность (ADCC); фагоцитоз; отрицательную регуляцию рецепторов поверхности клетки (например, B-клеточного рецептора) и активацию B-клеток. Для таких эффекторных функций, как правило, необходимо комбинирование Fc-цепи со связывающим доменом (например, вариабельной областью антитела), и их можно оценивать с использованием различных анализов, известных в этой области для оценки таких эффекторных функций антител. Пример измерения эффекторной функции осуществляют с помощью связывания Fcγ3 и/или C1q.

Эффекторные функции антител определяются последовательностями Fc-цепи; эта цепь также является частью, распознаваемой Fc-рецепторами (FcR), обнаруживаемыми на некоторых типах клеток.

В некоторых вариантах осуществления полипептид Fc содержит часть или всю последовательность шарнирной области дикого типа (как правило, на N-конце). В некоторых вариантах осуществления полипептид Fc не содержит функциональную последовательность шарнирной области или последовательность шарнирной области дикого типа.

В рамках изобретения термин "шарнирная область", "шарнирная последовательность" и его варианты включает значение, известное в этой области, проиллюстрированное, например, в Janeway et al., ImmunoBiology: the immune system in health and disease, Elsevier Science Ltd., NY (4th ed., 1999); Bloom et al., Protein Science, 6:407-415, 1997; и Humphreys et al., J. Immunol. Methods, 209:193-202, 1997.

В рамках изобретения термин "иммуноглобулиноподобная шарнирная область", "иммуноглобулиноподобная шарнирная последовательность" или его варианты относится к шарнирной области и шарнирной последовательности иммуноглобулиноподобной или антитело-подобной молекулы (например, иммуноадгезинов). В некоторых вариантах осуществления иммуноглобулиноподобную шарнирную область можно получать из любого подтипа IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4 или из IgA, IgE, IgD или IgM, включая их химерные формы, например, химерной шарнирной области IgG1/2.

В некоторых вариантах осуществления шарнирную область можно получать из подтипа IgG1 человека от аминокислоты 216 до аминокислоты 230 в соответствии с системой нумерации индекса EU или от аминокислоты 226 до аминокислоты 243 в соответствии с системой нумерации Kabat. В некоторых вариантах осуществления последовательность может представлять собой EPKSCDKTHTCPPCP (SEQ ID NO: 186). Специалисты в этой области могут отличаться по своему пониманию конкретных аминокислот, соответствующих различным доменам молекулы IgG. Таким образом, N-конец или C-конец доменов, описанных выше, может быть длиннее или короче на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или даже 10 аминокислот.

В некоторых вариантах осуществления шарнирная область может являться мутантной на одну или более аминокислот. В некоторых вариантах осуществления шарнирная область может быть укороченной и содержать лишь часть полной шарнирной области. В некоторых вариантах осуществления шарнирная область может содержать только последние 5 аминокислот шарнирной области.

В рамках изобретения термины "связанный", "слитый", "слияние", "ковалентно связанный", "ковалентно соединенный" и "генетически слитый" используют взаимозаменяемо. Эти термины относятся к соединению двух или более элементов или компонентов любыми способами, включая химическую конъюгацию или рекомбинантные способы. В рамках изобретения термин "ковалентно связанный" означает, что указанные фрагменты напрямую ковалентно связывают друг с другом или косвенно ковалентно соединяют друг с другом с помощью промежуточного остатка или остатков, таких как линкерный пептид или фрагмент. В предпочтительном варианте осуществления фрагменты ковалентно слиты. Одним из типов ковалентной связи является пептидная связь. Способы химической конъюгации (например, с использованием гетеробифункциональных перекрестно-сшивающих средств) известны в этой области. Слитые фрагменты также можно подвергать генетическому слиянию. В рамках изобретения термин "генетически слитый" или "генетически связанный" относится к колинейной ковалентной связи или присоединению двух или более белков, полипептидов или их фрагментов через их отдельные пептидные остовы, посредством генетической экспрессии единой полинуклеотидной молекулы, кодирующей эти белки, полипептиды или фрагменты. Такое генетическое слияние приводит к экспрессии единой смежной генетической последовательности. Предпочтительное генетическое слияние осуществляют в рамке считывания, т.е. две или более открытые рамки считывания (ORF) подвергают слиянию с образованием непрерывной более длинной ORF таким образом, чтобы сохранить правильную рамку считывания исходных ORF. Таким образом, получаемый рекомбинантный слитый белок является единым полипептидом, содержащим два или более белковых сегмента, соответствующих полипептидам, кодируемым исходными ORF (при этом сегменты в норме не соединены таким образом в природе). В этом случае, единый полипептид расщепляется при процессинге с образованием димерных молекул, содержащих две полипептидные цепи.

В рамках изобретения термин "модификация" относится к замене, инсерции и/или делеции аминокислоты в полипептидной последовательности, изменению во фрагменте, химически соединенном с белком, или модификации функции белка, например, антитела. Например, модификация может представлять собой измененную функцию антитела или измененную углеводную структуру, присоединенную к белку. В рамках изобретения термин "аминокислотная модификация" относится к мутации (замене), инсерции (добавлению) или делеции одного или более аминокислотных остатков в антителе. Термин "мутация аминокислоты" означает замену по меньшей мере одного существующего аминокислотного остатка другим, отличающимся аминокислотным остатком (например, замену аминокислотного остатка). Термин "делеция аминокислоты" означает удаление по меньшей мере одного аминокислотного остатка в заранее определенном положении в аминокислотной последовательности. Например, мутация L234A означает, что аминокислотный остаток лизин в положении 234 в Fc-области антитела заменен аминокислотным остатком аланином (замена лизина аланином) (нумерация в соответствии с индексом EU). Термин "природный аминокислотный остаток" означает аминокислотный остаток из группы, состоящей из аланина (трехбуквенное обозначение: Ala, однобуквенное обозначение: A), аргинина (Arg, R), аспарагина (Asn, N), аспарагиновой кислоты (Asp, D), цистеина (Cys, C), глутамина (Gln, Q), глутаминовой кислоты (Glu, E), глицина (Gly, G), гистидина (His, H), изолейцина (Ile, I), лейцина (Leu, L), лизина (Lys, K), метионина (Met, M), фенилаланина (Phe, F), пролина (Pro, P), серина (Ser, S), треонина (Thr, T), триптофана (Trp, W), тирозина (Tyr, Y) и валина (Val, V).

В рамках изобретения "консервативная аминокислотная замена" является заменой, при которой аминокислотный остаток заменяют аминокислотным остатком, имеющим схожую боковую цепь. В этой области определены семейства аминокислотных остатков, имеющих схожие боковые цепи. Эти семейства включают аминокислоты с основными боковыми цепями (например, лизин, аргинин, гистидин), кислыми боковыми цепями (например, аспарагиновую кислоту, глутаминовую кислоту), незаряженными полярными боковыми цепями (например, аспарагин, глутамин, серин, треонин, тирозин, цистеин), неполярными боковыми цепями (например, глицин, аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин, триптофан), бета-разветвленными боковыми цепями (например, треонин, валин, изолейцин) и ароматическими боковыми цепями (например, тирозин, фенилаланин, триптофан, гистидин).

В рамках изобретения "заменимый" аминокислотный остаток является остатком, который можно изменять относительно последовательности дикого типа связывающего средства, например, антитела, без устранения или без существенного изменения биологической активности, в то время как изменение "незаменимого" аминокислотного остатка приводит к такому изменению. В антителе незаменимый аминокислотный остаток может являться определяющим специфичность остатком (SDR).

Термин "средство" используют в настоящем описании для обозначения биологической макромолекулы, экстракта из биологических материалов, смеси биологических макромолекул, химического соединения, смеси химических соединений и/или смеси химических соединений и биологических макромолекул. Термин "терапевтическое средство" относится к средству, имеющему биологическую активность.

В рамках изобретения термин "моноклональное антитело" относится к антителу, полученному из популяции, по существу, гомогенных антител, т.е. отдельные антитела, составляющие популяцию, являются идентичными, за исключением возможных природных мутаций, которые могут присутствовать в незначительных количествах. Моноклональные антитела являются высокоспецифическими и направлены против одного антигенного участка. Кроме того, в отличие от препаратов поликлональных антител, которые, как правило, включают различные антитела, направленные против разных детерминант (эпитопов), каждое моноклональное антитело направлено против одной и той же детерминанты на антигене. Определение "моноклональное" свидетельствует о природе антитела как полученного из, по существу, гомогенной популяции антител, и не следует истолковывать его как требующее получения антитела любым конкретным способом. Например, моноклональные антитела для использования по настоящему изобретению, можно получать гибридомным способом, впервые описанным в Kohler and Milstein, Nature 256:495, 1975, или способами рекомбинантной ДНК, как описано в патенте США № 4816567. Моноклональные антитела также можно выделять из фаговых библиотек, полученных способом, описанным, например, в McCafferty et al., Nature 348:552-554, 1990.

Антитела по настоящему изобретению могут являться "гуманизированными антителами". В рамках изобретения термин "гуманизированное" антитело относится к формам не принадлежащих человеку антител (например, мыши, крысы, кролика, не являющегося человеком примата или другого млекопитающего), являющихся химерными иммуноглобулинами, иммуноглобулиновыми цепями или их фрагментами (такими как Fv, Fab, Fab’, F(ab')₂ или другие антигенсвязывающие подпоследовательности антител), содержащими один или более аминокислотных остатков, включенных в них из источника, не принадлежащего человеку. Эти не принадлежащий человеку аминокислотные остатки зачастую обозначают как "импортируемые" остатки, как правило, получаемые из "импортируемого" вариабельного домена. Импортируемый остаток, последовательность или антитело имеет желаемую аффинность и/или специфичность или другую желаемую биологическую активность антитела, представленную в настоящем описании.

Предпочтительно, гуманизированные антитела являются иммуноглобулинами человека (реципиентное антитело), в которых остатки из определяющей комплементарность области (CDR) реципиента заменяют остатками CDR не являющихся человеком видов (донорное антитело), таких как мышь, крыса или кролик, имеющими желаемую специфичность, аффинность и емкость. В некоторых случаях остатки каркасной области Fv (FR) иммуноглобулина человека заменяют соответствующими не принадлежащими человеку остатками. Кроме того, гуманизированное антитело может содержать остатки, не обнаруживаемые ни в реципиентном антителе, ни в импортируемых последовательностях CDR или каркас, но включенные для дополнительного улучшения и оптимизации свойств антител. В основном, гуманизированное антитело будет содержать, по существу, все из по меньшей мере одной и, как правило, двух вариабельных областей, в которых все или, по существу, все из областей CDR соответствуют CDR не принадлежащего человеку иммуноглобулина, и все или, по существу, все из областей FR являются областями из консенсусной последовательности иммуноглобулина человека. Гуманизированное антитело оптимально также будет содержать по меньшей мере часть константной области иммуноглобулина или домен (Fc), как правило, из иммуноглобулина человека. Предпочтительными являются антитела, имеющие Fc-цепи, модифицированные, как описано в WO 99/58572. Другие формы гуманизированных антител имеют одну или более CDR (CDR L1, CDR L2, CDR L3, CDR H1, CDR H2 или CDR H3), измененные относительно исходного антитела, также обозначаемые как одна или более CDR, "полученные из" одной или более CDR из исходного антитела. В рамках изобретения термин "гуманизированный" предназначен для включения деиммунизированных антител.

В рамках изобретения термин "антитело человека" означает антитело, имеющее аминокислотную последовательность, соответствующую последовательности антитела, продуцируемого человеком и/или полученного любым из способов получения антител человека, известных специалистам в этой области или представленных в настоящем описании. Таким образом, в рамках изобретения термин "антитело человека" предназначен для включения антител, имеющих вариабельные и константные области, полученные из последовательностей иммуноглобулинов зародышевой линии человека. Антитела человека по изобретению могут включать аминокислотные остатки, не кодируемые последовательностями иммуноглобулинов зародышевой линии человека (например, мутации, встроенные посредством случайного или сайт-специфического мутагенеза in vitro или соматической мутации in vivo), например, в CDR, и в частности, CDR3. Это определение антитела человека включает антитела, содержащие по меньшей мере один полипептид тяжелой цепи человека или по меньшей мере один полипептид легкой цепи человека. Одним из таких примеров является антитело, содержащее полипептиды легкой цепи мыши и тяжелой цепи человека. Антитела человека можно получать различными способами, известными в этой области. В одном из вариантов осуществления антитело человека выбрано из фаговой библиотеки, где фаговая библиотека экспрессирует антитела человека (Vaughan et al., Nature Biotechnology, 14:309-314, 1996; Sheets et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 95:6157-6162, 1998; Hoogenboom и Winter, J. Mol. Biol., 227:381, 1991; Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581, 1991). Антитела человека также можно получать посредством иммунизации животных, в которые локусы иммуноглобулинов человека трансгенно встроены вместо эндогенных локусорв, например, мышей, в которых эндогенные гены иммуноглобулинов частично или полностью инактивированы. Этот подход описан в патентах США №№ 5545807, 5545806, 5569825, 5625126, 5633425 и 5661016. Альтернативно, антитело человека можно получать посредством иммортализации B-лимфоцитов человека, продуцирующих антитело против антигена-мишени (такие B-лимфоциты можно выделять из индивидуума или при клонировании отдельных клеток с использованием кДНК, или их можно иммунизировать in vitro). См., например, Cole et al. Monoclonal antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77, 1985; Boerner et al., J. Immunol., 147(1):86-95, 1991; и патент США № 5750373.

Антитела человека по настоящему изобретению могут существовать по меньшей мере в двух формах, что связано с гетерогенностью шарнирной области. Например, молекула иммуноглобулина содержит стабильную конструкцию из четырех цепей массой приблизительно 150-160 кДа, в которой димеры удерживаются вместе с помощью межцепочечных дисульфидных связей между тяжелыми цепями. Альтернативно, димеры не связаны с помощью межцепочечных дисульфидных связей, и образуется молекула массой приблизительно 75-80 кДа, состоящая из ковалентно соединенных легкой и тяжелой цепей (полу-антитело).

В рамках изобретения термин "рекомбинантное антитело человека" предназначен для включения всех антител человека, полученных, экспрессированных, созданных или выделенных рекомбинантными способами, таких как антитела, экспрессируемые с использованием рекомбинантного экспрессирующего вектора, с помощью которого трансфицируют клетку-хозяина (описано ниже), антитела, выделенные из рекомбинантной комбинаторной библиотеки антител человека (описано ниже), антитела, выделенные из животного (например, мыши), являющегося трансгенным по генам иммуноглобулина человека (см., например, Taylor et al. (1992) Nucl. Acids Res. 20:6287-6295), или антитела, полученные, экспрессированные, созданные или выделенные любыми другими способами, включающими сплайсинг последовательностей генов иммуноглобулина человека с другими последовательностями ДНК. Такие рекомбинантные антитела человека имеют вариабельные и константные области, полученные из последовательностей иммуноглобулинов зародышевой линии человека. Однако в некоторых вариантах осуществления такие рекомбинантные антитела человека подвергают мутагенезу in vitro (или, если используют животное, трансгенное по последовательностям Ig человека, соматическому мутагенезу in vivo), и, таким образом, аминокислотные последовательности областей VH и VL рекомбинантных антител являются последовательностями, которые, хотя и происходят из последовательностей VH и VL зародышевой линии человека и являются родственными им, могут не существовать в природе в репертуаре антител зародышевой линии человека in vivo.

Антитела по изобретению могут являться "химерными" антителами, в которых часть тяжелой и/или легкой цепи является идентичной или гомологичной соответствующим последовательностям в антителах, полученных из конкретных видов или принадлежащих к конкретному классу или подклассу антител, в то время как остальная часть цепей является идентичной или гомологичной соответствующим последовательностям в антителах, полученных из других видов или принадлежащих к другому классу или подклассу антител, а также фрагментами таких антител при условии, что они проявляют желательную биологическая активность (патент США № 4816567; и Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855, 1984). Интересующие химерные антитела в настоящем описании включают приматизированные антитела, содержащие антигенсвязывающие последовательности вариабельной области, полученные из не являющегося человеком примата (например, обезьян Старого Света, человекообразных обезьян и т.д.), и последовательности константной области человека.

"Моновалентное антитело" содержит один антигенсвязывающий участок на молекулу (например, IgG или Fab). В некоторых случаях моновалентное антитело может иметь более одного антигенсвязывающего участка, но связывающие участки предназначены для разных антигенов.

Термин "моноспецифическое антитело" относится к антителу или препарату антител, содержащему два идентичных антигенсвязывающих участка на молекулу (например, IgG) таким образом, что два связывающих участка связываются с идентичным эпитопом на антигене. Таким образом, они конкурируют друг с другом за связывание с одной молекулой антигена. Этот термин включает "моноклональное антитело" или "композицию моноклональных антител". Большинство антител, обнаруживаемых в природе, являются моноспецифическими. В некоторых случаях моноспецифическое антитело может являться моновалентным антителом (например, Fab).

"Бивалентное антитело" содержит два антигенсвязывающих участка на молекулу (например, IgG). В некоторых случаях два связывающих участка имеют одинаковую антигенную специфичность. Однако бивалентные антитела могут являться биспецифическими.

В рамках изобретения "биспецифическое антитело", "антитело с двойной специфичностью", "бифункциональное антитело", "гетеромультимер", "гетеромультимерный комплекс", "биспецифическое гетеродимерное диатело" или "гетеромультимерный полипептид" представляет собой молекулу, содержащую по меньшей мере первый полипептид и второй полипептид, где второй полипептид отличается по аминокислотной последовательности от первого полипептида по меньшей мере на один аминокислотный остаток. В некоторых случаях биспецифическое антитело является искусственным гибридным антителом, имеющих две разные области тяжелой цепи и области легкой цепи. Предпочтительно, биспецифическое антитело имеет специфичность связывания по меньшей мере для двух разных лигандов, антигенов или участков связывания. Таким образом, биспецифические антитела могут связываться одновременно с двумя разными антигенами. Два антигенсвязывающих участка биспецифического антитела связываются с двумя разными эпитопами, которые могут находиться на одной или разных белковых мишенях, например, опухолевой мишени.

В рамках изобретения термин "антиген-мишень", "антиген клетки-мишени", "опухолевый антиген" или "опухолеспецифический антиген" относится к антигенной детерминанте, присутствующей на поверхности клетки-мишени, например, клетки в опухоли, такой как злокачественная клетка или клетка опухолевой стромы.

Термины "мутационная нагрузка" используют в настоящем описании взаимозаменяемо. Мутационная нагрузка опухоли является мерой количества мутаций в опухолевом геноме, определяемой как общее количество мутаций на кодирующую область опухолевого генома. Наблюдают значительную вариабельность мутационной нагрузки среди типов опухолей в диапазоне от всего лишь нескольких мутаций до тысяч мутаций (Alexandrov LB et al., Nature 2013;500(7463):415-421; Lawrence MS et al., Nature 2013;499:214-218; Vogelstein B et al., Science, 2013;339:1546-1558).

В рамках изобретения первая полипептидная цепь и вторая полипептидная цепь "биспецифического антитела" содержат по меньшей мере одну VL антитела и одну VH антитела или ее фрагмент, где оба связывающих домена антитела содержатся в одной полипептидной цепи, и где области VL и VH в каждой полипептидной цепи получены из разных антител.

Биспецифическое антитело, антитело с двойной специфичностью, бифункциональное антитело, гетеромультимер, гетеромультимерный комплекс, биспецифическое гетеродимерное диатело или гетеромультимерный полипептид могут образовывать третичные структуры более высокого порядка, где присутствуют другие полипептиды в дополнение к первому и второму полипептиду. Полипептиды гетеромультимера могут взаимодействовать друг с другом посредством непептидной ковалентной связи (например, дисульфидной связи) и/или нековалентного взаимодействия (например, водородных связей, ионных связей, вандерваальсовых сил и/или гидрофобных взаимодействий).

Биспецифическое антитело, антитело с двойной специфичностью, бифункциональное антитело, гетеромультимер, гетеромультимерный комплекс, биспецифическое гетеродимерное диатело или гетеромультимерный полипептид можно получать посредством конструирования sFv-фрагментов с короткими линкерами (например, приблизительно 3-10 остатков) между областями VH и VL таким образом, что достигают межцепочечного, а не внутрицепочечного спаривания V-областей, что приводит к образованию бивалентного фрагмента, т.е. фрагмента, имеющего два антигенсвязывающих участка. Биспецифические антитела можно получать из полноразмерных антител или фрагментов антител (например, биспецифических антител F(ab′)₂). Диатела более подробно описывают, например, в EP404,097; WO93/11161; и Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448, 1993. Биспецифические антитела являются гетеродимерами двух "перекрестных" sFv-фрагментов, в которых области VH и VL двух антител находятся на разных полипептидных цепях.

В рамках изобретения термин "выделенное антитело" означает антитело, идентифицированное и отделенное и/или выделенное из по меньшей мере одного компонента из своего природного окружения. Например, антитело, отделенное или удаленное от по меньшей мере одного компонента организма или от ткани или клетки, в которой антитело существует или продуцируется в природе, является "выделенным антителом" в соответствии с целями по настоящему изобретению. Выделенное антитело также включает антитело in situ в рекомбинантной клетке. Выделенные антитела являются антителами, подвергнутыми по меньшей мере одной стадии очистки или выделения. В некоторых вариантах осуществления выделенное антитело может, по существу, не содержать другой клеточный материал и/или химические вещества.

В рамках изобретения термин "связанный" или "связь" относится к прямому соединению посредством пептидной связи между первой и второй аминокислотной последовательностью или соединению, включающему третью аминокислотную последовательность, соединенную пептидной связью с первой и второй аминокислотными последовательностями. Например, линкер, соединенной пептидной связью с C-концом одной аминокислотной последовательности и N-концом другой аминокислотной последовательности.

В рамках изобретения термин "линкер" относится к аминокислотной последовательности длиной две или более аминокислот. Линкер может состоять из нейтральных полярных или неполярных аминокислот. Линкер может составлять, например, от 2 до 100 аминокислот в длину, например, от 2 до 50 аминокислот в длину, например, 3, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 или 50 аминокислот в длину. Линкер может являться "расщепляемым", например, посредством саморасщепления или ферментативного или химического расщепления. Участки расщепления в аминокислотных последовательностях и ферменты и химические вещества, расщепляющие по таким участкам, хорошо известны в этой области, а также представлены в настоящем описании.

В рамках изобретения термин "дисульфидная связь" или "цистеин-цистеиновая дисульфидная связь" относится к ковалентному взаимодействию между двумя цистеинами, в которых атомы серы из цистеинов окисляются с образованием дисульфидной связи. Средняя энергия связи в случае дисульфидной связи составляет приблизительно 60 ккал/моль по сравнению с 1-2 ккал/моль в случае водородной связи. В контексте настоящего изобретения цистеины, образующие дисульфидную связь, находятся в каркасных областях одноцепочечного антитела и служат для стабилизации конформации антитела. Остатки цистеина можно встраивать, например, посредством сайт-специфического мутагенезу таким образом, что в молекуле могут образовываться стабилизирующие дисульфидные связи.

Обозначение "выступ-во-впадину" является аналогичным обозначению "выступ и впадина", и их можно использовать взаимозаменяемо.

Термин "выступ" относится по меньшей мере к одной боковой цепи аминокислоты, выступающей с контактной поверхности первого полипептида и, таким образом, располагаемой в компенсаторной впадине в смежной контактной поверхности (т.е. контактной поверхности второго полипептида) для стабилизации гетеродимера, что, таким образом, способствует образованию гетеродимера по сравнению с образованием гомодимера. Выступ может существовать на исходной контактной поверхности, или его можно встраивать синтетически (например, посредством измерения нуклеиновой кислоты, кодирующей контактную поверхность). Как правило, нуклеиновую кислоту, кодирующую контактную поверхность первого полипептида, изменяют так, что она кодирует выступ. Для достижения этого нуклеиновую кислоту, кодирующую по меньшей мере один исходный аминокислотный остаток в контактной поверхности первого полипептида, заменяют нуклеиновой кислотой, кодирующей, по меньшей мере один импортируемый аминокислотный остаток, имеющий больший объем боковой цепи, чем исходный аминокислотный остаток. Верхним пределом количества исходных остатков, подвергаемых замене, является общее количество остатков в контактной поверхности первого полипептида. Некоторые импортируемые остатки для образования выступа, как правило, являются природными аминокислотными остатками и, предпочтительно, выбраны из аргинина (R), фенилаланина (F), тирозина (Y) и триптофана (W).

Выступ "располагается" во впадине, что означает, что пространственное расположение выступа и впадины на контактной поверхности первого полипептида и второго полипептида, соответственно, и размеры выступа и впадины являются такими, что выступ может располагаться во впадине без значительного нарушения нормального соединения первого и второго полипептидов в контактной поверхности. Т.к. выступы, такие как фенилаланин (F), тирозин (Y) и триптофан (W), как правило, не располагаются перпендикулярно от оси контактной поверхности, выравнивание выступа с соответствующей впадиной основано на моделировании пары выступ/впадина на основе трехмерной структуры, например, получаемой посредством рентгеновской кристаллографии или ядерного магнитного резонанса (ЯМР). Этого можно достигать способами, широко распространенными в этой области.

Термин "впадина" относится по меньшей мере к одной боковой цепи аминокислоты, углубленной относительно контактной поверхности второго полипептида и, таким образом, принимающей соответствующий выступ на смежной контактной поверхности первого полипептида. Впадина может существовать на исходной контактной поверхности, или ее можно встраивать синтетически (например, посредством изменения нуклеиновой кислоты, кодирующей контактную поверхность). Как правило, нуклеиновую кислоту, кодирующую контактную поверхность второго полипептида, изменяют так, что она кодирует впадину. Для достижения этого нуклеиновую кислоту, кодирующую по меньшей мере один исходный аминокислотный остаток в контактной поверхности второго полипептида, заменяют ДНК, кодирующей по меньшей мере один "импортируемый" аминокислотный остаток, имеющий меньший объем боковой цепи, чем исходный аминокислотный остаток. Верхним пределом количества исходных остатков, подвергаемых замене, является общее количество остатков в поверхности раздела второго полипептида. Некоторые импортируемые остатки для образования впадины, как правило, являются природными аминокислотными остатками и, предпочтительно, выбраны из аланина (A), серина (S), треонина (T) и валина (V).

В рамках изобретения термины "контактная поверхность", "остаток контактной поверхности", "аминокислота контактной поверхности", "контактный остаток" или "контактная аминокислота", как правило, относятся к любому аминокислотному остатку, присутствующему в домене, который может участвовать в контактах между первым полипептидом и вторым полипептидом.

"Исходный аминокислотный" остаток является остатком, заменяемым "импортируемым аминокислотным" остатком, который может иметь меньший или больший объем боковой цепи, чем исходный остаток. Импортируемый аминокислотный остаток может являться природным или неприродным аминокислотным остатком, но предпочтительно является первым из них. "Природные" аминокислотные остатки являются остатками, кодируемыми генетическим кодом. Термин "неприродный" аминокислотный остаток означает остаток, некодируемый генетическим кодом, но способный ковалентно связываться со смежными аминокислотными остатками полипептидной цепи. Примерами неприродных аминокислотных остатков являются норлейцин, орнитин, норвалин, гомосерин и другие аналоги аминокислотных остатков, такие как описываемые, например, в Ellman et al., Meth. Enzym. 202:301-336 (1991). В некоторых вариантах осуществления способ по настоящему изобретению может включать замену по меньшей мере одного исходного аминокислотного остатка, но можно заменять более одного исходного остатка. Как правило, не более чем общее количество остатков в контактной поверхности первого или второго полипептида может содержать исходные аминокислотные остатки, подвергаемые замене.

В рамках изобретения термин "конкурирует" в отношении антитела означает, что первое антитело или его антигенсвязывающий фрагмент (или часть) связывается с эпитопом, по существу, схоже со связыванием второго антитела или его антигенсвязывающей части, таким образом, что результат связывания первого антитела с его когнатным эпитопом детектируемо снижается в присутствии второго антитела по сравнению со связыванием первого антитела в отсутствие второго антитела. Альтернативный вариант, в котором связывание второго антитела с его эпитопом также детектируемо снижается в присутствии первого антитела, может иметь место, но не является обязательным. Т.е. первое антитело может ингибировать связывание второго антитела с его эпитопом без ингибирования вторым антителом связывания первого антитела с его соответствующим эпитопом. Однако если каждое антитело детектируемо ингибирует связывание другого антитела с его когнатным эпитопом или лигандом с той же, большей или меньшей степенью, указывают, что антитела "перекрестно конкурируют" друг с другом за связывание с их соответствующими эпитопами. Конкурирующие и перекрестно конкурирующие антитела входят в объем настоящего изобретения. Независимо от механизма, посредством которого происходит такая конкуренция или перекрестная конкуренция (например, стерическое препятствие, конформационное изменение или связывание с общим эпитопом или его частью), специалистам в этой области с учетом идей, представленных в настоящем описании, будет понятно, что предусмотрены такие конкурирующие и/или перекрестно конкурирующие антитела, и их можно использовать для способов, представленных в настоящем описании.

В рамках изобретения термин "антителозависимая клеточная цитотоксичность" или "ADCC" относится к клеточно-опосредованной реакции, при которой неспецифические цитотоксические клетки, экспрессирующие Fc-рецепторы (FcR) (например, естественные киллеры (NK), нейтрофилы и макрофаги), распознают связанное антитело на клетке-мишени, а затем вызывают лизис клетки-мишени. Активность ADCC интересующей молекулы можно оценивать с использованием анализа ADCC in vitro, как описано в патентах США №№ 5500362 или 5821337. Эффекторные клетки, которые можно использовать для таких анализов, включают мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC) и NK-клетки. Альтернативно или дополнительно, активность ADCC интересующей молекулы можно оценивать in vivo, например, в модели на животных, как описано в Clynes et al., PNAS (USA), 95:652-656, 1998.

В рамках изобретения термин "обусловленная комплементом цитотоксичность" или "CDC" относится к лизису мишени в присутствии комплемента. Путь активации комплемента инициируется связыванием первого компонента системы комплемента (C1q) с молекулой (например, антителом), комплексированной с когнатным антигеном. Для оценки активации комплемента можно осуществлять анализ CDC, например, как описано в Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods, 202: 163, 1996.

В рамках изобретения термины "иммуноспецифически связывается", "иммуноспецифически распознает", "специфически связывается", "специфически распознает" и аналогичные термины относятся к молекулам, например, связывающим доменам, специфически связывающимся с антигеном (например, эпитопом или иммунным комплексом) и не связывающимся специфически с другой молекулой. Молекула, специфически связывающаяся с антигеном, может связываться с другими пептидами или полипептидами с более низкой аффинностью, что определяют посредством анализов, известных в этой области, например, иммунологических анализов, BIACORE™ или других анализов. Предпочтительно, молекулы, специфически связывающиеся с антигеном, не реагируют перекрестно с другими белками.

Подходящие "условия умеренной строгости" включают предварительную промывку в растворе 5-кратного SSC, 0,5% SDS, 1,0 мМ ЭДТА (pH 8,0); гибридизацию при 50°C-65°C, 5-кратный SSC, в течение ночи; с последующей двукратной промывкой при 65°C в течение 20 минут каждым из 2-кратного, 0,5-кратного и 0,2-кратного SSC, содержащего 0,1% SDS.

В рамках изобретения "условия высокой строгости" являются следующими: (1) для промывки используют низкую ионную силу и высокую температуру, например, 0,015 M хлорида натрия/0,0015 M цитрата натрия/0,1% додецилсульфата натрия при 50°C; (2) во время гибридизации используют денатурирующее средство, такое как формамид, например, 50% (об./об.) формамида с 0,1% бычьего сывороточного альбумина/0,1% фиколла/0,1% поливинилпирролидона/50 мМ буфером фосфата натрия при pH 6,5 с 750 мМ хлорида натрия, 75 мМ цитрата натрия при 42°C; или (3) используют 50% формамида, 5-кратный SSC (0,75 M NaCl, 0,075 M цитрат натрия), 50 мМ фосфат натрия (pH 6,8), 0,1% пирофосфат натрия, 5-кратный раствор Денхардта, обработанную ультразвуком ДНК молок лососевых (50 мкг/мл), 0,1% SDS и 10% декстран сульфат при 42°C с промывками при 42°C в 0,2-кратном SSC (хлорид натрия/цитрат натрия) и 50% формамиде при 55°C с последующей промывкой высокой строгости, состоящей из 0,1-кратного SSC, содержащего ЭДТА при 55°C. Специалистам в этой области будет понятно, как корректировать температуру, ионную силу и т.д. по мере необходимости для адаптации к таким факторам, как длина зонда и т.п.

Связывающие белки, связывающие домены, CDR или антитела (определяемые в настоящем описании в широком смысле) можно идентифицировать в соответствии с определениями по Kabat, Chothia, совмещением Kabat и Chothia, AbM, Contact, North и/или конформационными определениями или любым способом определения CDR, хорошо известными в этой области. См., например, Kabat et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed. (гипервариабельные области); Chothia et al., Nature 342:877-883, 1989 (структурные петлевые структуры). Идентичность аминокислотных остатков в конкретном антителе, составляющих CDR, можно определять способами, хорошо известными в этой области. Определение CDR по AbM представляет собой компромисс между Kabat и Chothia, и в нем используют программное обеспечение для моделирования антител Oxford Molecular's AbM (Accelrys®). Определение CDR по системе "Contact" основано на наблюдаемых контактах антигена, как описано в MacCallum et al., J. Mol. Biol., 262:732-745, 1996. "Конформационное" определение CDR основано на остатках, вносящих энтальпийный вклад в связывание антигена (см., например, Makabe et al., J. Biol. Chem., 283:1156-1166, 2008). North идентифицировал канонические конформации CDR с использованием другого предпочтительного набора определений CDR (North et al., J. Mol. Biol. 406: 228-256, 2011). В другом подходе, обозначенном в настоящем описании как "конформационное определение" CDR, положения CDR можно идентифицировать как остатки, вносящие энтальпийный вклад в связывание антигена (Makabe et al., J Biol. Chem. 283:1156-1166, 2008). При других определениях границ CDR могут не следовать строго одному из описанных выше подходов, но, несмотря на это, они будут перекрываться с по меньшей мере частью CDR по Kabat, хотя они могут быть короче или длиннее в свете прогнозирования или экспериментальных результатов, касающихся того, что конкретные остатки, или группы остатков или даже целые CDR, не влияют значительно на связывание антигена. В рамках изобретения термин "CDR" может относиться к CDR, определенным с помощью любого подхода, известного в этой области, включая комбинации подходов. В способах, используемых в настоящем описании, можно использовать CDR, определенные с помощью любого из этих подходов. В случае любого указанного варианта осуществления, содержащего более одной CDR, CDR (или другой остаток антитела) можно определять в соответствии с любым из определений по Kabat, Chothia, расширенного определения (комбинации Kabat и Chothia), North, расширенного определения, AbM, Contact и/или конформационных определений.

Остатки в вариабельном домене нумеруют по Kabat, что представляет собой систему нумерации, используемую для вариабельных областей тяжелой цепи или вариабельных областей легкой цепи компиляции антител. См., Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991. При использовании этой системы нумерации конкретная линейная аминокислотная последовательность может содержать меньше аминокислот или дополнительные аминокислоты, соответствующие укорочению или инсерции в FR или CDR вариабельной области. Например, вариабельная область тяжелой цепи может включать инсерцию одной аминокислоты (остаток 52a по Kabat) после остатка 52 H2 и встроенные остатки (например, остатки 82a, 82b и 82c по Kabat) после остатка FR тяжелой цепи 82. Нумерацию остатков по Kabat можно определять для указанного антитела посредством выравнивания областей гомологии последовательности антитела со "стандартной" пронумерованной по Kabat последовательностью. Доступны различные алгоритмы для нумерации по Kabat. Алгоритм, воплощенный в версии 2.3.3 выпуска Abysis (www.abysis.org), использовали в настоящем изобретении для приписывания нумерации Kabat вариабельным областям CDR1 VL, CDR2 VL, CDR3 VL, CDR2 VH и CDR3 VH. Определение AbM использовали для CDR1 VH. Конкретные положения аминокислотных остатков в антителе также можно нумеровать по Kabat.

В рамках изобретения термин "библиотека фагового дисплея" относится к популяции бактериофагов, каждый из которых содержит чужеродную кДНК, рекомбинантно слитую в рамке считывания с поверхностным белком. Фаг экспонирует чужеродный белок, кодируемый кДНК, на своей поверхности. После репликации в бактериальной клетке-хозяине, как правило, E. coli, фаг, содержащий интересующую чужеродную кДНК, подвергают селекции по экспрессии чужеродного белка на поверхности фага.

Термин "эпитоп" относится к части молекулы, которая может распознаваться, контактировать и/или быть связанной антителом в одной или более антигенсвязывающих областей антитела, известных как паратоп. Один антиген может иметь более одного эпитопа. Таким образом, разные антитела могут связываться с разными областями на антигене и могут иметь разные биологические эффекты. Эпитопы зачастую состоят из химически активной поверхностной группировки молекул, таких как аминокислоты или сахарные боковые цепи, и имеют специфические трехмерные структурные характеристики, а также специфические характеристики заряда. В рамках изобретения эпитопы могут являться конформационными или линейными. Конформационный эпитоп образован пространственно близкими аминокислотами из разных сегментов линейной полипептидной цепи. Линейный эпитоп является эпитопом, образованным смежными аминокислотными остатками в полипептидной цепи. В некоторых вариантах осуществления эпитоп может включать фрагменты сахаридов, фосфорильных групп или сульфонильных групп на антигене.

В рамках изобретения термин "антигенный эпитоп" определяют как часть полипептида, с которой антитело может специфически связываться, что определяют любым способом, хорошо известным в этой области, например, с помощью общепринятых иммунологических анализов. "Нелинейный эпитоп" или "конформационный эпитоп" содержит несмежные полипептиды (или аминокислоты) в антигенном белке, с которым связывается антитело, специфическое для эпитопа. После определения желаемого эпитопа на антигене можно получать антитела к этому эпитопу, например, способами, представленными в настоящем описании.

Термины "специфическое связывание" или "специфически связывающийся" при использовании по отношению к взаимодействию антитела и белка или пептида относятся к взаимодействию, зависящему от наличия конкретной структуры (т.е. антигенной детерминанты или эпитопа) на белке; другими словами, антитело распознает и связывается со специфической белковой структурой, а не с белками в целом. Например, если антитело является специфическим для эпитопа "A", наличие белка, содержащего эпитоп A (или свободного, немеченого A), в реакционной смеси, содержащей меченый "A" и антитело, будет снижать количество меченого A, связанного с антителом.

В некоторых вариантах осуществления термин "специфически связывается" означает, например, что антитело связывается с белком с K_D приблизительно 0,1 нМ или менее, но более типично - менее приблизительно 1 мкМ. В некоторых вариантах осуществления термин "специфически связывается" означает, что антитело связывается с мишенью иногда с K_D по меньшей мере приблизительно 0,1 мкМ или менее, а в других случаях - по меньшей мере, приблизительно 0,01 мкМ или менее, и в других случаях - по меньшей мере приблизительно 1 нМ или менее. Из-за идентичности последовательности между гомологичными белками у разных биологических видов, специфическое связывание может включать антитело, распознающее белок у более одного биологического вида (например, GUCY2c человека и GUCY2c мыши). Аналогично, из-за гомологии в некоторых областях полипептидных последовательностей разных белков, специфическое связывание может включать антитело, распознающее более одного белка. Следует понимать, что в некоторых вариантах осуществления антитело или связывающий фрагмент, специфически связывающийся с первой мишенью, может связываться или не связываться специфически со второй мишенью. В связи с этим, "специфическое связывание" не требует обязательно (хотя может включать) исключительное связывание, т.е. связывание с единственной мишенью. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления антитело может специфически связываться с более чем одной мишенью. В некоторых вариантах осуществления множество мишеней может связываться одним и тем же антигенсвязывающим участком на антителе. Например, в некоторых случаях антитело может содержать два идентичных антигенсвязывающих участка, каждый из которых специфически связывается с одним и тем же эпитопом на двух или более белках. В некоторых альтернативных вариантах осуществления антитело может являться мультиспецифическим и содержать по меньшей мере два антигенсвязывающих участка с разными специфичностями. В качестве неограничивающего примера, биспецифическое антитело может содержать один антигенсвязывающий участок, распознающий эпитоп на одном белке (например, CD3 человека), и дополнительно содержать второй, иной антигенсвязывающий участок, распознающий другой эпитоп на втором белке. Как правило, но не обязательно, ссылка на связывание означает специфическое связывание.

Антитело, специфически связывающееся с антигеном, может связываться с другими пептидами или полипептидами с более низкой аффинностью, что определяют с помощью анализов, известных в этой области, например, иммунологических анализов, BIACORE™ или других анализов. Предпочтительно, антитело, специфически связывающееся с антигеном, не реагирует перекрестно с другими белками.

Термины "неспецифическое связывание" или "фоновое связывание" при использовании по отношению к взаимодействию антитела и белка или пептида относятся к взаимодействию, независящему от наличия конкретной структуры (т.е. антитело связывается с белками в целом, а не с конкретной структурой, такой как эпитоп).

В рамках изобретения термин "k_on" или "k_a" относится к константе скорости ассоциации антитела с антигеном. В частности, константы скорости (k_on/k_a и k_off/k_d) и равновесные константы диссоциации измеряют с использованием целого антитела (т.е. бивалентного) и мономерных белков GUCY2c.

В рамках изобретения термин "k_off" или "k_d" относится к константе скорости диссоциации антитела из комплекса антитело/антиген.

В рамках изобретения термин "K_D" относится к равновесной константе диссоциации взаимодействия антитело-антиген.

В рамках изобретения термин "аффинность связывания", как правило, относится к силе суммы всех нековалентных взаимодействий между одним участком связывания молекулы (например, антитела) и его партнера по связыванию (например, антигена). Если не указано иначе, в рамках изобретения термин "аффинность связывания" относится к характерной аффинности связывания, отражающей взаимодействие 1:1 между членами связывающейся пары (например, антителом и антигеном). Аффинность молекулы X к ее партнеру Y, как правило, можно представлять с помощью константы диссоциации (K_D). Аффинность молекулы X к ее партнеру Y, как правило, можно представлять с помощью константы диссоциации (Kd). Например, Kd может составлять приблизительно 200 нМ, 150 нМ, 100 нМ, 60 нМ, 50 нМ, 40 нМ, 30 нМ, 20 нМ, 10 нМ, 8 нМ, 6 нМ, 4 нМ, 2 нМ, 1 нМ или менее. Аффинность можно измерять общепринятыми, известными в этой области способами, включая способы, представленные в настоящем описании. Низкоаффинные антитела, как правило, связываются с антигеном медленно и имеют склонность к быстрой диссоциации, в то время как высокоаффинные антитела, как правило, связываются с антигеном быстрее и имеют склонность к тому, чтобы оставаться связанными в течение большего периода времени. В этой области известны различные способы измерения аффинности связывания, любой из которых можно использовать в целях по настоящему изобретению. В частности, термин "аффинность связывания" предназначен для обозначения скорости диссоциации конкретного взаимодействия антиген-антитело. K_D представляет собой соотношение скорости диссоциации, также называемой "скоростью обратной реакции (k_off)", и скорости ассоциации или "скорости прямой реакции (k_on)". Таким образом, K_D равна k_off/k_on, и ее выражают как молярную концентрацию (M). Из этого следует, что, чем меньше K_D, тем сильнее аффинность связывания. Таким образом, K_D 1 мкМ свидетельствует о слабой аффинности связывания по сравнению с K_D 1 нМ. Значения K_D антител можно определять способами, хорошо известными в этой области. Одним из способов определения K_D антитела является использование поверхностного плазмонного резонанса (SPR), как правило, с использованием биосенсорной системы, такой как система BIACORE™. Кинетический анализ BIACORE™ включает анализ связывания и диссоциации антигена с чипов с иммобилизованными молекулами (например, молекулами, содержащими эпитоп-связывающие домены) на их поверхности. Другим способом определения K_D антитела является использование интерферометрия биослоя, как правило, с использованием технологии OCTET^® (системы Octet QK^e, ForteBio).

Термины "биологически активный", "биологическая активность" и "биологические характеристики" в отношении биспецифического антитела по настоящему изобретению, такого как антитело, фрагмент или его производное, означает обладание способностью связываться с биологической молекулой, если не указано иначе.

В рамках изобретения термины "нуклеиновые кислоты" и "нуклеотидные последовательности" включают молекулы ДНК (например, кДНК или геномную ДНК), молекулы РНК (например, мРНК), комбинации молекул ДНК и РНК или гибридные молекулы ДНК/РНК и аналоги молекул ДНК или РНК. Такие аналоги можно получать с использованием, например, аналогов нуклеотидов, включающих, в качестве неограничивающих примеров, инозин или тритилированные основания. Такие аналоги также могут содержать молекулы ДНК или РНК, содержащие модифицированные остовы, придающие молекулам полезные свойства, такие как, например, резистентность к нуклеазам или повышенную способность проникать через клеточные мембраны. Нуклеиновые кислоты или нуклеотидные последовательности могут являться одноцепочечными, двухцепочечными, могут содержать одноцепочечные и двухцепочечные части, и могут содержать трехцепочечные части, но предпочтительно, является двухцепочечной ДНК.

Настоящее изобретение также относится к полинуклеотидам, кодирующим антитела по изобретению, включая полипептиды и связывающие области антител. Можно получать Полинуклеотиды, кодирующие молекулы по изобретению, и определять нуклеотидную последовательность полинуклеотидов любым известным в этой области способом.

Полинуклеотиды, кодирующие антитела по настоящему изобретению, могут включать следующее: только кодирующую последовательность для варианта, кодирующую последовательность для варианта и дополнительные кодирующие последовательности, такие как функциональный полипептид, или сигнальную или секреторную последовательность или последовательность пробелка; кодирующую последовательность для антитела и некодирующую последовательность, такую как интроны или 5’- и/или 3’-некодирующая последовательность кодирующей последовательности антитела. Термин "полинуклеотид, кодирующий антитело" включает полинуклеотид, включающий дополнительную кодирующую последовательность для варианта, но также полинуклеотид, включающий дополнительную кодирующую и/или некодирующую последовательность. В этой области известно, что полинуклеотидная последовательность, оптимизированная для конкретной клетки-хозяина/экспрессирующей системы, легко можно получать из аминокислотной последовательности желаемого белка (см. GENEART^® AG, Regensburg, Germany).

Антитела и их антигенсвязывающие фрагменты по настоящему изобретению могут иметь дополнительные консервативные замены аминокислот или замены заменимых аминокислот, не имеющие значительного эффекта в отношении функций полипептида. Будет ли конкретная замена хорошо переноситься или нет, т.е. не будет ли она негативно влиять на желаемые биологические свойства, такие как связывающая активность, можно определять, как описано в Bowie, JU et al. Science 247: 1306-1310,1990 или Padlan et al. FASEB J. 9: 133-139, 1995.

В рамках изобретения термин "выделенный" относится к материалу, удаленному из исходного окружения (например, природного окружения, если он является природным). Например, природный полинуклеотид или полипептид, присутствующий у живого животного, не является выделенным, но тот же полинуклеотид или полипептид, отделенный от некоторых или всех из сопутствующих материалов в природной системе, является выделенным. Такой полинуклеотид может являться частью вектора, и/или такой полинуклеотид или полипептид может являться частью композиции, например, смеси, раствора или суспензии, содержащей выделенную клетку или культивируемую клетку, содержащую полинуклеотид или полипептид, и все равно будет выделенным в том смысле, что вектор или композиция не является частью своего природного окружения.

В рамках изобретения термин "репликон" относится к любому генетическому элементу, такому как плазмида, хромосома или вирус, функционирующему в качестве автономной единицы репликации полинуклеотидов в клетке.

В рамках изобретения термин "функционально связанный" относится к ситуации, в которой описанные компоненты находятся во взаимосвязи, позволяющей им функционировать заранее определенным образом. Например, контрольную последовательность, "функционально связанную" с кодирующей последовательностью, лигируют таким образом, что достигают экспрессии кодирующей последовательности в условиях, подходящих или совместимых с контрольной последовательностью. В основном, термин "функционально связанный" означает, что соединенные последовательности ДНК являются смежными и, в случае секреторной лидерной последовательности, смежными и в рамке считывания. Однако энхансеры могут не являться смежными. Связывание осуществляют посредством лигирования по удобным участкам рестрикции. Если таких участков нет, используют синтетические олигонуклеотидные адаптеры или линкеры в соответствии с общепринятой практикой.

В рамках изобретения термин "вектор" означает конструкцию, с помощью которой можно доставлять и, предпочтительно, экспрессировать один или более интересующих генов или последовательностей в клетке-хозяине. Неограничивающие примеры векторов включают вирусные векторы, экспрессирующие векторы депротеинизированной ДНК или РНК, плазмиду, космиду или фаговые векторы, экспрессирующие векторы ДНК или РНК, ассоциированные с катионными конденсирующими средствами, экспрессирующие векторы ДНК или РНК, инкапсулированные в липосомах, и некоторые эукариотические клетки, такие как клетки-продуценты.

В рамках изобретения термин "последовательность контроля экспрессии" или "контрольная последовательность" относится к полинуклеотидной последовательности, необходимой для осуществления экспрессии кодирующей последовательности, с которой она лигирована. Природа таких контрольных последовательностей отличается в зависимости от организма-хозяина. Например, у прокариот такие контрольные последовательности, как правило, включают промотор, участок связывания рибосомы и терминаторы и, в некоторых случаях, энхансеры. Таким образом, термин "контрольная последовательность" предназначен для включения по меньшей мере всех компонентов, наличие которых является необходимым для экспрессии, а также может включать дополнительные компоненты, наличие которых является благоприятным, например, лидерные последовательности.

"Клетка-хозяин" включает отдельную клетку или культуру клеток, которая может являться или является реципиентом для векторов для включения полинуклеотидных вставок. Клетки-хозяева включают потомство одной клетки-хозяина, и потомство не обязательно должны быть полностью идентичными (по морфологии или по комплементарной геномной ДНК) исходной родительской клетке по причине природной, случайной или преднамеренной мутации. Клетка-хозяин включает клетки, трансфицированные in vivo с использованием полинуклеотидов по настоящему изобретению.

В рамках изобретения "клетки млекопитающих" включают ссылку на клетки, полученные из млекопитающих, включая людей, крыс, мышей, морских свинок, шимпанзе или макак. Клетки можно культивировать in vivo или in vitro.

В рамках изобретения термин "очищенный продукт" относится к препарату продукта, выделенному из клеточных составляющих, с которыми продукт в норме ассоциирован, и/или из других типов клеток, которые могут присутствовать в интересующем образце.

В рамках изобретения термин "по существу, чистый" относится к материалу, являющемуся по меньшей мере на 50% чистым (т.е. свободным от загрязнений), более предпочтительно - по меньшей мере на 90% чистым, более предпочтительно - по меньшей мере 95% чистым, еще более предпочтительно - по меньшей мере 98% чистым, и наиболее предпочтительно - по меньшей мере 99% чистым.

В рамках изобретения термин "злокачественное новообразование" или "злокачественный" относится к физиологическому состоянию у млекопитающих, как правило, отличающемуся нерегулируемым ростом клеток, неоплазией или опухолью, являющейся результатом аномального, неконтролируемого роста клеток. В некоторых аспектах термин "злокачественное новообразование" относится к злокачественной первичной опухоли без метастазирования, оставшейся локализованной. В других аспектах термин "злокачественное новообразование" относится к злокачественной опухоли, инвазирующей и разрушающе соседние структуры тела и распространяющейся в отдаленные очаги. В некоторых аспектах злокачественное новообразование ассоциировано со специфическим антигеном злокачественной опухоли. Неограничивающие примеры злокачественных новообразований включают злокачественное новообразование ротовой полости и глотки, пищеварительной системы (например, пищевода, желудка, тонкого кишечника, толстого кишечника, прямой кишки, анального канала, печени, желчного пузыря, аппендикса, желчных протоков и поджелудочной железы) или эндокринной системы. В некоторых вариантах осуществления злокачественное новообразование пищеварительной системы является раком пищевода, желудка, тонкого кишечника, толстого кишечника, прямой кишки, анального канала, печени, желчного пузыря, аппендикса, желчных протоков и поджелудочной железы.

В рамках изобретения термин "рак пищевода" предназначен для включения общепринятого медицинского определения, определяющего рак пищевода как медицинское состояние, отличающееся злокачественным новообразованием из клеток пищевода. Примеры злокачественного новообразования пищевода включают аденокарциному, плоскоклеточную карциному, хориокарциному, лимфому, саркому и мелкоклеточный рак.

Злокачественное новообразование "желудочно-кишечного тракта" (ЖКТ) представляет собой термин для группы злокачественных новообразований, поражающих пищеварительную систему. В рамках изобретения термин "рак желудка" предназначен для включения общепринятого медицинского определения, определяющего рак желудка как медицинское состояние, отличающееся злокачественным новообразованием из клеток желудка. В частности, рак желудка является заболеванием, при котором злокачественные клетки образуются в выстилке желудка. Рак желудка может развиваться в любой части желудка и может распространяться по всему желудку и в другие органы, в частности, пищевод, легкие и печень.

В рамках изобретения термин "колоректальный рак" предназначен для включения общепринятого медицинского определения, определяющего колоректальный рак как медицинское состояние, отличающееся злокачественным новообразованием из клеток желудочно-кишечного тракта ниже тонкого кишечника (т.е. толстого кишечника, включая слепую кишку, восходящую ободочную кишку, поперечную ободочную кишку, нисходящую ободочную кишку, сигмовидную кишку и прямую кишку). Кроме того, в рамках изобретения термин "колоректальный рак" предназначен для включения медицинских состояний, отличающихся злокачественным новообразованием из клеток двенадцатиперстной кишки и тонкого кишечника (тощей кишки и подвздошной кишки). Определение колоректального рака, используемое в настоящем описании, является более обширным, чем общепринятое медицинское определение, но приведено в таком виде, т.к. клетки двенадцатиперстной кишки и тонкого кишечника также содержат GUCY2c.

В рамках изобретения термин "злокачественная клетка" или "злокачественное новообразование" относится к опухолям или опухолевым клеткам, являющимся инвазивными и/или способными подвергаться метастазированию, т.е. злокачественным клеткам.

В рамках изобретения термин "лечить" или "лечение" означает подход для достижения благоприятных или желаемых клинических результатов. В целях по настоящему изобретению, лечение определяют как введение индивидууму, например, пациенту, молекулы антитела против GUCY2c (например, моноклонального антитела против GUCY2c или биспецифического или полиспецифического антитела против GUCY2c). Такое введение, например, можно осуществлять посредством прямого введения индивидууму или посредством нанесения на выделенную ткань или клетку из индивидуума, которую затем возвращают в организм индивидуума. Молекулу антитела против GUCY2c можно вводить в отдельности или в комбинации с одним или более средствами. Лечение может быть предназначено для излечения, заживления, ослабления, облегчения, изменения, восстановления, улучшения, временного облегчения или влияния на нарушение, симптомы нарушения или предрасположенность к нарушению, например, злокачественному новообразованию. В некоторых вариантах осуществления лечение является полезным при любом одном или более из следующего: (a) лечении, профилактике или улучшении одного или более симптомов состояния, ассоциированного со злокачественными клетками, экспрессирующими GUCY2c, у индивидуума (например, злокачественного новообразования желудочно-кишечного тракта, такого как колоректальный рак (CRC)); (b) ингибировании роста или прогрессирования опухоли у индивидуума, имеющего злокачественную опухоль, экспрессирующую GUCY2c; (c) ингибировании метастазирования злокачественных клеток, экспрессирующих GUCY2c, у индивидуума, имеющего одну или более злокачественных клеток, экспрессирующих GUCY2c; (d) индуцировании регрессирования (например, долговременного регрессирования) опухоли, экспрессирующей GUCY2c; (e) вызывании цитотоксической активности в злокачественных клетках, экспрессирующих GUCY2c; (f) повышении выживаемости без прогрессирования у индивидуума с GUCY2c-ассоциированным нарушением; (g) повышении общей выживаемости индивидуума с GUCY2c-ассоциированным нарушением; (h) снижении использования дополнительных химиотерапевтических или цитотоксических средств у индивидуума с GUCY2c-ассоциированным нарушением; (i) снижении опухолевой нагрузки у индивидуума с GUCY2c-ассоциированным нарушением; или (j) блокировании взаимодействия GUCY2c с другими еще не идентифицированными факторами. Не желая быть связанными какой-либо теорией, полагают, что лечение вызывает ингибирование, абляцию или уничтожение клетки in vitro или in vivo или иное снижение способности клетки, включая аномальную клетку, опосредовать нарушение, например, нарушение, представленное в настоящем описании, такое как злокачественное новообразование.

В рамках изобретения термин "противодиарейное средство" означает лекарственное средство, останавливающее или замедляющее диарею. В дополнение к поддерживающей терапии, которая может включать введение жидкости вместе с прекращением приема лактозы, алкоголя, продуктов с высокой осмолярностью, эти противодиарейные средства можно вводить совместно или в комбинации с биспецифическими антителами против GUCY2c. Противодиарейные средства включают, в качестве неограничивающих примеров, субгаллат висмута, Lactobacillus acidophilus, Saccharomyces boulardii, лоперамид/симетикон, атропин/дифеноксилат, атропин/дифеноксин, лиофилизат Saccharomyces boulardii, Lactobacillus acidophilus, лоперамид, субсалицилат висмута, Lactobacillus acidophilus/Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus rhamnosus, аттапульгит, крофелемер, фторхинолон, антибиотик или октреотид. См. Bensen et al. Recommended Guidelines for the Treatment of Cancer Treatment-Induced Diarrhea. Journal of Clinical Oncology 14: 2918-2926, 2004.

В рамках изобретения термин "индивидуум" предназначен для включения любого животного (например, млекопитающего), включая, в качестве неограничивающих примеров, людей, не являющихся человеком приматов, грызунов и т.п., которое будет реципиентом конкретного лечения. Например, индивидуум может являться пациентом (например, пациентом-человеком или ветеринарным пациентом), имеющим злокачественное новообразование. Как правило, термины "индивидуум" и "пациент" используют в настоящем описании взаимозаменяемо по отношению к человеку.

В рамках изобретения термин "не являющиеся человеком животные" включает всех не являющихся человеком позвоночных, например, не являющихся человеком млекопитающих и немлекопитающих, таких как не являющиеся человеком приматы, овца, собака, корова, курицы, амфибии, пресмыкающиеся, мышь, крыса, кролик или коза и т.д., если не указано иначе.

В рамках изобретения термин "фармацевтически приемлемый" относится к продукту или соединению, одобренному (или одобряемому) надзорным органом федерального правительства или правительства штата или указанному в Фармакопее США или других общепризнанных фармакопей для использования на животных, включая людей.

В рамках изобретения термины "фармацевтически приемлемый эксципиент, носитель или вспомогательное вещество" или "приемлемый фармацевтический носитель" относятся к эксципиенту, носителю или вспомогательному веществу, которое можно вводить индивидууму вместе с по меньшей мере одним антителом по настоящему изобретению и которое не нарушает активность антитела. Эксципиент, носитель или вспомогательное вещество должно являться нетоксичным при введении с антителом в дозах, достаточным для достижения терапевтического эффекта.

В рамках изобретения термин "улучшение" означает уменьшение или улучшение одного или более симптомов по сравнению с отсутствием введения молекулы антитела по изобретению. Термин "улучшение" также включает уменьшение длительности симптома.

В рамках изобретения термин "профилактика" относится к профилактике рецидивирования или дебюта одного или более симптомов нарушения у индивидуума в результате введения профилактического или терапевтического средства.

В рамках изобретения термины "эффективное количество", "терапевтически эффективное количество", "терапевтически достаточное количество" или "эффективная доза" относятся к любому количеству терапевтического средства, являющемуся эффективным или достаточным после введения однократной или многократных доз индивидууму для профилактики, заживления, улучшения или лечения заболевания, нарушения или побочного эффекта, или снижения скорости прогрессирования заболевания или нарушения, или пролонгирования излечения, облегчения или улучшения состояния индивидуума с нарушением, представленным в настоящем описании, за пределами ожидаемого в отсутствие такого лечения. Термин также включает количества, эффективные для усиления нормальной физиологической функции. Эффективное количество можно рассматривать в отношении введения одного или более терапевтических средств, и отдельное средство можно рассматривать для введения в эффективном количестве, если можно достигать или достигают желаемого результата одновременно с одним или более другими средствами.

В рамках изобретения термин "ингибирование роста" опухоли или злокачественного новообразования относится к замедлению, препятствию или прекращению роста и/или метастазирования и не обязательно свидетельствует об общей элиминации роста опухоли.

Активность является мерой активности терапевтического средства, выражаемой в терминах количества, необходимого для достижения эффекта с указанной интенсивностью. Высокоактивное средство вызывает больший ответ при низких концентрациях по сравнению со средством с более низкой активностью, вызывающим меньший ответ при низких концентрациях. Активность является функцией аффинности и эффективности. Термин "эффективность" относится к способности терапевтического средства вызывать биологический ответ после связывания с лигандом-мишенью и количественной величине этого ответа. В рамках изобретения термин "полумаксимальная эффективная концентрация (EC₅₀)" относится к концентрации терапевтического средства, вызывающей ответ, величина которого представляет собой половину между исходным уровнем и максимумом после определенного времени воздействия. Терапевтическое средство может вызывать ингибирование или стимуляцию. Значение EC₅₀является общеупотребительным, и его используют в настоящем описании в качестве меры активности.

В рамках изобретения термин "комбинированное лечение" или введение "в комбинации с" относится к использованию более одного профилактического и/или терапевтического средства. Использование термина "комбинированное лечение" или "в комбинации" не ограничивает порядок, в котором профилактические и/или терапевтические средства вводят индивидууму с нарушением. Другими словами, комбинированное лечение можно осуществлять посредством раздельного, последовательного или одновременного лечения с использованием терапевтических средств. В случае "последовательного введения" первое вводимое средство может вызывать некоторый физиологический эффект в отношении индивидуума, когда второе средство вводят или оно становится активным в организме индивидуума.

В рамках изобретения термин "одновременное введение" в отношении введения профилактического и/или терапевтического средства относится к введению средств таким образом, что отдельные средства присутствуют в организме индивидуума одновременно. На одновременное введение могут влиять молекулы, составляемые в одной композиции или отдельных композициях, вводимых одновременно или близко по времени. При необходимости, последовательное введение можно осуществлять в любом порядке.

В рамках изобретения термин "GUCY2c" относится к гуанилатциклазе C (GUCY2c) млекопитающего, предпочтительно - белку GUCY2c человека. Термин "GUCY2c" можно использовать взаимозаменяемо с термином "GUCY2C". Нуклеотидная последовательность GUCY2c человека описана как регистрационный номер GenBank: NM.sub.-004963, включенный в настоящее описание в качестве ссылки. Аминокислотная последовательность GUCY2c человека описана как регистрационный номер GenBank NP.sub.-004954, включенный в настоящее описание в качестве ссылки.

Как правило, природный аллельный вариант имеет аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 95%, 97% или 99% идентичную белку, представленному под регистрационным номером GenBank NP.sub.-004954. Белок GUCY2c охарактеризован как трансмембранный рецепторный белок поверхности клетки, и считают, что он играет критическую роль в поддержании жидкости кишечника, гомеостазе электролитов и пролиферации клеток.

В рамках изобретения термины "антитело, связывающееся с GUCY2c", "антитело, распознающее GUCY2c", "антитело против GUCY2c", "молекула антитела против GUCY2c" включает молекулу, в которой комбинируют по меньшей мере один связывающий домен антитела (как определено в настоящем описании) с по меньшей мере одним связывающим доменом антитела против GUCY2c (как определено в настоящем описании). Термин "молекула антитела против GUCY2c по настоящему изобретению" относится к антителам и их антигенсвязывающим фрагментам, взаимодействующим или распознающим, например, связывающим (например, связывающим специфически) GUCY2c, например, GUCY2c человека, GUCY2c мыши, GUCY2c крысы, GUCY2c яванского макака.

Термин "кластер дифференцировки 3" или "CD3" относится к мультимерному белковому комплексу, исторически известному как комплекс T3 и состоящему из четырех отдельных полипептидных цепей: эпсилон (ε), гамма (γ), дельта (δ), дзета (ζ), собирающихся и функционирующих как три пары димеров (εγ, εδ, ζζ). Комплекс CD3 служит в качестве T-клеточного корецептора, связанного нековалентно с T-клеточным рецептором (TCR) (Smith-Garvin et al. 2009) и генерирующего активационный сигнал в T-лимфоцитах. Белковый комплекс CD3 является определяющим признаком T-клеточного ростка, таким образом, антитела против CD3 можно эффективно использовать в качестве T-клеточных маркеров (Chetty and Gatter, Journal of Pathology, Vol 172, 4, 303-301 (1994)). Известно, что антитела против CD3 вызывают образование цитотоксических T-клеток посредством активации продукции эндогенных лимфокинов и способны селективно уничтожать опухолевые мишени (Yun et al., Cancer Research, 49:4770-4774, 1989).

Более конкретно, T-клетки экспрессируют комплексы TCR, способные индуцировать антигенспецифические иммунные ответы (Smith-Garvin et al., Annula Review of Immunology, 27: 1, 591-619 (2009)). Антигены являются пептидами, экспрессирующимися опухолевыми клетками и инфицированными вирусами клетками и способными стимулировать иммунные ответы. Внутриклеточно экспрессируемые антигены связаны с молекулами главного комплекса гистосовместимости класса I (MHC класса I) и транспортируются к поверхности, где они презентируются T-клеткам. Если аффинность связывания TCR с MHC класса I в комплексе с антигеном является достаточной, будет инициироваться образование иммунного синапса. Передача сигнала через иммунный синапс опосредован корецепторами CD3, образующими димеры εδ, εγ и ζζ. Эти димеры связываются с TCR и генерируют активационный сигнал в T-лимфоцитах. Этот сигнальный каскад направляет опосредованное T-клетками уничтожение клетки, экспрессирующей антиген. Цитотоксичность опосредована высвобождением и переносом гранзима B и перфорина из T-клетки в клетку-мишень.

В рамках изобретения термины "антитело, связывающееся с CD3", "антитело, распознающее CD3", "антитело против CD3", "молекула антитела против CD3" включает антитела и их антигенсвязывающие фрагменты, специфически распознающие одну субъединицу CD3 (например, эпсилон, дельта, гамма или дзета), а также антитела и их антигенсвязывающие фрагменты, специфически распознающие димерный комплекс из двух субъединиц CD3 (например, димеры гамма/эпсилон, дельта/эпсилон и дзета/дзета CD3). CD3 эпсилон человека приведен под регистрационным номером GenBank NM_000733. Антитела и антигенсвязывающие фрагменты по настоящему изобретению могут связываться с растворимым CD3 и/или CD3, экспрессирующимся на поверхности клетки. Растворимый CD3 включает природные белки CD3, а также рекомбинантные варианты белка CD3, такие как, например, мономерные и димерные конструкции CD3, в которых отсутствует трансмембранный домен или которые иначе не связаны с клеточной мембраной.

Антитела против CD3 могут генерировать активационный сигнал в T-лимфоцитах. Также можно использовать другие активирующие T-клетки лиганды, включая, в качестве неограничивающих примеров CD28, CD134, CD137 и CD27.

Биспецифические антитела против CD3 позволяют обходить потребность в вовлечении MHC-пептид/TCR и вместо этого рекрутируют T-клетки к клеткам-мишеням, экспрессирующим антиген на поверхности клетки. Одно плечо биспецифического антитела связывается с опухолеассоциированным антигеном на поверхности клетки, а другое плечо связывается с белком CD3, являющимся частью комплекса TCR на T-клетках. Совместное вовлечение CD3 на T-клетках и антигена-мишени на опухолевых клетках посредством биспецифического антитела приводит к цитотоксическому ответу. Таким образом, не желая быть связанными какой-либо теорией, полагают, что биспецифические антитела по настоящему изобретению могут позволить T-клетке обходить потребность во взаимодействии TCR и MHC класса I в комплексе с антигеном и вместо этого перенаправляют T-клетки к клеткам-мишеням через прямое совместное вовлечение CD3 (такого как CD3 эпсилон), экспрессирующегося на T-клетке, и GUCY2c, экспрессирующейся на опухоли.

В рамках изобретения термин "биспецифическое антитело против CD3-GUCY2c" относится к молекуле, сконструированной для направления T-клеток индивидуума на уничтожение злокачественных клеток посредством таргетинга опухолевых клеток, экспрессирующих желаемую молекулу. В некоторых вариантах осуществления желаемая молекула является GUCY2c человека. В некоторых вариантах осуществления биспецифическое антитело против CD3-GUCY2c содержит два FV-домена. В некоторых вариантах осуществления биспецифическое антитело против CD3-GUCY2c содержит первый FV-домен против GUCY2c и второй FV-домен против CD3. FV-домены могут являться scFV-доменами.

В рамках изобретения "первый полипептид" является любым полипептидом, подвергаемым связыванию со вторым полипептидом. Первый полипептид и второй полипептид соединены в области контакта. В дополнение к области контакта, первый полипептид может содержать один или более дополнительных доменов, таких как "связывающие домены" (например, вариабельный домен антитела, рецептор-связывающий домен, лиганд-связывающий домен или ферментативный домен) или константные домены антитела (или их части), включая домены CH2, CH1 и CL. Как правило, первый полипептид будет содержать по меньшей мере один домен, полученный из антитела. Этот домен, как правило, является константным доменом, таким как домен CH3 антитела, и может образовывать область контакта первого полипептида. Примеры первых полипептидов включают полипептиды тяжелой цепи антитела, химеры, в которых комбинируют константный домен антитела со связывающим доменом гетерологичного полипептида, рецепторные полипептиды, полипептиды-лиганды и полипептиды вариабельного домена антитела (например, биспецифические антитела).

В дополнение к области контакта, второй полипептид может содержать дополнительные домены, такие как "связывающий домен" (например, вариабельный домен антитела, рецептор-связывающий домен, лиганд-связывающий домен или ферментативный домен), или константные домены антитела (или их части), включая домены CH2, CH1 и CL. Как правило, второй полипептид будет содержать по меньшей мере один домен, полученный из антитела. Этот домен, как правило, является константной областью, такой как домен CH3 антитела, и может образовывать область контакта второго полипептида. Примеры вторых полипептидов включают полипептиды тяжелой цепи антитела, химеры, в которых комбинируют константный домен антитела со связывающим доменом гетерологичного полипептида, и полипептиды вариабельного домена антитела (например, биспецифические антитела).

В рамках изобретения термины "комплекс" или "комплексированный" относятся к связыванию двух или более молекул, взаимодействующих друг с другом с помощью связей и/или сил (например, вандерваальсовых, гидрофобных, гидрофильных сил), не являющихся пептидными связями. В одном из вариантов осуществления комплекс является гетеромультимерным. Следует понимать, что в рамках изобретения термин "белковый комплекс" или "полипептидный комплекс" включает комплексы, включающие небелковое вещество, конъюгированное с белком в белковом комплексе (например, включая, в качестве неограничивающих примеров, химические молекулы, такие как токсин или средство детекции).

Хотя в практическом осуществлении или тестировании настоящего изобретения можно использовать любые материалы и способы, схожие или эквивалентные материалам и способам, представленным в настоящем описании, далее будут описаны предпочтительные материалы и способы.

Материалы и способы

Описаны различные способы получения антител, включающие общепринятый гибридомный способ для получения моноклональных антител, рекомбинантные способы получения антител (включая химерные антитела, например, гуманизированные антитела), получение антител в трансгенных животных и недавно описанную технологию фагового дисплея для получения "полностью человеческих" антител. Эти способы вкратце описаны ниже.

Поликлональные антитела против интересующего антигена, как правило, можно индуцировать у животных посредством многократных подкожных (sc) или интраперитонеальных (ip) инъекций антигена и адъюванта. Антиген (или фрагмент, содержащий целевую аминокислотную последовательность) можно конъюгировать с белком, являющимся иммуногенным для биологического вида, подлежащего иммунизации, например, сывороточный альбумин, бычий тиреоглобулин или ингибитор трипсина сои, с использованием бифункционального или дериватизирующего средства, например малеимидобензоилсульфосукцинимидного сложного эфира (конъюгация через остатки цистеина) или N-гидроксисукцинимида (через остатки лизина). Животных иммунизируют с помощью иммуногенных конъюгатов или производных и через несколько недель животных подвергают бустерной иммунизации посредством подкожной инъекции во множестве участков. Через 7-14 дней у животных забирают кровь и анализируют сыворотку на титр антител. Животных подвергают бустерной иммунизации до достижения плато титра. Предпочтительно, животное подвергают бустерной иммунизации с использованием конъюгата того же антигена, но конъюгированного с другим белком и/или через другой перекрестно сшивающий реагент. Конъюгаты также можно получать в культуре рекомбинантных клеток в виде слитых белков. Кроме того, для усиления иммунного ответа используют средства, вызывающие агрегацию, такие как квасцы.

Моноклональные антитела можно получать из популяции, по существу, гомогенных антител с использованием гибридомного способа, впервые описанного в Kohler & Milstein, Nature 256:495, 1975, или можно получать способами рекомбинантной ДНК (Cabilly et al., патент США № 4816567). В гибридомном способе мышь или другого подходящего животного-хозяина иммунизируют, как описано выше, для индуцирования лимфоцитов, продуцирующих или способных продуцировать антитела, которые будут специфически связываться с белком, используемым для иммунизации. Альтернативно, лимфоциты можно иммунизировать in vitro. Затем лимфоциты подвергают слиянию с миеломными клетками с использованием подходящего средства для слияния, такого как полиэтиленгликоль, для получения гибридомной клетки (Goding, Monoclonal antibodies: Principles and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986)). Полученные таким образом гибридомные клетки высевают и выращивают в подходящей среде для культивирования, предпочтительно, содержащей одно или более веществ, ингибирующих рост или выживаемость неслитых, родительских миеломных клеток. Кроме того, гибридомные клетки можно выращивать in vivo в виде асцитных опухолей у животного. Моноклональные антитела, секретируемые субклонами, соответствующим образом отделяют от среды для культивирования, асцитной жидкости или сыворотки общепринятыми способами очистки иммуноглобулинов, такими как, например, с использованием протеин A-сефарозы, хроматография на гидроксиапатите, электрофорез в геле, диализ или аффинная хроматография.

Экспрессию антитела, антигенсвязывающих фрагментов антитела или любой конструкции антитела можно осуществлять в подходящих прокариотических или эукариотических клетках-хозяевах, подобных клеткам CHO, клеткам NSO, клеткам SP2/0, клеткам HEK293, клеткам COS, клеткам PER.C6, дрожжам или клеткам E. coli, и секретируемое антитело выделяют и собирают из клеток (супернатанта культуры клеток, кондиционированного супернатанта культуры клеток, лизата клеток или очищенной совокупности). Общие способы получения антител хорошо известны в этой области и описаны, например, в обзорных статьях Makrides, S.C., Protein Expr. Purif. 17:183-202, 1999; Geisse, S., et al., Protein Expr. Purif. 8:271-282, 1986; Kaufman, R.J., MoI. Biotechnol. 16:151-160, 2000; Werner, R.G., Drug Res. 48:870-880, 1998. В конкретном варианте осуществления культура клеток является культурой клеток млекопитающего, такой как культура клеток китайского хомяка (CHO).

В различных вариантах осуществления выделенные антитела можно подвергать дополнительным стадиям очистки с использованием общепринятых способов хроматографии, известных в этой области. В частности, способы очистки включают, в качестве неограничивающих примеров, аффинную хроматографию (например, аффинную хроматографию с протеином A), ионообменную хроматографию (например, анионообменную хроматографию или катионообменную хроматографию), хроматографию гидрофобных взаимодействий, хроматографию на гидроксиапатите, гель-фильтрацию и/или диализ. Среди них предпочтительным способом очистки является использование хроматографии с протеином A. Матрицей, к которой присоединяют аффинный лиганд, чаще всего является агароза, но доступны и другие матрицы.

В этой области также известны другие способы очистки антител, такие как фракционирование на ионообменной колонке, осаждение этанолом, обращенно-фазовая высокоэффективная хроматография, осаждение этанолом, обращенно-фазовая ВЭЖХ, хроматография на диоксиде кремния, хроматография на гепарин-сефарозе, хроматография на анионообменной или катионообменной смоле (например, на колонке с полиаспарагиновой кислотой), хроматофокусирование, электрофорез в ПААГ с SDS и осаждение сульфатом аммония. Изложенный выше список способов очистки представляет собой исключительно примеры, и не предназначен для ограничения перечисления.

Альтернативно, можно получать трансгенных животных (например, мышей), способных после иммунизации продуцировать полный репертуар антител человека в отсутствие продукции эндогенных иммуноглобулинов. Например, описано, что гомозиготная делеция гена соединительной области тяжелой цепи антитела (J.sub.H) у химерных и мутантных по зародышевой линии мышей приводит к полному ингибированию продукции эндогенных антител. Перенос набора генов иммуноглобулинов зародышевой линии человека таким мутантным по зародышевой мышам будет приводить к продукции антител человека после стимуляции антигеном. См., например, Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2551-255;1993 и Jakobovits et al., Nature 362:255-258, 1993.

В некоторых вариантах осуществления антитела по настоящему изобретению можно гуманизировать с сохранением высокой аффинности к антигену и других благоприятных биологических свойств. Способы гуманизации не принадлежащих человеку антител хорошо известны в этой области. Гуманизацию, по существу, можно осуществлять способом Winter с соавт. (Jones et al., Nature 321:522-525, 1986; Riechmann et al., Nature 332:323-327, 1988; Verhoeyen et al., Science 239:1534-1536, 1988) посредством замены CDR или последовательностей CDR грызуна соответствующими последовательностями антитела человека. Таким образом, такие гуманизированные антитела являются химерными антителами (Cabilly, выше), где вариабельный домен человека, по существу, меньший, чем интактный, заменяют соответствующей последовательностью не являющихся человеком видов. На практике, гуманизированные антитела, как правило, являются антителами человека, в которых некоторые остатки CDR и, возможно, некоторые остатки FR заменяют остатками из аналогичных участков в антителах грызуна. Важно гуманизировать антитела с сохранением высокой аффинность к антигену и других благоприятных биологических свойств. Для достижения этой цели по предпочтительному способу гуманизированные антитела получают способом анализа родительских последовательностей и различных концептуальных гуманизированных продуктов с использованием трехмерных моделей родительских и гуманизированных последовательностей. Трехмерные модели иммуноглобулинов хорошо известны специалистам в этой области. Доступны компьютерные программы, с помощью которых иллюстрируют и отображают возможные трехмерные конформационные структуры выбранных последовательностей иммуноглобулинов-кандидатов. Изучение таких отображений позволяет анализировать возможную роль остатков в функционировании последовательности иммуноглобулина-кандидата, т.е. анализировать остатки, влияющие на способность иммуноглобулина-кандидата связываться с антигеном. Таким образом, остатки FR можно выбирать и комбинировать из консенсусной и импортируемой последовательности таким образом, что достигают желаемой характеристики антитела, такой как повышенная аффинность к антигенам-мишеням. Более подробно см. WO92/22653, опубликованный 23 декабря 1992 года.

Антитела по настоящему изобретению также можно получать с использованием различных способов фагового дисплея, известных в этой области. В способах фагового дисплея функциональные домены антитела экспонируются на поверхности фаговых частиц, несущих полинуклеотидные последовательности, кодирующие их. В конкретном аспекте такого фага можно использовать для экспонирования антигенсвязывающих доменов, таких как Fab и Fv или стабилизированной дисульфидной связью Fv, экспрессирующихся из репертуара или комбинаторной библиотеки антител (например, человека или мыши). Фаг, экспрессирующий антигенсвязывающий домен, связывающий интересующий антиген, можно подвергать селекции или идентифицировать с использованием антигена, например, с использованием меченого антигена или антигена, связанного или фиксированного на твердой поверхности или частице. Фаг, используемый в этих способах, как правило, является нитевидным фагом, включая fd и M13. Антигенсвязывающие домены экспрессируются в виде рекомбинантно слитого белка с белком гена III или гена VIII фага. Примеры способов фагового дисплея, которые можно использовать для получения иммуноглобулинов или их фрагментов по настоящему изобретению, включают описанные в Brinkmann et al. "Phage display Of Disulfide-Stabilized Fv Fragments," J. Immunol. Methods, 182:41-50, 1995.

Функциональные характеристики множества изотипов IgG и их доменов хорошо известны в этой области. Аминокислотные последовательности IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4 известны в этой области. Выбор и/или комбинирование двух или более доменов из конкретных изотипов IgG для использования в способах по изобретению могут быть основаны на любом известном параметре родительских изотипов, включая аффинность к FcγR. Например, области или домены изотипов IgG, проявляющих ограниченное связывание с FcγRIIB или отсутствие связывания, например, IgG2 или IgG4, можно использовать, если биспецифическое антитело желательно конструировать для максимизации связывания с активирующим рецептором и минимизации связывания с ингибиторным рецептором. Аналогично, использование Fc-цепей или доменов из изотипов IgG, о которых известно, что они преференциально связываются с C1q или FcγRIIIA, например, IgG3 можно комбинировать с аминокислотными модификациями Fc, о которых в этой области известно, что они усиливают антителозависимую клеточную цитотоксичность (ADCC) и/или обусловленную комплементом цитотоксичность (CDC), для конструирования биспецифического антитела таким образом, что максимизируют активность эффекторной функции, например, активации комплемента или ADCC. Аналогично, можно получать мутации в Fc-цепях или доменах изотипов IgG, минимизирующие или устраняющие эффекторную функцию Fc-цепи.

Во время процесса поиска, с помощью получения и характеризации антител можно получать информацию о желаемых эпитопах. Затем с помощью этой информации можно осуществлять конкурентный скрининг антител на связывание с тем же эпитопом. Подходом для достижения этого является осуществление исследований конкуренции и перекрестной конкуренции для обнаружения антител, конкурирующих или перекрестно конкурирующих друг с другом, например, антител, конкурирующих за связывание с антигеном. Одним из способов является идентификация эпитопа, с которым связываются антитела, или "эпитопное картирование". Существует множество известных в этой области способов картирования и характеризации локализации эпитопов на белках, включая разрешение кристаллической структуры комплекса антитело-антиген, конкурентные анализы, анализы экспрессии фрагментов генов и анализы на основе синтетических пептидов, как описано, например, в главе 11 Harlow and Lane, Using Antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1999. В дополнительном примере эпитопное картирование можно использовать для определения последовательности, с которой связывается антитело. Эпитопное картирование коммерчески доступно в различных источниках, например, Pepscan Systems (Edelhertweg 15, 8219 PH Lelystad, The Netherlands). В дополнительном примере для идентификации остатков, требующихся, достаточных и/или необходимых для связывания эпитопа можно осуществлять мутагенез антигенсвязывающего домена, эксперименты по замене доменов и мутагенез с аланиновым сканированием. Аффинность связывания и скорость обратной реакции взаимодействия антигенсвязывающего домена можно определять с помощью анализов конкурентного связывания. Одним из примеров анализа конкурентного связывания является радиоиммунологический анализ, включающий инкубацию меченого антигена и детекцию молекулы, связанной с меченым антигеном. Аффинность молекулы по настоящему изобретению к антигену и скорости обратной реакции связывания можно определять из данных насыщения при анализе Скэтчарда.

Аффинности и связывающие свойства антител по настоящему изобретению в отношении антигена исходно можно определять с использованием анализов in vitro (биохимических или иммунологических анализов), известных в этой области для антигенсвязывающего домена, включая, в качестве неограничивающих примеров, твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA), поверхностный плазмонный резонанс (SPR), интерферометрию биослоя или анализы иммунопреципитации. Молекулы по изобретению могут иметь связывающие свойства в моделях in vivo (таких как описанные и представленные в настоящем описании), схожие с таковыми в анализах in vitro. Однако настоящее изобретение не исключает молекулы по изобретению, не проявляющие желаемый фенотип в анализах in vitro, но проявляющий желаемый фенотип in vivo.

Необязательным форматом биспецифического антитела является Fv-стратегия на основе ковалентно связанной, биспецифической гетеродимерной структуры диатела, также известной как переориентирующееся антитело с двойной аффинностью (DART^®), описанное, например, в патентных публикациях США №№ 2007/0004909, 2009/0060910 и 2010/0174053).

После получения последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей молекулы по изобретению (т.е. связывающие домены), можно получать вектор для получения молекул с помощью технологии рекомбинантных ДНК с использованием способов, хорошо известных в этой области.

Полинуклеотиды, кодирующие связывающие домены антитела (например, антитела против GUCY2c или биспецифического антитела против CD3-GUCY2c) по настоящему изобретению могут включать полинуклеотидную последовательность контроля экспрессии, функционально связанную с последовательностями, кодирующими антитело, включая ассоциированные в природе или гетерологичные промоторные области, известные в этой области. Последовательности контроля экспрессии могут представлять собой эукариотические промоторные системы в векторах, с помощью которых можно трансформировать или трансфицировать эукариотические клетки-хозяева, но также можно использовать контрольные последовательности для прокариотических хозяев. После встраивания вектора в подходящую линию клеток-хозяев, клетку-хозяина выращивают в условиях, подходящих для экспрессии нуклеотидных последовательностей и, при желании, для сбора и очистки антител. Эукариотические линии клеток включают линии клеток CHO, различные линии клеток COS, клетки HeLa, линии миеломных клеток, трансформированные B-клетки или линии эмбриональных клеток почки человека.

В одном из вариантов осуществления ДНК, кодирующую антитела по изобретению, выделяют и секвенируют общепринятыми способами (например, с использованием олигонуклеотидных зондов, способных специфически связываться с генами, кодирующими тяжелые и легкие цепи антител мыши). Гибридомные клетки по изобретению служат предпочтительным источником такой ДНК. После выделения ДНК можно встраивать в экспрессирующие векторы, с помощью которых затем трансфицируют клетки-хозяева, такие как клетки обезьян COS, клетки CHO или миеломные клетки, которые в ином случае не продуцируют иммуноглобулиновый белок, для синтеза моноклональных антител в рекомбинантных клетках-хозяевах. ДНК также можно модифицировать, например, посредством замены кодирующей последовательностью константных доменов тяжелой и легкой цепи человека гомологичных последовательностей мышей, Morrison et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 81:6851, 1984. Таким образом, получают химерные антитела, имеющие специфичность связывания моноклонального антитела против антигена по настоящему изобретению.

Как белок поверхности клетки, GUCY2c может служить в качестве терапевтической мишени для рецептор-связывающих белков, таких как антитела или лиганды. В нормальной ткани кишечника GUCY2c экспрессируется на апикальной стороне плотного контакта эпителиальных клеток, образующих барьер между средой просвета и сосудистым компартментом (Almenoff et al., Mol Microbiol 8: 865-873, 1993; и Guarino et al., Dig Dis Sci 32: 1017-1026, 1987). В связи с этим, системное внутривенное введение GUCY2c-связывающего белкового терапевтического средства будет иметь минимальный эффект в отношении кишечных рецепторов GUCY2c, присутствующих на нормальных клетках, при этом делая возможным доступ к неопластическим клеткам желудочно-кишечного тракта, включая злокачественные или метастазирующие клетки рака толстого кишечника, внекишечные или метастазирующие опухоли толстого кишечника, опухоли пищевода, опухоли желудка или аденокарциному в области гастроэзофагеального соединения. Кроме того, GUCY2c интернализуется посредством рецептор-опосредованного эндоцитоза после связывания лиганда (Buc et al. Eur J Cancer 41: 1618-1627, 2005; Urbanski et al., Biochem Biophys Acta 1245: 29-36, 1995).

Можно использовать тканеспецифическую экспрессию и ассоциацию GUCY2c со злокачественным новообразованием, например, желудочно-кишечного происхождения (например, раком толстого кишечника, раком желудка или раком пищевода), для использования GUCY2c в качестве диагностического маркера этого заболевания (Carrithers et al., Dis Colon Rectum 39:171-181, 1996; Buc et al. Eur J Cancer 41: 1618-1627, 2005).

Настоящее изобретение относится к антителу, связывающемуся с GUCY2c (например, GUCY2c человека (например, SEQ ID NO: 224, являющегося производным белка под регистрационным номером: NP_004954,2)), и которое можно использовать в любом одном или более из следующего: (a) лечении, профилактике или улучшении одного или более симптомов состояния, ассоциированного со злокачественными клетками, экспрессирующими GUCY2c, у индивидуума (например, злокачественного новообразования желудочно-кишечного новообразования, такого как колоректальный рак (CRC)); (b) ингибировании роста или прогрессирования опухоли у индивидуума, имеющего злокачественную опухоль, экспрессирующую GUCY2c; (c) ингибировании метастазирования злокачественных клеток, экспрессирующих GUCY2c, у индивидуума, имеющего одну или более злокачественных клеток, экспрессирующих GUCY2c; (d) индуцировании регрессирования (например, долговременного регрессирования) опухоли, экспрессирующей GUCY2c; (e) вызывании цитотоксической активности в отношении злокачественных клеток, экспрессирующих GUCY2c; (f) повышении выживаемости без прогрессирования у индивидуума с GUCY2c-ассоциированным нарушением; (g) повышении общей выживаемости индивидуума с GUCY2c-ассоциированным нарушением; (h) уменьшении использования дополнительных химиотерапевтических или цитотоксических средств у индивидуума с GUCY2c-ассоциированным нарушением; (i) снижении опухолевой нагрузки у индивидуума с GUCY2c-ассоциированным нарушением; или (j) блокировании взаимодействия GUCY2c с другими, еще не идентифицированными факторами.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к антителу, содержащему (a) вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую определяющую комплементарность область VH один (CDR1 VH), определяющую комплементарность область VH два (CDR2 VH) и определяющую комплементарность область VH три (CDR3 VH) последовательности VH, приведенной в SEQ ID NO: 11, 19, 26, 33, 41, 48, 52, 57, 60, 62, 64, 65, 67, 69, 71 или 73; и/или (b) вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую определяющую комплементарность область VL один (CDR1 VL), определяющую комплементарность область VL два (CDR2 VL) и определяющую комплементарность область VL три (CDR3 VL) последовательности VL, приведенной в SEQ ID NO: 92, 100, 104, 106, 112, 119, 125, 129, 134, 136, 137, 138, 140, 143, 145, 147, 150, 152, 156, 158, 160, 162, 166, 170, 171, 172, 173, 174 или 175.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к антителу, имеющему любую из частичных последовательностей тяжелой цепи и/или любую из частичных последовательностей легкой цепи, приведенных в таблице 1. В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к антителу, содержащему область VH и/или область VL, где: (a) область VH содержит SEQ ID NO: 11, 19, 26, 33, 41, 48, 52, 57, 60, 62, 64, 65, 67, 69, 71 или 73; и/или (b) область VL содержит SEQ ID NO: 92, 100, 104, 106, 112, 119, 125, 129, 134, 136, 137, 138, 140, 143, 145, 147, 150, 152, 156, 158, 160, 162, 166, 170, 171, 172, 173, 174 или 175.

Таблица 1

Описание Последовательность GUCY2C-0074_VH EVQLQQSGAELARPGASVNLSCKASGYTFTTYWMQWVKQRPGQGLEWIGAIYPGDGMTTYTQKFKDKATLTADKSSSTAYMQLSSLASEDSAVYYCVRKGMDYWGQGTSVTVSS (SEQ ID NO: 11) GUCY2C-0077_VH EVQLQQSGAELARPGASVKLSCKASGYTFTKYWMQWIKQRPGQGLEWIGAIYPGDGFTTYTQKFKGKATLTADKSSNTAYMQLSSLASEDSAVYYCARRNYGRTYGGDYWGQGTSVTVSS (SEQ ID NO: 19) GUCY2C-0098_VH QVQLQQPGAELVKPGASVKLSCKASGYTFTSYWMHWVKQRPGQGLEWIGEIKPSNGLTNYIEKFKNKATLTVDKSATTAYMQLSSLTAEDSAVYYCTRTITTTEGYWFFDVWGAGTTVTVSS (SEQ ID NO: 26) GUCY2C-0104_VH EVQLQQSGAELVKPGASVKLSCTASGFNIKDTYIHWVKQRPEQGLEWIGRIDPANGNANYDPKFQGKATITADTSSNTAYLQLSSLTSEDTAVFYCSSLGTGTYWGQGTTLTVSS (SEQ ID NO: 33) GUCY2C-0105_VH EVQLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYSFTDYIMLWVKQSHGKSLEWIGNSNPYYGSTSYNLKFKGKATLTVDKSSSTAYMHLNSLTSEDSAVYYCARSGYYGSSPYWYFDVWGAGTTVTVSS (SEQ ID NO: 41) GUCY2C-0240_VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTTYWMQWVRQAPGKGLEWIGAIYPGDGMTTYTQKFKDRFTISADKAKNSAYLQMNSLRAEDTAVYYCVRKGMDYWGQGTLVTVSS
(SEQ ID NO: 48) GUCY2C-0315_VH QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTTYWMQWVRQAPGQGLEWIGAIYPGDGMTTYTQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCVRKGMDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 52) GUCY2C-0179_VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYSFTDYIMLWVRQAPGKGLEWIGNSNPYYGSTSYNLKFKGRFTISVDKAKNSAYLQMNSLRAEDTAVYYCARSGYYGSSPYWYFDVWGQGTMVTVSS (SEQ ID NO: 57) GUCY2C-0193_VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYWMHWVRQAPGKGLEWIGEIKPSNGLTNYIEKFKNRFTISVDKAKNSAYLQMNSLRAEDTAVYYCTRTITTTEGYWFFDVWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 60) GUCY2C-0210_VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYWMHWVRQAPGKGLEWIAEIKPSNGLTNYIEKFKNRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARTITTTEGYWFFDVWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 62) GUCY2C-0212_VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYWMHWVRQAPGKGLEWIGEIKPSNGLTNYIEKFKNRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARTITTTEGYWFFDVWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 64) GUCY2C-1186_VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYWMHWVRQAPGKGLEWIGEIKPSNGLTNIHPKFKNRFTISVDKAKNSAYLQMNSLRAEDTAVYYCTRTITTTEGYWFFDVWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 65) GUCY2C-1476_VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYWMHWVRQAPGKGLEWIGEIKPSNGLTNVHEKFKNRFTISVDKAKNSAYLQMNSLRAEDTAVYYCTRTITTTEGYWFFDVWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 67) GUCY2C-1478_VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYWMHWVRQAPGKGLEWIGEIKPSNGLTNVHEKFKNRFTISVDKAKNSAYLQMNSLRAEDTAVYYCTRTITTTEGYWFFDVWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 69) GUCY2C-1512_VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYWMHWVRQAPGKGLEWIGEIKPSNGLTNYAEQFKNRFTISVDKAKNSAYLQMNSLRAEDTAVYYCTRTITTTEGYWFFDVWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 71) GUCY2C-1554_VH; GUCY2C-1608_VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMHWVRQAPGKGLEWIGEIKPSNELTNVHEKFKDRFTISVDKAKNSAYLQMNSLRAEDTAVYYCTRTITTTEGYWFFDVWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 73) GUCY2C-0074_VL DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVDNYGISFMNWFQQKPGQPPKLLIYAASNPGSGVPARFSGSGSGTDFSLNIHPLEEDDTAMFFCQQSKEVPYTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 92) GUCY2C-0077_VL DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVDNFDISFMNWFQQKPGQPPKLLIYAASNQGSGVPARFSGSGSGTDFSLNIHPMEEDDTAMYFCQQSKEVPYTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 100) GUCY2C-0078_VL DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRAGESVDNFDISFMNWFQQKPGQPPKLLIYAASNQGSGVPARFSGSGSGTDFSLNIHPMEEDDTAMYFCQQSKEVPYTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 104) GUCY2C-0098_VL DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVDYYGTSLMQWYQQKPGQPPKLLIYAASNVESGVPARFSGSGSGTDFSLNIHPVEEDDIAMYFCQQTRKVYTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 106) GUCY2C-0104_VL DIVMTQSPASLAVSLGQRATISCRASKGVTTSGYSYMHWYQQKPGQPPKLLIYLASNLESGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQHSREFPLTFGAGTKLELK (SEQ ID NO: 112) GUCY2C-0105_VL DIVMTQSPSSLAVSVGEKVTVSCKSSQSLLYSSNQKNYLAWYQQRPGQSPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLSISSVKAEDLAVYYCQQYYSYPTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 119) GUCY2C-0240_VL DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVDNYGISFMNWFQQKPGKAPKLLIYAASNPGSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSKEVPYTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO: 125) GUCY2C-0315_VL EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASESVDNYGISFMNWYQQKPGQAPRLLIYAASNPGSGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQSKEVPYTFGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 129) GUCY2C-0179_VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKSSQSLLYSSNQKNYLAWYQQKPGKSPKLLIYWASTRESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYSYPTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 134) GUCY2C-0193_VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVDYYGTSLMQWYQQKPGKAPKLLIYAASNVESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTRKVYTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO: 136) GUCY2C-0210_VL DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVDYYGTSLMQWYQQKPGKAPKLLIYAASNVESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTRKVYTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO: 137) GUCY2C-0247_VL DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVDYYGTSLMQWYQQKPGKPPKLLIYAASNVESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTRKVYTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO: 138) GUCY2C-1186_VL DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVDYYGTSLMQWYQQKPGKAPKLLIYAASKRYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTRKAYTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO: 140) GUCY2C-1467_VL DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVDYYGTSLMQWYQQKPGKAPKLLIYAASKLWSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTRKVYTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO: 143) GUCY2C-1476_VL DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVDYYGTSLMQWYQQKPGKAPKLLIYAASKVAPGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTRKAYTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO: 145) GUCY2C-1478_VL; GUCY2C-1608_VL DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVDYYGSSLLQWYQQKPGKAPKLLIYAASKLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTRKAYTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO: 147) GUCY2C-1481_VL DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVDYYGTSLMQWYQQKPGKAPKLLIYAASNIAPGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTRKAYTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO: 150) GUCY2C-1512_VL DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVDYYGSSLMQWYQQKPGKAPKLLIYAASKRYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTRKEYTFGQGTKLKIK (SEQ ID NO: 152) GUCY2C-1518_VL DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVDYYGSSLMQWYQQKPGKAPKLLIYAASNVAPGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTRKAYTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO: 156) GUCY2C-1526_VL DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVDYYGSSLMQWYQQKPGKAPKLLIYAASHRASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTRKAYTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO: 158) GUCY2C-1527_VL DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVDYYGTSLMQWYQQKPGKAPKLLIYAASNVASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTRKEYTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO: 160) GUCY2C-1538_VL DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVDYYGHSLMQWYQQKPGKAPKLLIYAASNRYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTRKAYSFGQGTKLEIK (SEQ ID NO: 162) GUCY2C-1554_VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSVDYYGSSLLQWYQQKPGKAPKLLIYDASKLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQERKAYTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO: 166) GUCY2C-1555_VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSVDYYGSSLLQWYQQKPGKAPKLLIYAASKLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQERKAYTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO: 170) GUCY2C-1556_VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSVDYYGSSLLQWYQQKPGKAPKLLIYDASKLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTRKAYTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO: 171) GUCY2C-1557_VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSVDYYGSSLLQWYQQKPGKAPKLLIYAASKLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTRKAYTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO: 172) GUCY2C-1590_VL DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVDYYGSSLLQWYQQKPGKAPKLLIYDASKLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQERKAYTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO: 173) GUCY2C-1591_VL DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVDYYGSSLLQWYQQKPGKAPKLLIYAASKLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQERKAYTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO: 174) GUCY2C-1592_VL DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVDYYGSSLLQWYQQKPGKAPKLLIYDASKLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTRKAYTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO: 175)

В таблице 1 подчеркнутые последовательности представляют собой последовательности CDR по Kabat, а выделенные полужирным шрифтом - по Chothia. Определение AbM использовали для CDR1 VH.

Изобретение также относится к частям CDR антител против GUCY2c. Контактные области CDR являются областями антитела, придающими антителу специфичность к антигену. В основном, контактные области CDR включают положения остатков в CDR и зонах Вернье, ограниченных для поддержания правильной петлевой структуры, чтобы антитело связывалось со специфическим антигеном. См., например, Makabe et al., J. Biol. Chem., 283:1156-1166, 2007. Определение областей CDR хорошо известно в этой области. Алгоритм, воплощенный в версии 2.3.3 выпуска Abysis (www.abysis.org), использовали в настоящем изобретении для приписывания нумерации по Kabat вариабельным областям, CDR1 VL, CDR2 VL, CDR3 VL, CDR2 VH и CDR3 VH, за исключением CDR1 VH. Определение AbM использовали для CDR1 VH.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к антителу, имеющему любую из последовательностей CDR VH и/или любую из последовательностей CDR VL, приведенных в таблице 2. В одном из аспектов настоящее изобретение относится к антителу, специфически связывающемуся с гуанилатциклазой C (GUCY2c), где антитело содержит: (a) вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую (i) определяющую комплементарность область VH один (CDR1 VH), содержащую SEQ ID NO: 12, 20, 27, 34, 42, 74, 257, 258, 259, 260 или 261; (ii) определяющую комплементарность область VH два (CDR2 VH), содержащую SEQ ID NO: 13, 21, 28, 35, 43, 53, 66, 68, 70, 72, 75, 262, 263, 264, 265, 266 или 267; и (iii) определяющую комплементарность область VH три (CDR3 VH), содержащую SEQ ID NO: 14, 22, 29, 36 или 44; и/или (b) вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую (i) определяющую комплементарность область VL один (CDR1 VL), содержащую SEQ ID NO: 93, 101, 105, 107, 113, 120, 148, 153, 163 или 167; (ii) определяющую комплементарность область VL два (CDR2 VL), содержащую SEQ ID NO: 78, 94, 102, 108, 114, 141, 144, 146, 149, 151, 157, 159, 161, 164 или 168; и (iii) определяющую комплементарность область VH три (CDR3 VL), содержащую SEQ ID NO: 95, 109, 115, 121, 142, 154, 165 или 169.

В конкретном варианте осуществления настоящее изобретение относится к антителу, где: (a) область VH содержит (i) CDR1 VH, содержащую последовательность SEQ ID NO: 74 или 259; (ii) CDR2 VH, содержащую последовательность SEQ ID NO: 75 или 267; и iii) CDR3 VH, содержащую последовательность SEQ ID NO: 29; и/или (b) область VL содержит (i) CDR1 VL, содержащую последовательность SEQ ID NO: 148; (ii) CDR2 VL, содержащую последовательность SEQ ID NO: 149; и (iii) CDR3 VL, содержащую последовательность SEQ ID NO: 142.

Таблица 2

Тяжелая цепь mAb CDR1 VH CDR2 VH CDR3 VH GUCY2C-0074_VH GYTFTTYWMQ (SEQ ID NO: 12) (ABM);
TYWMQ (SEQ ID NO: 257) (Kabat) AIYPGDGMTTYTQKFKD (SEQ ID NO: 13) Kabat);
YPGDGM (SEQ ID NO: 262) (Chothia) KGMDY (SEQ ID NO: 14) GUCY2C-0077_VH GYTFTKYWMQ(SEQ ID NO: 20) (ABM);
KYWMQ (SEQ ID NO: 258) (Kabat) AIYPGDGFTTYTQKFKG (SEQ ID NO: 21) (Kabat);
YPGDGF (SEQ ID NO: 263) (Chothia) RNYGRTYGGDY (SEQ ID NO: 22) GUCY2C-0098_VH GYTFTSYWMH (SEQ ID NO: 27) (ABM); SYWMH (SEQ ID NO: 259) (Kabat) EIKPSNGLTNYIEKFKN (SEQ ID NO: 28) (Kabat);
KPSNGL (SEQ ID NO: 264) (Chothia) TITTTEGYWFFDV (SEQ ID NO: 29) GUCY2C-0104_VH GFNIKDTYIH (SEQ ID NO: 34) (ABM);
DTYIH (SEQ ID NO: 260) (Kabat) RIDPANGNANYDPKFQG (SEQ ID NO: 35) (Kabat);
DPANGN (SEQ ID NO: 265) (Chothia) LGTGTY (SEQ ID NO: 36) GUCY2C-0105_VH GYSFTDYIML (SEQ ID NO: 42) (ABM);
DYIML (SEQ ID NO: 261) (Kabat) NSNPYYGSTSYNLKFKG (SEQ ID NO: 43) (Kabat);
NPYYGS (SEQ ID NO: 266) (Chothia) SGYYGSSPYWYFDV (SEQ ID NO: 44) GUCY2C-0240_VH GYTFTTYWMQ (SEQ ID NO: 12) (ABM);
TYWMQ(SEQ ID NO: 257) (Kabat) AIYPGDGMTTYTQKFKD (SEQ ID NO: 13) (Kabat);
YPGDGM (SEQ ID NO: 262) (Chothia) KGMDY (SEQ ID NO: 14) GUCY2C-0315_VH GYTFTTYWMQ (SEQ ID NO: 12) (ABM);
TYWMQ(SEQ ID NO: 257) (Kabat) AIYPGDGMTTYTQKFQG (SEQ ID NO: 53) (Kabat);
YPGDGM(SEQ ID NO: 262) (Chothia) KGMDY (SEQ ID NO: 14) GUCY2C-0179_VH GYSFTDYIML (SEQ ID NO: 42) (ABM);
DYIML (SEQ ID NO: 261) (Kabat) NSNPYYGSTSYNLKFKG(SEQ ID NO: 43) (Kabat);
NPYYGS(SEQ ID NO: 266) (Chothia) SGYYGSSPYWYFDV (SEQ ID NO: 44) GUCY2C-0193_VH GYTFTSYWMH (SEQ ID NO: 27) (ABM);
SYWMH (SEQ ID NO: 259) (Kabat) EIKPSNGLTNYIEKFKN (SEQ ID NO: 28) (Kabat);
KPSNGL(SEQ ID NO: 264) (Chothia) TITTTEGYWFFDV (SEQ ID NO: 29) GUCY2C-0210_VH GYTFTSYWMH (SEQ ID NO: 27) (ABM);
SYWMH (SEQ ID NO: 259) (Kabat) EIKPSNGLTNYIEKFKN (SEQ ID NO: 28) (Kabat);
KPSNGL(SEQ ID NO: 264) (Chothia) TITTTEGYWFFDV (SEQ ID NO: 29) GUCY2C-0212_VH GYTFTSYWMH(SEQ ID NO: 27) (ABM);
SYWMH (SEQ ID NO: 259) (Kabat) EIKPSNGLTNYIEKFKN(SEQ ID NO: 28) (Kabat);
KPSNGL (SEQ ID NO: 264) (Chothia) TITTTEGYWFFDV (SEQ ID NO: 29) GUCY2C-1186_VH GYTFTSYWMH (SEQ ID NO: 27) (ABM);
SYWMH (SEQ ID NO: 259) (Kabat) EIKPSNGLTNIHPKFKN (SEQ ID NO: 66) (Kabat);
KPSNGL(SEQ ID NO: 264) (Chothia) TITTTEGYWFFDV (SEQ ID NO: 29) GUCY2C-1476_VH GYTFTSYWMH (SEQ ID NO: 27) (ABM);
SYWMH (SEQ ID NO: 259) (Kabat) EIKPSNGLTNYNEKFKN (SEQ ID NO: 68) (Kabat);
KPSNGL (SEQ ID NO: 264) (Chothia) TITTTEGYWFFDV (SEQ ID NO: 29) GUCY2C-1478_VH GYTFTSYWMH (SEQ ID NO: 27) (ABM);
SYWMH (SEQ ID NO: 259) (Kabat) EIKPSNGLTNVHEKFKN (SEQ ID NO: 70) (Kabat);
KPSNGL (SEQ ID NO: 264) (Chothia) TITTTEGYWFFDV (SEQ ID NO: 29) GUCY2C-1512_VH GYTFTSYWMH (SEQ ID NO: 27) (ABM);
SYWMH (SEQ ID NO: 259) (Kabat) EIKPSNGLTNYAEQFKN (SEQ ID NO: 72) (Kabat);
KPSNGL (SEQ ID NO: 264) (Chothia) TITTTEGYWFFDV (SEQ ID NO: 29) GUCY2C-1554_VH; GUCY2C-1608_VH GFTFSSYWMH (SEQ ID NO: 74) (ABM);
SYWMH(SEQ ID NO: 259) (Kabat) EIKPSNELTNVHEKFKD (SEQ ID NO: 75) (Kabat);
KPSNEL (SEQ ID NO: 267) (Chothia) TITTTEGYWFFDV (SEQ ID NO: 29) Легкая цепь mAb CDR1 VL CDR2 VL CDR3 VL GUCY2C-0074_VL RASESVDNYGISFMN (SEQ ID NO: 93) AASNPGS (SEQ ID NO: 94) QQSKEVPYT (SEQ ID NO: 95) GUCY2C-0077_VL RASESVDNFDISFMN (SEQ ID NO: 101) AASNQGS (SEQ ID NO: 102) QQSKEVPYT (SEQ ID NO: 95) GUCY2C-0078_VL RAGESVDNFDISFMN (SEQ ID NO: 105) AASNQGS (SEQ ID NO: 102) QQSKEVPYT (SEQ ID NO: 95) GUCY2C-0098_VL RASESVDYYGTSLMQ (SEQ ID NO: 107) AASNVES (SEQ ID NO: 108) QQTRKVYT (SEQ ID NO: 109) GUCY2C-0104_VL RASKGVTTSGYSYMH (SEQ ID NO: 113) LASNLES (SEQ ID NO: 114) QHSREFPLT (SEQ ID NO: 115) GUCY2C-0105_VL KSSQSLLYSSNQKNYLA (SEQ ID NO: 120) WASTRES (SEQ ID NO: 78) QQYYSYPT (SEQ ID NO: 121) GUCY2C-0240_VL RASESVDNYGISFMN (SEQ ID NO: 93) AASNPGS (SEQ ID NO: 94) QQSKEVPYT (SEQ ID NO: 95) GUCY2C-0315_VL RASESVDNYGISFMN (SEQ ID NO: 93) AASNPGS (SEQ ID NO: 94) QQSKEVPYT (SEQ ID NO: 95) GUCY2C-0179_VL KSSQSLLYSSNQKNYLA (SEQ ID NO: 120) WASTRES (SEQ ID NO: 78) QQYYSYPT (SEQ ID NO: 121) GUCY2C-0193_VL RASESVDYYGTSLMQ (SEQ ID NO: 107) AASNVES (SEQ ID NO: 108) QQTRKVYT (SEQ ID NO: 109) GUCY2C-0210_VL RASESVDYYGTSLMQ (SEQ ID NO: 107) AASNVES (SEQ ID NO: 108) QQTRKVYT (SEQ ID NO: 109) GUCY2C-0247_VL RASESVDYYGTSLMQ (SEQ ID NO: 107) AASNVES (SEQ ID NO: 108) QQTRKVYT (SEQ ID NO: 109) GUCY2C-1186_VL RASESVDYYGTSLMQ (SEQ ID NO: 107) AASKRYS (SEQ ID NO: 141) QQTRKAYT (SEQ ID NO: 142) GUCY2C-1467_VL RASESVDYYGTSLMQ (SEQ ID NO: 107) AASKLWS (SEQ ID NO: 144) QQTRKVYT (SEQ ID NO: 109) GUCY2C-1476_VL RASESVDYYGTSLMQ (SEQ ID NO: 107) AASKVAP (SEQ ID NO: 146) QQTRKAYT (SEQ ID NO: 142) GUCY2C-1478_VL RASESVDYYGSSLLQ (SEQ ID NO: 148) AASKLAS (SEQ ID NO: 149) QQTRKAYT (SEQ ID NO: 142) GUCY2C-1481_VL RASESVDYYGTSLMQ (SEQ ID NO: 107) AASNIAP (SEQ ID NO: 151) QQTRKAYT (SEQ ID NO: 142) GUCY2C-1512_VL RASESVDYYGSSLMQ (SEQ ID NO: 153) AASKRYS (SEQ ID NO: 141) QQTRKEYT (SEQ ID NO: 154) GUCY2C-1518_VL RASESVDYYGSSLMQ (SEQ ID NO: 153) AASNVAP (SEQ ID NO: 157) QQTRKAYT (SEQ ID NO: 142) GUCY2C-1526_VL RASESVDYYGSSLMQ (SEQ ID NO: 153) AASHRAS (SEQ ID NO: 159) QQTRKAYT (SEQ ID NO: 142) GUCY2C-1527_VL RASESVDYYGTSLMQ (SEQ ID NO: 107) AASNVAS (SEQ ID NO: 161) QQTRKEYT (SEQ ID NO: 154) GUCY2C-1538_VL RASESVDYYGHSLMQ (SEQ ID NO: 163) AASNRYS (SEQ ID NO: 164) QQTRKAYS (SEQ ID NO: 165) GUCY2C-1554_VL RASQSVDYYGSSLLQ (SEQ ID NO: 167) DASKLAS (SEQ ID NO: 168) QQERKAYT (SEQ ID NO: 169) GUCY2C-1555_VL RASQSVDYYGSSLLQ (SEQ ID NO: 167) AASKLAS (SEQ ID NO: 149) QQERKAYT (SEQ ID NO: 169) GUCY2C-1556_VL RASQSVDYYGSSLLQ (SEQ ID NO: 167) DASKLAS (SEQ ID NO: 168) QQTRKAYT (SEQ ID NO: 142) GUCY2C-1557_VL RASQSVDYYGSSLLQ (SEQ ID NO: 167) AASKLAS (SEQ ID NO: 149) QQTRKAYT (SEQ ID NO: 142) GUCY2C-1590_VL RASESVDYYGSSLLQ (SEQ ID NO: 148) DASKLAS (SEQ ID NO: 168) QQERKAYT (SEQ ID NO: 169) GUCY2C-1591_VL RASESVDYYGSSLLQ (SEQ ID NO: 148) AASKLAS (SEQ ID NO: 149) QQERKAYT (SEQ ID NO: 169) GUCY2C-1592_VL RASESVDYYGSSLLQ (SEQ ID NO: 148) DASKLAS (SEQ ID NO: 168) QQTRKAYT (SEQ ID NO: 142) GUCY2C-1608_VL RASESVDYYGSSLLQ (SEQ ID NO: 148) AASKLAS (SEQ ID NO: 149) QQTRKAYT (SEQ ID NO: 142)

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к антителу, имеющему любую из частичных последовательностей легкой цепи и/или любую из частичных последовательностей тяжелой цепи, приведенных в таблице 3. В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к выделенному антителу или его антигенсвязывающему фрагменту, специфически связывающемуся с CD3, где антитело содержит: область VH, содержащую CDR1 VH, CDR2 VH и CDR3 VH последовательности VH, приведенной в SEQ ID NO: 1, 9 или 273; и/или область VL, содержащую CDR1 VL, CDR2 VL и CDR3 VL последовательности VL, приведенной в SEQ ID NO: 76, 84, 90, 274, 275 или 276.

Таблица 3

Описание Последовательность VH CD3-0001 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMTWVRQAPGKGLEWVAFIRNRARGYTSDHNPSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRPSYYVLDYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 1) VH CD3-0006 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMTWVRQAPGKGLEWVAFIRNQARGYTSDHNPSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRPSYYVLDYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 9) VH 2B5-1038,
VH 2B5-1039,
VH 2B5-1040 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMTWVRQAPGKGLEWVAFIRNQARGYTSDHNPSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRPSYYVLDYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 273) VL CD3-0001 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCTSSQSLFNVRSRKNYLAWYQQKPGKAPKLLIYWASTRESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCKQSYDLFTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 76) VL CD3-0004 DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKKSSQSLFNVRSRKNYLAWYQQKPGQPPKLLISWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCKQSYDLFTFGSGTKLEIK (SEQ ID NO: 84) VL CD3-0006 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCTSSQSLFNVRSQKNYLAWYQQKPGKAPKLLIYWASTRESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCKQSYDLFTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 90) VL 2B5-1038 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCTSDQSLFNVRSGKNYLAWYQQKPGKAPKLLIYWASDRESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCKQSYDLFTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 274) VL 2B5-1039 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCTSSESLFNVRSGKNYLAWYQQKPGKAPKLLIYWASDRESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCKQSYDLFTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 275) VL 2B5-1040 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCTSSQSLFNVRSGKNYLAWYQQKPGKAPKLLIYWASDRESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCKQSYDLFTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 276)

В таблице 3 подчеркнутые последовательности представляют собой последовательности CDR по Kabat, а выделенные полужирным шрифтом - по Chothia. Определение AbM использовали для CDR1 VH.

В таблице 4 приведены примеры последовательностей CDR для антител против CD3, представленных в настоящем описании.

Таблица 4

Тяжелая цепь mAb CDR1 VH CDR2 VH CDR3 VH CD3-0001_VH GFTFSDYYMT (SEQ ID NO: 2) (ABM);
DYYMT(SEQ ID NO: 268) (Kabat) FIRNRARGYTSDHNPSVKG (SEQ ID NO: 3) (Kabat);
RNRARGYT (SEQ ID NO: 269) (Chothia) DRPSYYVLDY (SEQ ID NO: 4) CD3-0006_VH GFTFSDYYMT (SEQ ID NO: 2) (ABM);
DYYMT(SEQ ID NO: 268) (Kabat) FIRNQARGYTSDHNPSVKG(SEQ ID NO: 10) (Kabat);
RNQARGYT (SEQ ID NO: 270) (Chothia) DRPSYYVLDY (SEQ ID NO: 4) 2B5-1038 DYYMT (SEQ ID NO: 268) (Kabat)
GFTFSDY (SEQ ID NO: 277) (Chothia)
GFTFSDYYMT (SEQ ID NO: 2) (расширенный) FIRNQARGYTSDHNPSVKG (SEQ ID NO: 10) (Kabat)
RNQARGYT (SEQ ID NO: 270) (Chothia) DRPSYYVLDY (SEQ ID NO: 4) 2B5-1039 DYYMT (SEQ ID NO: 268) (Kabat)
GFTFSDY (SEQ ID NO: 277) (Chothia)
GFTFSDYYMT (SEQ ID NO: 2) (расширенный) FIRNQARGYTSDHNPSVKG (SEQ ID NO: 10) (Kabat)
RNQARGYT (SEQ ID NO: 270) (Chothia) DRPSYYVLDY (SEQ ID NO: 4) 2B5-1040 DYYMT (SEQ ID NO: 268) (Kabat)
GFTFSDY (SEQ ID NO: 277) (Chothia)
GFTFSDYYMT
(SEQ ID NO: 2) (расширенный) FIRNQARGYTSDHNPSVKG (SEQ ID NO: 10) (Kabat)
RNQARGYT (SEQ ID NO: 270) (Chothia) DRPSYYVLDY (SEQ ID NO: 4) Легкая цепь mAb CDR1 VL CDR2 VL CDR3 VL CD3-0001_VL TSSQSLFNVRSRKNYLA (SEQ ID NO: 77) WASTRES (SEQ ID NO: 78) KQSYDLFT (SEQ ID NO: 79) CD3-0004_VL KSSQSLFNVRSRKNYLA
(SEQ ID NO: 85) WASTRES (SEQ ID NO: 78) KQSYDLFT (SEQ ID NO: 79) CD3-0006_VL TSSQSLFNVRSQKNYLA (SEQ ID NO: 91) WASTRES (SEQ ID NO: 78) KQSYDLFT (SEQ ID NO: 79) 2B5-1038 TSDQSLFNVRSGKNYLA (SEQ ID NO: 278) WASDRES (SEQ ID NO: 281) KQSYDLFT (SEQ ID NO: 79) 2B5-1039 TSSESLFNVRSGKNYLA (SEQ ID NO: 279) WASDRES (SEQ ID NO: 281) KQSYDLFT (SEQ ID NO: 79) 2B5-1040 TSSQSLFNVRSGKNYLA (SEQ ID NO: 280) WASDRES (SEQ ID NO: 281) KQSYDLFT (SEQ ID NO: 79)

В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к биспецифическому антителу, где: (a) CDR1 VL против GUCY2c содержит последовательность SEQ ID NO: 93, 101, 105, 107, 113, 120, 148, 153, 163 или 167; CDR2 VL против GUCY2c содержит последовательность SEQ ID NO: 78, 94, 102, 108, 114, 141, 144, 146, 149, 151, 157, 159, 161, 164 или 168; и CDR3 VL против GUCY2c содержит последовательность SEQ ID NO: 95, 109, 115, 121, 142, 154, 165 или 169; (b) CDR1 VH против CD3 содержит последовательность SEQ ID NO: 2, 268 или 277; CDR2 VH против CD3 содержит последовательность SEQ ID NO: 3, 10, 269 или 270; и CDR3 VH против CD3 содержит последовательность SEQ ID NO: 4; (c) CDR1 VL против CD3 содержит последовательность SEQ ID NO: 77, 85, 91, 278, 279 или 280; CDR2 VL против CD3 содержит последовательность SEQ ID NO: 78 или 281; и CDR3 VL против CD3 содержит последовательность SEQ ID NO: 79; и (d) CDR1 VH против GUCY2c содержит последовательность SEQ ID NO: 12, 20, 27, 34, 42, 74, 257, 258, 259, 260 или 261; CDR2 VH против GUCY2c содержит последовательность SEQ ID NO: 13, 21, 28, 35, 43, 53, 66, 68, 70, 72, 75, 262, 263, 264, 265, 266 или 267; и CDR3 VH против GUCY2c содержит последовательность SEQ ID NO: 14, 22, 29, 36 или 44.

В некоторых таких вариантах осуществления настоящее изобретение относится к биспецифическому антителу, где: (a) CDR1 VH против GUCY2c содержит последовательность SEQ ID NO: 74 или 259; (b) CDR2 VH против GUCY2c содержит последовательность SEQ ID NO: 75 или 267; (c) CDR3 VH против GUCY2c содержит последовательность SEQ ID NO: 29; (d) CDR1 VL против GUCY2c содержит последовательность SEQ ID NO: 148; (e) CDR2 VL против GUCY2c содержит последовательность SEQ ID NO: 149; и (f) CDR3 VL против GUCY2c содержит последовательность SEQ ID NO: 142.

В дополнительных вариантах осуществления описанного выше изобретение относится к биспецифическому антителу, где: (a) CDR1 VH против CD3 содержит последовательность SEQ ID NO: 2, 268, или 277; (b) CDR2 VH против CD3 содержит последовательность SEQ ID NO: 10 или 270; (c) CDR3 VH против CD3 содержит последовательность SEQ ID NO: 4; (d) CDR1 VL против CD3 содержит последовательность SEQ ID NO: 91, 278, 279 или 280; (e) CDR2 VL против CD3 содержит последовательность SEQ ID NO: 78 или 281; и (f) CDR3 VL против CD3 содержит последовательность SEQ ID NO: 79.

В конкретном варианте осуществления настоящее изобретение относится к полинуклеотиду, содержащему нуклеотидную последовательность, кодирующую вариабельные области тяжелой цепи и/или легкой цепи антитела, как представлено в настоящем описании и в таблице 5, таблице 37A и таблице 37B, включая: CD3-0001, CD3-0004, CD3-0006, GUCY2C-0074, GUCY2C-0077, GUCY2C-0078, GUCY2C-0098, GUCY2C-0104, GUCY2C-0105, GUCY2C-0240, GUCY2C-0315, GUCY2C-0179, GUCY2C-0193, GUCY2C-0210, GUCY2C-0212, GUCY2C-0241, GUCY2C-0247, GUCY2C-1186, GUCY2C-1467, GUCY2C-1478, GUCY2C-1481,GUCY2C-1512, GUCY2C-1518, GUCY2C-1526, GUCY2C-1527, GUCY2C-1538, GUCY2C-1554, GUCY2C-1555, GUCY2C-1556, GUCY2C-1557, GUCY2C-1590, GUCY2C-1591, GUCY2C-1592, GUCY2C-1608, huIGHV3-7, huIGKV1-39, GUCY2C-0405, GUCY2C-0486, GUCY2C-1640, GUCY2C-0250, GUCY2C-1678, GUCY2C-1679 или GUCY2C-1680.

В последовательностях, представленных в настоящем описании, приведены антитела против GUCY2c, антитела против CD3 и биспецифические антитела против CD3-GUCY2c. В некоторых вариантах осуществления эти антитела обозначают по ID их клона (например, GUCY2C-0098). Эти ID клонов можно использовать для обозначения зрелого антитела (например, IgG или биспецифического антитела против CD3). ID клона также может относиться к уникальным областям VH или VL, обнаруживаемым в этом антителе. В случае ID клонов, соответствующих биспецифическим антителам против CD3-GUCY2c (например, GUCY2C-0098), также можно упомянуть уникальную область антитела против CD3 (например, области VL и/или VH), включенную в зрелый белок. В таблице 5 приведен формат антитела и области против CD3 (если она есть), присутствующей в зрелом белке. В таблицах 37A и 37B дополнительно приведены последовательности компонентов этих зрелых антител против GUCY2c, IgG против CD3 и биспецифических антител против CD3-GUCY2c.

Таблица 5

Последовательность Описание Формат Область против CD3 CD3-0001 Антитело против CD3 IgG CD3-0001 CD3-0004 Антитело против CD3 IgG CD3-0004 CD3-0006 Антитело против CD3 IgG CD3-0006 GUCY2C-0074 Биспецифическое антитело против CD3-GUCY2c Биспецифическое антитело против CD3 CD3-0004 GUCY2C-0077 Биспецифическое антитело против CD3-GUCY2c Биспецифическое антитело против CD3 CD3-0004 GUCY2C-0078 Биспецифическое антитело против CD3-GUCY2c Биспецифическое антитело против CD3 CD3-0004 GUCY2C-0098 Биспецифическое антитело против CD3-GUCY2c Биспецифическое антитело против CD3 CD3-0004 GUCY2C-0104 Биспецифическое антитело против CD3-GUCY2c Биспецифическое антитело против CD3 CD3-0004 GUCY2C-0105 Биспецифическое антитело против CD3-GUCY2c Биспецифическое антитело против CD3 CD3-0004 GUCY2C-0240 Биспецифическое антитело против CD3-GUCY2c Биспецифическое антитело против CD3 CD3-0004 GUCY2C-0315 Биспецифическое антитело против CD3-GUCY2c Биспецифическое антитело против CD3 CD3-0004 GUCY2C-0179 Биспецифическое антитело против CD3-GUCY2c Биспецифическое антитело против CD3 CD3-0004 GUCY2C-0193 Антитело против GUCY2c IgG Нет GUCY2C-0210 Антитело против GUCY2c IgG Нет GUCY2C-0212 Антитело против GUCY2c IgG Нет GUCY2C-0241 Антитело против GUCY2c IgG Нет GUCY2C-0247 Биспецифическое антитело против CD3-GUCY2c Биспецифическое антитело против CD3 CD3-0004 GUCY2C-1186 Биспецифическое антитело против CD3-GUCY2c Биспецифическое антитело против CD3 CD3-0006 GUCY2C-1467 Биспецифическое антитело против CD3-GUCY2c Биспецифическое антитело против CD3 CD3-0006 GUCY2C-1476 Биспецифическое антитело против CD3-GUCY2c Биспецифическое антитело против CD3 CD3-0006 GUCY2C-1478 Биспецифическое антитело против CD3-GUCY2c Биспецифическое антитело против CD3 CD3-0006 GUCY2C-1481 Биспецифическое антитело против CD3-GUCY2c Биспецифическое антитело против CD3 CD3-0006 GUCY2C-1512 Биспецифическое антитело против CD3-GUCY2c Биспецифическое антитело против CD3 CD3-0006 GUCY2C-1518 Биспецифическое антитело против CD3-GUCY2c Биспецифическое антитело против CD3 CD3-0006 GUCY2C-1526 Биспецифическое антитело против CD3-GUCY2c Биспецифическое антитело против CD3 CD3-0006 GUCY2C-1527 Биспецифическое антитело против CD3-GUCY2c Биспецифическое антитело против CD3 CD3-0006 GUCY2C-1538 Биспецифическое антитело против CD3-GUCY2c Биспецифическое антитело против CD3 CD3-0006 GUCY2C-1554 Биспецифическое антитело против CD3-GUCY2c Биспецифическое антитело против CD3 CD3-0006 GUCY2C-1555 Биспецифическое антитело против CD3-GUCY2c Биспецифическое антитело против CD3 CD3-0006 GUCY2C-1556 Биспецифическое антитело против CD3-GUCY2c Биспецифическое антитело против CD3 CD3-0006 GUCY2C-1557 Биспецифическое антитело против CD3-GUCY2c Биспецифическое антитело против CD3 CD3-0006 GUCY2C-1590 Биспецифическое антитело против CD3-GUCY2c Биспецифическое антитело против CD3 CD3-0006 GUCY2C-1591 Биспецифическое антитело против CD3-GUCY2c Биспецифическое антитело против CD3 CD3-0006 GUCY2C-1592 Биспецифическое антитело против CD3-GUCY2c Биспецифическое антитело против CD3 CD3-0006 GUCY2C-1608 Биспецифическое антитело против CD3-GUCY2c Биспецифическое антитело против CD3 CD3-0006 huIGHV3-7 VH иммуноглобулина зародышевой линии человека VH Н/о huIGKV1-39 VL иммуноглобулина зародышевой линии человека VL Н/о GUCY2C-0405 слитый белок scFv-Fc против GUCY2c Слитый белок scFv-Fc Н/о GUCY2C-0486 Антитело против GUCY2c IgG Н/о GUCY2C-1640 Антитело против GUCY2c IgG Н/о GUCY2C-0250 Биспецифическое антитело против CD3-GUCY2c Биспецифическое антитело против CD3 CD3-0001 GUCY2C-1678 Биспецифическое антитело против CD3-GUCY2c Биспецифическое антитело против CD3 2B5-1038 GUCY2C-1679 Биспецифическое антитело против CD3-GUCY2c Биспецифическое антитело против CD3 2B5-1039 GUCY2C-1680 Биспецифическое антитело против CD3-GUCY2c Биспецифическое антитело против CD3 2B5-1040

Некоторые из антител против CD3, представленных в настоящем описании, можно обозначать несколькими названиями. Например, CD3-0001 можно обозначать как 2B5v1 или h2B5v1; CD3-0004 можно обозначать как 2B4 или h2B4; и CD3-0006 можно обозначать как 2B5v6 или h2B5v6.

Некоторые из антител против CD3, представленных в настоящем описании, включают, в качестве неограничивающих примеров, варианты CD3-0006 (также обозначаемые как 2B5v6 или h2B5v6). Например, варианты CD3-0006 включают, в качестве неограничивающих примеров, 2B5-1038, 2B5-1039 и 2B5-1040.

Аффинность связывания (K_D) антитела, представленного в настоящем описании, к GUCY2c (такой как GUCY2c человека (например, SEQ ID NO: 224, 230 или 232)) или CD3 (SEQ ID NO: 242) может составлять от приблизительно 0,001 нМ до приблизительно 6500 нМ. В некоторых вариантах осуществления аффинность связывания составляет приблизительно 6500 нМ, 6000 нМ, 5500 нМ, 4500 нМ, 4000 нМ, 3500 нМ, 3000 нМ, 2500 нМ, 2000 нМ, 1500 нМ, 1000 нМ, 750 нМ, 500 нМ, 400 нМ, 300 нМ, 250 нМ, 200 нМ, 150 нМ, 100 нМ, 75 нМ, 50 нМ, 45 нМ, 40 нМ, 35 нМ, 30 нМ, 25 нМ, 20 нМ, 19 нМ, 17 нМ, 16 нМ, 15 нМ, 10 нМ, 8 нМ, 7,5 нМ, 7 нМ, 6,5 нМ, 6 нМ, 5,5 нМ, 5 нМ, 4 нМ, 3 нМ, 2 нМ, 1 нМ, 0,5 нМ, 0,3 нМ, 0,1 нМ, 0,01 нМ, 0,002 нМ или 0,001 нМ. В некоторых вариантах осуществления аффинность связывания составляет менее приблизительно 6500 нМ, 6000 нМ, 5500 нМ, 5000 нМ, 4000 нМ, 3000 нМ, 2000 нМ, 1000 нМ, 900 нМ, 800 нМ, 500 нМ, 250 нМ, 200 нМ, 100 нМ, 50 нМ, 30 нМ, 20 нМ, 10 нМ, 7,5 нМ, 7 нМ, 6,5 нМ, 6 нМ, 5 нМ, 4,5 нМ, 4 нМ, 3,5 нМ, 3 нМ, 2,5 нМ, 2 нМ, 1,5 нМ, 1 нМ, 0,5 нМ, 0,1 нМ, 0,05 нМ, 0,01 нМ или менее. В некоторых вариантах осуществления антитело имеет K_D от приблизительно 80 до приблизительно 200 пМ, предпочтительно - от приблизительно от 100 до приблизительно 150 пМ.

В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к антителу, связывающемуся с GUCY2c и/или CD3 и конкурирующему с антителом, представленным в настоящем описании, включая: CD3-0001, CD3-0004, CD3-0006, GUCY2C-0074, GUCY2C-0077, GUCY2C-0078, GUCY2C-0098, GUCY2C-0104, GUCY2C-0105, GUCY2C-0240, GUCY2C-0315, GUCY2C-0179, GUCY2C-0193, GUCY2C-0210, GUCY2C-0212, GUCY2C-0241, GUCY2C-0247, GUCY2C-1186, GUCY2C-1467, GUCY2C-1478, GUCY2C-1481, GUCY2C-1512, GUCY2C-1518, GUCY2C-1526, GUCY2C-1527, GUCY2C-1538, GUCY2C-1554, GUCY2C-1555, GUCY2C-1556, GUCY2C-1557, GUCY2C-1590, GUCY2C-1591, GUCY2C-1592, GUCY2C-1608, huIGHV3-7, huIGKV1-39, GUCY2C-0405, GUCY2C-0486, GUCY2C-1640, GUCY2C-0250, GUCY2C-1678, GUCY2C-1679 и GUCY2C-1680 (таблица 5).

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к антителу, имеющему любую из последовательностей каркасной области, приведенных в таблице 6. В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к антителу, представленному в настоящем описании, дополнительно содержащему человеческий или гуманизированный каркас VH и человеческий или гуманизированный каркас VL. В некоторых таких вариантах осуществления каркас VH содержит последовательность SEQ ID NO: 5, 6, 7, 8, 15, 16, 17, 18, 23, 24, 25, 30, 31, 32, 37, 38, 39, 40, 45, 46, 47, 49, 50, 51, 54, 55, 56, 58, 59, 61 или 63; и/или каркас VL содержит последовательность SEQ ID NO: 80, 81, 82, 83, 86, 87, 88, 89, 96, 97, 98, 99, 103, 110, 111, 116, 117, 118, 122, 123, 124, 126, 127, 128, 130, 131, 132, 133, 135, 139 или 155.

Таблица 6

Описание каркасной области Последовательность CD3-0001_VH FW_H1 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS (SEQ ID NO: 5) CD3-0001_VH FW_H2 WVRQAPGKGLEWVA (SEQ ID NO: 6) CD3-0001_VH FW_H3 RFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR (SEQ ID NO: 7) CD3-0001_VH FW_H4 WGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 8) GUCY2C-0074_VH FW_H1 EVQLQQSGAELARPGASVNLSCKAS (SEQ ID NO: 15) GUCY2C-0074_VH FW_H2 WVKQRPGQGLEWIG (SEQ ID NO: 16) GUCY2C-0074_VH FW_H3 KATLTADKSSSTAYMQLSSLASEDSAVYYCVR (SEQ ID NO: 17) GUCY2C-0074_VH FW_H4 WGQGTSVTVSS (SEQ ID NO: 18) GUCY2C-0077_VH FW_H1 EVQLQQSGAELARPGASVKLSCKAS (SEQ ID NO: 23) GUCY2C-0077_VH FW_H2 WIKQRPGQGLEWIG (SEQ ID NO: 24) GUCY2C-0077_VH FW_H3 KATLTADKSSNTAYMQLSSLASEDSAVYYCAR (SEQ ID NO: 25) GUCY2C-0098_VH FW_H1 QVQLQQPGAELVKPGASVKLSCKAS (SEQ ID NO: 30) GUCY2C-0098_VH FW_H3 KATLTVDKSATTAYMQLSSLTAEDSAVYYCTR (SEQ ID NO: 31) GUCY2C-0098_VH FW_H4 WGAGTTVTVSS (SEQ ID NO: 32) GUCY2C-0104_VH FW_H1 EVQLQQSGAELVKPGASVKLSCTAS (SEQ ID NO: 37) GUCY2C-0104_VH FW_H2 WVKQRPEQGLEWIG (SEQ ID NO: 38) GUCY2C-0104_VH FW_H3 KATITADTSSNTAYLQLSSLTSEDTAVFYCSS (SEQ ID NO: 39) GUCY2C-0104_VH FW_H4 WGQGTTLTVSS (SEQ ID NO: 40) GUCY2C-0105_VH FW_H1 EVQLQQSGPELVKPGASVKISCKAS (SEQ ID NO: 45) GUCY2C-0105_VH FW_H2 WVKQSHGKSLEWIG (SEQ ID NO: 46) GUCY2C-0105_VH FW_H3 KATLTVDKSSSTAYMHLNSLTSEDSAVYYCAR (SEQ ID NO: 47) GUCY2C-0240_VH FW_H2 WVRQAPGKGLEWIG (SEQ ID NO: 49) GUCY2C-0240_VH FW_H3 RFTISADKAKNSAYLQMNSLRAEDTAVYYCVR (SEQ ID NO: 50) GUCY2C-0240_VH FW_H4 WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 51) GUCY2C-0315_VH FW_H1 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKAS (SEQ ID NO: 54) GUCY2C-0315_VH FW_H2 WVRQAPGQGLEWIG (SEQ ID NO: 55) GUCY2C-0315_VH FW_H3 RVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCVR (SEQ ID NO: 56) GUCY2C-0179_VH FW_H3 RFTISVDKAKNSAYLQMNSLRAEDTAVYYCAR (SEQ ID NO: 58) GUCY2C-0179_VH FW_H4 WGQGTMVTVSS (SEQ ID NO: 59) GUCY2C-0193_VH FW_H3 RFTISVDKAKNSAYLQMNSLRAEDTAVYYCTR (SEQ ID NO: 61) GUCY2C-0210_VH FW_H2 WVRQAPGKGLEWIA (SEQ ID NO: 63) CD3-0001_VL FW_L1 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (SEQ ID NO: 80) CD3-0001_VL FW_L2 WYQQKPGKAPKLLIY (SEQ ID NO: 81) CD3-0001_VL FW_L3 GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC (SEQ ID NO: 82) CD3-0001_VL FW_L4 FGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 83) CD3-0004_VL FW_L1 DIVMTQSPDSLAVSLGERATINC (SEQ ID NO: 86) CD3-0004_VL FW_L2 WYQQKPGQPPKLLIS (SEQ ID NO: 87) CD3-0004_VL FW_L3 GVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYC (SEQ ID NO: 88) CD3-0004_VL FW_L4 FGSGTKLEIK (SEQ ID NO: 89) GUCY2C-0074_VL FW_L1 DIVLTQSPASLAVSLGQRATISC (SEQ ID NO: 96) GUCY2C-0074_VL FW_L2 WFQQKPGQPPKLLIY (SEQ ID NO: 97) GUCY2C-0074_VL FW_L3 GVPARFSGSGSGTDFSLNIHPLEEDDTAMFFC (SEQ ID NO: 98) GUCY2C-0074_VL FW_L4 FGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 99) GUCY2C-0077_VL FW_L3 GVPARFSGSGSGTDFSLNIHPMEEDDTAMYFC (SEQ ID NO: 103) GUCY2C-0098_VL FW_L2 WYQQKPGQPPKLLIY (SEQ ID NO: 110) GUCY2C-0098_VL FW_L3 GVPARFSGSGSGTDFSLNIHPVEEDDIAMYFC (SEQ ID NO: 111) GUCY2C-0104_VL FW_L1 DIVMTQSPASLAVSLGQRATISC (SEQ ID NO: 116) GUCY2C-0104_VL FW_L3 GVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYC (SEQ ID NO: 117) GUCY2C-0104_VL FW_L4 FGAGTKLELK (SEQ ID NO: 118) GUCY2C-0105_VL FW_L1 DIVMTQSPSSLAVSVGEKVTVSC (SEQ ID NO: 122) GUCY2C-0105_VL FW_L2 WYQQRPGQSPKLLIY (SEQ ID NO: 123) GUCY2C-0105_VL FW_L3 GVPDRFTGSGSGTDFTLSISSVKAEDLAVYYC (SEQ ID NO: 124) GUCY2C-0240_VL FW_L1 DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITC (SEQ ID NO: 126) GUCY2C-0240_VL FW_L2 WFQQKPGKAPKLLIY (SEQ ID NO: 127) GUCY2C-0240_VL FW_L4 FGQGTKLEIK (SEQ ID NO: 128) GUCY2C-0315_VL FW_L1 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSC (SEQ ID NO: 130) GUCY2C-0315_VL FW_L2 WYQQKPGQAPRLLIY (SEQ ID NO: 131) GUCY2C-0315_VL FW_L3 GIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYC (SEQ ID NO: 132) GUCY2C-0315_VL FW_L4 FGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 133) GUCY2C-0179_VL FW_L2 WYQQKPGKSPKLLIY (SEQ ID NO: 135) GUCY2C-0247_VL FW_L2 WYQQKPGKPPKLLIYm (SEQ ID NO: 139) GUCY2C-1512_VL FW_L4 FGQGTKLKIK (SEQ ID NO: 155)

В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к антителу, где область VH содержит последовательность SEQ ID NO: 73 или ее вариант с одной или несколькими консервативными аминокислотными заменами в остатках, не находящихся в области CDR; и/или где область VL содержит последовательность SEQ ID NO: 147 или ее вариант с одной или несколькими консервативными аминокислотными заменами в аминокислотах, не находящихся в области CDR.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к биспецифическому антителу, специфически связывающемуся с GUCY2c и CD3, где биспецифическое антитело содержит первую полипептидную цепь и вторую полипептидную цепь. В одном из вариантов осуществления первая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность, приведенную в одной или более из SEQ ID NO: 216 и 220. В другом варианте осуществления вторая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность, приведенную в одной или более из SEQ ID NO: 216 и 220. В предпочтительном варианте осуществления первая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 216; и вторая полипептидная цепь содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 220. В некоторых таких вариантах осуществления биспецифическое антитело может специфически связываться с эпитопом GUCY2c и эпитопом CD3 и содержит первую полипептидную цепь и вторую полипептидную цепь, где первая полипептидная цепь содержит последовательность SEQ ID NO: 216, и вторая полипептидная цепь содержит последовательность SEQ ID NO: 220. В одном из вариантов осуществления вторая полипептидная цепь является любым полипептидом, подвергаемым связыванию с первой полипептидной цепью через область контакта.

В одном таком варианте осуществления настоящее изобретение относится к биспецифическому антителу, где: (a) первая полипептидная цепь содержит в направлении от N-конца к C-концу: (i) домен 1, содержащий VL антитела против GUCY2c (VL против GUCY2c) и VH антитела против CD3 (VH против CD3), и (ii) первый способствующий гетеродимеризации домен; и (b) вторая полипептидная цепь содержит в направлении от N-конца к C-концу: (i) домен 2, содержащий VL антитела против CD3 (VL против CD3) и VH антитела против GUCY2c (VH против GUCY2c), и (ii) второй способствующий гетеродимеризации домен; где VL против GUCY2c и VH против GUCY2c образуют домен, специфически связывающийся с GUCY2c; и VL против CD3 и VH против CD3 образуют домен, специфически связывающийся с CD3.

В другом таком варианте осуществления (a) первая полипептидная цепь содержит в направлении от N-конца к C-концу: (i) домен 1, содержащий VL против CD3 и VH против GUCY2c, и (ii) первый способствующий гетеродимеризации домен; и (b) вторая полипептидная цепь содержит в направлении от N-конца к C-концу: (i) домен 2, содержащий VL против GUCY2c и VH против CD3, и (ii) второй способствующий гетеродимеризации домен; где VL против GUCY2c и VH против GUCY2c образуют домен, специфически связывающийся с GUCY2c; и VL против CD3 и VH против CD3 образуют домен, специфически связывающийся с CD3.

В другом таком варианте осуществления (a) первая полипептидная цепь содержит в направлении от N-конца к C-концу: (i) домен 1, содержащий VH против GUCY2c и VL против CD3, и (ii) первый способствующий гетеродимеризации домен; и (b) вторая полипептидная цепь содержит в направлении от N-конца к C-концу: (i) домен 2, содержащий VH против CD3 и VL против GUCY2c, и (ii) второй способствующий гетеродимеризации домен; где VH против GUCY2c и VL против GUCY2c образуют домен, специфически связывающийся с GUCY2c; и VH против CD3 и VL против CD3 образуют домен, специфически связывающийся с CD3.

В дополнительном варианте осуществления (a) первая полипептидная цепь содержит в направлении от N-конца к C-концу: (i) домен 1, содержащий VH против CD3 и VL против GUCY2c, и (ii) первый способствующий гетеродимеризации домен; и (b) вторая полипептидная цепь содержит в направлении от N-конца к C-концу: (i) домен 2, содержащий VH против GUCY2c и VL против CD3, и (ii) второй способствующий гетеродимеризации домен, где VL против GUCY2c и VH против GUCY2c образуют домен, специфически связывающийся с GUCY2c; и VL против CD3 и VH против CD3 образуют домен, специфически связывающийся с CD3.

Изобретение также относится к выделенным полинуклеотидам, кодирующим антитела по изобретению, и векторам и клеткам-хозяевам, содержащим полинуклеотиды. В одном из аспектов полинуклеотид содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую вариабельные области тяжелой цепи, вариабельные области легкой цепи, области CDR, каркасные области, Fc-цепи с выступами и впадинами, первые полипептидные цепи и вторые полипептидные цепи, приведенные в таблицах 1-7 и 38. В некоторых вариантах осуществления полинуклеотид содержит последовательность, кодирующую любое из антител CD3-0001, CD3-0004, CD3-0006, GUCY2C-0074, GUCY2C-0077, GUCY2C-0078, GUCY2C-0098, GUCY2C-0104, GUCY2C-0105, GUCY2C-0240, GUCY2C-0315, GUCY2C-0179, GUCY2C-0193, GUCY2C-0210, GUCY2C-0212, GUCY2C-0241, GUCY2C-0247, GUCY2C-1186, GUCY2C-1467, GUCY2C-1478, GUCY2C-1481, GUCY2C-1512, GUCY2C-1518, GUCY2C-1526, GUCY2C-1527, GUCY2C-1538, GUCY2C-1554, GUCY2C-1555, GUCY2C-1556, GUCY2C-1557, GUCY2C-1590, GUCY2C-1591, GUCY2C-1592, GUCY2C-1608, huIGHV3-7, huIGKV1-39, GUCY2C-0405, GUCY2C-0486, GUCY2C-1640, GUCY2C-0250, GUCY2C-1678, GUCY2C-1679 или GUCY2C-1680.

Последовательность, кодирующую интересующее антитело, можно поддерживать в векторе в клетке-хозяине, а затем клетку-хозяина можно выращивать и замораживать для дальнейшего использования. Векторы (включая экспрессирующие векторы) и клетки-хозяева дополнительно представлены в настоящем описании.

Изобретение также относится к слитым белкам, содержащим один или более фрагментов или областей из антител по настоящему изобретению. В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к слитому полипептиду, содержащему по меньшей мере 10 смежных аминокислот из вариабельной области легкой цепи, приведенной в SEQ ID NO: 76, 84, 90, 92, 100, 104, 106, 112, 119, 125, 129, 134, 136, 137, 138, 140, 143, 145, 147, 150, 152, 156, 158, 160, 162, 166, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 274, 275 или 276; и/или по меньшей мере 10 смежных аминокислот из вариабельной области тяжелой цепи, приведенной в SEQ ID NO: 1, 9, 11, 19, 26, 33, 41, 48, 52, 57, 60, 62, 64, 65, 67, 69, 71, 73 или 273. В других вариантах осуществления настоящее изобретение относится к слитому полипептиду, содержащему по меньшей мере приблизительно 10, по меньшей мере приблизительно 15, по меньшей мере приблизительно 20, по меньшей мере приблизительно 25 или по меньшей мере приблизительно 30 смежных аминокислот из вариабельной области легкой цепи и/или по меньшей мере приблизительно 10, по меньшей мере приблизительно 15, по меньшей мере приблизительно 20, по меньшей мере приблизительно 25 или по меньшей мере приблизительно 30 смежных аминокислот из вариабельной области тяжелой цепи. В другом варианте осуществления слитый полипептид содержит вариабельную область легкой цепи и/или вариабельную область тяжелой цепи, приведенные в любой из пар последовательностей, выбранных из SEQ ID NO: 73 и 147;69 и 147; 60 и 138; 48 и 125; или 26 и 106. В другом варианте осуществления слитый полипептид содержит одну или более CDR. В других вариантах осуществления слитый полипептид содержит CDR H3 (CDR3 VH) и/или CDR L3 (CDR3 VL). В целях по настоящему изобретению слитый белок содержит одно или более антител и другую аминокислотную последовательность, к которой оно не присоединено в нативной молекуле, например, гетерологичную последовательность или гомологичную последовательность из другой области. Неограничивающие примеры гетерологичных последовательностей включают метку, такую как метка FLAG или метка 6His. Метки хорошо известны в этой области. Слитый полипептид можно получать известными в этой области способами, например, синтетически или рекомбинантно. Как правило, слитые белки по настоящему изобретению получают, получая экспрессирующий полинуклеотид, кодирующий их, рекомбинантными способами, представленными в настоящем описании, хотя их также можно получать другими способами, известными в этой области, включая, например, химический синтез.

Изобретение также относится к scFv антител по настоящему изобретению. Одноцепочечные фрагменты вариабельной области получают посредством связывания вариабельных областей легкой и/или тяжелой цепи с использованием короткого соединительного пептида (Bird et al., Science 242:423-426, 1988). Примером соединительного пептида является GGGGSGGGGSGGGGSG (SEQ ID NO: 193), служащего мостиком длиной приблизительно 3,5 нм между карбокси-концом одной вариабельной области и амино-концом другой вариабельной области. Можно конструировать и использовать линкеры с другими последовательностями (Bird et al., Science 242:423-426, 1988). Линкеры должны быть короткими, гибкими полипептидами и, предпочтительно, содержат менее приблизительно 20 аминокислотных остатков. В свою очередь, линкеры можно модифицировать для дополнительных функций, таких как присоединение лекарственных средств или прикрепление к твердым подложкам. Одноцепочечные варианты можно получать рекомбинантно или синтетически. Для синтетического получения scFv можно использовать автоматический синтезатор. Для рекомбинантного получения scFv подходящую плазмиду, содержащую полинуклеотид, кодирующий scFv, можно встраивать в подходящую клетку-хозяина, эукариотическую, такую как дрожжевые клетки, растительные клетки, клетки насекомых или клетки млекопитающих, или прокариотическую, такую как E. coli. Полинуклеотиды, кодирующие интересующие scFv, можно получать общепринятыми способами, такими как лигирование полинуклеотидов. Полученный scFv можно выделять стандартными способами очистки белков, известными в этой области.

Также предусмотрены другие формы одноцепочечных антител, такие как диатела или минитела. Диатела являются бивалентными, биспецифическими антителами, в которых вариабельные области тяжелой цепи (VH) и вариабельные области легкой цепи (VL) экспрессируются на одной полипептидной цепи, но с использованием линкера, слишком короткого для спаривания между двумя доменами на одной цепи, что, таким образом, заставляет домены спариваться с комплементарными доменами другой цепи и приводит к образованию двух антигенсвязывающих участков (см. например, Holliger, P., et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA 90:6444-6448, 1993; Poljak, R. J., et al., Structure 2:1121-1123, 1994). Минитело включает области VL и VH нативного антитела, слитые с шарнирной областью и домена CH3 молекулы иммуноглобулина. См., например, патент США № 5837821.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к композициям (таким как фармацевтические композиции), содержащим любые из полинуклеотидов по изобретению. В некоторых вариантах осуществления композиция содержит экспрессирующий вектор, содержащий полинуклеотид, кодирующий любые из антител, представленных в настоящем описании. В других вариантах осуществления композиция содержит любой или оба из полинуклеотидов, приведенных в SEQ ID NO: 246 (кодирующей первую полипептидную цепь GUCY2C-1608) и SEQ ID NO: 247 (кодирующей вторую полипептидную цепь GUCY2C-1608). Экспрессирующие векторы и введение композиций полинуклеотидов представлены в настоящем описании далее.

Полинуклеотиды, комплементарные любым таким последовательностям, также включены в настоящее изобретение. Полинуклеотиды могут являться одноцепочечными (кодирующими или антисмысловыми) или двухцепочечными и могут представлять собой молекулы ДНК (геномной, кДНК или синтетической) или РНК. Молекулы РНК включают зрелую и незрелую мРНК, такую как предшественник мРНК (пре-мРНК) или гетерогенные ядерные мРНК (hnRNA) и зрелые мРНК. Дополнительные кодирующие или некодирующие последовательности, необязательно, могут присутствовать в полинуклеотиде по настоящему изобретению, и полинуклеотид, необязательно, можно связывать с другими молекулами и/или материалами подложек.

Полинуклеотиды могут содержать нативную последовательность (т.е. эндогенную последовательность, кодирующую антитело или его часть) или вариант такой последовательности. Варианты полинуклеотидов содержат одну или более замен, добавлений, делеций и/или инсерций таким образом, что иммунореактивность кодируемого полипептида не снижается относительно нативной иммунореактивной молекулы. Эффект в отношении иммунореактивности кодируемого полипептида, как правило, можно оценивать, как представлено в настоящем описании. Предпочтительно, варианты демонстрируют по меньшей мере приблизительно 70% идентичности, более предпочтительно - по меньшей мере приблизительно 80% идентичности, еще более предпочтительно - по меньшей мере приблизительно 90% идентичности, и наиболее предпочтительно - по меньшей мере приблизительно 95% идентичности в отношении полинуклеотидной последовательности, кодирующей нативное антитело или его часть.

Указывают, что две полинуклеотидные или полипептидные последовательности являются "идентичными", если последовательность нуклеотидов или аминокислот в двух последовательностях является одинаковой при выравнивании для максимального соответствия, как описано ниже. Сравнение двух последовательностей, как правило, осуществляют посредством сравнения последовательностей в окне сравнения для идентификации и сравнения локальных областей сходства последовательностей. В рамках изобретения термин "окно сравнения" относится к сегменту из по меньшей мере приблизительно 20 смежных положений, как правило, от 30 до приблизительно 75 или от 40 до приблизительно 50, в которых последовательность можно сравнивать с референсной последовательностью с таким же количеством смежных положений после оптимального выравнивания двух последовательностей.

Оптимальное выравнивание последовательностей для сравнения можно осуществлять с использованием программы Megalign в пакете биоинформатического программного обеспечения Lasergene (DNASTAR, Inc., Madison, WI) с использованием параметров по умолчанию. Предпочтительно, "процент идентичности последовательности" определяют посредством сравнения двух оптимально выровненных последовательностей в окне сравнения из по меньшей мере 20 положений, где часть полинуклеотидной или полипептидной последовательности в окне сравнения может содержать добавления или делеции (т.е. пропуски) 20 процентов или менее, как правило, от 5 до 15 процентов или от 10 до 12 процентов, по сравнению с референсными последовательностями (несодержащими добавления или делеции) для оптимального выравнивания двух последовательностей. Процент вычисляют посредством определения количества положений, в которых встречаются идентичные основания нуклеиновой кислоты или аминокислотные остатки в обеих последовательностях для получения количества совпавших положений, разделяя количество совпавших положений на общее количество положений в референсной последовательности (т.е. размер окна) и умножая результат на 100 для получения процента идентичности последовательности.

Варианты, дополнительно или альтернативно, могут являться, по существу, гомологичными нативному гену или его части или комплементарной последовательности. Такие варианты полинуклеотидов могут гибридизоваться в умеренно строгих условиях с природной последовательностью ДНК, кодирующей нативное антитело (или комплементарную последовательность).

Специалистам в этой области следует понимать, что в результате вырожденности генетического кода существует множество нуклеотидных последовательностей, кодирующих полипептид, представленный в настоящем описании. Некоторые из этих полинуклеотидов имеют минимальную гомологию по отношению к нуклеотидной последовательности любого нативного гена. Несмотря на это, полинуклеотиды, варьирующиеся из-за различий в использовании кодонов, конкретно включены в настоящее изобретение. Кроме того, аллели генов, содержащие полинуклеотидные последовательности, представленные в настоящем описании, входят в объем настоящего изобретения. Аллели представляю собой эндогенные гены, измененные в результате одной или более мутаций, таких как делеции, добавления и/или замены нуклеотидов. Образующиеся мРНК и белок, необязательно, могут иметь измененную структуру или функцию. Аллели можно идентифицировать стандартными способами (такими как гибридизация, амплификация и/или сравнение последовательностей из баз данных).

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к способу получения любых из полинуклеотидов, представленных в настоящем описании. Например, полинуклеотиды по настоящему изобретению можно получать с использованием химического синтеза, рекомбинантных способов или ПЦР. Способы химического синтеза полинуклеотидов хорошо известны в этой области и не требуют подробного обсуждения в настоящем описании. Специалист в этой области может использовать последовательности, представленные в настоящем описании, и коммерческий синтезатор ДНК для получения желаемой последовательности ДНК.

Для получения полинуклеотидов рекомбинантными способами полинуклеотид, содержащий желаемую последовательность, можно встраивать в подходящий вектор и вектор, в свою очередь, можно встраивать в подходящую клетку-хозяина для репликации и амплификации, как представлено в настоящем описании. Полинуклеотиды можно встраивать в клетки-хозяева любыми способами, известными в этой области. Клетки трансформируют посредством встраивания экзогенного полинуклеотида посредством прямого захвата, эндоцитоза, трансфекции, F-скрещивания или электропорации. После встраивания экзогенный полинуклеотид можно поддерживать в клетке в виде неинтегрированного вектора (такого как плазмида) или интегрировать в геном клетки-хозяина. Амплифицированный таким образом полинуклеотид можно выделять из клетки-хозяина способами, хорошо известными в этой области (например, Sambrook et al., 1989).

Альтернативно, ПЦР позволяет воспроизводить последовательности ДНК. Технология ПЦР хорошо известна в этой области и описана в патентах США №№ 4683195, 4800159, 4754065 и 4683202, а также PCR: Polymerase Chain Reaction, Mullis et al. eds., Birkauswer Press, Boston, 1994.

РНК можно получать с использованием выделенной ДНК в подходящем векторе, встраивая его в подходящую клетку-хозяина. Когда клетка делится, и ДНК транскрибируется в РНК, РНК можно выделять способами, хорошо известными специалистам в этой области и описанными, например, в Sambrook et al., 1989, выше.

Подходящие клонирующие векторы можно конструировать стандартными способами или можно выбирать из большого количества клонирующих векторов, доступных в этой области. Хотя выбранный клонирующий вектор может варьироваться в зависимости от используемой клетки-хозяина, клонирующие векторы, которые можно использовать, как правило, будут обладать способностью к саморепликации, могут иметь одну мишень для конкретной эндонуклеазы рестрикции и/или могут нести гены для маркера, который можно использовать в селекции клонов, содержащих вектор. Подходящие примеры включают плазмиды и бактериальные вирусы, например, pUC18, pUC19, Bluescript (например, pBS SK+) и их производные, mp18, mp19, pBR322, pMB9, ColE1, pCR1, RP4, фаговую ДНК и челночные векторы, такие как pSA3 и pAT28. Эти и многие другие клонирующие векторы доступны в коммерческих источниках, таких как BioRad, Strategene и Invitrogen.

Экспрессирующие векторы, как правило, являются реплицируемыми полинуклеотидными конструкциями, содержащими полинуклеотид по изобретению. Следует понимать, что экспрессирующий вектор должен реплицироваться в клетках-хозяевах в виде эписом или интегральной части хромосомной ДНК. Подходящие экспрессирующие векторы включают, в качестве неограничивающих примеров, плазмиды, вирусные векторы, включая аденовирусы, аденоассоциированные вирусы, ретровирусы, космиды, и экспрессирующие векторы, описанные в публикации PCT № WO87/04462. Компоненты вектора, как правило, могут включать в качестве неограничивающих примеров, одно или более из следующего: сигнальную последовательность; участок начала репликации; один или более маркерных генов; подходящие элементы контроля транскрипции (такие как промоторы, энхансеры и терминатор). Для экспрессии (т.е. трансляции), как правило, также необходим один или более элементов контроля трансляции, такие как участки связывания рибосомы, участки инициации трансляции и стоп-кодоны.

Векторы, содержащие интересующие полинуклеотиды, можно встраивать в клетку-хозяина любым из ряда подходящих способов, включая электропорацию, трансфекцию с использованием хлорида кальция, хлорида рубидия, фосфата кальция, DEAE-декстрана или других веществ; бомбардировку микрочастицами; липофекцию и инфекцию (например, если вектор является возбудителем инфекции, таким как вирус осповакцины). Выбор встраиваемых векторов или полинуклеотидов зачастую будет зависеть от признаков клетки-хозяина.

Для выделения генов, кодирующих интересующее антитело, полипептид или белок, можно использовать любые клетки-хозяева, способные гиперэкспрессировать гетерологичную ДНК. Неограничивающие примеры клеток-хозяев млекопитающего включают клетки COS, HeLa и CHO. Также см. публикацию PCT № WO87/04462. Подходящие клетки-хозяева, не принадлежащие млекопитающим, включают прокариот (таких как E. coli или B. subtillis) и дрожжей (таких как S. cerevisae, S. pombe или K. lactis). Предпочтительно, клетки-хозяева экспрессируют кДНК на уровне приблизительно в 5 раз выше, более предпочтительно - в 10 раз выше, даже более предпочтительно - в 20 раз выше, чем у соответствующего эндогенного антитела, или белка GUCY2c, или домена GUCY2c (например, доменов 1-4), что определяют посредством иммунологического анализа или FACS. Можно идентифицировать клетку, гиперэкспрессирующую интересующее антитело или белок.

В одном из аспектов молекула антитела против GUCY2c будет иметь аффинность к GUCY2c, например, что измеряют посредством прямых анализов связывания или конкурентных анализов связывания в диапазоне аффинности от пикомоль до микромоль, предпочтительно - в диапазоне от пикомоль до низких наномолярных значений.

Биспецифические антитела можно получать с использованием антител, представленных в настоящем описании. Способы получения биспецифических антител известны в этой области (см., например, Suresh et al., Methods in Enzymology 121:210, 1986). Общепринято, рекомбинантная продукция биспецифических антител основана на коэкспрессии двух пар тяжелая цепь-легкая цепь иммуноглобулина, при этом две тяжелые цепи имеют разные специфичности (Millstein and Cuello, Nature 305, 537-539, 1983).

В другом варианте осуществления биспецифическое антитело, представленное в настоящем описании, содержит полноразмерное антитело человека, где вариабельная область антитела из гетеродимерного белка может рекрутировать активность иммунной эффекторной клетки человека посредством специфического связывания с эффекторным антигеном (например, антигеном CD3), находящимся на иммунной эффекторной клетке человека, и где вторая вариабельная область антитела из гетеродимерного белка может специфически связываться с антигеном-мишенью. В некоторых вариантах осуществления антитело человека имеет изотип IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4. В некоторых вариантах осуществления гетеродимерный белок содержит иммунологически инертную Fc-цепь.

Иммунная эффекторная клетка человека может являться любой из множества иммунных эффекторных клеток, известных в этой области. Например, иммунная эффекторная клетка может являться членом лимфоидного ростка клеток человека, включая, в качестве неограничивающих примеров, T-клетку (например, цитотоксическую T-клетку), B-клетку и естественный киллер (NK). Иммунная эффекторная клетка также, в качестве неограничивающих примеров, может являться членом миелоидного ростка человека, включая, в качестве неограничивающих примеров, моноцит, нейтрофильный гранулоцит и дендритную клетку. Такие иммунные эффекторные клетки могут иметь цитотоксический или апоптотический эффект в отношении клетки-мишени или другой желаемый эффект после активации посредством связывания эффекторного антигена.

Эффекторный антиген является антигеном (например, белком или полипептидом), экспрессирующимся на иммунной эффекторной клетке человека. Неограничивающие примеры эффекторных антигенов, которые могут связываться с гетеродимерным белком (например, гетеродимерным антителом или биспецифическим антителом), включают CD3 человека (или комплекс CD3 (кластер дифференцировки)), CD16, NKG2D, NKp46, CD2, CD28, CD25, CD64 и CD89.

Клетка-мишень может являться клеткой, являющейся нативной или чужеродной для людей. В случае нативной клетки-мишени клетка может трансформироваться в злокачественную клетку или патологически модифицироваться (например, нативная клетка-мишень, инфицированная вирусом, плазмодием или бактерией). В случае чужеродной клетки-мишени клетка является инвазирующим патогеном, таким как бактерия, плазмодий или вирус.

Антиген-мишень экспрессируется на клетке-мишени в состоянии заболевания (например, воспалительного заболевания, пролиферативного заболевания (например, злокачественного новообразования), иммунологического нарушения, неврологического заболевания, нейродегенеративного заболевания, аутоиммунного заболевания, инфекционного заболевания (например, вирусной инфекции или паразитарной инфекции), аллергической реакции, реакции "трансплантат против хозяина" или реакции "хозяин против трансплантата"). Антиген-мишень не является эффекторным антигеном. Неограничивающие примеры антигенов-мишеней включают GUCY2c, BCMA, EpCAM (молекулу адгезии эпителиальных клеток), CCR5 (хемокиновый рецептор типа 5), CD19, HER (рецептор эпидермального фактора роста человека)-2/neu, HER-3, HER-4, EGFR (рецептор эпидермального фактора роста), PSMA, CEA, MUC-1 (муцин), MUC2, MUC3, MUC4, MUC5AC, MUC5B, MUC7, CIhCG, антиген Льюиса Y, CD20, CD33, CD30, ганглиозид GD3, 9-O-ацетил-GD3, GM2, Globo H, фукозил-GM1, поли-SA, GD2, карбоангидразу IX (MN/CA IX), CD44v6, Shh (Sonic Hedgehog), Wue-1, антиген плазматических клеток, (мембраносвязанный) IgE, MCSP (меланомный хондроитинсульфатный протеогликан), CCR8, предшественник ФНО-альфа, STEAP, мезотелин, антиген A33, PSCA (антиген стволовых клеток предстательной железы), Ly-6; десмоглеин 4, неоэпитоп E-кадгерин, фетальный ацетилхолиновый рецептор, CD25, маркер CA19-9, маркер CA-125 и рецептор MIS (ингибирующей мюллеровой субстанции) типа II, sTn (сиалированный антиген Tn; TAG-72), FAP (антиген активации фибробластов), эндосиалин, EGFRvIII, LG, SAS и CD63.

В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к биспецифическому антителу, где: (a) CDR1 VL против GUCY2c, CDR2 VL против GUCY2c и CDR3 VL против GUCY2c из VL против GUCY2c содержат последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 92, 100, 104, 106, 112, 119, 125, 129, 134, 136, 137, 138, 140, 143, 145, 147, 150, 152, 156, 158, 160, 162, 166, 170, 171, 172, 173, 174 или 175; (b) CDR1 VH против CD3, CDR2 VH против CD3 и CDR3 VH против CD3 из VH против CD3 содержат последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 1, 9 или 273; (c) CDR1 VL против CD3, CDR2 VL против CD3 и CDR3 VL против CD3 из VL против CD3 содержат последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 76, 84, 90 или 274, 275 или 276; и/или (d) CDR1 VH против GUCY2c, CDR2 VH против GUCY2c и CDR3 VH против GUCY2c из VH против GUCY2c содержат последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 11, 19, 26, 33, 41, 48, 52, 57, 60, 62, 64, 65, 67, 69, 71 или 73.

В конкретном варианте осуществления настоящее изобретение относится к биспецифическому антителу, где: (a) область VH против GUCY2c содержит последовательность SEQ ID NO: 73; и (b) область VL против GUCY2c содержит последовательность SEQ ID NO: 147.

В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к биспецифическому антителу, где: (a) CDR1 VL против GUCY2c содержит последовательность SEQ ID NO: 93, 101, 105, 107, 113, 120, 148, 153, 163 или 167; CDR2 VL против GUCY2c содержит последовательность SEQ ID NO: 78, 94, 102, 108, 114, 141, 144, 146, 149, 151, 157, 159, 161, 164 или 168; и CDR3 VL против GUCY2c содержит последовательность SEQ ID NO: 95, 109, 115, 121, 142, 154, 165 или 169; (b) CDR1 VH против CD3 содержит последовательность SEQ ID NO: 2, 268 или 277; CDR2 VH против CD3 содержит последовательность SEQ ID NO: 3, 10, 269 или 270; и CDR3 VH против CD3 содержит последовательность SEQ ID NO: 4; (c) CDR1 VL против CD3 содержит последовательность SEQ ID NO: 77, 85, 91, 278, 279 или 280; CDR2 VL против CD3 содержит последовательность SEQ ID NO: 78 или 281; и CDR3 VL против CD3 содержит последовательность SEQ ID NO: 79; и (d) CDR1 VH против GUCY2c содержит последовательность SEQ ID NO: 12, 20, 27, 34, 42, 74, 257, 258, 259, 260 или 261; CDR2 VH против GUCY2c содержит последовательность SEQ ID NO: 13, 21, 28, 35, 43, 53, 66, 68, 70, 72, 75, 262, 263, 264, 265, 266 или 267; и CDR3 VH против GUCY2c содержит последовательность SEQ ID NO: 14, 22, 29, 36 или 44.

В некоторых вариантах осуществления антитела, которые можно использовать в настоящем изобретении, являются моноклональными антителами, поликлональными антителами, фрагментами антител (например, Fab, Fab’, F(ab’)₂, Fv, Fc и т.д.), химерными антителами, биспецифическими антителами, гетероконъюгированными антителами, одноцепочечными антителами (ScFv), их мутантами, слитыми белками, содержащими антительную часть (например, доменное антитело), гуманизированными антителами и любой другой модифицированной конфигурацией молекулы иммуноглобулина, содержащей участок распознавания антигена с необходимой специфичностью, включая варианты гликозилирования антител, варианты аминокислотной последовательности антител и ковалентно модифицированные антитела. Антитела могут являться антителами мыши, крысы, человека или иметь любое другое происхождение (включая химерные или гуманизированные антитела).

В некоторых вариантах осуществления антитело против GUCY2c или CD3, представленное в настоящем описании, является моноклональным антителом. Например, антитело против GUCY2c или CD3 является гуманизированным моноклональным антителом или химерным моноклональным антителом.

Настоящее изобретение относится к биспецифическому антителу, содержащему Fc-цепь или -домен или его часть. В некоторых вариантах осуществления Fc-цепь или ее части содержат один или более константных доменов Fc-цепи IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4 (например, домен CH2 или CH3). В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к молекулам, содержащим Fc-цепь или ее часть, где Fc-цепь или ее часть содержит по меньшей мере одну аминокислотную модификацию (например, замену) относительно сравнимой Fc-цепи дикого типа или ее части. Варианты Fc-области хорошо известны в этой области, и их, главным образом, используют для изменения фенотипа антитела, содержащего вариант Fc-области, что оценивают посредством любого анализа связывающей активности или эффекторной функции, хорошо известных в этой области, например, ELISA, анализа SPR или ADCC. Такие варианты Fc-цепи или их части могут повышать период полувыведения из плазмы и стабильность, проявляемые биспецифическим антителом по изобретению, содержащим Fc-цепь или ее часть. В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к применению любого варианта Fc, известного в этой области.

В одном из вариантов осуществления осуществляют одну или более модификаций аминокислот Fc-цепи для снижения аффинности и авидности Fc-цепи и, таким образом, молекулы биспецифического антитела по изобретению к одному или более рецепторам FcγR. В конкретном варианте осуществления настоящее изобретение относится к биспецифическим антителам, содержащим вариант Fc-цепи или его часть, где вариант Fc-цепи содержит по меньшей мере одну аминокислотную модификацию относительно Fc-цепи дикого типа, где вариант Fc-области связывается только с одним FcγR, где FcγR является FcγRIIIA. В другом конкретном варианте осуществления настоящее изобретение относится к биспецифическим антителам, содержащим вариант Fc-цепи или его часть, где вариант Fc-цепи содержит по меньшей мере одну аминокислотную модификацию относительно Fc-цепи дикого типа, где вариант Fc-области связывается только с одним FcγR, где FcγR является FcγRIIA. В другом конкретном варианте осуществления настоящее изобретение относится к биспецифическим антителам, содержащим вариант Fc-цепи или его часть, где вариант Fc-цепи содержит по меньшей мере одну аминокислотную модификацию относительно Fc-цепи дикого типа, где вариант Fc-цепи связывается только с одним FcγR, где FcγR является FcγRIIB. В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к молекулам, содержащим вариант Fc-цепи, где вариант придает или опосредует сниженную активность ADCC (или другую эффекторную функцию) и/или повышенное связывание с FcγRIIB (CD32B) относительно молекулы, несодержащей Fc-цепь или содержащей Fc-цепь дикого типа, что измеряют способами, известными специалистам в этой области и представленным в настоящем описании.

Изобретение также относится к применению Fc-области, содержащей домены или области из двух или более изотипов IgG. Как известно в этой области, аминокислотная модификация Fc-области может значительно влиять на Fc-опосредованную эффекторную функцию и/или связывающую активность. Однако эти изменения функциональных характеристик можно дополнительно улучшать и/или дорабатывать при воплощении в контексте выбранных изотипов IgG. Аналогично, на нативные характеристики изотипа Fc можно воздействовать посредством одной или более аминокислотных модификаций. Множество изотипов IgG (т.е. IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4) демонстрируют разные физические и функциональные свойства, включая время полужизни в сыворотке, фиксацию комплемента, аффинности связывания FcγR и активности эффекторных функций (например, ADCC, CDC) из-за различий аминокислотных последовательностей шарнирных областей и/или Fc-областей.

В одном из вариантов осуществления аминокислотную модификацию и Fc-области IgG независимо выбирают на основе их соответствующих отдельных активностей связывающей функции и/или эффекторной функции для конструирования биспецифического антитела с желаемыми характеристиками. В конкретном варианте осуществления аминокислотные модификации и шарнирные области/Fc-области IgG раздельно анализируют на активность связывающей и/или эффекторной функции, как представлено в настоящем описании или известно в этой области в отношении IgG1. В одном из вариантов осуществления аминокислотная модификация и шарнирная область/Fc-область IgG демонстрируют схожую функциональность, например, сниженную активность ADCC (или другую эффекторную функцию) и/или повышенное связывание с FcγRIIB в контексте биспецифического антитела или другой Fc-содержащей молекулы (например, иммуноглобулина). В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к вариантам Fc-области, содержащим комбинации аминокислотных модификаций, известных в этой области, и выбранных областей IgG, демонстрирующие новые свойства, неопределяемые, когда модификации и/или области анализируют независимо, как представлено в настоящем описании.

В некоторых вариантах осуществления каждый из первого способствующего гетеродимеризации домена и второго способствующего гетеродимеризации домена содержит Fc-область, содержащую домен CH2 и домен CH3, где аминокислотная последовательность каждого из домена CH2 и/или домена CH3 содержит по меньшей мере одну аминокислотную модификацию по сравнению с Fc-областью дикого типа, образующую выступ или впадину.

В некоторых вариантах осуществления каждый из первого способствующего гетеродимеризации домена и второго способствующего гетеродимеризации домена содержит домен CH2 и домен CH3, где аминокислотную последовательность каждого из доменов CH2 и/или каждого из доменов CH3 модифицируют для регуляции гетеродимеризации и/или стабилизации биспецифического антитела.

В некоторых таких вариантах осуществления биспецифические антитела по настоящему изобретению содержат первый способствующий гетеродимеризации домен на первой полипептидной цепи и второй способствующий гетеродимеризации домен на второй полипептидной цепи. В совокупности, первый и второй способствующие гетеродимеризации домены регулируют гетеродимеризацию, и/или стабилизируют биспецифическое антитело (например, посредством взаимодействия выступа и впадины на комплементарных способствующих гетеродимеризации доменов), и/или служат для стабилизации биспецифического антитела.

В некоторых вариантах осуществления первый способствующий гетеродимеризации домен и второй способствующий гетеродимеризации домен не являются оба выступами или не являются оба впадинами; и/или первый способствующий гетеродимеризации домен и второй способствующий гетеродимеризации домен образуют Fc-область иммуноглобулина IgG.

В некоторых вариантах осуществления первый способствующий гетеродимеризации домен может содержать Fc-цепь, имеющую домен CH2 и/или CH3, модифицированный так, чтобы он содержал выступ или впадину. В некоторых таких вариантах осуществления аминокислотная последовательность домена CH2 и/или домена CH3 содержит по меньшей мере одну аминокислотную модификацию, где: (a) домен CH3 первого способствующего гетеродимеризации домена образует выступ; и (b) домен CH3 второго способствующего гетеродимеризации домена образует впадину. В другом таком варианте осуществления домен CH3 первого способствующего гетеродимеризации домена содержит мутации Y349C и/или T366W для образования выступа; и домен CH3 второго способствующего гетеродимеризации домена содержит мутации S354C, T366S, L368A, и/или Y407V для образования впадины (нумерация в соответствии с индексом EU). В некоторых конкретных вариантах осуществления мутации приводят к сниженной эффекторной функции.

В некоторых вариантах осуществления первый способствующий гетеродимеризации домен может содержать домен CH2 и/или CH3, модифицированный так, чтобы он содержал выступ, содержащий последовательность SEQ ID NO: 188, если второй способствующий гетеродимеризации домен содержит домен CH2 и/или CH3, модифицированный так, чтобы он содержал впадину. В другом варианте осуществления первый способствующий гетеродимеризации домен может содержать впадину, если второй способствующий гетеродимеризации домен содержит домен CH2 и/или CH3, модифицированный так, чтобы он содержал выступ. В конкретном варианте осуществления описанного выше первый способствующий гетеродимеризации домен содержит последовательность SEQ ID NO: 188 для образования выступа; и где второй способствующий гетеродимеризации домен содержит последовательность SEQ ID NO: 189 для образования впадину. В таблице 7 приведены аминокислотные последовательности Fc-цепей с выступами и впадинами и первых полипептидных цепей и вторых полипептидных цепей биспецифических антител против GUCY2c с различными антителами против GUCY2c и CD3, представленными в настоящем описании (SEQ ID NO: 196, 197, 199, 200, 202, 203, 205, 206, 210, 211, 216, 217, 219, 220, 248, 249, 282, 283, 284, 285, 286 и 287).

Таблица 7

Fc-цепь с выступом (SEQ ID NO: 188) APEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG Fc-цепь с впадиной (SEQ ID NO: 189) APEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCREEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG GUCY2C-0074_выступ
(SEQ ID NO: 196) DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVDNYGISFMNWFQQKPGQPPKLLIYAASNPGSGVPARFSGSGSGTDFSLNIHPLEEDDTAMFFCQQSKEVPYTFGGGTKLEIKGGGSGGGGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMTWVRQAPGKGLEWVAFIRNRARGYTSDHNPSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRPSYYVLDYWGQGTTVTVSSGCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG GUCY2C-0074_впадина
(SEQ ID NO: 197) DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLFNVRSRKNYLAWYQQKPGQPPKLLISWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCKQSYDLFTFGSGTKLEIKGGGSGGGGEVQLQQSGAELARPGASVNLSCKASGYTFTTYWMQWVKQRPGQGLEWIGAIYPGDGMTTYTQKFKDKATLTADKSSSTAYMQLSSLASEDSAVYYCVRKGMDYWGQGTSVTVSSGCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCREEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG GUCY2C-0098_выступ
(SEQ ID NO: 199) DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVDYYGTSLMQWYQQKPGQPPKLLIYAASNVESGVPARFSGSGSGTDFSLNIHPVEEDDIAMYFCQQTRKVYTFGGGTKLEIKGGGSGGGGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMTWVRQAPGKGLEWVAFIRNRARGYTSDHNPSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRPSYYVLDYWGQGTTVTVSSGCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG GUCY2C-0098_впадина
(SEQ ID NO: 200) DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLFNVRSRKNYLAWYQQKPGQPPKLLISWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCKQSYDLFTFGSGTKLEIKGGGSGGGGQVQLQQPGAELVKPGASVKLSCKASGYTFTSYWMHWVKQRPGQGLEWIGEIKPSNGLTNYIEKFKNKATLTVDKSATTAYMQLSSLTAEDSAVYYCTRTITTTEGYWFFDVWGAGTTVTVSSGCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCREEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG GUCY2C-0105_выступ
(SEQ ID NO: 202) DIVMTQSPSSLAVSVGEKVTVSCKSSQSLLYSSNQKNYLAWYQQRPGQSPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLSISSVKAEDLAVYYCQQYYSYPTFGGGTKLEIKGGGSGGGGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMTWVRQAPGKGLEWVAFIRNRARGYTSDHNPSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRPSYYVLDYWGQGTTVTVSSGCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG GUCY2C-0105_впадина
(SEQ ID NO: 203) DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLFNVRSRKNYLAWYQQKPGQPPKLLISWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCKQSYDLFTFGSGTKLEIKGGGSGGGGEVQLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYSFTDYIMLWVKQSHGKSLEWIGNSNPYYGSTSYNLKFKGKATLTVDKSSSTAYMHLNSLTSEDSAVYYCARSGYYGSSPYWYFDVWGAGTTVTVSSGCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCREEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG GUCY2C-0240_выступ
(SEQ ID NO: 205) DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVDNYGISFMNWFQQKPGKAPKLLIYAASNPGSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSKEVPYTFGQGTKLEIKGGGSGGGGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMTWVRQAPGKGLEWVAFIRNRARGYTSDHNPSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRPSYYVLDYWGQGTTVTVSSGCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG GUCY2C-0240_впадина
(SEQ ID NO: 206) DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLFNVRSRKNYLAWYQQKPGQPPKLLISWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCKQSYDLFTFGSGTKLEIKGGGSGGGGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTTYWMQWVRQAPGKGLEWIGAIYPGDGMTTYTQKFKDRFTISADKAKNSAYLQMNSLRAEDTAVYYCVRKGMDYWGQGTLVTVSSGCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCREEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG GUCY2C-0247_выступ
(SEQ ID NO: 210) DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVDYYGTSLMQWYQQKPGKPPKLLIYAASNVESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTRKVYTFGQGTKLEIKGGGSGGGGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMTWVRQAPGKGLEWVAFIRNRARGYTSDHNPSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRPSYYVLDYWGQGTTVTVSSGCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG GUCY2C-0247_впадина
(SEQ ID NO: 211) DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLFNVRSRKNYLAWYQQKPGQPPKLLISWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCKQSYDLFTFGSGTKLEIKGGGSGGGGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYWMHWVRQAPGKGLEWIGEIKPSNGLTNYIEKFKNRFTISVDKAKNSAYLQMNSLRAEDTAVYYCTRTITTTEGYWFFDVWGQGTLVTVSSGCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCREEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG GUCY2C-1478_выступ;
GUCY2C-1608_выступ
(SEQ ID NO: 216) DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVDYYGSSLLQWYQQKPGKAPKLLIYAASKLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTRKAYTFGQGTKLEIKGGGSGGGGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMTWVRQAPGKGLEWVAFIRNQARGYTSDHNPSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRPSYYVLDYWGQGTTVTVSSGCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG GUCY2C-1478_впадина
(SEQ ID NO: 217) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCTSSQSLFNVRSQKNYLAWYQQKPGKAPKLLIYWASTRESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCKQSYDLFTFGGGTKVEIKGGGGSGGGGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYWMHWVRQAPGKGLEWIGEIKPSNGLTNVHEKFKNRFTISVDKAKNSAYLQMNSLRAEDTAVYYCTRTITTTEGYWFFDVWGQGTLVTVSSGCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCREEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG GUCY2C-1608_впадина
(SEQ ID NO: 220) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCTSSQSLFNVRSQKNYLAWYQQKPGKAPKLLIYWASTRESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCKQSYDLFTFGGGTKVEIKGGGGSGGGGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMHWVRQAPGKGLEWIGEIKPSNELTNVHEKFKDRFTISVDKAKNSAYLQMNSLRAEDTAVYYCTRTITTTEGYWFFDVWGQGTLVTVSSGCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCREEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG GUCY2C-0250_выступ
(SEQ ID NO: 248) DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVDYYGTSLMQWYQQKPGKAPKLLIYAASNVESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTRKVYTFGQGTKLEIKGGGSGGGGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMTWVRQAPGKGLEWVAFIRNRARGYTSDHNPSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRPSYYVLDYWGQGTTVTVSSGCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG GUCY2C-0250_впадина
(SEQ ID NO: 249) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCTSSQSLFNVRSRKNYLAWYQQKPGKAPKLLIYWASTRESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCKQSYDLFTFGGGTKVEIKGGGSGGGGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYWMHWVRQAPGKGLEWIGEIKPSNGLTNYIEKFKNRFTISVDKAKNSAYLQMNSLRAEDTAVYYCTRTITTTEGYWFFDVWGQGTLVTVSSGCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCREEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG GUCY2C-1678_выступ
(SEQ ID NO: 282) DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVDYYGSSLLQWYQQKPGKAPKLLIYAASKLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTRKAYTFGQGTKLEIKGGGSGGGGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMTWVRQAPGKGLEWVAFIRNQARGYTSDHNPSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRPSYYVLDYWGQGTTVTVSSGCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG GUCY2C-1678_впадина
(SEQ ID NO: 283) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCTSDQSLFNVRSGKNYLAWYQQKPGKAPKLLIYWASDRESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCKQSYDLFTFGGGTKVEIKGGGGSGGGGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMHWVRQAPGKGLEWIGEIKPSNELTNVHEKFKDRFTISVDKAKNSAYLQMNSLRAEDTAVYYCTRTITTTEGYWFFDVWGQGTLVTVSSGCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCREEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG GUCY2C-1679_выступ
(SEQ ID NO: 284) DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVDYYGSSLLQWYQQKPGKAPKLLIYAASKLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTRKAYTFGQGTKLEIKGGGSGGGGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMTWVRQAPGKGLEWVAFIRNQARGYTSDHNPSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRPSYYVLDYWGQGTTVTVSSGCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG GUCY2C-1679_впадина
(SEQ ID NO: 285) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCTSSQSLFNVRSGKNYLAWYQQKPGKAPKLLIYWASDRESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCKQSYDLFTFGGGTKVEIKGGGGSGGGGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMHWVRQAPGKGLEWIGEIKPSNELTNVHEKFKDRFTISVDKAKNSAYLQMNSLRAEDTAVYYCTRTITTTEGYWFFDVWGQGTLVTVSSGCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCREEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG GUCY2C-1680_выступ
(SEQ ID NO: 286) DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVDYYGSSLLQWYQQKPGKAPKLLIYAASKLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTRKAYTFGQGTKLEIKGGGSGGGGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMTWVRQAPGKGLEWVAFIRNQARGYTSDHNPSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRPSYYVLDYWGQGTTVTVSSGCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG GUCY2C-1680_впадина
(SEQ ID NO: 287) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCTSSESLFNVRSGKNYLAWYQQKPGKAPKLLIYWASDRESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCKQSYDLFTFGGGTKVEIKGGGGSGGGGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMHWVRQAPGKGLEWIGEIKPSNELTNVHEKFKDRFTISVDKAKNSAYLQMNSLRAEDTAVYYCTRTITTTEGYWFFDVWGQGTLVTVSSGCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCREEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG

Одним из способов определения аффинности связывания антител против GUCY2c или CD3 является измерение аффинности связывания монофункциональных Fab-фрагментов антитела. Для получения монофункциональных Fab-фрагментов антитело (например, IgG) можно расщеплять папаином или экспрессировать рекомбинантно. Аффинность Fab-фрагмента антитела против GUCY2c можно определять посредством поверхностного плазмонного резонанса (с использованием системы поверхностного плазмонного резонанса (SPR) BIACORE™ 3000™, BIACORE™, INC, Piscataway NJ) с использованием сенсорных чипов с предварительно иммобилизованным стрептавидином (SA) или с использованием антитела против Fc мыши или антитела против Fc человека и подвижного буфера HBS-EP (0,01 M HEPES, pH 7,4, 0,15 M NaCl, 3 мМ ЭДТА, 0,005% об./об. поверхностно-активного вещества P20). Биотинилированную или Fc-слитую GUCY2c человека можно разводить в буфере HBS-EP до концентрации менее 0,5 мкг/мл и впрыскивать в отдельные каналы чипа с использованием переменного времени контакта для получения двух диапазонов плотности антигена, 50-200 единиц ответа (RU) для подробных исследований кинетики или 800-1000 RU для скрининговых анализов. Исследования регенерации показали, что с помощью 25 мМ NaOH в 25% об./об. этаноле эффективно удаляют связанный Fab при сохранении активности GUCY2c на чипе при более чем 200 инъекциях. Как правило, серийные разведения (охватывающие концентрации, составляющие 0,1-10-кратную K_D) образцов очищенных Fab впрыскивают в течение 1 мин при 100 мкл/минуту и допускают время диссоциации до 2 часов. Концентрации белков Fab определяют посредством ELISA и/или электрофореза в ПААГ с SDS с использованием Fab в известной концентрации (что определяют посредством анализа аминокислот) в качестве стандарта. Кинетические данные о скорости ассоциации (k_on) и скорости диссоциации (k_off) получают одновременно посредством глобальной аппроксимации по модели связывания Ленгмюра 1:1 (Karlsson, R. Roos, H. Fagerstam, L. Petersson, B., Methods Enzymology 6. 99-110, 1994) с использованием программного обеспечения BIAevaluation. Значения равновесной константы диссоциации (K_D) вычисляют как k_off/k_on. Этот способ подходит для использования в определении аффинности связывания антитела с любой GUCY2c, включая GUCY2c человека, GUCY2c другого млекопитающего (такого как GUCY2c мыши, GUCY2c крысы или GUCY2c примата), а также различными формами GUCY2c (например, гликозилированной GUCY2c). Аффинность связывания антитела, как правило, измеряют при 25°C, но ее также можно измерять при 37°C.

Антитела, представленные в настоящем описании, можно получать любым известным в этой области способом. Для получения линий гибридомных клеток путь и схема иммунизации животных-хозяев, как правило, соответствуют установленным и общепринятым способам стимуляции и продукции антител, как дополнительно представлено в настоящем описании. Общие способы получения антител человека и мыши известны в этой области и/или представлены в настоящем описании.

Предполагают, что на любое млекопитающее, включая людей, или продуцирующие антитела клетки из них можно воздействовать так, чтобы они служили основой для получения линий клеток млекопитающего, включая линии клеток человека и линии гибридомные клеток. Как правило, животного-хозяина инокулируют интраперитонеально, внутримышечно, перорально, подкожно, внутриподошвенно и/или интрадермально с использованием количества иммуногена, представленное в настоящем описании.

Гибридомы можно получать из лимфоцитов и иммортализованных миеломных клеток с использованием общего способа гибридизации соматических клеток из Kohler, B. and Milstein, C., Nature 256:495-497, 1975 или его модифицированной версии из Buck, D. W., et al., In Vitro, 18:377-381, 1982. В гибридизации можно использовать доступные миеломные линии, включая в качестве неограничивающих примеров X63-Ag8.653 и клетки из Salk Institute, Cell Distribution Center, San Diego, Calif., USA. Как правило, способ включает слияние миеломных клеток и лимфоидных клеток с использованием фузогена, такого как полиэтиленгликоль, или электрическими способами, хорошо известными специалистам в этой области. После слияния клетки отделяют от среды для слияния и выращивают в селективной среде для выращивания, такой как гипоксантин-аминоптерин-тимидиновая (HAT) среда, для устранения негибридизовавшихся родительских клеток. Любые из сред, представленных в настоящем описании, дополненных или недополненных сывороткой, можно использовать для культивирования гибридом, секретирующих моноклональные антитела. В качестве другой альтернативы способу слияния клеток, для получения моноклональных антител по настоящему изобретению можно использовать EBV-иммортализованные B-клетки. Гибридомы, при желании, выращивают и субклонируют и супернатанты анализируют на антииммуногенную активность общепринятыми способами иммунологических анализов (например, посредством радиоиммунологического анализа, ферментативного иммунологического анализа или флуоресцентного иммунологического анализа).

Гибридомы, которые можно использовать в качестве источника антител, включают все производные, клетки-потомки родительских гибридом, продуцирующих моноклональные антитела, специфические в отношении GUCY2c, CD3 или их частей.

Гибридомы, продуцирующие такие антитела, можно выращивать in vitro или in vivo известными способами. Моноклональные антитела можно выделять из сред для культивирования или физиологических жидкостей общепринятыми способами очистки иммуноглобулинов, при желании, такими как осаждение сульфатом аммония, электрофорез в геле, диализ, хроматография и ультрафильтрации. Нежелательную активность, при ее наличии, можно устранять, например, пропуская препарат через адсорбенты, полученные из иммуногена, прикрепленного к твердой фазе, и осуществляя элюцию или высвобождая желаемые антитела из иммуногена. Популяцию антител (например, моноклональных антител) можно получать посредством иммунизации животного-хозяина с использованием GUCY2c или CD3 человека или их фрагмента, содержащего целевую аминокислотную последовательность, конъюгированную с белком, являющимся иммуногенным для биологического вида, подлежащего иммунизации, например, гемоцианином морского блюдца, сывороточным альбумином, бычьим тиреоглобулином или ингибитором трипсина сои с использованием бифункционального или дериватизирующего средства, например, малеимидобензоилсульфосукцинимидного сложного эфира (конъюгация через остатки цистеина), N-гидроксисукцинимида (через остатки лизина), глутаральдегида, янтарного ангидрида, SOCl₂, или R¹N=C=NR, где R и R¹ являются разными алкильными группами.

При желании, интересующее антитело (моноклональное или поликлональное) можно секвенировать, а затем полинуклеотидную последовательность можно клонировать в вектор для экспрессии или размножения. Последовательность, кодирующую интересующее антитело, можно поддерживать в векторе в клетке-хозяине, а затем клетку-хозяина можно выращивать и замораживать для дальнейшего использования. Получение рекомбинантных моноклональных антител в культуре клеток можно осуществлять посредством клонирования генов антител из B-клеток способами, известными в этой области. См., например, Tiller et al., J. Immunol. Methods, 3291122008; патент США № 7314622.

Альтернативно, полинуклеотидную последовательность можно использовать для генетического воздействия для гуманизации антитела или для улучшения аффинности или других характеристик антител. Например, константную область можно конструировать так, чтобы она как можно больше напоминала константные области человека во избежание иммунного ответа, если антитело используют в клинических испытаниях и лечении людей. Желательным может являться генетическое воздействие на последовательность антитела для достижения более высокой аффинности к GUCY2c или CD3 и большей эффективности в ингибировании GUCY2c.

Существуют четыре общие стадии гуманизации моноклонального антитела. Они представляют собой: (1) определение нуклеотидной и прогнозируемой аминокислотной последовательности начальных вариабельных областей легких и тяжелых цепей антитела, (2) дизайн гуманизированного антитела, т.е. принятие решения о том, какую каркасную область антитела использовать во время гуманизации, (3) конкретные способы гуманизации и (4) трансфекцию и экспрессию гуманизированного антитела. См., например, патенты США №№ 4816567, 5807715, 5866692, 6331415, 5530101, 5693761, 5693762, 5585089 и 6180370.

Описан ряд молекул гуманизированных антител, содержащих антигенсвязывающий участок, полученный из не принадлежащего человеку иммуноглобулина, включая химерные антитела, имеющие V-области грызуна или модифицированные V-области грызуна и соответствующие CDR, слитые с константными областями человека. См., например, Winter et al. Nature 349:293-299, 1991, Lobuglio et al. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 86:4220-4224, 1989, Shaw et al. J Immunol. 138:4534-4538, 1987, и Brown et al. Cancer Res. 47:3577-3583, 1987. В других источниках описывают CDR грызуна, пересаженные на поддерживающую каркасную область (FR) человека перед слиянием с подходящей константной областью антитела человека. См., например, Riechmann et al. Nature 332:323-327, 1988, Verhoeyen et al. Science 239:1534-1536, 1988, и Jones et al. Nature 321:522-525, 1986. В другом источнике описывают CDR грызуна, поддерживаемые рекомбинантно сконструированными каркасными областями грызуна. См., например, европейскую патентную публикацию № EP0519596. Эти "гуманизированные" молекулы конструируют для минимизации нежелательного иммунного ответа на молекулы антител грызуна против человека, что ограничивает длительность и эффективность терапевтического использования этих веществ на реципиентах-людях. Например, константную область антитела можно конструировать таким образом, что она является иммунологически инертной (например, не запускает опосредованный комплементом лизис). См., например, патентную заявку PCT № PCT/GB99/01441; патентную заявку Великобритании № 9809951.8. Другие способы гуманизации антител, которые также можно использовать, описаны в Daugherty et al., Nucl. Acids Res. 19:2471-2476, 1991, в патентах США №№ 6180377, 6054297, 5997867, 5866692, 6210671 и 6350861 и публикации PCT № WO01/27160.

Общие принципы, касающиеся гуманизированных антител, описанных выше, также можно использовать для кастомизации антител для использования, например, на собаках, кошках, приматах, лошадях и крупном рогатом скоте. Кроме того, можно комбинировать один или более аспектов гуманизации антитела, представленного в настоящем описании, например, пересадку CDR, мутации каркаса и мутации CDR.

В одном из вариантов полностью человеческие антитела можно получать с использованием коммерчески доступных мышей, сконструированных для экспрессии конкретных белков иммуноглобулина человека. Трансгенные животные, полученные для достижения более желательного (например, полностью человеческие антитела) или более устойчивого иммунного ответа, также можно использовать для получения гуманизированных антител или антител человека. Примерами такой технологии являются Xenomouse™ от Abgenix, Inc. (Fremont, CA) и HuMAb-Mouse® и TC Mouse™ от Medarex, Inc. (Princeton, NJ).

Альтернативно, антитела можно получать рекомбинантно и экспрессировать любым известным в этой области способом. В качестве другой альтернативы, антитела можно получать рекомбинантно с помощью технологии фагового дисплея. См., например, патенты США №№ 5565332, 5580717, 5733743 и 6265150 и Winter et al., Annu. Rev. Immunol. 12:433-455, 1994. Альтернативно, можно использовать технологию фагового дисплея (McCafferty et al., Nature 348:552-553, 1990) для получения антител человека и фрагментов антител in vitro из репертуара генов вариабельных областей (V) иммуноглобулина из иммунизированных доноров. В этом способе гены V-домена антитела клонируют в рамке считывания в ген основного или минорного белка оболочки нитевидного бактериофага, такого как M13 или fd, и экспонируют как функциональные фрагменты антител на поверхности фаговой частицы. Т.к. частица нитевидного фага содержит одноцепочечную копию ДНК генома фага, селекция на основе функциональных свойств антитела также приводит к селекции гена, кодирующего антитело, проявляющего эти свойства. Таким образом, фаг имитирует некоторые из свойств B-клетки. Фаговый дисплей можно осуществлять в различных форматах; обзор см., например, Johnson, Kevin S. and Chiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3:564-571, 1993. Для фагового дисплея можно использовать несколько источников сегментов V-генов. Clackson et al., Nature 352:624-628, 1991 выделяли разнообразный набор антител против оксазолона из небольшой рандомной комбинаторной библиотеки V-генов, полученных из селезенок иммунизированных мышей. Можно конструировать репертуар V-генов неиммунизированных людей-доноров и можно выделять антитела против разнообразного набора антигенов (включая аутоантигены), по существу, способами, описанными в Mark et al., J. Mol. Biol. 222:581-597, 1991, или Griffith et al., EMBO J. 12:725-734, 1993. При природном иммунном ответе гены антител накапливают мутации в большом количестве (соматическая супермутация). Некоторые вносимые изменения будут придавать более высокую аффинность, и B-клетки, экспонирующие высокоаффинный поверхностный иммуноглобулин, преференциально делятся и дифференцируются во время последующей стимуляции антигеном. Этот природный процесс можно имитировать способом, известным как "перестановка цепей" (Marks et al., Bio/Technol. 10:779-783, 1992). В этом способе аффинность "первичных" антител человека, полученных посредством фагового дисплея, можно улучшать, последовательно заменяя гены V-области тяжелой и легкой цепи репертуаром природных вариантов (репертуаром) генов V-доменов, полученным из неиммунизированных доноров. Этот способ делает возможным получение антител и фрагментов антител с аффинностями в диапазоне пМ-нМ. Стратегия получения очень большого репертуара фаговых антител (также известная как "библиотеки всеобщей матери") описана в Waterhouse et al., Nucl. Acids Res. 21:2265-2266, 1993. Перестановку генов также можно использовать для получения антител человека из антител грызунов, где антитело человека обладает аффинностями и специфичностями, схожими с исходным антителом грызуна. В этом способе, также обозначаемом как "импринтинг эпитопов", ген V-домена тяжелой или легкой цепи антител грызуна, полученный способом фагового дисплея, заменяют репертуаром генов V-доменов человека, получая химеры грызун-человек. Селекция с использованием антигена приводит к выделению вариабельных областей человека, способных восстанавливать функциональный антигенсвязывающий участок, т.е. эпитоп регулирует (импринтирует) выбор партнера. Когда способ повторяют для замены оставшегося V-домена грызуна, получают антитело человека (см. публикацию PCT № WO93/06213). В отличие от общепринятой гуманизации антител грызунов посредством пересадки CDR, этот способ обеспечивает получение полностью человеческих антител, не имеющих остатки каркаса или CDR грызуна.

Антитела можно получать рекомбинантно, сначала выделяя антитела и продуцирующие антитела клетки из животных-хозяев, получая последовательность гена и используя последовательность гена для рекомбинантной экспрессии антитела в клетках-хозяевах (например, клетках CHO). Другим способом, который можно использовать, является экспрессия последовательности антитела в растениях (например, табаке) или трансгенном молоке. Описаны способы рекомбинантной экспрессии антител в растениях или молоке. См., например, Peeters, et al. Vaccine 19:2756, 2001; Lonberg, N. and D. Huszar Int. Rev. Immunol 13:65, 1995; и Pollock, et al., J Immunol Methods 231:147, 1999. В этой области известны способы получения производных антител, например, гуманизированных, одноцепочечных и т.д.

Для выделения антител, специфических в отношении GUCY2c, CD3 или интересующих антигенов, также можно использовать иммунологические анализы и способы сортировки на основе проточной цитометрии, такие как активируемая флуоресценцией сортировка клеток (FACS).

Антитела, представленные в настоящем описании, можно связывать с множеством разных твердых подложек или носителей. Такие подложки могут являться активными и/или инертными. Хорошо известные подложки включают полипропилен, полистирол, полиэтилен, декстран, нейлон, амилазы, стекло, природные и модифицированные целлюлозы, полиакриламиды, агарозы и магнетит. В целях по изобретению подложка может являться растворимой или нерастворимой. Специалистам в этой области будут известны другие подходящие подложки для связывания антител, или они смогут определять их с использованием рутинного экспериментирования. В некоторых вариантах осуществления подложка содержит фрагмент, нацеленный на миокард.

ДНК, кодирующую моноклональные антитела, легко выделяют и секвенируют общепринятыми способами (например, с использованием олигонуклеотидных зондов, которые могут специфически связываться с генами, кодирующими тяжелые и легкие цепи моноклональных антител). Гибридомные клетки служат в качестве предпочтительного источника такой ДНК. После выделения ДНК можно помещать в экспрессирующие векторы (такие как экспрессирующие векторы, описанные в публикации PCT № WO87/04462), с помощью которых затем трансфицируют клетки-хозяева, такие как клетки E. coli, клетки обезьян COS, клетки CHO или миеломные клетки, которые в ином случае не продуцируют иммуноглобулиновый белок, для достижения синтеза моноклональных антител в рекомбинантных клетках-хозяевах. См., например, публикацию PCT № WO87/04462. ДНК также можно модифицировать, например, посредством замены кодирующей последовательностью константных областей тяжелой и легкой цепи человека гомологичных последовательностей мыши, Morrison et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 81:6851, 1984, или посредством ковалентного соединения с кодирующей последовательностью иммуноглобулина всей или части кодирующей последовательности неиммуноглобулинового полипептида. Таким образом, получают "химерные" или "гибридные" антитела, имеющие специфичность связывания моноклонального антитела по настоящему изобретению.

Антитела против GUCY2c, CD3 или других антигенов, представленные в настоящем описании, можно идентифицировать или охарактеризовывать известными в этой области способами, при этом определяют и/или измеряют снижение уровней экспрессии GUCY2c, CD3 или другого антигена. В некоторых вариантах осуществления антитело против GUCY2c идентифицируют посредством инкубации средства-кандидата с GUCY2c и мониторинга связывания и/или сопутствующего снижения уровней экспрессии GUCY2c. Анализ связывания можно осуществлять с использованием очищенных полипептидов GUCY2c или клеток, от природы экспрессирующих или трансфицированных для экспрессии полипептидов GUCY2c. В одном из вариантов осуществления анализ связывания является анализом конкурентного связывания, где оценивают способность антитела-кандидата конкурировать с известным антителом против GUCY2c за связывание с GUCY2c. Анализ можно осуществлять в различных форматах, включая формат ELISA.

После исходной идентификации активность антитела-кандидата против GUCY2c, CD3 или другого антигена можно дополнительно подтверждать и уточнять посредством биологических анализов, известных для тестирования целевых видов биологической активности. Альтернативно, биологические анализы можно использовать для прямого скрининга кандидатов. Некоторые из способов идентификации и характеризации антител подробно описаны в примерах.

Антитела против GUCY2c, CD3 или другого антигена можно охарактеризовывать способами, хорошо известными в этой области. Например, одним из способов является идентификация эпитопа, с которым оно связывается, или эпитопное картирование. Существует множество известных в этой области способов картирования и характеризации локализации эпитопов на белках, включая разрешение кристаллической структуры комплекса антитело-антиген, конкурентные анализы, анализы экспрессии фрагментов генов и синтетические анализы на основе пептидов, как описано, например, в главе 11 Harlow and Lane, Using Antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1999. В дополнительном примере эпитопное картирование можно использовать для определения последовательности, с которой связывается антитело. Эпитопное картирование является коммерчески доступным в различных источниках, например, Pepscan Systems (Edelhertweg 15, 8219 PH Lelystad, The Netherlands). Эпитоп может являться линейным эпитопом, т.е. содержаться в одном фрагменте аминокислот, или конформационным эпитопом, образованным при трехмерном взаимодействии аминокислот, которые могут не содержаться в одном фрагменте. Пептиды различной длины (например, по меньшей мере 4-6 аминокислот) можно выделять или синтезировать (например, рекомбинантно) и использовать для анализов связывания с антителом против GUCY2c, CD3 или другим антигеном. В другом примере эпитоп, с которым связывается антитело против GUCY2c, CD3 или другого антигена, можно определять посредством системного скрининга с использованием перекрывающихся пептидов, полученных из последовательности GUCY2c, CD3 или другого антигена, и определения связывания с антителом против GUCY2c, CD3 или другого антигена. В соответствии с анализами экспрессии фрагментов генов, открытую рамку считывания, кодирующую GUCY2c, CD3 или другой антиген, фрагментируют случайным образом или с помощью специфических генетических конструкций, и определяют реактивность экспрессируемых фрагментов GUCY2c, CD3 или другого антигена и антитела, подлежащего тестированию. Фрагменты генов можно получать, например, посредством ПЦР, а затем транскрибировать и транслировать в белок in vitro в присутствии радиоактивных аминокислот. Затем определяют связывание антитела с радиоактивно мечеными фрагментами GUCY2c, CD3 или другого антигена с помощью иммунопреципитации и электрофореза в геле. Некоторые эпитопы также можно идентифицировать с использованием больших библиотек случайных пептидных последовательностей, экспонируемых на поверхности фаговых частиц (фаговые библиотеки). Альтернативно, определенную библиотеку перекрывающихся пептидных фрагментов можно тестировать на связывание с тестовым антителом в простых анализах связывания. В дополнительном примере для идентификации остатков, требующихся, достаточных и/или необходимых для связывания эпитопа, можно осуществлять мутагенез антигенсвязывающего домена, эксперименты по перестановке доменов и мутагенез с аланиновым сканированием. Например, эксперименты по перестановке доменов можно осуществлять с использованием мутантной GUCY2c, CD3 или другого антигена, где различные фрагменты GUCY2c, CD3 или другого антигенного белка заменяют (перестанавливают) последовательностями из GUCY2c другого биологического вида (например, мыши) или близкородственного, но антигенно отличающегося отдельного белка (например, Trop-1). Оценивая связывание антитела с мутантной GUCY2c, CD3 или другим антигеном, можно оценивать важность конкретного фрагмента GUCY2c, CD3 или другого антигена для связывания антитела.

Другим способом, который можно использовать для характеризации антитела против GUCY2c, CD3 или другого антигена, является использование конкурентных анализов с другими антителами, которые, как известно, связываются с тем же антигеном, т.е. различными фрагментами на GUCY2c, CD3 или другом антигене, для определения того, связывается ли антитело против GUCY2c, CD3 или другого антигена с тем же эпитопом, что и другие антитела, соответственно. Конкурентные анализы хорошо известны специалистам в этой области.

Для регуляции экспрессии антитела против GUCY2c, CD3 или другого антигена можно использовать экспрессирующий вектор. Специалисту в этой области известно введение экспрессирующих векторов для достижения экспрессии экзогенного белка in vivo. См., например, патенты США №№ 6436908, 6413942 и 6376471. Введение экспрессирующих векторов включает локальное или системное введение, включая инъекцию, пероральное введение, биобаллистическую пушку или катетерное введение и местное введение. В другом варианте осуществления экспрессирующий вектор вводят напрямую в симпатический ствол или ганглий или коронарную артерию, предсердие, желудочек или перикард.

Также можно использовать направленную доставку терапевтических композиций, содержащих экспрессирующий вектор, или субгеномных полинуклеотидов. Рецептор-опосредованные способы доставки ДНК описаны, например, в Findeis et al., Trends Biotechnol., 11:202, 1993; Chiou et al., Gene Therapeutics: Methods And Applications Of Direct Gene Transfer, J.A. Wolff, ed., 1994; Wu et al., J. Biol. Chem., 263:621, 1988; Wu et al., J. Biol. Chem., 269:542, 1994; Zenke et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:3655, 1990; и Wu et al., J. Biol. Chem., 266:338, 1991. Терапевтические композиции, содержащие полинуклеотид, вводят в диапазоне от приблизительно 100 нг до приблизительно 200 мг ДНК для локального введения в способе генной терапии. В способе генной терапии также можно использовать диапазоны концентраций от приблизительно 500 нг до приблизительно 50 мг, от приблизительно 1 мкг до приблизительно 2 мг, от приблизительно 5 мкг до приблизительно 500 мкг и от приблизительно 20 мкг до приблизительно 100 мкг ДНК. Терапевтические полинуклеотиды и полипептиды можно доставлять с использованием носителей для доставки генов. Носитель для доставки генов может иметь вирусное или невирусное происхождение (см., в целом, Jolly, Cancer Gene Therapy,1:51, 1994; Kimura, Human Gene Therapy, 5:845, 1994; Connelly, Human Gene Therapy, 1:185, 1995; и Kaplitt, Nature Genetics, 6:148, 1994). Экспрессию таких кодирующих последовательностей можно индуцировать с использованием эндогенных промоторов млекопитающих или гетерологичных промоторов. Экспрессия кодирующей последовательности может являться конститутивной или регулируемой.

Вирусные векторы для доставки желаемого полинуклеотида и экспрессии в желаемой клетке хорошо известны в этой области. Неограничивающие примеры носителей на основе вирусов включают рекомбинантные ретровирусы (см., например, публикации PCT №№ WO90/07936; WO94/03622; WO93/25698; WO93/25234; WO93/11230; WO93/10218; WO91/02805; патенты США №№ 5219740 и 4777127; патент Великобритании № 2200651; и патент EP № EP0 345 242), векторы на основе альфавирусов (например, векторы вируса Синдбис, вируса леса Семлики (ATCC VR-67; ATCC VR-1247), вируса лихорадки реки Росс (ATCC VR-373; ATCC VR-1246) и вируса венесуэльского энцефалита лошадей (ATCC VR-923; ATCC VR-1250; ATCC VR 1249; ATCC VR-532)) и векторы на основе аденоассоциированного вируса (AAV) (см., например, публикации PCT №№ WO94/12649, WO93/03769; WO93/19191; WO94/28938; WO95/11984 и WO95/00655). Также можно использовать введение ДНК, связанной с убитым аденовирусом, как описано в Curiel, Hum. Gene Ther., 3:147, 1992.

Также можно использовать невирусные носители для доставки и способы, включая, в качестве неограничивающих примеров, конденсированную с поликатионами ДНК, связанную или несвязанную с убитым аденовирусом в отдельности (см., например, Curiel, Hum. Gene Ther., 3:147, 1992); связанную с лигандом ДНК (см., например, Wu, J. Biol. Chem., 264:16985, 1989); эукариотическая клетки-носители для доставки (см., например, патент США № 5814482; публикации PCT №№ WO95/07994; WO96/17072; WO95/30763 и WO97/42338) и нейтрализацию заряда ядра или слияние с клеточными мембранами. Также можно использовать депротеинизированную ДНК. Примеры способов встраивания депротеинизированной ДНК описаны в публикации PCT № WO90/11092 и патенте США № 5580859. Липосомы, которые могут действовать в качестве носителей для доставки генов, описаны в патенте США № 5422120; публикациях PCT №№ WO95/13796; WO94/23697; WO91/14445; и европейской публикации № EP 0524968. Дополнительные подходы описаны в Philip, Mol. Cell Biol., 14:2411, 1994 и Woffendin, Proc. Natl. Acad. Sci., 91:1581, 1994.

В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к композициям, включая фармацевтические композиции, содержащие антитела по изобретению, представленные в настоящем описании или полученные способами, представленными в настоящем описании, и имеющие характеристики, представленные в настоящем описании. В рамках изобретения фармацевтические композиции могут содержать одно или более антител, связывающихся с GUCY2c, одно или более биспецифических антител, связывающихся с CD3 и опухолевым антигеном GUCY2c, и/или один или более полинуклеотидов, содержащих последовательности, кодирующие одно или более из этих антител. Эти композиции могут дополнительно содержать подходящие эксципиенты, такие как фармацевтически приемлемые эксципиенты, включая буферы, хорошо известные в этой области.

Изобретение также относится к способам получения любых из таких антител. Антитела по настоящему изобретению можно получать известными в этой области способами. Полипептиды можно получать посредством протеолитической или другой деградации антител, рекомбинантными способами (т.е. в виде единых или слитых полипептидов), как описано выше, или посредством химического синтеза. Полипептиды антител, в особенности, более короткие полипептиды до приблизительно 50 аминокислот, удобно получать посредством химического синтеза. Способы химического синтеза известны в этой области и коммерчески доступны. Например, антитело можно получать с помощью автоматизированного полипептидного синтезатора с использованием твердофазного способа. Также см., патенты США №№ 5807715, 4816567 и 6331415.

Гетероконъюгированные антитела, содержащие два ковалентно соединенных антитела, также входят в объем изобретения. Такие антитела используют для таргетинга клеток иммунной системы к нежелательным клеткам (патент США № 4676980) и для лечения инфекции ВИЧ (публикации PCT №№ WO91/00360 и WO92/200373; и европейская патентная публикация № EP03089). Гетероконъюгированные антитела можно получать любыми удобными способами перекрестной сшивки. Подходящие сшивающие средства и способы хорошо известны в этой области и описаны в патенте США № 4676980.

Химерные или гибридные антитела также можно получать in vitro известными способами синтетической химии белков, включая способы, включающие сшивающие средства. Например, иммунотоксины можно конструировать с использованием реакции дисульфидного обмена или посредством образования тиоэфирной связи. Примеры подходящих реагентов для этой цели включают иминотиолат и метил-4-меркаптобутиримидат.

В рекомбинантных гуманизированных антителах Fcγ-часть можно модифицировать во избежание взаимодействия с Fcγ-рецептором, и комплементом и иммунной системой. Способы получения таких антител описаны в публикации PCT № WO99/58572. Например, константную область можно конструировать так, чтобы она больше напоминала константные области человека во избежание иммунного ответа, если антитело используют в клинических испытаниях и лечении людей. См., например, патенты США №№ 5997867 и 5866692.

Антитела против GUCY2c и биспецифические антитела против CD3-GUCY2c, представленные в настоящем описании, могут содержать одну или более замен, инсерций и/или делеций аминокислот в каркасных областях и/или областях CDR вариабельных доменов тяжелых и легких цепей по сравнению с соответствующими последовательностями зародышевой линии, из которых получают антитела. Такие мутации можно устанавливать посредством сравнения аминокислотных последовательностей, представленных в настоящем описании, с последовательностями зародышевой линии, доступными, например, в общедоступных базах данных о последовательностях антител. Настоящее изобретение относится к антителам и их антигенсвязывающим фрагментам, полученным из любых аминокислотных последовательностей, представленных в настоящем описании, где одна или более аминокислот в одной или более каркасных областей и/или областей CDR подвергнуты мутации в соответствующие остатки последовательности зародышевой линии, из которой получали антитело, или в соответствующие остатки другой последовательности зародышевой линии человека, или в консервативную аминокислотную замену соответствующих остатков зародышевой линии (такие изменения в последовательности в совокупности в настоящем описании обозначают как "мутации зародышевой линии"). Специалист в этой области, начиная с последовательностей вариабельной области тяжелой и легкой цепи, представленных в настоящем описании, легко может получать многочисленные антитела и антигенсвязывающие фрагменты, содержащие одну или более отдельных мутаций зародышевой линии или их комбинаций. В некоторых вариантах осуществления все из остатков каркаса и/или CDR в доменах VH и/или VL подвергнуты обратной мутации в остатки, обнаруживаемые в исходной последовательности зародышевой линии, из которой получали антитело. В других вариантах осуществления только некоторые остатки подвергают обратной мутации в исходную последовательность зародышевой линии, например, только мутантные остатки, обнаруживаемые в первых 8 аминокислотах FR1 или в последних 8 аминокислотах FR4, или только мутантные остатки, обнаруживаемые в CDR1, CDR2 или CDR3. В других вариантах осуществления один или более остатков из каркаса и/или CDR подвергают мутации в соответствующие остатки другой последовательности зародышевой линии (т.е. последовательности зародышевой линии, отличающейся от последовательности зародышевой линии, из которой антитело получали исходно).

Кроме того, антитела по настоящему изобретению могут содержать любую комбинацию двух или более мутаций зародышевой линии в каркасных областях и/или областях CDR, например, где некоторые отдельные остатки подвергнуты мутации в соответствующий остаток конкретной последовательности зародышевой линии, в то время как некоторые другие остатки, отличающиеся от исходной последовательности зародышевой линии, сохраняют или подвергают мутации в соответствующий остаток другой последовательности зародышевой линии. После получения антитела и антигенсвязывающие фрагменты, содержащие одну или более мутаций зародышевой линии, легко можно тестировать на одно или более желаемых свойств, таких как улучшенная специфичность связывания, повышенная аффинность связывания, улучшенные или повышенные антагонистические или агонистические биологические свойства (соответственно), сниженная иммуногенность и т.д. Антитела и антигенсвязывающие фрагменты, полученные этим общим способом, включены в настоящем изобретении.

Настоящее изобретение также относится к антителам против GUCY2c и биспецифическим антителам против CD3-GUCY2c, содержащим варианты любых аминокислотных последовательностей HC VR, LC VR и/или CDR, представленных в настоящем описании, имеющих одну или более консервативных замен. Например, настоящее изобретение относится к антителам против GUCY2c и биспецифическим антителам против CD3-GUCY2c, имеющим аминокислотные последовательности HC VR, LC VR и/или CDR с, например, 10 или менее, 8 или менее, 6 или менее, 4 или менее и т.д. консервативных аминокислотных замен относительно любой из аминокислотных последовательностей HC VR, LC VR и/или CDR, как представлено в настоящем описании.

Таким образом, настоящее изобретение относится к модификациям вариантов антител и полипептидов по изобретению, как представлено в настоящем описании, включая функционально эквивалентные антитела, не влияющим значимо на их свойства, и вариантам, имеющим повышенную или сниженную активность и/или аффинность. Например, аминокислотную последовательность можно подвергать мутации для получения антитела с желаемой аффинностью связывания с GUCY2c и/или CD3. Модификация полипептидов является общепринятой практикой в этой области и не требует подробного обсуждения в настоящем описании. Примеры модифицированных полипептидов включают полипептиды с консервативными заменами аминокислотных остатков, одной или более делециями или добавлениями аминокислот, которые не изменяют значительно, неблагоприятно функциональную активность или которые приводят к созреванию (повышают) аффинность полипептида к его лиганду, или использование химических аналогов.

Инсерции аминокислотной последовательности включают, амино- и/или карбокси-концевые слияния с диапазоном длин от одного остатка до полипептидов, содержащих сотню или более остатков, а также инсерции отдельных или многочисленных аминокислотных остатков в последовательности. Примеры концевых инсерций включают антитело с N-концевым метионильным остатком или антитело, слитое с эпитопной меткой. Другие инсерционные варианты молекулы антитела включают слияние фермента или полипептида, повышающего время полужизни антитела в кровотоке, с N- или C-концом антитела.

Варианты с заменой включают удаление по меньшей мере одного аминокислотного остатка в молекуле антитела и встраивание другого остатка вместо него. Участки, представляющие наибольший интерес для замещающего мутагенеза, включают гипервариабельные области, но также предусмотрены изменения FR. Консервативные замены приведены в таблице 8 под заголовком "консервативные замены". Если такие замены приводят к изменению биологической активности, то можно встраивать более существенные изменения, обозначенные в таблице 8 как "примеры замен" или описанные ниже по отношению к классам аминокислот, и подвергать скринингу полученные продукты.

Таблица 8

Исходный остаток (природная аминокислота) Консервативные замены Примеры замен Ala (A) Val Val; Leu; Ile Arg (R) Lys Lys; Gln; Asn Asn (N) Gln Gln; His; Asp, Lys; Arg Asp (D) Glu Glu; Asn Cys (C) Ser Ser; Ala Gln (Q) Asn Asn; Glu Glu (E) Asp Asp; Gln Gly (G) Ala Ala His (H) Arg Asn; Gln; Lys; Arg Ile (I) Leu Leu; Val; Met; Ala; Phe; норлейцин Leu (L) Ile Норлейцин; Ile; Val; Met; Ala; Phe Lys (K) Arg Arg; Gln; Asn Met (M) Leu Leu; Phe; Ile Phe (F) Tyr Leu; Val; Ile; Ala; Tyr Pro (P) Ala Ala Ser (S) Thr Thr Thr (T) Ser Ser Trp (W) Tyr Tyr; Phe Tyr (Y) Phe Trp; Phe; Thr; Ser Val (V) Leu Ile; Leu; Met; Phe; Ala; норлейцин

Значительные модификации биологических свойств антитела осуществляют посредством выбора замен, значительно отличающихся по своему эффекты в отношении (a) структуры остова полипептида в области замены, например, в виде конформации листа или спирали, (b) заряда или гидрофобности молекулы в целевом участке или (c) объема боковой цепи. Природные аминокислотные остатки разделяют на группы с учетом общих свойств боковой цепи:

(1) Неполярные: норлейцин, Met, Ala, Val, Leu, Ile;

(2) Полярные незаряженные: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;

(3) Кислые (отрицательно заряженные): Asp, Glu;

(4) Основные (положительно заряженные): Lys, Arg;

(5) Остатки, влияющие на ориентацию цепи: Gly, Pro; и

(6) Ароматические: Trp, Tyr, Phe, His.

Неконсервативные замены осуществляют посредством замены члена одного из этих классов членом другого класса.

Любой остаток цистеина, не участвующий в поддержании правильной конформации антитела, также можно заменять, как правило, серином, для улучшения окислительной стабильности молекулы и предотвращения аномальной перекрестной сшивки. И наоборот, цистеиновые связи можно добавлять в антитело для улучшения его стабильности, в частности, если антитело является фрагментом антитела, таким как Fv-фрагмент.

Модификации аминокислот могут находиться в диапазоне от изменения или модификации одной или более аминокислот для завершения реконструкции области, такой как вариабельная область. Изменения вариабельной области могут приводить к изменению аффинности и/или специфичности связывания. В некоторых вариантах осуществления в домене CDR осуществляют от не более одной до пяти консервативных аминокислотных замен. В других вариантах осуществления в домене CDR осуществляют от не более одной до трех консервативных аминокислотных замен. В других вариантах осуществления домен CDR является CDR3 VH и/или CDR3 VL.

Модификации также включают гликозилированные и негликозилированные полипептиды, а также полипептиды с другими посттрансляционными модификациями, такими как, например, гликозилирование разными сахарами, ацетилирование и фосфорилирование. Антитела являются гликозилированными в консервативных положениях в их константных областях (Jefferis and Lund, Chem. Immunol. 65:111-128, 1997; Wright and Morrison, TibTECH 15:26-32, 1997). Олигосахаридные боковые цепи иммуноглобулинов влияют на функцию белка (Boyd et al., Mol. Immunol. 32:1311-1318, 1996; Wittwe and Howard, Biochem. 29:4175-4180, 1990) и внутримолекулярное взаимодействие между частями гликопротеина, которые могут влиять на конформацию и представлять собой трехмерную поверхность гликопротеина (Jefferis and Lund, выше; Wyss и Wagner, Current Opin. Biotech. 7:409-416, 1996). Олигосахариды также могут служить для таргетинга указанного гликопротеина к некоторым молекулам с учетом специфических распознающих структур. Также сообщают, что гликозилирование антител влияет на антителозависимую клеточную цитотоксичность (ADCC). В частности, сообщают, что клетки CHO с тетрациклин-регулируемой экспрессией β(1,4)-N-ацетилглюкозаминилтрансферазы III (GnTIII), гликозилтрансферазы, катализирующей образование GlcNAc в точках ветвления, имеют улучшенную активность ADCC (Umana et al., Mature Biotech. 17:176-180, 1999).

Гликозилирование антител, как правило, является N-связанным или O-связанным. Термин "N-связанный" относится к присоединению молекулы углевода к боковой цепи остатка аспарагина. Трипептидные последовательности аспарагин-X-серин, аспарагин-X-треонин и аспарагин-X-цистеин, где X является любой аминокислотой, за исключением пролина, являются распознаваемыми последовательностями для ферментативного присоединения молекулы углевода к боковой цепи аспарагина. Таким образом, наличие этих трипептидных последовательностей в полипептиде приводит к образованию потенциального участка гликозилирования. Термин "O-связанное" гликозилирование относится к присоединению одного из сахаров N-ацетилгалактозамина, галактозы или ксилозы к гидроксиаминокислоте, чаще всего, серину или треонину, хотя также можно использовать 5-гидроксипролин или 5-гидроксилизин.

Добавление участков гликозилирования в антитело удобно осуществлять посредством изменения аминокислотной последовательности таким образом, что она содержит одну или более из описанных выше трипептидных последовательностей (в случае N-связанных участков гликозилирования). Изменение также можно осуществлять посредством добавления или замены одним или более остатками серина или треонина в последовательности исходного антитела (в случае O-связанных участков гликозилирования).

Профиль гликозилирования антител также можно изменять без изменения основополагающей нуклеотидной последовательности. Гликозилирование, главным образом, зависит от клетки-хозяина, используемой для экспрессии антитела. Т.к. тип клеток, используемый для экспрессии рекомбинантных гликопротеинов, например, антител, в качестве потенциальных терапевтических средств, редко представляет собой нативную клетку, можно ожидать вариаций профиля гликозилирования антител (см., например, Hse et al., J. Biol. Chem. 272:9062-9070, 1997).

В дополнение к выбору клеток-хозяев, факторы, влияющие на гликозилирование во время рекомбинантной продукции антител, включают режим выращивания, состав средств, плотность культуры, оксигенацию, pH, схемы очистки т.п. Предложены различные способы изменения профиля гликозилирования, достигаемого в конкретном организме-хозяине, включая встраивание или гиперэкспрессию некоторых ферментов, вовлеченных в продукцию олигосахаридов (патенты США №№ 5047335, 5510261 и 5278299). Гликозилирование или некоторые типы гликозилирования можно ферментативно удалять из гликопротеина, например, с использованием эндогликозидаз H (Endo H), N-гликозидазы F, эндогликозидазы F1, эндогликозидазы F2, эндогликозидазы F3. Кроме того, рекомбинантную клетку-хозяина можно генетически конструировать так, чтобы она была дефектной по процессингу некоторых типов полисахаридов. Эти и схожие способы хорошо известны в этой области.

Другие способы модификации включают использование способов связывания, известных в этой области, включая в качестве неограничивающих примеров, ферментативные способы, окислительную замену и хелатирование. Модификации можно использовать, например, для присоединения меток для иммунологических анализов. Модифицированные полипептиды получают способами, общепринятыми в этой области, и их можно подвергать скринингу с использованием стандартных способов, известных в этой области, некоторые из которых описаны ниже и в примерах.

В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело содержит модифицированную константную область, такую как константная область, имеющая повышенную аффинность к Fc-рецептору гамма человека, является иммунологически инертным или частично инертным, например, не запускает комплемент-опосредованный лизис, не стимулирует антителозависимую клеточную цитотоксичность (ADCC) или не активирует макрофаги; или имеет сниженные активности (по сравнению с немодифицированным антителом) в любом одном или более из следующего: запуске комплемент-опосредованного лизиса, стимуляции антителозависимой клеточной цитотоксичности (ADCC) или активации микроглии. Для достижения оптимального уровня и/или комбинации эффекторных функций можно использовать различные модификации константной области. См., например, Morgan et al., Immunology 86:319-324, 1995; Lund et al., J. Immunology 157:4963-9 157:4963-4969, 1996; Idusogie et al., J. Immunology 164:4178-4184, 2000; Tao et al., J. Immunology 143: 2595-2601, 1989; и Jefferis et al., Immunological Reviews 163:59-76, 1998. В некоторых вариантах осуществления константная область модифицирована, как описано в Eur. J. Immunol., 29:2613-2624, 1999; заявке PCT № PCT/GB99/01441; и/или заявке Великобритании № 9809951.8. В других вариантах осуществления константная область является агликозилированной по N-связанному гликозилированию. В некоторых вариантах осуществления константная область является агликозилированной по N-связанному гликозилированию в результате мутации гликозилированного аминокислотного остатка или фланкирующих остатков, являющихся частью последовательности распознавания N-гликозилирования в константной области. Например, N-участок гликозилирования N297 можно подвергать мутации в A, Q, K или H. См., Tao et al., J. Immunology 143: 2595-2601, 1989; и Jefferis et al., Immunological Reviews 163:59-76, 1998. В некоторых вариантах осуществления константная область является агликозилированной по N-связанному гликозилированию. Константная область может являться агликозилированной по N-связанному гликозилированию ферментативно (например, посредством удаления углевода с помощью фермента ПНГазы) или посредством экспрессии в клетке-хозяине с недостаточностью гликозилирования.

Другие модификации антител включают антитела, модифицированные, как описано в публикации PCT № WO99/58572. Эти антитела содержат, в дополнение к связывающему домену, направленному против молекулы-мишени, эффекторный домен, имеющий аминокислотную последовательность, по существу, гомологичную всей или части константной области тяжелой цепи иммуноглобулина человека. Эти антитела могут связываться с молекулой-мишенью без запуска значительного комплемент-зависимого лизиса или клеточно-опосредованного разрешения мишени. В некоторых вариантах осуществления эффекторный домен может специфически связываться с FcRn и/или FcγRIIb. Они, как правило, основаны на химерных доменах, полученных из двух или более доменов CH2 тяжелой цепи иммуноглобулина человека. Антитела, модифицированные таким образом, особенно пригодны для использования в хронической терапии антителами, для избегания воспалительных и других нежелательных реакций на общепринятую терапию антителами.

Настоящее изобретение включает аффинно зрелые варианты осуществления. Например, аффинно зрелые антитела можно получать известными в этой области способами (Marks et al., Bio/Technology, 10:779-783, 1992; Barbas et al., Proc Nat. Acad. Sci, USA 91:3809-3813, 1994; Schier et al., Gene, 169:147-155, 1995; Yelton et al., J. Immunol., 155:1994-2004, 1995; Jackson et al., J. Immunol., 154(7):3310-9, 1995, Hawkins et al., J. Mol. Biol., 226:889-896, 1992; и публикация PCT № WO04/058184).

Следующие способы можно использовать для коррекции аффинности антитела и для характеризации CDR. Один из способов характеризации CDR антитела и/или изменения (такого как улучшение) аффинности связывания полипептида, такого как антитело, называется "сканирующий мутагенез библиотеки". Как правило, сканирующий мутагенез библиотеки осуществляют следующим образом. Одно или более положений аминокислот в CDR заменяют двумя или более (например, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20) аминокислотами с использованием способов, известных в этой области. Таким образом получают небольшие библиотеки клонов (в некоторых вариантах осуществления одну для каждого положения аминокислоты, подвергаемого анализу), каждая из которых имеет сложность два или более члена (если две или более аминокислот заменяют в каждом положении). Как правило, библиотека также включает клон, содержащий нативную (незамещенную) аминокислоту. Небольшое количество клонов, например, приблизительно 20-80 клонов (в зависимости от сложности библиотеки), из каждой библиотеки подвергают скринингу на аффинность связывания с полипептидом мишенью (или другой мишенью связывания) и идентифицируют кандидатов с повышенным, тем же, сниженным или отсутствующим связыванием. Способы определения аффинности связывания хорошо известны в этой области. Аффинность связывания можно определять с использованием анализа поверхностного плазмонного резонанса BIACORE™, с помощью которого определяют различия аффинности связывания приблизительно в 2 раза или более. BIACORE™ особенно подходит, если исходное антитело уже связывается с относительно высокой аффинностью, например, KD приблизительно 10 нМ или менее. Скрининг с использованием анализа поверхностного плазмонного резонанса BIACORE™ описан в примерах в настоящем описании.

Аффинность связывания можно определять с использованием биосенсора Kinexa, сцинтилляционного анализа сближения, ELISA, иммунологического анализа ORIGEN (IGEN), гашения флуоресценции, переноса флуоресценции и/или дрожжевого дисплея. Аффинность связывания также можно подвергать скринингу с использованием подходящего биологического анализа.

В некоторых вариантах осуществления каждое положение аминокислоты в CDR заменяют (в некоторых вариантах осуществления одно за один раз) всеми 20 природными аминокислотами с использованием известных в этой области способов мутагенеза (некоторые из которых представлены в настоящем описании). Это приводит к получению небольших библиотек клонов (в некоторых вариантах осуществления одной библиотеки на каждое положение аминокислоты, подвергаемое анализу), каждая из которых имеет сложность 20 членов (если все 20 аминокислот заменяют в каждом положении).

В некоторых вариантах осуществления библиотека, подлежащая скринингу, содержит замены в двух или более положениях, которые могут находиться в одной и той же CDR или двух или более CDR. Таким образом, библиотека может содержать замены в двух или более положениях в одной CDR. Библиотека может содержать замену в двух или более положениях в двух или более CDR. Библиотека может содержать замену в 3, 4, 5 или более положениях, где указанные положения, обнаруживаемые в двух, трех, четырех, пяти или шести CDR. Замену можно получать с использованием кодонов с низкой избыточностью. См., например, таблицу 2 из Balint et al., Gene 137(1):109-18, 1993.

Кандидатов с улучшенным связыванием можно секвенировать, таким образом, идентифицируя мутанта с заменой в CDR, приводящей к улучшенной аффинности (также обозначаемой как "улучшенная" замена). Кандидатов, которые связываются, также можно секвенировать, таким образом, идентифицируя замену CDR, сохраняющую связывание.

Можно осуществлять множество раундов скрининга. Например, кандидаты (каждый из которых содержит замену аминокислоты в одном или более положениях одной или более CDR) с улучшенным связыванием также подходят для дизайна второй библиотеки, содержащей по меньшей мере исходную и замещенную аминокислоту в каждом улучшенном положении CDR (т.е. положении аминокислоты в CDR, в котором мутант с заменой демонстрирует улучшенное связывание). Получение и скрининг или селекцию этой библиотеки дополнительно описывают ниже.

Сканирующий мутагенез библиотеки также представляет собой способ характеризации CDR, поскольку частота клонов с улучшенным связыванием, тем же связыванием, сниженным связыванием или отсутствием связывания также дает информацию, касающуюся важности каждого положения аминокислоты для стабильности комплекса антитело-антиген. Например, если положение CDR сохраняет связывание при изменении во все 20 аминокислот, это положение идентифицируют как положение, которое вряд ли требуется для связывания антигена. И наоборот, если положение в CDR сохраняет связывание лишь при небольшой доле замен, это положение идентифицируют как положение, важное для функции CDR. Таким образом, способами сканирующего мутагенеза библиотеки получают информацию, касающуюся положений в CDR, которые можно изменять во множество разных аминокислот (включая все 20 аминокислот), и положений в CDR, которые нельзя изменять или которые можно изменять в несколько аминокислот.

Кандидатов с улучшенной аффинностью можно комбинировать во второй библиотеке, включающей улучшенную аминокислоту, исходную аминокислоту в этом положении, и которая может дополнительно включать дополнительные замены в этом положении, в зависимости от сложности библиотеки, желаемой или допускаемой с использованием желаемого способа скрининга или селекции. Кроме того, при желании, смежное положение аминокислоты можно рандомизировать в по меньшей мере две или более аминокислот. Рандомизация смежных аминокислот может делать возможной дополнительную конформационную гибкость в мутантной CDR, что, в свою очередь, может делать возможным или облегчать встраивание большего количества улучшающих мутаций. Библиотека также может содержать замену в положениях, не демонстрирующих улучшенную аффинность в первом раунде скрининга.

Вторую библиотеку подвергают скринингу или селекции по членам библиотеки с улучшенной и/или измененной аффинностью связывания с использованием любого известного в этой области способа, включая скрининг с использованием анализа поверхностного плазмонного резонанса BIACORE™, и селекцию с использованием любого известного в этой области способа селекции, включая фаговый дисплей, дрожжевой дисплей и рибосомный дисплей.

Настоящее изобретение также относится к композициям, содержащим антитела, конъюгированные (например, связанные) со средством, облегчающим связывание с твердой подложкой (такой как биотин или авидин). Для простоты, как правило, можно ссылаться на антитела с пониманием того, что эти способы используют по отношению к любому из вариантов осуществления антител против GUCY2c, представленных в настоящем описании. Термин "конъюгация", как правило, относится к связыванию этих компонентов, как представлено в настоящем описании. Связывания (как правило, представляющего собой фиксацию этих компонентов вблизи друг друга по меньшей мере для введения) можно достигать рядом способов. Например, прямая реакция между средством и антителом возможна, если каждый из компонентов включает заместитель, способный реагировать с другим заместителем. Например, нуклеофильная группа, такая как аминогруппа или сульфгидрильная группа, на одном компоненте может реагировать с карбонил-содержащей группой, такой как ангидрид или галогенангидрид, или с алкильной группой, содержащей хорошую уходящую группу (например, галид) на другом.

В некоторых вариантах осуществления в качестве первой стадии выбирают первый и второй полипептид (и любые дополнительные полипептиды, образующие биспецифическое антитело). Как правило, нуклеиновую кислоту, кодирующую эти полипептиды, необходимо выделять таким образом, что ее можно изменять так, чтобы она кодировала выступ, или впадину, или и то, и другое, как определено в настоящем описании. Однако мутации можно вносить синтетическими способами, например, с использованием пептидного синтезатора. Кроме того, в случае, если замещенный остаток является неприродным остатком, доступен способ по Noren et al., выше, для получения полипептидов, имеющих такие замены. Кроме того, часть биспецифического антитела соответствующим образом получают рекомбинантно в культуре клеток, а другие части молекулы получают указанными выше способами.

Способы выделения антител и получения биспецифических антител являются следующими. Однако следует понимать, что биспецифические антитела можно получать из других полипептидов, или они могут включать другие полипептиды, с использованием способов, известных в этой области. Например, нуклеиновую кислоту, кодирующую интересующий полипептид (например, лиганд, рецептор или фермент), можно выделять из библиотеки кДНК, полученной из ткани, которая, как считают, содержит мРНК полипептида и экспрессирует ее на детектируемом уровне. Библиотеки подвергают скринингу с использованием зондов (таких как антитела или олигонуклеотиды из приблизительно 20-80 оснований), сконструированных для идентификации интересующего гена или белка, кодируемого им. Скрининг кДНК или геномной библиотеки с использованием выбранного зонда можно осуществлять стандартными способами, как описано в главах 10-12 Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989).

Как указано выше, термин "биспецифическое антитело" относится к комплексу двух или более полипептидных цепей, каждая из которых содержит по меньшей мере одну область VL антитела и одну область VH антитела или ее фрагмент, где области VL и VH в каждой полипептидной цепи получают из разных антител. В конкретных аспектах биспецифическое антитело включает димеры или тетрамеры полипептидных цепей, содержащие области VL и VH. Отдельные полипептидные цепи, содержащие мультимерные белки, можно ковалентно соединять по меньшей мере с одним другим пептидом мультимера посредством межцепочечных дисульфидных связей.

Биспецифические антитела по настоящему изобретению одновременно направленно воздействуют на T-клетки (CD3) и опухолевые клетки (GUCY2c) и успешно направляют и активируют T-клеточную цитотоксичность в отношении опухолевых клеток, экспрессирующих GUCY2c.

Каждая полипептидная цепь биспецифического антитела содержит область VL и область VH, которые можно ковалентно связывать с помощью линкера, где линкер является глицин-сериновым линкером, содержащим остатки глицина и серина таким образом, что связывающие домены антитела ограничены в отношении самосборки. В конкретном варианте осуществления глицин-сериновый линкер является линкером 1, содержащим последовательность SEQ ID NO: 190. Кроме того, каждая полипептидная цепь содержит домен гетеродимеризации, способствующий гетеродимеризации и/или стабилизации множества полипептидных цепей и снижающий вероятность гомодимеризации разных полипептидных цепей. Домен гетеродимеризации может находиться на N-конце полипептидной цепи или C-конце. Домен гетеродимеризации может содержать цистеиновый линкер (линкер 2), имеющий длину 1, 2, 3, 4, 5, 6 или более аминокислотных остатков. Взаимодействие двух полипептидных цепей может приводить к образованию двух пар VL/VH, образующих два эпитоп-связывающих домена, т.е. бивалентной молекулы. Ни одна из областей VH или VL не ограничена в каком-либо положении в полипептидной цепи, т.е. не ограничена амино-концом или карбокси-концом, области также не ограничены по своим положениям относительно друг друга, т.е. область VL может являться N-концевой относительно области VH и наоборот. Единственным ограничением является то, чтобы комплементарная полипептидная цепь была доступна для образования функционального биспецифического антитела. Если области VL и VH получают из антител, специфических для разных антигенов, для образования функционального биспецифического антитела необходимо взаимодействие двух разных полипептидных цепей, т.е. образование гетеродимера. В отличие от этого, если две разные полипептидные цепи свободны в своем взаимодействии, например, в рекомбинантной системе экспрессии, одна из которых содержит VLA и VHB (A является первым эпитопом, и B является вторым эпитопом), а другая содержит VLB и VHA, два разных участка связывания могут образовывать: VLA-VHA и VLB-VHB. Во всех парах полипептидных цепей биспецифического антитела возможно смещение или неправильное связывание двух цепей, например, взаимодействие областей VL-VL или VH-VH. Однако очистку функциональных биспецифических антител легко осуществлять с учетом иммуноспецифичности правильно димеризованного участка связывания с использованием любого способа на основе аффинности, известного в этой области или представленного в настоящем описании, например, аффинной хроматографии.

В одном из вариантов осуществления полипептидные цепи биспецифического антитела могут содержать различные линкеры и пептиды. Линкеры и пептиды могут содержать 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или более аминокислот. В некоторых вариантах осуществления VL против GUCY2c и VH против CD3 соединяют с помощью линкера 1 или линкера 2; и VL против CD3 и VH против GUCY2c соединяют с помощью линкера 1 или линкера 2. В некоторых таких вариантах осуществления линкер 1 содержит последовательность SEQ ID NO: 190. В других вариантах осуществления линкер 2 содержит последовательность SEQ ID NO: 191.

В некоторых вариантах осуществления домен 1 ковалентно связывают с первым способствующим гетеродимеризации доменом посредством цистеинового линкера и домен 2 ковалентно связывают со вторым способствующий гетеродимеризации доменом посредством цистеинового линкера. Каждый из цистеиновых линкеров включает по меньшей мере один остаток цистеина, делающий возможным образование внутримолекулярной дисульфидной связи. В дополнительных вариантах осуществления описанного выше цистеиновый линкер содержит по меньшей мере пять аминокислот. В некоторых таких вариантах осуществления цистеиновый линкер является линкером 3, содержащим последовательность SEQ ID NO: 192.

В некоторых вариантах осуществления первую полипептидную цепь ковалентно связывают со второй полипептидной цепью посредством по меньшей мере одной дисульфидной связи. В некоторых таких вариантах осуществления по меньшей мере одна дисульфидная связь образуется между линкером 3 первой полипептидной цепи и линкером 3 второй полипептидной цепи. В другом таком варианте осуществления по меньшей мере одна дисульфидная связь образуется между первым способствующим гетеродимеризации доменом и вторым способствующим гетеродимеризации доменом. В конкретных вариантах осуществления каждая дисульфидная связь образуется при связывании двух остатков цистеина.

Биспецифические антитела по изобретению одновременно могут связываться с двумя отдельными и отличающимися эпитопами. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один участок связывания эпитопа является специфическим в отношении детерминанты CD3, экспрессирующейся на иммунной эффекторной клетке, например, экспрессирующейся на T-лимфоцитах. В одном из вариантов осуществления молекула биспецифического антитела связывается с детерминантой эффекторной клетки, а также активирует эффекторную клетку.

В конкретных вариантах осуществления биспецифическое антитело по настоящему изобретению (a) связывается с внеклеточным доменом GUCY2c человека, (b) демонстрирует повышенное время полужизни в сыворотке и опухоли от 30 мин до 100 дней; и/или (c) демонстрирует более низкое значение EC₅₀ от 0,0001 нМ до 100 нМ в присутствии повышенных уровней экспрессии GUCY2c или повышенных уровней плотности рецепторов.

В одном из вариантов осуществления эпитоп-связывающий домен может связываться с опухолеспецифическим антигеном GUCY2c, ассоциированным с раком молочной железы, яичников, щитовидной железы, предстательной железы, шейки матки, легких (включая, в качестве неограничивающих примеров, немелкоклеточный рак легких и мелкоклеточный рак легких), мочевого пузыря, эндометрия, головы и шеи, яичек и глиобластомой. В некоторых вариантах осуществления злокачественное новообразование является злокачественным новообразованием пищеварительной системы, выбранным из группы, состоящей из злокачественного новообразования пищевода, желудка, тонкого кишечника, толстого кишечника, прямой кишки, анального канала, печени, желчного пузыря, аппендикса, желчных протоков и поджелудочной железы. В конкретных вариантах осуществления терапия активирует ответ цитолитических T-клеток.

Биспецифические антитела по настоящему изобретению содержат антигенсвязывающие домены, как правило, полученные из иммуноглобулинов или антител. Антитела, из которых получают связывающие домены, используемые в способах по изобретению, можно получать из любого животного, включая птиц и млекопитающих (например, человека, не являющегося человеком примата, мышь, осла, овцу, кролика, козу, морскую свинку, верблюда, лошадь или курицу). Предпочтительно, антитела являются человеческими или гуманизированными моноклональными антителами.

Биспецифические антитела по настоящему изобретению можно охарактеризовывать различными способами. В частности, молекулы по изобретению можно анализировать на способность иммуноспецифически связываться с антигеном. Молекулы, идентифицированные как иммуноспецифически связывающиеся с антигеном, затем можно анализировать на их специфичность и аффинность к антигену.

Биспецифическое антитело по настоящему изобретению можно получать различными способами, хорошо известными в этой области, включая синтез белков de novo и рекомбинантную экспрессию нуклеиновых кислот, кодирующих связывающие белки. Желаемые последовательности нуклеиновой кислоты можно получать рекомбинантными способами (например, посредством ПЦР-мутагенеза ранее полученного варианта желаемого полинуклеотида) или посредством твердофазного синтеза ДНК. Как правило, используют способы рекомбинантной экспрессии. В одном из аспектов настоящее изобретение относится к полинуклеотиду, содержащему последовательность, кодирующую VH и/или VL против CD3; в другом аспекте изобретение относится к полинуклеотиду, содержащему последовательность, кодирующую VH и/или VL против GUCY2c. Из-за вырожденности генетического кода различные последовательности нуклеиновой кислоты кодируют каждую аминокислотную последовательность иммуноглобулина, и настоящее изобретение относится ко всем нуклеиновым кислотам, кодирующим связывающие белки, представленные в настоящем описании.

Биспецифическое антитело по настоящему изобретению может содержать два scFV-домена, связывающихся с антигеном-мишенью и CD3, слитые с Fc-доменом IgG. В одном из вариантов осуществления изобретения биспецифическое антитело содержит два scFV-домена, связывающихся с GUCY2c и CD3 эпсилон, слитые с Fc-доменом IgG1. В частности, на фигурах 1A, 1B, 1C и 1D показаны четыре альтернативные схемы биспецифических антител против CD3-GUCY2c. Биспецифическое антитело содержит первый способствующий гетеродимеризации и второй способствующий гетеродимеризации домен. Каждый первый способствующий гетеродимеризации и второй способствующий гетеродимеризации домен может содержать домен CH2 и/или домен CH3 Fc-области иммуноглобулина, где домен CH2 и/или домен CH3 изменяют так, чтобы он содержал выступ или впадину. Модификации Fc-части биспецифического антитела описаны ниже.

В аспекте настоящего изобретения биспецифическое антитело, как показано на фигурах 1A, 1B, 1C и 1D, содержит первую полипептидную цепь и вторую полипептидную цепь.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к биспецифическому антителу, представленному в настоящем описании, где: (a) первая полипептидная цепь содержит в направлении от N-конца к C-концу: (i) домен 1,содержащий VL антитела против GUCY2c (VL против GUCY2c) и VH антитела против CD3 (VH против CD3), и (ii) первый способствующий гетеродимеризации домен; и (b) вторая полипептидная цепь содержит в направлении от N-конца к C-концу: (i) домен 2, содержащий VL антитела против CD3 (VL против CD3) и VH антитела против GUCY2c (VH против GUCY2c), и (ii) второй способствующий гетеродимеризации домен.

В другом аспекте изобретение относится к биспецифическому антителу, представленному в настоящем описании, где: (a) первая полипептидная цепь содержит в направлении от N-конца к C-концу: (i) домен 1, содержащий VL против CD3 и VH против GUCY2c, и (ii) первый способствующий гетеродимеризации домен; и (b) вторая полипептидная цепь содержит в направлении от N-конца к C-концу: (i) домен 2, содержащий VL против GUCY2c и VH против CD3, и (ii) второй способствующий гетеродимеризации домен.

В еще одном аспекте изобретение относится к биспецифическому антителу, представленному в настоящем описании, где: (a) первая полипептидная цепь содержит в направлении от N-конца к C-концу: (i) домен 1, содержащий VH против GUCY2c и VL против CD3, и (ii) первый способствующий гетеродимеризации домен; и (b) вторая полипептидная цепь содержит в направлении от N-конца к C-концу: (i) домен 2, содержащий VH против CD3 и VL против GUCY2c, и (ii) второй способствующий гетеродимеризации домен.

В другом аспекте изобретение относится к биспецифическому антителу, представленному в настоящем описании, где: (a) первая полипептидная цепь содержит в направлении от N-конца к C-концу: (i) домен 1, содержащий VH против CD3 и VL против GUCY2c, и (ii) первый способствующий гетеродимеризации домен; и (b) вторая полипептидная цепь содержит в направлении от N-конца к C-концу: (i) домен 2, содержащий VH против GUCY2c и VL против CD3 и (ii) второй способствующий гетеродимеризации домен.

В некоторых вариантах осуществления описанного выше VL против GUCY2c и VH против GUCY2c образуют домен, специфически связывающийся с GUCY2c; и VL против CD3 и VH против CD3 образуют домен, специфически связывающийся с CD3.

В дополнительных вариантах осуществления любого из описанных выше биспецифическое антитело по настоящему изобретению содержит (a) CDR1 VH против GUCY2c, содержащую последовательность SEQ ID NO: 12, 20, 27, 34, 42, 74, 257, 258, 259, 260,или 261; (b) CDR2 VH против GUCY2c, содержащую последовательность SEQ ID NO: 13, 21, 28, 35, 43, 53, 66, 68, 70, 72, 75, 262, 263, 264, 265, 266 или 267; (c) CDR3 VH против GUCY2c, содержащую последовательность SEQ ID NO: 14, 22, 29, 36 или 44; (d) CDR1 VL против GUCY2c, содержащую последовательность SEQ ID NO: 93, 101, 105, 107, 113, 120, 148, 153, 163 или 167; (e) CDR2 VL против GUCY2c, содержащую последовательность SEQ ID NO: 78, 94, 102, 108, 114, 141, 144, 146, 149, 151, 157, 159, 161, 164 или 168; и (f) CDR3 VL против GUCY2c, содержащую последовательность SEQ ID NO: 95, 109, 115, 121, 142, 154, 165 или 169.

В конкретном варианте осуществления биспецифическое антитело по настоящему изобретению содержит (a) CDR1 VH против GUCY2c, содержащую последовательность SEQ ID NO: 74; (b) CDR2 VH против GUCY2c, содержащую последовательность SEQ ID NO: 75; (c) CDR3 VH против GUCY2c, содержащую последовательность SEQ ID NO: 29; (d) CDR1 VL против GUCY2c, содержащую последовательность SEQ ID NO: 148; (e) CDR2 VL против GUCY2c, содержащую последовательность SEQ ID NO: 149; и (f) CDR3 VL против GUCY2c, содержащую последовательность SEQ ID NO: 142.

В конкретных вариантах осуществления биспецифическое антитело содержит: (a) область VH против GUCY2c, содержащую последовательность SEQ ID NO: 73; и (b) область VL против GUCY2c, содержащую последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 147.

В дополнительных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к биспецифическим антителам, содержащим (a) CDR1 VH против CD3, содержащую последовательность SEQ ID NO: 2; (b) CDR2 VH против CD3, содержащую последовательность SEQ ID NO: 3 или 10; (c) CDR3 VH против CD3, содержащую последовательность SEQ ID NO: 4; (d) CDR1 VL против CD3, содержащую последовательность SEQ ID NO: 77, 85, или 91; (e) CDR2 VL против CD3, содержащую SEQ ID NO: 78; и (f) CDR3 VL против CD3, содержащую последовательность SEQ ID NO: 79.

В конкретном варианте осуществления настоящее изобретение относится к биспецифическому антителу, содержащему (a) CDR1 VH против CD3, содержащую последовательность SEQ ID NO: 2; (b) CDR2 VH против CD3, содержащую последовательность SEQ ID NO: 10; (c) CDR3 VH против CD3, содержащую последовательность SEQ ID NO: 4; (d) CDR1 VL против CD3, содержащую последовательность SEQ ID NO: 91; (e) CDR2 VL против CD3, содержащую последовательность SEQ ID NO: 78; и (f) CDR3 VL против CD3, содержащую последовательность SEQ ID NO: 79.

В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к биспецифическому антителу, содержащему: (a) область VH против CD3, содержащую последовательность SEQ ID NO: 1, 9 или 273; и (b) область VL против CD3, содержащую последовательность SEQ ID NO: 76, 84, 90, 274, 275 или 276. В конкретном варианте осуществления биспецифическое антитело по настоящему изобретению содержит: (a) область VH против CD3, содержащую последовательность SEQ ID NO: 9; и (b) область VL против CD3, содержащую последовательность SEQ ID NO: 90.

В другом аспекте по изобретению линкер 3 может содержать укороченную нижнюю шарнирную область IgG1 человека, имеющую последовательность GCPPCP (SEQ ID NO: 192), с по меньшей мере одним остатком глицина, предшествующим нижней шарнирной области.

В одном из аспектов первый способствующий гетеродимеризации домен может содержать Fc-цепь, содержащую домен CH2 и/или CH3, измененную так, чтобы содержать Fc-цепь с выступом, содержащую последовательность SEQ ID NO: 188, 196, 199, 202, 205, 210, 216, или 248, 282, 284 или 286; или Fc-цепь с впадиной, содержащую последовательность SEQ ID NO: 189, 197, 200, 203, 206, 211, 217, 220, 249, 283, 285 или 287. В другом аспекте второй способствующий гетеродимеризации домен может содержать Fc-цепь, содержащую домен CH2 и/или CH3, измененную так, чтобы содержать Fc-цепь с выступом, содержащую последовательность SEQ ID NO: 188, 196, 199, 202, 205, 210, 216 или 248, 282, 284 или 286, если такая первая гетеродимерная область содержит Fc-цепь с впадиной, или Fc-цепь с впадиной, содержащую последовательность SEQ ID NO: 189, 197, 200, 203, 206, 211, 217, 220, 249, 283, 285 или 287, если такая первая гетеродимерная область содержит Fc-цепь с выступом (таблица 7).

В таблице 9 приведены последовательности нуклеиновых кислот первой полипептидной цепи и второй полипептидной цепи биспецифических антител с различными антителами против GUCY2c м CD3, представленными в настоящем описании. В SEQ ID NO: 246 и 247 приведены соответствующие нуклеотидные последовательности по изобретению.

Таблица 9

Первая полипептидная цепь GUCY2C-1608 (SEQ ID NO: 246) gacatccagctgacccagtctccatcctccctgtctgcatctgtaggagacagagtcaccatcacttgcagagccagtgaaagtgttgattattatggcagtagtttattgcagtggtatcagcagaaaccagggaaagcccctaagctcctgatctatgctgcatccaaactagcttctggggtcccatcaaggttcagtggcagtggatctgggacagatttcactctcaccatcagcagtctgcaacctgaagattttgcaacttactactgtcagcaaactcggaaagcgtatacgtttggccaggggaccaagctggagatcaaaggtggaggtagcgggggcggcggggaagttcaactcgttgagtctggcgggggattggttcaacccggtggaagccttagattgtcatgtgccgcctccggctttacatttagcgactattacatgacctgggtgagacaagctccaggcaaaggacttgaatgggtggcctttatcagaaatcaggcccgcggctacacaagcgaccataatccctccgtgaaaggaagatttaccatcagccgggacaatgctaaaaattcactttaccttcaaatgaactctcttagagccgaggacaccgccgtatactactgcgcaagagatagaccaagttattacgtcctggattactggggccagggaacaaccgtcaccgtgtcttctggatgcccaccgtgcccagcacctgaagccgctggggcaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtgcaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgtggtgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctatagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtcccccggaaag Вторая полипептидная цепь GUCY2C-1608 (SEQ ID NO: 247) gacatccagatgacccagtccccctcttctctgtctgcctctgtgggcgacagagtgaccatcacctgcacaagctcacagtcactgtttaatgtccgcagccagaaaaactatcttgcgtggtatcagcagaagcctggcaaggctcccaagctgctgatctactgggccagtacacgagaatccggcgtgccttccagattctccggctctggctctggcaccgatttcaccctgaccatctcctccctccagcctgaggatttcgccacctactactgcaaacagtcttacgaccttttcacttttggcggcggaacaaaggtggagatcaagggcggaggtggatctggcggcggaggcgaggtgcagctggtggagtctgggggaggcttggtccagcctggggggtccctgagactctcctgtgcagcctctggcttcaccttcagcagctactggatgcactgggtccgccaggctccagggaaggggctggagtggattggagagattaaacctagcaacgaacttactaacgtccatgaaaagttcaaggaccgattcaccatctccgtggacaaggccaagaactcagcctatctgcaaatgaacagcctgagagccgaggacacggctgtgtattactgtacaagaacgattacgacgacggagggatactggttcttcgatgtctggggccaagggacactggtcaccgtctcttcaggatgtccaccgtgcccagcacctgaagccgctggggcaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatgccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgtcctgcgcggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctcgttagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtcccccggaaag

Эффекторные нуль-мутации в CH2-CH3 IgG1 человека

Fc-цепь IgG1 человека модифицировали для встраивания мутаций L234A, L235A и G237A (SEQ ID NO: 187, нумерация в соответствии с индексом EU) с использованием стандартного, направляемого праймерами ПЦР-мутагенеза для снижения эффекторной функции по причине связывания с FcγRIII, получая нуль-фенотип эффекторной функции (Canfield et al., J. Exp. Med (1991) 173:1483-1491; Shields et al., J. Biol. Chem.(2001) 276:6591-604).

Мутации "выступы-во-впадины" в CH2-CH3 IgG1 человека

"Выступы-во-впадины" представляют собой эффективную стратегию дизайна, известную в этой области для конструирования гомодимеров тяжелой цепи антитела для гетеродимеризации. В этом подходе вариант с "выступом" получали посредством замены небольшой аминокислоты более крупной аминокислотой в одной цепи Fc-цепи IgG1, например, Y349C и T366W, (нумерация в соответствии с индексом EU). "Выступ" конструировали для вставки во "впадину" в домене CH3 комплементарной цепи Fc-цепи, полученной посредством замены крупного остатка меньшим остатком, например, S354C, T366S, L368A и Y407V (нумерация в соответствии с индексом EU).

В некоторых вариантах осуществления встраивали комплементарные мутации для достижения гетеродимеризации получаемых Fc-цепей, таким образом, что каждая Fc-цепь будет нести набор мутаций, Y349C и T366W в случае Fc-цепи с выступом (SEQ ID NO: 188), или S354C, T366S, L368A и Y407V в случае Fc-цепи с впадиной (SEQ ID NO: 189), как показано в таблице 10. При совместной трансфекции в подходящую ДНК млекопитающего-хозяина, кодирующую аминокислотные последовательности например SEQ ID NO: 246 и 247, получают Fc-домен, т.е. преимущественно биспецифическое антитело содержит одну Fc-цепь с выступом, связанную с одной Fc-цепью с впадиной.

Таблица 10

Мутации Fc-цепи с "выступом" (SEQ ID NO: 188) APEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG Мутации Fc-цепи с "впадиной" (SEQ ID NO: 189) APEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCREEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG

Биспецифические антитела против CD3-GUCY2c по настоящему изобретению являются стабильными против агрегации в исследованиях термической стабильности и мощными слитыми белками биспецифическое антитело-Fc против CD3 и GUCY2c человека. Fc-домен с "выступом-во-впадину" делает возможной улучшенную экспрессию в клетках CHO и улучшенную очистку, приводящую к высокой чистоте желаемого гетеродимера. Мутации, сконструированные в Fc-домене, устраняют связывание FcγR, таким образом, потенциально позволяя избегать ADCC-опосредованного истощения T-клеток. Кроме того, включение Fc-домена в биспецифическое антитело повышает стабильность молекул, анализируемую посредством дифференциальной сканирующей калориметрии (DSC).

Биспецифическое антитело можно конструировать так, чтобы оно содержало по меньшей мере один остаток цистеина, который может взаимодействовать с соответствующим остатком цистеина на другой полипептидной цепи по изобретению с образованием межцепочечной дисульфидной связи. Межцепочечные дисульфидные связи могут служить для стабилизации биспецифического антитела, улучшая экспрессию и выделение в рекомбинантных системах, что приводит к стабильному и единообразному составу, а также улучшая стабильность выделенного и/или очищенного продукта in vivo. Остаток или остатки цистеина можно встраивать в виде отдельной аминокислоты или как часть более крупной аминокислотной последовательности, например, шарнирной области, в любой части полипептидной цепи. В конкретном аспекте по меньшей мере один остаток цистеина конструируют так, чтобы он находился на C-конце полипептидной цепи.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к биспецифическому антителу, специфически связывающемуся с GUCY2c и конкурирующему за связывание с биспецифическим антителом, представленным в настоящем описании. В некоторых таких вариантах осуществления биспецифическое антитело специфически связывается с эпитопом GUCY2c.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к биспецифическому антителу, специфически связывающемуся с GUCY2c и CD3, где биспецифическое антитело содержит первую полипептидную цепь и вторую полипептидную цепь, и где: (a) первая полипептидная цепь содержит следующие области в следующем порядке в направлении от N-конца к C-концу: VL антитела против GUCY2c (VL против GUCY2c) (SEQ ID NO: 147) - линкер 1 (SEQ ID NO: 190) - VH антитела против CD3 (VH против CD3) (SEQ ID NO: 9) - линкер 3 (SEQ ID NO: 192) - первый способствующий гетеродимеризации домен (SEQ ID NO: 188); и (b) вторая полипептидная цепь содержит следующие области в следующем порядке в направлении от N-конца к C-концу: VL антитела против CD3 (VL против CD3) (SEQ ID NO: 90) - линкер 2 (SEQ ID NO: 191) - VH антитела против GUCY2c (VH против GUCY2c) (SEQ ID NO: 73) - линкер 3 (SEQ ID NO: 192) - второй способствующий гетеродимеризации домен (SEQ ID NO: 189).

В другом аспекте изобретение относится к биспецифическому антителу, специфически связывающемуся с GUCY2c и CD3, где биспецифическое антитело содержит первую полипептидную цепь и вторую полипептидную цепь, и где: (a) первая полипептидная цепь содержит следующие области в следующем порядке в направлении от N-конца к C-концу: VL антитела против GUCY2c (VL против GUCY2c) (SEQ ID NO: 147) - линкер 1 (SEQ ID NO: 190) - VH антитела против CD3 (VH против CD3) (SEQ ID NO: 9) - линкер 3 (SEQ ID NO: 192) - первый способствующий гетеродимеризации домен (SEQ ID NO: 188); и (b) вторая полипептидная цепь содержит следующие области в следующем порядке в направлении от N-конца к C-концу: VL антитела против CD3 (VL против CD3) (SEQ ID NO: 90) - линкер 2 (SEQ ID NO: 191) -VH антитела против GUCY2c (VH против GUCY2c) (SEQ ID NO: 73) - линкер 3 (SEQ ID NO: 192) -второй способствующий гетеродимеризации домен (SEQ ID NO: 189); где VL против GUCY2c и VH против GUCY2c образуют домен, специфически связывающийся с GUCY2c; и VL против CD3 и VH против CD3 образуют домен, специфически связывающийся с CD3; где линкер 3 первой полипептидной цепи и линкер 3 второй полипептидной цепи ковалентно связаны друг с другом двумя дисульфидными связями; где каждый из первого способствующего гетеродимеризации домена и второго способствующего гетеродимеризации домена содержит домен CH2 и домен CH3; где домен CH3 первого способствующего гетеродимеризации домена образует выступ, и домен CH3 второго способствующего гетеродимеризации домена образует впадину; где по меньшей мере одна дисульфидная связь образуется между доменом CH3 первого способствующего гетеродимеризации домена и доменом CH3 второго способствующего гетеродимеризации домена.

В некоторых таких вариантах осуществления настоящее изобретение относится к биспецифическому антителу, специфически связывающемуся с эпитопом GUCY2c и эпитопом CD3.

В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к биспецифическому антителу, дополнительно содержащему человеческий или гуманизированный каркас VH и человеческий или гуманизированный каркас VL. В некоторых таких вариантах осуществления биспецифическое антитело является гуманизированным антителом. В конкретных вариантах осуществления каркас VH содержит последовательность SEQ ID NO: 5, 6, 7, 8, 15, 16, 17, 18, 23, 24, 25, 30, 31, 32, 37, 38, 39, 40, 45, 46, 47, 49, 50, 51, 54, 55, 56, 58, 59, 61 или 63; и/или каркас VL содержит последовательность SEQ ID NO: 80, 81, 82, 83, 86, 87, 88, 89, 96, 97, 98, 99, 103, 110, 111, 116, 117, 118, 122, 123, 124, 126, 127, 128, 130, 131, 132, 133, 135, 139 или 155.

В одном из аспектов биспецифическое антитело по настоящему изобретению специфически связывается с GUCY2c и CD3, где биспецифическое антитело содержит первую полипептидную цепь и вторую полипептидную цепь; где первую полипептидную цепь получают с помощью экспрессирующего вектора с регистрационным номером ATCC PTA-124944; и вторую полипептидную цепь получают с помощью экспрессирующего вектора с регистрационным номером ATCC PTA-124943.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к биспецифическому антителу, способному специфически связываться с GUCY2c и CD3, содержащему первую полипептидную цепь и вторую полипептидную цепь, где первая полипептидная цепь содержит последовательность SEQ ID NO: 216, и вторая полипептидная цепь содержит последовательность SEQ ID NO: 220.

В некоторых таких вариантах осуществления настоящее изобретение относится к биспецифическому антителу, где первая и вторая полипептидные цепи ковалентно связаны друг с другом по меньшей мере одной дисульфидной связью.

Настоящее изобретение дополнительно относится к фармацевтической композиции, содержащей терапевтически эффективное количество антитела или биспецифического антитела, представленного в настоящем описании, и фармацевтически приемлемый носитель.

Настоящее изобретение относится к способам и композициям для лечения, профилактики или контроля злокачественного новообразования у индивидуума, включающим введение индивидууму терапевтически эффективного количества антитела или биспецифических антител, сконструированных по изобретению, где молекула дополнительно связывается с антигеном злокачественной опухоли. Молекулы по изобретению могут особенно подходить для профилактики, ингибирования, уменьшения роста и/или регрессирования первичных опухолей и метастазирования злокачественных клеток. Хотя они и не ограничены каким-либо конкретным механизмом действия, молекулы по изобретению могут опосредовать эффекторную функцию, что может приводить к клиренсу опухоли, уменьшению опухоли или их комбинации.

Антитела (например, против GUCY2c или биспецифические антитела против CD3-GUCY2c) по настоящему изобретению можно использовать по-разному, включая, в качестве неограничивающих примеров, способы терапевтического лечения и способы диагностики.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к способу лечения состояния, ассоциированного с экспрессией GUCY2c, у индивидуума. В некоторых вариантах осуществления способ лечения состояния, ассоциированного с экспрессией GUCY2c у индивидуума, включает введение нуждающемуся в этом индивидууму эффективного количества композиции (например, фармацевтической композиции), содержащей антитела против GUCY2c или биспецифические антитела против GUCY2c, представленные в настоящем описании. Состояния, ассоциированные с экспрессией GUCY2c, включают, в качестве неограничивающих примеров, аномальную экспрессию GUCY2c, измененную или аномальную экспрессию GUCY2c, злокачественные клетки, экспрессирующие GUCY2c, и пролиферативное нарушение (например, злокачественное новообразование).

Таким образом, изобретение относится к способам лечения злокачественного новообразования, отличающегося антигеном GUCY2c, посредством конструирования биспецифического антитела для иммуноспецифического распознавания антигена GUCY2c и антигена CD3 на T-клетках. Биспецифические антитела, сконструированные по изобретению, можно использовать для профилактики или лечения злокачественного новообразования, т.к. они обладают цитотоксической активностью благодаря индуцируемым антителом против CD3, активированным киллерным T-клеткам.

В конкретном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу лечения GUCY2c-ассоциированного нарушения у нуждающегося в этом пациента, включающему введение пациенту антитела против GUCY2c, представленного в настоящем описании. Настоящее изобретение также относится к способу лечения GUCY2c-ассоциированного нарушения у нуждающегося в этом пациента, включающему введение пациенту биспецифического антитела по настоящему изобретению.

Настоящее изобретение дополнительно относится к способу лечения GUCY2c-ассоциированного нарушения у нуждающегося в этом пациента, включающему введение пациенту фармацевтической композиции, содержащей антитело против GUCY2c или биспецифическое антитело, представленное в настоящем описании. В некоторых таких вариантах осуществления GUCY2c-ассоциированное нарушение является злокачественным новообразованием. В конкретных вариантах осуществления злокачественное новообразование является раком молочной железы, яичников, щитовидной железы, предстательной железы, шейки матки, легких (включая, в качестве неограничивающих примеров, немелкоклеточный рак легких и мелкоклеточный рак легких), мочевого пузыря, эндометрия, головы и шеи, яичка или глиобластому. В некоторых вариантах осуществления злокачественное новообразование является злокачественным новообразованием пищеварительной системы, выбранным из группы, состоящей из злокачественного новообразования пищевода, желудка, тонкого кишечника, толстого кишечника, прямой кишки, анального канала, печени, желчного пузыря, аппендикса, желчных протоков и поджелудочной железы. В конкретных вариантах осуществления с помощью терапии активируют ответ цитолитических T-клеток.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к антителу, биспецифическому антителу или фармацевтической композиции, представленным в настоящем описании, для использования в терапии. В конкретном варианте осуществления изобретение также относится к антителу против GUCY2c или биспецифическому антителу против CD3-GUCY2c для использования в способе лечения злокачественного новообразования, определенном в настоящем описании.

Настоящее изобретение дополнительно относится к антителу или биспецифическому антителу, представленному в настоящем описании, для использования в производстве лекарственного средства для использования в терапии. В некоторых вариантах осуществления терапия представляет собой лечения GUCY2c-ассоциированного нарушения. В конкретных вариантах осуществления GUCY2c-ассоциированное нарушение является злокачественным новообразованием. В некоторых вариантах осуществления злокачественное новообразование выбрано из группы, состоящей из рака молочной железы, яичников, щитовидной железы, предстательной железы, шейки матки, легких (включая, в качестве неограничивающих примеров, немелкоклеточный рак легких и мелкоклеточный рак легких), мочевого пузыря, эндометрия, головы и шеи, яичка или глиобластомы. В некоторых вариантах осуществления злокачественное новообразование является злокачественным новообразованием пищеварительной системы, выбранным из группы, состоящей из злокачественного новообразования пищевода, желудка, тонкого кишечника, толстого кишечника, прямой кишки, анального канала, печени, желчного пузыря, аппендикса, желчных протоков и поджелудочной железы. В конкретных вариантах осуществления с помощью терапии активируют ответ цитолитических T-клеток.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к полинуклеотиду, кодирующему антитело или биспецифическое антитело, представленное в настоящем описании. В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к вектору, содержащему полинуклеотиды, представленные в настоящем описании. В еще одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к клетке-хозяину, трансформированной или трансфицированной с использованием векторов, представленных в настоящем описании. В некоторых таких вариантах осуществления клетка-хозяин рекомбинантно продуцирует антитело или биспецифическое антитело, представленное в настоящем описании. В конкретных вариантах осуществления, клетка-хозяин выбрана из группы, состоящей из линий бактериальных клеток, линий клеток млекопитающих, линий клеток насекомых и линий дрожжевых клеток. В конкретном варианте осуществления линия клеток млекопитающих является линией клеток CHO. В одном из вариантов осуществления антитело или биспецифическое антитело получают с использованием бесклеточной система синтеза белка in vitro.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к способу лечения злокачественного новообразования у нуждающегося в этом индивидуума, включающему a) получение биспецифического антитела, представленного в настоящем описании, и b) введение указанного биспецифического антитела указанному пациенту. В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способу лечения состояния, ассоциированного со злокачественными клетками, экспрессирующими опухолевый антиген, у индивидуума, включающему a) получение антитела, представленного в настоящем описании, и b) введение нуждающемуся в этом индивидууму эффективного количества фармацевтической композиции, содержащей антитело, представленное в настоящем описании. Неограничивающие примеры злокачественного новообразования, подлежащего лечению, включают рак пищевода, рак желудка, рак тонкого кишечника, рак толстого кишечника, рак прямой кишки, рак анального канала, рак печени, рак желчного пузыря, рак аппендикса, рак желчных протоков и рак поджелудочной железы. Таким образом, композиции и способы, представленные в настоящем описании, можно использовать для лечения, визуализации, детекции и вакцинации против указанных выше первичных и метастатических злокачественных новообразований.

В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способу ингибирования роста или прогрессирования опухоли у индивидуума, имеющего злокачественные клетки, экспрессирующие GUCY2c, включающему введение нуждающемуся в этом индивидууму эффективного количества композиции, содержащей антитела против GUCY2c или биспецифические антитела против CD3-GUCY2c, представленные в настоящем описании. В других вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способу ингибирования метастазирования клеток, экспрессирующих GUCY2c, у индивидуума, включающему введение нуждающемуся в этом индивидууму эффективного количества композиции, содержащей антитела против GUCY2c или биспецифические антитела против CD3-GUCY2c, как представлено в настоящем описании. В других вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способу индуцирования регрессирования опухоли в злокачественных клетках у индивидуума, включающему введение нуждающемуся в этом индивидууму эффективного количества композиции, содержащей антитела против GUCY2c или биспецифические антитела против CD3-GUCY2c, представленные в настоящем описании.

В конкретном аспекте антитела против GUCY2c или биспецифическое антитело против CD3-GUCY2c по изобретению ингибируют или снижают рост злокачественных клеток по меньшей мере на 99%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 45%, по меньшей мере на 40%, по меньшей мере на 45%, по меньшей мере на 35%, по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 25%, по меньшей мере на 20% или по меньшей мере на 10% относительно роста злокачественных клеток в отсутствие антитела или биспецифического антитела по изобретению.

В конкретном аспекте антитела против GUCY2c или биспецифические антитела против CD3-GUCY2c уничтожают клетки или ингибируют или снижают рост злокачественных клеток по меньшей мере на 5%, по меньшей мере на 10%, по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 25%, по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 35%, по меньшей мере на 40%, по меньшей мере на 45%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или по меньшей мере на 100% лучше, чем в отсутствие антитела или биспецифических антител по изобретению.

В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к способу лечения аутоиммунного нарушения у индивидуума, включающему введение нуждающемуся в этом индивидууму эффективного количества композиции, содержащей антитела против GUCY2c или биспецифические антитела против CD3-GUCY2c, представленные в настоящем описании.

В рамках изобретения аутоиммунные нарушения включают, в качестве неограничивающих примеров, воспалительное заболевание кишечника, системную красную волчанку, диабет (типа I), целиакию, агаммаглобулинемию, аутоиммунную энтеропатию, аутоиммунный гепатит, болезнь Крона, пемфигоид желудочно-кишечного тракта, полимиозит, поперечный миелит, язвенный колит и васкулит.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к эффективному количеству композиции (например, фармацевтической композиции), содержащей антитела (например, антитела против GUCY2c или биспецифические антитела против CD3-GUCY2c), представленные в настоящем описании, для лечения состояния (например, злокачественного новообразования), ассоциированного с экспрессией GUCY2c, у нуждающегося в этом индивидуума. В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к эффективному количеству композиции (например, фармацевтической композиции), содержащей антитела (например, антитела против GUCY2c или биспецифические антитела против CD3-GUCY2c), как представлено в настоящем описании, для ингибирования роста или прогрессирования опухоли у индивидуума, имеющие злокачественные клетки, экспрессирующие GUCY2c. В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к эффективному количеству композиции (например, фармацевтической композиции), содержащей антитела (например, антитела против GUCY2c или биспецифические антитела против CD3-GUCY2c), как представлено в настоящем описании, для ингибирования метастазирования злокачественных клеток, экспрессирующих GUCY2c, у нуждающегося в этом индивидуума. В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к эффективному количеству композиции (например, фармацевтической композиции), содержащей антитела (например, антитела против GUCY2c или биспецифические антитела против CD3-GUCY2c), представленные в настоящем описании.

В другом аспекте изобретение относится к антителам (например, антителам GUCY2c или биспецифическим антителам против CD3-GUCY2c), представленным в настоящем описании, для использования в лечении состояния (например, злокачественного новообразования), ассоциированного с экспрессией GUCY2c, у нуждающегося в этом индивидуума. В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к антителам (например, антителам против GUCY2c или биспецифическим антителам против CD3-GUCY2c), представленным в настоящем описании, для ингибирования роста или прогрессирование опухоли у индивидуума, имеющего злокачественные клетки, экспрессирующие GUCY2c. В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к антителам (например, антителам против GUCY2c или биспецифическим антителам против CD3-GUCY2c), представленным в настоящем описании, для ингибирования метастазирования злокачественных клеток, экспрессирующих GUCY2c, у нуждающегося в этом индивидуума. В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к антителам (например, антителам GUCY2c или биспецифическим антителам против CD3-GUCY2c), представленным в настоящем описании, для индуцирования регрессирования опухоли у индивидуума, имеющего злокачественные клетки, экспрессирующие GUCY2c.

В другом аспекте изобретение относится к применению антител (например, антител против GUCY2c или биспецифических антител против CD3-GUCY2c), представленных в настоящем описании, в производстве лекарственного средства для лечения состояния (например, злокачественного новообразования), ассоциированного с экспрессией GUCY2c. В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к применению антител (например, антител против GUCY2c или биспецифических антител против CD3-GUCY2c), представленных в настоящем описании, в производстве лекарственного средства для ингибирования роста или прогрессирования опухоли. В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к применению антител (например, антител против GUCY2c или биспецифических антител против CD3-GUCY2c), представленных в настоящем описании, в производстве лекарственного средства для ингибирования метастазирования злокачественных клеток, экспрессирующих GUCY2c. В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к применению антител (например, антител против GUCY2c или биспецифических антител против CD3-GUCY2c), представленных в настоящем описании, в производстве лекарственного средства для индуцирования регрессирования опухоли.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу детекции, диагностики и/или мониторинга состояния, ассоциированного с экспрессией GUCY2c. Например, антитела (например, антитела против GUCY2c или биспецифические антитела против CD3-GUCY2c), представленные в настоящем описании, можно метить детектируемым фрагментом, таким как визуализирующее средство и фермент-субстратная метка. Антитела, представленные в настоящем описании, также можно использовать для диагностических анализов in vivo, таких как визуализация in vivo (например, ПЭТ или SPECT), или в качестве реагента для окрашивания.

Таким образом, в дополнение к перенаправлению T-клеток к опухолеспецифическим антигенам, биспецифические антитела против CD3-GUCY2c по настоящему изобретению можно использовать для доставки других диагностических или терапевтических средств к клеткам, экспрессирующим опухолевый антиген на своей поверхности. Таким образом, биспецифическое антитело можно присоединять прямо или косвенно, например, через линкер, с лекарственным средством таким образом, что его будут доставлять непосредственно в клетки, несущие опухолевый антиген. Терапевтические средства включают, в качестве неограничивающих примеров, нуклеиновые кислоты, белки, пептиды, аминокислоты или производные, гликопротеины, радиоактивные изотопы, липиды, углеводы или рекомбинантные вирусы. Диагностические или терапевтические средства на основе нуклеиновых кислот включают, в качестве неограничивающих примеров, антисмысловые нуклеиновые кислоты, дериватизированные олигонуклеотиды для ковалентной перекрестной сшивки с одиночной или дуплексной ДНК и триплекс-образующие олигонуклеотиды.

Альтернативно, диагностические или терапевтические средства, связанные с биспецифическими антителами по настоящему изобретению, могут представлять собой систему инкапсуляции, такую как липосома или мицелла, содержащая терапевтическое средство, такое как лекарственное средство, нуклеиновая кислота (например, антисмысловая нуклеиновая кислота) или другое терапевтическое средство, предпочтительно, защищенное от прямого воздействия кровотока. Способы получения липосом, присоединенных к антителам, хорошо известны специалистам в этой области. См., например, патент США № 4957735; и Connor, et al., Pharm. Ther. 28:341-365 (1985).

В некоторых вариантах осуществления способы, представленные в настоящем описании, дополнительно включают стадию лечения индивидуума с использованием дополнительной формы терапии. В некоторых вариантах осуществления дополнительная форма терапии является дополнительной противоопухолевой терапией, включая, в качестве неограничивающих примеров, химиотерапию, лучевую терапию, хирургическое вмешательство, гормональную терапию и/или дополнительную иммунотерапию.

Настоящее изобретение дополнительно включает введение молекулы по изобретению в комбинации с другими терапевтическими средствами, известными специалистам в этой области для лечения или профилактики злокачественного новообразования, включая, в качестве неограничивающих примеров, стандартные и экспериментальные химиотерапевтические средства, биологические терапевтические средства, иммунотерапевтические средства, лучевую терапию или хирургическое вмешательство. В некоторых аспектах молекулы по изобретению можно вводить в комбинации с терапевтически или профилактически эффективным количеством одного или более средств, терапевтических антител или других средств, известных специалистам в этой области для лечения и/или профилактики злокачественного новообразования.

Таким образом, способы лечения злокачественного новообразования включают введение нуждающемуся в этом индивидууму эффективного количества антитела или биспецифического антитела по настоящему изобретению в комбинации с химиотерапевтическим средством. Такое комбинированное лечение можно вводить раздельно, последовательно, или одновременно. Подходящие химиотерапевтические средства включают, в качестве неограничивающих примеров, по меньшей мере одно дополнительное средство, такое как бевацизумаб, цетуксимаб, сиролимус, панитумумаб, 5-фторурацил(5-FU), капецитабин, тивозаниб, иринотекан, оксалиплатин, цисплатин, трифлуридин, типирацил, лейковорин, гемцитабин и/или эрлотиниба гидрохлорид.

Дозируемые количества и частоты введения, представленные в настоящем описании, включены в термины "терапевтически эффективный" и "профилактически эффективный". Доза и частота дополнительно варьируются в зависимости от факторов, специфических для каждого пациента, в зависимости от специфических вводимых терапевтических или профилактических средств, тяжести и типа злокачественных новообразований, пути введение, а также возраста, массы тела, ответа и медицинского анамнеза пациента. Специалист в этой области может выбирать подходящие схемы лечения, рассматривая такие факторы и следуя, например, дозам, описанным в литературе и рекомендуемым в Настольном справочнике врача (56-ое издание, 2002 год).

Антитела или биспецифические антитела по настоящему изобретению могут находиться в фармацевтической композиции для введения, составляемой так, чтобы подходить для выбранного способа введения, и содержащей фармацевтически приемлемый дилюент или эксципиенты, такие как буферы, поверхностно-активные вещества, консерванты, солюбилизаторы, изотонические средства, стабилизирующие средства, носители и т.п. В Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton Pa., 18^th ed., 1995 представлено руководство по способам составления, как правило, известным практикующим специалистам.

Эти фармацевтические композиции можно вводить любыми способами, известными в этой области, с помощью которых, как правило, достигают назначенной цели лечения злокачественного новообразования. Путь введения может являться парентеральным, определенным в настоящем описании как относящийся к способам введения, включающим, в качестве неограничивающих примеров, чреспищеводную, внутриопухолевую, трансколоноскопическую, чрескожную, внутривенную, внутримышечную, интраперитонеальную, подкожную и внутрисуставную инъекцию и инфузию. Способ введения и дозирования молекул по изобретению (например, антител против GUCY2c, биспецифического антитела против CD3-GUCY2c, фармацевтической композиции) зависит от типа заболевания, подлежащего лечению, при необходимости, его стадии, антигена, подлежащего контролю, типа сопутствующего лечения, если оно есть, частоты лечения, природы желаемого эффекта, а также массы тела, возраста, состояния здоровья, питания и пола пациента. Таким образом, конкретный используемый режим дозирования может варьироваться в широких пределах и, таким образом, может отклоняться от режимов дозирования, приведенных в настоящем описании.

Для введения можно использовать различные составы антител по настоящему изобретению (например, антител против GUCY2c или биспецифических антител против CD3-GUCY2c). В некоторых вариантах осуществления антитела (например, антитела против GUCY2c или биспецифическое антитело против CD3-GUCY2c) можно вводить в отдельности. В некоторых вариантах осуществления антитело (например, антитело против GUCY2c или биспецифическое антитело против CD3-GUCY2c) и фармацевтически приемлемый эксципиент могут находиться в различных составах. Фармацевтически приемлемые эксципиенты известны в этой области и являются относительно инертными веществами, облегчающими введение фармакологически эффективного вещества. Например, эксципиент может придавать форму или консистенцию или действовать в качестве дилюента. Подходящие эксципиенты включают, в качестве неограничивающих примеров, стабилизирующие средства, увлажнители и эмульгаторы, соли для варьирования осмолярности, инкапсулирующие средства, буферы и усилители проникновения через кожу. Эксципиенты, а также составы для парентерального и непарентерального введения лекарственного средства, приведены в Remington, The Science and Practice of Pharmacy 21st Ed. Mack Publishing, 2005.

В некоторых вариантах осуществления эти средства составляют для введения посредством инъекции (например, интраперитонеально, внутривенно, подкожно, внутримышечно и т.д.). Таким образом, эти средства можно комбинировать с фармацевтически приемлемыми носителями, такими как физиологический раствор, раствор Рингера, раствор декстрозы и т.п. Конкретный режим дозирования, т.е. доза, время и повторение, будут зависеть от конкретного индивидуума и медицинского анамнеза индивидуума.

Антитела (например, антитела против GUCY2c или биспецифические антитела против CD3-GUCY2c), представленные в настоящем описании, можно вводить любым подходящим способом, включая инъекцию (например, интраперитонеальную, внутривенную, подкожную, внутримышечную и т.д.). Антитело, например, моноклональное антитело или биспецифическое антитело, также вводят посредством ингаляции, как представлено в настоящем описании. Как правило, в случае введения антитела по настоящему изобретению (например, антитела против GUCY2c или биспецифического антитела против CD3-GUCY2c) доза зависит от организма, подвергаемого лечению и конкретного способа введения. В одном из вариантов осуществления диапазон доз антитела по настоящему изобретению будет составлять от приблизительно 0,001 мкг/кг массы тела до приблизительно 20000 мкг/кг массы тела. Термин "масса тела" используют, когда пациента подвергают лечению. Если обрабатывают выделенные клетки, термин "масса тела" в рамках изобретения относится к "общей массе клеток". Термин "общая масса тела" можно использовать в отношении обработки выделенной клетки и лечения пациента. Все концентрации и уровни обработки, выраженные в настоящей заявке как "масса тела" или просто "кг", также считают охватывающими аналогичные концентрации "общей массы клеток" и "общей массы тела". Однако специалистам в этой области будет понятна полезность различных диапазонов доз, например, от 0,01 мкг/кг массы тела до 20000 мкг/кг массы тела, от 0,02 мкг/кг массы тела до 15000 мкг/кг массы тела, от 0,03 мкг/кг массы тела до 10000 мкг/кг массы тела, от 0,04 мкг/кг массы тела до 5000 мкг/кг массы тела, от 0,05 мкг/кг массы тела до 2500 мкг/кг массы тела, от 0,06 мкг/кг массы тела до 1000 мкг/кг массы тела, от 0,07 мкг/кг массы тела до 500 мкг/кг массы тела, от 0,08 мкг/кг массы тела до 400 мкг/кг массы тела, от 0,09 мкг/кг массы тела до 200 мкг/кг массы тела или от 0,1 мкг/кг массы тела до 100 мкг/кг массы тела. Кроме того, специалистам будет понятно, что можно использовать различные уровни доз, например, 0,0001 мкг/кг, 0,0002 мкг/кг, 0,0003 мкг/кг, 0,0004 мкг/кг, 0,005 мкг/кг, 0,0007 мкг/кг, 0,001 мкг/кг, 0,1 мкг/кг, 1,0 мкг/кг, 1,5 мкг/кг, 2,0 мкг/кг, 5,0 мкг/кг, 10,0 мкг/кг, 15,0 мкг/кг, 30,0 мкг/кг, 50 мкг/кг, 75 мкг/кг, 80 мкг/кг, 90 мкг/кг, 100 мкг/кг, 120 мкг/кг, 140 мкг/кг, 150 мкг/кг, 160 мкг/кг, 180 мкг/кг, 200 мкг/кг, 225 мкг/кг, 250 мкг/кг, 275 мкг/кг, 300 мкг/кг, 325 мкг/кг, 350 мкг/кг, 375 мкг/кг, 400 мкг/кг, 450 мкг/кг, 500 мкг/кг, 550 мкг/кг, 600 мкг/кг, 700 мкг/кг, 750 мкг/кг, 800 мкг/кг, 900 мкг/кг, 1 мкг/кг, 5 мкг/кг, 10 мкг/кг, 12 мкг/кг, 15 мг/кг, 20 мг/кг и/или 30 мг/кг. Все эти дозы являются примерами, и ожидают, что в настоящем изобретении можно использовать любую дозу между этими значениями. Для антитела по настоящему изобретению можно использовать любые из указанных выше диапазонов доз или уровней доз. В случае повторных введений в течение нескольких дней или более, в зависимости от состояния, лечение продолжают до возникновения желаемой супрессии симптомов или до достижения достаточных терапевтических уровней, например, для ингибирования или задержки роста/прогрессирования опухоли или метастазирования злокачественных клеток.

Также можно использовать другие режимы дозирования в зависимости от профиля фармакокинетического распада, который хочет достигнуть практикующий специалист. В одном из вариантов осуществления антитело по настоящему изобретению вводят в усиленной начальной дозе, с последующей более высокой и/или непрерывной, по существу постоянной дозой. В некоторых вариантах осуществления предусмотрено введение от одного до четырех раз в неделю. В других вариантах осуществления предусмотрено введение раз в месяц, или раз в два месяца, или раз в три месяца. Прогресс этой терапии легко подвергать мониторингу с помощью общепринятых способов и анализов. Схему дозирования (включающую антитело (например, антитело против GUCY2c или биспецифическое антитело против CD3-GUCY2c)) можно варьировать с течением времени.

В целях по настоящему изобретению, подходящая доза антитела (например, антитела против GUCY2c или биспецифического антитела против CD3-GUCY2c) будет зависеть от антитела (например, антитела против GUCY2c или биспецифического антитела против CD3-GUCY2c) или его используемых композиций, типа и тяжести симптомов, подвергаемых лечению, если средство вводят в терапевтических целях, предшествующей терапии, клинического анамнеза пациента и ответа на средство, скорости выведения вводимого средства у пациента и решения лечащего врача. Как правило, клиницист будет вводить антитело (например, антитело против GUCY2c или биспецифическое антитело против CD3-GUCY2c) до достижения дозы, позволяющей достигать желаемого результата. Дозу и/или частоту можно варьировать в течение лечения. При определении дозы, как правило, будут учитывать эмпирические факторы, такие как время полужизни. Например, антитела, совместимые с иммунной системой человека, такие как гуманизированные антитела или полностью человеческие антитела, можно использовать для пролонгирования времени полужизни антитела и для предотвращения атаки антитела иммунной системой организма-хозяина. Частоту введения можно определять и корректировать в течение терапии, и она, как правило, но не обязательно, основана на лечении, и/или супрессии, и/или улучшении, и/или задержке симптомов, например, ингибировании или задержке роста опухоли и т.д. Альтернативно, подходящими могут являться составы антител с замедленным высвобождением (например, антител GUCY2c или биспецифического антитела против CD3-GUCY2c). В этой области известны различные составы и устройства для достижения замедленного высвобождения.

В одном из вариантов осуществления дозы антитела (например, антитела против GUCY2c или биспецифического антитела против CD3-GUCY2c) можно определять эмпирически у индивидуумов, подвергнутых одному или более введениям антитела (например, антитела против GUCY2c или биспецифического антитела против CD3-GUCY2c). Индивидуумам вводят увеличивающиеся дозы антитела (например, антитела против GUCY2c или биспецифического антитела против CD3-GUCY2c). Для оценки эффективности можно отслеживать показатель заболевания.

В некоторых вариантах осуществления введение антитела (например, антитела против GUCY2c или биспецифического антитела против CD3-GUCY2c) приводит по меньшей мере к одному эффекту, выбранному из группы, состоящей из ингибирования роста опухоли, регрессирования опухоли, снижения размера опухоли, снижения количества опухолевых клеток, задержки роста опухоли, абскопального эффекта, ингибирования метастазирования опухоли, уменьшения метастатических очагов с течением времени, снижения использования химиотерапевтических или цитотоксических средств, уменьшения опухолевой массы, повышения выживаемости без прогрессирования, повышения общей выживаемости, полного ответа, частичного ответа и стабильного заболевания.

Введение антитела (например, антитела против GUCY2c или биспецифического антитела против CD3-GUCY2c) в соответствии со способом по настоящему изобретению может являться непрерывным или дробным, в зависимости, например, от физиологического состояния реципиента, является ли цель введения терапевтической или профилактической, и других факторов, известных специалистам в этой области. Введение антитела (например, антитела против GUCY2c или биспецифического антитела против CD3-GUCY2c) может являться, по существу, непрерывным в течение заранее выбранного периода времени или может представлять собой серию дробных доз.

В некоторых вариантах осуществления могут присутствовать несколько антител (например, антитело против GUCY2c или биспецифическое антитело против CD3-GUCY2c). Могут присутствовать по меньшей мере одно, по меньшей мере два, по меньшей мере три, по меньшей мере четыре, по меньшей мере пять или более разных антител (например, антител против GUCY2c или биспецифических антител против CD3-GUCY2c). Как правило, антитела (например, антитела против GUCY2c или биспецифические антитела против CD3-GUCY2c) могут иметь комплементарные активности, не влияющие друг на друга негативно. Например, можно использовать одно или более из следующих антител: первое антитело против GUCY2c или CD3, направленное против одного эпитопа на GUCY2c или CD3, и второе антитело против GUCY2c или CD3, направленное против другого эпитопа на GUCY2c или CD3.

Терапевтические составы антитела (например, антитела против GUCY2c или биспецифического антитела против CD3-GUCY2c), используемые по настоящему изобретению, получают для хранения посредством смешивания антитела, имеющего желаемую степень чистоты, с необязательными фармацевтически приемлемыми носителями, эксципиентами или стабилизаторами (Remington, The Science and Practice of Pharmacy 21st Ed. Mack Publishing, 2005), в форме лиофилизированных составов или водных растворов. Приемлемые носители, эксципиенты или стабилизаторы являются нетоксичными для реципиентов в используемых дозах и концентрациях, и могут содержать буферы, такие как фосфат, цитрат и другие органические кислоты; соли, такие как хлорид натрия; антиоксиданты, включая аскорбиновую кислоту и метионин; консерванты (такие как хлорид октадецилдиметилбензиламмония; хлорид гексаметония; хлорид бензалкония, хлорид бензетония; фенол, бутиловый или бензиловый спирт; алкилпарабены, такие как метил- или пропилпарабен; катехол; резорцинол; циклогексанол; 3-пентанол и m-крезол); низкомолекулярные (менее приблизительно 10 остатков) полипептиды; белки, такие как сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины; гидрофильные полимеры, такие как поливинилпирролидон; аминокислоты, такие как глицин, глутамин, аспарагин, гистидин, аргинин или лизин; моносахариды, дисахариды и другие углеводы, включая глюкозу, маннозу или декстрины; хелатирующие средства, такие как ЭДТА; сахара, такие как сахароза, маннит, трегалоза или сорбит; солеобразующие противоионы, такие как натрий; комплексные соединения с металлами (например, комплексы Zn-белок); и/или неионные поверхностно-активные средства, такие как TWEEN^TM, PLURONIC^TM или полиэтиленгликоль (PEG).

Липосомы, содержащие антитело (например, антитело против GUCY2c или биспецифическое антитело против CD3-GUCY2c), получают известными в этой области способами, как описано в Epstein, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688, 1985; Hwang, et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 77:4030, 1980; и патентах США №№ 4485045 и 4544545. Липосомы с повышенным временем циркуляции описаны в патенте США № 5013556. Особенно подходящие липосомы можно получать способом обращенно-фазового выпаривания с использованием липидной композиции, содержащей фосфатидилхолин, холестерин и PEG-дериватизированный фосфатидилэтаноламин (PEG-PE). Липосомы экструдируют через фильтры с определенным размером пор для получения липосом с желаемым диаметром.

Активные ингредиенты также можно заключать в микрокапсулы, полученные, например, способами коацервации или посредством интерфазной полимеризации, например, гидроксиметилцеллюлозные или желатиновые микрокапсулы и микрокапсулы из полиметилметакрилата, соответственно, в коллоидных системах доставки лекарственного средства (например, липосомы, альбуминовые микросферы, микроэмульсии, наночастицы и нанокапсулы) или в макроэмульсиях. Такие способы описаны в Remington, The Science and Practice of Pharmacy 21st Ed. Mack Publishing, 2005.

Можно получать препараты с замедленным высвобождением. Подходящие примеры препаратов с замедленным высвобождением включают полупроницаемые матрицы из твердых гидрофобных полимеров, содержащих антитело, где матрицы находятся в форме профилированных изделий, например, пленок или микрокапсул. Примеры матриц с замедленным высвобождением включают полиэфиры, гидрогели (например, поли(2-гидроксиэтил-метакрилат) или поливиниловый спирт), полилактиды (патент США № 3773919), сополимеры L-глутаминовой кислоты и 7-этил-L-глутамата, недеградируемый этилен-винилацетат, деградируемые сополимеры молочной кислоты и гликолевой кислоты, такие как LUPRON DEPOT^TM (инъецируемые микросферы, состоящие из сополимера молочной кислоты и гликолевой кислоты и лейпролид ацетат), ацетат избутират сахарозы и поли-D-(-)-3-гидроксимасляная кислота.

Составы, предназначенные для использования для введения in vivo, должны быть стерильными. Этого легко достигать, например, посредством фильтрации через мембраны для стерилизации фильтрацией. Композиции терапевтического антитела (например, антитела против GUCY2c или биспецифического антитела против CD3-GUCY2c), как правило, помещают в контейнер, имеющий стерильное входное отверстие, например, мешок для внутривенного раствора или флакон с пробкой, прокалываемой иглой для подкожных инъекций.

Композиции по настоящему изобретению могут находиться в стандартных лекарственных формах, таких как таблетки, пилюли, капсулы, порошки, гранулы, растворы или суспензии или суппозитории, для перорального, парентерального или ректального введения или введения посредством ингаляции или инсуффляции.

Для получения твердых композиций, таких как таблетки, основной активный ингредиент смешивают с фармацевтическим носителем, например, общепринятыми ингредиентами для таблетирования, таких как кукурузный крахмал, лактоза, сахароза, сорбит, тальк, стеариновая кислота, стеарат магния, дифосфат кальция или камеди, и другими фармацевтическими дилюентами, например, водой, для получения твердой композиции до придания ей лекарственной формы, содержащей однородную смесь соединения по настоящему изобретению или его нетоксичную фармацевтически приемлемую соль. Упоминание этих композиций до придания им лекарственной формы как однородных означает, что активный ингредиент равномерно диспергирован по всей композиции таким образом, что композицию легко можно разделять на в равной степени эффективные стандартные лекарственные формы, такие как таблетки, пилюли и капсулы. Затем эту твердую композицию до придания ей лекарственной формы разделяют на стандартные лекарственные формы описанного выше типа, содержащие от 0,1 до приблизительно 500 мг активного ингредиента по настоящему изобретению. Таблетки или пилюли новой композиции можно покрывать или иначе экстемпорально получать для получения лекарственной формы, обеспечивающей преимущество пролонгированного действия. Например, таблетка или пилюля может содержать внутренний компонент дозы и внешний компонент дозы, последний из которых находится в виде оболочки вокруг первого из них. Два компонента можно разделять кишечнорастворимым слоем, предназначенным для устойчивости к распаду в желудке и позволяющим внутреннему компоненту попадать в двенадцатиперстную кишку или иметь замедленное высвобождение. Для таких кишечнорастворимых слоев или покрытий можно использовать различные материалы, включающие ряд полимерных кислот и смесей полимерных кислот с такими материалами, как шеллак, цетиловый спирт и ацетат целлюлозы.

Подходящие поверхностно-активные средства включают, в частности, неионные средства, такие как полиоксиэтиленсорбитаны (например, Tween^TM 20, 40, 60, 80 или 85) и другие сорбитаны (например, Span^TM 20, 40, 60, 80 или 85). Композиции с поверхностно-активным средством, как правило, будут содержать от 0,05 до 5% поверхностно-активного средства и могут содержать от 0,1 до 2,5%. Следует понимать, что, при необходимости, можно добавлять другие ингредиенты, например, маннит или другие фармацевтически приемлемые носители.

Подходящие эмульсии можно получать с использованием коммерчески доступных жировых эмульсий, таких как Intralipid^TM, Liposyn^TM, Infonutrol^TM, Lipofundin^TM и Lipiphysan^TM. Активный ингредиент можно растворять в заранее смешанной композиции эмульсии или, альтернативно, его можно растворять в масле (например, соевом масле, сафлоровом масле, хлопковом масле, сезамовом масле, кукурузном масле или миндальном масле) и эмульсии, полученной после смешивания с фосфолипидом (например, фосфолипидами яйца, фосфолипидами сои или лецитином сои) и водой. Следует понимать, что можно добавлять другие ингредиенты, например, глицерин или глюкозу, для корректировки тоничности эмульсии. Подходящие эмульсии, как правило, будут содержать до 20% масла, например, от 5 до 20%. Жировая эмульсия может содержать жировые капли от 0,1 до 1,0 мкм, в частности, от 0,1 до 0,5 мкм, и иметь pH в диапазоне от 5,5 до 8,0.

Композиции эмульсий могут являться композициями, полученными посредством смешивания антитела (например, антитела против GUCY2c или биспецифического антитела против CD3-GUCY2c) с Intralipid^TM или его компонентами (соевым маслом, фосфолипидами яйца, глицерином и водой).

Композиции для ингаляции или инсуффляции включают растворы и суспензии в фармацевтически приемлемых водных или органических растворителях или их смесях и порошки. Жидкие или твердые композиции могут содержать подходящие фармацевтически приемлемые эксципиенты, как описано выше. В некоторых вариантах осуществления композиции вводят пероральным или назальным респираторным путем для локального или системного эффекта. Композиции в предпочтительно стерильных фармацевтически приемлемых растворителях можно небулизировать с помощью газов. Небулизируемые растворы можно вдыхать непосредственно из небулизирующего устройства, или небулизирующее устройство можно прикреплять к маске для лица, тенту или дыхательному аппарату с положительным перемежающимся давлением. Композиции в виде раствора, суспензии или порошка можно вводить, предпочтительно, перорально или назально с помощью устройства, посредством которого состав вводят соответствующим образом.

Композиции в объеме изобретения включают все композиции, где антитело (антитело против GUCY2c или биспецифическое антитело против CD3-GUCY2c) присутствует в количестве, являющемся эффективным для достижения желаемого медицинского эффекта при лечении злокачественного новообразования. Хотя индивидуальные потребности могут варьироваться от одного пациента к другому, определение оптимальных диапазонов эффективных количеств всех компонентов входит в объем навыков специалиста в этой области.

Примеры таких композиций, а также способов составления, также описаны выше и ниже. В некоторых вариантах осуществления композиция содержит одно или более антител (например, антитело против GUCY2c или биспецифическое антитело против CD3-GUCY2c). В некоторых вариантах осуществления антитело против GUCY2c или биспецифическое антитело против CD3-GUCY2c является антителом человека, гуманизированным антителом или химерным антителом. В некоторых вариантах осуществления антитело против GUCY2c или биспецифическое антитело против CD3-GUCY2c содержит константную область, способную запускать желаемый иммунный ответ, такой как антитело-опосредованный лизис или ADCC. В других вариантах осуществления антитело против GUCY2c или биспецифическое антитело против CD3-GUCY2c содержит константную область, не запускающую нежелательный иммунный ответ, такой как антитело-опосредованный лизис или ADCC.

Следует понимать, что композиции могут содержать несколько антител (например, антитело против GUCY2c или биспецифическое антитело против CD3-GUCY2c), например, смесь антител против GUCY2c или биспецифических антител против CD3-GUCY2c, распознающих разные эпитопы GUCY2c или CD3 и GUCY2c. Другие примеры композиций содержат несколько антител против GUCY2c или биспецифических антител против CD3-GUCY2c, распознающих одни и те же эпитопы, или разные типы антител против GUCY2c биспецифических антител против CD3-GUCY2c, или антитела, связывающиеся с разными эпитопами GUCY2c (например, GUCY2cA человека) или CD3 и GUCY2c (CD3 и GUCY2c человека).

В некоторых вариантах осуществления антитело против GUCY2c или биспецифическое антитело против CD3-GUCY2c можно вводить в комбинации с введением одного или более дополнительных терапевтических средств. Они включают, в качестве неограничивающих примеров, введение биотерапевтического средства и/или химиотерапевтического средства, такого как, в качестве неограничивающих примеров, вакцина, терапию CAR-T-клетками, лучевую терапию, цитокиновую терапию, биспецифическое антитело против CD3, ингибитор других иммуносупрессорных путей, ингибитор ангиогенеза, активатор T-клеток, ингибитор метаболического пути, ингибитор mTOR, ингибитор пути аденозина, ингибитор тирозинкиназ включая, в качестве неограничивающих примеров, Inlyta, ингибиторы ALK и сунитиниб, ингибитор BRAF, эпигенетический модификатор, ингибитор IDO1, ингибитор JAK, ингибитор STAT, ингибитор циклин-зависимой киназы, биотерапевтическое средство (включая, в качестве неограничивающих примеров, антитела против VEGF, VEGFR, EGFR, Her2/neu, других рецепторов факторов роста, CD40, CD-40L, CTLA-4, OX-40, 4-1BB, TIGIT и ICOS), иммуногенное средство (например, аттенуированные злокачественные клетки, опухолевые антигены, антигенпрезентирующие клетки, такие как дендритные клетки с введенным опухолевым антигеном или нуклеиновыми кислотми, иммуностимулирующие цитокины (например, ИЛ-2, ИФНα2, ГМ-КСФ) и клетки, трансфицированные с использованием генов, кодирующих иммуностимулирующие цитокины, такие как, в качестве неограничивающих примеров, ГМ-КСФ).

Примеры биотерапевтических средств включают терапевтические антитела, иммуномодулирующие средства и терапевтические иммунные клетки.

Терапевтические антитела могут иметь специфичность в отношении различных антигенов. Например, терапевтические антитела могут быть направлены против опухолеассоциированного антигена, таким образом, что связывание антитела с антигеном способствует гибели клетки, экспрессирующей антиген. В другом примере терапевтические антитела могут быть направлены против антигена (например, PD-1) на иммунной клетке, таким образом, что связывание антитела предотвращает отрицательную регуляцию активности клетки, экспрессирующей антиген (и, таким образом, способствует активности клетки, экспрессирующей антиген). В некоторых случаях терапевтическое антитело может функционировать посредством множества разных механизмов (например, оно может i) способствовать гибели клетки, экспрессирующей антиген, а также ii) предотвращать индуцирование антигеном отрицательной регуляции активности иммунных клеток, контактирующих с клеткой, экспрессирующей антиген).

Терапевтические антитела могут быть направлены против, например, антигенов, указанных ниже. Для некоторых антигенов примеры антител против антигена также включены ниже (в прямых/круглых скобках после антигена). Следующие антигены также можно обозначать в настоящем описании как "антигены-мишени" или т.п. Антигены-мишени для терапевтических антител в настоящем описании включают, например: 4-1BB (например, утомилумаб); 5T4; A33; альфа-фолатный рецептор 1 (например, мирветуксимаб соравтанзин); Alk-1; BCMA [например, PF-06863135 (см. патент США № 9969809)]; BTN1A1 (например, см. WO2018222689); CA-125 (например, абаговомаб); карбоангидразу IX; CCR2; CCR4 (например, могамулизумаб); CCR5 (например, леронлимаб); CCR8; CD3 [например, блинатумомаб (биспецифическое антитело против CD3/CD19), PF-06671008 (биспецифическое антитело против CD3/P-кадгерина), PF-06863135 (биспецифическое антитело против CD3/BCMA), CD19 (например, блинатумомаб, MOR208); CD20 (например ибритумомаб тиуксетан, обинутузумаб, офатумумаб, ритуксимаб, ублитуксимаб); CD22 (инотузумаб озогамицин, моксетумомаб пасудотокс); CD25; CD28; CD30 (например, брентуксимаб ведотин); CD33 (например, гемтузумаб озогамицин); CD38 (например, даратумумаб, исатуксимаб), CD40; CD-40L; CD44v6; CD47; CD52 (например, алемтузумаб); CD63; CD79 (например, полатузумаб ведотин); CD80; CD123; CD276/B7-H3 (например, омбуртамаб); CDH17; CEA; ClhCG; CTLA-4 (например, ипилимумаб, тремелимумаб), CXCR4; десмоглеин 4; DLL3 (например, ровалпитузумаб тесирин); DLL4; E-кадгерин; EDA; EDB; EFNA4; EGFR (например, цетуксимаб, депатуксизумаб мафодотин, нецитумумаб, панитумумаб); EGFRvIII; эндосиалин; EpCAM (например, опортузумаб монатокс); FAP; фетальный ацетилхолиновый рецептор; FLT3 (например, см. WO2018/220584); GD2 (например, динутуксимаб, 3F8); GD3; GITR; GloboH; GM1; GM2; GUCY2C (например, PF-07062119); HER2/neu [например, маргетуксимаб, пертузумаб, трастузумаб; ado-трастузумаб эмтанзин, трастузумаб дуокармазин, PF-06804103 (см. US8828401)]; HER3; HER4; ICOS; IL-10; ITG-AvB6; LAG-3 (например, релатлимаб); антиген Льюиса Y; LG; Ly-6; M-CSF [например PD-0360324 (см. патент США № 7326414)]; MCSP; мезотелин; MUC1; MUC2; MUC3; MUC4; MUC5AC; MUC5B; MUC7; MUC16; Notch1; Notch3; нектин-4 (например, энфортумаб ведотин); OX40 [например, PF-04518600 (см. патент США № 7960515)]; P-кадгерин [например PF-06671008 (см. WO2016/001810)]; PCDHB2; PD-1 [например, BCD-100, камрелизумаб, цемиплимаб, генолимзумаб (CBT-501), MEDI0680, ниволумаб, пембролизумаб, RN888 (см. WO2016/092419), синтилимаб, спартализумаб, STI-A1110, тислелизумаб, TSR-042]; PD-L1 (например, атезолизумаб, дурвалумаб, BMS-936559 (MDX-1105) или LY3300054); PDGFRA (например, оларатумаб); антиген плазматических клеток; поли-SA; PSCA; PSMA; PTK7 [например, PF-06647020 (см. патент США № 9409995)]; Ror1; SAS; SCRx6; SLAMF7 (например, элотузумаб); SHH; SIRPa (например, ED9, Effi-DEM); STEAP; TGF-бета; TIGIT; TIM-3; TMPRSS3; предшественник ФНО-альфа; TROP-2 (например, сацитузумаб говитекан); TSPAN8; VEGF (например, бевацизумаб, бролуцизумаб); VEGFR1 (например, ранибизумаб); VEGFR2 (например, рамуцирумаб, ранибизумаб); Wue-1.

Терапевтические антитела могут иметь любой подходящий формат. Например, терапевтические антитела могут иметь любой формат, описанный где-либо в настоящем описании. В некоторых вариантах осуществления терапевтическое антитело может являться "голым" антителом. В некоторых вариантах осуществления терапевтическое антитело можно связывать с лекарственным средством/средством (также известным как "конъюгат антитело-лекарственное средство" (ADC)). В некоторых вариантах осуществления терапевтическое антитело против конкретного антигена можно включать в мультиспецифическое антитело (например, биспецифическое антитело).

В некоторых вариантах осуществления антитело против антигена можно конъюгировать с лекарственным средством/средством. Связанные молекулы антитело-лекарственное средство также обозначают как "конъюгаты антитело-лекарственное средство" (ADC). Лекарственные средства/средства можно соединять с антителом прямо или косвенно через линкер. Чаще всего, токсические лекарственные средства соединяют с антителом таким образом, что связывание ADC с соответствующим антигеном способствует уничтожению клеток, экспрессирующих антиген. Например, ADC, которые соединяют с токсическими лекарственными средствами, особенно подходят для таргетинга опухолеассоциированных антигенов для стимуляции уничтожения опухолевых клеток, экспрессирующих опухолеассоциированные антигены. В других вариантах осуществления средства, которые можно соединять с антителом, могут являться, например, иммуномодулирующим средством (например, для модуляции активности иммунных клеток вблизи ADC), визуализирующим средством (например, для облегчения визуализации ADC у индивидуума или в биологическом образце индивидуума) или средством для повышения времени полужизни в сыворотке или биологической активности антитела.

Способы конъюгации цитотоксического средства или других терапевтических средств с антителами описаны в различных публикациях. Например, химическую модификацию можно осуществлять в антителах через амины боковой цепи лизина или сульфгидрильные группы цистеина, активированные посредством восстановления межцепочечных дисульфидных связей, для того, чтобы произошла реакция конъюгации. См., например, Tanaka et al., FEBS Letters 579:2092-2096, 2005, и Gentle et al., Bioconjugate Chem. 15:658-663, 2004. Также описаны реакционноспособные остатки цистеина, сконструированные в конкретных участках антител для специфической конъюгации лекарственного средства с определенной стехиометрией. См., например, Junutula et al., Nature Biotechnology, 26:925-932, 2008. Конъюгация с использованием метки, содержащей глутамин-донор ацила, или эндогенного глутамина, сделанного реакционноспособным (т.е. со способностью образовывать ковалентную связь в качестве донора ацила) посредством конструирования полипептида в присутствии трансглутаминазы и амина (например, цитотоксического средства, содержащего или прикрепленного к реакционноспособному амину), также описана в международных заявках WO2012/059882 и WO2015015448. В некоторых вариантах осуществления ADC может иметь любой из признаков или характеристик ADC, представленных WO2016166629, таким образом, включенной в качестве ссылки для всех целей.

Лекарственные средства/средства, которые можно соединять с антителом в формате ADC, могут включать, например, цитотоксические средства, иммуномодулирующие средства, визуализирующие средства, терапевтические белки, биополимеры или олигонуклеотиды.

Примеры цитотоксических средств, которые можно включать в ADC, включают антрациклин, ауристатин, доластатин, комбретастатин, дуокармицин, димер пирролобензодиазепина, димер индолино-бензодиазепинп, ендиин, гелданамицин, майтанзин, пуромицин, таксан, алкалоид барвинка, камптотецин, тубулизин, гемиастерлин, сплайсостатин, пладиенолид и их стереоизомеры, изостереомеры, аналоги или производные.

Примеры иммуномодулирующих средств, которые можно включать в ADC, включают ганцикловир, этанерцепт, такролимус, сиролимус, воклоспорин, циклоспорин, рапамицин, циклофосфамид, азатиоприн, микофенолата мофетил, метотрексат, глюкокортикоид и его аналоги, цитокины, факторы роста стволовых клеток, лимфотоксины, фактор некроза опухоли (ФНО), гемопоэтические факторы, интерлейкины (например, интерлейкин-1 (ИЛ-1), ИЛ-2, ИЛ-3, ИЛ-6, ИЛ-10, ИЛ-12, ИЛ-18 и ИЛ-21), колониестимулирующие факторы (например, гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (Г-КСФ) и гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (ГМ-КСФ)), интерфероны (например, интерферон-альфа, -бета и гамма.), фактор роста стволовых клеток, обозначенный как "фактор S 1", эритропоэтин и тромбопоэтин или их комбинацию.

Примеры визуализирующих средств, которые можно включать в ADC, включают флуоресцеин, родамин, лантаноид-активированные фосфоры и их производные или радиоактивный изотоп, связанный с хелатором. Неограничивающие примеры флуорофоров включают флуоресцеинизотиоцианат (FITC) (например, 5-FITC), флуоресцеин амидит (FAM) (например, 5-FAM), эозин, карбоксифлуоресцеин, эритрозин, Alexa Fluor^TM (например, Alexa 350, 405, 430, 488, 500, 514, 532, 546, 555, 568, 594, 610, 633, 647, 660, 680, 700 или 750), карбокситетраметилродамин (TAMRA) (например, 5,-TAMRA), тетраметилродамин (TMR) и сульфородамин (SR) (например, SR101). Неограничивающие примеры хелаторов включают 1,4,7,10-тетраазациклододекан-N, N',N'',N'''-тетрауксуснкю кислоту (DOTA), 1,4,7-триазациклононан-1,4,7-триуксусную кислоту (NOTA), 1,4,7-триазациклононан, 1-глутаровая кислота-4,7-уксусную кислоту (дефероксамин), диэтилентриаминпентауксусную кислоту (DTPA) и 1,2-бис(o-аминофенокси)этан-N, N,N',N'-тетрауксусную кислоту (BAPTA).

Примеры терапевтических белков, которые можно включать в ADC, включают токсин, гормон, фермент и фактор роста.

Примеры биосовместимых полимеров, которые можно включать в ADC, включают водорастворимые полимеры, такие как полиэтиленгликоль (PEG) или его производные и цвиттер-ион-содержащие биосовместимые полимеры (например, фосфорилхолин-содержащий полимер).

Примеры биосовместимых полимеров, которые можно включать в ADC, включают антисмысловые олигонуклеотиды.

В некоторых вариантах осуществления антитело против антигена, представленное в настоящем описании, можно включать в молекулу биспецифического антитела. Биспецифические антитела являются моноклональными антителами, имеющими специфичность связывания в отношении по меньшей мере двух разных антигенов.

Иммуномодулирующие средства включают различные типы молекул, которые могут стимулировать иммунный ответ у индивидуума, такие как агонисты паттерн-распознающего рецептора (PRR), иммуностимулирующие цитокины и противоопухолевые вакцины.

Паттерн-распознающие рецепторы (PRR) являются рецепторами, экспрессирующимися клетками иммунной системы и распознающими различные молекулы, ассоциированные с патогенами и/или повреждением или гибелью клеток. PRR участвуют во врожденном иммунном ответе и адаптивном иммунном ответе. Агонисты PRR можно использовать для стимуляции иммунного ответа в индивидуума. Существует множество классов молекул PRR, включая Толл-подобные рецепторы (TLR), RIG-I-подобные рецепторы (RLR), рецепторы, подобные нуклеотид-связывающему домену олигомеризации (NOD) (NLRs), лектиновые рецепторы C-типа (CLR) и белок-стимулятор интерфероновых генов (STING).

Термины "TLR" и "Толл-подобный рецептор" относятся к любому Толл-подобному рецептору. Толл-подобные рецепторы являются рецепторами, участвующими в активации иммунных ответов. TLR распознают, например, патоген-ассоциированные молекулярные паттерны (PAMP), экспрессирующиеся в микроорганизмах, а также эндогенные молекулярные паттерны, ассоциированные с повреждением (DAMP), высвобождающиеся из умерших или умирающих клеток.

Молекулы, активирующие TLR (и, таким образом, активирующие иммунные ответы), обозначают в настоящем описании как "агонисты TLR". Агонисты TLR могут включать, например, низкомолекулярные соединения (например, органическую молекулу, имеющую молекулярную массу до приблизительно 1000 Да), а также крупные молекулы (например, олигонуклеотиды и белки). Некоторые агонисты TLR являются специфическими для одного типа TLR (например, TLR3 или TLR9), в то время как некоторые агонисты TLR активируют два или более типа TLR (например, и TLR7, и TLR8).

Примеры агонистов TLR, представленные в настоящем описании, включают агонисты TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8 и TLR9.

Примеры низкомолекулярных агонистов TLR включают описанные, например, в патентах США №№ 4689338; 4929624; 5266575; 5268376; 5346905; 5352784; 5389640; 5446153; 5482936; 5756747; 6110929; 6194425; 6331539; 6376669; 6451810; 6525064; 6541485; 6545016; 6545017; 6573273; 6656938; 6660735; 6660747; 6664260; 6664264; 6664265; 6667312; 6670372; 6677347; 6677348; 6677349; 6683088; 6756382; 6797718; 6818650 и 77091214; патентных публикациях США №№ 2004/0091491, 2004/0176367 и 2006/0100229; и международных патентных публикациях №№ WO 2005/18551, WO 2005/18556, WO 2005/20999, WO 2005/032484, WO 2005/048933, WO 2005/048945, WO 2005/051317, WO 2005/051324, WO 2005/066169, WO 2005/066170, WO 2005/066172, WO 2005/076783, WO 2005/079195, WO 2005/094531, WO 2005/123079, WO 2005/123080, WO 2006/009826, WO 2006/009832, WO 2006/026760, WO 2006/028451, WO 2006/028545, WO 2006/028962, WO 2006/029115, WO 2006/038923, WO 2006/065280, WO 2006/074003, WO 2006/083440, WO 2006/086449, WO 2006/091394, WO 2006/086633, WO 2006/086634, WO 2006/091567, WO 2006/091568, WO 2006/091647, WO 2006/093514 и WO 2006/098852.

Дополнительные примеры низкомолекулярных агонистов TLR включают некоторые производные пурина (такие как описываемые в патентах США №№ 6376501 и 6028076), некоторые производные амида имидазохинолина (такие как описываемые в патенте США № 6069149), некоторые производные имидазопиридина (такие как описываемые в патенте США № 6518265), некоторые производные бензимидазола (такие как описываемые в патенте США № 6387938), некоторые производные 4-аминопиримидина, слитые с пятичленным азот-содержащим гетероциклическим ядром (такие как производные аденина, описанные в патентах США №№ 6376501, 6028076 и 6329381 и в WO 02/08905) и некоторые производные 3-.бета.-D-рибофуранозилтиазоло[4,5-d]пиримидина (такие как описываемые в патентной публикации США № 2003/0199461) и некоторые низкомолекулярные иммунопотенциирующие соединения, такие как описываемые, например, в патентной публикации США № 2005/0136065.

Примеры крупных агонистов TLR включают олигонуклеотидные последовательности. Некоторые агонисты TLR-олигонуклеотидные последовательности содержат динуклеотиды цитозин-гуанин (CpG) и описаны, например, в патентах США №№ 6194388, 6207646, 6239116, 6339068 и 6406705. Некоторые CpG-содержащие олигонуклеотиды могут включать синтетические иммуномодулирующие структурные мотивы, такие как описываемые, например, в патентах США №№ 6426334 и 6476000. В других агонистах TLR-нуклеотидных последовательностях отсутствуют последовательности CpG, и они описаны, например, в международной патентной публикации № WO 00/75304. Другие агонисты TLR-нуклеотидные последовательности включают гуанозин- и уридин-богатую одноцепочечную РНК (ssRNA), такую как описанная, например, в Heil et al, Science, vol. 303, pp. 1526-1529, Mar. 5, 2004.

Другие агонисты TLR включают биологические молекулы, такие как аминоалкилглюкозаминидфосфаты (AGP), и описаны, например, в патентах США №№ 6113918, 6303347, 6525028 и 6649172.

Агонисты TLR также включают инактивированные патогены или их фракции, которые могут активировать множество разных типов рецепторов TLR. Примеры агонистов TLR, полученных из патогенов, включают BCG, экстракт Mycobacterium obuense, талимоген лагерпарепвек (T-Vec) (полученный из HSV-1) и Pexa-Vec (полученный из вируса осповакцины).

В некоторых вариантах осуществления агонист TLR может являться агонистическим антителом, специфически связывающимся с TLR.

Ниже приведено краткое описание различных TLR, а также агонистов TLR. Перечисление агонистов TLR ниже для конкретного TLR не следует истолковывать как указание того, что упомянутый агонист TLR обязательно активирует только этот TLR (например, некоторые молекулы могут активировать множество типов TLR или даже множество классов PRR). Например, некоторые молекулы, приведенные ниже в качестве примеров агонистов TLR4, также могут являться агонистами TLR5.

Термины "TLR1" и "Толл-подобный рецептор 1" относятся к любой форме рецептора TLR1, а также вариантам, изоформам и видовым гомологам, сохраняющим по меньшей мере часть активности TLR1. Если не указано иначе, например, со ссылкой на TLR1 человека, TLR1 включает нативную последовательность TLR1 всех видов млекопитающих, например человека, обезьяны и мыши. Один из примеров TLR1 человека приведен под регистрационным номером UniProt Q15399.

В рамках изобретения термин "агонист TLR1" означает любую молекулу, которая после связывания с TLR1 (1) стимулирует или активирует TLR1, (2) повышает, способствует, индуцирует или пролонгирует активность, функцию или присутствие TLR1 или (3) повышает, способствует или индуцирует экспрессию TLR1. Агонисты TLR1, которые можно использовать в любом из способов лечения, лекарственных средств и применении по настоящему изобретению, включают, например, бактериальные липопротеины и их производные, связывающиеся с TLR1.

Примеры агонистов TLR1, которые можно использовать в способах лечения, лекарственных средствах и применении по настоящему изобретению, включают, например, бактериальные липопротеины и их производные, такие как SPM-105 (полученные из автоклавированных микобактерий), OM-174 (производное липида A), OmpS1 (порин из Salmonella typhi), OmpS1 (порин из Salmonella typhi), OspA (из Borrelia burgdorferi), MALP-2 (макрофаг-активирующий липопептид-2kD микоплазмы), STF (растворимый туберкулезный фактор), CU-T12-9, дипровоцим и липопептиды, полученные из компонентов клеточной стенки, такие как PAM2CSK4, PAM3CSK4 и PAM3Cys.

TLR1 может образовывать гетеродимер с TLR2 и, таким образом, многие агонисты TLR1 также являются агонистами TLR2.

Термины "TLR2" и "Толл-подобный рецептор 2" относятся к любой форме рецептора TLR2, а также вариантам, изоформам и видовым гомологам, сохраняющим по меньшей мере часть активности TLR2. Если не указано иначе, например, со ссылкой на TLR2 человека, TLR2 включает нативную последовательность TLR2 всех видов млекопитающих, например, человека, обезьяны и мыши. Один из примеров TLR2 человека приведен под регистрационным номером UniProt O60603.

Термин "агонист TLR2" в рамках изобретения означает любую молекулу, которая после связывания TLR2 (1) стимулирует или активирует TLR2, (2) повышает, способствует, индуцирует или пролонгирует активность, функцию или присутствие TLR2 или (3) повышает, способствует или индуцирует экспрессию TLR2. Агонисты TLR2, которые можно использовать в любом из способов лечения, лекарственных средств и применении по настоящему изобретению, включают, например, бактериальные липопротеины и их производные, которые связываются с TLR2.

Примеры агонистов TLR2, которые можно использовать в способах лечения, лекарственных средствах и применении по настоящему изобретению, включают, например, бактериальные липопротеины (например, диацилированные липопротеины) и их производные, такие как SPM-105 (полученный их автоклавированных микобактерий), OM-174 (производное липида A), OmpS1 (порин из Salmonella typhi), OmpS1 (порин из Salmonella typhi), OspA (из Borrelia burgdorferi), MALP-2 (макрофаг-активирующий липопептид-2kD микоплазмы), STF (растворимый туберкулезный фактор), CU-T12-9, дипровоцим, ампливант и липопептиды, полученные из компонентов клеточной стенки, такие как PAM2CSK4, PAM3CSK4 и PAM3Cys.

TLR2 может образовывать гетеродимер с TLR1 или TLR6, и, таким образом, многие агонисты TLR2 также являются агонистами TLR1 или TLR6.

Термины "TLR3" и "Толл-подобный рецептор 3" относятся к любой форме рецептора TLR3, а также вариантам, изоформам и видовым гомологам, сохраняющим по меньшей мере часть активности TLR3. Если не указано иначе, например, со ссылкой на TLR3 человека, TLR3 включает нативную последовательность TLR3 всех видов млекопитающих, например, человека, обезьяны и мыши. Один из примеров TLR3 человека приведен под регистрационным номером UniProt O15455.

В рамках изобретения термин "агонист TLR3" означает любую молекулу, которая после связывания с TLR3 (1) стимулирует или активирует TLR3, (2) повышает, способствует, индуцирует или пролонгирует активность, функцию или присутствие TLR3 или (3) повышает, способствует или индуцирует экспрессию TLR3. Агонисты TLR3, которые можно использовать в любом из способов лечения, лекарственных средств и применении по настоящему изобретению включают, например, лиганды нуклеиновой кислоты, связывающиеся с TLR3.

Примеры агонистов TLR3, которые можно использовать в способах лечения, лекарственных средствах и применении по настоящему изобретению, включают лиганды TLR3, такие как синтетическая дцРНК, полиинозин-полицитидиловая кислота ["поли(I:C)"] (доступна, например, в InvivoGen в высокомолекулярных (HMW) и низкомолекулярных (LMW) препаратах), полиаденил-полиуридиловая кислота ["поли(A:U)"] (доступная, например, в InvivoGen), поли-ICLC (см. Levy et al., Journal of Infectious Diseases, vol. 132, no. 4, pp. 434-439, 1975), амплиген (см. Jasani et al., Vaccine, vol. 27, no. 25-26, pp. 3401-3404, 2009), хилтонол, ринтатолимод и RGC100 (см. Naumann et al., Clinical and Developmental Immunology, vol. 2013, article ID 283649).

Термины "TLR4" и "Толл-подобный рецептор 4" относятся к любой форме рецептора TLR4, а также вариантам, изоформам и видовым гомологам, сохраняющим по меньшей мере часть активности TLR4. Если не указано иначе, например, со ссылкой на TLR4 человека, TLR4 включает нативную последовательность TLR4 всех видов млекопитающих, например, человека, обезьяны и мыши. Один из примеров TLR4 человека приведен под регистрационным номером UniProt O00206.

в рамках изобретения термин "агонист TLR4" означает любую молекулу, которая после связывания с TLR4 (1) стимулирует или активирует TLR4, (2) повышает, способствует, индуцирует или пролонгирует активность, функцию или присутствие TLR4 или (3) повышает, способствует или индуцирует экспрессию TLR4. Агонисты TLR4, которые можно использовать в любом из способов лечения, лекарственных средств и применении по настоящему изобретению, включают, например, бактериальные липополисахариды (LPS) и их производные, связывающиеся с TLR4.

Примеры агонистов TLR4, которые можно использовать в способах лечения, лекарственных средствах и применении по настоящему изобретению, включают, например, бактериальные липополисахариды (LPS) и их производные, такие как B:0111 (Sigma), монофосфорил-липид A (MPLA), 3DMPL (3-O-деацилированный MPL), GLA-AQ, G100, AS15, ASO2, GSK1572932A (GlaxoSmithKline, UK).

Термины "TLR5" и "Толл-подобный рецептор 5" относятся к любой форме рецептора TLR5, а также вариантам, изоформам и видовым гомологам, сохраняющим по меньшей мере часть активности TLR5. Если не указано иначе, например, со ссылкой на TLR5 человека, TLR5 включает нативную последовательность TLR5 всех видов млекопитающих, например, человека, обезьяны и мыши. Один из примеров TLR5 человека приведен под регистрационным номером UniProt O60602.

В рамках изобретения термин "агонист TLR5" означает любую молекулу, которая после связывания с TLR5 (1) стимулирует или активирует TLR5, (2) повышает, способствует, индуцирует или пролонгирует активность, функцию или присутствие TLR5 или (3) повышает, способствует или индуцирует экспрессию TLR5. Агонисты TLR5, которые можно использовать в любом из способов лечения, лекарственных средств и применении по настоящему изобретению, включают, например, бактериальные флагеллины и их производные, связывающиеся с TLR5.

Примеры агонистов TLR5, которые можно использовать в способах лечения, лекарственных средствах и применении по настоящему изобретению, включают, например, бактериальный флагеллин, очищенный из B. subtilis, флагеллин, очищенный из P. aeruginosa, флагеллин, очищенный из S. typhimurium, и рекомбинантный флагеллин (все из которых доступны в InvivoGen), энтолимод (CBLB502; фармакологически оптимизированное производное флагеллина).

Термины "TLR6" и "Толл-подобный рецептор 6" относятся к любой форме рецептора TLR6, а также вариантам, изоформам и видовым гомологам, сохраняющим по меньшей мере часть активности TLR6. Если не указано иначе, например, со ссылкой на TLR6 человека, TLR6 включает нативную последовательность TLR6 всех видов млекопитающих, например, человека, обезьяны и мыши. Один из примеров TLR6 человека приведен под регистрационным номером UniProt Q9Y2C9.

В рамках изобретения термин "агонист TLR6" означает любую молекулу, которая после связывания с TLR6 (1) стимулирует или активирует TLR6, (2) повышает, способствует, индуцирует или пролонгирует активность, функцию или присутствие TLR6 или (3) повышает, способствует или индуцирует экспрессию TLR6. Агонисты TLR6, которые можно использовать в любом из способов лечения, лекарственных средств и применении по настоящему изобретению, включают, например, бактериальные липопептиды и их производные, связывающиеся с TLR6.

Примеры агонистов TLR6, которые можно использовать в способах лечения, лекарственных средствах и применении по настоящему изобретению, включают, например, многие из агонистов TLR2, представленных выше, т.к. TLR2 и TLR6 могут образовывать гетеродимер. TLR6 также может образовывать гетеродимер с TLR4, и агонисты TLR6 могут включать различные агонисты TLR4, представленные выше.

Термины "TLR7" и "Толл-подобный рецептор 7" относятся к любой форме рецептора TLR7, а также вариантам, изоформам и видовым гомологам, сохраняющим по меньшей мере часть активности TLR7. Если не указано иначе, например, со ссылкой на TLR7 человека, TLR7 включает нативную последовательность TLR7 всех видов млекопитающих, например, человека, обезьяны и мыши. Один из примеров TLR7 человека приведен под регистрационным номером UniProt Q9NYK1.

В рамках изобретения термин "агонист TLR7" означает любую молекулу, которая после связывания с TLR7 (1) стимулирует или активирует TLR7, (2) повышает, способствует, индуцирует или пролонгирует активность, функцию или присутствие TLR7 или (3) повышает, способствует или индуцирует экспрессию TLR7. Агонисты TLR7, которые можно использовать в любом из способов лечения, лекарственных средств и применении по настоящему изобретению включают, например, лиганды нуклеиновой кислоты, связывающиеся с TLR7.

Примеры агонистов TLR7, которые можно использовать в способах лечения, лекарственных средствах и применении по настоящему изобретению, включают рекомбинантную одноцепочечную ("ss")РНК, имидазохинолиновые соединения, такие как имиквимод (R837), гардиквимод и резиквимод (R848); локсорибин (7-аллил-7,8-дигидро-8-оксо-гуанозин) и родственные соединения; 7-тиа-8-оксогуанозин, 7-деазагуанозин и родственные гуанозиновые аналоги; ANA975 (Anadys Pharmaceuticals) и родственные соединения; SM-360320 (Sumimoto); 3M-01, 3M-03, 3M-852 и 3M-S-34240 (3M Pharmaceuticals); GSK2245035 (GlaxoSmithKline; молекула 8-оксоаденина), AZD8848 (AstraZeneca; молекула 8-оксоаденин), MEDI9197 (Medimmune; ранее известный как 3M-052), ssRNA40 и аналоги аденозина, такие как UC-1V150 (Jin et al., Bioorganic Medicinal Chem Lett (2006) 16:4559-4563, соединение 4). Многие агонисты TLR7 также являются агонистами TLR8.

Термины "TLR8" и "Толл-подобный рецептор 8" относятся к любой форме рецептора TLR8, а также вариантам, изоформам и видовым гомологам, сохраняющим по меньшей мере часть активности TLR8. Если не указано иначе, например, со ссылкой на TLR8 человека, TLR8 включает нативную последовательность TLR8 всех видов млекопитающих, например, человека, обезьяны и мыши. Одним из примеров TLR8 человека приведен под регистрационным номером UniProt Q9NR97.

В рамках изобретения термин "агонист TLR8" означает любую молекулу, которая после связывания с TLR8 (1) стимулирует или активирует TLR8, (2) повышает, способствует, индуцирует или пролонгирует активность, функцию или присутствие TLR8 или (3) повышает, способствует или индуцирует экспрессию TLR8. Агонисты TLR8, которые можно использовать в любом из способов лечения, лекарственных средств и применении по настоящему изобретению, включают, например, лиганды нуклеиновой кислоты, связывающиеся с TLR8.

Примеры агонистов TLR8, которые можно использовать в способах лечения, лекарственных средствах и применении по настоящему изобретению, включают рекомбинантную одноцепочечную оцРНК, имиквимод (R837), гардиквимод, резиквимод (R848), 3M-01, 3M-03, 3M-852 и 3M-S-34240 (3M Pharmaceuticals); GSK2245035 (GlaxoSmithKline; молекула 8-оксоадениан), AZD8848 (AstraZeneca; молекула 8-оксоаденина), MEDI9197 (Medimmune; ранее известный как 3M-052), поли-G10, мотолимод и различные агонисты TLR7, представленные выше (как описано выше, многие агонисты TLR7 также являются агонистами TLR8).

Термины "TLR9" и "Толл-подобный рецептор 9" относятся к любой форме рецептора TLR9, а также вариантам, изоформам и видовым гомологам, сохраняющим по меньшей мере часть активности TLR9. Если не указано иначе, например, со ссылкой на человек TLR9, TLR9 включает нативную последовательность TLR9 всех видов млекопитающих, например, человека, обезьяны и мыши. Одним из примеров TLR9 человека приведен под регистрационным номером UniProt Q9NR96.

В рамках изобретения термин "агонист TLR9" означает любую молекулу, которая после связывания с TLR9 (1) стимулирует или активирует TLR9, (2) повышает, способствует, индуцирует или пролонгирует активность, функцию или присутствие TLR9 или (3) повышает, способствует или индуцирует экспрессию TLR9. Агонисты TLR9, которые можно использовать в любом из способов лечения, лекарственных средств и применении по настоящему изобретению, включают, например, лиганды нуклеиновой кислоты, связывающиеся с TLR9.

Примеры агонистов TLR9, которые можно использовать в способах лечения, лекарственных средствах и применении по настоящему изобретению, включают неметилированную CpG-содержащую ДНК, иммуностимулирующие олигодезоксинуклеотиды (ODN), такие как CpG-содержащие ODN, такие как CpG24555, CpG10103, CpG7909 (PF-3512676/агатолимод), CpG1018, AZD1419, ODN2216, MGN1703, SD-101, 1018ISS и CMP-001. Агонисты TLR9 также включают нуклеотидные последовательности, содержащие синтетический цитозин-фосфат-2'-дезокси-7-деазагуанозиновый динуклеотид (CpR) (Hybridon, Inc.), dSLIM-30L1 и комплексы иммуноглобулин-ДНК. Примеры агонистов TLR9 описаны в WO2003/015711, WO2004/016805, WO2009/022215, PCT/US95/01570, PCT/US97/19791 и патентах США №№ 8552165, 6194388 и 6239116, каждый из которых включен, таким образом, в настоящее описание в качестве ссылки для всех целей.

RLR включают различные цитозольные PRR, определяющие, например, дцРНК. Примеры RLR включают, например, индуцируемый ретиноевой кислотой ген I (RIG-I), ген 5, ассоциированный с дифференцировкой меланомы (MDA-5) и белок Laboratory of Genetics and Physiology 2 (LGP2).

В рамках изобретения термин "агонист RLR" означает любую молекулу, которая после связывания с RLR (1) стимулирует или активирует RLR, (2) повышает, способствует, индуцирует или пролонгирует активность, функцию или присутствие RLR или (3) повышает, способствует или индуцирует экспрессию RLR. Агонисты RLR, которые можно использовать в любом из способов лечения, лекарственных средств и применении по настоящему изобретению, включают, например, нуклеиновые кислоты и их производные, связывающиеся с RLR, и агонистические моноклональные антитела (mAb), специфически связывающееся с RLR.

Примеры агонистов RLR, которые можно использовать в способах лечения, лекарственных средствах и применении по настоящему изобретению, включают, например, короткую двухцепочечную РНК с некэпированным 5’-трифосфатом (агонист RIG-I); поли I:C (агонист MDA-5) и BO-112 (агонист MDA-A).

NLR включают различные PRR, определяющие, например, молекулы молекулярных паттернов, ассоциированных с повреждением (DAMP). NLR включают подсемейства NLRA-A, NLRB-B, NLRC-C и NLRP-P. Примеры NLR включают, например, NOD1, NOD2, NAIP, NLRC4 и NLRP3.

В рамках изобретения термин "агонист NLR" означает любую молекулу, которая после связывания с NLR (1) стимулирует или активирует NLR, (2) повышает, способствует, индуцирует или пролонгирует активность, функцию или присутствие NLR или (3) повышает, способствует или индуцирует экспрессию NLR. Агонисты NLR, которые можно использовать в любом из способов лечения, лекарственных средств и применении по настоящему изобретению, включают, например, DAMP и их производные, связывающиеся с NLR, и агонистические моноклональные антитела (mAb), специфически связывающееся с NLR.

Примеры агонистов NLR, которые можно использовать в способах лечения, лекарственных средствах и применении по настоящему изобретению, включают, например, липосомальный мурамилтрипептид/мифамуртид (агонист NOD2).

CLR включают различные PRR, определяющие, например, углеводы и гликопротеины. CLR включают трансмембранные CLR и секретируемые CLR. Примеры CLR включают, например, DEC-205/CD205, макрофагальный рецептор маннозы (MMR), дектин-1, дектин-2, Mincle, DC-SIGN, DNGR-1 и маннозо-связывающий лектин (MBL).

В рамках изобретения термин "агонист CLR" означает любую молекулу, которая после связывания с CLR (1) стимулирует или активирует CLR, (2) повышает, способствует, индуцирует или пролонгирует активность, функцию или присутствие CLR или (3) повышает, способствует или индуцирует экспрессию CLR. Агонисты CLR, которые можно использовать в любом из способов лечения, лекарственных средств и применении по настоящему изобретению, включают, например, углеводы и их производные, связывающиеся с CLR и агонистические моноклональные антитела (mAb), специфически связывающееся с CLR.

Примеры агонистов CLR, которые можно использовать в способах лечения, лекарственных средствах и применении по настоящему изобретению, включают, например, MD-фракцию (очищенный растворимый бета-глюкановый экстракт из Grifola frondosa) и Imprime PGG (бета 1,3/1,6-глюкановый PAMP, полученный из дрожжей).

Белок STING функционирует как цитозольный сенсор ДНК и адаптерный белок в передаче сигнала интерферона типа 1. Термины "STING" и "стимулятор генов интерферонов" относятся к любой форме белка STING, а также вариантам, изоформам и видовым гомологам, сохраняющим по меньшей мере часть активности STING. Если не указано иначе, например, со ссылкой на STING человека, STING включает нативную последовательность STING всех видов млекопитающих, например, человека, обезьяны и мыши. Один из примеров TLR9 человека приведен под регистрационным номером UniProt Q86WV6. STING также известен как TMEM173.

В рамках изобретения "термин STING" означает любую молекулу, которая после связывания с TLR9 (1) стимулирует или активирует STING, (2) повышает, способствует, индуцирует или пролонгирует активность, функцию или присутствие STING или (3) повышает, способствует или индуцирует экспрессию STING. Агонисты STING, которые можно использовать в любом из способов лечения, лекарственных средств и применении по настоящему изобретению, включают, например, лиганды нуклеиновой кислоты, связывающиеся с STING.

Примеры агонистов STING, которые можно использовать в способах лечения, лекарственных средствах и применении по настоящему изобретению, включают различные иммуностимулирующие нуклеиновые кислоты, такие как синтетическая двухцепочечная ДНК, циклическая ди-ГМФ, циклическая ГМФ-АМФ (цГАМФ), синтетические циклические динуклеотиды (CDN), такие как MK-1454 и ADU-S100 (MIW815), и низкомолекулярные соединения, такие как P0-424.

Другие PRR включают, например, ДНК-зависимый активатор ИФН-регуляторных факторов (DAI) и белок Absent in Melanoma 2 (AIM2).

Иммуностимулирующие цитокины включают различные сигнальные белки, стимулирующие иммунный ответ, такие как интерфероны, интерлейкины и гемопоэтические факторы роста.

Примеры иммуностимулирующих цитокинов включают ГМ-КСФ, Г-КСФ, ИФН-альфа, ИФН-гамма; ИЛ-2 (например, денилейкин-дифтитокс), ИЛ-6, ИЛ-7, ИЛ-11, ИЛ-12, ИЛ-15, ИЛ-18, ИЛ-21 и ФНО-альфа.

Иммуностимулирующие цитокины могут иметь любой подходящий формат. В некоторых вариантах осуществления иммуностимулирующий цитокин может являться рекомбинантной версией цитокина дикого типа. В некоторых вариантах осуществления иммуностимулирующий цитокин может являться мутеином, имеющим одно или более изменений аминокислот по сравнению с соответствующим цитокином дикого типа. В некоторых вариантах осуществления иммуностимулирующий цитокин можно включать в химерный белок, содержащий цитокин и по меньшей мере один другой функциональный белок (например, антитело). В некоторых вариантах осуществления иммуностимулирующий цитокин можно ковалентно связывать с лекарственным средством/средством (например, любым лекарственным средством/средством, описанным где-либо в настоящем описании, в качестве возможного компонента ADC).

Противоопухолевые вакцины включают различные композиции, содержащие опухолеассоциированные антигены (или которые можно использовать для получения опухолеассоциированного антигена у индивидуума), и, таким образом, их можно использовать для провоцирования иммунного ответа у индивидуума, которые будут направлены на опухолевые клетки, содержащие опухолеассоциированный антиген.

Примеры материалов, которые можно включать в противоопухолевую вакцину, включают, аттенуированные злокачественные клетки, опухолевые антигены, антигенпрезентирующие клетки, такие как дендритные клетки, в которые добавлен опухолевый антиген или нуклеиновые кислоты, кодирующие опухолеассоциированный антигены. В некоторых вариантах осуществления противоопухолевую вакцину можно получать с использованием собственных злокачественных клеток пациента. В некоторых вариантах осуществления противоопухолевую вакцину можно получать с использованием биологического материала не из собственных злокачественных клеток пациента.

Противоопухолевые вакцины включают, например, сипулеуцел-T и талимоген лагерпарепвек (T-VEC).

Терапия иммунными клетками включает лечение пациента иммунными клетками, способными к таргетингу злокачественных клеток. Терапия иммунными клетками включает, например, инфильтрирующие опухоль лимфоциты (TIL) и T-клетки с химерными антигенными рецепторами (CAR-T-клетки).

Примеры химиотерапевтическими средствами включают алкилирующие средства, такие как тиотепа и циклофосфамид; алкилсульфонаты, такие как бусульфан, импросульфан и пипосульфан; азиридины, такие как бензодопа, карбоквон, метуредопа и уредопа; этиленимины и метилмеламины, включая алтретамин, триэтиленмеламин, триэтиленфосфорамид, триэтилентиофосфорамид и триметилоломеламин; ацетогенины (в частности, буллатацин и буллатацинон); камптотецин (включая синтетический аналог топотекан); бриостатин; каллистатин; CC-1065 (включая его синтетические аналоги адозелесин, карзелесин и бизелесин); криптофицины (в частности, криптофицин 1 и криптофицин 8); доластатин; дуокармицин (включая синтетические аналоги, KW-2189 и CBI-TMI); элеутеробин; панкратистатин; саркодиктин; спонгистатин; азотистые иприты, такие как хлорамбуцил, хлорнафазин, холофосфамид, эстрамустин, ифосфамид, мехлоретамин, гидрохлорид оксида мехлоретамина, мелфалан, новэмбихин, фенестерин, преднимустин, трофосфамид, урамустин; нитрозомочевины, такие как кармустин, хлорозотоцин, фотемустин, ломустин, нимустин, ранимустин; антибиотики, такие как ендииновые антибиотики (например, калихимицин, в частности, калихимицин гамма 1I и калихимицин фи I1, см., например, Agnew, Chem. Intl. Ed. Engl., 33:183-186 (1994); динемицин, включая динемицин A; бисфосфонаты, такие как клодронат; эсперамицин; а также неокарциностатин хромофор и родственные хромопротеиновые хромофоры ендииновых антибиотиков), аклациномизины, актиномицин, аутрамицин, азасерин, блеомицины, кактиномицин, карабицин, каминомицин, карцинофилин, хромомицины, дактиномицин, даунорубицин, деторубицин, 6-диазо-5-оксо-L-норлейцин, доксорубицин (включая морфолино-доксорубицин, цианоморфолино-доксорубицин, 2-пирролино-доксорубицин и дезоксидоксорубицин), пегилированный липосомальный доксорубицин, эпирубицин, эзорубицин, идарубицин, марцелломицин, митомицины, такие как митомицин C, микофеноловую кислоту, ногаламицин, оливомицины, пепломицин, потфиромицин, пуромицин, квеламицин, родорубицин, стрептонигрин, стрептозоцин, туберцидин, убенимекс, зиностатин, зорубицин; антиметаболиты, такие как метотрексат и 5-фторурацил (5-FU); аналоги фолиевой кислоты, такие как деноптерин, метотрексат, птероптерин, триметрексат; аналоги пурина, такие как флударабин, 6-меркаптопурин, тиамиприн, тиогуанин; аналоги пиримидина, такие как анцитабин, азацитидин, 6-азауридин, кармофур, цитарабин, дидезоксиуридин, доксифлуридин, эноцитабин, флоксуридин; андрогены, такие как калустерон, пропионат дромостанолона, эпитиостанол, мепитиостан, тестолактон; антиадреналовые средства, такие как аминоглутемид, митотан, трилостан; пополнитель фолиевой кислоты, такой как фролиновая кислота; ацеглатон; альдофосфамид гликозид; аминолевулиновую кислоту; энилурацил; амсакрин; бестрабуцил; бисантрен; эдатрексат; дефофамин; демеколцин; диазиквон; эфлорнитин; ацетат эллиптиния; эпотилон; этоглюцид; нитрат галлия; гидроксимочевину; лентинан; лонидамин; майтанзиноиды, такие как майтанзин и ансамитоцины; митогуазон; митоксантрон; мопидамол; нитракрин; пентостатин; фенамет; пирарубицин; лозоксантрон; подофиллиновую кислоту; 2-этилгидразид; прокарбазин; разоксан; ризоксин; сизофуран; спирогерманий; тенуазоновую кислоту; триазиквон; 2,2′,2″-трихлортриэтиламин; трихотецены (в частности, токсин T-2, верракурин A, роридин A и ангуидин); уретан; виндезин; дакарбазин; манномустин; митобронитол; митолактол; пипоброман; гaцитозин; арабинозид ("Ara-C"); циклофосфамид; тиотепа; таксоиды, например, паклитаксел и доксетаксел; хлорамбуцил; гемцитабин; 6-тиогуанин; меркаптопурин; метотрексат; аналоги платины, такие как цисплатин и карбоплатин; винбластин; платина; этопозид (VP-16); ифосфамид; митоксантрон; винкристин; винорелбин; новантрон; тенипозид; эдатрексат; дауномицин; аминоптерин; кселода; ибандронат; CPT-11; ингибитор топоизомеразы RFS 2000; дифторметилорнитин (DMFO); ретиноиды, такие как ретиноевая кислота; капецитабин; и фармацевтически приемлемые соли, кислоты или производные любых из указанных выше соединений. Также включены противогормональные средства, регулирующие или ингибирующие действие гормонов на опухоли, такие как антиэстрогены и селективные модуляторы эстрогеновых рецепторов (SERM), включая, например, тамоксифен, ралоксифен, дролоксифен, 4-гидрокситамоксифен, триоксифен, кеоусифен, LY117018, онапристон и торемифен (фарестон); ингибиторы ароматазы, ингибирующие фермент ароматазу, регулирующую продукцию эстрогена в надпочечников, такие как, например, 4(5)-имидазолы, аминоглутетимид, мегестрол ацетат, экземестан, форместан, фадрозол, ворозол, летрозол и анастрозол; и антиандрогены, такие как флутамид, нилутамид, бикалутамид, лейпролид и гозерелин; ингибиторы KRAS; ингибиторы MCT4; ингибиторы MAT2a; ингибиторы тирозинкиназ, такие как сунитиниб, акситиниб; ингибиторы alk/c-Met/ROS, такие как кризотиниб, лорлатиниб; ингибиторы mTOR, такие как темсиролимус, гедатолисиб; ингибиторы src/abl, такие как босутиниб; ингибиторы циклин-зависимых киназ (CDK), такие как палбоциклиб, PF-06873600; ингибиторы erb, такие как дакомитиниб; ингибиторы PARP, такие как талазопариб; ингибиторы SMO, такие как гласдегиб, PF-5274857; ингибиторы EGFR T790M, такие как PF-06747775; ингибиторы EZH2, такие как PF-06821497; ингибиторы PRMT5, такие как PF-06939999; ингибиторы TGFRβr1, такие как PF-06952229; и фармацевтически приемлемые соли, кислоты или производные любого из указанных выше соединений. В конкретных вариантах осуществления такое дополнительное терапевтическое средство является бевацизумабом, цетуксимабом, сиролимусом, панитумумабом, 5-фторурацилом (5-FU), капецитабином, тивозанибом, иринотеканом, оксалиплатином, цисплатином, трифлуридином, типирацилом, лейковорином, гемцитабином, регорафинибом или гидрохлоридом эрлотиниба.

В некоторых вариантах осуществления антитело против GUCY2c или биспецифическое антитело против CD3-GUCY2c используют в комбинации с одним или более другими терапевтическими средствами, направленно воздействующими на модулятор иммунных контрольных точек или костимуляторное средство, такими как, в качестве неограничивающих примеров, средство, направленно воздействующее на CTLA-4, LAG-3, B7-H3, B7-H4, B7-DC (PD-L2), B7-H5, B7-H6, B7-H8, B7-H2, B7-1, B7-2, ICOS, ICOS-L, TIGIT, CD2, CD47, CD80, CD86, CD48, CD58, CD226, CD155, CD112, LAIR1, 2B4, BTLA, CD160, TIM1, TIM-3, TIM4, VISTA (PD-H1), OX40, OX40L, GITR, GITRL, CD70, CD27, 4-1BB, 4-BBL, DR3, TL1A, CD40, CD40L, CD30, CD30L, LIGHT, HVEM, SLAM (SLAMF1, CD150), SLAMF2 (CD48), SLAMF3 (CD229), SLAMF4 (2B4, CD244), SLAMF5 (CD84), SLAMF6 (NTB-A), SLAMCF7 (CS1), SLAMF8 (BLAME), SLAMF9 (CD2F), CD28, CEACAM1 (CD66a), CEACAM3, CEACAM4, CEACAM5, CEACAM6, CEACAM7, CEACAM8, CEACAM1-3AS, CEACAM3C2, CEACAM1-15, PSG1-11, CEACAM1-4C1, CEACAM1-4S, CEACAM1-4L, IDO, TDO, CCR2, путь CD39-CD73-аденозин (A2AR), BTK, TIK, CXCR2, CXCR4, CCR4, CCR8, CCR5, CSF-1 или модулятор врожденного иммунного ответа.

В некоторых вариантах осуществления антитело против GUCY2c или биспецифическое антитело против CD3-GUCY2c используют в комбинации, например, с антагонистическим антителом против CTLA-4, таким как, например, ипилимумаб; антагонистическим антителом против LAG-3, таким как BMS-986016 и IMP701; антагонистическим антителом против TIM-3; антагонистическим антителом против B7-H3, таким как, например, MGA271; антагонистическим антителом против VISTA; антагонистическим антителом против TIGIT; антитело; антителом против CD80; антителом против CD86; антагонистическим антителом против B7-H4; агонистическим антителом против ICOS; агонистическим антителом против CD28; модулятором врожденного иммунного ответа (например, TLR, KIR, NKG2A) и ингибитором IDO.

В некоторых вариантах осуществления антитело против GUCY2c или биспецифическое антитело против CD3-GUCY2c используют в комбинации с агонистом OX40, таким как, например, агонистическое антитело против OX-40. В некоторых вариантах осуществления антитело против GUCY2c или биспецифическое антитело против CD3-GUCY2c используют в комбинации с агонистом GITR, таким как, например, агонистическое антитело против GITR, такое как, в качестве неограничивающих примеров, TRX518. В некоторых вариантах осуществления антитело против GUCY2c или биспецифическое антитело против CD3-GUCY2c используют в комбинации с ингибитором IDO. В некоторых вариантах осуществления антитело против GUCY2c или биспецифическое антитело против CD3-GUCY2c используют в комбинации с цитокиновой терапией, такой как, в качестве неограничивающих примеров, ИЛ-15, КСФ-1, М-КСФ-1 и т.д.

В некоторых вариантах осуществления антитело против GUCY2c или биспецифическое антитело против CD3-GUCY2c используют в комбинации с одним или более другими терапевтическими антителами, такими как, в качестве неограничивающих примеров, антитело против CD19, CD22, CD40, CD52 или CCR4.

В некоторых вариантах осуществления композиция антитела против GUCY2c или биспецифического антитела против CD3-GUCY2c содержит по меньшей мере одно дополнительное средство, такое как бевацизумаб, цетуксимаб, сиролимус, панитумумаб, 5-фторурацил(5-FU), капецитабин, тивозаниб, иринотекан, оксалиплатин, цисплатин, трифлуридин, типирацил, лейковорин, гемцитабин и эрлотиниба гидрохлорид.

В некоторых вариантах осуществления антитело против GUCY2c или биспецифическое антитело против CD3-GUCY2c можно вводить совместно или вводить последовательно до или после другого средства с интервалами в диапазоне от минут до недель. В вариантах осуществления, если другие средства, и/или белки, или полинуклеотиды вводят раздельно, как правило, будут обеспечивать то, что между каждым введением не проходил значительный период времени, таким образом, что средство и композиция по настоящему изобретению все равно смогут вызывать преимущественно комбинированный эффект в отношении индивидуума. В таких случаях предусмотрено, что можно вводить оба средства в пределах приблизительно 12-24 ч. друг относительно друга и, более предпочтительно - в пределах приблизительно 6-12 ч. друг относительно друга. Однако в некоторых случаях желательным может являться значительное увеличение периода времени для введения, где между соответствующими введениями проходит от нескольких дней (2, 3, 4, 5, 6 или 7) до нескольких недель (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8).

В некоторых вариантах осуществления композицию антитела против GUCY2c или биспецифического антитела против CD3-GUCY2c комбинируют со схемой лечения, дополнительно включающей общепринятую терапию, выбранную из группы, состоящей из: хирургического вмешательства, лучевой терапии, химиотерапии, таргетированной терапии, иммунотерапии, гормональной терапии, ингибирования ангиогенеза и паллиативной терапии.

Композиция, используемая в настоящем изобретении, может дополнительно содержать фармацевтически приемлемые носители, эксципиенты или стабилизаторы (Remington: The Science and practice of Pharmacy 21st Ed., 2005, Lippincott Williams and Wilkins, Ed. K. E. Hoover) в форме лиофилизированных составов или водных растворов. Приемлемые носители, эксципиенты или стабилизаторы являются нетоксичными для реципиентов в дозах и концентрациях и могут содержать буферы, такие как фосфат, цитрат и другие органические кислоты; антиоксиданты, включая аскорбиновую кислоту и метионин; консерванты (такие как хлорид октадецилдиметилбензиламмония; хлорид гексаметония; хлорид бензалкония, хлорид бензетония; фенол, бутиловый или бензиловый спирт; алкилпарабены, такие как метил- или пропилпарабен; катехол; резорцин; циклогексанол; 3-пентанол; и m-крезол); низкомолекулярные (менее приблизительно 10 остатков) полипептиды; белки, такие как сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины; гидрофильные полимеры, такие как поливинилпирролидон; аминокислоты, такие как глицин, глутамин, аспарагин, гистидин, аргинин или лизин; моносахариды, дисахариды и другие углеводы, включая глюкозу, маннозу или декстраны; хелатирующие средства, такие как ЭДТА; сахара, такие как сахароза, маннит, трегалоза или сорбит; солеобразующие противоионы, такие как натрий; комплексные соединения с металлами (например, комплексы Zn-белок); и/или неионные поверхностно-активные средства, такие как TWEEN™, PLURONIC™ или полиэтиленгликоль (PEG). Фармацевтически приемлемые эксципиенты дополнительно приведены в настоящем описании.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к способу получения антитела против GUCY2c или биспецифического антитела, как представлено в настоящем описании, включающему культивирование клетки-хозяина в условиях, приводящих к продукции антитела против GUCY2c или биспецифического антитела, представленного в настоящем описании, и очистку антитела или биспецифического антитела из культуры.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к применению антитела против GUCY2c, биспецифического антитела, фармацевтической композиции, полинуклеотида, супернатанта, вектора или клетки-хозяина, представленных в настоящем описании, в производстве лекарственного средства для детекции, диагностики и/или лечения GUCY2c-ассоциированного нарушения.

Дополнительный аспект изобретения относится к набору, содержащему антитело против GUCY2c или биспецифическое антитело против CD3-GUCY2c, как представлено в настоящем описании выше, и инструкции по использованию в соответствии с любыми из способов по изобретению, представленных в настоящем описании. Как правило, эти инструкции включают описание введения антитела против GUCY2c или биспецифического антитела против CD3-GUCY2c для описанного выше терапевтического лечения. Этот набор содержит любую фармацевтическую композицию, представленную в настоящем описании. Фармацевтические композиции и другие реагенты могут находиться в наборах в любой удобной форме, такой как, например, раствор или порошок.

В другом аспекте набор дополнительно содержит одно или более других профилактических или терапевтических средств, которые можно использовать в лечении злокачественного новообразования, в одном или более контейнерах. В одном из вариантов осуществления другое профилактическое или терапевтическое средство является химиотерапевтическим средством. В других аспектах профилактическое или терапевтическое средство является биологическим или гормональным терапевтическим средством.

Некоторые аспекты фармацевтических композиций, профилактических или терапевтических средств по изобретению, предпочтительно, тестируют in vitro, в системе культуры клеток и в модели на животных организм, такой как система модели на грызунах, на желаемую терапевтическую активность перед использованием на людях.

Токсичность и эффективность профилактических и/или терапевтических способов по настоящему изобретению можно определять стандартными фармацевтическими способами в культурах клеток или на экспериментальных животных, например, для определения LD₅₀ (дозы, летальной для 50% популяции) и ED₅₀ (дозы, терапевтически эффективной для 50% популяции). Соотношение дозы между токсическими и терапевтическими эффектами представляет собой терапевтический индекс, и его можно выражать как соотношение LD₅₀/ED₅₀. Профилактические и/или терапевтические средства, демонстрирующие большие терапевтические индексы, являются предпочтительными.

Кроме того, для оценки профилактической и/или терапевтической полезности терапевтических средств или комбинированной терапии, представленных в настоящем описании, для лечения или профилактики злокачественного новообразования можно использовать любые анализы, известные специалистам в этой области.

Инструкции, касающиеся использования антитела против GUCY2c или биспецифического антитела против CD3-GUCY2c, представленного в настоящем описании, как правило, включают информацию о дозе, режиме дозирования и пути введения для предполагаемого лечения. Контейнеры могут представлять собой однократные дозы, многодозовые упаковки или субоднократные дозы. Инструкции, поставляемые в наборах по изобретению, как правило, являются письменными инструкциями на ярлыке или вкладыше в упаковку (например, бумажном листе, включенном в набор), но машиночитаемые инструкции (например, инструкции на магнитном или оптическом устройстве хранения данных) также являются приемлемыми.

Наборы по настоящему изобретению находятся в подходящей упаковке. Подходящая упаковка включает, в качестве неограничивающих примеров, флаконы, ампулы, пробирки, бутыли, банки, гибкую упаковку (например, запаянные майларовые или пластиковые пакеты) и т.п. для каждой фармацевтической композиции и других включенных реагентов, например, буферов, сбалансированных солевых растворов и т.д., для использования в введении фармацевтических композиций индивидуумам. Также предусмотрены упаковки для использования в комбинации с конкретным устройством, таким как ингалятор, устройство для назального введения (например, атомайзер) или инфузионное устройство, такое как минипомпа. Набор может иметь стерильное входное отверстие (например, контейнер может являться мешком для внутривенного раствора или флаконом, имеющим пробку, прокалываемую иглой для подкожных инъекций). Контейнер также может иметь стерильное входное отверстие (например, контейнер может являться мешком для внутривенного раствора или флаконом, имеющим пробку, прокалываемую иглой для подкожных инъекций). По меньшей мере одно активное средство в композиции является антителом против GUCY2c или биспецифическим антителом против CD3-GUCY2c. Контейнер может дополнительно содержать второе фармацевтически активное средство.

Как правило, набор содержит контейнер и ярлык или вкладыши в упаковку на контейнере или прикрепленным к контейнеру.

Депонирование биологического материала

Типичные материалы по настоящему изобретению депонированы в American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, Va. 20110-2209, USA, на 13 февраля 2018 года. Вектор цепи A GUCY2C-1608 (VH-впадина SEQ ID NO: 220), имеющий регистрационный номер ATCC PTA-124943, содержит вставку ДНК (SEQ ID NO: 247), кодирующую цепь VH-впадина биспецифического антитела GUCY2C-1608, и вектор цепи B GUCY2C-1608 (VL-выступ SEQ ID NO: 216), имеющий регистрационный номер ATCC PTA-124944, содержит вставку ДНК (SEQ ID NO: 246), кодирующую цепь VL-выступ биспецифического антитела GUCY2C-1608.

Депонирование осуществляли в соответствии с положениями Будапештского договора о международном признании депонирования микроорганизмов для целей патентной процедуры и нормативных актов в рамках него (Будапештский договор). Это гарантирует поддержание жизнеспособной культуры депозита в течение 30 лет с даты депонирования. Депозит будет сделан доступным ATCC в рамках Будапештского договора и является объектом соглашения между Pfizer Inc. и ATCC, обеспечивающей постоянный и неограниченный доступ потомства культуры депозита для публики после выдачи пертинентного патента США или выкладки любой патентной заявки США или иностранной патентной заявки, в зависимости от того что произойдет первым и обеспечивающей доступность потомства кому-либо, определенному Ведомством по патентам и товарным знакам США как имеющему право на это в соответствии с разделом 122 35 U.S.C. и правилами Ведомства, соответствующими ему (включая раздел 1.14 37 C.F.R. с конкретной ссылкой на 886 OG 638).

Правоприобретатель по настоящей заявке согласен на то, что, если материалы депозита погибнут, или будут утрачены, или будут разрушены при культивировании в подходящих условиях, материалы незамедлительно будут заменены по уведомлении такими же материалами. Доступность депонируемого материала не следует истолковывать как лицензию на практическое осуществление настоящего изобретения в нарушение прав, предоставленных властью любого правительства в соответствии с патентным правом.

Следующие примеры конкретных аспектов осуществления настоящего изобретения представлены исключительно в иллюстративных целях и не предназначены для ограничения объема настоящего изобретения каким-либо образом.

Примеры

Пример 1: Иммунизация и гибридомное получение антител мыши против GUCY2c

Рекомбинантный иммуноген-белок GUCY2c человека или клетки, гиперэкспрессирующие GUCY2c человека на своей поверхности (SEQ ID NO: 224), инъецировали мышам Balb/c для получения гибридом. Самок мышей Balb/c возрастом восемь недель иммунизировали растворимым белком huGUCY2c-mIgG2a или линией клеток 300.19, экспрессирующей GUCY2c человека (SEQ ID 224/225). В случае мышей, иммунизированных рекомбинантным белком huGUCY2c, животным вводили дозы по протоколу RIMMS (Kilpatrick, et al. Hybridoma. 1997. 16:381-389). В кратком изложении, мышей иммунизировали шесть раз рекомбинантным Fc-слитым белком GUCY2c человека-IgG2a мыши (SEQ ID NO: 230) в течение двух недель посредством подкожной инъекции. Используемыми адъювантами являлись полный и неполный адъюванты Фрейнда. В случае иммунизации на основе клеток мышей Balb/c иммунизировали с помощью 5×10⁶ клеток 300.19, гиперэкспрессирующих GUCY2c человека, дважды в неделю в течение одного месяца без адъюванта посредством i.p. инъекции. Для определения титров антитела мыши против GUCY2c получали образцы крови иммунизированных животных и исследовали GUCY2c-специфические титры посредством твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA) с использованием рекомбинантного GUCY2c mIgG2a-Fc человека (SEQ ID NO: 230) и GUCY2c-mIgG2a-Fc яванского макака (SEQ ID NO: 234). Животных с наиболее высокими титрами GUCY2c выбирали для получения гибридомы. В случае мышей, иммунизированных растворимым рекомбинантным белком, для слияния использовали лимфоциты LN и спленоциты, в то время как в случае мышей, иммунизированных 300.19/hGUCY2c, для слияния использовали только спленоциты. Для получения гибридомы спленоциты и/или лимфоциты лимфоузлов подвергали слиянию с миеломой P3X в соотношении 1:1 с использованием PEG. Слитые клетки подвергали селекции в присутствии HAT в течение семи дней, после чего гибридомы поддерживали в HT-содержащих средах перед скринингом. Для идентификации специфических в отношении антитела против huGUCY2c гибридом, супернатанты гибридом подвергали скринингу на реактивность IgG против huGUCY2c посредством ELISA. Затем потенциальные гибридомы против GUCY2c объединяли и анализировали на реактивность в отношении GUCY2c человека и яванского макака на поверхности трансфицированных линий клеток 300.19 и первичных линий опухолевых клеток, экспрессирующих GUCY2c. В кратком изложении, линии клеток 300.19, экспрессирующих различные белки GUCY2c (SEQ ID NO: 224, 226 и 228), высевали в количестве 4×10⁴ клеток/лунку в стерильные 96-луночные планшеты для культивирования тканей (Becton Dickinson) в день 1 и инкубировали при 37°C/5% CO₂ в течение 1-2 дней до достижения конфлюэнтного монослоя. Клетки 4 раза промывали PBS+Ca²⁺ и Mg²⁺и блокировали в течение 1 часа при комнатной температуре с помощью 3% молока/1% BSA/PBS+Ca²⁺ и Mg²⁺. Серийно разведенные образцы (1:3 в блокирующем буфере) наносили на планшет. Планшеты инкубировали при комнатной температуре в течение 2 часов перед промывкой PBS+Ca²⁺ и Mg²⁺. Затем добавляли HRP-конъюгированное вторичное антитело, антитело козы против Fc IgG мыши (Thermo Scientific), разведенное (1:4.000) в блокирующем буфере, и инкубировали с клетками в течение 1 часа. Планшеты промывали PBS+Ca²⁺ и Mg²⁺перед проявлением с помощью раствора субстрата TMB в течение 10 минут, а затем добавляли 0,18M⋅H₂SO₄ для остановки реакции. Измеряли поглощение при OD 450 нМ, строили график данных и анализировали с помощью программного обеспечения Microsoft Excel и Graphpad-Prism. Идентифицировали гибридомы, специфически связывающиеся с GUCY2c человека и яванского макака.

Пример 2: Связывание гибридомных антител против GUCY2c в анализах проточной цитометрии и иммуногистохимии

Гибридомные антитела против GUCY2c подвергали скринингу посредством проточной цитометрии на связывание на поверхности клетки с GUCY2c человека на опухолевых клетках T84 и HT55. Клетки HT29 использовали в качестве отрицательных контролей. Клетки подвергали диссоциации с помощью буфера для диссоциации клеток (Sigma) и блокировали на льду с помощью PBS+3% BSA. Клетки окрашивали на льду с использованием первичного антитела в течение 1 часа, а затем промывали холодным PBS. Добавляли 10 мкг/мл вторичного антитела (PE-конъюгированного вторичного антитела против мыши, Jackson Immunoresearch) на льду в течение часа. Клетки снова промывали холодным PBS, ресуспендировали в PBS, окрашивали DAPI для различения живых/погибших клеток и анализировали на связывание GUCY2c с помощью BD LSRII Fortessa. Идентифицировали несколько клонов, демонстрирующих специфическое связывание с GUCY2c-экспрессирующими линиями клеток (T84 и HT55) и отсутствие связывания с GUCY2c-отрицательными клетками (HT29).

Гибридомы из мышей BALB/c, иммунизированных против GUCY2c, тестировали на иммунореактивность в фиксированных формалином погруженных в парафин клеточных осадках. Клеточные осадки, полученные при этом скрининге, состояли из родительских клеток 300.19, клеток 300.19, гиперэкспрессирующих GUCY2c мыши, яванского макака или человека, одной линии клеток колоректального рака человека, экспрессирующих высокие эндогенные уровни GUCY2c (T84), и одной линии клеток колоректального рака человека, отрицательных по экспрессии GUCY2c (HT29). Линии клеток фиксировали в течение 24 ч. в 10% нейтральном забуференном формалине (Thermo Scientific) и центрифугировали при 300×g в течение 4 минут (мин) для осаждения. Формалин удаляли и клеточные осадки осторожно ресуспендировали предварительно нагретым до 50ºC Histogel (Thermo Scientific). Клеточные осадки, заключенные в Histogel, охлаждали при 4°C в течение 1-2 ч. перед обработкой в течение ночи в автоматизированном гистопроцессоре VIP (Ткань-Tek). Обработанные клеточные осадки заключали в парафин. Нарезали срезы микропанелей клеток по пять мкм, переносили на водяную баню и помещали на предметные стекла Superfrost Excell (Fisher). Стеклам позволяли сохнуть в течение ночи. После депарафинизации и регидратации тканевых срезов осуществляли термически-индуцируемое демаскирование эпитопов с помощью варочного автоклава Retriever 2100 (Electron Microscopy Sciences) в буфере Borg Decloaker, pH 9,5 (Biocare Medical), или цитратном буфере, pH 6,0 (Thermo Scientific), с последующим охлаждением до комнатной температуры (RT). Активность эндогенной пероксидазы инактивировали с помощью Peroxidazed 1 (Biocare Medical) в течение 10 мин. Неспецифические белковые взаимодействия блокировали в течение 10 мин с помощью Background Punisher (Biocare Medical). Каждую гибридому инкубировали без разведения в течение 1 ч. в условиях термически-индуцируемого демаскирования эпитопов. Срезы промывали в TBS и определяли связывание гибридомы с помощью Envision+ Mouse HRP (DAKO) в течение 30 мин. Препараты промывали в TBS и определяли иммунореактивность с использованием набора Betazoid DAB Chromogen Kit (Biocare Medical) в течение 5 мин с последующим промыванием дистиллированной водой. Иммуноокрашенные среды быстро докрашивали гематоксилина CAT (Biocare Medical), промывали водопроводной водой, дегидратировали батареей спиртов, очищали в ксилоле и накрывали покровным стеклом с помощью гистологической среды Permount (FisherChemicals). Препараты оценивал ветеринарный патолог для анализа иммунореактивности. При этом скрининге идентифицировали клоны с иммунореактивностью в отношении GUCY2c человека, яванского макака и мыши.

Результаты, касающиеся связывания гибридомных антител против GUCY2c по данным проточной цитометрии и иммуногистохимии (IHC), приведены в таблице 11.

Таблица 11

Клон Связывание T84+ HT55+ HT29- по результатам проточной цитометрии Связывание по результатам IHC (GUCY2c человека) Связывание по результатам IHC (GUCY2c яванского макака) Связывание по результатам IHC (GUCY2c мыши) 1A7 + + + - 2D4 + 4F2 + 4F12 + 4G3 + 5G7 + 9H3 + + + + 20D11 + 3H6 + 18E10 +

Пример 3: Количественный анализ уровней экспрессии GUCY2c на линиях клеток

Плотность рецепторов GUCY2c на линиях клеток измеряли с использованием клона GUCY2C-9H3, конъюгированного в соотношении 1:1 с фикоэритрином (Thermo Scientific). 1×10⁵ клеток окрашивали с помощью 10 мкг/мл PE-меченого mAb против GUCY2c для насыщающего связывания. Клетки промывали и ресуспендировали в буфере для FACS с DAPI и анализировали с использованием BD LSRII Fortessa с программным обеспечением FACS Diva. Меченые QuantiBRITE PE бусы (BD) использовали в тех же условиях определения нагрузки PE для вычисления количества PE-меченых антител на клетку (ABC) с учетом геометрического среднего интенсивности флуоресценции PE. Измерения плотности рецептора GUCY2c в линиях опухолевых клеток человека приведены в таблице 12. Линии клеток с плотностями рецептора GUCY2c охарактеризовывали в этом анализе и использовали в последующих анализах (например, анализах цитотоксичности) для оценки функциональной активности биспецифических антител против CD3-GUCY2c.

Таблица 12

Линия клеток Связывающая способность антитела (ABC)/клетка T84 8066,6 LS1034 6007,7 SNU16 3029,3 HT55 2811,5 SW1116 2650,7 CACO-2 4214,6 JHH7 2290 LS174T 1666,8 ASPC-1 495,6

Пример 4: Клонирование и секвенирование гибридомных антител против GUCY2c

Супернатанты гибридом с подтвержденной связывающей активностью на поверхности клетки субклонировали в формат IgG1 мыши. Выделяли РНК и получали последовательности ДНК вариабельной (V) области из экспрессирующихся антител посредством клонирования с помощью полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (RT-ПЦР), как описано ниже.

От одного до пяти миллионов субклонированных гибридомных клеток гомогенизировали для выделения тотальной РНК с помощью набора QIAGEN RNAeasy Mini. Затем первую цепь кДНК получали с использованием набора SuperScript III RT (Invitrogen). Затем получали двухцепочечную кДНК для вариабельных областей IgG против GUCY2c и амплифицировали посредством ПЦР с использованием праймеров для константных областей тяжелой цепи (IgG1, IgG2a, IgG2b) и легкой цепи (каппа или лямбда) IgG мыши, как описано ниже. Условия циклов ПЦР являлись следующими: 1 цикл при 95°C в течение 1 мин; 25 циклов при 95°C в течение 1 мин, 63°C в течение 1 мин и 72°C в течение 1 мин. Получаемые продукты RT-ПЦР клонировали в клонирующий вектор TOPO-Blunt (Invitrogen) и секвенировали.

Остатки в вариабельном домене нумеровали по Kabat, что представляет собой систему нумерации, используемую для вариабельных доменов тяжелой цепи или вариабельных доменов легких цепей компиляции антител (Kabat et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD). При использовании этой системы нумерации точная линейная аминокислотная последовательность может содержать меньше или больше аминокислот, что соответствует укорочению или инсерции в FR или CDR вариабельного домена. Например, вариабельный домен тяжелой цепи может включать инсерцию одной аминокислоты (остатка 52a по Kabat) после остатка 52 H2 и встроенные остатки (например, остатки 82a, 82b и 82c по Kabat) после остатка 82 каркаса (FR) тяжелой цепи. Нумерацию остатков по Kabat можно определять для указанного антитела посредством выравнивания в областях гомологии последовательности антитела со "стандартной", пронумерованной по Kabat последовательностью. Доступны различные алгоритмы приписывания нумерации по Kabat. В настоящем описании для приписывания нумерации по Kabat CDR1 VL, CDR2 VL, CDR3 VL, CDR2 VH и CDR3 VH вариабельных областей используют алгоритм, воплощенный в версии 2.3.3 выпуска Abysis (www.abysis.org). Определение AbM используют для CDR1 VH. Остатки FR являются остатками вариабельного домена антитела, иными, чем остатки CDR. Каркас домена VH или VL содержит четыре подобласти каркаса, FR1, FR2, FR3 и FR4, перемежающиеся с CDR в следующем порядке: FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4.

Химерные T-клеточные биспецифические белки с V-областями мыши и модифицированные константные области IgG человека (hIgG1) получали следующим образом: кДНК V-области из родительских векторов мыши TOPO субклонировали в экспрессирующие векторы млекопитающих, состоящие из первого и второго способствующего гетеродимеризации домена, каждый из которых содержит цистеиновый линкер (линкер 3), такой как GCPPCP (SEQ ID NO: 192), и Fc-цепь с "выступом" (SEQ ID NO: 188) или Fc-цепь с "впадиной" (SEQ ID NO: 189). В этом случае, вариабельную область тяжелой цепи (VH) антитела против GUCY2c мыши (SEQ ID NO: 11, 19, 26, 33 и 41) подвергали слиянию в рамке считывания с вариабельной областью легкой цепи (VL) антитела против CD3 человека (SEQ ID NO: 84), разделяя линкером GGGSGGGG (SEQ ID NO: 190), а затем другим линкером GCPPCP (SEQ ID NO: 192), соединяя с Fc-цепью с "впадиной" (SEQ ID NO: 189). Области VL против GUCY2c мыши (SEQ ID NO: 92, 100, 104, 106, 112 и 119) подвергали слиянию в рамке считывания с линкером GGGSGGGG (SEQ ID NO: 190), областью VH против CD3 человека (SEQ ID NO: 1), с последующим линкером GCPPCP (SEQ ID NO: 192) и Fc-цепь с "выступом" (SEQ ID NO: 188). Фрагменты амплифицировали посредством стандартной ПЦР с использованием праймеров, включающих липкие концы по 15-25 нуклеотидов, имеющих гомологию с принимающим вектором, для клонирования с изотермальной сборкой (ITA). Фрагменты рекомбинировали в указанные выше линеаризованные векторы с использованием набора для клонирования Infusion ITA (Clontech).

Затем продукты лигирования трансформировали в компетентные E. coli DH5α (Life Technologies) и выращивали в течение ночи при 37°C на чашках с агарозой, содержащей 100 мкг/мл карбенициллина. Колонии подсчитывали, отбирали и выращивали в течение ночи в бульоне YT с 100 мкг/мл карбенициллина и выделяли ДНК стандартными способами. Затем все конструкции ДНК секвенировали по обеим цепям перед экспрессией в клетках млекопитающего с использованием общепринятых способов секвенирования.

Пример 5: Экспрессия и очистка химерных биспецифических антител против CD3-GUCY2c

С помощью комплементарных пар конструкций (по 12,5 мкг каждой цепи) котрансфицировали 25 мл культуры в логарифмической фазе роста, содержащих 1 миллион клеток/мл клеток HEK 293 с использованием набора для трансфекции ExpiFectamine™ 293 (Life Technologies). Через 24 часа после трансфекции добавляли энхансер трансфекции ExpiFectamine и клеткам позволяли расти еще в течение 4-5 дней перед сбором. Затем собирали истощенные культуры, центрифугировали для удаления клеточного детрита, а затем пропускали через фильтр 20 мкм.

Затем очищенные кондиционированные среды, содержащие биспецифические антитела против CD3-GUCY2c, очищали с использованием аффинной хроматографии с протеином A. Образцы вводили в микроколонки 0,45 мл (Repligen), предварительно заполненные смолой MabSelect SuRe™ с протеином A (GE Healthcare) с использованием жидкостного манипулятора (Tecan). Связанный белок промывали PBS, pH 7,2, затем элюировали 20 мМ лимонной кислотой, 150 мМ хлоридом натрия, pH 3,5, и нейтрализовали 2 M Трис, pH 8,0. Затем образцы обессаливали в PBS, pH 7,2 с использованием капельных колонок G25 Sephadex (GE Healthcare) по инструкциям производителя. Очищенные белки анализировали на чистоту с использованием эксклюзионной хроматографии аналитического масштаба с помощью колонки Mab HTP (Tosoh Bioscience) и Aglient 1200 ВЭЖХ по инструкциям производителя. Концентрации определяли посредством измерения поглощения при OD280 нм с использованием микроспектрофотометра (Trinean).

Пример 6: Анализ связывания рекомбинантного белка

Белки подвергали скринингу на связывание с рекомбинантными белками человека, яванского макака и мыши с помощью ELISA. Очищенными ECD GUCY2c человека, яванского макака, мыши или белками CD3 эпсилон-дельта человека покрывали 384-луночные планшеты для ELISA Nunc-Maxisorb в количестве 1 мкг/мл в 20 мкл в PBS-CMF (без кальция и магния) при 4°C. Планшеты 3 раза промывали PBS+0,05% TWEEN20 и блокировали PBS+3% молока в течение 1 ч., встряхивали при RT. Блокирующий раствор удаляли, добавляли образцы, серийно разведенные в блокирующем растворе, и инкубировали в течение 1 ч. со встряхиванием при RT. Планшеты промывали 3 раза, как описано выше, и добавляли вторичное антитело (антитело козы против Fc IgG человека-HRP - Southern Biotech L2047-05, 1:5000; антитело козы против Fc IgG мыши-HRP - Thermo Scientific, разведенное 1:4000; или антитело мыши против пента-HIS-HRP, Qiagen, 1:1000), с последующим встряхиванием в течение 1 ч. при RT. Планшеты промывали, как описано выше, и проявляли сигнал с использованием TMB, реакцию останавливали с помощью H₂SO₄ и считывали поглощение при 450 нм с помощью спектрофотометра для чтения планшетов Envision (Perkin Elmer). Также периодически использовали альтернативный способ детекции вместо TMB/H₂SO₄. После добавления и первичной промывки добавляли 20 мкл на лунку конъюгата антитела против IgG человека с европием (Perkin Elmer EU-N1), разведенного 1:1000 в аналитическом буфере DELFIA (Perkin Elmer 1244-330) и инкубировали при RT в течение 1 ч. Затем планшеты промывали 3 раза 1-кратным промывочным раствором DELFIA (Perkin Elmer 1244-114), добавляли 20 мкл на лунку усиливающего раствора (Perkin Elmer 1244-105) и инкубировали в течение 30 минут. Затем измеряли флуоресценцию с временным разрешением при 320 и 615 нм с использованием спектрофотометра для чтения планшетов EnVision® (многоканального спектрофотометра для чтения планшетов EnVision®, Perkin Elmer) по инструкциям производителя.

Для тестирования биспецифического связывания с GUCY2c и CD3 осуществляли ELISA в сэндвич-формате. CD3 эпсилон-дельта человека (SEQ ID NO: 242) покрывали 384-луночные планшеты для ELISA Nunc-Maxisorb в количестве 1 мкг/мл в 20 мкл PBS-CMF (без кальция и магния) при 4°C. Планшеты промывали 3 раза PBS+0,05% TWEEN20 и блокировали PBS+3% молока в течение 1 ч., встряхивая при RT. Удаляли блокирующий раствор, добавляли образцы, серийно разведенные в блокирующем растворе, и инкубировали в течение 1 ч. со встряхиванием при RT. Планшеты промывали 3 раза, как описано выше, и добавляли очищенный слитый белок ECD GUCY2c человека, яванского макака или мыши-Fc IgG2a мыши в планшет в количестве 1 мкг/мл и инкубировали при RT, встряхивая в течение 1 ч. Планшеты промывали 3 раза, как описано выше, и добавляли вторичное антитело (антитело козы против Fc IgG мыши-HRP - Thermo Scientific, разведенное 1:4000) с последующим встряхиванием в течение 1 ч. при RT. Планшеты промывали, как описано выше, и проявляли сигнал с использованием TMB, реакцию останавливали с помощью H₂SO₄ и считывали поглощение при 450 нм с помощью спектрофотометра для чтения планшетов EnVision® (Perkin Elmer). Также периодически использовали альтернативный способ детекции вместо TMB/H₂SO₄. После добавления и промывки очищенного слитого белка ECD GUCY2c человека, яванского макака или мыши-Fc IgG2a мыши, добавляли 20 мкл на лунку конъюгата IgG против мыши с европием (Perkin Elmer EU-N1), разведенного 1:1000 в аналитическом буфере DELFIA (Perkin Elmer 1244-330), и инкубировали при RT в течение 1 ч. Планшеты промывали 3 раза промывочным буфером DELFIA и инкубировали в течение 30 минут с 20 мкл усиливающего раствора (Perkin Elmer 1244-105). Затем измеряли флуоресценцию с разрешением по времени при 3240 и 615 нм с использованием спектрофотометра для чтения планшетов EnVision® (Perkin Elmer) по инструкциям производителя. Химерные биспецифические антитела против CD3-GUCY2c подвергали скринингу на связывающую активность против рекомбинантной GUCY2c человека и CD3 эпсилон человека с помощью ELISA. Лучшие 6 клонов демонстрировали двойную связывающую активность в нижнем или субнаномолярном диапазоне (таблица 13).

Таблица 13

Клон EC₅₀ GUCY2C человека (нМ) EC₅₀CD3 человека (нМ) EC₅₀биспецифического связывания (нМ) EC₅₀ отрицательного контроля (нМ) GUCY2C-0074 >100 1,128 4,051 NB GUCY2C-0077 27,53 0,8873 7,504 NB GUCY2C-0078 23,51 1,446 9,68 NB GUCY2C-0098 60,19 7,244 185,6 NB GUCY2C-0104 >100 0,4179 2,479 NB GUCY2C-0105 79,76 0,3547 5,045 NB

Пример 7: Опосредованная биспецифическим антителом T-клеточная активность

PBMC человека выделяли из крови здорового донора с использованием Histopaque-177 (Sigma). Наивные T-клетки выделяли из PBMC с использованием набора для обогащения T-клеток от Stem Cell Technologies (отрицательная селекция T-клеток). GUCY2c-экспрессирующие опухолевые клетки человека T84, трансфицированные с использованием экспрессирующей конструкции люциферазы, ресуспендировали в среде R10 (RPMI, 10% FBS, 1% пенициллин/стрептомицин, 3 мл 45% глюкозы). T-клетки также ресуспендировали в средах R10 и добавляли к клеткам T84 при соотношении эффектора и мишени (соотношении E:T) 10:1 или 5:1. Клетки обрабатывали серийными разведениями биспецифических антител против GUCY2c или биспецифическим антителом против CD3 отрицательного контроля и инкубировали при 37°C в течение 48 часов с последующим измерением сигнала люциферазы с использованием реагента Neolite (Perkin Elmer) с использованием устройства Victor (Perkin Elmer). Значения EC₅₀ вычисляли с помощью Graphpad PRISM с использованием четырех-параметрического нелинейного регрессионного анализа. Мишене-отрицательные клетки HCT116 или HT29 не демонстрировали какой-либо опосредованной биспецифическим антителом против GUCY2c цитотоксичности. Результаты анализов уничтожения клеток с использованием химерных биспецифических антител против CD3-GUCY2c (соотношение E:T=10:1) приведены в таблице 14. Все биспецифические антитела против CD3-GUCY2c демонстрировали специфическое и мощное T-клеточно-зависимое уничтожение GUCY2c-положительных клеток.

Таблица 14

Клон EC₅₀опухолевых клеток T84 (нМ) GUCY2C-0074 2,6 GUCY2C-0077 28,7 GUCY2C-0078 7,8 GUCY2C-0098 0,41 GUCY2C-0104 14,9 GUCY2C-0105 7,51

Результаты анализов уничтожения клеток с использованием гуманизированных биспецифических антител против CD3-GUCY2c (соотношение E:T=5:1) приведены в таблице 15. Все биспецифические антитела демонстрировали T-клеточно-зависимую цитотоксичность в отношении GUCY2c-положительных клеток.

Таблица 15

Клон EC₅₀опухолевых клеток T84 (нМ) GUCY2C-0240 0,53 GUCY2C-0247 0,07 GUCY2C-1186 0,22 GUCY2C-1467 0,2 GUCY2C-1476 0,07 GUCY2C-1478 0,24 GUCY2C-1481 1,57 GUCY2C-1512 0,57 GUCY2C-1518 0,37 GUCY2C-1526 0,13 GUCY2C-1538 0,05 GUCY2C-1554 12,6 GUCY2C-1555 1,13 GUCY2C-1556 5,04 GUCY2C-1557 0,22 GUCY2C-1590 11,07 GUCY2C-1592 2,6 GUCY2C-1608 0,19

Пример 8: Биннинг эпитопов с помощью Octet

Биспецифические белки GUCY2C-0074, -0077, -0104, -0105 и -0098 оценивали на конкурентное и неконкурентное связывание с GUCY2c человека (SEQ ID NO: 224) с использованием анализа тандемного биннинга с помощью OctetRED 384 (ForteBio). Анализ Octet осуществляли при комнатной температуре. Биотинилированную GUCY2c человека разводили до 10 мкг/мл фосфатно-солевом буфере (PBS) без кальция и магния и фиксировали на биосенсорах со стрептавидином (SA) (18-5020, ForteBio) по инструкциям производителя. Биспецифические белки разбавляли до 300 нМ в PBS. Покрытые GUCY2c биосенсоры погружали в первый биспецифический белок на 300 секунд, затем погружали во второй биспецифический белок на 300 секунд. Каждое из биспецифических антител тестировали таким попарно комбинаторным способом. Биспецифические антитела, конкурирующие за одну и ту же область связывания на GUCY2c человека, группировали в одном бине. Посредством биннинга эпитопов химерных биспецифических антител против CD3-GUCY2c с помощью Octet определяли уникальные группы эпитопов, распознаваемые связывающими доменами против GUCY2c (таблица 16). Символом "+" указаны конкурирующие эпитопы; символом "+/-" указаны частично перекрывающиеся эпитопы; символом "-" указаны неконкурирующие эпитопы; и "NT" указано, что сравнительный анализ не проводили.

Таблица 16

Клон GUCY2C-0074 + GUCY2C-0077 NT + GUCY2C-0098 + +/- + GUCY2C-0104 NT + +/- + GUCY2C-0105 NT + - + + GUCY2C-0074 GUCY2C-0077 GUCY2C-0098 GUCY2C-0104 GUCY2C-0105 Клон

Пример 9: Гуманизация связывающих доменом антитела мыши против GUCY2c

Гуманизацию вариабельных областей антитела мыши против GUCY2c осуществляли с использованием стратегии пересадки CDR. Комплементарную ДНК (кДНК), содержащую акцепторный каркас человека, VH3-7 (SEQ ID NO: 176) в случае тяжелой цепи и VK1-39 (SEQ ID NO: 180) в случае легкой цепи, с донорными последовательностями определяющих комплементарность областей (CDR) против GUCY2c синтезировали в векторах, содержащих константную область IgG1-3m человека или каппа-цепи человека в случае легкой цепи. Вектор тяжелой цепи состоял из области CH1 (SEQ ID NO: 185), шарнирной области (SEQ ID NO: 186) и области CH2-CH3, включающей мутации, влияющие на эффекторную функцию, L234A, L235A и G237A (SEQ ID NO: 187; нумерация в соответствии с индексом EU). Вектор легкой цепи состоял из домена CL каппа (SEQ ID NO: 184). Встраивали Обратные мутации в последовательность мыши в каркасных областях областей VH и VL и оценивали их на полное восстановление связывающей активности. Выравнивание областей VH и VL акцепторного каркаса человека, родительских клонов мыши и полностью активных гуманизированных вариантов приведено в таблицах 17A, 17B, 18A и 18B ниже для клона GUCY2C-0098.

Обратные мутации в последовательность мыши в каркасных областях областей VH и VL встраивали и оценивали на полное восстановление связывающей активности. Выравнивание областей VH и VL акцепторного каркаса человека, родительских клонов мыши и полностью активного гуманизированного варианта GUCY2C-0241 приведено в таблицах 17A и 17B ниже для клона GUCY2C-0098.

Таблица 17A

Клон HFW1 VHCDR1 HFW2 huIGHV3-7 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS
(SEQ ID NO: 5) GFTFSSYWMS (SEQ ID NO: 177) (ABM);
SYWMS (SEQ ID NO: 271) Kabat WVRQAPGKGLEWVA (SEQ ID NO: 6) GUCY2C-0098 QVQLQQPGAELVKPGASVKLSCKAS
(SEQ ID NO: 30) GYTFTSYWMH (SEQ ID NO: 27) (ABM);
SYWMH (SEQ ID NO: 259) (Kabat) WVKQRPGQGLEWIG (SEQ ID NO: 16) GUCY2C-0241 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS
(SEQ ID NO: 5) GYTFTSYWMH (SEQ ID NO: 27) (ABM);
SYWMH (SEQ ID NO: 259) (Kabat) WVRQAPGKGLEWIG (SEQ ID NO: 49)

Таблица 17B

Клон CDR2 VH HFW3 CDR3 VH huIGHV3-7 NIKQDGSEKYYVDSVKG(SEQ ID NO: 178) (Kabat);
KQDGSE (SEQ ID NO: 272) Chothia RFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR(SEQ ID NO: 7) Нет GUCY2C-0098 EIKPSNGLTNYIEKFKN(SEQ ID NO: 28)(Kabat);
KPSNGL (SEQ ID NO: 264) (Chothia) KATLTVDKSATTAYMQLSSLTAEDSAVYYCTR(SEQ ID NO: 31) TITTTEGYWFFDV
(SEQ ID NO: 29) GUCY2C-0241 EIKPSNGLTNYIEKFKN(SEQ ID NO: 28) (Kabat);
KPSNGL (SEQ ID NO: 264) (Chothia) RFTISVDKAKNSAYLQMNSLRAEDTAVYYCTR(SEQ ID NO: 61) TITTTEGYWFFDV
(SEQ ID NO: 29)

Выравнивание области VL акцепторного каркаса человека, родительского клона мыши и полностью гуманизированного варианта приведено в таблицах 18A и 18B для клона GUCY2C-0098. Подчеркнуты CDR при нумерации по Kabat. Полужирным шрифтом выделены исходные, не принадлежащие человеку аминокислоты зародышевой линии, присутствующие в полностью гуманизированном клоне.

Таблица 18A

Клон LFW1 VLCDR1 LFW2 huIGKV1-39 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC
(SEQ ID NO: 80) RASQSISSYLN
(SEQ ID NO: 181) WYQQKPGKAPKLLIY
(SEQ ID NO: 81) GICU2C-0098 DIVLTQSPASLAVSLGQRATISC
(SEQ ID NO: 96) RASESVDYYGTSLMQ
(SEQ ID NO: 107) WYQQKPGQPPKLLIY
(SEQ ID NO: 110) GICU2C-0241 DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITC
(SEQ ID NO: 126) RASESVDYYGTSLMQ
(SEQ ID NO: 107) WYQQKPGKAPKLLIY
(SEQ ID NO: 81)

Таблица 18B

Клон VLCDR2 LFW3 CDR3 VL huIGKV1-39 AASSLQS
(SEQ ID NO: 182) GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC
(SEQ ID NO: 82) QQSYSTPYT
(SEQ ID NO: 183) GICU2C-0098 AASNVES
(SEQ ID NO: 108) GVPARFSGSGSGTDFSLNIHPVEEDDIAMYFC
(SEQ ID NO: 111) QQTRKVYT
(SEQ ID NO: 109) GICU2C-0241 AASNVES
(SEQ ID NO: 108) GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC
(SEQ ID NO: 82) QQTRKVYT (SEQ ID NO: 109)

В таблице 19 показано, что гуманизированные GUCY2c-связывающие домены как в IgG1 человека сохраняли связывание с рекомбинантным белком GUCY2c по результатам ELISA.

Таблица 19

Клон Прямое связывание huGUCY2C (нМ) GUCY2C-0166 0,06935 GUCY2C-0179 5,143 GUCY2C-0193 0,2297 GUCY2C-0210 8,961 GUCY2C-0212 0,7694 GUCY2C-0241 0,1605

В таблице 20 показано, что гуманизированные GUCY2c-связывающие домены как в биспецифических антителах против CD3 сохраняли одновременное связывание с рекомбинантными белками GUCY2c человека и CD3 человека. GUCY2C-0240 является гуманизированной версией биспецифического антитела против CD3 IgG GUCY2C-0166. GUCY2C-0247 и GUCY2C-0250 являются гуманизированными биспецифическими антителами против CD3 GUCY2C-0241 с разными вариабельными областями против CD3.

Таблица 20

Клон huCD3-huGUCY2C в ELISA в сэндвич-формате (нМ) GUCY2C-0240 0,07992 GUCY2C-0247 0,705 GUCY2C-0250 76,9

Пример 10: Дальнейшая гуманизация и оптимизация GUCY2C-связывающих доменов с использованием фагового дисплея

В некоторых вариантах осуществления замена является заменой зародышевой линии человека, в которой остаток CDR заменяют соответствующим остатком зародышевой линии человека для повышения содержания аминокислот человека и снижения потенциальной иммуногенности антитела. Например, если используют каркас VH3-7 человека зародышевой линии и пример антитела GUCY2C-0241, выравнивание CDR1 VH антитела GUCY2C-0241 (SEQ ID NO: 27) и VH3-7 зародышевой линии человека приведено в таблице 21 (с использованием системы нумерации Kabat с определением AbM CDR1 VH):

Таблица 21

Положение 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 VH3-7 зародышевой линии человека G F T F S S Y W M S GUGY2C-0241 G Y T F T S Y W M H

В случае положений 26, 28, 29, 31, 32, 33 и 34 остаток зародышевой линии человека и соответствующий остаток GUCY2C-0241 являются одинаковыми, и замена зародышевой линии невозможна. В случае положений 27, 30 и 35 (выделены полужирным шрифтом и подчеркнуты) остаток зародышевой линии человека и соответствующий остаток GUCY2C-0241 отличаются. Остатки GUCY2C-0241 в этих положениях можно заменять соответствующим остатком VH3-7 зародышевой линии человека для дополнительного повышения содержания остатков человека.

Антитело его или антигенсвязывающий фрагмент может содержать каркас VH, содержащий последовательность каркаса VH зародышевой линии человека. Последовательность каркаса VH можно получать из VH3 зародышевой линии человека, VH1 зародышевой линии, VH5 зародышевой линии или VH4 зародышевой линии. Предпочтительными каркасами тяжелой цепи зародышевой линии человека являются каркасы, полученные из VH1, VH3 или VH5 зародышевой линии. Например, можно использовать каркасы VH из следующих зародышевых линий: IGHV3-23, IGHV3-7 или IGHV1-69 (названия зародышевых линий основаны на определении зародышевой линии IMGT). Предпочтительными каркасами легкой цепи зародышевой линии человека являются каркасы, полученные из Vκ или Vλ зародышевой линии. Например, можно использовать каркасы VL из следующих зародышевых линий: IGKV1-39 или IGKV3-20 (названия зародышевых линий основаны на определении зародышевой линии IMGT). Альтернативно или дополнительно, каркасная последовательность может являться консенсусной каркасной последовательностью зародышевой линии человека, такой как каркас консенсусной последовательности Vλ1 человека, консенсусной последовательности Vκ1, консенсусной последовательности Vκ2, консенсусной последовательности Vκ3, консенсусной последовательности зародышевой линии VH3, консенсусной последовательности зародышевой линии VH1, консенсусной последовательности зародышевой линии VH5 или консенсусной последовательности зародышевой линии VH4. Последовательности каркасов зародышевой линии человека доступны в различных общедоступных базах данных, таких как V-base, IMGT, NCBI или Abysis.

Антитело его или антигенсвязывающий фрагмент может содержать каркас VL, содержащий последовательность каркаса VL зародышевой линии человека. Каркас VL может содержать одну или более замен, добавлений или делеций аминокислот при сохранении функционального и структурного сходства с зародышевой линией, из которой его получают. В некоторых аспектах каркас VL является по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99% или на 100% идентичным каркасной последовательности VL зародышевой линии человека. В некоторых аспектах антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит каркас VL, содержащий 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 замен, добавлений или делеций аминокислот относительно последовательности каркаса VL зародышевой линии человека.

Каркас VL зародышевой линии человек может являться каркасом DPK9 (название IMGT: IGKV1-39). Каркас VL зародышевой линии человека может являться каркасом DPK12 (название IMGT: IGKV2D-29). Каркас VL зародышевой линии человека может являться каркасом DPK18 (название IMGT: IGKV2-30). Каркас VL зародышевой линии человека может являться каркасом DPK24 (название IMGT: IGKV4-1). Каркас VL зародышевой линии человека может являться каркасом HK102_V1 (название IMGT: IGKV1-5). Каркас VL зародышевой линии человека может являться каркасом DPK1 (название IMGT: IGKV1-33). Каркас VL зародышевой линии человека может являться каркасом DPK8 (название IMGT: IGKV1-9). Каркас VL зародышевой линии человека может являться каркасом DPK3 (название IMGT: IGKV1-6).Каркас VL зародышевой линии человека может являться каркасом DPK21 (название IMGT: IGKV3-15). Каркас VL зародышевой линии человека может являться каркасом Vg_38K (название IMGT: IGKV3-11). Каркас VL зародышевой линии человека может являться каркасом DPK22 (название IMGT: IGKV3-20). Каркас VL зародышевой линии человека может являться каркасом DPK15 (название IMGT: IGKV2-28). Каркас VL зародышевой линии человека может являться каркасом DPL16 (название IMGT: IGLV3-19). Каркас VL зародышевой линии человека может являться каркасом DPL8 (название IMGT: IGLV1-40). Каркас VL зародышевой линии человека может являться каркасом V1-22 (название IMGT: IGLV6-57). Каркас VL зародышевой линии человека может являться консенсусной последовательностью каркаса Vλ человека. Каркас VL зародышевой линии человека может являться консенсусной последовательностью каркаса Vλ1 человека. Каркас VL зародышевой линии человека может являться консенсусной последовательностью каркаса Vλ3 человека. Каркас VL зародышевой линии человека может являться консенсусной последовательностью каркаса Vκ человека. Каркас VL зародышевой линии человека может являться консенсусной последовательностью каркаса Vκ1 человека. Каркас VL зародышевой линии человека может являться консенсусной последовательностью каркаса Vκ2 человека. Каркас VL зародышевой линии человека может являться консенсусной последовательностью каркаса Vκ3 человека.

Определение паратопов антител против GUCY2c посредством расширенной бинарной замены

Описан способ определения критических остатков CDR, с помощью которого выбирают функциональные варианты антител из библиотеки, содержащей остаток зародышевой линии человека или соответствующий остаток грызуна в каждом положении CDR, за исключением CDR-H3 (Townsend et al., 2015, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 112(50):15354-15359). Конструировали фаговую библиотеку scFv, в которой все положения CDR, за исключением CDR3 VH GUCY2C-0241, отличающейся от зародышевой линии человека (VH3-7/VK1-39), рандомизировали так, чтобы приблизительно 50% клонов кодировали аминокислоту GUCY2C-0241 мыши и приблизительно 50% кодировали аминокислоту зародышевой линии человека в этом положении (таблицы 17A, 17B, 18A и 18B). Библиотеки получали и подвергали 3-4 раундам селекции по GUCY2c человека (SEQ ID NO: 232), как описано ниже. Клоны, сохранявшие связывание с GUCY2c, выделяли и определяли их последовательности.

В этом эксперименте положения, в которых последовательность человека наблюдали у менее чем приблизительно 20% связывающих клонов, определяли как необходимые остатки мыши. Остатки мыши преимущественно сохранялись в 25 положениях (остатки тяжелой цепи H35, E50, P52a, S53, N54, G55, L56, T57, N58, I60, E61, K62, F63 и N65; остатки легкой цепи E27, V29, D30, L32, M33, Q34, N53, E55, T91, R92 и K93 в соответствии с системой нумерации Kabat, и определением AbM использовали для CDR1 VH; систему нумерации Chothia использовали для CDR1 VL), что свидетельствует о том, что замена этих остатков остатками зародышевой линии человека является крайне неблагоприятной. Остатки мыши и человека обнаруживали со схожей частотой (определяемой как содержание остатков человека более 20%) в остатках тяжелой цепи 27 (F/Y) и 30 (S/T) и остатках легкой цепи 54 (L/V) и 94 (A/V; в соответствии с системой нумерации Kabat; определение AbM использовали для CDR1 VH), что свидетельствует о том, что последовательность мыши в этих положениях не является критической.

Кроме того, в стратегию расширенной бинарной замены включали остатки каркаса (FW), ранее требовавшие обратной мутации в аминокислоты мыши (положения тяжелой цепи I48 и G49 в соответствии с нумерацией по Kabat). После селекции и скрининга фага аминокислотную последовательность человека для положения каркаса тяжелой цепи 48 определяли в приблизительно 10% случаев, что позволяет предполагать, что обратная мутация является предпочтительной. Положение тяжелой цепи 49 содержало аминокислотный остаток мыши в 100% случаев, что позволяет предполагать, что эта обратная мутация является необходимой. Частота аминокислотной последовательности мыши или человека в положениях CDR или FW после расширенной бинарной замены приведена в таблице 22. В таблице 22 показана частота включения аминокислот человека в положениях CDR GUCY2C-0098, тестируемых посредством расширенной бинарной замены (с использованием системы нумерации Kabat, и для CDR1 VH использовали определение AbM; для CDR1 VL использовали систему нумерации Chothia).

Таблица 22

Участок Аминокислоты мыши GUCY2C-0098 Аминокислоты зародышевой линии человека % остатков человека в исходной библиотеке % остатков человека в связывающих клонах H27 Y F 50 21 H30 T S 35 28 H35 H S 39 2 H50 E N 30 0 H52A P Q 46 0 H53 S D 33 0 H54 N G 37 0 H55 G S 41 1 H56 L E 39 0 H57 T K 46 0 H58 N Y 37 1 H60 I V 43 2 H61 E D 48 3 H62 K S 41 2 H63 F V 35 5 H65 N G 26 4 L27 E Q 48 12 L29 V I 46 4 L30 D S 28 2 L32 L Y 48 0 L33 M L 35 13 L34 Q N 20 6 L53 N S 20 2 L54 V L 50 26 L55 E Q 35 10 L91 T S 43 4 L92 R Y 57 2 L93 K S 48 10 L94 V T 46 24 H48 I V 26 10 H49 G A 48 0

Дальнейшая оптимизация связывающих доменов после GUCY2c

Варианты антител против GUCY2c с улучшенной стабильностью выделяли следующими способами. Области VH и VL гуманизированного клона GUCY2C-0241 (SEQ ID NO: 60 и 137) синтезировали в виде одноцепочечного вариабельного фрагмента (scFv) в фаговом экспрессирующем векторе, содержащем C-концевые метки His6 и c-myc (Blue Heron). Встраивали случайные мутации в домены CDR VH и VL посредством "мягкой" рандомизации NNK (способами, ранее описанными в патенте США № 9884921). Олигонуклеотиды, сконструированные для селективной мутации одного остатка CDR за один раз, синтезировал поставщик (IDT), а затем их использовали для внесения изменений в матрицу нуклеиновой кислоты ранее описанными способами (Townsend et al., 2015, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 112(50):15354-15359). В дизайн олигонуклеотидов также включают мутацию, сконструированную для устранения потенциального участка посттрансляционной модификации (G55E тяжелой цепи), в рамках которой удаляют потенциальный участок дезамидирования аспарагина NG (Chelius et al., Anal. Chem. 77(18):6004-6011, 2005). Мутантные клоны выбирали и отправляли на секвенирование для оценки частоты мутации. Затем эти фаговые экспрессирующие векторы, содержащие подвергнутые мутагенезу варианты CDR VH и VL GUCY2C-0241 (SEQ ID NO: 60 и 137), объединяли в небольшие подбиблиотеки для фагового дисплея.

Рекомбинантные белки GUCY2c человека, яванского макака и мыши использовали на стадиях селекции и последующего скрининга (SEQ ID NO: 230, 232, 234, 236, 238 и 240). Для селекции, включающей биотинилированные белки, аликвоты описанных выше совокупностей фагов и магнитные частицы с стрептавидином (Dynabeads M-280 с стрептавидином) блокировали раздельно в 3% молоке/PBS в течение 1 часа при комнатной температуре, 60°C или 65°C в ротационном смесителе (20 об/мин). После инкубации при разных температурах блокированные совокупности фагов центрифугировали при 4000 об/мин в течение 10 минут, супернатанты переносили в новые пробирки и смешивали с 6% блокирующим буфером. Блокированных фагов инкубировали с избыточными молярными концентрациями реагентов для деселекции (т.е. стрептавидиновых частиц, несодержащих мишень, содержащих двухцепочечную ДНК, инсулин и/или реагенты экстракта мембран), инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа на роторном шейкере (20 об/мин), смешивали с блокированными магнитными частицами с стрептавидином и инкубировали еще в течение часа. Подвергнутую деселекции библиотеку собирали посредством осаждения частиц с использованием магнитного сепаратора. Используя устройство для магнитной очистки Kingfisher (ThermoFisher, Springfield NJ, USA) биотинилированный антиген для селекции (в различных концентрациях, указанных в таблице 23) инкубировали с подвергнутой деселекции фаговой библиотеки в 96-луночном планшете с глубокими лунками в течение 1 часа при комнатной температуре с периодическим смешиванием. Частицы разделяли с использованием магнитного сепаратора на устройстве Kingfisher и промывали 4 раза PBS/0,1% Tween20 и 3 раза PBS в отдельных 96-луночных планшетах с глубокими лунками. Связанного фага элюировали посредством инкубации с 100 мМ триэтиламина (TEA) в течение 8 минут в новом 96-луночном планшете с последующим отделением от магнитных частиц. Элюированного фага нейтрализовали с помощью 2 M Трис-HCl, pH 7,5. Пример условий селекции фага для оптимизации связывающего домена антитела против GUCY2c приведены в таблице 23. В таблице 23 также показаны условия селекции, используемые для фагового дисплея. "Dslxn" означает используемые условия деселекции. SA=стрептавидин; D=ДНК; I=инсулин; M=белки мембранного экстракта. "Therm" соответствует термической инкубации, осуществляемой перед инкубацией с мишенью.

Таблица 23

Раунд Условия R1 Группа C1R1 Мишень huGUCY2C Концентрация мишени 10 нМ Dslxn SA, D, I, M Therm Нет R2 Группа C1R2A Мишень cyGUCY2C Концентрация мишени 1 нМ Dslxn SA, D, I, M Therm 60°C R3 Группа C1R3A1 Мишень huGUCY2C Концентрация мишени 0,1 нМ Dslxn SA, D, I, M Therm 65°C

Элюированного фага использовали для инфицирования 10 мл культуры E. coli ER2738, выращенной до средне-логарифмической фазы (соответствующей OD₆₀₀~0,5). Бактерии инфицировали фагом в течение 1 часа при 37°C со встряхиванием при 150 об/мин, концентрировали после стадии центрифугирования и высевали на чашки с 2-кратным YT-агаром для биологических анализов, содержащих 2% глюкозу и 100 мкг/мл ампициллина (2-кратный YTAG). Для определения титров фага различные разведения культуры E. coli, инфицированных исходным или выходным фагом, также высевали на 2-кратный агар YTAG. После выращивания в течение ночи при 30°C добавляли 10 мл 2-кратной среды YTAG в каждый планшет для биологического анализа и клетки ресуспендировали, соскребая бактериальный "газон". К этой суспензии клеток добавляли глицерин для достижения конечной концентрации 17% и хранили в аликвотах при -80°C до дальнейшего использования. Для "спасения" фага для следующего раунда селекции 100 мкл этой суспензии клеток использовали для инокуляции 20 мл 2-кратной среды YTAG, выращивали при 37°C (300 об/мин) до OD₆₀₀ 0,3-0,5. Затем клетки суперинфицировали с помощью 3,3 мкл хелперного фага MK13K07 и инкубировали при 37°C (150 об/мин) в течение 1 часа. Затем клетки центрифугировали и ресуспендировали осадок в содержащей канамицин/несодержащей глюкозу среде (2-кратной YT с 50 мкг/мл канамицина и 100 мкг/мл ампициллина). Эту культуру выращивали в течение ночи при 30°C (300 об/мин). Фаг собирали в супернатанте после центрифугирования, и он был готов для использования в следующем раунде селекции, как описано выше.

Получение необработанного периплазматического материала для применения в ELISA

ScFv можно экспрессировать на поверхности фаговой частицы или в растворе в бактериальном периплазматическом пространстве в зависимости от используемых условий выращивания. Для индуцирования высвобождения scFv в периплазму на 96-луночные планшеты с глубокими лунками, содержащие 2-кратные среды YT с 0,1% глюкозой/100 мкг/мл ампициллина, инокулировали материал из размороженных глицериновых стоков (один клон на лунку) с использованием устройства-сборщика колоний QPix (Molecular Devices) и выращивали при 37°C (999 об/мин) в течение ~4 часов. Культуры индуцировали с использованием IPTG в конечной концентрации 0,02 мМ и выращивали в течение ночи при 30°C (999 об/мин). Содержимое бактериальной периплазмы (PeriPreps) высвобождали с помощью осмотического шока. В кратком изложении, планшеты центрифугировали и осадки ресуспендировали в 150 мкл периплазматического буфера TES (50 мМ Трис, 1 мМ ЭДТА, 20% сахарозы, pH7,4) с последующим добавлением 150 мкл 1:5 TES:воды и инкубировали на льду в течение 30 минут. Планшеты центрифугировали в течение 20 минут при 4000 об/мин и собирали scFv-содержащий супернатант.

Конкурентный ELISA

Планшеты для ELISA (NUNC-Maxisorb 460372) покрывали 1 мкг/мл интересующего антигена в буфере PBS в течение ночи при 4°C. Покрывающий раствор выбрасывали, а затем планшеты блокировали при комнатной температуре в течение 2 часов с помощью 70 мкл PBS-3% BSA на лунку. Блокирующий раствор выбрасывали и добавляли 20 мкл первичного антитела, представлявшего собой смесь неизвестного образца в виде PeriPreps или очищенного белка (в заранее определенном разведении, как правило, 1:5) и чистого родительского антитела в желаемой концентрации (как правило, EC₅₀-EC₈₀). Планшеты инкубировали в течение 2 часов при комнатной температуре с медленным встряхиванием. Планшеты промывали 5 раз 100 мкл на лунку промывочного буфера (Perkin Elmer 1244-114) и инкубировали в течение 1 часа с 20 мкл конъюгата вторичного антитела с европием, разведенного 1:1000 в аналитическом буфере Delfia (Perkin Elmer 1244-111) в случае стрептавидин-Eu или антитела против IgG человека, разведенного 1:500, в случае антитела против IgG мыши. Планшеты промывали 5 раз, как описано выше, и инкубировали в течение 30 минут с 20 мкл усиливающего раствора (Perkin Elmer 1244-105). Затем измеряли флуоресценцию с разрешением по времени при 320 и 615 нм с использованием спектрофотометра для чтения планшетов EnVision® (EnVision® многоканального спектрофотометра для чтения планшетов, Perkin Elmer) по инструкциям производителя.

Преобразование ScFv в scFv-Fc, IgG и биспецифическое антитело

ScFv, демонстрирующее желаемые свойства, выбирали для субклонирования в scFv-Fc, где Fc-домен IgG1 человека присоединяли к 3'-концу scFv. В кратком изложении, фрагменты амплифицировали посредством стандартной полимеразной цепной реакции (ПЦР) с праймерами BssHII в случае 5’-амплификации и BclI в случае 3’-амплификации. Фрагменты разрезали соответствующими ферментами рестрикции по инструкциям производителя (New England Biolabs). Ампликоны scFv-Fc против GUCY2c выделяли из геля (набор для очистки из геля Qiagen) и лигировали в предварительно расщепленный экспрессирующий вектор млекопитающего, являющийся собственностью Pfizer, содержащий Fc-домен IgG1 человека. С помощью конструкций ScFv-Fc трансформировали E. coli и секвенировали, как описано выше. Затем экспрессирующие векторы с проверенной последовательностью использовали для транзиторной экспрессии в клетках млекопитающих HEK 293, как описано выше. Образцы очищали с использованием аффинной хроматографии с протеином A с последующей заменой буфера на PBS, как описано выше. Затем очищенные образцы подвергали скринингу на связывающую активность в отношении рекомбинантного белка GUCY2c и стабильность. Примером последовательности scFv-Fc является GUCY2C-0405 (SEQ ID NO: 213). Этот формат состоит из scFv в ориентации VH-VL, соединенных линкером 4, являющимся глицин-сериновым линкером (SEQ ID NO: 193). VH-VL соединяют с модифицированным Fc-доменом IgG1 человека (SEQ ID NO: 187) с использованием двух линкерных последовательностей, линкера 5 (SEQ ID NO: 194) и линкера 6 (SEQ ID NO: 195).

Оптимизированные scFv также субклонировали в IgG1 человека и T-клеточные биспецифические форматы, как описано выше. Праймеры, специфические для генов вариабельных областей, конструировали для клонирования ITA, как описано ранее.

Пример 11: Поверхностный плазмонный резонанс оптимизированных антител против GUCY2c

Оптимизированные антитела против GUCY2c оценивали на связывание посредством поверхностного плазмонного резонанса с использованием устройства BIACORE™ 8K (GE Healthcare). Используя сенсорный чип CM5, сначала наносили антитело против Fc человека (GE BR-1008-39) по инструкциям производителя. IgG человека против GUCY2c поливали чип в течение 30 сек при 0,5 мкг/мл, 10 мкл/мин в забуференном физиологическом растворе Хэнкса (HBS) -EP+ pH=7,4. Затем белку GUCY2c человека (SEQ ID NO: 224) в концентрации 450 нМ, 150 нМ и 50 нМ позволяли ассоциироваться, поливая им чип в течение 54 сек при 50 мкл/мин, а затем диссоциировать в течение 300 сек. Чип регенерировали после каждого прогона с помощью 3-кратного 3M MgCl₂ в течение 30 сек при 5 BIACORE™. Аффинность связывания (K_D, нМ) оптимизированных связывающих доменов против GUCY2c в формате IgG1 человека с рекомбинантным белком GUCY2c человека приведены в таблице 24. Несколько оптимизированных связывающих доменов против GUCY2c, таких как GUCY2C-0486 (SEQ ID NO: 214 и 215), демонстрировали улучшенную аффинность связывания по сравнению с родительским, неоптимизированным связывающим доменом (GUCY2C-0241).

Таблица 24

Клон K_D huGUCY2C (нМ) GUCY2C-0210 85,67±2,76 GUCY2C-0212 25,98±0,01 GUCY2C-0241 9,81 GUCY2C-0456 13,75 GUCY2C-0478 29,85±0,26 GUCY2C-0483 6,92±0,13 GUCY2C-0486 5,47±0,07

Пример 12: Анализ связывания способом термической проверки

Для оценки улучшенной термической стабильности оптимизированных вариантов, периплазматические препараты оптимизированных фаговых клонов (описанных выше) или очищенные белки оценивали на связывающую активность после термической проверки при повышенных температурах в устройстве для ПЦР. 384-луночные белые планшеты для ELISA Greiner bio-one (781074) покрывали 1 мкг/мл целевого белка покрывающего буфера (25 мМ Na₂CO₃, 75 мМ NaHCO₃, pH 9,6) O/N при 4°C. Планшеты промывали 3 раза PBS+0,05% TWEEN20, а затем блокировали в течение 1 ч. при встряхивании при RT с блокирующим буфером (PBS+3% молока). Отдельно подготавливали планшеты для разведения периплазматических препаратов или очищенного белка при связывании 1:10 периплазматических препаратов или 1 мкг/мл (EC₈₀) рекомбинантного белка при комнатной температуре в блокирующем буфере и 100 мкл переносили в 96-луночный планшет для ПЦР. Затем планшет для ПЦР, содержащий 100 мкл разведенного образца, нагревали при желаемых температурах (как правило, от 55°C до 75°C) в течение 30 минут. Планшетам позволяли охлаждаться в течение 15 минут при комнатной температуре, а затем центрифугировали при 4000 об/мин в течение 10 минут. Блокированные планшеты для ELISA опустошали и добавляли 20 мкл термически проверенного белкового супернатанта на лунку, затем инкубировали в течение 1 ч., встряхивали при RT. Планшеты промывали 3 раза, как описано выше, и добавляли 20 мкл реагента белка против 6xHIS-европий (Perkin Elmer EU-N1) или реагента белка конъюгата антитела против IgG человека и европия (Perkin Elmer EU-N1), разведенного 1:1000 в аналитическом буфере DELFIA (Perkin Elmer 1244-330), на лунку и инкубировали при RT в течение 1 ч. со встряхиванием. Планшеты промывали 3 раза 1-кратным промывочным раствором DELFIA (Perkin Elmer 1244-114), в каждую лунку добавляли 20 мкл усиливающего раствора (Perkin Elmer 1244-105) и инкубировали в течение 30 минут. Планшеты считывали на спектрофотометре для чтения планшетов Envision для определения флуоресценции с разрешением по времени сначала при OD320, затем при OD615 по инструкциям производителя. Температуру, при которой сохранялось 50% активности, регистрировали как T50. При термическом анализе связывания на стабильность оптимизированных GUCY2c-связывающих доменов как scFv-Fc наблюдали улучшенную термическую стабильность после инкубации при повышенных температурах по сравнению с неоптимизированным родительским клоном GUCY2C-0241 (обозначенным как GUCY2C-0295 в формате scFv-Fc) (таблицы 25A и 25B).

В таблицах 25A и 25B показана флуоресценция с разрешением по времени (TRF) для оптимизированных GUCY2c-связывающих доменов (в виде белков scFv-Fc) при повышенной температуре. Значение T50 представляет собой температуру, при которой клон сохраняет 50% связывающей активности.

Таблица 25A

Клон 50°C 50,5°C 51,7°C 53,2°C 55,5°C 58,4°C 61,8°C GUCY2C-0295 113537,5 68863 40896 27068 21936 21409,5 21197 GUCY2C-0389 497589,5 517068 495444,5 397372 464052 150312,5 78680 GUCY2C-0393 477566,5 511271 501945,5 480373,5 451437,5 77154,5 3630,5 GUCY2C-0401 506357,5 526131 535157,5 517779 523479 525247 469885,5 GUCY2C-0403 488139,5 544047,5 526733 536576 526171,5 522549,5 506987,5 GUCY2C-0411 471676,5 522040 542235 531706 539339 515333,5 425089 GUCY2C-0413 574068 598919 607913,5 603587,5 606227 590548 562273,5 GUCY2C-0418 547580 567189,5 526030,5 539879 526607 492907,5 407950 GUCY2C-0421 515013 487958,5 511088,5 510749 547231,5 529472 527035,5 GUCY2C-0423 411893,5 399052,5 462363,5 343803 464695,5 363302 8103 GUCY2C-0425 484807 479583 556277,5 510768 551751,5 548408 527384,5 GUCY2C-0427 512520 546980,5 547056 523887,5 537909,5 533628 498146 GUCY2C-0428 517436,5 541570,5 548392,5 536214,5 536255,5 523982,5 507148 GUCY2C-0435 487047,5 528185 517133,5 489329 490196,5 326153,5 42327 GUCY2C-0439 628296 568971 578626,5 576348,5 591356 585622 597929,5 GUCY2C-0445 536524 543057,5 522756 529305,5 529928 461742 36773,5 GUCY2C-0447 489262,5 499721 483027,5 484959 490929,5 470553,5 424560,5 GUCY2C-0448 565712,5 572475 566258 558343,5 560063 559518 547452 GUCY2C-0450 579746,5 595076,5 582737 578649,5 574037,5 563058,5 555110,5 GUCY2C-0451 564219,5 565212 541781 561199,5 534570 542623 528037

Таблица 25B

Клон 64,6°C 66,8°C 68,1°C 69,6°C 70°C T50 GUCY2C-0295 9853,5 1922 594 642,5 464,5 50,41 GUCY2C-0389 51040,5 21131,5 5766 2710,5 640,5 57,98 GUCY2C-0393 1677 909,5 2306 532 745,5 57,65 GUCY2C-0401 26531 3014,5 3061,5 2215 1178,5 62,77 GUCY2C-0403 498400,5 448403,5 298626,5 158161,5 77527 68,01 GUCY2C-0411 52317 20580 5945,5 1917 1162 62,44 GUCY2C-0413 573518,5 541790,5 469893 256224 108873 68,65 GUCY2C-0418 231526 136359 41704 7131,5 2812,5 62,23 GUCY2C-0421 489965 156593 1903,5 1135 980,5 66,44 GUCY2C-0423 2270,5 1542,5 785,5 879,5 929,5 59,23 GUCY2C-0425 494844,5 160062,5 2404,5 944 804 66,45 GUCY2C-0427 486978 224510 2906,5 1084 902,5 66,67 GUCY2C-0428 476739 96235,5 2133,5 1663,5 1332,5 66,1 GUCY2C-0435 17360 2504,5 1119,5 820,5 1061,5 58,65 GUCY2C-0439 562458,5 469494 249716,5 35294 6786,5 67,88 GUCY2C-0445 9384,5 1404,5 372,5 318,5 416 59,21 GUCY2C-0447 241324,5 12424,5 1271 391,5 1092,5 64,6 GUCY2C-0448 510974,5 221540 2645 724,5 648 66,62 GUCY2C-0450 518052,5 131373 1147 468,5 593 66,26 GUCY2C-0451 496304,5 189156 1814,5 693,5 731,5 66,53

Аминокислотные последовательности клонов антитела против GUCY2c, демонстрирующие улучшенную термическую стабильность, сравнивали с родительским клоном GUCY2C-0241 (VH SEQ ID NO: 60 и VL SEQ ID NO: 137). Изменения содержания аминокислот в CDR VH, приводящие к улучшенной стабильности, приведены в таблице 26A. Изменения в положениях 59, 60, 61 и 62, по-видимому, оказывают наибольшее влияние на стабильность, коррелируя с наибольшими изменениями стабильности (в соответствии с системой нумерации Kabat с использованием определения AbM для CDR1 VH).

Таблица 26A

Положение Родительская аминокислота Оптимизированная аминокислота CDR1 VH 30 T G 31 S N 32 Y D CDR2 VH 59 Y V, I, L 60 I N, H, A, S, G 61 E D, P 62 K Q, R, T CDR3 VH 95 T L 96 I V 97 T L, M 98 T K 99 T P, K, A, S, R

Изменения содержания аминокислот в CDR VL, приводящие к улучшенной стабильности, приведены в таблице 26B (использовали систему нумерации Chothia для CDR1 VL и систему нумерации Kabat для CDR2 VL и CDR3). Изменения в положениях 53, 54, 55 в CDR2 VL и положениях 93 и 94 в CDR3 VL, по-видимому, оказывают наибольшее влияние на стабильность, коррелируя с наибольшими изменениями стабильности.

Таблица 26B

Положение Родительская аминокислота Оптимизированная аминокислота CDR1 VH 24 R T, K 30a Y W, A 30d T S, H, A, R, N 33 M L 34 Q H CDR2 VH 50 A G 51 A G 52 S T, H 53 N K, H 54 V L, R, I, G, K, T 55 E A, Y, W, V 56 S P, T, A CDR3 VH 89 Q M, L, N 91 T S, N 93 K R, N, Q, S 94 V A, E, G, D, I, Q 97 T S

Пример 13: Связывание рекомбинантного белка оптимизированными биспецифическими антителами против CD3-GUCY2c

Оптимизированные связывающие домены против GUCY2c оценивали в биспецифическом формате на одновременное связывание рекомбинантного белка с GUCY2c человека (SEQ ID NO: 224) и CD3 человека (SEQ ID NO: 242) при комнатной температуре и 60°C способом DELFIA, описанным выше. Оптимизированные биспецифические антитела также оценивали на прямое связывание с GUCY2c человека (SEQ ID NO: 232) и GUCY2c яванского макака (SEQ ID NO: 236) при комнатной температуре и 60°C способом DELFIA, описанным выше. Двойное связывание оптимизированных биспецифических антител против GUCY2c с GUCY2c человека и CD3 человека приведены в таблице 27. Оптимизированные биспецифические антитела против CD3-GUCY2c, такие как GUCY2C-1478, демонстрировали сильное связывание при комнатной температуре и 60°C.

Таблица 27

Клон DELFIA huCD3-huGUCY сэндвич-формата при RT (1 мкг/мл) DELFIA huCD3-huGUCY сэндвич-формата при 60°C (1 мкг/мл) GUCY2C-1186 536148 137679 GUCY2C-1467 830590 620774 GUCY2C-1476 860194,5 682977,5 GUCY2C-1478 833155,5 727935 GUCY2C-1481 790943,5 694815,5 GUCY2C-1512 800436 673743,5 GUCY2C-1518 430465 87434,5 GUCY2C-1526 568727,75 147975 GUCY2C-1527 405448,25 67409 GUCY2C-1538 617581 151603 GUCY2C-1554 138640 14584 GUCY2C-1555 353355,25 68362,25 GUCY2C-1556 217761,5 40731,75 GUCY2C-1557 473322 190626,25 GUCY2C-1590 165141 71515 GUCY2C-1591 422409,25 159723,25 GUCY2C-1592 262425,75 79415,75 GUCY2C-1608 523911,5 192704,5

Результаты анализа прямого связывания оптимизированных биспецифических антител против GUCY2c с GUCY2c человека и яванского макака приведены в таблице 28. Оптимизированные биспецифические антитела против CD3-GUCY2C, такие как GUCY2C-1478, демонстрировали сильное связывание при комнатной температуре с GUCY2c человека и яванского макака, но при этом наблюдали некоторую потерю сигнала связывания после инкубации при 60°C.

Таблица 28

Клон EC₅₀huGUCY2C при RT (нМ) EC₅₀CyGUCY2C при RT (нМ) EC₅₀ huGUCY2C при 60°C (нМ) EC₅₀CyGUCY2C при 60°C (нМ) GUCY2C-1478 4,387 4,902 19,24 15,65 GUCY2C-1481 7,836 8,34 27,36 64,99 GUCY2C-1554 18,32 13,93 NB NB GUCY2C-1555 5,391 6,85 39,44 94,86 GUCY2C-1556 13,58 10,14 65,58 62,41 GUCY2C-1557 6,382 7,51 38,2 53,52 GUCY2C-1590 20,25 13,31 48,65 57,3 GUCY2C-1592 13,38 14,39 94,09 75,97 GUCY2C-1608 8,775 9,835 23,67 49,87 Отрицательный контроль NB NB NB NB

Пример 14: Связывание клеток биспецифическими антителами против CD3-GUCY2c по результатам проточной цитометрии

Оптимизированные биспецифические антитела против CD3 титровали на связывание поверхности клетки с GUCY2c на клетках T84 и с CD3 человека на наивных T-клетках человека, выделенных из свежих мононуклеарных клеток периферической крови человека (PBMC), описанными выше способами проточной цитометрии. Гуманизированные и оптимизированные клоны против GUCY2c GUCY2C-0247 и GUCY2C-1608 демонстрировали аффинность связывания с клетками T84, экспрессирующими GUCY2c человека, в нижнем и субнаномолярном диапазоне (фигуры 2A и 2B). Гуманизированные и оптимизированные биспецифические антитела против GUCY2c также оценивали на связывание с CD3 на поверхности клетки посредством проточной цитометрии (фигуры 3A и 3B) и наблюдали аффинность связывания с наивными T-клетками человека в нижнем или среднем наномолярном диапазоне.

Пример 15: Уменьшение риска иммуногенности биспецифических антител против GUCY2c

Если некоторые терапевтические белки вводят пациентам, нежелательные иммунные ответы, такие как образование антител против лекарственных средств (ADA), влияют на эффективность лекарственного средства и вызывает проблемы в отношении безопасности для пациента (Yin L., et al., Cell Immunol. Jun; 295(2):118-26, 2015). ADA можно классифицировать на две группы: нейтрализующие ADA (NAb) или ненейтрализующие ADA (не-NAb) в зависимости от того, ингибируют ли они фармакологическую активность терапевтического белка (Yin L., et al., Cell Immunol. Jun; 295(2):118-26, 2015). Существует два возможных механизма, посредством которых NAb и не-NAb могут вносить вклад в снижение эффективности лекарственного средства. Во-первых, NAb напрямую блокируют связывание терапевтического белка с молекулой-мишенью, таким образом, снижая ее терапевтическую эффективность (Yin L., et al., Cell Immunol. Jun; 295(2):118-26, 2015). Во-вторых, NAb и не-NAb могут вносить вклад в повышенный клиренс, влияя на фармакокинетику (PK) TPP, таким образом, препятствуя эффективности лекарственного средства (Yin L., et al., Cell Immunol. Jun; 295(2):118-26, 2015). Иммуногенность в отношении терапевтического белка может генерироваться в рамках T-клеточно-зависимого и T-клеточно-независимого путей. В T-клеточно-зависимом пути T-клетки активируются посредством распознавания образующихся из терапевтического белка антигенных пептидов, презентируемых молекулами главного комплекса гистосовместимости класса II (MHC II) в антигенпрезентирующих клетках. Затем активированные T-клетки стимулируют B-клетки так, что они образуют ADA, специфические в отношении терапевтического белка (Yin L., et al., Cell Immunol. Jun; 295(2):118-26, 2015). Для минимизации вероятности иммуногенности, возникающей в результате T-клеточно-зависимых ответов, предпринимались попытки снизить антигенный потенциал последовательностей биспецифических антител против CD3-GUCY2c способами in silico, описанными ниже.

Последовательности анализировали двумя способами (подробно описанными ниже) для идентификации потенциальных T-клеточных эпитопов. Любую последовательность, отмеченную по правилам, представленным в настоящем описании для любого способа, считали эпитопом. В настоящем описании исследуют последовательности, главным образом, на уровне аминокислотных 9-меров.

Способ 1: Последовательности подвергают анализу EpiMatrix в пакете программ ISPRI (ISPRI v 1.8.0, EpiVax Inc., Providence, RI (2017); Schafer JRA, Jesdale BM, George JA, Kouttab NM, De Groot AS. Prediction of well-conserved HIV-1 ligands using a matrix-based algorithm, EpiMatrix. Vaccine 16(19), 1880-84, 1998). Необработанные результаты представляют собой ранжирование вероятности связывания каждого 9-мерного аминокислотного фрагмента относительно 8 разных типов HLA. Таким образом, существует 8 предсказаний ("наблюдений") для каждого 9-мера. 9-меры получают, начиная с каждого индивидуального положения линейной нумерации последовательности (таким образом, один и тот же 9-мер может встречаться более одного раза в одной и той же последовательности). Если любые 4 наблюдения свидетельствуют о том, что 9-мер входит в лучшие 5% связывающих средств (что означает, что согласно предсказанию он будет в лучших 5% связывающих средств для по меньшей мере 4 типов HLA), 9-мер считают прогнозируемым эпитопом ("эпитоп"). Альтернативно, если любое 1 из 8 предсказаний свидетельствует о том, что 9- мер входит в лучший 1% связывающих средств, 9-мер также считают прогнозируемым эпитопом.

Способ 2: Последовательности подвергали анализу с использованием консенсусного способа связывания MHC-II (Wang P, Sidney J, Kim Y, Sette A, Lund O, Nielsen M, Peters B. Peptide binding predictions for HLA DR, DP и DQ molecules. BMC Bioinformatics 11:568, 2010; Wang P, Sidney J, Dow C, Mothé B, Sette A, Peters B. A systematic assessment of MHC class II peptide binding predictions and evaluation of a консенсусн approach. PLoS Comput Biol. 4(4),e1000048, 2008in IEDB (Vita R, Overton JA, Greenbaum JA, Ponomarenko J, Clark JD, Cantrell JR, Wheeler DK, Gabbard JL, Hix D, Sette A, Peters B. The immune epitope database (IEDB) 3,0. Nucleic Acids Res. Jan 28 (43), D405-12, 2015; IEDB MHC-II Binding Predictions, http://www.iedb.org).

Выходные данные программного обеспечения распределяют результаты по 15-мерам. Получают консенсусные баллы и ранжирование процентилей для каждой комбинации 15-мера и типа HLA. Но индивидуальные баллы, из которых получают консенсусные результаты для каждого 15-мера, представляют собой ранжирование некоторых 9-меров, обнаруживаемых в 15-мере: в каждом способе, используемом для получения консенсусных результатов, отчет предоставляется в виде ранга процентили для 9-мера в 15-мере, и консенсусные баллы, принятые за значение для общего 15-мера, представляет собой предсказание для 9-мера, имеющего медианные баллы. Авторы настоящего изобретения классифицировали 9-мер как эпитоп, если (a) его выбирают как консенсусный типичный результат для 15-мера, и (b) он имеет ранг процентили в лучших 10% связывающих средств для рассматриваемого типа HLA, и если критерии (a) и (b) совпадают для трех или более отдельных типов HLA для одного и того же 9-мера (т.е. три наблюдения). Рассматриваемые типы HLA представляли собой DRB1*01, 1*03, 1*04, 1*07, 1*08, 1*11, 1*13 и 1*15, являющиеся теми же типами HLA в стандартном отчете ISPRI/EpiMatrix. Таким образом, хотя первичными выходными данными способа является ранжирование 15-мер, авторы настоящего изобретения по-новому истолковывают данные для получения списка прогнозируемых 9-мерных эпитопов для простоты сравнения со способа 1.

Авторы настоящего изобретения классифицировали каждый эпитоп как эпитоп зародышевой линии или не-зародышевой линии. В случае антител авторы настоящего изобретения дополнительно классифицировали каждый эпитоп с учетом его локализации в антителе (CDR или не-CDR). Авторы настоящего изобретения фильтровали последовательности V-доменов человека, полученные из IMGT (www.imgt.org), для удаления зародышевых линий, аннотированных как псевдогены или открытые рамки считывания (ORF). Любой прогнозируемый 9-мерный эпитоп, обнаруживаемый в остальных последовательностях, считали эпитопом зародышевой линии. Эпитопы, обнаруживаемые в областях J или C (включая IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4) или соединениях между этими областями, также классифицировали как эпитопы зародышевой линии. Иными словами, эпитоп классифицируют как эпитоп не-зародышевой линии. Определения CDR основаны на системе нумерации Kabat (Kabat EA, Wu TT, Perry HM, Gottesman KS, Foeller C. Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242, 1991), где CDR определяют как включающие следующие остатки: CDR1 VH (H26-H35, включая инсерции, такие как H35A, до H36, но не включая его), CDR2 VH (H50-H65 включительно), CDR3 VH (H95-H102 включительно), CDR1 VL (L24-L34 включительно), CDR2 VL (L54-L56, включительно), CDR3 VL (L89-L97, включительно). Прогнозируемый 9-мерный эпитоп является эпитопом CDR, если любая из этих аминокислот является частью области CDR. Необходимо отметить, что выбранное авторами настоящего изобретения исходное положение (H26) для CDR1 VH отличается от описанного в некоторых других публикациях при использовании аннотации по Kabat.

В случае отдельной цепи или пары доменов VH и VL антитела общие баллы можно вычислять, суммируя каждый из 9-меров следующим образом. Исследуют все отдельные комбинации 9-мера и типа HLA ("наблюдения"), независимо от того, является ли 9-мер эпитопом. Если конкретное наблюдение свидетельствует о том, что пептид входит в лучшие 5% связывающих средств для казанного типа HLA, Z-баллы EpiMatrix для этого наблюдения добавляют к промежуточной сумме, ассоциированной со всей последовательностью белка. Также регистрируют общее количество исследуемых наблюдений. Единственным исключением является то, что все наблюдения, касающиеся 9-меров, идентифицированных посредством ISPRI как "T-регитопы", считают имеющими баллы EpiMatrix, равные нулю. В промежуточной сумме исходные баллы 0,05*2,2248 вычитают из каждого наблюдения (включая T-регитопы). Конечные баллы вычисляют следующим образом:

Скорректированные баллы T-reg = (промежуточная сумма)*1000/(количество наблюдений)

Более низкие баллы свидетельствуют о более низком прогнозируемом иммуногенном потенциале.

Баллы включают только прогнозирование с помощью ISPRI/EpiMatrix и не включают информацию, полученную с помощью IEDB. Таким образом, любые сильные HLA-связывающие средства, прогнозируемые с помощью IEDB, но не ISPRI, не вносят вклад в баллы. Теоретически, последовательности могут содержать множество IEDB-прогнозируемых HLA-связывающих средств и все равно иметь благоприятные скорректированные баллы T-reg, если с помощью EpiMatrix также не прогнозируют те же последовательности как вероятные связывающие средства.

Выравнивание неоптимизированных и оптимизированных областей VH и VL против GUCY2c с зародышевыми линиями. Остатки, выделенные полужирным шрифтом, представляют собой горячие точки T-клеточного эпитопа, определяемые описанными выше способами in silico. В некоторых вариантах осуществления замена является заменой зародышевой линии человека, при которой остаток CDR заменяют соответствующим остатком зародышевой линии человека для повышения содержания аминокислот человека и снижения потенциальной иммуногенности антитела (как описано выше). В других вариантах осуществления замена представляет собой другую аминокислоту, снижающую потенциальную иммуногенность антитела и не мешающую связывающим свойствам антитела.

Например, если каркас VH3-7 зародышевой линии человека используют с примером антитела GUCY2C-0241, то выравнивание CDR2 VH GUCY2C-0241 (SEQ ID NO: 28) и VH3-7 зародышевой линии человека (SEQ ID NO: 178) является таким, как представлено в таблице 29 ниже (с использованием системы нумерации Kabat):

Таблица 29

Клон 50 51 52 52 A 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 VH3-7 N I K Q D G S E K Y Y V D S V K G GUGY2c-0241 E I K P S N G L T N Y I E K F K N

В случае положений 51, 52, 59 и 64 остаток зародышевой линии человека и соответствующий остаток GUCY2C-0241 являются одинаковыми, и замена зародышевой линии невозможна. В случае положений 50, 52A, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 60, 61, 62, 63 и 65 (выделены полужирным шрифтом), остаток зародышевой линии человека и соответствующий остаток GUCY2C-0241 отличаются. Если анализу T-клеточных эпитопов in silico подвергают последовательность GUCY2C-0241, идентифицируют потенциальные пептидные последовательности (подчеркнуты). Затем их дополнительно анализируют на содержимое непринадлежащей человеку зародышевой линии с баллами T-клеточных эпитопов >10 и остатки непринадлежащей человеку зародышевой линии используют для мутагенеза (показано выше полужирным шрифтом и подчеркнуто). Используя мутагенез с "мягкой" рандомизацией (способами, ранее описанными в патенте США № 9884921), эти остатки подвергали мутагенезу и тестировали на сохранение связывающей активности и сохранение стабильности.

Пример 16: Активность опосредованного T-клетками уничтожения клеток оптимизированными биспецифическими антителами против CD3-GUCY2c

Оптимизированные биспецифические антитела против CD3-GUCY2c оценивали на опосредованную T-клетками цитотоксичность в отношении опухолевых клеток, как описано ранее. Оптимизированные биспецифические антитела против GUCY2c демонстрировали улучшенное эффективное опосредованное T-клетками уничтожение опухолевых клеток T84. Результаты анализов уничтожения клеток с использованием гуманизированного биспецифического антитела против CD3-GUCY2c (соотношение E:T=5:1) приведены в таблице 30 и на фигурах 4A-4D.

Таблица 30

Клон EC₅₀ опухолевых клеток T84 (нМ) GUCY2C-0240 0,53 GUCY2C-0453 17,65 GUCY2C-0454 14,34 GUCY2C-0247 0,07 GUCY2C-0381 2,7 GUCY2C-1186 0,22 GUCY2C-1467 0,2 GUCY2C-1476 0,07 GUCY2C-1478 0,24 GUCY2C-1481 1,57 GUCY2C-1512 0,57 GUCY2C-1518 0,37 GUCY2C-1526 0,13 GUCY2C-1538 0,05 GUCY2C-1554 12,6 GUCY2C-1555 1,13 GUCY2C-1556 5,04 GUCY2C-1557 0,22 GUCY2C-1590 11,07 GUCY2C-1592 2,6 GUCY2C-1608 0,19

Пример 17: Анализ дифференциальной сканирующей калориметрии (DSC)

Белки разводили в фосфатно-солевом буфере (PBS) до 0,6 мг/мл в объеме 400 мкл. PBS использовали в качестве буфера пустой пробы в референсной ячейке. PBS содержал 137 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl, 8,1 мМ Na₂HPO₄ и 1,47 мМ KH₂PO₄, pH 7,2. Образцы распределяли в лоток для образцов MicroCal VP-Capillary DSC с помощью автосемплера (Malvern Instruments Ltd, Malvern, UK). Образцы уравновешивали в течение 5 минут при 10°C, а затем доводили до 110°C со скоростью 100°C в час. Выбирали период фильтрации 16 секунд. Необработанные данные подвергали поправке на фон и нормализовали концентрацию белка. Для аппроксимации данных к модели MN2-State с соответствующим количеством переходов использовали программное обеспечение Origin 7.0 (OriginLab Corporation, Northampton, MA). Результаты дифференциальной сканирующей калориметрии оптимизированных связывающих доменов против GUCY2c в формате scFv-Fc приведены в таблице 31. Оптимизированные клоны демонстрируют улучшенную температуру разворачивания (Tm1) по сравнению с родительским, неоптимизированным клоном GUCY2C-0247 (обозначенным как GUCY2C-0295 в формате scFv-Fc).

Таблица 31

Клон Tm1 DSC Tm2 DSC Tm3 DSC GUCY2C-0295 57,9 68,8 83,6 GUCY2C-0389 64,2 67,5 83,6 GUCY2C-0393 64,1 67,5 83,6 GUCY2C-0401 69,1 69,1 83,6 GUCY2C-0403 73,3 73,3 84,5 GUCY2C-0411 69,1 69,1 83,8 GUCY2C-0413 71,6 76,2 84,5 GUCY2C-0418 51 68,1 83,7 GUCY2C-0421 71,5 71,5 84 GUCY2C-0423 66,1 66,1 83,8 GUCY2C-0425 71,6 71,6 84 GUCY2C-0427 68,3 72,1 84 GUCY2C-0428 71,2 71,2 84,1 GUCY2C-0435 65,3 65,3 83,7 GUCY2C-0439 72,8 72,8 84,4 GUCY2C-0445 67 67 83,8 GUCY2C-0447 69,7 69,7 84,3 GUCY2C-0448 71,6 71,6 84,3 GUCY2C-0450 71,2 71,2 84,2 GUCY2C-0451 71,6 71,6 84,2

Пример 18: Анализ поверхностного плазмонного резонанса (SPR) биспецифических антител против CD3-GUCY2c

Аффинности связывания биспецифических антител против CD3-GUCY2c с GUCY2c человека (SEQ ID NO: 224), GUCY2c яванского макака (SEQ ID NO: 236) и GUCY2C мыши (SEQ ID NO: 240) определяли с использованием устройства BIACORE™ T200 (GE Healthcare) при 25°C и 37°C со скоростью сбора 10 Гц. GUCY2c человека, GUCY2c яванского макака и GUCY2c мыши напрямую иммобилизовали на поверхности трех разных проточных кювет сенсорного чипа CM5 (BR100530, GE Healthcare) с использованием набора для присоединения по аминогруппе (BR100050, GE Healthcare) по инструкциям производителя. Конечные уровни иммобилизации GUCY2c человека, яванского макака и мыши составляли 142 резонансных единиц (RU), 61 RU и 201 RU соответственно. Проточную кювету 1 использовали в качестве референсной проточной кюветы. Серию трехкратных разведений биспецифических антител против CD3-GUCY2c с концентрациями в диапазоне от 450 нМ до 5,56 нМ впрыскивали на поверхность сенсора в течение 52 секунд при скорости потока 50 мкл/мин. Осуществляли мониторинг диссоциации в течение 400 секунд и регенерировали поверхность 10 мМ глицином, pH 2,1. Подвижный буфер и буфер для образцов представляли собой 10 мМ HEPES, pH 7,4, 0,15 M NaCl, 3 мМ ЭДТА, 0,05% P-20 (HBS-EP+). Данные получали в двух параллелях. Аффинности связывания и константы скорости определяли посредством аппроксимации данных получаемой сенсограммы к модели 1:1 Ленгмюра с помощью аналитического программного обеспечения BIACORE™ T200 версии 3.0 (GE Healthcare). Аффинности связывания биспецифических антител против GUCY2c с CD3 человека (SEQ ID NO: 242) и CD3 яванского макака (SEQ ID NO: 244) определяли с использованием устройства BIACORE™ T200 (GE Healthcare) при 25°C и 37°C со скоростью сбора 10 Гц. CD3 человека и яванского макака захватывали на поверхности трех разных проточных кювет сенсорного чипа CM5 (BR100050, GE Healthcare) с использованием набора для захвата по His-группе (28995056, GE Healthcare) по инструкциям производителя. Уровни захвата CD3 человека (SEQ ID NO: 242) составляли 8 резонансных единиц (RU) и 16 RU на проточных кюветах 2 и 3, соответственно, при этом 10 RU CD3 яванского макака захватывали на проточной кювете 4. Проточную кювету 1 использовали в качестве референса. Серию трехкратных разведений биспецифического белка против GUCy2c с концентрациями в диапазоне от 100 нМ до 3,7 нМ впрыскивали на сенсорную поверхность в течение 55 секунд при скорости потока 50 мкл/мин. Осуществляли мониторинг диссоциации в течение 300 секунд и поверхность регенерировали 10 мМ глицином, pH 1,5. Подвижный буфер и буфер для образцов представляли собой 10 мМ HEPES, pH 7,4, 0,15 M NaCl, 3 мМ ЭДТА, 0,05% P-20 (HBS-EP+). Данные получали в двух параллелях. Аффинности связывания и константы скорости определяли посредством аппроксимации получаемых данных сенсограммы к модели Ленгмюра 1:1 с помощью аналитического программного обеспечения BIACORE™ T200 версии 3.0 (GE Healthcare). Результаты анализа связывания BIACORE™ биспецифических антител против CD3-GUCY2c с GUCY2c человека, яванского макака и мыши в разных условиях, включая ориентацию анализа и температуру, приведены в таблицах 32A-32J. Гуманизированные и оптимизированные GUCY2C-связывающие домены демонстрировали сохраненное или улучшенное связывание с GUCY2C и CD3 в качестве биспецифических антител. В некоторых случаях наблюдали снижение аффинности связывания при повышенной температуре (37°C).

В таблице 32A показана кинетика связывания биспецифических антител против CD3-GUCY2c с GUCY2c человека. Используемым способом захвата являлся захват с помощью антитела против IgG человека при 25°C.

Таблица 32A

Клон ka (1/Мс) kd (1/с) K_D (нМ) N GUCY2C-0074 4,41E+4±2,17E+3 2,00E-3±4,27E-5 45,40±2,90 4 GUCY2C-0098 1,36E+5±4,79E+1 6,75E-4±1,97E-6 4,96±0,02 2 GUCY2C-0240 9,62E+4±4,76E+3 3,64E-3±1,22E-5 37,90±1,75 2 GUCY2C-0247 9,82E+4±1,64E+3 4,57E-4±2,84E-6 4,65±0,09 4 GUCY2C-1478 1,18E+5±7,24E+2 4,34E-4±3,05E-5 3,69±0,28 2

В таблице 32B показана кинетика связывания биспецифических антител против CD3-GUCY2c с GUCY2c человека. Используемым способом захвата являлась прямая иммобилизация при 25°C.

Таблица 32B

Клон ka (1/Мс) kd (1/с) K_D (нМ) N GUCY2C-0077 1,43E+5±1,7E+4 2,24E-2±1,00E-3 160,00±25,00 2 GUCY2C-0098 1,45E+5±2,41E+3 1,04E-3±2,61E-5 7,19±0,30 2 GUCY2C-0104 1,48E+5±1,00E+4 3,86E-3±2,00E-5 26,10±1,90 2 GUCY2C-0240 9,62E+4±4,76E+3 3,64E-3±1,22E-5 37,90±1,75 2 GUCY2C-0247 1,44E+5±1,83E+3 4,33E-4±2,88E-6 3,01±0,02 2 GUCY2C-1608 1,01E+5±2,19E+3 7,58E-4±1,68E-6 7,47±0,15 2

В таблице 32C показана кинетика связывания биспецифических антител против CD3-GUCY2c с GUCY2c человека. Используемым способом захвата являлась прямая иммобилизация при 37°C.

Таблица 32C

Клон ka (1/Мс) kd (1/с) K_D (нМ) N GUCY2C-0098 2,51E+5±4,65E+3 3,77E-3±1,85E-5 15,02±0,35 2 GUCY2C-1608 1,61E+5±8,47E+3 2,17E-3±6,58E-5 13,52±1,12 2

В таблице 32D показана кинетика связывания биспецифических антител против CD3-GUCY2c с GUCY2c яванского макака. Используемым способом захвата являлся захват с помощью антитела против IgG человека при 25°C.

Таблица 32D

Клон ka (1/Мс) kd (1/с) K_D (нМ) N GUCY2C-0074 4,73E+4±7,70E+3 2,84E-3±3,60E-4 60,35±2,15 2 GUCY2C-0098 1,34E+5±1,63E+3 5,24E-4±3,93E-5 3,93±0,34 2 GUCY2C-0240 2,61E+4±7,10E+3 2,34E-3±5,24E-4 91,20±12,50 4 GUCY2C-0247 8,55E+4±1,35E+4 3,69E-4±4,35E-5 4,35±0,24 4

В таблице 32E показана кинетика связывания биспецифических антител против CD3-GUCY2c с GUCY2c яванского макака. Используемым способом захвата являлась прямая иммобилизация при 25°C.

Таблица 32E

Клон ka (1/Мс) kd (1/с) K_D (нМ) N GUCY2C-0098 2,06E+5±1,17E+3 5,77E-4±3,50E-6 2,80±0,03 2 GUCY2C-1608 1,38E+5±1,04E+3 4,17E-4±7,61E-6 3,01±0,03 2

Таблица 32F показана кинетика связывания биспецифических антител против CD3-GUCY2c с GUCY2c яванского макака. Используемым способом захвата являлась прямая иммобилизация при 37°C.

Таблица 32F

Клон ka (1/Мс) kd (1/с) K_D (нМ) N GUCY2C-0098 3,10E+5±7,75E+3 2,64E-3±3,76E-5 8,52±0,33 2 GUCY2C-1608 1,91E+5±1,18E+4 1,66E-3±4,67E-5 8,68±0,29 2

В таблице 32H показана кинетика связывания биспецифических антител против CD3-GUCY2c с GUCY2c мыши. Используемым способом захвата являлся захват с помощью антитела против IgG человека при 25°C.

Таблица 32H

Клон ka (1/Мс) kd (1/с) K_D (нМ) N GUCY2C-0074 1,48E+4±5,32E+1 2,82E-3±1,08E-4 191,01±6,60 2 GUCY2C-0098 3,75E+4±1,31E+3 4,02E-3±2,25E-5 107,19±3,15 2 GUCY2C-0240 1,06E+4±8,30E+1 3,36E-3±6,89E-5 316,54±8,95 2

В таблице 32I показана кинетика связывания биспецифических антител против CD3-GUCY2c с GUCY2c мыши. Используемым способом захвата являлась прямая иммобилизация при 25°C.

Таблица 32I

Клон ka (1/Мс) kd (1/с) K_D (нМ) N GUCY2C-0098 1,34E+5±1,61E+3 2,68E-3±1,55E-5 19,97±0,36 2 GUCY2C-0240 1,22E+5±3,83E+3 5,15E-3±1,35E-5 42,34±1,44 2 GUCY2C-0247 1,50E+5±1,67E+3 1,83E-3±9,99E-6 12,22±0,07 2 GUCY2C-1608 9,12E+4±1,13E+3 1,57E-3±3,04E-6 17,27±0,25 2

В таблице 32J показана кинетика связывания биспецифических антител против CD3-GUCY2c с GUCY2c мыши. Используемым способом захвата являлась прямая иммобилизация при 37°C.

Таблица 32J

Клон ka (1/Мс) kd (1/с) K_D (нМ) N GUCY2C-0098 1,96E+5±1,25E+4 2,01E-2±1,48E-3 102,66±0,97 2 GUCY2C-1608 1,29E+5±7,10E+3 1,16E-2±1,61E-4 90,17±3,71 2

В таблицах 33A-33F показан анализ связывания BIACORE™ биспецифических антител против CD3-GUCY2c с CD3 человека и яванского макака в разных условиях, включая ориентацию анализа и температуру.

В таблице 33A показана кинетика связывания биспецифических антител против CD3-GUCY2c с белком CD3 человека. Используемым способом захвата являлся захват с помощью антитела против IgG человека при 25°C.

Таблица 33A

Клон ka (1/Мс) kd (1/с) K_D (нМ) N GUCY2C-0074 4,71E+5±2,16E+5 8,61E-4±1,56E-5 2,17±0,99 4 GUCY2C-0098 2,97E+5±1,28E+3 9,67E-4±2,15E-5 3,26±0,09 2 GUCY2C-0240 3,47E+5±8,83E+3 1,29E-3±4,5E-5 3,73±0,19 4 GUCY2C-0247 2,95E+5±2,17E+3 9,85E-4±6,34E-6 3,34±0,04 4

В таблице 33B показана кинетика связывания биспецифических антител против CD3-GUCY2c с CD3 человека. Используемым способом захвата являлся захват с помощью антитела против His при 25°C.

Таблица 33B

Клон ka (1/Мс) kd (1/с) K_D (нМ) N GUCY2C-0098 1,10E+6±2,14E+4 5,24E-3±8,88E-5 4,75±0,08 4 GUCY2C-1478 3,55E+5±6,10E+3 9,56E-3±1,37E-4 26,93±0,76 3 GUCY2C-1608 4,18E+5±2,78E+4 9,99E-3±2,41E-4 23,97±0,97 4

В таблице 33C показана кинетика связывания биспецифических антител против CD3-GUCY2c с CD3 человека. Используемым способом являлся захват с помощью антитела против His при 25°C.

Таблица 33C

Клон ka (1/Мс) kd (1/с) K_D (нМ) N GUCY2C-0098 2,51E+6±6,34E+5 5,05E-2±1,43E-2 19,93±0,72 4 GUCY2C-1608 7,44E+5±2,31E+5 9,00E-2±2,18E-2 123,77±10,95 4

В таблице 33D показана кинетика связывания биспецифических антител против CD3-GUCY2c с CD3 яванского макака. Используемым способом являлся захват с помощью антитела против His при 25°C.

Таблица 33D

Клон ka (1/Мс) kd (1/с) K_D (нМ) N GUCY2C-0074 4,25E+5±1,36E+4 1,12E-3±8,98E-5 2,64±0,28 4 GUCY2C-0098 2,84E+5±9,80E+3 1,01E-3±3,55E-5 3,56±0,25 2 GUCY2C-0240 4,40E+5±5,00E+2 2,07E-3±8,00E-5 4,71±0,19 2 GUCY2C-0247 2,80E+5±1,48E+4 1,00E-3±6,76E-5 3,61±0,43 4

В таблице 33E показана кинетика связывания биспецифических антител против CD3-GUCY2c с CD3 яванского макака. Используемым способом являлся захват с помощью антитела против His при 25°C.

Таблица 33E

Клон ka (1/Мс) kd (1/с) K_D (нМ) N GUCY2C-0098 9,69E+5±1,85E+4 4,78E-3±1,03E-4 4,94±0,01 2 GUCY2C-1608 3,81E+5±2,33E+4 9,16E-3±2,31E-4 24,12±0,87 2

В таблице 33F показана кинетика связывания биспецифических антител против CD3-GUCY2c с CD3 яванского макака. Используемым способом являлся захват с помощью антитела против His при 25°C.

Таблица 33F

Клон ka (1/Мс) kd (1/с) K_D (нМ) N GUCY2C-0098 2,28E+6±3,59E+5 4,42E-2±7,86E-3 19,34±0,40 2 GUCY2C-1608 5,14E+5±1,86E+4 6,65E-2±1,46E-3 129,78±7,53 2

Пример 19: Измерения высвобождения цитокинов in vitro в случае биспецифических антител против CD3-GUCY2c

Клетки T84 обрабатывали T-клетками (соотношение E:T 5:1) и GUCY2C-1608 в разных дозах. Супернатанты собирали в разные моменты времени (24 ч., 48 ч., 96 ч.), анализировали с использованием мультиплексного анализа Lumninex по инструкциям производителя и считывали с помощью Luminex 200 с использованием программного обеспечения xPONENT. Измеряемыми цитокинами являлись ИФН-гамма, ИЛ-10, ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-6, ФНО-альфа человека. На фигурах 5A-5F проиллюстрированы профили высвобождения цитокинов в случае GUCY2C-1608. Эти цитокины подвергались положительной регуляции при обработке GUCY2C-1608 клетками T84 в присутствии T-клеток, что подтверждает механизм опосредованной T-клетками активности биспецифического антитела против CD3-GUCY2c в GUCY2c-экспрессирующих клетках.

Пример 20: Оценка in vivo активности, опосредованной биспецифическим антителом против CD3-GUCY2c

PBMC человека размораживали в средах (X-VIVO 15 (Lonza). Добавляли 5% сывороточного альбумина человека (Gemini #100-318), 1% пенициллина/стрептомицина, 0,01 мМ 2-меркаптоэтанола на приблизительно 5 миллионов клеток на мл. Клетки центрифугировали и ресуспендировали в буфере Robosep (Stem Cell Technologies) в концентрации 50 миллионов клеток на мл. T-клетки выделяли с использованием набора для обогащения T-клеток человека EasySep (Stem Cell Technologies). T-клетки активировали и выращивали с использованием набора для активации/экспансии T-клеток человека (Miltenyi). В день 2 T-клетки переносили в устройство для культивирования клеток G-Rex для экспансии, в среды добавляли ИЛ-2 (Stem Cell Technologies) и восполняли через 2 дня. T-клетки собирали через 1 неделю после активации/экспансии. Во время сбора частицы удаляли с помощью магнита и клетки ресуспендировали в DPBS в количестве 1×10⁷ клеток/мл для инокуляции in vivo.

Для исследований ксенотрансплантатов мышам NSG подкожно в бок инокулировали линии клеток колоректальной опухоли (T84, H55, LS1034) или полученные из пациента фрагменты ксенотрансплантата (PDX-CRX-11201, PDX-CRX-12213, PDX-CRX-24225).

Опухоли измеряли с использованием цифрового штангенциркуля и вычисляли объемы с помощью модифицированной формулы эллипсоида 1/2 × длина × ширина 2. Мышей рандомизировали и стадировали по размеру опухоли 150-200 мм³. Начальную дозу биспецифического антитела против GUCY2c, биспецифического антитела отрицательного контроля или носителя вводили животным в день 0 и 2 миллиона культивированных T-клеток инокулировали на следующий день. Мышам вводили дозы в виде болюсных инъекций 0,2 мл еженедельно до 5 раз, и все введения соединений и T-клеток осуществляли внутривенно через боковую хвостовую вену каждого животного. Опухоли измеряли дважды в неделю вместе с непрерывным мониторингом признаков реакции "трансплантат-против-хозяина" (фигуры 6-15). Все биспецифические антитела против CD3-GUCY2c демонстрировали дозозависимую опосредованную T-клетками противоопухолевую активность в моделях линии клеток ксенотрансплантата и полученного из пациента ксенотрансплантата.

Пример 21: Анализ циклического гуанозинмонофосфата (цГМФ) для характеризации биспецифических антител против GUCY2c-CD3 в отношении потенциальной активности модуляции пути GUCY2c

Для тестирования продукции циклического гуанозиномонофосфата (цГМФ) клетками T84 в ответ на стимуляцию пути GUCY2c 2×10⁶ клеток T84 высевали в 24-луночный планшет на ночь. Клетки промывали DMEM, содержащей 50 мМ HEPES, и обрабатывали DMEM, содержащей 50 мМ HEPES и 1 мМ 3-изобутил-1-метилксантин (IBMX), в течение 15 минут. Затем клетки обрабатывали GUCY2C-1608 или биспецифическим антителом отрицательного контроля в концентрациях в диапазоне от 0,1 до 99 мкМ. В качестве положительного контроля добавляли агониста GUCY2c, энтеротоксин STp (BACHEM) (от 0,02 до 51 мкМ) в течение 45 минут. Твердые частицы удаляли посредством центрифугирования и использовали 200 мкл супернатанта для анализа продукции цГМФ с использованием набора cGMP Parameter Assay Kit (R&D Systems) по инструкциям производителя. Для оценки потенциальной нейтрализующей активности GUCY2C-1608 добавляли 0,2 мкМ STp в том же диапазоне, что и GUCY2C-1608 или биспецифическое антитело отрицательного контроля, как описано выше, на 45 минут, и супернатанты аналогично анализировали на уровни цГМФ.

Активность пути GUCY2c оценивали в клетках T84 посредством измерения продукции цГМФ. Хотя агонист пути GUCY2c бактериальный энтеротоксин STp повышал цГМФ дозозависимым образом, продукция цГМФ не повышалась при добавлении увеличивающихся концентраций GUCY2C-1608. Кроме того, GUCY2C-1608 не влияло на продукцию цГМФ, индуцируемую 0,2 мкМ STp (фигура 16). Эти результаты свидетельствуют о том, что GUCY2C-1608 не является агонистом пути GUCY2c и не нейтрализует функцию пути GUCY2c в присутствии лиганда.

Пример 22: ELISA полиспецифичности в отношении ДНК и инсулина

Предполагают, что неспецифическое связывание антител с иными молекулами, чем мишени, является механизмом быстрого клиренса in vivo (Hötzel et al., 2010, MAbs 4(6):753-760). Доказательства такого полиреактивного неспецифического связывания можно получать посредством измерения связывания препаратов мембран (Xu et al., Protein Eng. Des. Select. 26(10):663-70, 2013), бакуловирусных частиц (Hötzel et al., mAbs 4, 753-760, (2012)) или отрицательно заряженных субстратов, таких как ДНК, инсулин и гепарин (Tiller et al., J. Immunol. Methods 329(1-2):112-124, 2008). В ELISA на ДНК и инсулин использовали способ низкой строгости, исходно разработанный для детекции низкоаффинных аутоантител от пациентов с системной красной волчанкой (Tiller et al., J. Immunol. Methods 329, 112, 2008; патент США № 7314622).

384-луночные планшеты для ELISA (Nunc Maxisorp) покрывали в течение ночи при 4°C ДНК (10 мкг/мл) и инсулином (5 мкг/мл) в PBS, pH 7,5. ELISA, адаптированный из анализов, описанных в Tiller et al., J. Immunol. Methods 329, 112, 2008; патенте США № 7314622, осуществляли с помощью автоматизированного устройства для манипуляций с жидкостями PerkinElmer Janus. Лунки промывали водой, блокировали 50 мкл буфера ELISA на полиреактивность (PEB; PBS, содержащий 0,5% Tween-20, 1 мМ ЭДТА) в течение 1 часа при комнатной температуре и три раза промывали водой. Серийно разведенные mAb в 25 мкл добавляли в лунки в четырех параллелях и инкубировали в течение 1 ч. при комнатной температуре. Планшеты 3 раза промывали водой и в каждую лунку добавляли 25 мкл 10 нг/мл антитела козы против IgG человека (Fcγ-фрагмент-специфического), конъюгированного с пероксидазой хрена (Jackson ImmunoResearch). Планшеты инкубировали в течение 1 ч. при комнатной температуре, 3 раза промывали 80 мкл воды и в каждую лунку добавляли 25 мкл субстрата TMB (Sigma Aldrich). Реакции останавливали через 6 минут 50 секунд посредством добавления 25 мкл 0,18 M ортофосфорной кислоты в каждую лунку и считывали поглощение при 450 нм. Баллы связывания с ДНК и инсулином вычисляли как соотношение сигнала ELISA антитела в количестве 10 мкг/мл и сигнала в лунке, содержащей буфер. В таблице 34 показан анализ полиспецифичности биспецифических антител против CD3-GUCY2c с использованием ELISA связывания ДНК и инсулина. Оптимизированные биспецифические антитела демонстрировали низкий потенциал неспецифического связывания.

Таблица 34

Клон Баллы полиреактивности в отношении ДНК Баллы полиреактивности в отношении инсулина GUCY2C-0405 3 1 GUCY2C-0486 2 1 GUCY2C-1186 13 7 GUCY2C-1467 6 7 GUCY2C-1476 7 7 GUCY2C-1478 5 7 GUCY2C-1481 4 5 GUCY2C-1518 6 3 GUCY2C-1526 6 4 GUCY2C-1538 13 7 GUCY2C-1554 3 2 GUCY2C-1555 4 2 GUCY2C-1556 3 1 GUCY2C-1557 5 3 GUCY2C-1590 2 1 GUCY2C-1591 3 2 GUCY2C-1592 4 2 GUCY2C-1606 2 1 GUCY2C-1608 3 2

Пример 23: Спектроскопический анализ самовзаимодействия наночастиц с аффинным захватом (AC-SINS)

Антитело и антитело-подобные белки обладают потенциалом к взаимодействию с самими собой, особенно при повышенных концентрациях. Это самовзаимодействие может приводить к проблемам с вязкостью, ассоциированными с составом, во время разработки лекарственных средств, а также повышенному риску клиренса (Avery et al., mAbs, 2018, Vol. 0, N0. 0, 1-12). С помощью спектроскопического анализа самовзаимодействия наночастиц с аффинным захватом измеряют самовзаимодействие, и его используют для облегчения прогнозирования высокой вязкости и потенциально плохих фармакокинетических свойств.

Анализ AC-SINS стандартизировали в 384-луночном формате с помощью автоматизированного устройства для манипуляций с жидкостями Perkin-Elmer Janus. 20 нм наночастиц золота (Ted Pella, Inc., #15705) покрывали смесью 80% антитела козы против Fc человека (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. # 109-005-098) и 20% неспецифических поликлональных антител козы (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. # 005-000-003), подвергнутых замене буфера на 20 мМ ацетат натрия, pH 4,3, и разводили до 0,4 мг/мл. После инкубации в течение одного часа при комнатной температуре незанятые участки на наночастицах золота блокировали тиолированным полиэтиленгликолем (2 кДа). Затем покрытые наночастицы концентрировали в 10 раз с использованием шприцевого фильтра и добавляли 10 мкл к 100 мкл mAb при 0,05 мг/мл в PBS, pH 7,2. Покрытые наночастицы инкубировали с интересующим антителом в течение 2 ч. в 96-луночном полипропиленовом планшете, а затем переносили в 384-луночный полистироловый планшет и считывали с помощью спектрофотометра Tecan M1000. Поглощение считывали при 450-650 с приращениями 2 нм, и для идентификации максимального поглощения, сглаживания данных и аппроксимации данных с использованием полинома второго порядка использовали Microsoft Excel macro. Сглаженное максимальное поглощение средней пустой пробы (только буфер PBS) вычитали из сглаженного максимального поглощения образца антитела для определения баллов AC-SINS антитела. В таблице 35 приведен анализ неспецифичности AC-SINS для оптимизированных биспецифических антител против CD3-GUCY2c, показавший низкий потенциал самовзаимодействия и неспецифичности.

Таблица 35

Клон AC-SINS GUCY2C-0405 4 GUCY2C-0486 7 GUCY2C-1186 2 GUCY2C-1467 2 GUCY2C-1476 2 GUCY2C-1478 2 GUCY2C-1481 2 GUCY2C-1518 1 GUCY2C-1526 2 GUCY2C-1538 2 GUCY2C-1554 1 GUCY2C-1555 1 GUCY2C-1556 0 GUCY2C-1557 1 GUCY2C-1590 0 GUCY2C-1591 1 GUCY2C-1592 1 GUCY2C-1608 1

Пример 24: Получение стабильной линии клеток, экспрессия и очистка биспецифического антитела GUCY2c-1608

Две цепи, кодирующие биспецифическое антитело GUCY2C-1608, клонировали в экспрессирующий вектор млекопитающего pRY19-GA-Q, содержащий двойной промотор и участок рекомбинации для интеграции по одному участку (SSI) (Zhang, L. et al. Biotechnology Progress., 31: 1645-1656, 2015) в геном клетки CHO. SSI основана на инсерции интересующего гена с использованием основанной на рекомбиназе замене кассеты в хромосомном участке, известном высокой стабильной экспрессией генов. Конструкции GUCY2C-1608-впадина и GUCY2C-1608-выступ клонировали в экспрессирующий вектор в кассете один и два, соответственно. С помощью полученной плазмиды GUCY2C-1608 трансфицировали 10E9 клеток CHO-K1 SV посредством электропорации с использованием вектора pRY19, содержащего интересующий ген, с последующим положительным и отрицательным селекционным давлением с использованием гигромицина-B и ганцикловира. Эти популяции CHO подвергали 3-недельной фазе восстановления. Когда наблюдаемая жизнеспособность превышала 90%, получали банки клеток для последующего использования. Затем полученные популяции CHO подвергали 12-дневной экспрессии на платформе для культивирования с подпиткой в средах CD-CHO (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA). В конце 12-дневного периода клетки центрифугировали при 3000×g в течение 10 минут с последующей стерильной фильтрацией кондиционированных сред с использованием фильтра-пробки для бутыли PES 0,2 мкм (Corning, Oneonta, NY). Кроме того, стабильные популяции CHO масштабировали для контролируемого качающегося биореактора объемом 10 л (Finesse, Santa Clara, CA). Популяции CHO выращивали в собственных средах Pfizer в рамках 12-дневного культивирования с подпиткой, включавшего химически определенную подпитку для поддержания жизнеспособности культуры. После завершения культуру подвергали глубинной фильтрации с использованием фильтровального тракта, состоящего из фильтра 20" 5 мкм Pall Profile II с последующим фильтром 10" 0,2 мкм Pall Supor (Pall Corporation, Port Washington, NY). Титры оценивали с использованием аффинной хроматографии с протеином A. Затем осуществляли очистку белка способами, известными в этой области, включая хроматографию с протеином A, хроматографию гидрофобных взаимодействий и ионообменную хроматографию. Титр экспрессии белка GUCY2C-1608 из стабильно трансфицированной популяции клеток CHO приведен в таблице 36. Титры экспрессии для популяций клона GUCY2C-1608 свидетельствовали об уровнях экспрессии от 0,48 до 0,84 г/литр.

Таблица 36

Популяция клонов Экспрессия (г/л) Популяция A 0,842 Популяция B 0,710 Популяция C 0,480

Пример 25: Масс-спектрометрический анализ биспецифического антитела GUCY2C-1608

Анализ LC/MS осуществляли для подтверждения образования правильного спаренного очищенного биспецифического антитела GUCY2C-1608. Молекулярные массы биспецифической молекулы определяют по ее уникальным аминокислотным последовательностям, и при определении точной молекулярной массы получают доказательства наличия правильно спаренных биспецифических молекул против GUCY2c. В кратком изложении, образец биспецифического антитела против CD3-GUCY2c анализировали посредством анализа LC/MS с помощью устройства для ВЭЖХ Waters Acquity H-класса, сопряженного с масс-спектрометром Bruker maXis II Q-ToF. Аналиты нагружали на колонку SMT SAM C2 (2,1 мм × 100 мм, поддерживаемую при 80°C) и элюировали с использованием третичного градиента буфера B (80% 1-пропанола, 20% ацетонитрила с 0,05% трифторуксусной кислоты) и буфера C (100% ацетонитрила с 0,05% трифторуксусной кислоты) при скорости потока 300 мкл/мин (5 мин линейного повышения до 19% B и 4% C, 20 мин линейного повышения до 22% B и 16% C, 10 мин линейного повышения до 0% B и 98% C). Масс-спектрометрическую детекцию осуществляли в позитивном режиме с капиллярным напряжением 3,5 кВ. Анализ данных осуществляли с помощью деконволюции MaxEnt 1 в программе Compass DataAnalysis v4.2. На фигуре 17 показана высокая чистота при прогнозируемой молекулярной массе конечного очищенного биспецифического антитела GUCY2C-1608.

Пример 26: Последовательности

В таблицах 37A и 37B приведено обобщение SEQ ID NO антител или фрагментов антител, представленных в настоящем описании. В таблице 37A используют систему нумерации ABM для последовательностей CDR1 VH. В таблице 37A используют систему нумерации Kabat для всех других последовательностей, включая CDR2 VH.

Таблица 37A

Последовательность CDR_H1 CDR_H2 CDR_H3 CDR_L1 CDR_L2 CDR_L3 FV_H FV_L FW_H1 FW_H2 FW_H3 FW_H4 FW_L1 FW_L2 FW_L3 FW_L4 Линкер 1 Линкер 2 CD3-0001 2 3 4 77 78 79 1 76 5 6 7 8 80 81 82 83 NA NA CD3-0004 2 3 4 85 78 79 1 84 5 6 7 8 86 87 88 89 н/о н/о CD3-0006 2 10 4 91 78 79 9 90 5 6 7 8 80 81 82 83 н/о н/о GUCY2C-0074 12 13 14 93 94 95 11 92 15 16 17 18 96 97 98 99 190 н/о GUCY2C-0077 20 21 22 101 102 95 19 100 23 24 25 18 96 97 103 99 190 н/о GUCY2C-0078 20 21 22 105 102 95 19 104 23 24 25 18 96 97 103 99 190 н/о GUCY2C-0098 27 28 29 107 108 109 26 106 30 16 31 32 96 110 111 99 190 н/о GUCY2C-0104 34 35 36 113 114 115 33 112 37 38 39 40 116 110 117 118 190 н/о GUCY2C-0105 42 43 44 120 78 121 41 119 45 46 47 32 122 123 124 99 190 н/о GUCY2C-0240 12 13 14 93 94 95 48 125 5 49 50 51 126 127 82 128 190 н/о GUCY2C-0315 12 53 14 93 94 95 52 129 54 55 56 51 130 131 132 133 н/о н/о GUCY2C-0179 42 43 44 120 78 121 57 134 5 49 58 59 80 135 82 83 н/о н/о GUCY2C-0193 27 28 29 107 108 109 60 136 5 49 61 51 80 81 82 128 н/о н/о GUCY2C-0210 27 28 29 107 108 109 62 137 5 63 7 51 126 81 82 128 н/о н/о GUCY2C-0212 27 28 29 107 108 109 64 137 5 49 7 51 126 81 82 128 н/о н/о GUCY2C-0241 27 28 29 107 108 109 60 137 5 49 61 51 126 81 82 128 н/о н/о GUCY2C-0247 27 28 29 107 108 109 60 138 5 49 61 51 126 139 82 128 190 н/о GUCY2C-1186 27 66 29 107 141 142 65 140 5 49 61 51 126 81 82 128 190 н/о GUCY2C-1467 27 28 29 107 144 109 60 143 5 49 61 51 126 81 82 128 190 н/о GUCY2C-1476 27 68 29 107 146 142 67 145 5 49 61 51 126 81 82 128 190 н/о GUCY2C-1478 27 70 29 148 149 142 69 147 5 49 61 51 126 81 82 128 190 191 GUCY2C-1481 27 70 29 107 151 142 69 150 5 49 61 51 126 81 82 128 190 н/о GUCY2C-1512 27 72 29 153 141 154 71 152 5 49 61 51 126 81 82 155 190 н/о GUCY2C-1518 27 70 29 153 157 142 69 156 5 49 61 51 126 81 82 128 190 н/о GUCY2C-1526 27 68 29 153 159 142 67 158 5 49 61 51 126 81 82 128 190 н/о GUCY2C-1527 27 70 29 107 161 154 69 160 5 49 61 51 126 81 82 128 190 н/о GUCY2C-1538 27 68 29 163 164 165 67 162 5 49 61 51 126 81 82 128 190 н/о GUCY2C-1554 74 75 29 167 168 169 73 166 5 49 61 51 80 81 82 128 190 н/о GUCY2C-1555 74 75 29 167 149 169 73 170 5 49 61 51 80 81 82 128 190 н/о GUCY2C-1556 74 75 29 167 168 142 73 171 5 49 61 51 80 81 82 128 190 н/о GUCY2C-1557 74 75 29 167 149 142 73 172 5 49 61 51 80 81 82 128 190 н/о GUCY2C-1590 74 75 29 148 168 169 73 173 5 49 61 51 126 81 82 128 190 н/о GUCY2C-1591 74 75 29 148 149 169 73 174 5 49 61 51 126 81 82 128 190 н/о GUCY2C-1592 74 75 29 148 168 142 73 175 5 49 61 51 126 81 82 128 190 н/о GUCY2C-1602 74 75 29 148 149 142 73 147 5 49 61 51 126 81 82 128 190 191 huIGHV3-7 177 178 179 н/о н/о н/о 176 н/о 5 6 7 н/о н/о н/о н/о н/о н/о н/о huIGKV1-39 н/о н/о н/о 181 182 183 н/о 180 н/о н/о н/о н/о 80 81 82 н/о н/о н/о GUCY2C-0405 27 70 29 148 149 142 69 147 5 49 61 51 126 81 82 128 н/о н/о GUCY2C-0486 27 70 29 148 149 142 69 147 5 49 61 51 126 81 82 128 н/о н/о GUCY2C-1640 74 75 29 148 149 142 73 147 5 49 61 51 126 81 82 128 н/о н/о GUCY2C-0250 27 28 29 107 108 109 60 137 5 49 61 51 126 81 82 128 190 н/о

Таблица 37B

Последовательность Линкер 3 Линкер 4 Линкер 5 Линкер 6 CL1 IgG1 человека CH1 IgG1 человека Шарнирная область IgG1 человека Fc IgG1 человека (CH2-CH3) CH против CD3 VL против CD3 Fc-цепь с выступом Fc-цепь с впадиной Легкая цепь IgG Тяжелая цепь IgG VL с выступом VH с впадиной Полная последовательность Нуклеотиды первой полипептидной цепи Нуклеотиды второй полипептидной цепи CD3-0001 н/о н/о н/о н/о н/о н/о н/о н/о 1 76 н/о н/о н/о н/о н/о н/о н/о н/о н/о CD3-0004 н/о н/о н/о н/о н/о н/о н/о н/о 1 84 н/о н/о н/о н/о н/о н/о н/о н/о н/о CD3-0006 н/о н/о н/о н/о н/о н/о н/о н/о 9 90 н/о н/о н/о н/о н/о н/о н/о н/о н/о GUCY2C-0074 192 н/о н/о н/о н/о н/о н/о н/о 1 84 188 189 н/о н/о 196 197 198 н/о н/о GUCY2C-0077 192 н/о н/о н/о н/о н/о н/о н/о 1 84 188 189 н/о н/о н/о н/о н/о н/о н/о GUCY2C-0078 192 н/о н/о н/о н/о н/о н/о н/о 1 84 188 189 н/о н/о н/о н/о н/о н/о н/о GUCY2C-0098 192 н/о н/о н/о н/о н/о н/о н/о 1 84 188 189 н/о н/о 199 200 201 н/о н/о GUCY2C-0104 192 н/о н/о н/о н/о н/о н/о н/о 1 84 188 189 н/о н/о н/о н/о н/о н/о н/о GUCY2C-0105 192 н/о н/о н/о н/о н/о н/о н/о 1 84 188 189 н/о н/о 202 203 204 н/о н/о GUCY2C-0240 192 н/о н/о н/о н/о н/о н/о н/о 1 84 188 189 н/о н/о 205 206 207 н/о н/о GUCY2C-0315 н/о н/о н/о н/о 184 185 186 187 н/о н/о н/о н/о 214 223 н/о н/о н/о н/о н/о GUCY2C-0179 н/о н/о н/о н/о 184 185 186 187 н/о н/о н/о н/о 214 223 н/о н/о н/о н/о н/о GUCY2C-0193 н/о н/о н/о н/о 184 185 186 187 н/о н/о н/о н/о 214 223 н/о н/о н/о н/о н/о GUCY2C-0210 н/о н/о н/о н/о 184 185 186 187 н/о н/о н/о н/о 214 223 н/о н/о н/о н/о н/о GUCY2C-0212 н/о н/о н/о н/о 184 185 186 187 н/о н/о н/о н/о 214 223 н/о н/о н/о н/о н/о GUCY2C-0241 н/о н/о н/о н/о 184 185 186 187 н/о н/о н/о н/о 208 209 н/о н/о н/о н/о н/о GUCY2C-0247 192 н/о н/о н/о н/о н/о н/о н/о 1 84 188 189 н/о н/о 210 211 212 н/о н/о GUCY2C-1186 192 н/о н/о н/о н/о н/о н/о н/о 1 84 188 189 н/о н/о н/о н/о н/о н/о н/о GUCY2C-1467 192 н/о н/о н/о н/о н/о н/о н/о 1 84 188 189 н/о н/о н/о н/о н/о н/о н/о GUCY2C-1476 192 н/о н/о н/о н/о н/о н/о н/о 1 84 188 189 н/о н/о н/о н/о н/о н/о н/о GUCY2C-1478 192 н/о н/о н/о н/о н/о н/о н/о 9 90 188 189 н/о н/о 216 217 218 н/о н/о GUCY2C-1481 192 н/о н/о н/о н/о н/о н/о н/о 1 84 188 189 н/о н/о н/о н/о н/о н/о н/о GUCY2C-1512 192 н/о н/о н/о н/о н/о н/о н/о 1 84 188 189 н/о н/о н/о н/о н/о н/о н/о GUCY2C-1518 192 н/о н/о н/о н/о н/о н/о н/о 1 84 188 189 н/о н/о н/о н/о н/о н/о н/о GUCY2C-1526 192 н/о н/о н/о н/о н/о н/о н/о 1 84 188 189 н/о н/о н/о н/о н/о н/о н/о GUCY2C-1527 192 н/о н/о н/о н/о н/о н/о н/о 1 84 188 189 н/о н/о н/о н/о н/о н/о н/о GUCY2C-1538 192 н/о н/о н/о н/о н/о н/о н/о 1 84 188 189 н/о н/о н/о н/о н/о н/о н/о GUCY2C-1554 192 н/о н/о н/о н/о н/о н/о н/о 1 84 188 189 н/о н/о н/о н/о н/о н/о н/о GUCY2C-1555 192 н/о н/о н/о н/о н/о н/о н/о 1 84 188 189 н/о н/о н/о н/о н/о н/о н/о GUCY2C-1556 192 н/о н/о н/о н/о н/о н/о н/о 1 84 188 189 н/о н/о н/о н/о н/о н/о н/о GUCY2C-1557 192 н/о н/о н/о н/о н/о н/о н/о 1 84 188 189 н/о н/о н/о н/о н/о н/о н/о GUCY2C-1590 192 н/о н/о н/о н/о н/о н/о н/о 1 84 188 189 н/о н/о н/о н/о н/о н/о н/о GUCY2C-1591 192 н/о н/о н/о н/о н/о н/о н/о 1 84 188 189 н/о н/о н/о н/о н/о н/о н/о GUCY2C-1592 192 н/о н/о н/о н/о н/о н/о н/о 1 84 188 189 н/о н/о н/о н/о н/о н/о н/о GUCY2C-1608 192 н/о н/о н/о н/о н/о н/о н/о 9 90 188 189 н/о н/о 216 220 221 246 247 hulGHV3-7 н/о н/о н/о н/о н/о н/о н/о н/о н/о н/о н/о н/о н/о н/о н/о н/о н/о н/о н/о hulGKV1-39 н/о н/о н/о н/о н/о н/о н/о н/о н/о н/о н/о н/о н/о н/о н/о н/о н/о н/о н/о GUCY2C-0405 н/о 193 194 195 н/о н/о н/о 187 н/о н/о н/о н/о н/о н/о н/о н/о 213 н/о н/о GUCY2C-0486 н/о н/о н/о н/о 184 185 186 187 н/о н/о н/о н/о 214 215 н/о н/о н/о н/о н/о GUCY2C-1640 н/о н/о н/о н/о 184 185 186 187 н/о н/о н/о н/о 214 223 н/о н/о н/о н/о н/о GUCY2C-0250 н/о н/о н/о н/о н/о н/о н/о н/о 1 76 188 189 н/о н/о 248 249 250 н/о н/о

В таблице 38 приведены последовательности, представленные в настоящем описании.

Таблица 38

SEQ ID NO: Описание Последовательность 1 CD3-0001_VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMTWVRQAPGKGLEWVAFIRNRARGYTSDHNPSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRPSYYVLDYWGQGTTVTVSS 2 CD3-0001_VH,
2B5-1038 VH,
2B5-1039 VH,
2B5-1040 VH,
CDR1 (расширенный/ABM) GFTFSDYYMT 3 CD3-0001_CDR2 VH FIRNRARGYTSDHNPSVKG 4 CD3-0001_VH,
2B5-1038 VH,
2B5-1039 VH,
2B5-1040 VH,
CDR3 DRPSYYVLDY 5 CD3-0001_VH FW_H1 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS 6 CD3-0001_VH FW_H2 WVRQAPGKGLEWVA 7 CD3-0001_VH FW_H3 RFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR 8 CD3-0001_VH FW_H4 WGQGTTVTVSS 9 CD3-0006_VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMTWVRQAPGKGLEWVAFIRNQARGYTSDHNPSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRPSYYVLDYWGQGTTVTVSS 10 CD3-0006_VH,
2B5-1038 VH,
2B5-1039 VH,
2B5-1040 VH,
CDR2 (Kabat) FIRNQARGYTSDHNPSVKG 11 GUCY2C-0074_VH EVQLQQSGAELARPGASVNLSCKASGYTFTTYWMQWVKQRPGQGLEWIGAIYPGDGMTTYTQKFKDKATLTADKSSSTAYMQLSSLASEDSAVYYCVRKGMDYWGQGTSVTVSS 12 GUCY2C-0074_CDR1 VH GYTFTTYWMQ 13 GUCY2C-0074_CDR2 VH AIYPGDGMTTYTQKFKD 14 GUCY2C-0074_CDR3 VH KGMDY 15 GUCY2C-0074_VH FW_H1 EVQLQQSGAELARPGASVNLSCKAS 16 GUCY2C-0074_VH FW_H2 WVKQRPGQGLEWIG 17 GUCY2C-0074_VH FW_H3 KATLTADKSSSTAYMQLSSLASEDSAVYYCVR 18 GUCY2C-0074_VH FW_H4 WGQGTSVTVSS 19 GUCY2C-0077_VH EVQLQQSGAELARPGASVKLSCKASGYTFTKYWMQWIKQRPGQGLEWIGAIYPGDGFTTYTQKFKGKATLTADKSSNTAYMQLSSLASEDSAVYYCARRNYGRTYGGDYWGQGTSVTVSS 20 GUCY2C-0077_CDR1 VH GYTFTKYWMQ 21 GUCY2C-0077_CDR2 VH AIYPGDGFTTYTQKFKG 22 GUCY2C-0077_CDR3 VH RNYGRTYGGDY 23 GUCY2C-0077_VH FW_H1 EVQLQQSGAELARPGASVKLSCKAS 24 GUCY2C-0077_VH FW_H2 WIKQRPGQGLEWIG 25 GUCY2C-0077_VH FW_H3 KATLTADKSSNTAYMQLSSLASEDSAVYYCAR 26 GUCY2C-0098_VH QVQLQQPGAELVKPGASVKLSCKASGYTFTSYWMHWVKQRPGQGLEWIGEIKPSNGLTNYIEKFKNKATLTVDKSATTAYMQLSSLTAEDSAVYYCTRTITTTEGYWFFDVWGAGTTVTVSS 27 GUCY2C-0098_CDR1 VH GYTFTSYWMH 28 GUCY2C-0098_CDR2 VH EIKPSNGLTNYIEKFKN 29 GUCY2C-0098_CDR3 VH TITTTEGYWFFDV 30 GUCY2C-0098_VH FW_H1 QVQLQQPGAELVKPGASVKLSCKAS 31 GUCY2C-0098_VH FW_H3 KATLTVDKSATTAYMQLSSLTAEDSAVYYCTR 32 GUCY2C-0098_VH FW_H4 WGAGTTVTVSS 33 GUCY2C-0104_VH EVQLQQSGAELVKPGASVKLSCTASGFNIKDTYIHWVKQRPEQGLEWIGRIDPANGNANYDPKFQGKATITADTSSNTAYLQLSSLTSEDTAVFYCSSLGTGTYWGQGTTLTVSS 34 GUCY2C-0104_CDR1 VH GFNIKDTYIH 35 GUCY2C-0104_CDR2 VH RIDPANGNANYDPKFQG 36 GUCY2C-0104_CDR3 VH LGTGTY 37 GUCY2C-0104_VH FW_H1 EVQLQQSGAELVKPGASVKLSCTAS 38 GUCY2C-0104_VH FW_H2 WVKQRPEQGLEWIG 39 GUCY2C-0104_VH FW_H3 KATITADTSSNTAYLQLSSLTSEDTAVFYCSS 40 GUCY2C-0104_VH FW_H4 WGQGTTLTVSS 41 GUCY2C-0105_VH EVQLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYSFTDYIMLWVKQSHGKSLEWIGNSNPYYGSTSYNLKFKGKATLTVDKSSSTAYMHLNSLTSEDSAVYYCARSGYYGSSPYWYFDVWGAGTTVTVSS 42 GUCY2C-0105_CDR1 VH GYSFTDYIML 43 GUCY2C-0105_CDR2 VH NSNPYYGSTSYNLKFKG 44 GUCY2C-0105_CDR3 VH SGYYGSSPYWYFDV 45 GUCY2C-0105_VH FW_H1 EVQLQQSGPELVKPGASVKISCKAS 46 GUCY2C-0105_VH FW_H2 WVKQSHGKSLEWIG 47 GUCY2C-0105_VH FW_H3 KATLTVDKSSSTAYMHLNSLTSEDSAVYYCAR 48 GUCY2C-0240_VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTTYWMQWVRQAPGKGLEWIGAIYPGDGMTTYTQKFKDRFTISADKAKNSAYLQMNSLRAEDTAVYYCVRKGMDYWGQGTLVTVSS 49 GUCY2C-0240_VH FW_H2 WVRQAPGKGLEWIG 50 GUCY2C-0240_VH FW_H3 RFTISADKAKNSAYLQMNSLRAEDTAVYYCVR 51 GUCY2C-0240_VH FW_H4 WGQGTLVTVSS 52 GUCY2C-0315_VH QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTTYWMQWVRQAPGQGLEWIGAIYPGDGMTTYTQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCVRKGMDYWGQGTLVTVSS 53 GUCY2C-0315_CDR2 VH AIYPGDGMTTYTQKFQG 54 GUCY2C-0315_VH FW_H1 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKAS 55 GUCY2C-0315_VH FW_H2 WVRQAPGQGLEWIG 56 GUCY2C-0315_VH FW_H3 RVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCVR 57 GUCY2C-0179_VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYSFTDYIMLWVRQAPGKGLEWIGNSNPYYGSTSYNLKFKGRFTISVDKAKNSAYLQMNSLRAEDTAVYYCARSGYYGSSPYWYFDVWGQGTMVTVSS 58 GUCY2C-0179_VH FW_H3 RFTISVDKAKNSAYLQMNSLRAEDTAVYYCAR 59 GUCY2C-0179_VH FW_H4 WGQGTMVTVSS 60 GUCY2C-0193_VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYWMHWVRQAPGKGLEWIGEIKPSNGLTNYIEKFKNRFTISVDKAKNSAYLQMNSLRAEDTAVYYCTRTITTTEGYWFFDVWGQGTLVTVSS 61 GUCY2C-0193_VH FW_H3 RFTISVDKAKNSAYLQMNSLRAEDTAVYYCTR 62 GUCY2C-0210_VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYWMHWVRQAPGKGLEWIAEIKPSNGLTNYIEKFKNRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARTITTTEGYWFFDVWGQGTLVTVSS 63 GUCY2C-0210_VH FW_H2 WVRQAPGKGLEWIA 64 GUCY2C-0212_VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYWMHWVRQAPGKGLEWIGEIKPSNGLTNYIEKFKNRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARTITTTEGYWFFDVWGQGTLVTVSS 65 GUCY2C-1186_VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYWMHWVRQAPGKGLEWIGEIKPSNGLTNIHPKFKNRFTISVDKAKNSAYLQMNSLRAEDTAVYYCTRTITTTEGYWFFDVWGQGTLVTVSS 66 GUCY2C-1186_CDR2 VH EIKPSNGLTNIHPKFKN 67 GUCY2C-1476_VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYWMHWVRQAPGKGLEWIGEIKPSNGLTNYNEKFKNRFTISVDKAKNSAYLQMNSLRAEDTAVYYCTRTITTTEGYWFFDVWGQGTLVTVSS 68 GUCY2C-1476_CDR2 VH EIKPSNGLTNYNEKFKN 69 GUCY2C-1478_VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYWMHWVRQAPGKGLEWIGEIKPSNGLTNVHEKFKNRFTISVDKAKNSAYLQMNSLRAEDTAVYYCTRTITTTEGYWFFDVWGQGTLVTVSS 70 GUCY2C-1478_CDR2 VH EIKPSNGLTNVHEKFKN 71 GUCY2C-1512_VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYWMHWVRQAPGKGLEWIGEIKPSNGLTNYAEQFKNRFTISVDKAKNSAYLQMNSLRAEDTAVYYCTRTITTTEGYWFFDVWGQGTLVTVSS 72 GUCY2C-1512_CDR2 VH EIKPSNGLTNYAEQFKN 73 GUCY2C-1554_VH;
GUCY2C-1608_VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMHWVRQAPGKGLEWIGEIKPSNELTNVHEKFKDRFTISVDKAKNSAYLQMNSLRAEDTAVYYCTRTITTTEGYWFFDVWGQGTLVTVSS 74 GUCY2C-1554_CDR1 VH GFTFSSYWMH 75 GUCY2C-1554_CDR2 VH EIKPSNELTNVHEKFKD 76 CD3-0001_VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCTSSQSLFNVRSRKNYLAWYQQKPGKAPKLLIYWASTRESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCKQSYDLFTFGGGTKVEIK 77 CD3-0001_CDR1 VL TSSQSLFNVRSRKNYLA 78 CD3-0001_CDR2 VL WASTRES 79 CD3-0001_CDR3 VL KQSYDLFT 80 CD3-0001_VL FW_L1 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC 81 CD3-0001_VL FW_L2 WYQQKPGKAPKLLIY 82 CD3-0001_VL FW_L3 GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC 83 CD3-0001_VL FW_L4 FGGGTKVEIK 84 CD3-0004_VL DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLFNVRSRKNYLAWYQQKPGQPPKLLISWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCKQSYDLFTFGSGTKLEIK 85 CD3-0004_CDR1 VL KSSQSLFNVRSRKNYLA 86 CD3-0004_VL FW_L1 DIVMTQSPDSLAVSLGERATINC 87 CD3-0004_VL FW_L2 WYQQKPGQPPKLLIS 88 CD3-0004_VL FW_L3 GVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYC 89 CD3-0004_VL FW_L4 FGSGTKLEIK 90 CD3-0006_VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCTSSQSLFNVRSQKNYLAWYQQKPGKAPKLLIYWASTRESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCKQSYDLFTFGGGTKVEIK 91 CD3-0006_CDR1 VL TSSQSLFNVRSQKNYLA 92 GUCY2C-0074_VL DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVDNYGISFMNWFQQKPGQPPKLLIYAASNPGSGVPARFSGSGSGTDFSLNIHPLEEDDTAMFFCQQSKEVPYTFGGGTKLEIK 93 GUCY2C-0074_CDR1 VL RASESVDNYGISFMN 94 GUCY2C-0074_CDR2 VL AASNPGS 95 GUCY2C-0074_CDR3 VL QQSKEVPYT 96 GUCY2C-0074_VL FW_L1 DIVLTQSPASLAVSLGQRATISC 97 GUCY2C-0074_VL FW_L2 WFQQKPGQPPKLLIY 98 GUCY2C-0074_VL FW_L3 GVPARFSGSGSGTDFSLNIHPLEEDDTAMFFC 99 GUCY2C-0074_VL FW_L4 FGGGTKLEIK 100 GUCY2C-0077_VL DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVDNFDISFMNWFQQKPGQPPKLLIYAASNQGSGVPARFSGSGSGTDFSLNIHPMEEDDTAMYFCQQSKEVPYTFGGGTKLEIK 101 GUCY2C-0077_CDR1 VL RASESVDNFDISFMN 102 GUCY2C-0077_CDR2 VL AASNQGS 103 GUCY2C-0077_VL FW_L3 GVPARFSGSGSGTDFSLNIHPMEEDDTAMYFC 104 GUCY2C-0078_VL DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRAGESVDNFDISFMNWFQQKPGQPPKLLIYAASNQGSGVPARFSGSGSGTDFSLNIHPMEEDDTAMYFCQQSKEVPYTFGGGTKLEIK 105 GUCY2C-0078_CDR1 VL RAGESVDNFDISFMN 106 GUCY2C-0098_VL DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVDYYGTSLMQWYQQKPGQPPKLLIYAASNVESGVPARFSGSGSGTDFSLNIHPVEEDDIAMYFCQQTRKVYTFGGGTKLEIK 107 GUCY2C-0098_CDR1 VL RASESVDYYGTSLMQ 108 GUCY2C-0098_CDR2 VL AASNVES 109 GUCY2C-0098_CDR3 VL QQTRKVYT 110 GUCY2C-0098_VL FW_L2 WYQQKPGQPPKLLIY 111 GUCY2C-0098_VL FW_L3 GVPARFSGSGSGTDFSLNIHPVEEDDIAMYFC 112 GUCY2C-0104_VL DIVMTQSPASLAVSLGQRATISCRASKGVTTSGYSYMHWYQQKPGQPPKLLIYLASNLESGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQHSREFPLTFGAGTKLELK 113 GUCY2C-0104_CDR1 VL RASKGVTTSGYSYMH 114 GUCY2C-0104_CDR2 VL LASNLES 115 GUCY2C-0104_CDR3 VL QHSREFPLT 116 GUCY2C-0104_VL FW_L1 DIVMTQSPASLAVSLGQRATISC 117 GUCY2C-0104_VL FW_L3 GVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYC 118 GUCY2C-0104_VL FW_L4 FGAGTKLELK 119 GUCY2C-0105_VL DIVMTQSPSSLAVSVGEKVTVSCKSSQSLLYSSNQKNYLAWYQQRPGQSPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLSISSVKAEDLAVYYCQQYYSYPTFGGGTKLEIK 120 GUCY2C-0105_CDR1 VL KSSQSLLYSSNQKNYLA 121 GUCY2C-0105_CDR3 VL QQYYSYPT 122 GUCY2C-0105_VL FW_L1 DIVMTQSPSSLAVSVGEKVTVSC 123 GUCY2C-0105_VL FW_L2 WYQQRPGQSPKLLIY 124 GUCY2C-0105_VL FW_L3 GVPDRFTGSGSGTDFTLSISSVKAEDLAVYYC 125 GUCY2C-0240_VL DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVDNYGISFMNWFQQKPGKAPKLLIYAASNPGSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSKEVPYTFGQGTKLEIK 126 GUCY2C-0240_VL FW_L1 DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITC 127 GUCY2C-0240_VL FW_L2 WFQQKPGKAPKLLIY 128 GUCY2C-0240_VL FW_L4 FGQGTKLEIK 129 GUCY2C-0315_VL EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASESVDNYGISFMNWYQQKPGQAPRLLIYAASNPGSGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQSKEVPYTFGQGTKVEIK 130 GUCY2C-0315_VL FW_L1 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSC 131 GUCY2C-0315_VL FW_L2 WYQQKPGQAPRLLIY 132 GUCY2C-0315_VL FW_L3 GIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYC 133 GUCY2C-0315_VL FW_L4 FGQGTKVEIK 134 GUCY2C-0179_VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKSSQSLLYSSNQKNYLAWYQQKPGKSPKLLIYWASTRESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYSYPTFGGGTKVEIK 135 GUCY2C-0179_VL FW_L2 WYQQKPGKSPKLLIY 136 GUCY2C-0193_VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVDYYGTSLMQWYQQKPGKAPKLLIYAASNVESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTRKVYTFGQGTKLEIK 137 GUCY2C-0210_VL DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVDYYGTSLMQWYQQKPGKAPKLLIYAASNVESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTRKVYTFGQGTKLEIK 138 GUCY2C-0247_VL DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVDYYGTSLMQWYQQKPGKPPKLLIYAASNVESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTRKVYTFGQGTKLEIK 139 GUCY2C-0247_VL FW_L2 WYQQKPGKPPKLLIY 140 GUCY2C-1186_VL DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVDYYGTSLMQWYQQKPGKAPKLLIYAASKRYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTRKAYTFGQGTKLEIK 141 GUCY2C-1186_CDR2 VL AASKRYS 142 GUCY2C-1186_CDR3 VL QQTRKAYT 143 GUCY2C-1467_VL DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVDYYGTSLMQWYQQKPGKAPKLLIYAASKLWSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTRKVYTFGQGTKLEIK 144 GUCY2C-1467_CDR2 VL AASKLWS 145 GUCY2C-1476_VL DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVDYYGTSLMQWYQQKPGKAPKLLIYAASKVAPGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTRKAYTFGQGTKLEIK 146 GUCY2C-1476_CDR2 VL AASKVAP 147 GUCY2C-1478_VL DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVDYYGSSLLQWYQQKPGKAPKLLIYAASKLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTRKAYTFGQGTKLEIK 148 GUCY2C-1478_CDR1 VL RASESVDYYGSSLLQ 149 GUCY2C-1478_CDR2 VL AASKLAS 150 GUCY2C-1481_VL DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVDYYGTSLMQWYQQKPGKAPKLLIYAASNIAPGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTRKAYTFGQGTKLEIK 151 GUCY2C-1481_CDR2 VL AASNIAP 152 GUCY2C-1512_VL DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVDYYGSSLMQWYQQKPGKAPKLLIYAASKRYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTRKEYTFGQGTKLKIK 153 GUCY2C-1512_CDR1 VL RASESVDYYGSSLMQ 154 GUCY2C-1512_CDR3 VL QQTRKEYT 155 GUCY2C-1512_VL FW_L4 FGQGTKLKIK 156 GUCY2C-1518_VL DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVDYYGSSLMQWYQQKPGKAPKLLIYAASNVAPGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTRKAYTFGQGTKLEIK 157 GUCY2C-1518_CDR2 VL AASNVAP 158 GUCY2C-1526_VL DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVDYYGSSLMQWYQQKPGKAPKLLIYAASHRASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTRKAYTFGQGTKLEIK 159 GUCY2C-1526_CDR2 VL AASHRAS 160 GUCY2C-1527_VL DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVDYYGTSLMQWYQQKPGKAPKLLIYAASNVASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTRKEYTFGQGTKLEIK 161 GUCY2C-1527_CDR2 VL AASNVAS 162 GUCY2C-1538_VL DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVDYYGHSLMQWYQQKPGKAPKLLIYAASNRYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTRKAYSFGQGTKLEIK 163 GUCY2C-1538_CDR1 VL RASESVDYYGHSLMQ 164 GUCY2C-1538_CDR2 VL AASNRYS 165 GUCY2C-1538_CDR3 VL QQTRKAYS 166 GUCY2C-1554_VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSVDYYGSSLLQWYQQKPGKAPKLLIYDASKLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQERKAYTFGQGTKLEIK 167 GUCY2C-1554_CDR1 VL RASQSVDYYGSSLLQ 168 GUCY2C-1554_CDR2 VL DASKLAS 169 GUCY2C-1554_CDR3 VL QQERKAYT 170 GUCY2C-1555_VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSVDYYGSSLLQWYQQKPGKAPKLLIYAASKLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQERKAYTFGQGTKLEIK 171 GUCY2C-1556_VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSVDYYGSSLLQWYQQKPGKAPKLLIYDASKLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTRKAYTFGQGTKLEIK 172 GUCY2C-1557_VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSVDYYGSSLLQWYQQKPGKAPKLLIYAASKLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTRKAYTFGQGTKLEIK 173 GUCY2C-1590_VL DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVDYYGSSLLQWYQQKPGKAPKLLIYDASKLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQERKAYTFGQGTKLEIK 174 GUCY2C-1591_VL DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVDYYGSSLLQWYQQKPGKAPKLLIYAASKLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQERKAYTFGQGTKLEIK 175 GUCY2C-1592_VL DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVDYYGSSLLQWYQQKPGKAPKLLIYDASKLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTRKAYTFGQGTKLEIK 176 huIGHV3-7_VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMSWVRQAPGKGLEWVANIKQDGSEKYYVDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARYYYYYGMDV 177 huIGHV3-7_CDR1 VH GFTFSSYWMS 178 huIGHV3-7_CDR2 VH NIKQDGSEKYYVDSVKG 179 huIGHV3-7_CDR3 VH YYYYYGMDV 180 huIGKV1-39_VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPYTFGQGTKLEIK 181 huIGKV1-39_CDR1 VL RASQSISSYLN 182 huIGKV1-39_CDR2 VL AASSLQS 183 huIGKV1-39_CDR3 VL QQSYSTPYT 184 CL IgG1 человека RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 185 CH1 IgG1 человека ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKV 186 Шарнирная область IgG1 человека EPKSCDKTHTCPPCP 187 Fc IgG1-3m человека (CH2-CH3) APEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 188 Fc-цепь с выступом APEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 189 Fc-цепь с впадиной APEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCREEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 190 Линкер 1 GGGSGGGG 191 Линкер 2 GGGGSGGGG 192 Линкер 3 GCPPCP 193 Линкер 4 GGGGSGGGGSGGGGSG 194 Линкер 5 RTSDQ 195 Линкер 6 EPKSSDKTHTCPPCP 196 GUCY2C-0074_выступ DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVDNYGISFMNWFQQKPGQPPKLLIYAASNPGSGVPARFSGSGSGTDFSLNIHPLEEDDTAMFFCQQSKEVPYTFGGGTKLEIKGGGSGGGGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMTWVRQAPGKGLEWVAFIRNRARGYTSDHNPSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRPSYYVLDYWGQGTTVTVSSGCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 197 GUCY2C-0074_впадина DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLFNVRSRKNYLAWYQQKPGQPPKLLISWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCKQSYDLFTFGSGTKLEIKGGGSGGGGEVQLQQSGAELARPGASVNLSCKASGYTFTTYWMQWVKQRPGQGLEWIGAIYPGDGMTTYTQKFKDKATLTADKSSSTAYMQLSSLASEDSAVYYCVRKGMDYWGQGTSVTVSSGCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCREEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 198 GUCY2C-0074_мономер DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVDNYGISFMNWFQQKPGQPPKLLIYAASNPGSGVPARFSGSGSGTDFSLNIHPLEEDDTAMFFCQQSKEVPYTFGGGTKLEIKGGGSGGGGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMTWVRQAPGKGLEWVAFIRNRARGYTSDHNPSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRPSYYVLDYWGQGTTVTVSSGCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGDIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLFNVRSRKNYLAWYQQKPGQPPKLLISWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCKQSYDLFTFGSGTKLEIKGGGSGGGGEVQLQQSGAELARPGASVNLSCKASGYTFTTYWMQWVKQRPGQGLEWIGAIYPGDGMTTYTQKFKDKATLTADKSSSTAYMQLSSLASEDSAVYYCVRKGMDYWGQGTSVTVSSGCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCREEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 199 GUCY2C-0098_выступ DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVDYYGTSLMQWYQQKPGQPPKLLIYAASNVESGVPARFSGSGSGTDFSLNIHPVEEDDIAMYFCQQTRKVYTFGGGTKLEIKGGGSGGGGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMTWVRQAPGKGLEWVAFIRNRARGYTSDHNPSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRPSYYVLDYWGQGTTVTVSSGCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 200 GUCY2C-0098_впадина DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLFNVRSRKNYLAWYQQKPGQPPKLLISWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCKQSYDLFTFGSGTKLEIKGGGSGGGGQVQLQQPGAELVKPGASVKLSCKASGYTFTSYWMHWVKQRPGQGLEWIGEIKPSNGLTNYIEKFKNKATLTVDKSATTAYMQLSSLTAEDSAVYYCTRTITTTEGYWFFDVWGAGTTVTVSSGCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCREEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 201 GUCY2C-0098_мономер DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVDYYGTSLMQWYQQKPGQPPKLLIYAASNVESGVPARFSGSGSGTDFSLNIHPVEEDDIAMYFCQQTRKVYTFGGGTKLEIKGGGSGGGGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMTWVRQAPGKGLEWVAFIRNRARGYTSDHNPSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRPSYYVLDYWGQGTTVTVSSGCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGDIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLFNVRSRKNYLAWYQQKPGQPPKLLISWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCKQSYDLFTFGSGTKLEIKGGGSGGGGQVQLQQPGAELVKPGASVKLSCKASGYTFTSYWMHWVKQRPGQGLEWIGEIKPSNGLTNYIEKFKNKATLTVDKSATTAYMQLSSLTAEDSAVYYCTRTITTTEGYWFFDVWGAGTTVTVSSGCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCREEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 202 GUCY2C-0105_выступ DIVMTQSPSSLAVSVGEKVTVSCKSSQSLLYSSNQKNYLAWYQQRPGQSPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLSISSVKAEDLAVYYCQQYYSYPTFGGGTKLEIKGGGSGGGGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMTWVRQAPGKGLEWVAFIRNRARGYTSDHNPSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRPSYYVLDYWGQGTTVTVSSGCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 203 GUCY2C-0105_впадина DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLFNVRSRKNYLAWYQQKPGQPPKLLISWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCKQSYDLFTFGSGTKLEIKGGGSGGGGEVQLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYSFTDYIMLWVKQSHGKSLEWIGNSNPYYGSTSYNLKFKGKATLTVDKSSSTAYMHLNSLTSEDSAVYYCARSGYYGSSPYWYFDVWGAGTTVTVSSGCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCREEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 204 GUCY2C-0105_мономер DIVMTQSPSSLAVSVGEKVTVSCKSSQSLLYSSNQKNYLAWYQQRPGQSPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLSISSVKAEDLAVYYCQQYYSYPTFGGGTKLEIKGGGSGGGGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMTWVRQAPGKGLEWVAFIRNRARGYTSDHNPSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRPSYYVLDYWGQGTTVTVSSGCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGDIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLFNVRSRKNYLAWYQQKPGQPPKLLISWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCKQSYDLFTFGSGTKLEIKGGGSGGGGEVQLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYSFTDYIMLWVKQSHGKSLEWIGNSNPYYGSTSYNLKFKGKATLTVDKSSSTAYMHLNSLTSEDSAVYYCARSGYYGSSPYWYFDVWGAGTTVTVSSGCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCREEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 205 GUCY2C-0240_выступ DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVDNYGISFMNWFQQKPGKAPKLLIYAASNPGSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSKEVPYTFGQGTKLEIKGGGSGGGGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMTWVRQAPGKGLEWVAFIRNRARGYTSDHNPSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRPSYYVLDYWGQGTTVTVSSGCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 206 GUCY2C-0240_впадина DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLFNVRSRKNYLAWYQQKPGQPPKLLISWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCKQSYDLFTFGSGTKLEIKGGGSGGGGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTTYWMQWVRQAPGKGLEWIGAIYPGDGMTTYTQKFKDRFTISADKAKNSAYLQMNSLRAEDTAVYYCVRKGMDYWGQGTLVTVSSGCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCREEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 207 GUCY2C-0240_мономер DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVDNYGISFMNWFQQKPGKAPKLLIYAASNPGSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSKEVPYTFGQGTKLEIKGGGSGGGGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMTWVRQAPGKGLEWVAFIRNRARGYTSDHNPSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRPSYYVLDYWGQGTTVTVSSGCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGDIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLFNVRSRKNYLAWYQQKPGQPPKLLISWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCKQSYDLFTFGSGTKLEIKGGGSGGGGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTTYWMQWVRQAPGKGLEWIGAIYPGDGMTTYTQKFKDRFTISADKAKNSAYLQMNSLRAEDTAVYYCVRKGMDYWGQGTLVTVSSGCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCREEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 208 GUCY2C-0241_легкая цепь DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVDYYGTSLMQWYQQKPGKAPKLLIYAASNVESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTRKVYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 209 GUCY2C-0241_тяжелая цепь EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYWMHWVRQAPGKGLEWIGEIKPSNGLTNYIEKFKNRFTISVDKAKNSAYLQMNSLRAEDTAVYYCTRTITTTEGYWFFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 210 GUCY2C-0247_выступ DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVDYYGTSLMQWYQQKPGKPPKLLIYAASNVESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTRKVYTFGQGTKLEIKGGGSGGGGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMTWVRQAPGKGLEWVAFIRNRARGYTSDHNPSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRPSYYVLDYWGQGTTVTVSSGCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 211 GUCY2C-0247_впадина DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLFNVRSRKNYLAWYQQKPGQPPKLLISWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCKQSYDLFTFGSGTKLEIKGGGSGGGGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYWMHWVRQAPGKGLEWIGEIKPSNGLTNYIEKFKNRFTISVDKAKNSAYLQMNSLRAEDTAVYYCTRTITTTEGYWFFDVWGQGTLVTVSSGCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCREEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 212 GUCY2C-0247_мономер DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVDYYGTSLMQWYQQKPGKPPKLLIYAASNVESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTRKVYTFGQGTKLEIKGGGSGGGGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMTWVRQAPGKGLEWVAFIRNRARGYTSDHNPSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRPSYYVLDYWGQGTTVTVSSGCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGDIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLFNVRSRKNYLAWYQQKPGQPPKLLISWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCKQSYDLFTFGSGTKLEIKGGGSGGGGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYWMHWVRQAPGKGLEWIGEIKPSNGLTNYIEKFKNRFTISVDKAKNSAYLQMNSLRAEDTAVYYCTRTITTTEGYWFFDVWGQGTLVTVSSGCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCREEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 213 GUCY2C-0405_scFv-Fc EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYWMHWVRQAPGKGLEWIGEIKPSNGLTNVHEKFKNRFTISVDKAKNSAYLQMNSLRAEDTAVYYCTRTITTTEGYWFFDVWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGDIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVDYYGSSLLQWYQQKPGKAPKLLIYAASKLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTRKAYTFGQGTKLEIKRTSDQEPKSSDKTHTCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP 214 GUCY2C-0486_легкая цепь; GUCY2C-1640_легкая цепь DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVDYYGSSLLQWYQQKPGKAPKLLIYAASKLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTRKAYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 215 GUCY2C-0486_тяжелая цепь EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYWMHWVRQAPGKGLEWIGEIKPSNGLTNVHEKFKNRFTISVDKAKNSAYLQMNSLRAEDTAVYYCTRTITTTEGYWFFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 216 GUCY2C-1478_выступ;
GUCY2C-1608_выступ DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVDYYGSSLLQWYQQKPGKAPKLLIYAASKLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTRKAYTFGQGTKLEIKGGGSGGGGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMTWVRQAPGKGLEWVAFIRNQARGYTSDHNPSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRPSYYVLDYWGQGTTVTVSSGCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 217 GUCY2C-1478_впадина DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCTSSQSLFNVRSQKNYLAWYQQKPGKAPKLLIYWASTRESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCKQSYDLFTFGGGTKVEIKGGGGSGGGGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYWMHWVRQAPGKGLEWIGEIKPSNGLTNVHEKFKNRFTISVDKAKNSAYLQMNSLRAEDTAVYYCTRTITTTEGYWFFDVWGQGTLVTVSSGCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCREEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 218 GUCY2C-1478_мономер DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVDYYGSSLLQWYQQKPGKAPKLLIYAASKLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTRKAYTFGQGTKLEIKGGGSGGGGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMTWVRQAPGKGLEWVAFIRNQARGYTSDHNPSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRPSYYVLDYWGQGTTVTVSSGCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCTSSQSLFNVRSQKNYLAWYQQKPGKAPKLLIYWASTRESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCKQSYDLFTFGGGTKVEIKGGGGSGGGGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYWMHWVRQAPGKGLEWIGEIKPSNGLTNVHEKFKNRFTISVDKAKNSAYLQMNSLRAEDTAVYYCTRTITTTEGYWFFDVWGQGTLVTVSSGCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCREEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 219 Верхняя шарнирная область IgG1 человека EPKSCDKTHT 220 GUCY2C-1608_впадина DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCTSSQSLFNVRSQKNYLAWYQQKPGKAPKLLIYWASTRESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCKQSYDLFTFGGGTKVEIKGGGGSGGGGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMHWVRQAPGKGLEWIGEIKPSNELTNVHEKFKDRFTISVDKAKNSAYLQMNSLRAEDTAVYYCTRTITTTEGYWFFDVWGQGTLVTVSSGCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCREEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 221 GUCY2C-1608_мономер DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVDYYGSSLLQWYQQKPGKAPKLLIYAASKLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTRKAYTFGQGTKLEIKGGGSGGGGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMTWVRQAPGKGLEWVAFIRNQARGYTSDHNPSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRPSYYVLDYWGQGTTVTVSSGCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCTSSQSLFNVRSQKNYLAWYQQKPGKAPKLLIYWASTRESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCKQSYDLFTFGGGTKVEIKGGGGSGGGGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMHWVRQAPGKGLEWIGEIKPSNELTNVHEKFKDRFTISVDKAKNSAYLQMNSLRAEDTAVYYCTRTITTTEGYWFFDVWGQGTLVTVSSGCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCREEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 222 Нижняя шарнирная область IgG1 человека CPPCP 223 GUCY2C-1640_тяжелая цепь EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMHWVRQAPGKGLEWIGEIKPSNELTNVHEKFKDRFTISVDKAKNSAYLQMNSLRAEDTAVYYCTRTITTTEGYWFFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 224 Полноразмерная GUCY2C человека SQVSQNCHNGSYEISVLMMGNSAFAEPLKNLEDAVNEGLEIVRGRLQNAGLNVTVNATFMYSDGLIHNSGDCRSSTCEGLDLLRKISNAQRMGCVLIGPSCTYSTFQMYLDTELSYPMISAGSFGLSCDYKETLTRLMSPARKLMYFLVNFWKTNDLPFKTYSWSTSYVYKNGTETEDCFWYLNALEASVSYFSHELGFKVVLRQDKEFQDILMDHNRKSNVIIMCGGPEFLYKLKGDRAVAEDIVIILVDLFNDQYLEDNVTAPDYMKNVLVLTLSPGNSLLNSSFSRNLSPTKRDFALAYLNGILLFGHMLKIFLENGENITTPKFAHAFRNLTFEGYDGPVTLDDWGDVDSTMVLLYTSVDTKKYKVLLTYDTHVNKTYPVDMSPTFTWKNSKLPNDITGRGPQILMIAVFTLTGAVVLLLLVALLMLRKYRKDYELRQKKWSHIPPENIFPLETNETNHVSLKIDDDKRRDTIQRLRQCKYDKKRVILKDLKHNDGNFTEKQKIELNKLLQIDYYNLTKFYGTVKLDTMIFGVIEYCERGSLREVLNDTISYPDGTFMDWEFKISVLYDIAKGMSYLHSSKTEVHGRLKSTNCVVDSRMVVKITDFGCNSILPPKKDLWTAPEHLRQANISQKGDVYSYGIIAQEIILRKETFYTLSCRDRNEKIFRVENSNGMKPFRPDLFLETAEEKELEVYLLVKNCWEEDPEKRPDFKKIETTLAKIFGLFHDQKNESYMDTLIRRLQLYSRNLEHLVEERTQLYKAERDRADRLNFMLLPRLVVKSLKEKGFVEPELYEEVTIYFSDIVGFTTICKYSTPMEVVDMLNDIYKSFDHIVDHHDVYKVETIGDAYMVASGLPKRNGNRHAIDIAKMALEILSFMGTFELEHLPGLPIWIRIGVHSGPCAAGVVGIKMPRYCLFGDTVNTASRMESTGLPLRIHVSGSTIAILKRTECQFLYEVRGETYLKGRGNETTYWLTGMKDQKFNLPTPPTVENQQRLQAEFSDMIANSLQKRQAAGIRSQKPRRVASYKKGTLEYLQLNTTDKESTYFTRTRPLEQKLISEEDLAANDILDYKDDDDK 225 Полноразмерная GUCY2C человека TCCCAGGTGAGTCAGAACTGCCACAATGGCAGCTATGAAATCAGCGTCCTGATGATGGGCAACTCAGCCTTTGCAGAGCCCCTGAAAAACTTGGAAGATGCGGTGAATGAGGGGCTGGAAATAGTGAGAGGACGTCTGCAAAATGCTGGCCTAAATGTGACTGTGAACGCTACTTTCATGTATTCGGATGGTCTGATTCATAACTCAGGCGACTGCCGGAGTAGCACCTGTGAAGGCCTCGACCTACTCAGGAAAATTTCAAATGCACAACGGATGGGCTGTGTCCTCATAGGGCCCTCATGTACATACTCCACCTTCCAGATGTACCTTGACACAGAATTGAGCTACCCCATGATCTCAGCTGGAAGTTTTGGATTGTCATGTGACTATAAAGAAACCTTAACCAGGCTGATGTCTCCAGCTAGAAAGTTGATGTACTTCTTGGTTAACTTTTGGAAAACCAACGATCTGCCCTTCAAAACTTATTCCTGGAGCACTTCGTATGTTTACAAGAATGGTACAGAAACTGAGGACTGTTTCTGGTACCTTAATGCTCTGGAGGCTAGCGTTTCCTATTTCTCCCACGAACTCGGCTTTAAGGTGGTGTTAAGACAAGATAAGGAGTTTCAGGATATCTTAATGGACCACAACAGGAAAAGCAATGTGATTATTATGTGTGGTGGTCCAGAGTTCCTCTACAAGCTGAAGGGTGACCGAGCAGTGGCTGAAGACATTGTCATTATTCTAGTGGATCTTTTCAATGACCAGTACTTGGAGGACAATGTCACAGCCCCTGACTATATGAAAAATGTCCTTGTTCTGACGCTGTCTCCTGGGAATTCCCTTCTAAATAGCTCTTTCTCCAGGAATCTATCACCAACAAAACGAGACTTTGCTCTTGCCTATTTGAATGGAATCCTGCTCTTTGGACATATGCTGAAGATATTTCTTGAAAATGGAGAAAATATTACCACCCCCAAATTTGCTCATGCTTTCAGGAATCTCACTTTTGAAGGGTATGACGGTCCAGTGACCTTGGATGACTGGGGGGATGTTGACAGTACCATGGTGCTTCTGTATACCTCTGTGGACACCAAGAAATACAAGGTTCTTTTGACCTATGATACCCACGTAAATAAGACCTATCCTGTGGATATGAGCCCCACATTCACTTGGAAGAACTCTAAACTTCCTAATGATATTACAGGCCGGGGCCCTCAGATCCTGATGATTGCAGTCTTCACCCTCACTGGAGCTGTGGTGCTGCTCCTGCTCGTCGCTCTCCTGATGCTCAGAAAATATAGAAAAGATTATGAACTTCGTCAGAAAAAATGGTCCCACATTCCTCCTGAAAATATCTTTCCTCTGGAGACCAATGAGACCAATCATGTTAGCCTCAAGATCGATGATGACAAAAGACGAGATACAATCCAGAGACTACGACAGTGCAAATACGACAAAAAGCGAGTGATTCTCAAAGATCTCAAGCACAATGATGGTAATTTCACTGAAAAACAGAAGATAGAATTGAACAAGTTGCTTCAGATTGACTATTACAACCTGACCAAGTTCTACGGCACAGTGAAACTTGATACCATGATCTTCGGGGTGATAGAATACTGTGAGAGAGGATCCCTCCGGGAAGTTTTAAATGACACAATTTCCTACCCTGATGGCACATTCATGGATTGGGAGTTTAAGATCTCTGTCTTGTATGACATTGCTAAGGGAATGTCATATCTGCACTCCAGTAAGACAGAAGTCCATGGTCGTCTGAAATCTACCAACTGCGTAGTGGACAGTAGAATGGTGGTGAAGATCACTGATTTTGGCTGCAATTCCATTTTACCTCCAAAAAAGGACCTGTGGACAGCTCCAGAGCACCTCCGCCAAGCCAACATCTCTCAGAAAGGAGATGTGTACAGCTATGGGATCATCGCACAGGAGATCATTCTGCGGAAAGAAACCTTCTACACTTTGAGCTGTCGGGACCGGAATGAGAAGATTTTCAGAGTGGAAAATTCCAATGGAATGAAACCCTTCCGCCCAGATTTATTCTTGGAAACAGCAGAGGAAAAAGAGCTAGAAGTGTACCTACTTGTAAAAAACTGTTGGGAGGAAGATCCAGAAAAGAGACCAGATTTCAAAAAAATTGAGACTACACTTGCCAAGATATTTGGACTTTTTCATGACCAAAAAAATGAAAGCTATATGGATACCTTGATCCGACGTCTACAGCTATATTCTCGAAACCTGGAACATCTGGTAGAGGAAAGGACACAGCTGTACAAGGCAGAGAGGGACAGGGCTGACAGACTTAACTTTATGTTGCTTCCAAGGCTAGTGGTAAAGTCTCTGAAGGAGAAAGGCTTTGTGGAGCCGGAACTATATGAGGAAGTTACAATCTACTTCAGTGACATTGTAGGTTTCACTACTATCTGCAAATACAGCACCCCCATGGAAGTGGTGGACATGCTTAATGACATCTATAAGAGTTTTGACCACATTGTTGATCATCATGATGTCTACAAGGTGGAAACCATCGGTGATGCGTACATGGTGGCTAGTGGTTTGCCTAAGAGAAATGGCAATCGGCATGCAATAGACATTGCCAAGATGGCCTTGGAAATCCTCAGCTTCATGGGGACCTTTGAGCTGGAGCATCTTCCTGGCCTCCCAATATGGATTCGCATTGGAGTTCACTCTGGTCCCTGTGCTGCTGGAGTTGTGGGAATCAAGATGCCTCGTTATTGTCTATTTGGAGATACGGTCAACACAGCCTCTAGGATGGAATCCACTGGCCTCCCTTTGAGAATTCACGTGAGTGGCTCCACCATAGCCATCCTGAAGAGAACTGAGTGCCAGTTCCTTTATGAAGTGAGAGGAGAAACATACTTAAAGGGAAGAGGAAATGAGACTACCTACTGGCTGACTGGGATGAAGGACCAGAAATTCAACCTGCCAACCCCTCCTACTGTGGAGAATCAACAGCGTTTGCAAGCAGAATTTTCAGACATGATTGCCAACTCTTTACAGAAAAGACAGGCAGCAGGGATAAGAAGCCAAAAACCCAGACGGGTAGCCAGCTATAAAAAAGGCACTCTGGAATACTTGCAGCTGAATACCACAGACAAGGAGAGCACCTATTTTACGCGTACGCGGCCGCTCGAGCAGAAACTCATCTCAGAAGAGGATCTGGCAGCAAATGATATCCTGGATTACAAGGATGACGACGATAAG 226 Полноразмерная GUCY2C яванского макака SQVSQNCHNGSYEISVLMMDNSAFAEPLENVEDAVNEGLEIVRGRLQNAGLNVTVNASFMYSDGLIHNSGDCRSSTCEGLDLLRKISNAKRMGCVLMGPSCTYSTFQMYLDTELSYPMISAGSFGLSCDYKETLTRLMSPARKLTYFLVNFWKTNDLPFKTYSWSTSYVYKNGTESEDCFWYLNALEASVSYFSHELSFKLVLRQDKEFQDILMDHNRKSNVIVMCGDPEFLYKLKGDRAVAEDIVIILVDLFNDQYFEDNVTAPDYMKNVLVLTQSPGNSLLNSSFSRNLSPTKRDFALAYLNGILLFGHMLKTFLENGENITTPKFAHAFRNLTFEGYDGPVTLDDWGDVDSTMVLLYTSVDTKKYKVLLTYDTHVNQTNPVDMSPTFTWKNSKLPNDITDRGPQILMIAVFTLTGAVVLLLLVALLMLRKYKKDYELRQKKWSHIPPENIFPLETNETNHVSLKIDDDKRRDTIQRLRQCKYDKKRVILKDLKHNDGNFTEKQKIELNKLLQIDYYNLTKFYGTVKLDTMIFGVIEYCERGSLREVLNDTISYPDGTFMDWEFKISVLYDIAKGMSYLHSSKTEVHGRLKSTNCVVDSRMVVKITDFGCNSILPPKKDLWTAPEHLRQANVSQKGDVYSYGIIAQEIILRKETFYTSSCRDRNEKIFRVENSNGMKPFRPDLFLETAEEKELEVYLLVKSCWEEDPEKRPDFKKIETTLAKIFGLFHDQKNESYMDTLIRRLQLYSRNLEHLVEERTQLYKAERDRADRLNFMLLPRLVVKSLKEKGFVEPELYEEVTIYFSDIVGFTTICKYSTPMEVVDMLNDIYKSFDHIVDHHDVYKVETIGDAYMVASGLPKRNGNRHAIDIAKMALEILSFMGTFELEHLPGLPIWIRIGVHSGPCAAGVVGIKMPRYCLFGDTVNTASRMESTGLPLRIHVSGSTIAILKRTECQFLYEVRGETYLKGRGNETTYWLTGMKDQKFNLPTPPTVENQQRLQAEFSDMIANSLQKRQAAGIRSQKPRRVASYKKGTLEYLQLNTTDKESTYFTRTRPLEQKLISEEDLAANDILDYKDDDDK 227 Полноразмерная GUCY2C яванского макака tcacaggtgagtcagaactgccacaatggcagctatgaaatcagcgtcctgatgatggacaactcagcctttgcagagcccctggaaaacgtggaagatgcggtgaatgaggggctggaaatagtgagaggacgtctgcaaaacgctggcctaaatgtgactgtgaatgcttctttcatgtattcggatggtctgattcataactccggcgactgccggagcagcacctgtgaaggccttgacctactcaggaaaatttcaaatgcaaaacggatgggctgtgtcctcatggggccctcatgtacatactccaccttccagatgtaccttgacacagaattgagctaccccatgatctcagctggaagttttggattgtcatgtgactataaagaaaccttaaccaggctgatgtctccagctagaaagttgacatacttcttggttaacttttggaaaaccaatgatctacccttcaaaacttattcctggagcacttcgtatgtttacaagaatggtacggagtccgaggactgtttctggtaccttaacgctctggaggccagtgtttcctatttctcccacgaactcagttttaagttggtgttaagacaagataaggagtttcaggatatcttaatggaccacaacaggaaaagcaatgtgattgttatgtgtggtgatccaGagttcctctacaagttgaagggtgaccgagcagtggctgaagacattgtcattattctagtggatcttttcaatgaccagtactttgaggacaatgtcacagcccctgactatatgaaaaatgtccttgttctgacgcagtctcctggcaattccctcctaaatagctctttctccaggaatctatccccaacaaaacgagactttgctcttgcctatttgaatggaatcctgctctttggacatatgctaaagacatttcttgaaaatggagaaaatattaccacccccaaatttgctcatgctttcaggaatctcacttttgaagggtatgacggtccagtgaccttggatgactggggggatgtggacagtaccatggtgcttctgtatacgtctgtggacaccaagaaatacaaggttcttttgacctatgatacccacgtaaatcagaccaaccctgtggatatgagccccacattcacttggaagaactctaaacttcctaatgatattacagaccggggccctcagatcctgatgattgcagtcttcaccctcaccggagctgtggtgctgctcctgcttgtcgctctcctgatgctcagaaaatataaaaaagattatgaacttcgtcagaaaaaatggtcccacattcctcctgaaaatatctttcctctggagaccaatgagaccaatcacgttagcctgaagatcgatgatgacaaaagacgagatacaatccagagactacgacagtgcaaatacgacaaaaagcgagtgattctcaaagatctcaagcacaatgatggtaatttcactgaaaaacagaagatagaattgaacaagttgcttcagattgactattacaacctgaccaagttctatggcaccgtgaaacttgataccatgatcttcggggtgatagaatactgtgagagaggatccctccgggaagttttaaatgacacaatttcctaccctgatggcacattcatggattgggagtttaagatctctgtcctgtatgacattgctaagggaatgtcatatctgcactccagtaagacagaagtccatggtcgtctgaaatctaccaactgcgtagtggacagtagaatggtggtgaagatcactgattttggctgcaattccattttacctccaaaaaaagacctgtggacagctccagagcacctccgccaagccaacgtctctcagaaaggagatgtgtacagctacgggatcatcgcacaggagatcatcctgcggaaagaaaccttctacacttcgagctgtcgagaccggaacgagaagattttcagagtggaaaattccaatggaatgaaacccttccgtccagatttattcttggaaacggcagaggaaaaagagctagaagtgtacctacttgtaaaaagctgttgggaagaagatccagaaaagagaccagatttcaaaaaaattgagactacacttgccaagatatttggactttttcatgaccaaaaaaatgaaagctatatggataccttgatccgacgtctacagctatattctcgaaacctggaacatctggtagaggaaaggacacagctatacaaggcagagagggacagggctgacagacttaactttatgttgcttccaaggctagtggtaaagtctctgaaggagaaaggctttgtagagccggaactatatgaggaagttacaatctacttcagtgacattgtaggtttcactactatctgcaaatacagcacccccatggaagtggtggacatgcttaatgacatctataagagttttgaccacattgttgatcatcatgatgtctacaaggtggaaaccattggtgatgcctacatggtggctagtggtttgcctaagagaaatggcaatcggcatgcaatagacattgccaagatggccttggaaatcctcagcttcatggggacctttgagctggagcatcttcctggcctcccaatatggattcgcattggcgttcactctggtccctgcgctgctggagttgtgggaatcaagatgcctcgttattgtctatttggagatacagtcaacacagcctctaggatggaatccactggcctccctttgaggattcatgtgagtggctccaccatagccattctgaagagaactgagtgccagttcctgtatgaagtgagaggagaaacgtacttaaagggaagaggaaatgagactacctactggctgaccgggatgaaggaccagaaattcaacctgccaacccctcctactgtggagaatcaacagcgtttgcaagcagaattttcagacatgattgccaactctttacagaaaagacaggcggcagggataagaagccaaaaacccagacgagtagccagctataaaaaaggcactctggaatacttgcaactgaataccacggacaaggagagcacctattttACGCGTACTCGGCCGCTCGAGCAGAAACTCATCTCAGAAGAGGATCTGGCAGCAAATGATATCCTGGATTACAAGGATGACGACGATAAG 228 Полноразмерная GUCY2C мыши VFWASQVRQNCRNGSYEISVLMMDNSAYKEPMQNLREAVEEGLDIVRKRLREADLNVTVNATFIYSDGLIHKSGDCRSSTCEGLDLLREITRDHKMGCALMGPSCTYSTFQMYLDTELNYPMISAGSYGLSCDYKETLTRILPPARKLMYFLVDFWKVNNASFKPFSWNSSYVYKNGSEPEDCFWYLNALEAGVSYFSEVLNFKDVLRRSEQFQEILTGHNRKSNVIVMCGTPESFYDVKGDLQVAEDTVVILVDLFSNHYFEENTTAPEYMDNVLVLTLPSEQSTSNTSVAERFSSGRSDFSLAYLEGTLLFGHMLQTFLENGENVTGPKFARAFRNLTFQGFAGPVTLDDSGDIDNIMSLLYVSLDTRKYKVLMKYDTHKNKTIPVAENPNFIWKNHKLPNDVPGLGPQILMIAVFTLTGILVVLLLIALLVLRKYRRDHALRQKKWSHIPSENIFPLETNETNHISLKIDDDRRRDTIQRVRQCKYDKKKVILKDLKHSDGNFSEKQKIDLNKLLQSDYYNLTKFYGTVKLDTRIFGVVEYCERGSLREVLNDTISYPDGTFMDWEFKISVLNDIAKGMSYLHSSKIEVHGRLKSTNCVVDSRMVVKITDFGCNSILPPKKDLWTAPEHLRQATISQKGDVYSFAIIAQEIILRKETFYTLSCRDHNEKIFRVENSYGKPFRPDLFLETADEKELEVYLLVKSCWEEDPEKRPDFKKIESTLAKIFGLFHDQKNESYMDTLIRRLQLYSRNLEHLVEERTQLYKAERDRADHLNFMLLPRLVVKSLKEKGIVEPELYEEVTIYFSDIVGFTTICKYSTPMEVVDMLNDIYKSFDQIVDHHDVYKVETIGDAYVVASGLPMRNGNRHAVDISKMALDILSFIGTFELEHLPGLPVWIRIGVHSGPCAAGVVGIKMPRYCLFGDTVNTASRMESTGLPLRIHMSSSTITILKRTDCQFLYEVRGETYLKGRGTETTYWLTGMKDQEYNLPSPPTVENQQRLQTEFSDMIVSALQKRQASGKKSRRPTRVASYKKGFLEYMQLNNSDHDSTYFTRTRPLEQKLISEEDLAANDILDYKDDDDK 229 Полноразмерная GUCY2C мыши GTGTTCTGGGCCTCTCAGGTGAGGCAGAACTGCCGCAATGGCAGCTACGAGATCAGCGTCCTGATGATGGACAACTCAGCCTACAAAGAACCTATGCAAAACCTGAGGGAGGCTGTGGAGGAAGGACTGGACATAGTGCGAAAGCGCCTGCGTGAAGCCGACCTAAATGTGACTGTGAACGCGACTTTCATCTACTCCGACGGTCTGATTCATAAGTCAGGTGACTGCCGGAGCAGCACCTGTGAAGGCCTTGACCTACTCAGGGAGATTACAAGAGATCATAAGATGGGCTGCGCCCTCATGGGGCCCTCGTGCACGTATTCCACCTTCCAGATGTACCTCGACACAGAGTTGAACTATCCCATGATTTCCGCTGGAAGTTATGGATTGTCCTGTGACTATAAGGAAACCCTAACCAGGATCCTGCCTCCAGCCAGGAAGCTGATGTACTTCTTGGTCGATTTCTGGAAAGTCAACAATGCATCTTTCAAACCCTTTTCCTGGAACTCTTCGTATGTTTACAAGAATGGATCGGAACCTGAAGATTGTTTCTGGTACCTCAATGCTCTGGAGGCTGGGGTGTCCTATTTTTCTGAGGTGCTCAACTTCAAGGATGTACTGAGACGCAGCGAACAGTTCCAGGAAATCTTAACAGGCCATAACAGAAAGAGCAATGTGATTGTTATGTGTGGCACGCCAGAAAGCTTCTATGATGTGAAAGGTGACCTCCAAGTGGCTGAAGATACTGTTGTCATCCTGGTAGATCTGTTCAGTAACCATTACTTTGAGGAGAACACCACAGCTCCTGAGTATATGGACAATGTCCTCGTCCTGACGCTGCCGTCTGAACAGTCCACCTCAAACACCTCTGTCGCCGAGAGGTTTTCATCGGGGAGAAGTGACTTTTCTCTCGCTTACTTGGAGGGAACCTTGCTATTTGGACACATGCTGCAGACGTTTCTTGAAAATGGAGAAAATGTCACGGGTCCCAAGTTTGCTCGTGCATTCAGGAATCTCACTTTTCAAGGCTTTGCAGGACCTGTGACTCTGGATGACAGTGGGGACATTGACAACATTATGTCCCTTCTGTATGTGTCTCTGGATACCAGGAAATACAAGGTTCTTATGAAGTATGACACCCACAAAAACAAAACTATTCCGGTGGCTGAGAACCCCAACTTCATCTGGAAGAACCACAAGCTCCCCAATGACGTTCCTGGGCTGGGCCCTCAAATCCTGATGATTGCCGTCTTCACGCTCACGGGGATCCTGGTAGTTCTGCTGCTGATTGCCCTCCTCGTGCTGAGAAAATACAGAAGAGATCATGCACTTCGACAGAAGAAATGGTCCCACATTCCTTCTGAAAACATCTTTCCTCTGGAGACCAACGAGACCAACCACATCAGCCTGAAGATTGACGATGACAGGAGACGAGACACAATCCAGAGAGTGCGACAGTGCAAATACGACAAGAAGAAAGTGATTCTGAAAGACCTCAAGCACAGCGACGGGAACTTCAGTGAGAAGCAGAAGATAGACCTGAACAAGTTGCTGCAGTCTGACTACTACAACCTGACTAAGTTCTACGGCACCGTGAAGCTGGACACCAGGATCTTTGGGGTGGTTGAGTACTGCGAGAGGGGATCCCTCCGGGAAGTGTTAAACGACACAATTTCCTACCCTGACGGCACGTTCATGGATTGGGAGTTTAAGATCTCTGTCTTAAATGACATCGCTAAGGGGATGTCCTACCTGCACTCCAGTAAGATTGAAGTCCACGGGCGTCTCAAATCCACCAACTGCGTGGTGGACAGCCGCATGGTGGTGAAGATCACCGACTTTGGGTGCAATTCCATCCTGCCTCCAAAAAAAGACCTGTGGACGGCCCCGGAGCACCTGCGCCAGGCCACCATCTCTCAGAAAGGAGACGTGTACAGCTTCGCCATCATTGCCCAGGAGATCATCCTCCGTAAGGAGACTTTTTACACGCTGAGCTGTCGGGATCACAATGAGAAGATTTTCAGAGTGGAAAATTCATACGGGAAACCTTTCCGCCCAGACCTCTTCCTGGAGACTGCAGATGAGAAGGAGCTGGAGGTCTATCTACTTGTCAAAAGCTGTTGGGAGGAGGATCCAGAAAAGAGGCCAGATTTCAAGAAAATCGAGAGCACACTGGCCAAGATATTTGGCCTTTTCCATGACCAGAAAAACGAGTCTTACATGGACACCTTGATCCGACGTCTCCAGCTGTACTCTCGAAACCTGGAACATCTGGTGGAGGAAAGGACTCAGCTGTACAAGGCGGAGAGGGACAGGGCTGACCACCTTAACTTCATGCTCCTCCCACGGCTGGTGGTAAAGTCACTGAAGGAGAAAGGCATCGTGGAGCCAGAGCTGTACGAAGAAGTCACAATCTACTTCAGTGACATTGTGGGCTTCACCACCATCTGCAAGTATAGCACGCCCATGGAGGTGGTGGACATGCTCAACGACATCTACAAGAGCTTTGACCAGATTGTGGACCACCATGACGTCTACAAGGTAGAAACCATCGGTGACGCCTACGTGGTGGCCAGCGGTCTGCCTATGAGAAACGGCAACCGACACGCGGTAGACATTTCCAAGATGGCCTTGGACATCCTCAGCTTCATAGGGACCTTTGAGTTGGAGCATCTCCCTGGCCTCCCCGTGTGGATCCGCATTGGAGTTCATTCTGGGCCCTGCGCTGCTGGTGTTGTGGGGATCAAGATGCCTCGCTATTGCCTGTTTGGAGACACTGTCAACACTGCCTCCAGGATGGAATCCACCGGCCTCCCCTTGAGGATTCACATGAGCAGCTCCACCATAACCATCCTGAAGAGAACGGATTGCCAGTTCCTGTATGAAGTGAGGGGAGAAACCTACTTAAAGGGAAGAGGGACAGAGACCACATACTGGCTGACTGGGATGAAGGACCAAGAATACAACCTGCCATCCCCACCGACAGTGGAGAACCAACAGCGTCTGCAGACTGAGTTCTCAGACATGATCGTTAGCGCCTTACAGAAAAGACAGGCCTCGGGCAAGAAGAGCCGGAGGCCCACTCGGGTGGCCAGCTACAAGAAAGGCTTTCTGGAATACATGCAGCTGAACAATTCAGACCACGATAGCACCTATTTTACGCGTACGCGGCCGCTCGAGCAGAAACTCATCTCAGAAGAGGATCTGGCAGCAAATGATATCCTGGATTACAAGGATGACGACGATAAG 230 ECD GUCY2C человека-muIgG2a SQVSQNCHNGSYEISVLMMGNSAFAEPLKNLEDAVNEGLEIVRGRLQNAGLNVTVNATFMYSDGLIHNSGDCRSSTCEGLDLLRKISNAQRMGCVLIGPSCTYSTFQMYLDTELSYPMISAGSFGLSCDYKETLTRLMSPARKLMYFLVNFWKTNDLPFKTYSWSTSYVYKNGTETEDCFWYLNALEASVSYFSHELGFKVVLRQDKEFQDILMDHNRKSNVIIMCGGPEFLYKLKGDRAVAEDIVIILVDLFNDQYFEDNVTAPDYMKNVLVLTLSPGNSLLNSSFSRNLSPTKRDFALAYLNGILLFGHMLKIFLENGENITTPKFAHAFRNLTFEGYDGPVTLDDWGDVDSTMVLLYTSVDTKKYKVLLTYDTHVNKTYPVDMSPTFTWKNSKLPNDITGRGPQGGGGSENLYFQGGGGSGGGGSEPRGPTIKPCPPCKCPAPNLEGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKAFACAVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGGGPPDYKDDDDK 231 ECD GUCY2C человека-muIgG2a ATGGAGACAGACACACTGCTCCTGTGGGTGCTGCTTCTGTGGGTGCCAGGTTCCACTGGAtcacaggtgagtcagaactgccacaatggcagctatgaaatcagcgtcctgatgatgggcaactcagcctttgcagagcccctgaaaaacttggaagatgcggtgaatgaggggctggaaatagtgagaggacgtctgcaaaatgctggcctaaatgtgactgtgaacgctactttcatgtattcggatggtctgattcataactcaggcgactgccggagtagcacctgtgaaggcctcgacctactcaggaaaatttcaaatgcacaacggatgggctgtgtcctcatagggccctcatgtacatactccaccttccagatgtaccttgacacagaattgagctaccccatgatctcagctggaagttttggattgtcatgtgactataaagaaaccttaaccaggctgatgtctccagctagaaagttgatgtacttcttggttaacttttggaaaaccaacgatctgcccttcaaaacttattcctggagcacttcgtatgtttacaagaatggtacagaaactgaggactgtttctggtaccttaatgctctggaggctagcgtttcctatttctcccacgaactcggctttaaggtggtgttaagacaagataaggagtttcaggatatcttaatggaccacaacaggaaaagcaatgtgattattatgtgtggtggtccagagttcctctacaagctgaagggtgaccgagcagtggctgaagacattgtcattattctagtggatcttttcaatgaccagtactttgaggacaatgtcacagcccctgactatatgaaaaatgtccttgttctgacgctgtctcctgggaattcccttctaaatagctctttctccaggaatctatcaccaacaaaacgagactttgctcttgcctatttgaatggaatcctgctctttggacatatgctgaagatatttcttgaaaatggagaaaatattaccacccccaaatttgctcatgctttcaggaatctcacttttgaagggtatgacggtccagtgaccttggatgactggggggatgttgacagtaccatggtgcttctgtatacctctgtggacaccaagaaatacaaggttcttttgacctatgatacccacgtaaataagacctatcctgtggatatgagccccacattcacttggaagaactctaaacttcctaatgatattacaggccggggccctcagggaggcggaggttccGAGAATTTATACTTCCAGGGCGGAGGCGGTTCCGGCGGCGGAGGAAGCgagccccgcggaccgacaatcaagccctgtcctccatgcaaatgcccagcacctaacctcgagggtggaccatccgtcttcatcttccctccaaagatcaaggatgtactcatgatctccctgagccccatagtcacatgtgtggtggtggatgtgagcgaggatgacccagatgtccagatcagctggtttgtgaacaacgtggaagtacacacagctcagacacaaacccatagagaggattacaacagtactctccgggtggtcagtgccctccccatccagcaccaggactggatgagtggcaaggctttcgcatgcgccgtcaacaacaaagacctcccagcgcccatcgagagaaccatctcaaaacccaaagggtcagtaagagctccacaggtatatgtcttgcctccaccagaagaagagatgactaagaaacaggtcactctgacctgcatggtcacagacttcatgcctgaagacatttacgtggagtggaccaacaacgggaaaacagagctaaactacaagaacactgaaccagtcctggactctgatggttcttacttcatgtacagcaagctgagagtggaaaagaagaactgggtggaaagaaatagctactcctgttcagtggtccacgagggtctgcacaatcaccacacgactaagagcttctcccggactccgggtGGCGGGCCACCCGACTACAAGGACGACGATGACAAA 232 Расщепленный ECD GUCY2C человека SQVSQNCHNGSYEISVLMMGNSAFAEPLKNLEDAVNEGLEIVRGRLQNAGLNVTVNATFMYSDGLIHNSGDCRSSTCEGLDLLRKISNAQRMGCVLIGPSCTYSTFQMYLDTELSYPMISAGSFGLSCDYKETLTRLMSPARKLMYFLVNFWKTNDLPFKTYSWSTSYVYKNGTETEDCFWYLNALEASVSYFSHELGFKVVLRQDKEFQDILMDHNRKSNVIIMCGGPEFLYKLKGDRAVAEDIVIILVDLFNDQYFEDNVTAPDYMKNVLVLTLSPGNSLLNSSFSRNLSPTKRDFALAYLNGILLFGHMLKIFLENGENITTPKFAHAFRNLTFEGYDGPVTLDDWGDVDSTMVLLYTSVDTKKYKVLLTYDTHVNKTYPVDMSPTFTWKNSKLPNDITGRGPQGGGGSENLYFQ 233 Расщепленный ECD GUCY2C человека tcacaggtgagtcagaactgccacaatggcagctatgaaatcagcgtcctgatgatgggcaactcagcctttgcagagcccctgaaaaacttggaagatgcggtgaatgaggggctggaaatagtgagaggacgtctgcaaaatgctggcctaaatgtgactgtgaacgctactttcatgtattcggatggtctgattcataactcaggcgactgccggagtagcacctgtgaaggcctcgacctactcaggaaaatttcaaatgcacaacggatgggctgtgtcctcatagggccctcatgtacatactccaccttccagatgtaccttgacacagaattgagctaccccatgatctcagctggaagttttggattgtcatgtgactataaagaaaccttaaccaggctgatgtctccagctagaaagttgatgtacttcttggttaacttttggaaaaccaacgatctgcccttcaaaacttattcctggagcacttcgtatgtttacaagaatggtacagaaactgaggactgtttctggtaccttaatgctctggaggctagcgtttcctatttctcccacgaactcggctttaaggtggtgttaagacaagataaggagtttcaggatatcttaatggaccacaacaggaaaagcaatgtgattattatgtgtggtggtccagagttcctctacaagctgaagggtgaccgagcagtggctgaagacattgtcattattctagtggatcttttcaatgaccagtactttgaggacaatgtcacagcccctgactatatgaaaaatgtccttgttctgacgctgtctcctgggaattcccttctaaatagctctttctccaggaatctatcaccaacaaaacgagactttgctcttgcctatttgaatggaatcctgctctttggacatatgctgaagatatttcttgaaaatggagaaaatattaccacccccaaatttgctcatgctttcaggaatctcacttttgaagggtatgacggtccagtgaccttggatgactggggggatgttgacagtaccatggtgcttctgtatacctctgtggacaccaagaaatacaaggttcttttgacctatgatacccacgtaaataagacctatcctgtggatatgagccccacattcacttggaagaactctaaacttcctaatgatattacaggccggggccctcagggaggcggaggttccGAGAATTTATACTTCCAG 234 ECD GUCY2C яванского макака-muIG2a SQVSQNCHNGSYEISVLMMDNSAFAEPLENVEDAVNEGLEIVRGRLQNAGLNVTVNASFMYSDGLIHNSGDCRSSTCEGLDLLRKISNAKRMGCVLMGPSCTYSTFQMYLDTELSYPMISAGSFGLSCDYKETLTRLMSPARKLTYFLVNFWKTNDLPFKTYSWSTSYVYKNGTESEDCFWYLNALEASVSYFSHELSFKLVLRQDKEFQDILMDHNRKSNVIVMCGDPEFLYKLKGDRAVAEDIVIILVDLFNDQYFEDNVTAPDYMKNVLVLTQSPGNSLLNSSFSRNLSPTKRDFALAYLNGILLFGHMLKTFLENGENITTPKFAHAFRNLTFEGYDGPVTLDDWGDVDSTMVLLYTSVDTKKYKVLLTYDTHVNQTNPVDMSPTFTWKNSKLPNDITDRGPQGGGGSENLYFQGGGGSGGGGSEPRGPTIKPCPPCKCPAPNLEGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKAFACAVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGGGPPDYKDDDDK 235 ECD GUCY2C яванского макака-muIG2a tcacaggtgagtcagaactgccacaatggcagctatgaaatcagcgtcctgatgatggacaactcagcctttgcagagcccctggaaaacgtggaagatgcggtgaatgaggggctggaaatagtgagaggacgtctgcaaaacgctggcctaaatgtgactgtgaatgcttctttcatgtattcggatggtctgattcataactccggcgactgccggagcagcacctgtgaaggccttgacctactcaggaaaatttcaaatgcaaaacggatgggctgtgtcctcatggggccctcatgtacatactccaccttccagatgtaccttgacacagaattgagctaccccatgatctcagctggaagttttggattgtcatgtgactataaagaaaccttaaccaggctgatgtctccagctagaaagttgacatacttcttggttaacttttggaaaaccaatgatctacccttcaaaacttattcctggagcacttcgtatgtttacaagaatggtacggagtccgaggactgtttctggtaccttaacgctctggaggccagtgtttcctatttctcccacgaactcagttttaagttggtgttaagacaagataaggagtttcaggatatcttaatggaccacaacaggaaaagcaatgtgattgttatgtgtggtgatccaGagttcctctacaagttgaagggtgaccgagcagtggctgaagacattgtcattattctagtggatcttttcaatgaccagtactttgaggacaatgtcacagcccctgactatatgaaaaatgtccttgttctgacgcagtctcctgggaattccctcctaaatagctctttctccaggaatctatccccaacaaaacgagactttgctcttgcctatttgaatggaatcctgctctttggacatatgctaaagacatttcttgaaaatggagaaaatattaccacccccaaatttgctcatgctttcaggaatctcacttttgaagggtatgacggtccagtgaccttggatgactggggggatgtggacagtaccatggtgcttctgtatacgtctgtggacaccaagaaatacaaggttcttttgacctatgatacccacgtaaatcagaccaaccctgtggatatgagccccacattcacttggaagaactctaaacttcctaatgatattacagaccggggccctcagggaggcggaggttccGAGAATTTATACTTCCAGGGCGGAGGCGGTTCCGGCGGCGGAGGAAGCgagccccgcggaccgacaatcaagccctgtcctccatgcaaatgcccagcacctaacctcgagggtggaccatccgtcttcatcttccctccaaagatcaaggatgtactcatgatctccctgagccccatagtcacatgtgtggtggtggatgtgagcgaggatgacccagatgtccagatcagctggtttgtgaacaacgtggaagtacacacagctcagacacaaacccatagagaggattacaacagtactctccgggtggtcagtgccctccccatccagcaccaggactggatgagtggcaaggctttcgcatgcgccgtcaacaacaaagacctcccagcgcccatcgagagaaccatctcaaaacccaaagggtcagtaagagctccacaggtatatgtcttgcctccaccagaagaagagatgactaagaaacaggtcactctgacctgcatggtcacagacttcatgcctgaagacatttacgtggagtggaccaacaacgggaaaacagagctaaactacaagaacactgaaccagtcctggactctgatggttcttacttcatgtacagcaagctgagagtggaaaagaagaactgggtggaaagaaatagctactcctgttcagtggtccacgagggtctgcacaatcaccacacgactaagagcttctcccggactccgggtGGCGGGCCACCCGACTACAAGGACGACGATGACAAA 236 Расщепленный ECD GUCY2C яванского макака SQVSQNCHNGSYEISVLMMDNSAFAEPLENVEDAVNEGLEIVRGRLQNAGLNVTVNASFMYSDGLIHNSGDCRSSTCEGLDLLRKISNAKRMGCVLMGPSCTYSTFQMYLDTELSYPMISAGSFGLSCDYKETLTRLMSPARKLTYFLVNFWKTNDLPFKTYSWSTSYVYKNGTESEDCFWYLNALEASVSYFSHELSFKLVLRQDKEFQDILMDHNRKSNVIVMCGDPEFLYKLKGDRAVAEDIVIILVDLFNDQYFEDNVTAPDYMKNVLVLTQSPGNSLLNSSFSRNLSPTKRDFALAYLNGILLFGHMLKTFLENGENITTPKFAHAFRNLTFEGYDGPVTLDDWGDVDSTMVLLYTSVDTKKYKVLLTYDTHVNQTNPVDMSPTFTWKNSKLPNDITDRGPQGGGGSENLYFQ 237 Расщепленный ECD GUCY2C яванского макака tcacaggtgagtcagaactgccacaatggcagctatgaaatcagcgtcctgatgatggacaactcagcctttgcagagcccctggaaaacgtggaagatgcggtgaatgaggggctggaaatagtgagaggacgtctgcaaaacgctggcctaaatgtgactgtgaatgcttctttcatgtattcggatggtctgattcataactccggcgactgccggagcagcacctgtgaaggccttgacctactcaggaaaatttcaaatgcaaaacggatgggctgtgtcctcatggggccctcatgtacatactccaccttccagatgtaccttgacacagaattgagctaccccatgatctcagctggaagttttggattgtcatgtgactataaagaaaccttaaccaggctgatgtctccagctagaaagttgacatacttcttggttaacttttggaaaaccaatgatctacccttcaaaacttattcctggagcacttcgtatgtttacaagaatggtacggagtccgaggactgtttctggtaccttaacgctctggaggccagtgtttcctatttctcccacgaactcagttttaagttggtgttaagacaagataaggagtttcaggatatcttaatggaccacaacaggaaaagcaatgtgattgttatgtgtggtgatccaGagttcctctacaagttgaagggtgaccgagcagtggctgaagacattgtcattattctagtggatcttttcaatgaccagtactttgaggacaatgtcacagcccctgactatatgaaaaatgtccttgttctgacgcagtctcctgggaattccctcctaaatagctctttctccaggaatctatccccaacaaaacgagactttgctcttgcctatttgaatggaatcctgctctttggacatatgctaaagacatttcttgaaaatggagaaaatattaccacccccaaatttgctcatgctttcaggaatctcacttttgaagggtatgacggtccagtgaccttggatgactggggggatgtggacagtaccatggtgcttctgtatacgtctgtggacaccaagaaatacaaggttcttttgacctatgatacccacgtaaatcagaccaaccctgtggatatgagccccacattcacttggaagaactctaaacttcctaatgatattacagaccggggccctcagggaggcggaggttccGAGAATTTATACTTCCAG 238 ECD GUCY2C мыши-muIgG2a VFWASQVRQNCRNGSYEISVLMMDNSAYKEPMQNLREAVEEGLDIVRKRLREADLNVTVNATFIYSDGLIHKSGDCRSSTCEGLDLLREITRDHKMGCALMGPSCTYSTFQMYLDTELNYPMISAGSYGLSCDYKETLTRILPPARKLMYFLVDFWKVNNASFKPFSWNSSYVYKNGSEPEDCFWYLNALEAGVSYFSEVLNFKDVLRRSEQFQEILTGHNRKSNVIVMCGTPESFYDVKGDLQVAEDTVVILVDLFSNHYFEENTTAPEYMDNVLVLTLPSEQSTSNTSVAERFSSGRSDFSLAYLEGTLLFGHMLQTFLENGENVTGPKFARAFRNLTFQGFAGPVTLDDSGDIDNIMSLLYVSLDTRKYKVLMKYDTHKNKTIPVAENPNFIWKNHKLPNDVPGLGPQILMGGGGSENLYFQGGGGSGGGGSEPRGPTIKPCPPCKCPAPNLEGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKAFACAVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGHHHHHH 239 ECD GUCY2C мыши-muIgG2a gtgttctgggcctctcaggtgaggcagaactgccgcaatggcagctacgagatcagcgtcctgatgatggacaactcagcctacaaagaacctatgcaaaacctgagggaggctgtggaggaaggactggacatagtgcgaaagcgcctgcgtgaagccgacctaaatgtgactgtgaacgcgactttcatctactccgacggtctgattcataagtcaggtgactgccggagcagcacctgtgaaggccttgacctactcagggagattacaagagatcataagatgggctgcgccctcatggggccctcgtgcacgtattccaccttccagatgtacctcgacacagagttgaactatcccatgatttccgctggaagttatggattgtcctgtgactataaggaaaccctaaccaggattctgcctccagccaggaagctgatgtacttcttggtcgatttctggaaagtcaacaatgcatctttcaaacccttttcctggaactcttcgtatgtttacaagaatggatcggaacctgaagattgtttctggtacctcaatgctctggaggctggggtgtcctatttttctgaggtgctcaacttcaaggatgtactgagacgcagcgaacagttccaggaaatcttaacaggccataacagaaagagcaatgtgattgttatgtgtggcacgccagaaagcttctatgatgtgaaaggtgacctccaagtggctgaagatactgttgtcatcctggtagatctgttcagtaaccattactttgaggagaacaccacagctcctgagtatatggacaatgtcctcgtcctgacgctgccgtctgaacagtccacctcaaacacctctgtcgccgagaggttttcatcggggagaagtgacttttctctcgcttacttggagggaaccttgctatttggacacatgctgcagacgtttcttgaaaatggagaaaatgtcacgggtcccaagtttgctcgtgcattcaggaatctcacttttcaaggctttgcaggacctgtgactctggatgacagtggggacattgacaacattatgtcccttctgtatgtgtctctggataccaggaaatacaaggttcttatgaagtatgacacccacaaaaacaaaactattccggtggctgagaaccccaacttcatctggaagaaccacaagctccccaatgacgttcctgggctgggccctcaaatcctgatgggaggcggaggttccGAGAATTTATACTTCCAGGGCGGAGGCGGTTCCGGCGGCGGAGGAAGCgagccccgcggaccgacaatcaagccctgtcctccatgcaaatgcccagcacctaacctcgagggtggaccatccgtcttcatcttccctccaaagatcaaggatgtactcatgatctccctgagccccatagtcacatgtgtggtggtggatgtgagcgaggatgacccagatgtccagatcagctggtttgtgaacaacgtggaagtacacacagctcagacacaaacccatagagaggattacaacagtactctccgggtggtcagtgccctccccatccagcaccaggactggatgagtggcaaggctttcgcatgcgccgtcaacaacaaagacctcccagcgcccatcgagagaaccatctcaaaacccaaagggtcagtaagagctccacaggtatatgtcttgcctccaccagaagaagagatgactaagaaacaggtcactctgacctgcatggtcacagacttcatgcctgaagacatttacgtggagtggaccaacaacgggaaaacagagctaaactacaagaacactgaaccagtcctggactctgatggttcttacttcatgtacagcaagctgagagtggaaaagaagaactgggtggaaagaaatagctactcctgttcagtggtccacgagggtctgcacaatcaccacacgactaagagcttctcccggactccgggtCACCATCACCATCACCAT 240 Расщепленный ECD GUCY2C мыши VFWASQVRQNCRNGSYEISVLMMDNSAYKEPMQNLREAVEEGLDIVRKRLREADLNVTVNATFIYSDGLIHKSGDCRSSTCEGLDLLREITRDHKMGCALMGPSCTYSTFQMYLDTELNYPMISAGSYGLSCDYKETLTRILPPARKLMYFLVDFWKVNNASFKPFSWNSSYVYKNGSEPEDCFWYLNALEAGVSYFSEVLNFKDVLRRSEQFQEILTGHNRKSNVIVMCGTPESFYDVKGDLQVAEDTVVILVDLFSNHYFEENTTAPEYMDNVLVLTLPSEQSTSNTSVAERFSSGRSDFSLAYLEGTLLFGHMLQTFLENGENVTGPKFARAFRNLTFQGFAGPVTLDDSGDIDNIMSLLYVSLDTRKYKVLMKYDTHKNKTIPVAENPNFIWKNHKLPNDVPGLGPQILMGGGGSENLYFQ 241 Расщепленный ECD GUCY2C мыши gtgttctgggcctctcaggtgaggcagaactgccgcaatggcagctacgagatcagcgtcctgatgatggacaactcagcctacaaagaacctatgcaaaacctgagggaggctgtggaggaaggactggacatagtgcgaaagcgcctgcgtgaagccgacctaaatgtgactgtgaacgcgactttcatctactccgacggtctgattcataagtcaggtgactgccggagcagcacctgtgaaggccttgacctactcagggagattacaagagatcataagatgggctgcgccctcatggggccctcgtgcacgtattccaccttccagatgtacctcgacacagagttgaactatcccatgatttccgctggaagttatggattgtcctgtgactataaggaaaccctaaccaggattctgcctccagccaggaagctgatgtacttcttggtcgatttctggaaagtcaacaatgcatctttcaaacccttttcctggaactcttcgtatgtttacaagaatggatcggaacctgaagattgtttctggtacctcaatgctctggaggctggggtgtcctatttttctgaggtgctcaacttcaaggatgtactgagacgcagcgaacagttccaggaaatcttaacaggccataacagaaagagcaatgtgattgttatgtgtggcacgccagaaagcttctatgatgtgaaaggtgacctccaagtggctgaagatactgttgtcatcctggtagatctgttcagtaaccattactttgaggagaacaccacagctcctgagtatatggacaatgtcctcgtcctgacgctgccgtctgaacagtccacctcaaacacctctgtcgccgagaggttttcatcggggagaagtgacttttctctcgcttacttggagggaaccttgctatttggacacatgctgcagacgtttcttgaaaatggagaaaatgtcacgggtcccaagtttgctcgtgcattcaggaatctcacttttcaaggctttgcaggacctgtgactctggatgacagtggggacattgacaacattatgtcccttctgtatgtgtctctggataccaggaaatacaaggttcttatgaagtatgacacccacaaaaacaaaactattccggtggctgagaaccccaacttcatctggaagaaccacaagctccccaatgacgttcctgggctgggccctcaaatcctgatgggaggcggaggttccGAGAATTTATACTTCCAG 242 CD3 эпсилон-дельта человека mqsgthwrvlglcllsvgvwgqdgneemggitqtpykvsisgttviltcpqypgseilwqhndkniggdeddknigsdedhlslkefseleqsgyyvcyprgskpedanfylylrarggggsggggsggggspieeledrvfvncntsitwvegtvgtllsditrldlgkrildprgiyrcngtdiykdkestvqvhyrmcqscveldhhhhhh 243 CD3 эпсилон-дельта человека atgcaatccggtacgcactggagagtcttgggtctgtgccttttgtctgttggcgtatgggggcaagacgggaacgaagaaatgggaggcattacacaaacaccatacaaggtatcaattagcggcacgacggttatactgacatgtccacaatatccaggcagcgaaattctgtggcagcacaatgacaagaatattgggggagatgaagacgacaaaaatatcggtagcgacgaggaccatctgtctctgaaggaattttcagaacttgaacaatctggctattatgtgtgctacccgcgaggcagcaaaccggaagatgcaaacttttacctttatctgagagcaaggggcggcggaggctctgggggcggaggcagcggcggaggaggatcaccaatcgaggaattggaagatagggtattcgtaaattgtaacaccagcattacatgggtggaagggaccgttggaactctcctgagcgatatcacacgactggatcttggtaaacgaatcctggacccacgcggaatctatagatgtaacggaactgatatttacaaagacaaagaatctactgtgcaagttcactaccgaatgtgtcaatcatgcgttgaactcgatcaccaccaccatcatcac 244 CD3 эпсилон-дельта яванского макака mqsgthwrvlglcllsvgvwgqdgneemgsitqtpyqvsisgttviltcsqhlgseaqwqhngknkgdsgdqlflpefsemeqsgyyvcyprgsnpedashhlylkarggggsggggsggggspveeledrvfvkcntsvtwvegtvgtlltnntrldlgkrildprgiyrcngtdiykdkesavqvhyrmcqncveldhhhhhh 245 CD3 эпсилон-дельта яванского макака atgcaaagcggaactcattggcgcgtcctgggactctgtctgctctccgtgggagtctggggacaagatggaaacgaagagatgggaagcattacacaaacaccataccaagtctccattagcggcactaccgtcattctgacatgttcccaacatctgggcagcgaagctcaatggcagcacaatggaaagaataagggcgatagcggagaccaactgtttctgccagaatttagcgaaatggagcaatccggctattacgtgtgctacccacgcggcagcaaccctgaagatgctagccatcacctctatctgaaggctcgcggaggcggaggcagcggcggcggaggatccggcggaggcggaagcccagtcgaggaactggaagatcgcgtcttcgtgaagtgtaacaccagcgtcacatgggtggaaggcaccgtcggaactctcctgactaacaacacacgcctggatctcggaaaacgcatcctggacccacgcggaatctatagatgtaacggaactgatatttacaaagacaaagaatccgctgtgcaagtccactaccgcatgtgtcaaaactgtgtcgaactggatcatcaccatcaccatcac 246 GUCY2C-1608_выступ gacatccagctgacccagtctccatcctccctgtctgcatctgtaggagacagagtcaccatcacttgcagagccagtgaaagtgttgattattatggcagtagtttattgcagtggtatcagcagaaaccagggaaagcccctaagctcctgatctatgctgcatccaaactagcttctggggtcccatcaaggttcagtggcagtggatctgggacagatttcactctcaccatcagcagtctgcaacctgaagattttgcaacttactactgtcagcaaactcggaaagcgtatacgtttggccaggggaccaagctggagatcaaaggtggaggtagcgggggcggcggggaagttcaactcgttgagtctggcgggggattggttcaacccggtggaagccttagattgtcatgtgccgcctccggctttacatttagcgactattacatgacctgggtgagacaagctccaggcaaaggacttgaatgggtggcctttatcagaaatcaggcccgcggctacacaagcgaccataatccctccgtgaaaggaagatttaccatcagccgggacaatgctaaaaattcactttaccttcaaatgaactctcttagagccgaggacaccgccgtatactactgcgcaagagatagaccaagttattacgtcctggattactggggccagggaacaaccgtcaccgtgtcttctggatgcccaccgtgcccagcacctgaagccgctggggcaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtgcaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgtggtgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctatagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtcccccggaaag 247 GUCY2C-1608_впадина gacatccagatgacccagtccccctcttctctgtctgcctctgtgggcgacagagtgaccatcacctgcacaagctcacagtcactgtttaatgtccgcagccagaaaaactatcttgcgtggtatcagcagaagcctggcaaggctcccaagctgctgatctactgggccagtacacgagaatccggcgtgccttccagattctccggctctggctctggcaccgatttcaccctgaccatctcctccctccagcctgaggatttcgccacctactactgcaaacagtcttacgaccttttcacttttggcggcggaacaaaggtggagatcaagggcggaggtggatctggcggcggaggcgaggtgcagctggtggagtctgggggaggcttggtccagcctggggggtccctgagactctcctgtgcagcctctggcttcaccttcagcagctactggatgcactgggtccgccaggctccagggaaggggctggagtggattggagagattaaacctagcaacgaacttactaacgtccatgaaaagttcaaggaccgattcaccatctccgtggacaaggccaagaactcagcctatctgcaaatgaacagcctgagagccgaggacacggctgtgtattactgtacaagaacgattacgacgacggagggatactggttcttcgatgtctggggccaagggacactggtcaccgtctcttcaggatgtccaccgtgcccagcacctgaagccgctggggcaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatgccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgtcctgcgcggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctcgttagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtcccccggaaag 248 GUCY2C-0250_выступ DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVDYYGTSLMQWYQQKPGKAPKLLIYAASNVESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTRKVYTFGQGTKLEIKGGGSGGGGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMTWVRQAPGKGLEWVAFIRNRARGYTSDHNPSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRPSYYVLDYWGQGTTVTVSSGCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 249 GUCY2C-0250_впадина DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCTSSQSLFNVRSRKNYLAWYQQKPGKAPKLLIYWASTRESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCKQSYDLFTFGGGTKVEIKGGGSGGGGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYWMHWVRQAPGKGLEWIGEIKPSNGLTNYIEKFKNRFTISVDKAKNSAYLQMNSLRAEDTAVYYCTRTITTTEGYWFFDVWGQGTLVTVSSGCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCREEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 250 GUCY2C-0250_мономер DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVDYYGTSLMQWYQQKPGKAPKLLIYAASNVESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTRKVYTFGQGTKLEIKGGGSGGGGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMTWVRQAPGKGLEWVAFIRNRARGYTSDHNPSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRPSYYVLDYWGQGTTVTVSSGCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCTSSQSLFNVRSRKNYLAWYQQKPGKAPKLLIYWASTRESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCKQSYDLFTFGGGTKVEIKGGGSGGGGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYWMHWVRQAPGKGLEWIGEIKPSNGLTNYIEKFKNRFTISVDKAKNSAYLQMNSLRAEDTAVYYCTRTITTTEGYWFFDVWGQGTLVTVSSGCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCREEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 251 Полноразмерная GUCY2C человека
Регистрационный номер GenBank NP_004954.2 MKTLLLDLALWSLLFQPGWLSFSSQVSQNCHNGSYEISVLMMGNSAFAEPLKNLEDAVNEGLEIVRGRLQNAGLNVTVNATFMYSDGLIHNSGDCRSSTCEGLDLLRKISNAQRMGCVLIGPSCTYSTFQMYLDTELSYPMISAGSFGLSCDYKETLTRLMSPARKLMYFLVNFWKTNDLPFKTYSWSTSYVYKNGTETEDCFWYLNALEASVSYFSHELGFKVVLRQDKEFQDILMDHNRKSNVIIMCGGPEFLYKLKGDRAVAEDIVIILVDLFNDQYFEDNVTAPDYMKNVLVLTLSPGNSLLNSSFSRNLSPTKRDFALAYLNGILLFGHMLKIFLENGENITTPKFAHAFRNLTFEGYDGPVTLDDWGDVDSTMVLLYTSVDTKKYKVLLTYDTHVNKTYPVDMSPTFTWKNSKLPNDITGRGPQILMIAVFTLTGAVVLLLLVALLMLRKYRKDYELRQKKWSHIPPENIFPLETNETNHVSLKIDDDKRRDTIQRLRQCKYDKKRVILKDLKHNDGNFTEKQKIELNKLLQIDYYNLTKFYGTVKLDTMIFGVIEYCERGSLREVLNDTISYPDGTFMDWEFKISVLYDIAKGMSYLHSSKTEVHGRLKSTNCVVDSRMVVKITDFGCNSILPPKKDLWTAPEHLRQANISQKGDVYSYGIIAQEIILRKETFYTLSCRDRNEKIFRVENSNGMKPFRPDLFLETAEEKELEVYLLVKNCWEEDPEKRPDFKKIETTLAKIFGLFHDQKNESYMDTLIRRLQLYSRNLEHLVEERTQLYKAERDRADRLNFMLLPRLVVKSLKEKGFVEPELYEEVTIYFSDIVGFTTICKYSTPMEVVDMLNDIYKSFDHIVDHHDVYKVETIGDAYMVASGLPKRNGNRHAIDIAKMALEILSFMGTFELEHLPGLPIWIRIGVHSGPCAAGVVGIKMPRYCLFGDTVNTASRMESTGLPLRIHVSGSTIAILKRTECQFLYEVRGETYLKGRGNETTYWLTGMKDQKFNLPTPPTVENQQRLQAEFSDMIANSLQKRQAAGIRSQKPRRVASYKKGTLEYLQLNTTDKESTYF 252 Полноразмерная GUCY2C человека
Регистрационный номер GenBank NM_004963.3 GACCAGAGAGAAGCGTGGGGAAGAGTGGGCTGAGGGACTCCACTAGAGGCTGTCCATCTGGATTCCCTGCCTCCCTAGGAGCCCAACAGAGCAAAGCAAGTGGGCACAAGGAGTATGGTTCTAACGTGATTGGGGTCATGAAGACGTTGCTGTTGGACTTGGCTTTGTGGTCACTGCTCTTCCAGCCCGGGTGGCTGTCCTTTAGTTCCCAGGTGAGTCAGAACTGCCACAATGGCAGCTATGAAATCAGCGTCCTGATGATGGGCAACTCAGCCTTTGCAGAGCCCCTGAAAAACTTGGAAGATGCGGTGAATGAGGGGCTGGAAATAGTGAGAGGACGTCTGCAAAATGCTGGCCTAAATGTGACTGTGAACGCTACTTTCATGTATTCGGATGGTCTGATTCATAACTCAGGCGACTGCCGGAGTAGCACCTGTGAAGGCCTCGACCTACTCAGGAAAATTTCAAATGCACAACGGATGGGCTGTGTCCTCATAGGGCCCTCATGTACATACTCCACCTTCCAGATGTACCTTGACACAGAATTGAGCTACCCCATGATCTCAGCTGGAAGTTTTGGATTGTCATGTGACTATAAAGAAACCTTAACCAGGCTGATGTCTCCAGCTAGAAAGTTGATGTACTTCTTGGTTAACTTTTGGAAAACCAACGATCTGCCCTTCAAAACTTATTCCTGGAGCACTTCGTATGTTTACAAGAATGGTACAGAAACTGAGGACTGTTTCTGGTACCTTAATGCTCTGGAGGCTAGCGTTTCCTATTTCTCCCACGAACTCGGCTTTAAGGTGGTGTTAAGACAAGATAAGGAGTTTCAGGATATCTTAATGGACCACAACAGGAAAAGCAATGTGATTATTATGTGTGGTGGTCCAGAGTTCCTCTACAAGCTGAAGGGTGACCGAGCAGTGGCTGAAGACATTGTCATTATTCTAGTGGATCTTTTCAATGACCAGTACTTTGAGGACAATGTCACAGCCCCTGACTATATGAAAAATGTCCTTGTTCTGACGCTGTCTCCTGGGAATTCCCTTCTAAATAGCTCTTTCTCCAGGAATCTATCACCAACAAAACGAGACTTTGCTCTTGCCTATTTGAATGGAATCCTGCTCTTTGGACATATGCTGAAGATATTTCTTGAAAATGGAGAAAATATTACCACCCCCAAATTTGCTCATGCTTTCAGGAATCTCACTTTTGAAGGGTATGACGGTCCAGTGACCTTGGATGACTGGGGGGATGTTGACAGTACCATGGTGCTTCTGTATACCTCTGTGGACACCAAGAAATACAAGGTTCTTTTGACCTATGATACCCACGTAAATAAGACCTATCCTGTGGATATGAGCCCCACATTCACTTGGAAGAACTCTAAACTTCCTAATGATATTACAGGCCGGGGCCCTCAGATCCTGATGATTGCAGTCTTCACCCTCACTGGAGCTGTGGTGCTGCTCCTGCTCGTCGCTCTCCTGATGCTCAGAAAATATAGAAAAGATTATGAACTTCGTCAGAAAAAATGGTCCCACATTCCTCCTGAAAATATCTTTCCTCTGGAGACCAATGAGACCAATCATGTTAGCCTCAAGATCGATGATGACAAAAGACGAGATACAATCCAGAGACTACGACAGTGCAAATACGACAAAAAGCGAGTGATTCTCAAAGATCTCAAGCACAATGATGGTAATTTCACTGAAAAACAGAAGATAGAATTGAACAAGTTGCTTCAGATTGACTATTACAACCTGACCAAGTTCTACGGCACAGTGAAACTTGATACCATGATCTTCGGGGTGATAGAATACTGTGAGAGAGGATCCCTCCGGGAAGTTTTAAATGACACAATTTCCTACCCTGATGGCACATTCATGGATTGGGAGTTTAAGATCTCTGTCTTGTATGACATTGCTAAGGGAATGTCATATCTGCACTCCAGTAAGACAGAAGTCCATGGTCGTCTGAAATCTACCAACTGCGTAGTGGACAGTAGAATGGTGGTGAAGATCACTGATTTTGGCTGCAATTCCATTTTACCTCCAAAAAAGGACCTGTGGACAGCTCCAGAGCACCTCCGCCAAGCCAACATCTCTCAGAAAGGAGATGTGTACAGCTATGGGATCATCGCACAGGAGATCATCCTGCGGAAAGAAACCTTCTACACTTTGAGCTGTCGGGACCGGAATGAGAAGATTTTCAGAGTGGAAAATTCCAATGGAATGAAACCCTTCCGCCCAGATTTATTCTTGGAAACAGCAGAGGAAAAAGAGCTAGAAGTGTACCTACTTGTAAAAAACTGTTGGGAGGAAGATCCAGAAAAGAGACCAGATTTCAAAAAAATTGAGACTACACTTGCCAAGATATTTGGACTTTTTCATGACCAAAAAAATGAAAGCTATATGGATACCTTGATCCGACGTCTACAGCTATATTCTCGAAACCTGGAACATCTGGTAGAGGAAAGGACACAGCTGTACAAGGCAGAGAGGGACAGGGCTGACAGACTTAACTTTATGTTGCTTCCAAGGCTAGTGGTAAAGTCTCTGAAGGAGAAAGGCTTTGTGGAGCCGGAACTATATGAGGAAGTTACAATCTACTTCAGTGACATTGTAGGTTTCACTACTATCTGCAAATACAGCACCCCCATGGAAGTGGTGGACATGCTTAATGACATCTATAAGAGTTTTGACCACATTGTTGATCATCATGATGTCTACAAGGTGGAAACCATCGGTGATGCGTACATGGTGGCTAGTGGTTTGCCTAAGAGAAATGGCAATCGGCATGCAATAGACATTGCCAAGATGGCCTTGGAAATCCTCAGCTTCATGGGGACCTTTGAGCTGGAGCATCTTCCTGGCCTCCCAATATGGATTCGCATTGGAGTTCACTCTGGTCCCTGTGCTGCTGGAGTTGTGGGAATCAAGATGCCTCGTTATTGTCTATTTGGAGATACGGTCAACACAGCCTCTAGGATGGAATCCACTGGCCTCCCTTTGAGAATTCACGTGAGTGGCTCCACCATAGCCATCCTGAAGAGAACTGAGTGCCAGTTCCTTTATGAAGTGAGAGGAGAAACATACTTAAAGGGAAGAGGAAATGAGACTACCTACTGGCTGACTGGGATGAAGGACCAGAAATTCAACCTGCCAACCCCTCCTACTGTGGAGAATCAACAGCGTTTGCAAGCAGAATTTTCAGACATGATTGCCAACTCTTTACAGAAAAGACAGGCAGCAGGGATAAGAAGCCAAAAACCCAGACGGGTAGCCAGCTATAAAAAAGGCACTCTGGAATACTTGCAGCTGAATACCACAGACAAGGAGAGCACCTATTTTTAAACCTAAATGAGGTATAAGGACTCACACAAATTAAAATACAGCTGCACTGAGGCAGCGACCTCAAGTGTCCTGAAAGCTTACATTTTCCTGAGACCTCAATGAAGCAGAAATGTACTTAGGCTTGGCTGCCCTGTCTGGAACATGGACTTTCTTGCATGAATCAGATGTGTGTTCTCAGTGAAATAACTACCTTCCACTCTGGAACCTTATTCCAGCAGTTGTTCCAGGGAGCTTCTACCTGGAAAAGAAAAGAAATGAATAGACTATCTAGAACTTGAGAAGATTTTATTCTTATTTCATTTATTTTTTGTTTGTTTATTTTTATCGTTTTTGTTTACTGGCTTTCCTTCTGTATTCATAAGATTTTTTAAATTGTCATAATTATATTTTAAATACCCATCTTCATTAAAGTATATTTAACTCATAATTTTTGCAGAAAATATGCTATATATTAGGCAAGAATAAAAGCTAAAGGTTTCCCAAAAAAAAAA 253 Полноразмерная GUCY2C яванского макака sqvsqnchngsyeisvlmmdnsafaeplenvedavnegleivrgrlqnaglnvtvnasfmysdglihnsgdcrsstcegldllrkisnakrmgcvlmgpsctystfqmyldtelsypmisagsfglscdyketltrlmsparkltyflvnfwktndlpfktyswstsyvykngtesedcfwylnaleasvsyfshelsfklvlrqdkefqdilmdhnrksnvivmcgdpeflyklkgdravaediviilvdlfndqyfednvtapdymknvlvltqspgnsllnssfsrnlsptkrdfalaylngillfghmlktflengenittpkfahafrnltfegydgpvtlddwgdvdstmvllytsvdtkkykvlltydthvnqtnpvdmsptftwknsklpnditdrgpqilmiavftltgavvllllvallmlrkykkdyelrqkkwshippenifpletnetnhvslkidddkrrdtiqrlrqckydkkrvilkdlkhndgnftekqkielnkllqidyynltkfygtvkldtmifgvieycergslrevlndtisypdgtfmdwefkisvlydiakgmsylhssktevhgrlkstncvvdsrmvvkitdfgcnsilppkkdlwtapehlrqanvsqkgdvysygiiaqeiilrketfytsscrdrnekifrvensngmkpfrpdlfletaeekelevyllvkscweedpekrpdfkkiettlakifglfhdqknesymdtlirrlqlysrnlehlveertqlykaerdradrlnfmllprlvvkslkekgfvepelyeevtiyfsdivgfttickystpmevvdmlndiyksfdhivdhhdvykvetigdaymvasglpkrngnrhaidiakmaleilsfmgtfelehlpglpiwirigvhsgpcaagvvgikmpryclfgdtvntasrmestglplrihvsgstiailkrtecqflyevrgetylkgrgnettywltgmkdqkfnlptpptvenqqrlqaefsdmianslqkrqaagirsqkprrvasykkgtleylqlnttdkestyf 254 Полноразмерная GUCY2C яванского макака tcacaggtgagtcagaactgccacaatggcagctatgaaatcagcgtcctgatgatggacaactcagcctttgcagagcccctggaaaacgtggaagatgcggtgaatgaggggctggaaatagtgagaggacgtctgcaaaacgctggcctaaatgtgactgtgaatgcttctttcatgtattcggatggtctgattcataactccggcgactgccggagcagcacctgtgaaggccttgacctactcaggaaaatttcaaatgcaaaacggatgggctgtgtcctcatggggccctcatgtacatactccaccttccagatgtaccttgacacagaattgagctaccccatgatctcagctggaagttttggattgtcatgtgactataaagaaaccttaaccaggctgatgtctccagctagaaagttgacatacttcttggttaacttttggaaaaccaatgatctacccttcaaaacttattcctggagcacttcgtatgtttacaagaatggtacggagtccgaggactgtttctggtaccttaacgctctggaggccagtgtttcctatttctcccacgaactcagttttaagttggtgttaagacaagataaggagtttcaggatatcttaatggaccacaacaggaaaagcaatgtgattgttatgtgtggtgatccagagttcctctacaagttgaagggtgaccgagcagtggctgaagacattgtcattattctagtggatcttttcaatgaccagtactttgaggacaatgtcacagcccctgactatatgaaaaatgtccttgttctgacgcagtctcctggcaattccctcctaaatagctctttctccaggaatctatccccaacaaaacgagactttgctcttgcctatttgaatggaatcctgctctttggacatatgctaaagacatttcttgaaaatggagaaaatattaccacccccaaatttgctcatgctttcaggaatctcacttttgaagggtatgacggtccagtgaccttggatgactggggggatgtggacagtaccatggtgcttctgtatacgtctgtggacaccaagaaatacaaggttcttttgacctatgatacccacgtaaatcagaccaaccctgtggatatgagccccacattcacttggaagaactctaaacttcctaatgatattacagaccggggccctcagatcctgatgattgcagtcttcaccctcaccggagctgtggtgctgctcctgcttgtcgctctcctgatgctcagaaaatataaaaaagattatgaacttcgtcagaaaaaatggtcccacattcctcctgaaaatatctttcctctggagaccaatgagaccaatcacgttagcctgaagatcgatgatgacaaaagacgagatacaatccagagactacgacagtgcaaatacgacaaaaagcgagtgattctcaaagatctcaagcacaatgatggtaatttcactgaaaaacagaagatagaattgaacaagttgcttcagattgactattacaacctgaccaagttctatggcaccgtgaaacttgataccatgatcttcggggtgatagaatactgtgagagaggatccctccgggaagttttaaatgacacaatttcctaccctgatggcacattcatggattgggagtttaagatctctgtcctgtatgacattgctaagggaatgtcatatctgcactccagtaagacagaagtccatggtcgtctgaaatctaccaactgcgtagtggacagtagaatggtggtgaagatcactgattttggctgcaattccattttacctccaaaaaaagacctgtggacagctccagagcacctccgccaagccaacgtctctcagaaaggagatgtgtacagctacgggatcatcgcacaggagatcatcctgcggaaagaaaccttctacacttcgagctgtcgagaccggaacgagaagattttcagagtggaaaattccaatggaatgaaacccttccgtccagatttattcttggaaacggcagaggaaaaagagctagaagtgtacctacttgtaaaaagctgttgggaagaagatccagaaaagagaccagatttcaaaaaaattgagactacacttgccaagatatttggactttttcatgaccaaaaaaatgaaagctatatggataccttgatccgacgtctacagctatattctcgaaacctggaacatctggtagaggaaaggacacagctatacaaggcagagagggacagggctgacagacttaactttatgttgcttccaaggctagtggtaaagtctctgaaggagaaaggctttgtagagccggaactatatgaggaagttacaatctacttcagtgacattgtaggtttcactactatctgcaaatacagcacccccatggaagtggtggacatgcttaatgacatctataagagttttgaccacattgttgatcatcatgatgtctacaaggtggaaaccattggtgatgcctacatggtggctagtggtttgcctaagagaaatggcaatcggcatgcaatagacattgccaagatggccttggaaatcctcagcttcatggggacctttgagctggagcatcttcctggcctcccaatatggattcgcattggcgttcactctggtccctgcgctgctggagttgtgggaatcaagatgcctcgttattgtctatttggagatacagtcaacacagcctctaggatggaatccactggcctccctttgaggattcatgtgagtggctccaccatagccattctgaagagaactgagtgccagttcctgtatgaagtgagaggagaaacgtacttaaagggaagaggaaatgagactacctactggctgaccgggatgaaggaccagaaattcaacctgccaacccctcctactgtggagaatcaacagcgtttgcaagcagaattttcagacatgattgccaactctttacagaaaagacaggcggcagggataagaagccaaaaacccagacgagtagccagctataaaaaaggcactctggaatacttgcaactgaataccacggacaaggagagcacctatttt 255 Полноразмерная GUCY2C мыши
Регистрационный номер GenBank NP_001120790.1 MTSLLGLAVRLLLFQPALMVFWASQVRQNCRNGSYEISVLMMDNSAYKEPMQNLREAVEEGLDIVRKRLREADLNVTVNATFIYSDGLIHKSGDCRSSTCEGLDLLREITRDHKMGCALMGPSCTYSTFQMYLDTELNYPMISAGSYGLSCDYKETLTRILPPARKLMYFLVDFWKVNNASFKPFSWNSSYVYKNGSEPEDCFWYLNALEAGVSYFSEVLNFKDVLRRSEQFQEILTGHNRKSNVIVMCGTPESFYDVKGDLQVAEDTVVILVDLFSNHYFEENTTAPEYMDNVLVLTLPSEQSTSNTSVAERFSSGRSDFSLAYLEGTLLFGHMLQTFLENGENVTGPKFARAFRNLTFQGFAGPVTLDDSGDIDNIMSLLYVSLDTRKYKVLMKYDTHKNKTIPVAENPNFIWKNHKLPNDVPGLGPQILMIAVFTLTGILVVLLLIALLVLRKYRRDHALRQKKWSHIPSENIFPLETNETNHISLKIDDDRRRDTIQRVRQCKYDKKKVILKDLKHSDGNFSEKQKIDLNKLLQSDYYNLTKFYGTVKLDTRIFGVVEYCERGSLREVLNDTISYPDGTFMDWEFKISVLNDIAKGMSYLHSSKIEVHGRLKSTNCVVDSRMVVKITDFGCNSILPPKKDLWTAPEHLRQATISQKGDVYSFAIIAQEIILRKETFYTLSCRDHNEKIFRVENSYGKPFRPDLFLETADEKELEVYLLVKSCWEEDPEKRPDFKKIESTLAKIFGLFHDQKNESYMDTLIRRLQLYSRNLEHLVEERTQLYKAERDRADHLNFMLLPRLVVKSLKEKGIVEPELYEEVTIYFSDIVGFTTICKYSTPMEVVDMLNDIYKSFDQIVDHHDVYKVETIGDAYVVASGLPMRNGNRHAVDISKMALDILSFIGTFELEHLPGLPVWIRIGVHSGPCAAGVVGIKMPRYCLFGDTVNTASRMESTGLPLRIHMSSSTITILKRTDCQFLYEVRGETYLKGRGTETTYWLTGMKDQEYNLPSPPTVENQQRLQTEFSDMIVSALQKRQASGKKSRRPTRVASYKKGFLEYMQLNNSDHDSTYF 256 Полноразмерная GUCY2C мыши
Регистрационный номер GenBank NM_001127318.1 GACCAGTGTGGCAAGACCAGAAAGGTGCGTGGGGAAGAGAAGACCAAGGGACTCTGCTAGCGACTCTCCAGAGGGGCTCCCTGTGTCTCTAAAAGCGAGCAATCCAGGGGGGCATGGTGCTACGGTGAGCCAGGTCATGACGTCACTGCTGGGCTTGGCTGTGCGGTTACTGCTCTTCCAGCCCGCGCTGATGGTGTTCTGGGCCTCTCAGGTGAGGCAGAACTGCCGCAATGGCAGCTACGAGATCAGCGTCCTGATGATGGACAACTCAGCCTACAAAGAACCTATGCAAAACCTGAGGGAGGCTGTGGAGGAAGGACTGGACATAGTGCGAAAGCGCCTGCGTGAAGCCGACCTAAATGTGACTGTGAACGCGACTTTCATCTACTCCGACGGTCTGATTCATAAGTCAGGTGACTGCCGGAGCAGCACCTGTGAAGGCCTTGACCTACTCAGGGAGATTACAAGAGATCATAAGATGGGCTGCGCCCTCATGGGGCCCTCGTGCACGTATTCCACCTTCCAGATGTACCTCGACACAGAGTTGAACTATCCCATGATTTCCGCTGGAAGTTATGGATTGTCCTGTGACTATAAGGAAACCCTAACCAGGATCCTGCCTCCAGCCAGGAAGCTGATGTACTTCTTGGTCGATTTCTGGAAAGTCAACAATGCATCTTTCAAACCCTTTTCCTGGAACTCTTCGTATGTTTACAAGAATGGATCGGAACCTGAAGATTGTTTCTGGTACCTCAATGCTCTGGAGGCTGGGGTGTCCTATTTTTCTGAGGTGCTCAACTTCAAGGATGTACTGAGACGCAGCGAACAGTTCCAGGAAATCTTAACAGGCCATAACAGAAAGAGCAATGTGATTGTTATGTGTGGCACGCCAGAAAGCTTCTATGATGTGAAAGGTGACCTCCAAGTGGCTGAAGATACTGTTGTCATCCTGGTAGATCTGTTCAGTAACCATTACTTTGAGGAGAACACCACAGCTCCTGAGTATATGGACAATGTCCTCGTCCTGACGCTGCCGTCTGAACAGTCCACCTCAAACACCTCTGTCGCCGAGAGGTTTTCATCGGGGAGAAGTGACTTTTCTCTCGCTTACTTGGAGGGAACCTTGCTATTTGGACACATGCTGCAGACGTTTCTTGAAAATGGAGAAAATGTCACGGGTCCCAAGTTTGCTCGTGCATTCAGGAATCTCACTTTTCAAGGCTTTGCAGGACCTGTGACTCTGGATGACAGTGGGGACATTGACAACATTATGTCCCTTCTGTATGTGTCTCTGGATACCAGGAAATACAAGGTTCTTATGAAGTATGACACCCACAAAAACAAAACTATTCCGGTGGCTGAGAACCCCAACTTCATCTGGAAGAACCACAAGCTCCCCAATGACGTTCCTGGGCTGGGCCCTCAAATCCTGATGATTGCCGTCTTCACGCTCACGGGGATCCTGGTAGTTCTGCTGCTGATTGCCCTCCTCGTGCTGAGAAAATACAGAAGAGATCATGCACTTCGACAGAAGAAATGGTCCCACATTCCTTCTGAAAACATCTTTCCTCTGGAGACCAACGAGACCAACCACATCAGCCTGAAGATTGACGATGACAGGAGACGAGACACAATCCAGAGAGTGCGACAGTGCAAATACGACAAGAAGAAAGTGATTCTGAAAGACCTCAAGCACAGCGACGGGAACTTCAGTGAGAAGCAGAAGATAGACCTGAACAAGTTGCTGCAGTCTGACTACTACAACCTGACTAAGTTCTACGGCACCGTGAAGCTGGACACCAGGATCTTTGGGGTGGTTGAGTACTGCGAGAGGGGATCCCTCCGGGAAGTGTTAAACGACACAATTTCCTACCCTGACGGCACGTTCATGGATTGGGAGTTTAAGATCTCTGTCTTAAATGACATCGCTAAGGGGATGTCCTACCTGCACTCCAGTAAGATTGAAGTCCACGGGCGTCTCAAATCCACCAACTGCGTGGTGGACAGCCGCATGGTGGTGAAGATCACCGACTTTGGGTGCAATTCCATCCTGCCTCCAAAAAAAGACCTGTGGACGGCCCCGGAGCACCTGCGCCAGGCCACCATCTCTCAGAAAGGAGACGTGTACAGCTTCGCCATCATTGCCCAGGAGATCATCCTCCGTAAGGAGACTTTTTACACGCTGAGCTGTCGGGATCACAATGAGAAGATTTTCAGAGTGGAAAATTCATACGGGAAACCTTTCCGCCCAGACCTCTTCCTGGAGACTGCAGATGAGAAGGAGCTGGAGGTCTATCTACTTGTCAAAAGCTGTTGGGAGGAGGATCCAGAAAAGAGGCCAGATTTCAAGAAAATCGAGAGCACACTGGCCAAGATATTTGGCCTTTTCCATGACCAGAAAAACGAGTCTTACATGGACACCTTGATCCGACGTCTCCAGCTGTACTCTCGAAACCTGGAACATCTGGTGGAGGAAAGGACTCAGCTGTACAAGGCGGAGAGGGACAGGGCTGACCACCTTAACTTCATGCTCCTCCCACGGCTGGTGGTAAAGTCACTGAAGGAGAAAGGCATCGTGGAGCCAGAGCTGTACGAAGAAGTCACAATCTACTTCAGTGACATTGTGGGCTTCACCACCATCTGCAAGTATAGCACGCCCATGGAGGTGGTGGACATGCTCAACGACATCTACAAGAGCTTTGACCAGATTGTGGACCACCATGACGTCTACAAGGTAGAAACCATCGGTGACGCCTACGTGGTGGCCAGCGGTCTGCCTATGAGAAACGGCAACCGACACGCGGTAGACATTTCCAAGATGGCCTTGGACATCCTCAGCTTCATAGGGACCTTTGAGTTGGAGCATCTCCCTGGCCTCCCCGTGTGGATCCGCATTGGAGTTCATTCTGGGCCCTGCGCTGCTGGTGTTGTGGGGATCAAGATGCCTCGCTATTGCCTGTTTGGAGACACTGTCAACACTGCCTCCAGGATGGAATCCACCGGCCTCCCCTTGAGGATTCACATGAGCAGCTCCACCATAACCATCCTGAAGAGAACGGATTGCCAGTTCCTGTATGAAGTGAGGGGAGAAACCTACTTAAAGGGAAGAGGGACAGAGACCACATACTGGCTGACTGGGATGAAGGACCAAGAATACAACCTGCCATCCCCACCGACAGTGGAGAACCAACAGCGTCTGCAGACTGAGTTCTCAGACATGATCGTTAGCGCCTTACAGAAAAGACAGGCCTCGGGCAAGAAGAGCCGGAGGCCCACTCGGGTGGCCAGCTACAAGAAAGGCTTTCTGGAATACATGCAGCTGAACAATTCAGACCACGATAGCACCTATTTTTAGACCAAGTGAGGTCTGAGAACTGACAGTAGCAACCTCCTATATCATGAATCTGTATTTTCCAGAGACCTCAACAACATAGACAAGCACTTAGCCTCAGTGCCCTGACTGGAACGTAGAACCAACCCCTCAAGTCATGTGGGTCTGATTTTGGGTTGGTTGGTTGGTTGGTTGGTTGGTTTTGGTTTTGTTGAGACAGAGTTTCGTGTATCCCAAGCTGGTCTCAAACTCACTGTGTAGCAGCAGATGACTTTGGACTTCTAAGATCATCCGTGTGTGTTCCTGACAGTGTGATGAGTGTATACGTCAGAGCCCTGTCCCACAGTTCTCCATGGAGCATCAACCTGAATGGAGGAGCGAGGAGGGGGAATGTCCTGTGCTGTACAGAACTTGGGGTTTTGTTCTAATTTTATCTCTGGTTTGGTTTTGTTTTCTGGCTCCTTCCCTCTCTATGTGTGAGAGAAGTTTTTAAATTGTCTGAATTGTATGCTAAGTAGCTTATCTACAAGAAAGTGTGTTTAACTAGTGATTTTTGCAGAAACCATGCTGGATATTAGGTAAAAAATAAAAGTGTTTAGAGTCTAAAAAAAAAAAAAAAA 257 GUCY2C-0074_CDR1 VH TYWMQ 258 GUCY2C-0077_CDR1 VH KYWMQ 259 GUCY2C-0098_CDR1 VH SYWMH 260 GUCY2C-0104_CDR1 VH DTYIH 261 GUCY2C-0105_CDR1 VH DYIML 262 GUCY2C-0074_CDR2 VH YPGDGM 263 GUCY2C-0077_CDR2 VH YPGDGF 264 GUCY2C-0098_CDR2 VH KPSNGL 265 GUCY2C-0104_CDR2 VH DPANGN 266 GUCY2C-0105_CDR2 VH NPYYGS 267 GUCY2C-1554_VH; GUCY2C-1608_CDR2 VH KPSNEL 268 CD3-0006_VH,
2B5-1038 VH,
2B5-1039 VH,
2B5-1040 VH,
CDR1 (Kabat) DYYMT 269 CD3-0001_CDR2 VH RNRARGYT 270 CD3-0006_VH,
2B5-1038 VH,
2B5-1039 VH,
2B5-1040 VH,
CDR2 (Chothia) RNQARGYT 271 CDR1 VH huIGHV3-7 SYWMS 272 CDR2 VH huIGHV3-7 KQDGSE 273 2B5-1038 VH,
2B5-1039 VH,
2B5-1040 VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMTWVRQAPGKGLEWVAFIRNQARGYTSDHNPSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRPSYYVLDYWGQGTTVTVSS 274 VL 2B5-1038 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCTSDQSLFNVRSGKNYLAWYQQKPGKAPKLLIYWASDRESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCKQSYDLFTFGGGTKVEIK 275 VL 2B5-1039 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCTSSESLFNVRSGKNYLAWYQQKPGKAPKLLIYWASDRESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCKQSYDLFTFGGGTKVEIK 276 VL 2B5-1040 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCTSSQSLFNVRSGKNYLAWYQQKPGKAPKLLIYWASDRESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCKQSYDLFTFGGGTKVEIK 277 VH 2B5-1038,
VH 2B5-1039,
VH 2B5-1040,
CDR1 (Chothia) GFTFSDY 278 CDR1 VL 2B5-1038 TSDQSLFNVRSGKNYLA 279 CDR1 VL 2B5-1039 TSSESLFNVRSGKNYLA 280 CDR1 VL 2B5-1040 TSSQSLFNVRSGKNYLA 281 VL 2B5-1038,
VL 2B5-1039,
VL 2B5-1040,
CDR2 WASDRES 282 GUCY2C-1678_выступ DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVDYYGSSLLQWYQQKPGKAPKLLIYAASKLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTRKAYTFGQGTKLEIKGGGSGGGGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMTWVRQAPGKGLEWVAFIRNQARGYTSDHNPSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRPSYYVLDYWGQGTTVTVSSGCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 283 GUCY2C-1678_впадина DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCTSDQSLFNVRSGKNYLAWYQQKPGKAPKLLIYWASDRESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCKQSYDLFTFGGGTKVEIKGGGGSGGGGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMHWVRQAPGKGLEWIGEIKPSNELTNVHEKFKDRFTISVDKAKNSAYLQMNSLRAEDTAVYYCTRTITTTEGYWFFDVWGQGTLVTVSSGCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCREEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 284 GUCY2C-1679_выступ DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVDYYGSSLLQWYQQKPGKAPKLLIYAASKLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTRKAYTFGQGTKLEIKGGGSGGGGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMTWVRQAPGKGLEWVAFIRNQARGYTSDHNPSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRPSYYVLDYWGQGTTVTVSSGCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 285 GUCY2C-1679_впадина DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCTSSQSLFNVRSGKNYLAWYQQKPGKAPKLLIYWASDRESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCKQSYDLFTFGGGTKVEIKGGGGSGGGGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMHWVRQAPGKGLEWIGEIKPSNELTNVHEKFKDRFTISVDKAKNSAYLQMNSLRAEDTAVYYCTRTITTTEGYWFFDVWGQGTLVTVSSGCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCREEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 286 GUCY2C-1680_выступ DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVDYYGSSLLQWYQQKPGKAPKLLIYAASKLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTRKAYTFGQGTKLEIKGGGSGGGGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMTWVRQAPGKGLEWVAFIRNQARGYTSDHNPSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRPSYYVLDYWGQGTTVTVSSGCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 287 GUCY2C-1680_впадина DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCTSSESLFNVRSGKNYLAWYQQKPGKAPKLLIYWASDRESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCKQSYDLFTFGGGTKVEIKGGGGSGGGGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMHWVRQAPGKGLEWIGEIKPSNELTNVHEKFKDRFTISVDKAKNSAYLQMNSLRAEDTAVYYCTRTITTTEGYWFFDVWGQGTLVTVSSGCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCREEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 288 2B5-1038_VL GACATCCAGATGACCCAGTCCCCCTCTTCTCTGTCTGCCTCTGTGGGCGACAGAGTGACCATCACCTGCACAAGCGACCAGTCACTGTTTAATGTCCGCAGCGGCAAAAACTATCTTGCGTGGTATCAGCAGAAGCCTGGCAAGGCTCCCAAGCTGCTGATCTACTGGGCCAGTGACCGAGAATCCGGCGTGCCTTCCAGATTCTCCGGCTCTGGCTCTGGCACCGATTTCACCCTGACCATCTCCTCCCTCCAGCCTGAGGATTTCGCCACCTACTACTGCAAACAGTCTTACGACCTTTTCACTTTTGGCGGCGGAACAAAGGTGGAGATCaag 289 2B5-1038_VH GAAGTGCAGCTTGTTGAATCTGGCGGCGGTTTGGTTCAGCCCGGTGGATCACTGCGACTCAGTTGCGCAGCTAGCGGCTTCACCTTTTCTGATTACTACATGACATGGGTACGACAGGCGCCAGGCAAGGGTTTGGAATGGGTAGCATTCATACGCAATCAGGCACGCGGGTACACTTCAGACCACAATCCCTCAGTAAAAGGAAGATTTACCATCTCAAGAGACAATGCCAAAAATTCACTCTACCTGCAAATGAACTCACTTCGCGCCGAGGATACCGCCGTGTATTACTGTGCCAGAGACAGACCATCTTATTACGTGCTGGACTATTGGGGACAGGGCACTACAGTCACCGTCAGCTCT 290 2B5-1039_VL GACATCCAGATGACCCAGTCCCCCTCTTCTCTGTCTGCCTCTGTGGGCGACAGAGTGACCATCACCTGCACAAGCTCAGAGTCACTGTTTAATGTCCGCAGCGGCAAAAACTATCTTGCGTGGTATCAGCAGAAGCCTGGCAAGGCTCCCAAGCTGCTGATCTACTGGGCCAGTGACCGAGAATCCGGCGTGCCTTCCAGATTCTCCGGCTCTGGCTCTGGCACCGATTTCACCCTGACCATCTCCTCCCTCCAGCCTGAGGATTTCGCCACCTACTACTGCAAACAGTCTTACGACCTTTTCACTTTTGGCGGCGGAACAAAGGTGGAGATCAAG 291 2B5-1039_VH GAAGTGCAGCTTGTTGAATCTGGCGGCGGTTTGGTTCAGCCCGGTGGATCACTGCGACTCAGTTGCGCAGCTAGCGGCTTCACCTTTTCTGATTACTACATGACATGGGTACGACAGGCGCCAGGCAAGGGTTTGGAATGGGTAGCATTCATACGCAATCAGGCACGCGGGTACACTTCAGACCACAATCCCTCAGTAAAAGGAAGATTTACCATCTCAAGAGACAATGCCAAAAATTCACTCTACCTGCAAATGAACTCACTTCGCGCCGAGGATACCGCCGTGTATTACTGTGCCAGAGACAGACCATCTTATTACGTGCTGGACTATTGGGGACAGGGCACTACAGTCACCGTCAGCTCT 292 2B5-1040_VL GACATCCAGATGACCCAGTCCCCCTCTTCTCTGTCTGCCTCTGTGGGCGACAGAGTGACCATCACCTGCACAAGCTCACAGTCACTGTTTAATGTCCGCAGCGGCAAAAACTATCTTGCGTGGTATCAGCAGAAGCCTGGCAAGGCTCCCAAGCTGCTGATCTACTGGGCCAGTGACCGAGAATCCGGCGTGCCTTCCAGATTCTCCGGCTCTGGCTCTGGCACCGATTTCACCCTGACCATCTCCTCCCTCCAGCCTGAGGATTTCGCCACCTACTACTGCAAACAGTCTTACGACCTTTTCACTTTTGGCGGCGGAACAAAGGTGGAGATCAAG 293 2B5-1040_VH GAAGTGCAGCTTGTTGAATCTGGCGGCGGTTTGGTTCAGCCCGGTGGATCACTGCGACTCAGTTGCGCAGCTAGCGGCTTCACCTTTTCTGATTACTACATGACATGGGTACGACAGGCGCCAGGCAAGGGTTTGGAATGGGTAGCATTCATACGCAATCAGGCACGCGGGTACACTTCAGACCACAATCCCTCAGTAAAAGGAAGATTTACCATCTCAAGAGACAATGCCAAAAATTCACTCTACCTGCAAATGAACTCACTTCGCGCCGAGGATACCGCCGTGTATTACTGTGCCAGAGACAGACCATCTTATTACGTGCTGGACTATTGGGGACAGGGCACTACAGTCACCGTCAGCTCT 294 GUCY2C-1696_VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTRWMHWVRQAPGKGLEWIGEIKPSNKLTNVHEKFKDRFTISVDKAKNSAYLQMNSLRAEDTAVYYCARTITTTEGYWFLSDWGQGTLVTVSS 295 GUCY2C-1696_VL DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVDYYGHSLMQWYQQKPGKAPKLLIYAASKLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTRKAYTFGQGTKLEIK 296 GUCY2C-1701_VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMHWVRQAPGKGLEWIGEIKPSNELTNVHEKFKDRFTISVDKAKNSAYLQMNSLRAEDTAVYYCTRTITTPLGYWFFDVWGQGTLVTVSS 297 GUCY2C-1701_VL DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVDYYGSSLMQWYQQKPGKAPKLLIYAASKLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTRKAYTFGQGTKLEIK 298 GUCY2C-1702_VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMHWVRQAPGKGLEWIGEIKPSNELTNVHEKFKDRFTISVDKAKNSAYLQMNSLRAEDTAVYYCTRTITTPLGYWFFDVWGQGTLVTVSS 299 GUCY2C-1702_VL DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVDYYGSSLMQWYQQKPGKAPKLLIYAASKLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTRKAYTFGQGTKLEIK 300 GUCY2C-1703_VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMHWVRQAPGKGLEWIGEIKPSNRWNNVHEKFKDRFTISVDKAKNSAYLQMNSLRAEDTAVYYCTRTITTTEGYWFFDVWGQGTLVTVSS 301 GUCY2C-1703_VL DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVDYYGSSLMQWYQQKPGKAPKLLIYAASKLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTRKAYTFGQGTKLEIK 302 GUCY2C-1705_VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMHWVRQAPGKGLEWIGEIKPSRGFTNVHEKFKDRFTISVDKAKNSAYLQMNSLRAEDTAVYYCTRTITTTEGYWFFDVWGQGTLVTVSS 303 GUCY2C-1705_VL DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVDYYGSSLMQWYQQKPGKAPKLLIYAASKLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTRKAYTFGQGTKLEIK 304 GUCY2C-1706_VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSTWMHWVRQAPGKGLEWIGEIKPSNELTNVHEKFKDRFTISVDKAKNSAYLQMNSLRAEDTAVYYCTRTITTTEGYWFFDVWGQGTLVTVSS 305 GUCY2C-1706_VL DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVDYYGSSLMQWYQQKPGKAPKLLIYAASKLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTRKAYTFGQGTKLEIK 306 GUCY2C-1708_VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRPWMHWVRQAPGKGLEWIGEIKPSTGWTNVHEKFKDRFTISVDKAKNSAYLQMNSLRAEDTAVYYCTRTITTTTGYWFFDVWGQGTLVTVSS 307 GUCY2C-1708_VL DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVDYYKHSLMQWYQQKPGKAPKLLIYAASKLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTRKAYTFGQGTKLEIK 308 GUCY2C-1710_VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMHWVRQAPGKGLEWIGEIKPSRGWTNVHEKFKDRFTISVDKAKNSAYLQMNSLRAEDTAVYYCARTITTTEGYWFFDVWGQGTLVTVSS 309 GUCY2C-1710_VL DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVDYYRHSLMQWYQQKPGKAPKLLIYAASKLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTRKAYTFGQGTKLEIK 310 GUCY2C-1713_VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSHTWMHWVRQAPGKGLEWIGEIKPSRGFTNVHEKFKDRFTISVDKAKNSAYLQMNSLRAEDTAVYYCTRTITTTQGYWFFDVWGQGTLVTVSS 311 GUCY2C-1713_VL DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVNWYGSSLMQWYQQKPGKAPKLLIYAASKLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTRKAYTFGQGTKLEIK 312 GUCY2C-1714_VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSHTWMHWVRQAPGKGLEWIGEIKPSTKYTNVHEKFKDRFTISVDKAKNSAYLQMNSLRAEDTAVYYCARTIFTREGYWFFDVWGQGTLVTVSS 313 GUCY2C-1714_VL DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVNWYGSSLMQWYQQKPGKAPKLLIYAASKLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTRKAYTFGQGTKLEIK 314 GUCY2C-1715_VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMHWVRQAPGKGLEWIGEIKPSTKYTNVHEKFKDRFTISVDKAKNSAYLQMNSLRAEDTAVYYCTRTIFTNEGYWFFDVWGQGTLVTVSS 315 GUCY2C-1715_VL DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVSIYGSSLMQWYQQKPGKAPKLLIYAASKLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTRKAYTFGQGTKLEIK 316 Пептид 1 GUCY2C_ECD MKTLLLDLALWSLLFQPGWL 317 Пептид 2 GUCY2C_ECD LDLALWSLLFQPGWLSFSSQ 318 Пептид 3 GUCY2C_ECD WSLLFQPGWLSFSSQVSQNC 319 Пептид 4 GUCY2C_ECD QPGWLSFSSQVSQNCHNGSY 320 Пептид 5 GUCY2C_ECD SFSSQVSQNCHNGSYEISVL 321 Пептид 6 GUCY2C_ECD VSQNCHNGSYEISVLMMGNS 322 Пептид 7 GUCY2C_ECD HNGSYEISVLMMGNSAFAEP 323 Пептид 8 GUCY2C_ECD EISVLMMGNSAFAEPLKNLE 324 Пептид 9 GUCY2C_ECD MMGNSAFAEPLKNLEDAVNE 325 Пептид 10 GUCY2C_ECD AFAEPLKNLEDAVNEGLEIV 326 Пептид 11 GUCY2C_ECD LKNLEDAVNEGLEIVRGRLQ 327 Пептид 12 GUCY2C_ECD DAVNEGLEIVRGRLQNAGLN 328 Пептид 13 GUCY2C_ECD GLEIVRGRLQNAGLNVTVNA 329 Пептид 14 GUCY2C_ECD RGRLQNAGLNVTVNATFMYS 330 Пептид 15 GUCY2C_ECD NAGLNVTVNATFMYSDGLIH 331 Пептид 16 GUCY2C_ECD VTVNATFMYSDGLIHNSGDC 332 Пептид 17 GUCY2C_ECD TFMYSDGLIHNSGDCRSSTC 333 Пептид 18 GUCY2C_ECD DGLIHNSGDCRSSTCEGLDL 334 Пептид 19 GUCY2C_ECD NSGDCRSSTCEGLDLLRKIS 335 Пептид 20 GUCY2C_ECD RSSTCEGLDLLRKISNAQRM 336 Пептид 21 GUCY2C_ECD EGLDLLRKISNAQRMGCVLI 337 Пептид 22 GUCY2C_ECD LRKISNAQRMGCVLIGPSCT 338 Пептид 23 GUCY2C_ECD NAQRMGCVLIGPSCTYSTFQ 339 Пептид 24 GUCY2C_ECD GCVLIGPSCTYSTFQMYLDT 340 Пептид 25 GUCY2C_ECD GPSCTYSTFQMYLDTELSYP 341 Пептид 26 GUCY2C_ECD YSTFQMYLDTELSYPMISAG 342 Пептид 27 GUCY2C_ECD MYLDTELSYPMISAGSFGLS 343 Пептид 28 GUCY2C_ECD ELSYPMISAGSFGLSCDYKE 344 Пептид 29 GUCY2C_ECD MISAGSFGLSCDYKETLTRL 345 Пептид 30 GUCY2C_ECD SFGLSCDYKETLTRLMSPAR 346 Пептид 31 GUCY2C_ECD CDYKETLTRLMSPARKLMYF 347 Пептид 32 GUCY2C_ECD TLTRLMSPARKLMYFLVNFW 348 Пептид 33 GUCY2C_ECD MSPARKLMYFLVNFWKTNDL 349 Пептид 34 GUCY2C_ECD KLMYFLVNFWKTNDLPFKTY 350 Пептид 35 GUCY2C_ECD LVNFWKTNDLPFKTYSWSTS 351 Пептид 36 GUCY2C_ECD KTNDLPFKTYSWSTSYVYKN 352 Пептид 37 GUCY2C_ECD PFKTYSWSTSYVYKNGTETE 353 Пептид 38 GUCY2C_ECD SWSTSYVYKNGTETEDCFWY 354 Пептид 39 GUCY2C_ECD YVYKNGTETEDCFWYLNALE 355 Пептид 40 GUCY2C_ECD GTETEDCFWYLNALEASVSY 356 Пептид 41 GUCY2C_ECD DCFWYLNALEASVSYFSHEL 357 Пептид 42 GUCY2C_ECD LNALEASVSYFSHELGFKVV 358 Пептид 43 GUCY2C_ECD ASVSYFSHELGFKVVLRQDK 359 Пептид 44 GUCY2C_ECD FSHELGFKVVLRQDKEFQDI 360 Пептид 45 GUCY2C_ECD GFKVVLRQDKEFQDILMDHN 361 Пептид 46 GUCY2C_ECD LRQDKEFQDILMDHNRKSNV 362 Пептид 47 GUCY2C_ECD EFQDILMDHNRKSNVIIMCG 363 Пептид 48 GUCY2C_ECD LMDHNRKSNVIIMCGGPEFL 364 Пептид 49 GUCY2C_ECD RKSNVIIMCGGPEFLYKLKG 365 Пептид 50 GUCY2C_ECD IIMCGGPEFLYKLKGDRAVA 366 Пептид 51 GUCY2C_ECD GPEFLYKLKGDRAVAEDIVI 367 Пептид 52 GUCY2C_ECD YKLKGDRAVAEDIVIILVDL 368 Пептид 53 GUCY2C_ECD DRAVAEDIVIILVDLFNDQY 369 Пептид 54 GUCY2C_ECD EDIVIILVDLFNDQYLEDNV 370 Пептид 55 GUCY2C_ECD ILVDLFNDQYLEDNVTAPDY 371 Пептид 56 GUCY2C_ECD FNDQYLEDNVTAPDYMKNVL 372 Пептид 57 GUCY2C_ECD LEDNVTAPDYMKNVLVLTLS 373 Пептид 58 GUCY2C_ECD TAPDYMKNVLVLTLSPGNSL 374 Пептид 59 GUCY2C_ECD MKNVLVLTLSPGNSLLNSSF 375 Пептид 60 GUCY2C_ECD MKNVLVLTLSPGNSLLNSSF 376 Пептид 61 GUCY2C_ECD VLTLSPGNSLLNSSFSRNLS 377 Пептид 62 GUCY2C_ECD PGNSLLNSSFSRNLSPTKRD 378 Пептид 63 GUCY2C_ECD LNSSFSRNLSPTKRDFALAY 379 Пептид 64 GUCY2C_ECD SRNLSPTKRDFALAYLNGIL 380 Пептид 65 GUCY2C_ECD PTKRDFALAYLNGILLFGHM 381 Пептид 66 GUCY2C_ECD FALAYLNGILLFGHMLKIFL 382 Пептид 67 GUCY2C_ECD LNGILLFGHMLKIFLENGEN 383 Пептид 68 GUCY2C_ECD LFGHMLKIFLENGENITTPK 384 Пептид 69 GUCY2C_ECD LKIFLENGENITTPKFAHAF 385 Пептид 70 GUCY2C_ECD ENGENITTPKFAHAFRNLTF 386 Пептид 71 GUCY2C_ECD ITTPKFAHAFRNLTFEGYDG 387 Пептид 72 GUCY2C_ECD FAHAFRNLTFEGYDGPVTLD 388 Пептид 73 GUCY2C_ECD RNLTFEGYDGPVTLDDWGDV 389 Пептид 74 GUCY2C_ECD EGYDGPVTLDDWGDVDSTMV 390 Пептид 75 GUCY2C_ECD PVTLDDWGDVDSTMVLLYTS 391 Пептид 76 GUCY2C_ECD DWGDVDSTMVLLYTSVDTKK 392 Пептид 77 GUCY2C_ECD DSTMVLLYTSVDTKKYKVLL 393 Пептид 78 GUCY2C_ECD LLYTSVDTKKYKVLLTYDTH 394 Пептид 79 GUCY2C_ECD VDTKKYKVLLTYDTHVNKTY 395 Пептид 80 GUCY2C_ECD YKVLLTYDTHVNKTYPVDMS 396 Пептид 81 GUCY2C_ECD TYDTHVNKTYPVDMSPTFTW 397 Пептид 82 GUCY2C_ECD VNKTYPVDMSPTFTWKNSKL 398 Пептид 83 GUCY2C_ECD PVDMSPTFTWKNSKLPNDIT 399 Пептид 84 GUCY2C_ECD PTFTWKNSKLPNDITGRGPQ 400 Пептид 85 GUCY2C_ECD KNSKLPNDITGRGPQILMIA 401 Пептид 86 GUCY2C_ECD PNDITGRGPQILMIAVFTLT 402 Пептид 87 GUCY2C_ECD LRKISNAQRMGCVLIGPSCT 403 Пептид 88 GUCY2C_ECD NAQRMGCVLIGPSCTYSTFQ 404 Пептид 89 GUCY2C_ECD GCVLIGPSCTYSTFQMYLDT 405 Пептид GUCY2C_ECD NSGDCRSSTCEGLDLLRKISNAQRM 406 Пептид GUCY2C_ECD RSSTCEGLDLLRKIS 407 GUCY2C-1637_VH DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCTSSQSLFNVRSQKNYLAWYQQKPGKAPKLLIYWASTRESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCKQSYDLFTFGGGTKVEIKGGGGSGGGGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMHWVRQAPGKGLEWIGEIKPSNELTNVHEKFKDRFTISVDKAKNSAYLQMNSLRAEDTAVYYCTRTITTTEGYWFFDVWGQGTLVTVSSGGCGGHHHHHH 408 GUCY2C-1637_VL DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVDYYGSSLLQWYQQKPGKAPKLLIYAASKLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTRKAYTFGQGTKLEIKGGGSGGGGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMTWVRQAPGKGLEWVAFIRNQARGYTSDHNPSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRPSYYVLDYWGQGTTVTVSSGGCGGDYKDDDDK 409 GUCY2C-1608_scFv evqlvesggglvqpggslrlscaasgftfssywmhwvrqapgkglewigeikpsneltnvhekfkdrftisvdkaknsaylqmnslraedtavyyctrtitttegywffdvwgqgtlvtvssggggsggggsggggsgdiqltqspsslsasvgdrvtitcrasesvdyygssllqwyqqkpgkapklliyaasklasgvpsrfsgsgsgtdftltisslqpedfatyycqqtrkaytfgqgtkleiktgsenlyfq 410 CID1814 MQLLRCFSIFSVIASVLAQEGKPIPNPLLGLDSTGGGSGGGAQAAGAHSSQVSQNCHNGSYEISVLMMGNSAFAEPLKNLEDAVNEGLEIVRGRLQNAGLNVTVNATFMYSDGLIHNSGDCRSSTCEGLDLLRKISNAQRMGCVLIGPSCTYSTFQMYLDTELSYPMISAGSFGLSCDYKETLTRLMSPARKLMYFLVNFWKTNDLPFKTYSWSTSYVYKNGTETEDCFWYLNALEASVSYFSHELGFKVVLRQDKEFQDILMDHNRKSNVIIMCGGPEFLYKLKGDRAVAEDIVIILVDLFNDQYFEDNVTAPDYMKNVLVLTLSPGNSLLNSSFSRNLSPTKRDFALAYLNGILLFGHMLKIFLENGENITTPKFAHAFRNLTFEGYDGPVTLDDWGDVDSTMVLLYTSVDTKKYKVLLTYDTHVNKTYPVDMSPTFTWKNSKLPNDITGRGPQRTSDQASGAHHHHHHGAYPYDVPDYAGHGTSGGGGSGGTSTPSYTTSIISTETPSHSTPSSSTSITTTETPSHSTPSYTSSVSTSETTSHSTPSETSSSRTTESTSYSSPSSTSSNTITETSSHSTPSTATSISSTETPSSSIPSVSSSITVTESSSHSTPGATSTLTSSETSTWSTPSSTSSIMSSSYTSADTPSETSVYTSSETPSSSSPTSTSLISSSKSTSTSTPSFTSSITSTETSSYSASSYTPSVSSTASSSKNTTSSTASISSAETVSSSSSSVSSTIPSSQSTSYSTPSFSSSATSSVTPLHSTPSLPSWVTTSKTTSHITPGLTSSMSSSETYSHSTPGFTSSITSTESTSESTPSLSSSTIYSTVSTSTTAITSHFTTSETAVTPTPVTPSSLSTDIPTTSLRTLTPSSVGTSTSLTTTTDFPSIPTDISTLPTRTHIISSSPSIQSTETSSLVGTTSPTMSTVRMTLRITENTPISSFSTSIVVIPETPTQTPPVLTSATGTQTSPAPTTVTFGSTDSSTSTLHKLQGDSGETIGKYIGAADSLGGSVLLLALAPLVLLSLL 411 CID1815 MQLLRCFSIFSVIASVLAQEGKPIPNPLLGLDSTGGGSGGGAQAAGAHSSQVRQKCHNGTYEISVLMMDNSAYKEPLQNLRDAVEEGLDIVRKRLREAELNVTVNATFIYSDGLIHKSGDCRSSTCEGLDLLREITRDRKMGCVLMGPSCTYSTFQMYLDTELNYPMISAGSFGLSCDYKETLTRILPPARKLMYFLVDFWKVNNAPFKTFSWNSSYVYKNGSEPEDCFWYLNALEAGVSYFSEVLSFKDVLRRSEQFQEILMGRNRKSNVIVMCGTPETFYNVKGDLKVADDTVVILVDLFSNHYFEDDTRAPEYMDNVLVLTLPPEKFIANASVSGRFPSERSDFSLAYLEGTLLFGHMLQTFLENGESVTTPKFARAFRNLTFQGLEGPVTLDDSGDIDNIMCLLYVSLDTRKYKVLMAYDTHKNQTIPVATSPNFIWKNHRLPNDVPGLGPQRTSDQASGAHHHHHHGAYPYDVPDYAGHGTSGGGGSGGTSTPSYTTSIISTETPSHSTPSSSTSITTTETPSHSTPSYTSSVSTSETTSHSTPSETSSSRTTESTSYSSPSSTSSNTITETSSHSTPSTATSISSTETPSSSIPSVSSSITVTESSSHSTPGATSTLTSSETSTWSTPSSTSSIMSSSYTSADTPSETSVYTSSETPSSSSPTSTSLISSSKSTSTSTPSFTSSITSTETSSYSASSYTPSVSSTASSSKNTTSSTASISSAETVSSSSSSVSSTIPSSQSTSYSTPSFSSSATSSVTPLHSTPSLPSWVTTSKTTSHITPGLTSSMSSSETYSHSTPGFTSSITSTESTSESTPSLSSSTIYSTVSTSTTAITSHFTTSETAVTPTPVTPSSLSTDIPTTSLRTLTPSSVGTSTSLTTTTDFPSIPTDISTLPTRTHIISSSPSIQSTETSSLVGTTSPTMSTVRMTLRITENTPISSFSTSIVVIPETPTQTPPVLTSATGTQTSPAPTTVTFGSTDSSTSTLHKLQGDSGETIGKYIGAADSLGGSVLLLALAPLVLLSLL 412 CID1818 MQLLRCFSIFSVIASVLAQEGKPIPNPLLGLDSTGGGSGGGAQAAGAHSSSRCNNNNYMINVMLMPDSDFPSTSENLTSAVEEALSTIQNELETEGVKVTVNASFHHFRSSLYVSQGCRTSTCEGVELIKQIFENGTLGCAVIGPACTYATYQMVSVETIPSLPLISVGSFGLSCDYKENLTRLLTPARKVNDFFYYFWNEIQQPFKTSTWESVYLYKKTDNSEQCLWYMNALDAGVTQFSEKLKFKDIVRTQDQFRRLVKNPKRKSNVIIMCGTPADIRQDLGTETVDKDIVIILIDLFKNTYFRNTTSARYMQNVLVLTLPPANNNFSTRTTDTSLLEDDFVIGYYNAVLLFGHILKKFIFSQSPVLPTSFINEFRNITFEGAQGPVTLDEFGDIDNNLTLLYTTQSASDPQYRVLMYFNTQENDTYVVSTSPDFIWKSHRLPSDIPSTGPHRTSDQASGAHHHHHHGAYPYDVPDYAGHGTSGGGGSGGTSTPSYTTSIISTETPSHSTPSSSTSITTTETPSHSTPSYTSSVSTSETTSHSTPSETSSSRTTESTSYSSPSSTSSNTITETSSHSTPSTATSISSTETPSSSIPSVSSSITVTESSSHSTPGATSTLTSSETSTWSTPSSTSSIMSSSYTSADTPSETSVYTSSETPSSSSPTSTSLISSSKSTSTSTPSFTSSITSTETSSYSASSYTPSVSSTASSSKNTTSSTASISSAETVSSSSSSVSSTIPSSQSTSYSTPSFSSSATSSVTPLHSTPSLPSWVTTSKTTSHITPGLTSSMSSSETYSHSTPGFTSSITSTESTSESTPSLSSSTIYSTVSTSTTAITSHFTTSETAVTPTPVTPSSLSTDIPTTSLRTLTPSSVGTSTSLTTTTDFPSIPTDISTLPTRTHIISSSPSIQSTETSSLVGTTSPTMSTVRMTLRITENTPISSFSTSIVVIPETPTQTPPVLTSATGTQTSPAPTTVTFGSTDSSTSTLHKLQGDSGETIGKYIGAADSLGGSVLLLALAPLVLLSLL 413 CID1868 MQLLRCFSIFSVIASVLAQEGKPIPNPLLGLDSTGGGSGGGAQAAGAHSSQVSQNCHNGSYEINVLMMGNSAFAEPLKNLEDAVNEGLEIVRGRLQNAGLNVTVNATFMYFDGLLHNSGDCRSSTCEGVDLLRKISNAQRMGCVLIGPSCTYSTFQMYLDTELSYPMISAGSFGLSCDYKETLTRLMSPARKLMYFLVNFWKTNDLPFKTYSWSTSYVYKNGTETEDCFWYLNALEASVSYFSHELGFKVVLRQDKEFQDILMDHNRKSNVIIMCGGPEFLYKLKGDRAVAEDIVIILVDLFNDQYFEDNVTAPDYMKNVLVLTLSPGNSLLNSSFSRNLSPTKRDFALAYLNGILLFGHMLKIFLENGENITTPKFAHAFRNLTFEGYDGPVTLDDWGDVDSTMVLLYTSVDTKKYKVLLTYDTHVNKTYPVDMSPTFTWKNSKLPNDITGRGPQRTSDQASGAHHHHHHGAYPYDVPDYAGHGTSGGGGSGGTSTPSYTTSIISTETPSHSTPSSSTSITTTETPSHSTPSYTSSVSTSETTSHSTPSETSSSRTTESTSYSSPSSTSSNTITETSSHSTPSTATSISSTETPSSSIPSVSSSITVTESSSHSTPGATSTLTSSETSTWSTPSSTSSIMSSSYTSADTPSETSVYTSSETPSSSSPTSTSLISSSKSTSTSTPSFTSSITSTETSSYSASSYTPSVSSTASSSKNTTSSTASISSAETVSSSSSSVSSTIPSSQSTSYSTPSFSSSATSSVTPLHSTPSLPSWVTTSKTTSHITPGLTSSMSSSETYSHSTPGFTSSITSTESTSESTPSLSSSTIYSTVSTSTTAITSHFTTSETAVTPTPVTPSSLSTDIPTTSLRTLTPSSVGTSTSLTTTTDFPSIPTDISTLPTRTHIISSSPSIQSTETSSLVGTTSPTMSTVRMTLRITENTPISSFSTSIVVIPETPTQTPPVLTSATGTQTSPAPTTVTFGSTDSSTSTLHKLQGDSGETIGKYIGAADSLGGSVLLLALAPLVLLSLL 414 CID1869 MQLLRCFSIFSVIASVLAQEGKPIPNPLLGLDSTGGGSGGGAQAAGAHSSQVSQNCHNGSYEISVLMMGDSDFAEPLKNLEDAVNEGLEIVRGRLQNAGLNVTVNATFMYSDGLIHNSGGCRSSTCEGLDLLRKISNAQRMGCVLIGPSCTYSTFQMYLDTELSYPMISAGSFGLSCDYKETLTRLMSPARKLMYFLVNFWKTNDLPFKTYSWSTSYVYKNGTETEDCFWYLNALEASVSYFSHELGFKVVLRQDKEFQDILMDHNRKSNVIIMCGGPEFLYKLKGDRAVAEDIVIILVDLFNDQYFEDNVTAPDYMKNVLVLTLSPGNSLLNSSFSRNLSPTKRDFALAYLNGILLFGHMLKIFLENGENITTPKFAHAFRNLTFEGYDGPVTLDDWGDVDSTMVLLYTSVDTKKYKVLLTYDTHVNKTYPVDMSPTFTWKNSKLPNDITGRGPQRTSDQASGAHHHHHHGAYPYDVPDYAGHGTSGGGGSGGTSTPSYTTSIISTETPSHSTPSSSTSITTTETPSHSTPSYTSSVSTSETTSHSTPSETSSSRTTESTSYSSPSSTSSNTITETSSHSTPSTATSISSTETPSSSIPSVSSSITVTESSSHSTPGATSTLTSSETSTWSTPSSTSSIMSSSYTSADTPSETSVYTSSETPSSSSPTSTSLISSSKSTSTSTPSFTSSITSTETSSYSASSYTPSVSSTASSSKNTTSSTASISSAETVSSSSSSVSSTIPSSQSTSYSTPSFSSSATSSVTPLHSTPSLPSWVTTSKTTSHITPGLTSSMSSSETYSHSTPGFTSSITSTESTSESTPSLSSSTIYSTVSTSTTAITSHFTTSETAVTPTPVTPSSLSTDIPTTSLRTLTPSSVGTSTSLTTTTDFPSIPTDISTLPTRTHIISSSPSIQSTETSSLVGTTSPTMSTVRMTLRITENTPISSFSTSIVVIPETPTQTPPVLTSATGTQTSPAPTTVTFGSTDSSTSTLHKLQGDSGETIGKYIGAADSLGGSVLLLALAPLVLLSLL 415 CID1870 MQLLRCFSIFSVIASVLAQEGKPIPNPLLGLDSTGGGSGGGAQAAGAHSSQVSQNCHNGSYEISVLMMGNSAFAEPLKNLEDAVNEGLEIVRGRLQNAGLNVTVNATFMYSDGLIHNSGDCRSSTCEGLDLLRKISNAQRMGCVLIGPSCTYSTFQMVLDTELSYPMISAGSFGLSCDYKENLTRLMSPARKLMYFLVNFWKTNDLPFKTYSWSTSYVYKNGTETEDCFWYLNALEASVSYFSHELGFKVVLRQDKEFQDILMDHNRKSNVIIMCGGPEFLYKLKGDRAVAEDIVIILVDLFNDQYFEDNVTAPDYMKNVLVLTLSPGNSLLNSSFSRNLSPTKRDFALAYLNGILLFGHMLKIFLENGENITTPKFAHAFRNLTFEGYDGPVTLDDWGDVDSTMVLLYTSVDTKKYKVLLTYDTHVNKTYPVDMSPTFTWKNSKLPNDITGRGPQRTSDQASGAHHHHHHGAYPYDVPDYAGHGTSGGGGSGGTSTPSYTTSIISTETPSHSTPSSSTSITTTETPSHSTPSYTSSVSTSETTSHSTPSETSSSRTTESTSYSSPSSTSSNTITETSSHSTPSTATSISSTETPSSSIPSVSSSITVTESSSHSTPGATSTLTSSETSTWSTPSSTSSIMSSSYTSADTPSETSVYTSSETPSSSSPTSTSLISSSKSTSTSTPSFTSSITSTETSSYSASSYTPSVSSTASSSKNTTSSTASISSAETVSSSSSSVSSTIPSSQSTSYSTPSFSSSATSSVTPLHSTPSLPSWVTTSKTTSHITPGLTSSMSSSETYSHSTPGFTSSITSTESTSESTPSLSSSTIYSTVSTSTTAITSHFTTSETAVTPTPVTPSSLSTDIPTTSLRTLTPSSVGTSTSLTTTTDFPSIPTDISTLPTRTHIISSSPSIQSTETSSLVGTTSPTMSTVRMTLRITENTPISSFSTSIVVIPETPTQTPPVLTSATGTQTSPAPTTVTFGSTDSSTSTLHKLQGDSGETIGKYIGAADSLGGSVLLLALAPLVLLSLL 416 CID1871 MQLLRCFSIFSVIASVLAQEGKPIPNPLLGLDSTGGGSGGGAQAAGAHSSQVSQNCHNGSYEISVLMMGNSAFAEPLKNLEDAVNEGLEIVRGRLQNAGLNVTVNATFMYSDGLIHNSGDCRSSTCEGLDLLRKISNAQRMGCVLIGPSCTYSTFQMYLDTELSYPMISAGSFGLSCDYKETLTRLMSPARKLMYFLVNFWKTNDLPFKTYTWSTSYVYKNGTETEDCFWYLNALEASVSYFSHELGFKVVLRQDKEFQDILMDHNRKSNVIIMCGGPEFLYKLKGDRAVAEDIVIILVDLFNDQYFEDNVTAPDYMKNVLVLTLSPGNSLLNSSFSRNLSPTKRDFALAYLNGILLFGHMLKIFLENGENITTPKFAHAFRNLTFEGYDGPVTLDDWGDVDSTMVLLYTSVDTKKYKVLLTYDTHVNKTYPVDMSPTFTWKNSKLPNDITSRGPQRTSDQASGAHHHHHHGAYPYDVPDYAGHGTSGGGGSGGTSTPSYTTSIISTETPSHSTPSSSTSITTTETPSHSTPSYTSSVSTSETTSHSTPSETSSSRTTESTSYSSPSSTSSNTITETSSHSTPSTATSISSTETPSSSIPSVSSSITVTESSSHSTPGATSTLTSSETSTWSTPSSTSSIMSSSYTSADTPSETSVYTSSETPSSSSPTSTSLISSSKSTSTSTPSFTSSITSTETSSYSASSYTPSVSSTASSSKNTTSSTASISSAETVSSSSSSVSSTIPSSQSTSYSTPSFSSSATSSVTPLHSTPSLPSWVTTSKTTSHITPGLTSSMSSSETYSHSTPGFTSSITSTESTSESTPSLSSSTIYSTVSTSTTAITSHFTTSETAVTPTPVTPSSLSTDIPTTSLRTLTPSSVGTSTSLTTTTDFPSIPTDISTLPTRTHIISSSPSIQSTETSSLVGTTSPTMSTVRMTLRITENTPISSFSTSIVVIPETPTQTPPVLTSATGTQTSPAPTTVTFGSTDSSTSTLHKLQGDSGETIGKYIGAADSLGGSVLLLALAPLVLLSLL 417 CID1872 MQLLRCFSIFSVIASVLAQEGKPIPNPLLGLDSTGGGSGGGAQAAGAHSSQVSQNCHNGSYEISVLMMGNSAFAEPLKNLEDAVNEGLEIVRGRLQNAGLNVTVNATFMYSDGLIHNSGDCRSSTCEGLDLLRKISNAQRMGCVLIGPSCTYSTFQMYLDTELSYPMISAGSFGLSCDYKETLTRLMSPARKLMYFLVNFWKTNDLPFKTYSWSTSYVYKNGTETEDCFWYLNALEASVSYFSHELGFKVVLRQDKEFRDILMDHNRKSNVIIMCGGPAFLYKLKGTRAVAEDIVIILVDLFNDQYFRDNVTAPDYMKNVLVLTLSPGNSLLNSSFSRNLSPTKRDFALAYLNGILLFGHMLKIFLENGENITTPKFAHAFRNLTFEGYDGPVTLDDWGDVDSTMVLLYTSVDTKKYKVLLTYDTHVNKTYPVDMSPTFTWKNSKLPNDITGRGPQRTSDQASGAHHHHHHGAYPYDVPDYAGHGTSGGGGSGGTSTPSYTTSIISTETPSHSTPSSSTSITTTETPSHSTPSYTSSVSTSETTSHSTPSETSSSRTTESTSYSSPSSTSSNTITETSSHSTPSTATSISSTETPSSSIPSVSSSITVTESSSHSTPGATSTLTSSETSTWSTPSSTSSIMSSSYTSADTPSETSVYTSSETPSSSSPTSTSLISSSKSTSTSTPSFTSSITSTETSSYSASSYTPSVSSTASSSKNTTSSTASISSAETVSSSSSSVSSTIPSSQSTSYSTPSFSSSATSSVTPLHSTPSLPSWVTTSKTTSHITPGLTSSMSSSETYSHSTPGFTSSITSTESTSESTPSLSSSTIYSTVSTSTTAITSHFTTSETAVTPTPVTPSSLSTDIPTTSLRTLTPSSVGTSTSLTTTTDFPSIPTDISTLPTRTHIISSSPSIQSTETSSLVGTTSPTMSTVRMTLRITENTPISSFSTSIVVIPETPTQTPPVLTSATGTQTSPAPTTVTFGSTDSSTSTLHKLQGDSGETIGKYIGAADSLGGSVLLLALAPLVLLSLL 418 CID1873 MQLLRCFSIFSVIASVLAQEGKPIPNPLLGLDSTGGGSGGGAQAAGAHSSQVSQNCHNGSYEISVLMMGNSAFAEPLKNLEDAVNEGLEIVRGRLQNAGLNVTVNATFMYSDGLIHNSGDCRSSTCEGLDLLRKISNAQRMGCVLIGPSCTYSTFQMYLDTELSYPMISAGSFGLSCDYKETLTRLMSPARKLMYFLVNFWKTNDLPFKTYSWSTSYVYKNGTETEDCFWYLNALEASVSYFSHELGFKVVLRQDKEFQDILMDHNRKSNVIIMCGGPEFLYKLKGDRAVAEDIVIILVDLFNDQYFEDNVTAPDYMKNVLVLTLSPGNSLLNSSFSRNLSPTKRDFALAYLNGILLFGHMLKIFLENGENITTPKFAHEFRNITFEGYDGPVTLDDWGDVDSTMVLLYTSVDTKKYKVLLTYDTHVNKTYPVDMSPTFTWKNSKLPNDITGRGPQRTSDQASGAHHHHHHGAYPYDVPDYAGHGTSGGGGSGGTSTPSYTTSIISTETPSHSTPSSSTSITTTETPSHSTPSYTSSVSTSETTSHSTPSETSSSRTTESTSYSSPSSTSSNTITETSSHSTPSTATSISSTETPSSSIPSVSSSITVTESSSHSTPGATSTLTSSETSTWSTPSSTSSIMSSSYTSADTPSETSVYTSSETPSSSSPTSTSLISSSKSTSTSTPSFTSSITSTETSSYSASSYTPSVSSTASSSKNTTSSTASISSAETVSSSSSSVSSTIPSSQSTSYSTPSFSSSATSSVTPLHSTPSLPSWVTTSKTTSHITPGLTSSMSSSETYSHSTPGFTSSITSTESTSESTPSLSSSTIYSTVSTSTTAITSHFTTSETAVTPTPVTPSSLSTDIPTTSLRTLTPSSVGTSTSLTTTTDFPSIPTDISTLPTRTHIISSSPSIQSTETSSLVGTTSPTMSTVRMTLRITENTPISSFSTSIVVIPETPTQTPPVLTSATGTQTSPAPTTVTFGSTDSSTSTLHKLQGDSGETIGKYIGAADSLGGSVLLLALAPLVLLSLL 419 CID1874 MQLLRCFSIFSVIASVLAQEGKPIPNPLLGLDSTGGGSGGGAQAAGAHSSQVSQNCHNGSYEISVLMMGNSAFAEPLKNLEDAVNEGLEIVRGRLQNAGLNVTVNATFMYSDGLIHNSGDCRTSTCEGVELIKQIFENGTLGCVLIGPSCTYSTFQMYLDTELSYPMISAGSFGLSCDYKETLTRLMSPARKLMYFLVNFWKTNDLPFKTYSWSTSYVYKNGTETEDCFWYLNALEASVSYFSHELGFKVVLRQDKEFQDILMDHNRKSNVIIMCGGPEFLYKLKGDRAVAEDIVIILVDLFNDQYFEDNVTAPDYMKNVLVLTLSPGNSLLNSSFSRNLSPTKRDFALAYLNGILLFGHMLKIFLENGENITTPKFAHAFRNLTFEGYDGPVTLDDWGDVDSTMVLLYTSVDTKKYKVLLTYDTHVNKTYPVDMSPTFTWKNSKLPNDITGRGPQRTSDQASGAHHHHHHGAYPYDVPDYAGHGTSGGGGSGGTSTPSYTTSIISTETPSHSTPSSSTSITTTETPSHSTPSYTSSVSTSETTSHSTPSETSSSRTTESTSYSSPSSTSSNTITETSSHSTPSTATSISSTETPSSSIPSVSSSITVTESSSHSTPGATSTLTSSETSTWSTPSSTSSIMSSSYTSADTPSETSVYTSSETPSSSSPTSTSLISSSKSTSTSTPSFTSSITSTETSSYSASSYTPSVSSTASSSKNTTSSTASISSAETVSSSSSSVSSTIPSSQSTSYSTPSFSSSATSSVTPLHSTPSLPSWVTTSKTTSHITPGLTSSMSSSETYSHSTPGFTSSITSTESTSESTPSLSSSTIYSTVSTSTTAITSHFTTSETAVTPTPVTPSSLSTDIPTTSLRTLTPSSVGTSTSLTTTTDFPSIPTDISTLPTRTHIISSSPSIQSTETSSLVGTTSPTMSTVRMTLRITENTPISSFSTSIVVIPETPTQTPPVLTSATGTQTSPAPTTVTFGSTDSSTSTLHKLQGDSGETIGKYIGAADSLGGSVLLLALAPLVLLSLL 420 CID1875 MQLLRCFSIFSVIASVLAQEGKPIPNPLLGLDSTGGGSGGGAQAAGAHSSQVSQNCHNGSYEISVLMMGNSAFAEPLKNLEDAVNEGLEIVRGRLQNAGLNVTVNATFMYSDGLIHNSGDCRSSTCEGLDLLRKISNAQRMGCVLIGPSCTYSTFQMYLDTELSYPMISAGSFGLSCDYKETLTRLMSPARKLMYFLVNFWNEIQQPFKTSTWESSYVYKNGTETEDCFWYLNALEASVSYFSHELGFKVVLRQDKEFQDILMDHNRKSNVIIMCGGPEFLYKLKGDRAVAEDIVIILVDLFNDQYFEDNVTAPDYMKNVLVLTLSPGNSLLNSSFSRNLSPTKRDFALAYLNGILLFGHMLKIFLENGENITTPKFAHAFRNLTFEGYDGPVTLDDWGDVDSTMVLLYTSVDTKKYKVLLTYDTHVNKTYPVDMSPTFTWKNSKLPNDITGRGPQRTSDQASGAHHHHHHGAYPYDVPDYAGHGTSGGGGSGGTSTPSYTTSIISTETPSHSTPSSSTSITTTETPSHSTPSYTSSVSTSETTSHSTPSETSSSRTTESTSYSSPSSTSSNTITETSSHSTPSTATSISSTETPSSSIPSVSSSITVTESSSHSTPGATSTLTSSETSTWSTPSSTSSIMSSSYTSADTPSETSVYTSSETPSSSSPTSTSLISSSKSTSTSTPSFTSSITSTETSSYSASSYTPSVSSTASSSKNTTSSTASISSAETVSSSSSSVSSTIPSSQSTSYSTPSFSSSATSSVTPLHSTPSLPSWVTTSKTTSHITPGLTSSMSSSETYSHSTPGFTSSITSTESTSESTPSLSSSTIYSTVSTSTTAITSHFTTSETAVTPTPVTPSSLSTDIPTTSLRTLTPSSVGTSTSLTTTTDFPSIPTDISTLPTRTHIISSSPSIQSTETSSLVGTTSPTMSTVRMTLRITENTPISSFSTSIVVIPETPTQTPPVLTSATGTQTSPAPTTVTFGSTDSSTSTLHKLQGDSGETIGKYIGAADSLGGSVLLLALAPLVLLSLL 421 CID1876 MQLLRCFSIFSVIASVLAQEGKPIPNPLLGLDSTGGGSGGGAQAAGAHSSQVSQNCHNGSYEISVLMMGNSAFAEPLKNLEDAVNEGLEIVRGRLQNAGLNVTVNATFMYSDGLIHNSGDCRSSTCEGLDLLRKISNAQRMGCVLIGPSCTYSTFQMYLDTELSYPMISAGSFGLSCDYKETLTRLMSPARKLMYFLVNFWKTNDLPFKTYSWSTSYVYKKTDNSEQCFWYLNALEASVSYFSHELGFKVVLRQDKEFQDILMDHNRKSNVIIMCGGPEFLYKLKGDRAVAEDIVIILVDLFNDQYFEDNVTAPDYMKNVLVLTLSPGNSLLNSSFSRNLSPTKRDFALAYLNGILLFGHMLKIFLENGENITTPKFAHAFRNLTFEGYDGPVTLDDWGDVDSTMVLLYTSVDTKKYKVLLTYDTHVNKTYPVDMSPTFTWKNSKLPNDITGRGPQRTSDQASGAHHHHHHGAYPYDVPDYAGHGTSGGGGSGGTSTPSYTTSIISTETPSHSTPSSSTSITTTETPSHSTPSYTSSVSTSETTSHSTPSETSSSRTTESTSYSSPSSTSSNTITETSSHSTPSTATSISSTETPSSSIPSVSSSITVTESSSHSTPGATSTLTSSETSTWSTPSSTSSIMSSSYTSADTPSETSVYTSSETPSSSSPTSTSLISSSKSTSTSTPSFTSSITSTETSSYSASSYTPSVSSTASSSKNTTSSTASISSAETVSSSSSSVSSTIPSSQSTSYSTPSFSSSATSSVTPLHSTPSLPSWVTTSKTTSHITPGLTSSMSSSETYSHSTPGFTSSITSTESTSESTPSLSSSTIYSTVSTSTTAITSHFTTSETAVTPTPVTPSSLSTDIPTTSLRTLTPSSVGTSTSLTTTTDFPSIPTDISTLPTRTHIISSSPSIQSTETSSLVGTTSPTMSTVRMTLRITENTPISSFSTSIVVIPETPTQTPPVLTSATGTQTSPAPTTVTFGSTDSSTSTLHKLQGDSGETIGKYIGAADSLGGSVLLLALAPLVLLSLL 422 CID1877 MQLLRCFSIFSVIASVLAQEGKPIPNPLLGLDSTGGGSGGGAQAAGAHSSQVSQNCHNGSYEISVLMMGNSAFAEPLKNLEDAVNEGLEIVRGRLQNAGLNVTVNATFMYSDGLIHNSGDCRSSTCEGLDLLRKISNAQRMGCVLIGPSCTYSTFQMYLDTELSYPMISAGSFGLSCDYKETLTRLMSPARKLMYFLVNFWKTNDLPFKTYSWSTSYVYKNGTETEDCFWYLNALEASVSYFSHELKFKDIVRTQKEFQDILMDHNRKSNVIIMCGGPEFLYKLKGDRAVAEDIVIILVDLFNDQYFEDNVTAPDYMKNVLVLTLSPGNSLLNSSFSRNLSPTKRDFALAYLNGILLFGHMLKIFLENGENITTPKFAHAFRNLTFEGYDGPVTLDDWGDVDSTMVLLYTSVDTKKYKVLLTYDTHVNKTYPVDMSPTFTWKNSKLPNDITGRGPQRTSDQASGAHHHHHHGAYPYDVPDYAGHGTSGGGGSGGTSTPSYTTSIISTETPSHSTPSSSTSITTTETPSHSTPSYTSSVSTSETTSHSTPSETSSSRTTESTSYSSPSSTSSNTITETSSHSTPSTATSISSTETPSSSIPSVSSSITVTESSSHSTPGATSTLTSSETSTWSTPSSTSSIMSSSYTSADTPSETSVYTSSETPSSSSPTSTSLISSSKSTSTSTPSFTSSITSTETSSYSASSYTPSVSSTASSSKNTTSSTASISSAETVSSSSSSVSSTIPSSQSTSYSTPSFSSSATSSVTPLHSTPSLPSWVTTSKTTSHITPGLTSSMSSSETYSHSTPGFTSSITSTESTSESTPSLSSSTIYSTVSTSTTAITSHFTTSETAVTPTPVTPSSLSTDIPTTSLRTLTPSSVGTSTSLTTTTDFPSIPTDISTLPTRTHIISSSPSIQSTETSSLVGTTSPTMSTVRMTLRITENTPISSFSTSIVVIPETPTQTPPVLTSATGTQTSPAPTTVTFGSTDSSTSTLHKLQGDSGETIGKYIGAADSLGGSVLLLALAPLVLLSLL 423 CID1878 MQLLRCFSIFSVIASVLAQEGKPIPNPLLGLDSTGGGSGGGAQAAGAHSSQVSQNCHNGSYEISVLMMGNSAFAEPLKNLEDAVNEGLEIVRGRLQNAGLNVTVNATFMYSDGLIHNSGDCRSSTCEGLDLLRKISNAQRMGCVLIGPSCTYSTFQMYLDTELSYPMISAGSFGLSCDYKETLTRLMSPARKLMYFLVNFWKTNDLPFKTYSWSTSYVYKNGTETEDCFWYLNALEASVSYFSHELGFKVVLRQDDQFRRLVKNPKRKSNVIIMCGGPEFLYKLKGDRAVAEDIVIILVDLFNDQYFEDNVTAPDYMKNVLVLTLSPGNSLLNSSFSRNLSPTKRDFALAYLNGILLFGHMLKIFLENGENITTPKFAHAFRNLTFEGYDGPVTLDDWGDVDSTMVLLYTSVDTKKYKVLLTYDTHVNKTYPVDMSPTFTWKNSKLPNDITGRGPQRTSDQASGAHHHHHHGAYPYDVPDYAGHGTSGGGGSGGTSTPSYTTSIISTETPSHSTPSSSTSITTTETPSHSTPSYTSSVSTSETTSHSTPSETSSSRTTESTSYSSPSSTSSNTITETSSHSTPSTATSISSTETPSSSIPSVSSSITVTESSSHSTPGATSTLTSSETSTWSTPSSTSSIMSSSYTSADTPSETSVYTSSETPSSSSPTSTSLISSSKSTSTSTPSFTSSITSTETSSYSASSYTPSVSSTASSSKNTTSSTASISSAETVSSSSSSVSSTIPSSQSTSYSTPSFSSSATSSVTPLHSTPSLPSWVTTSKTTSHITPGLTSSMSSSETYSHSTPGFTSSITSTESTSESTPSLSSSTIYSTVSTSTTAITSHFTTSETAVTPTPVTPSSLSTDIPTTSLRTLTPSSVGTSTSLTTTTDFPSIPTDISTLPTRTHIISSSPSIQSTETSSLVGTTSPTMSTVRMTLRITENTPISSFSTSIVVIPETPTQTPPVLTSATGTQTSPAPTTVTFGSTDSSTSTLHKLQGDSGETIGKYIGAADSLGGSVLLLALAPLVLLSLL 424 CID1879 MQLLRCFSIFSVIASVLAQEGKPIPNPLLGLDSTGGGSGGGAQAAGAHSSQVSQNCHNGSYEISVLMMGNSAFAEPLKNLEDAVNEGLEIVRGRLQNAGLNVTVNATFMYSDGLIHNSGDCRSSTCEGLDLLRKISNAQRMGCVLIGPSCTYSTFQMYLDTELSYPMISAGSFGLSCDYKETLTRLMSPARKLMYFLVNFWKTNDLPFKTYSWSTSYVYKNGTETEDCFWYLNALEASVSYFSHELGFKVVLRQDKEFQDILMDHNRKSNVIIMCGGPEFLYKLKGTETVDKDIVIILVDLFNDQYFEDNVTAPDYMKNVLVLTLSPGNSLLNSSFSRNLSPTKRDFALAYLNGILLFGHMLKIFLENGENITTPKFAHAFRNLTFEGYDGPVTLDDWGDVDSTMVLLYTSVDTKKYKVLLTYDTHVNKTYPVDMSPTFTWKNSKLPNDITGRGPQRTSDQASGAHHHHHHGAYPYDVPDYAGHGTSGGGGSGGTSTPSYTTSIISTETPSHSTPSSSTSITTTETPSHSTPSYTSSVSTSETTSHSTPSETSSSRTTESTSYSSPSSTSSNTITETSSHSTPSTATSISSTETPSSSIPSVSSSITVTESSSHSTPGATSTLTSSETSTWSTPSSTSSIMSSSYTSADTPSETSVYTSSETPSSSSPTSTSLISSSKSTSTSTPSFTSSITSTETSSYSASSYTPSVSSTASSSKNTTSSTASISSAETVSSSSSSVSSTIPSSQSTSYSTPSFSSSATSSVTPLHSTPSLPSWVTTSKTTSHITPGLTSSMSSSETYSHSTPGFTSSITSTESTSESTPSLSSSTIYSTVSTSTTAITSHFTTSETAVTPTPVTPSSLSTDIPTTSLRTLTPSSVGTSTSLTTTTDFPSIPTDISTLPTRTHIISSSPSIQSTETSSLVGTTSPTMSTVRMTLRITENTPISSFSTSIVVIPETPTQTPPVLTSATGTQTSPAPTTVTFGSTDSSTSTLHKLQGDSGETIGKYIGAADSLGGSVLLLALAPLVLLSLL 425 CID1880 MQLLRCFSIFSVIASVLAQEGKPIPNPLLGLDSTGGGSGGGAQAAGAHSSQVSQNCHNGSYEISVLMMGNSAFAEPLKNLEDAVNEGLEIVRGRLQNAGLNVTVNATFMYSDGLIHNSGDCRSSTCEGLDLLRKISNAQRMGCVLIGPSCTYSTFQMYLDTELSYPMISAGSFGLSCDYKETLTRLMSPARKLMYFLVNFWKTNDLPFKTYSWSTSYVYKNGTETEDCFWYLNALEASVSYFSHELGFKVVLRQDKEFQDILMDHNRKSNVIIMCGGPEFLYKLKGDRAVAEDIVIILVDLFNDQYFRNTTSARYMQNVLVLTLSPGNSLLNSSFSRNLSPTKRDFALAYLNGILLFGHMLKIFLENGENITTPKFAHAFRNLTFEGYDGPVTLDDWGDVDSTMVLLYTSVDTKKYKVLLTYDTHVNKTYPVDMSPTFTWKNSKLPNDITGRGPQRTSDQASGAHHHHHHGAYPYDVPDYAGHGTSGGGGSGGTSTPSYTTSIISTETPSHSTPSSSTSITTTETPSHSTPSYTSSVSTSETTSHSTPSETSSSRTTESTSYSSPSSTSSNTITETSSHSTPSTATSISSTETPSSSIPSVSSSITVTESSSHSTPGATSTLTSSETSTWSTPSSTSSIMSSSYTSADTPSETSVYTSSETPSSSSPTSTSLISSSKSTSTSTPSFTSSITSTETSSYSASSYTPSVSSTASSSKNTTSSTASISSAETVSSSSSSVSSTIPSSQSTSYSTPSFSSSATSSVTPLHSTPSLPSWVTTSKTTSHITPGLTSSMSSSETYSHSTPGFTSSITSTESTSESTPSLSSSTIYSTVSTSTTAITSHFTTSETAVTPTPVTPSSLSTDIPTTSLRTLTPSSVGTSTSLTTTTDFPSIPTDISTLPTRTHIISSSPSIQSTETSSLVGTTSPTMSTVRMTLRITENTPISSFSTSIVVIPETPTQTPPVLTSATGTQTSPAPTTVTFGSTDSSTSTLHKLQGDSGETIGKYIGAADSLGGSVLLLALAPLVLLSLL 426 CID1881 MQLLRCFSIFSVIASVLAQEGKPIPNPLLGLDSTGGGSGGGAQAAGAHSSQVSQNCHNGSYEISVLMMGNSAFAEPLKNLEDAVNEGLEIVRGRLQNAGLNVTVNATFMYSDGLIHNSGDCRSSTCEGLDLLRKISNAQRMGCVLIGPSCTYSTFQMYLDTELSYPMISAGSFGLSCDYKETLTRLMSPARKLMYFLVNFWKTNDLPFKTYSWSTSYVYKNGTETEDCFWYLNALEASVSYFSHELGFKVVLRQDKEFQDILMDHNRKSNVIIMCGGPEFLYKLKGDRAVAEDIVIILVDLFNDQYFEDNVTAPDYMKNVLVLTLSPGNSLLNSSFSRNLSPTKRDFALAYLNGILLFGHMLKIFLENGENITTPKFAHAFRNLTFEGYDGPVTLDDWGDVDSTMVLLYTSASDPQYRVLMYFNTHVNKTYPVDMSPTFTWKNSKLPNDITGRGPQRTSDQASGAHHHHHHGAYPYDVPDYAGHGTSGGGGSGGTSTPSYTTSIISTETPSHSTPSSSTSITTTETPSHSTPSYTSSVSTSETTSHSTPSETSSSRTTESTSYSSPSSTSSNTITETSSHSTPSTATSISSTETPSSSIPSVSSSITVTESSSHSTPGATSTLTSSETSTWSTPSSTSSIMSSSYTSADTPSETSVYTSSETPSSSSPTSTSLISSSKSTSTSTPSFTSSITSTETSSYSASSYTPSVSSTASSSKNTTSSTASISSAETVSSSSSSVSSTIPSSQSTSYSTPSFSSSATSSVTPLHSTPSLPSWVTTSKTTSHITPGLTSSMSSSETYSHSTPGFTSSITSTESTSESTPSLSSSTIYSTVSTSTTAITSHFTTSETAVTPTPVTPSSLSTDIPTTSLRTLTPSSVGTSTSLTTTTDFPSIPTDISTLPTRTHIISSSPSIQSTETSSLVGTTSPTMSTVRMTLRITENTPISSFSTSIVVIPETPTQTPPVLTSATGTQTSPAPTTVTFGSTDSSTSTLHKLQGDSGETIGKYIGAADSLGGSVLLLALAPLVLLSLL 427 CID1939 MQLLRCFSIFSVIASVLAQEGKPIPNPLLGLDSTGGGSGGGAQAAGAHSSSRCNNNNYMINVMLMPDSDFPSTSENLTSAVEEALSTIQNELETEGVKVTVNASFHHFRSSLYVSQGCRSSTCEGLDLLRKISNAQRMGCAVIGPACTYATYQMVSVETIPSLPLISVGSFGLSCDYKENLTRLLTPARKVNDFFYYFWNEIQQPFKTSTWESVYLYKKTDNSEQCLWYMNALDAGVTQFSEKLKFKDIVRTQDQFRRLVKNPKRKSNVIIMCGTPADIRQDLGTETVDKDIVIILIDLFKNTYFRNTTSARYMQNVLVLTLPPANNNFSTRTTDTSLLEDDFVIGYYNAVLLFGHILKKFIFSQSPVLPTSFINEFRNITFEGAQGPVTLDEFGDIDNNLTLLYTTQSASDPQYRVLMYFNTQENDTYVVSTSPDFIWKSHRLPSDIPSTGPHRTSDQASGAHHHHHHGAYPYDVPDYAGHGTSGGGGSGGTSTPSYTTSIISTETPSHSTPSSSTSITTTETPSHSTPSYTSSVSTSETTSHSTPSETSSSRTTESTSYSSPSSTSSNTITETSSHSTPSTATSISSTETPSSSIPSVSSSITVTESSSHSTPGATSTLTSSETSTWSTPSSTSSIMSSSYTSADTPSETSVYTSSETPSSSSPTSTSLISSSKSTSTSTPSFTSSITSTETSSYSASSYTPSVSSTASSSKNTTSSTASISSAETVSSSSSSVSSTIPSSQSTSYSTPSFSSSATSSVTPLHSTPSLPSWVTTSKTTSHITPGLTSSMSSSETYSHSTPGFTSSITSTESTSESTPSLSSSTIYSTVSTSTTAITSHFTTSETAVTPTPVTPSSLSTDIPTTSLRTLTPSSVGTSTSLTTTTDFPSIPTDISTLPTRTHIISSSPSIQSTETSSLVGTTSPTMSTVRMTLRITENTPISSFSTSIVVIPETPTQTPPVLTSATGTQTSPAPTTVTFGSTDSSTSTLHKLQGDSGETIGKYIGAADSLGGSVLLLALAPLVLLSLL 428 CID1940 MQLLRCFSIFSVIASVLAQEGKPIPNPLLGLDSTGGGSGGGAQAAGAHSSSRCNNNNYMINVMLMPDSDFPSTSENLTSAVEEALSTIQNELETEGVKVTVNASFHHFRSSLYVSQGCRSSTCEGLDLLRKISENGTLGCAVIGPACTYATYQMVSVETIPSLPLISVGSFGLSCDYKENLTRLLTPARKVNDFFYYFWNEIQQPFKTSTWESVYLYKKTDNSEQCLWYMNALDAGVTQFSEKLKFKDIVRTQDQFRRLVKNPKRKSNVIIMCGTPADIRQDLGTETVDKDIVIILIDLFKNTYFRNTTSARYMQNVLVLTLPPANNNFSTRTTDTSLLEDDFVIGYYNAVLLFGHILKKFIFSQSPVLPTSFINEFRNITFEGAQGPVTLDEFGDIDNNLTLLYTTQSASDPQYRVLMYFNTQENDTYVVSTSPDFIWKSHRLPSDIPSTGPHRTSDQASGAHHHHHHGAYPYDVPDYAGHGTSGGGGSGGTSTPSYTTSIISTETPSHSTPSSSTSITTTETPSHSTPSYTSSVSTSETTSHSTPSETSSSRTTESTSYSSPSSTSSNTITETSSHSTPSTATSISSTETPSSSIPSVSSSITVTESSSHSTPGATSTLTSSETSTWSTPSSTSSIMSSSYTSADTPSETSVYTSSETPSSSSPTSTSLISSSKSTSTSTPSFTSSITSTETSSYSASSYTPSVSSTASSSKNTTSSTASISSAETVSSSSSSVSSTIPSSQSTSYSTPSFSSSATSSVTPLHSTPSLPSWVTTSKTTSHITPGLTSSMSSSETYSHSTPGFTSSITSTESTSESTPSLSSSTIYSTVSTSTTAITSHFTTSETAVTPTPVTPSSLSTDIPTTSLRTLTPSSVGTSTSLTTTTDFPSIPTDISTLPTRTHIISSSPSIQSTETSSLVGTTSPTMSTVRMTLRITENTPISSFSTSIVVIPETPTQTPPVLTSATGTQTSPAPTTVTFGSTDSSTSTLHKLQGDSGETIGKYIGAADSLGGSVLLLALAPLVLLSLL 429 CID1941 MQLLRCFSIFSVIASVLAQEGKPIPNPLLGLDSTGGGSGGGAQAAGAHSSQVSQNCHNGSYEINVLMMGNSAFAEPLKNLEDAVNEGLEIVRGRLQNAGLNVTVNATFMYSDGLIHNSGDCRSSTCEGLDLLRKISNAQRMGCVLIGPSCTYSTFQMYLDTELSYPMISAGSFGLSCDYKETLTRLMSPARKLMYFLVNFWKTNDLPFKTYSWSTSYVYKNGTETEDCFWYLNALEASVSYFSHELGFKVVLRQDKEFQDILMDHNRKSNVIIMCGGPEFLYKLKGDRAVAEDIVIILVDLFNDQYFEDNVTAPDYMKNVLVLTLSPGNSLLNSSFSRNLSPTKRDFALAYLNGILLFGHMLKIFLENGENITTPKFAHAFRNLTFEGYDGPVTLDDWGDVDSTMVLLYTSVDTKKYKVLLTYDTHVNKTYPVDMSPTFTWKNSKLPNDITGRGPQRTSDQASGAHHHHHHGAYPYDVPDYAGHGTSGGGGSGGTSTPSYTTSIISTETPSHSTPSSSTSITTTETPSHSTPSYTSSVSTSETTSHSTPSETSSSRTTESTSYSSPSSTSSNTITETSSHSTPSTATSISSTETPSSSIPSVSSSITVTESSSHSTPGATSTLTSSETSTWSTPSSTSSIMSSSYTSADTPSETSVYTSSETPSSSSPTSTSLISSSKSTSTSTPSFTSSITSTETSSYSASSYTPSVSSTASSSKNTTSSTASISSAETVSSSSSSVSSTIPSSQSTSYSTPSFSSSATSSVTPLHSTPSLPSWVTTSKTTSHITPGLTSSMSSSETYSHSTPGFTSSITSTESTSESTPSLSSSTIYSTVSTSTTAITSHFTTSETAVTPTPVTPSSLSTDIPTTSLRTLTPSSVGTSTSLTTTTDFPSIPTDISTLPTRTHIISSSPSIQSTETSSLVGTTSPTMSTVRMTLRITENTPISSFSTSIVVIPETPTQTPPVLTSATGTQTSPAPTTVTFGSTDSSTSTLHKLQGDSGETIGKYIGAADSLGGSVLLLALAPLVLLSLL 430 CID1942 MQLLRCFSIFSVIASVLAQEGKPIPNPLLGLDSTGGGSGGGAQAAGAHSSQVSQNCHNGSYEISVLMMGNSAFAEPLKNLEDAVNEGLEIVRGRLQNAGLNVTVNATFMYFDGLIHNSGDCRSSTCEGLDLLRKISNAQRMGCVLIGPSCTYSTFQMYLDTELSYPMISAGSFGLSCDYKETLTRLMSPARKLMYFLVNFWKTNDLPFKTYSWSTSYVYKNGTETEDCFWYLNALEASVSYFSHELGFKVVLRQDKEFQDILMDHNRKSNVIIMCGGPEFLYKLKGDRAVAEDIVIILVDLFNDQYFEDNVTAPDYMKNVLVLTLSPGNSLLNSSFSRNLSPTKRDFALAYLNGILLFGHMLKIFLENGENITTPKFAHAFRNLTFEGYDGPVTLDDWGDVDSTMVLLYTSVDTKKYKVLLTYDTHVNKTYPVDMSPTFTWKNSKLPNDITGRGPQRTSDQASGAHHHHHHGAYPYDVPDYAGHGTSGGGGSGGTSTPSYTTSIISTETPSHSTPSSSTSITTTETPSHSTPSYTSSVSTSETTSHSTPSETSSSRTTESTSYSSPSSTSSNTITETSSHSTPSTATSISSTETPSSSIPSVSSSITVTESSSHSTPGATSTLTSSETSTWSTPSSTSSIMSSSYTSADTPSETSVYTSSETPSSSSPTSTSLISSSKSTSTSTPSFTSSITSTETSSYSASSYTPSVSSTASSSKNTTSSTASISSAETVSSSSSSVSSTIPSSQSTSYSTPSFSSSATSSVTPLHSTPSLPSWVTTSKTTSHITPGLTSSMSSSETYSHSTPGFTSSITSTESTSESTPSLSSSTIYSTVSTSTTAITSHFTTSETAVTPTPVTPSSLSTDIPTTSLRTLTPSSVGTSTSLTTTTDFPSIPTDISTLPTRTHIISSSPSIQSTETSSLVGTTSPTMSTVRMTLRITENTPISSFSTSIVVIPETPTQTPPVLTSATGTQTSPAPTTVTFGSTDSSTSTLHKLQGDSGETIGKYIGAADSLGGSVLLLALAPLVLLSLL 431 CID1943 MQLLRCFSIFSVIASVLAQEGKPIPNPLLGLDSTGGGSGGGAQAAGAHSSQVSQNCHNGSYEISVLMMGNSAFAEPLKNLEDAVNEGLEIVRGRLQNAGLNVTVNATFMYSDGLLHNSGDCRSSTCEGLDLLRKISNAQRMGCVLIGPSCTYSTFQMYLDTELSYPMISAGSFGLSCDYKETLTRLMSPARKLMYFLVNFWKTNDLPFKTYSWSTSYVYKNGTETEDCFWYLNALEASVSYFSHELGFKVVLRQDKEFQDILMDHNRKSNVIIMCGGPEFLYKLKGDRAVAEDIVIILVDLFNDQYFEDNVTAPDYMKNVLVLTLSPGNSLLNSSFSRNLSPTKRDFALAYLNGILLFGHMLKIFLENGENITTPKFAHAFRNLTFEGYDGPVTLDDWGDVDSTMVLLYTSVDTKKYKVLLTYDTHVNKTYPVDMSPTFTWKNSKLPNDITGRGPQRTSDQASGAHHHHHHGAYPYDVPDYAGHGTSGGGGSGGTSTPSYTTSIISTETPSHSTPSSSTSITTTETPSHSTPSYTSSVSTSETTSHSTPSETSSSRTTESTSYSSPSSTSSNTITETSSHSTPSTATSISSTETPSSSIPSVSSSITVTESSSHSTPGATSTLTSSETSTWSTPSSTSSIMSSSYTSADTPSETSVYTSSETPSSSSPTSTSLISSSKSTSTSTPSFTSSITSTETSSYSASSYTPSVSSTASSSKNTTSSTASISSAETVSSSSSSVSSTIPSSQSTSYSTPSFSSSATSSVTPLHSTPSLPSWVTTSKTTSHITPGLTSSMSSSETYSHSTPGFTSSITSTESTSESTPSLSSSTIYSTVSTSTTAITSHFTTSETAVTPTPVTPSSLSTDIPTTSLRTLTPSSVGTSTSLTTTTDFPSIPTDISTLPTRTHIISSSPSIQSTETSSLVGTTSPTMSTVRMTLRITENTPISSFSTSIVVIPETPTQTPPVLTSATGTQTSPAPTTVTFGSTDSSTSTLHKLQGDSGETIGKYIGAADSLGGSVLLLALAPLVLLSLL 432 CID1944 MQLLRCFSIFSVIASVLAQEGKPIPNPLLGLDSTGGGSGGGAQAAGAHSSQVSQNCHNGSYEISVLMMGNSAFAEPLKNLEDAVNEGLEIVRGRLQNAGLNVTVNATFMYSDGLIHNSGDCRTSTCEGLDLLRKISNAQRMGCVLIGPSCTYSTFQMYLDTELSYPMISAGSFGLSCDYKETLTRLMSPARKLMYFLVNFWKTNDLPFKTYSWSTSYVYKNGTETEDCFWYLNALEASVSYFSHELGFKVVLRQDKEFQDILMDHNRKSNVIIMCGGPEFLYKLKGDRAVAEDIVIILVDLFNDQYFEDNVTAPDYMKNVLVLTLSPGNSLLNSSFSRNLSPTKRDFALAYLNGILLFGHMLKIFLENGENITTPKFAHAFRNLTFEGYDGPVTLDDWGDVDSTMVLLYTSVDTKKYKVLLTYDTHVNKTYPVDMSPTFTWKNSKLPNDITGRGPQRTSDQASGAHHHHHHGAYPYDVPDYAGHGTSGGGGSGGTSTPSYTTSIISTETPSHSTPSSSTSITTTETPSHSTPSYTSSVSTSETTSHSTPSETSSSRTTESTSYSSPSSTSSNTITETSSHSTPSTATSISSTETPSSSIPSVSSSITVTESSSHSTPGATSTLTSSETSTWSTPSSTSSIMSSSYTSADTPSETSVYTSSETPSSSSPTSTSLISSSKSTSTSTPSFTSSITSTETSSYSASSYTPSVSSTASSSKNTTSSTASISSAETVSSSSSSVSSTIPSSQSTSYSTPSFSSSATSSVTPLHSTPSLPSWVTTSKTTSHITPGLTSSMSSSETYSHSTPGFTSSITSTESTSESTPSLSSSTIYSTVSTSTTAITSHFTTSETAVTPTPVTPSSLSTDIPTTSLRTLTPSSVGTSTSLTTTTDFPSIPTDISTLPTRTHIISSSPSIQSTETSSLVGTTSPTMSTVRMTLRITENTPISSFSTSIVVIPETPTQTPPVLTSATGTQTSPAPTTVTFGSTDSSTSTLHKLQGDSGETIGKYIGAADSLGGSVLLLALAPLVLLSLL 433 CID1945 MQLLRCFSIFSVIASVLAQEGKPIPNPLLGLDSTGGGSGGGAQAAGAHSSQVSQNCHNGSYEISVLMMGNSAFAEPLKNLEDAVNEGLEIVRGRLQNAGLNVTVNATFMYSDGLIHNSGDCRSSTCEGVDLLRKISNAQRMGCVLIGPSCTYSTFQMYLDTELSYPMISAGSFGLSCDYKETLTRLMSPARKLMYFLVNFWKTNDLPFKTYSWSTSYVYKNGTETEDCFWYLNALEASVSYFSHELGFKVVLRQDKEFQDILMDHNRKSNVIIMCGGPEFLYKLKGDRAVAEDIVIILVDLFNDQYFEDNVTAPDYMKNVLVLTLSPGNSLLNSSFSRNLSPTKRDFALAYLNGILLFGHMLKIFLENGENITTPKFAHAFRNLTFEGYDGPVTLDDWGDVDSTMVLLYTSVDTKKYKVLLTYDTHVNKTYPVDMSPTFTWKNSKLPNDITGRGPQRTSDQASGAHHHHHHGAYPYDVPDYAGHGTSGGGGSGGTSTPSYTTSIISTETPSHSTPSSSTSITTTETPSHSTPSYTSSVSTSETTSHSTPSETSSSRTTESTSYSSPSSTSSNTITETSSHSTPSTATSISSTETPSSSIPSVSSSITVTESSSHSTPGATSTLTSSETSTWSTPSSTSSIMSSSYTSADTPSETSVYTSSETPSSSSPTSTSLISSSKSTSTSTPSFTSSITSTETSSYSASSYTPSVSSTASSSKNTTSSTASISSAETVSSSSSSVSSTIPSSQSTSYSTPSFSSSATSSVTPLHSTPSLPSWVTTSKTTSHITPGLTSSMSSSETYSHSTPGFTSSITSTESTSESTPSLSSSTIYSTVSTSTTAITSHFTTSETAVTPTPVTPSSLSTDIPTTSLRTLTPSSVGTSTSLTTTTDFPSIPTDISTLPTRTHIISSSPSIQSTETSSLVGTTSPTMSTVRMTLRITENTPISSFSTSIVVIPETPTQTPPVLTSATGTQTSPAPTTVTFGSTDSSTSTLHKLQGDSGETIGKYIGAADSLGGSVLLLALAPLVLLSLL 434 CID1946 MQLLRCFSIFSVIASVLAQEGKPIPNPLLGLDSTGGGSGGGAQAAGAHSSQVSQNCHNGSYEISVLMMGNSAFAEPLKNLEDAVNEGLEIVRGRLQNAGLNVTVNATFMYSDGLIHNSGDCRSSTCEGLELLRKISNAQRMGCVLIGPSCTYSTFQMYLDTELSYPMISAGSFGLSCDYKETLTRLMSPARKLMYFLVNFWKTNDLPFKTYSWSTSYVYKNGTETEDCFWYLNALEASVSYFSHELGFKVVLRQDKEFQDILMDHNRKSNVIIMCGGPEFLYKLKGDRAVAEDIVIILVDLFNDQYFEDNVTAPDYMKNVLVLTLSPGNSLLNSSFSRNLSPTKRDFALAYLNGILLFGHMLKIFLENGENITTPKFAHAFRNLTFEGYDGPVTLDDWGDVDSTMVLLYTSVDTKKYKVLLTYDTHVNKTYPVDMSPTFTWKNSKLPNDITGRGPQRTSDQASGAHHHHHHGAYPYDVPDYAGHGTSGGGGSGGTSTPSYTTSIISTETPSHSTPSSSTSITTTETPSHSTPSYTSSVSTSETTSHSTPSETSSSRTTESTSYSSPSSTSSNTITETSSHSTPSTATSISSTETPSSSIPSVSSSITVTESSSHSTPGATSTLTSSETSTWSTPSSTSSIMSSSYTSADTPSETSVYTSSETPSSSSPTSTSLISSSKSTSTSTPSFTSSITSTETSSYSASSYTPSVSSTASSSKNTTSSTASISSAETVSSSSSSVSSTIPSSQSTSYSTPSFSSSATSSVTPLHSTPSLPSWVTTSKTTSHITPGLTSSMSSSETYSHSTPGFTSSITSTESTSESTPSLSSSTIYSTVSTSTTAITSHFTTSETAVTPTPVTPSSLSTDIPTTSLRTLTPSSVGTSTSLTTTTDFPSIPTDISTLPTRTHIISSSPSIQSTETSSLVGTTSPTMSTVRMTLRITENTPISSFSTSIVVIPETPTQTPPVLTSATGTQTSPAPTTVTFGSTDSSTSTLHKLQGDSGETIGKYIGAADSLGGSVLLLALAPLVLLSLL 435 CID1947 MQLLRCFSIFSVIASVLAQEGKPIPNPLLGLDSTGGGSGGGAQAAGAHSSQVSQNCHNGSYEISVLMMGNSAFAEPLKNLEDAVNEGLEIVRGRLQNAGLNVTVNATFMYSDGLIHNSGDCRSSTCEGLDLIRKISNAQRMGCVLIGPSCTYSTFQMYLDTELSYPMISAGSFGLSCDYKETLTRLMSPARKLMYFLVNFWKTNDLPFKTYSWSTSYVYKNGTETEDCFWYLNALEASVSYFSHELGFKVVLRQDKEFQDILMDHNRKSNVIIMCGGPEFLYKLKGDRAVAEDIVIILVDLFNDQYFEDNVTAPDYMKNVLVLTLSPGNSLLNSSFSRNLSPTKRDFALAYLNGILLFGHMLKIFLENGENITTPKFAHAFRNLTFEGYDGPVTLDDWGDVDSTMVLLYTSVDTKKYKVLLTYDTHVNKTYPVDMSPTFTWKNSKLPNDITGRGPQRTSDQASGAHHHHHHGAYPYDVPDYAGHGTSGGGGSGGTSTPSYTTSIISTETPSHSTPSSSTSITTTETPSHSTPSYTSSVSTSETTSHSTPSETSSSRTTESTSYSSPSSTSSNTITETSSHSTPSTATSISSTETPSSSIPSVSSSITVTESSSHSTPGATSTLTSSETSTWSTPSSTSSIMSSSYTSADTPSETSVYTSSETPSSSSPTSTSLISSSKSTSTSTPSFTSSITSTETSSYSASSYTPSVSSTASSSKNTTSSTASISSAETVSSSSSSVSSTIPSSQSTSYSTPSFSSSATSSVTPLHSTPSLPSWVTTSKTTSHITPGLTSSMSSSETYSHSTPGFTSSITSTESTSESTPSLSSSTIYSTVSTSTTAITSHFTTSETAVTPTPVTPSSLSTDIPTTSLRTLTPSSVGTSTSLTTTTDFPSIPTDISTLPTRTHIISSSPSIQSTETSSLVGTTSPTMSTVRMTLRITENTPISSFSTSIVVIPETPTQTPPVLTSATGTQTSPAPTTVTFGSTDSSTSTLHKLQGDSGETIGKYIGAADSLGGSVLLLALAPLVLLSLL 436 CID1948 MQLLRCFSIFSVIASVLAQEGKPIPNPLLGLDSTGGGSGGGAQAAGAHSSQVSQNCHNGSYEISVLMMGNSAFAEPLKNLEDAVNEGLEIVRGRLQNAGLNVTVNATFMYSDGLIHNSGDCRSSTCEGLDLLKKISNAQRMGCVLIGPSCTYSTFQMYLDTELSYPMISAGSFGLSCDYKETLTRLMSPARKLMYFLVNFWKTNDLPFKTYSWSTSYVYKNGTETEDCFWYLNALEASVSYFSHELGFKVVLRQDKEFQDILMDHNRKSNVIIMCGGPEFLYKLKGDRAVAEDIVIILVDLFNDQYFEDNVTAPDYMKNVLVLTLSPGNSLLNSSFSRNLSPTKRDFALAYLNGILLFGHMLKIFLENGENITTPKFAHAFRNLTFEGYDGPVTLDDWGDVDSTMVLLYTSVDTKKYKVLLTYDTHVNKTYPVDMSPTFTWKNSKLPNDITGRGPQRTSDQASGAHHHHHHGAYPYDVPDYAGHGTSGGGGSGGTSTPSYTTSIISTETPSHSTPSSSTSITTTETPSHSTPSYTSSVSTSETTSHSTPSETSSSRTTESTSYSSPSSTSSNTITETSSHSTPSTATSISSTETPSSSIPSVSSSITVTESSSHSTPGATSTLTSSETSTWSTPSSTSSIMSSSYTSADTPSETSVYTSSETPSSSSPTSTSLISSSKSTSTSTPSFTSSITSTETSSYSASSYTPSVSSTASSSKNTTSSTASISSAETVSSSSSSVSSTIPSSQSTSYSTPSFSSSATSSVTPLHSTPSLPSWVTTSKTTSHITPGLTSSMSSSETYSHSTPGFTSSITSTESTSESTPSLSSSTIYSTVSTSTTAITSHFTTSETAVTPTPVTPSSLSTDIPTTSLRTLTPSSVGTSTSLTTTTDFPSIPTDISTLPTRTHIISSSPSIQSTETSSLVGTTSPTMSTVRMTLRITENTPISSFSTSIVVIPETPTQTPPVLTSATGTQTSPAPTTVTFGSTDSSTSTLHKLQGDSGETIGKYIGAADSLGGSVLLLALAPLVLLSLL 437 CID1949 MQLLRCFSIFSVIASVLAQEGKPIPNPLLGLDSTGGGSGGGAQAAGAHSSQVSQNCHNGSYEISVLMMGNSAFAEPLKNLEDAVNEGLEIVRGRLQNAGLNVTVNATFMYSDGLIHNSGDCRSSTCEGLDLLRQISNAQRMGCVLIGPSCTYSTFQMYLDTELSYPMISAGSFGLSCDYKETLTRLMSPARKLMYFLVNFWKTNDLPFKTYSWSTSYVYKNGTETEDCFWYLNALEASVSYFSHELGFKVVLRQDKEFQDILMDHNRKSNVIIMCGGPEFLYKLKGDRAVAEDIVIILVDLFNDQYFEDNVTAPDYMKNVLVLTLSPGNSLLNSSFSRNLSPTKRDFALAYLNGILLFGHMLKIFLENGENITTPKFAHAFRNLTFEGYDGPVTLDDWGDVDSTMVLLYTSVDTKKYKVLLTYDTHVNKTYPVDMSPTFTWKNSKLPNDITGRGPQRTSDQASGAHHHHHHGAYPYDVPDYAGHGTSGGGGSGGTSTPSYTTSIISTETPSHSTPSSSTSITTTETPSHSTPSYTSSVSTSETTSHSTPSETSSSRTTESTSYSSPSSTSSNTITETSSHSTPSTATSISSTETPSSSIPSVSSSITVTESSSHSTPGATSTLTSSETSTWSTPSSTSSIMSSSYTSADTPSETSVYTSSETPSSSSPTSTSLISSSKSTSTSTPSFTSSITSTETSSYSASSYTPSVSSTASSSKNTTSSTASISSAETVSSSSSSVSSTIPSSQSTSYSTPSFSSSATSSVTPLHSTPSLPSWVTTSKTTSHITPGLTSSMSSSETYSHSTPGFTSSITSTESTSESTPSLSSSTIYSTVSTSTTAITSHFTTSETAVTPTPVTPSSLSTDIPTTSLRTLTPSSVGTSTSLTTTTDFPSIPTDISTLPTRTHIISSSPSIQSTETSSLVGTTSPTMSTVRMTLRITENTPISSFSTSIVVIPETPTQTPPVLTSATGTQTSPAPTTVTFGSTDSSTSTLHKLQGDSGETIGKYIGAADSLGGSVLLLALAPLVLLSLL 438 CID1950 MQLLRCFSIFSVIASVLAQEGKPIPNPLLGLDSTGGGSGGGAQAAGAHSSQVSQNCHNGSYEISVLMMGNSAFAEPLKNLEDAVNEGLEIVRGRLQNAGLNVTVNATFMYSDGLIHNSGDCRSSTCEGLDLLRKIFNAQRMGCVLIGPSCTYSTFQMYLDTELSYPMISAGSFGLSCDYKETLTRLMSPARKLMYFLVNFWKTNDLPFKTYSWSTSYVYKNGTETEDCFWYLNALEASVSYFSHELGFKVVLRQDKEFQDILMDHNRKSNVIIMCGGPEFLYKLKGDRAVAEDIVIILVDLFNDQYFEDNVTAPDYMKNVLVLTLSPGNSLLNSSFSRNLSPTKRDFALAYLNGILLFGHMLKIFLENGENITTPKFAHAFRNLTFEGYDGPVTLDDWGDVDSTMVLLYTSVDTKKYKVLLTYDTHVNKTYPVDMSPTFTWKNSKLPNDITGRGPQRTSDQASGAHHHHHHGAYPYDVPDYAGHGTSGGGGSGGTSTPSYTTSIISTETPSHSTPSSSTSITTTETPSHSTPSYTSSVSTSETTSHSTPSETSSSRTTESTSYSSPSSTSSNTITETSSHSTPSTATSISSTETPSSSIPSVSSSITVTESSSHSTPGATSTLTSSETSTWSTPSSTSSIMSSSYTSADTPSETSVYTSSETPSSSSPTSTSLISSSKSTSTSTPSFTSSITSTETSSYSASSYTPSVSSTASSSKNTTSSTASISSAETVSSSSSSVSSTIPSSQSTSYSTPSFSSSATSSVTPLHSTPSLPSWVTTSKTTSHITPGLTSSMSSSETYSHSTPGFTSSITSTESTSESTPSLSSSTIYSTVSTSTTAITSHFTTSETAVTPTPVTPSSLSTDIPTTSLRTLTPSSVGTSTSLTTTTDFPSIPTDISTLPTRTHIISSSPSIQSTETSSLVGTTSPTMSTVRMTLRITENTPISSFSTSIVVIPETPTQTPPVLTSATGTQTSPAPTTVTFGSTDSSTSTLHKLQGDSGETIGKYIGAADSLGGSVLLLALAPLVLLSLL 439 CID1431 MQLLRCFSIFSVIASVLAQEGKPIPNPLLGLDSTGGGSGGGAQAAGAHSRTSDQASGAGAYPYDVPDYAGHGTSGGGGSGGTSTPSYTTSIISTETPSHSTPSSSTSITTTETPSHSTPSYTSSVSTSETTSHSTPSETSSSRTTESTSYSSPSSTSSNTITETSSHSTPSTATSISSTETPSSSIPSVSSSITVTESSSHSTPGATSTLTSSETSTWSTPSSTSSIMSSSYTSADTPSETSVYTSSETPSSSSPTSTSLISSSKSTSTSTPSFTSSITSTETSSYSASSYTPSVSSTASSSKNTTSSTASISSAETVSSSSSSVSSTIPSSQSTSYSTPSFSSSATSSVTPLHSTPSLPSWVTTSKTTSHITPGLTSSMSSSETYSHSTPGFTSSITSTESTSESTPSLSSSTIYSTVSTSTTAITSHFTTSETAVTPTPVTPSSLSTDIPTTSLRTLTPSSVGTSTSLTTTTDFPSIPTDISTLPTRTHIISSSPSIQSTETSSLVGTTSPTMSTVRMTLRITENTPISSFSTSIVVIPETPTQTPPVLTSATGTQTSPAPTTVTFGSTDSSTSTLHKLQGDSGETIGKYIGAADSLGGSVLLLALAPLVLLSLL 440 GUCY2C-0118_
Легкая цепь IgG кролика версии клона 9H3 DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVDYYGTSLMQWYQQKPGQPPKLLIYAASNVESGVPARFSGSGSGTDFSLNIHPVEEDDIAMYFCQQTRKVYTFGGGTKLEIKGDPVAPTVLIFPPAADQVATGTVTIVCVANKYFPDVTVTWEVDGTTQTTGIENSKTPQNSADCTYNLSSTLTLTSTQYNSHKEYTCRVTQGTTSVVQSFNRGDC 441 GUCY2C-0118_
Тяжелая цепь IgG кролика версии клона 9H3 QVQLQQPGAELVKPGASVKLSCKASGYTFTSYWMHWVKQRPGQGLEWIGEIKPSNGLTNYIEKFKNKATLTVDKSATTAYMQLSSLTAEDSAVYYCTRTITTTEGYWFFDVWGAGTTVTVSSGQPKAPSVFPLAPCCGDTPSSTVTLGCLVKGYLPEPVTVTWNSGTLTNGVRTFPSVRQSSGLYSLSSVVSVTSSSQPVTCNVAHPATNTKVDKTVAPSTCSKPTCPPPELLGGPSVFIFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQDDPEVQFTWYINNEQVRTARPPLREQQFNSTIRVVSTLPIAHQDWLRGKEFKCKVHNKALPAPIEKTISKARGQPLEPKVYTMGPPREELSSRSVSLTCMINGFYPSDISVEWEKNGKAEDNYKTTPAVLDSDGSYFLYSKLSVPTSEWQRGDVFTCSVMHEALHNHYTQKSISRSPGK 442 GUCY2C-0117_
Легкая цепь IgG1 мыши клона 9H3 DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVDYYGTSLMQWYQQKPGQPPKLLIYAASNVESGVPARFSGSGSGTDFSLNIHPVEEDDIAMYFCQQTRKVYTFGGGTKLEIKRTDAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC 443 GUCY2C-0117_
Тяжелая цепь IgG1 мыши клона 9H3 QVQLQQPGAELVKPGASVKLSCKASGYTFTSYWMHWVKQRPGQGLEWIGEIKPSNGLTNYIEKFKNKATLTVDKSATTAYMQLSSLTAEDSAVYYCTRTITTTEGYWFFDVWGAGTTVTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMDTDGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK 444 GUCY2C-0119_
Легкая цепь_
Химерное 9H3 IgG1 человека 3m в pTT5 DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVDYYGTSLMQWYQQKPGQPPKLLIYAASNVESGVPARFSGSGSGTDFSLNIHPVEEDDIAMYFCQQTRKVYTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 445 GUCY2C-0119_
Тяжелая цепь
Химерное 9H3 IgG1 человека 3m в pTT5 QVQLQQPGAELVKPGASVKLSCKASGYTFTSYWMHWVKQRPGQGLEWIGEIKPSNGLTNYIEKFKNKATLTVDKSATTAYMQLSSLTAEDSAVYYCTRTITTTEGYWFFDVWGAGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG

Последовательности антител по настоящему изобретению пронумерованы с использованием Abysis AbM. С помощью системы нумерации Abysis AbM приписывают нумерацию по Kabat и определяют начало и конец каждой CDR по правилам Kabat, за исключением CDR H1. CDR H1 определяют по AbM.

Пример 27: Три варианта антитела против CD3 демонстрировали улучшенную аффинность и цитотоксичность в биспецифических антителах против GUCY2C-CD3

Три варианта антитела против CD3, 2B5-1038 (SEQ ID NO: 273 и 274), 2B5-1039 (SEQ ID NO: 273 и 275), и 2B5-1040 (SEQ ID NO: 273 и 276), полученные из 2B5v6, переформатировали в молекулы биспецифическое диатело-Fc, спаренные с последовательностью противоопухолевого антитела против GUCY2c в одной из конфигураций, показанных на фигуре 1, с использованием стандартных способов клонирования, экспрессии и очистки, представленных в настоящем описании выше. Получаемые биспецифические антитела, приведенные в таблице 39, тестировали на цитотоксичность in vitro с использованием анализа перенаправления T-клеток, аффинность связывания с использованием анализа поверхностного плазмонного резонанса (SPR) и неспецифичность с использованием AC-SIN. Риск иммуногенности оценивали с помощью Epivax Tool для прогнозирования in silico потенциальных T-клеточных эпитопов. Интактные данные масс-спектроскопии свидетельствуют о том, что все биспецифические антитела имеют правильное спаривание и на 100% являются гетеродимерами. В таблице 39 показано, что все три биспецифические антитела (1) являются приблизительно в 2 раза более активными в анализе цитотоксичности in vitro по сравнению с контрольным биспецифическим GUCY2C-1608, спаренным с антителом против CD3 2B5v6 (фигура 18); (2) имеют аффинность связывания с рекомбинантным CD3 человек по результатам SPR, соответствующую активности цитотоксичности; (3) имеют баллы иммуногенности, являющуюся улучшенными по сравнению с контролем; и (4) баллы AC-SIN оставались теми же, что и у контрольного биспецифического антитела GUCY2C-1608.

Таблица 39

Биспецифическое антитело Вариант антитела против CD3 Баллы Epivax (скорректированные по tReg) Масс-спектрометрия (интактные данные) Баллы AC-SIN Цитотоксичность in vitro (нМ) KD (нМ, SPR) GUCY2C-1608 2B5-0542 -33,7 100% гетеродимер 3 0,772 127,88±1,63 GUCY2C-1678 2B5-1038 -52,61 100% гетеродимер 2 0,247 63,55±0,49 GUCY2C-1679 2B5-1040 -47,58 100% гетеродимер 3 0,194 72,02±0,36 GUCY2C-1680 2B5-1039 -53,51 100% гетеродимер 3 0,385 78,57±0,9

Пример 28:Созревание аффинности связывающего домена антитела против GUCY2c

Для повышения аффинности связывающего домена антитела против GUCY2c к GUCY2c использовали подход фагового дисплея. Конструировали четыре библиотеки фагового дисплея и получали их способами, описанными выше. Библиотеки получали посредством встраивания мутаций в CDR H1, H2 и H3 и CDR L1 антитела GUCY2C-1608 (SEQ ID NO: 221). Фаговые библиотеки подвергали "спасению", как описано выше, и селекции с использованием стратегии конкурентной селекции, показанной в таблице 40. Для раунда 1 фаг инкубировали с стрептавидиновыми частицами, комплексированными с биотинилированной GUCY2c человека (5 нМ; SEQ ID NO: 232). После 3 промывок в реакционную смесь добавляли 100-кратный избыток небиотинилированного антигена (500 нМ) и смесь вращали в течение ночи при 4°C. Частицы промывали на следующий день для удаления фага, диссоциировавшего от частиц, и оставшегося связанного фага элюировали с использованием TEA. Для раунда 2 селекцию повторяли, как описано выше, против 0,5 нМ антигена без какой-либо конкуренции. Отбирали колонии и получали периплазматические препараты, как описано выше. Клоны подвергали скринингу на улучшенную активность связывания с использованием конкурентного ELISA, описанного выше. Клоны, демонстрировавшие улучшенное связывание по сравнению с родительскими вариантами, выбирали для дальнейшего анализа. После скрининга осуществляли секвенирование ДНК, как описано выше, лучших клонов для идентификации мутаций, вносящих вклад в улучшенную активность связывания GUCY2c.

После исходной библиотеки для селекции посредством созревания аффинности области CDR этих лучших вариантов комбинировали в новую библиотеку и осуществляли дополнительные селекции фагового дисплея, приведенные в таблице 41. Раунд 1 селекции осуществляли, как описано выше для исходной библиотеки для селекции посредством созревания аффинности, за исключением того, что использовали 0,5 нМ биотинилированного антигена. Для каждой библиотеки было две группы селекции раунда 2, в которых фага перед селекцией стимулировали или не стимулировали с помощью инкубации при 65°C. После селекции фага отбирали колонии и получали периплазматические препараты, как описано выше. Клоны подвергали скринингу посредством конкурентного ELISA, описанного выше. После скрининга осуществляли секвенирование ДНК лучших клонов для идентификации мутаций, вносящих вклад в улучшенную активность связывания GUCY2c. В таблицах 40 и 41 показана стратегия селекции фагового дисплея, используемая для библиотек созревания аффинности (C=библиотека; R=раунд; Dslxn=условия деселекции; Therm=термические условия; SA=стрептавидин; D=ДНК; I=инсулин; M=мембранный экстракт).

Таблица 40

Раунд Условия R1 Группа C1R1 Мишень GUCY2C человека Концентрация мишени 5 нМ Dslxn SA, D, I, M Therm Нет Конкуренция 500 нМ R2 Группа C1R2 Мишень GUCY2C человека Концентрация мишени 5 нМ Dslxn SA, D, I, M Therm Нет Конкуренция Нет

Таблица 41

Раунд Условия R1 Группа C1R1 Мишень GUCY2C человека Концентрация мишени 0,5 нМ Dslxn SA, D, I, M Therm Нет Конкуренция 500 нМ R2A Группа C1R2A Мишень GUCY2C человека Концентрация мишени 0,5 нМ Dslxn SA, D, I, M Therm Нет Конкуренция 500 нМ R2B Группа C1R2B Мишень Человек GUCY2C Концентрация мишени 0,5 нМ Dslxn SA, D, I, M Therm 65°C Конкуренция 500 нМ

Аминокислотные последовательности клонов антитела против GUCY2c, демонстрировавших улучшенную аффинность при конкурентном ELISA PeriPrep, сравнивали с родительским клоном GUCY2C-1608 (VH SEQ ID NO: 73 и VL SEQ ID NO: 147). Изменения содержания аминокислот в CDR VH, приводившие к улучшенной стабильности, приведены в таблице 42A. Изменения в положениях 54, 55, 56, 97 и 99, по-видимому, имеют наибольшее влияние на аффинность, что коррелирует с наибольшими изменениями флуоресценции с разрешением по времени (в соответствии с системой нумерации Kabat, с использованием определения AbM для CDR1 VH).

Таблица 42A

Обозначение Положение Родительская аминокислота Оптимизированная аминокислота CDR1 VH
(H1) H1.31 31 S R, W, Y, A, H, P, Y, T, N, K, D, G, V H1.32 32 Y R, L, T, K, P, I, N, M, V, S CDR2 VH
(H2) H2.52A 52A P T, V H2.53 53 S A, L, R H2.54 54 N T, R, H, K, M, S, A, Y, T, I H2.55 55 E R, K, N, Y, G, L, A, M, S, H, D, Q H2.56 56 L W, Y, F, V, I, N, H H2.57 57 T M, S, L, N, Q, V FW3 VH 93 T A CDR3 VH
(H3) H3.96 96 I F, K H3.97 97 T V, L, I, M, F, Y, A H3.98 98 T N, R, G, L, I H3.99 99 T K, L, W, A, S, M, P, N, R H3.100 100 E G, A, H, S, D, T, R, Q, K, Y, L, M H3.100B 100B Y H H3.100E 100E F L H3.101 101 D Y, E, S

Изменения содержания аминокислот в CDR VL, приводящие к улучшенной аффинности при конкурентном ELISA PeriPrep, показаны в таблице 42B (систему нумерации Chothia использовали для CDR1 VL). Изменения в положениях 30, 30a и 30d в CDR1 VL, по-видимому, имеют наибольшее влияние на аффинность, что коррелирует с наибольшими изменениями флуоресценции с разрешением по времени.

Таблица 42B

Обозначение Положение Родительская аминокислота Оптимизированная аминокислота CDR1 VL
(L1) L1.30 30 D N, S L1.30a 30a Y W, I L1.30d 30d T S, H

После скрининга в формате scFv в виде периплазматических препаратов последовательности VH и VL лучших клонов клонировали в полный формат IgG1/каппа человека. Гены VH и VL амплифицировали посредством ПЦР из фагового вектора и субклонировали в векторы IgG1 человека и каппа человека способами молекулярной биологии, описанными выше. Затем версию IgG1 человека этих лучших аффинно зрелых клонов транзиторно экспрессировали и очищали способами, также описанными выше. Затем очищенные белки анализировали посредством поверхностного плазмонного резонанса, как описано выше, против рекомбинантного белка GUCY2c человека (SEQ ID NO: 232). В таблице 43 показаны скорость прямой реакции (ka), скорость обратной реакции (kd) и равновесная константа (K_D) для аффинно зрелых клонов по сравнению с родительским GUCY2C-1608 в форме IgG (GUCY2c-1640; SEQ ID NO: 214 и 223). Несколько вариантов демонстрировали аффинность, улучшенную в 3,4 раза по сравнению с родительским антителом. В таблице 44 приведены полные аминокислотные последовательности VH и VL этих аффинно зрелых версий GUCY2C-1608.

Таблица 43. Поверхностный плазмонный резонанс аффинно зрелых IgG против GUCY2c относительно белка внеклеточного домена (ECD) GUCY2c человека.

Лиганд ka (1/Мс) kd (1/с) K_D (нМ) GUCY2C-1640 1,95E+05 2,71E-03 13,87±0,38 GUCY2C-1696 1,44E+05 1,79E-03 12,42±0,55 GUCY2C-1701 2,35E+05 2,79E-03 11,85±0,38 GUCY2C-1702 2,46E+05 1,51E-03 6,16±0,34 GUCY2C-1703 2,10E+05 2,14E-03 10,32±1,34 GUCY2C-1705 2,39E+05 1,49E-03 6,25±0,04 GUCY2C-1706 1,98E+05 1,93E-03 9,75±0,07 GUCY2C-1708 1,40E+05 1,32E-03 9,44±0,4 GUCY2C-1710 2,48E+05 1,47E-03 5,94±0,24 GUCY2C-1713 1,61E+05 1,08E-03 6,71±0,33 GUCY2C-1714 1,21E+05 1,24E-03 10,27±0,59 GUCY2C-1715 2,72E+05 1,10E-03 4,07±0,4

Таблица 44. Аминокислотные последовательности аффинно зрелых областей VH и VL

SEQ ID NO: 294 GUCY2C-1696_VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTRWMHWVRQAPGKGLEWIGEIKPSNKLTNVHEKFKDRFTISVDKAKNSAYLQMNSLRAEDTAVYYCARTITTTEGYWFLSDWGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 295 GUCY2C-1696_VL DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVDYYGHSLMQWYQQKPGKAPKLLIYAASKLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTRKAYTFGQGTKLEIK SEQ ID NO: 296 GUCY2C-1701_VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMHWVRQAPGKGLEWIGEIKPSNELTNVHEKFKDRFTISVDKAKNSAYLQMNSLRAEDTAVYYCTRTITTPLGYWFFDVWGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 297 GUCY2C-1701_VL DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVDYYGSSLMQWYQQKPGKAPKLLIYAASKLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTRKAYTFGQGTKLEIK SEQ ID NO: 298 GUCY2C-1702_VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMHWVRQAPGKGLEWIGEIKPSNELTNVHEKFKDRFTISVDKAKNSAYLQMNSLRAEDTAVYYCTRTITTPLGYWFFDVWGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 299 GUCY2C-1702_VL DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVDYYGSSLMQWYQQKPGKAPKLLIYAASKLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTRKAYTFGQGTKLEIK SEQ ID NO: 300 GUCY2C-1703_VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMHWVRQAPGKGLEWIGEIKPSNRWNNVHEKFKDRFTISVDKAKNSAYLQMNSLRAEDTAVYYCTRTITTTEGYWFFDVWGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 301 GUCY2C-1703_VL DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVDYYGSSLMQWYQQKPGKAPKLLIYAASKLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTRKAYTFGQGTKLEIK SEQ ID NO: 302 GUCY2C-1705_VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMHWVRQAPGKGLEWIGEIKPSRGFTNVHEKFKDRFTISVDKAKNSAYLQMNSLRAEDTAVYYCTRTITTTEGYWFFDVWGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 303 GUCY2C-1705_VL DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVDYYGSSLMQWYQQKPGKAPKLLIYAASKLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTRKAYTFGQGTKLEIK SEQ ID NO: 304 GUCY2C-1706_VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSTWMHWVRQAPGKGLEWIGEIKPSNELTNVHEKFKDRFTISVDKAKNSAYLQMNSLRAEDTAVYYCTRTITTTEGYWFFDVWGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 305 GUCY2C-1706_VL DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVDYYGSSLMQWYQQKPGKAPKLLIYAASKLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTRKAYTFGQGTKLEIK SEQ ID NO: 306 GUCY2C-1708_VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRPWMHWVRQAPGKGLEWIGEIKPSTGWTNVHEKFKDRFTISVDKAKNSAYLQMNSLRAEDTAVYYCTRTITTTTGYWFFDVWGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 307 GUCY2C-1708_VL DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVDYYKHSLMQWYQQKPGKAPKLLIYAASKLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTRKAYTFGQGTKLEIK SEQ ID NO: 308 GUCY2C-1710_VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMHWVRQAPGKGLEWIGEIKPSRGWTNVHEKFKDRFTISVDKAKNSAYLQMNSLRAEDTAVYYCARTITTTEGYWFFDVWGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 309 GUCY2C-1710_VL DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVDYYRHSLMQWYQQKPGKAPKLLIYAASKLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTRKAYTFGQGTKLEIK SEQ ID NO: 310 GUCY2C-1713_VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSHTWMHWVRQAPGKGLEWIGEIKPSRGFTNVHEKFKDRFTISVDKAKNSAYLQMNSLRAEDTAVYYCTRTITTTQGYWFFDVWGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 311 GUCY2C-1713_VL DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVNWYGSSLMQWYQQKPGKAPKLLIYAASKLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTRKAYTFGQGTKLEIK SEQ ID NO: 312 GUCY2C-1714_VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSHTWMHWVRQAPGKGLEWIGEIKPSTKYTNVHEKFKDRFTISVDKAKNSAYLQMNSLRAEDTAVYYCARTIFTREGYWFFDVWGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 313 GUCY2C-1714_VL DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVNWYGSSLMQWYQQKPGKAPKLLIYAASKLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTRKAYTFGQGTKLEIK SEQ ID NO: 314 GUCY2C-1715_VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMHWVRQAPGKGLEWIGEIKPSTKYTNVHEKFKDRFTISVDKAKNSAYLQMNSLRAEDTAVYYCTRTIFTNEGYWFFDVWGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 315 GUCY2C-1715_VL DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVSIYGSSLMQWYQQKPGKAPKLLIYAASKLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTRKAYTFGQGTKLEIK

Пример 29: Определение эпитопов посредством пептидного картирования внеклеточного домена GUCY2C

Пептидное картирование осуществляли для определения эпитопа на внеклеточном домене (ECD) GUCY2c, с которым связывается основное антитело против GUCY2c. Для этого подхода получали 20-мерные пептиды с перекрыванием 15 аминокислот, охватывающие весь внеклеточный домен в трансмембранном домене GUCY2c, состоящем из аминокислот 1-440 (таблица 45). Пептиды синтезировали и предоставляли в виде панелей в лиофилизированном формате (New England Peptide, Gardner MA). Панели переразводили ацетонитрилом до 100 мкг/мл, а затем дополнительно разбавляли до 20 мкг/мл буфером карбоната/бикарбоната натрия. Затем очищенные антитела или биспецифические антитела против GUCY2c-CD3 тестировали с помощью Delfia ELISA на связывание с различными пептидами с использованием описанных выше способов Delfia ELISA, при этом разведенные пептиды использовали в качестве антигенов-мишеней. GUCY2C-1608 демонстрировало сильное связывание с пептидами 19 и 20 (SEQ ID NO: 334 и 335), что измеряли по флуоресценции с разрешением по времени (TRF). Данные о связывании по результатам TRF для GUCY2C-1608 относительно всех пептидов приведены в таблице 45. Последовательность NSGDCRSSTCEGLDLLRKISNAQRM (SEQ ID NO: 405) охватывается этими пептидами. Область перекрывания пептидов представляет собой RSSTCEGLDLLRKIS (SEQ ID NO: 406), указывая на эпитоп в области.

Таблица 45

Seq ID № пептида Последовательность пептида TRF DELFIA 316 1 MKTLLLDLALWSLLFQPGWL 166,25 317 2 LDLALWSLLFQPGWLSFSSQ 106,5 318 3 WSLLFQPGWLSFSSQVSQNC 97,75 319 4 QPGWLSFSSQVSQNCHNGSY 124,75 320 5 SFSSQVSQNCHNGSYEISVL 108,75 321 6 VSQNCHNGSYEISVLMMGNS 412,5 322 7 HNGSYEISVLMMGNSAFAEP 136 323 8 EISVLMMGNSAFAEPLKNLE 147,5 324 9 MMGNSAFAEPLKNLEDAVNE 145 325 10 AFAEPLKNLEDAVNEGLEIV 105,25 326 11 LKNLEDAVNEGLEIVRGRLQ 101,25 327 12 DAVNEGLEIVRGRLQNAGLN 258,75 328 13 GLEIVRGRLQNAGLNVTVNA 101,5 329 14 RGRLQNAGLNVTVNATFMYS 97 330 15 NAGLNVTVNATFMYSDGLIH 88,75 331 16 VTVNATFMYSDGLIHNSGDC 105,25 332 17 TFMYSDGLIHNSGDCRSSTC 112 333 18 DGLIHNSGDCRSSTCEGLDL 126 334 19 NSGDCRSSTCEGLDLLRKIS 19179,25 335 20 RSSTCEGLDLLRKISNAQRM 3208,75 336 21 EGLDLLRKISNAQRMGCVLI 81 337 22 LRKISNAQRMGCVLIGPSCT 93,5 338 23 NAQRMGCVLIGPSCTYSTFQ 96,25 339 24 GCVLIGPSCTYSTFQMYLDT 118,75 340 25 GPSCTYSTFQMYLDTELSYP 131 341 26 YSTFQMYLDTELSYPMISAG 104,25 342 27 MYLDTELSYPMISAGSFGLS 105 343 28 ELSYPMISAGSFGLSCDYKE 96,75 344 29 MISAGSFGLSCDYKETLTRL 101 345 30 SFGLSCDYKETLTRLMSPAR 125 346 31 CDYKETLTRLMSPARKLMYF 90,25 347 32 TLTRLMSPARKLMYFLVNFW 83,25 348 33 MSPARKLMYFLVNFWKTNDL 87,5 349 34 KLMYFLVNFWKTNDLPFKTY 99 350 35 LVNFWKTNDLPFKTYSWSTS 108 351 36 KTNDLPFKTYSWSTSYVYKN 111,5 352 37 PFKTYSWSTSYVYKNGTETE 106,75 353 38 SWSTSYVYKNGTETEDCFWY 109,5 354 39 YVYKNGTETEDCFWYLNALE 86,5 355 40 GTETEDCFWYLNALEASVSY 85,25 356 41 DCFWYLNALEASVSYFSHEL 161 357 42 LNALEASVSYFSHELGFKVV 96,5 358 43 ASVSYFSHELGFKVVLRQDK 104 359 44 FSHELGFKVVLRQDKEFQDI 90,5 360 45 GFKVVLRQDKEFQDILMDHN 107,5 361 46 LRQDKEFQDILMDHNRKSNV 105,75 362 47 EFQDILMDHNRKSNVIIMCG 103,75 363 48 LMDHNRKSNVIIMCGGPEFL 148 364 49 RKSNVIIMCGGPEFLYKLKG 129,25 365 50 IIMCGGPEFLYKLKGDRAVA 161 366 51 GPEFLYKLKGDRAVAEDIVI 96,75 367 52 YKLKGDRAVAEDIVIILVDL 103,75 368 53 DRAVAEDIVIILVDLFNDQY 87,75 369 54 EDIVIILVDLFNDQYLEDNV 112,25 370 55 ILVDLFNDQYLEDNVTAPDY 100,25 371 56 FNDQYLEDNVTAPDYMKNVL 81 372 57 LEDNVTAPDYMKNVLVLTLS 99,75 373 58 TAPDYMKNVLVLTLSPGNSL 98,5 374 59 MKNVLVLTLSPGNSLLNSSF 135,25 375 60 MKNVLVLTLSPGNSLLNSSF 150,25 376 61 VLTLSPGNSLLNSSFSRNLS 125,5 377 62 PGNSLLNSSFSRNLSPTKRD 91,25 378 63 LNSSFSRNLSPTKRDFALAY 109,5 379 64 SRNLSPTKRDFALAYLNGIL 116 380 65 PTKRDFALAYLNGILLFGHM 103 381 66 FALAYLNGILLFGHMLKIFL 114,25 382 67 LNGILLFGHMLKIFLENGEN 93,25 383 68 LFGHMLKIFLENGENITTPK 73,5 384 69 LKIFLENGENITTPKFAHAF 100,5 385 70 ENGENITTPKFAHAFRNLTF 91,75 386 71 ITTPKFAHAFRNLTFEGYDG 105 387 72 FAHAFRNLTFEGYDGPVTLD 116 388 73 RNLTFEGYDGPVTLDDWGDV 116,25 389 74 EGYDGPVTLDDWGDVDSTMV 100 390 75 PVTLDDWGDVDSTMVLLYTS 88,25 391 76 DWGDVDSTMVLLYTSVDTKK 102 392 77 DSTMVLLYTSVDTKKYKVLL 98,25 393 78 LLYTSVDTKKYKVLLTYDTH 97,75 394 79 VDTKKYKVLLTYDTHVNKTY 130 395 80 YKVLLTYDTHVNKTYPVDMS 1468,75 396 81 TYDTHVNKTYPVDMSPTFTW 109 397 82 VNKTYPVDMSPTFTWKNSKL 99,25 398 83 PVDMSPTFTWKNSKLPNDIT 85,75 399 84 PTFTWKNSKLPNDITGRGPQ 133 400 85 KNSKLPNDITGRGPQILMIA 163,25 401 86 PNDITGRGPQILMIAVFTLT 110,5 402 87 LRKISNAQRMGCVLIGPSCT 102 403 88 NAQRMGCVLIGPSCTYSTFQ 120,25 404 89 GCVLIGPSCTYSTFQMYLDT 115 405 NSGDCRSSTCEGLDLLRKISNAQRM 406 RSSTCEGLDLLRKIS

Затем определяли конкуренцию пептида 19 GUCY2c (SEQ ID NO: 334) с полным внеклеточным доменом в конкурентном ELISA DELFIA способами, описанными выше, и показано, что он эффективно конкурирует с полным внеклеточным доменом (фигура 19). Это позволяет предполагать, что пептид 19 (SEQ ID NO 334) содержит специфический эпитоп, с которым связывается GUCY2C-1608, на полном внеклеточном домене GUCY2c.

GUCY2C-1608 связывается с иным эпитопом ECD GUCY2c, чем Антитело MS20

Связывание GUCY2C-1608 с внеклеточным доменом GUCY2c также сравнивали с известными с антителами против GUCY2c. Антитело MS20, описанное в US2013/315923, не имеет описанного эпитопа. Для сравнения этого антитела с GUCY2C-1608 осуществляли конкурентный ELISA Delfia с использованием модифицированного способа конкурентного ELISA Delfia, описанного выше. В этом случае белок GUCY2c человека (SEQ ID NO: 232) наносили в виде покрытия на планшет, как описано выше. GUCY2C-1640 (IgG-версию GUCY2C-1608; SEQ ID NO: 214 и 223) или антитело MS20 серийно разводили, начиная с 20 мкг/мл, затем комбинировали с химерной IgG-версией кролика GUCY2C-0098 (SEQ ID NO: 440 и 441, состоящих из SEQ ID NO: 26 и 106, слитых с константным доменом кролика) в количестве 250 нг/мл (значение EC₅₀, определенное отдельно). Планшеты промывали, как описано выше, и добавляли вторичное антитело против кролика с европием (Perkin Elmer), разведенное 1:1000, для детекции. Сигнал TRF определяли, как описано ранее. Снижение сигнала TRF свидетельствует о конкурентном связывании, т.к. химерная версия кролика GUCY2C-0098 вытесняется из связывания с GUCY2c человека. Как и ожидали, GUCY2C-1640 вытесняет химерную версию кролика GUCY2C-0098, в то время как MS20 не вытесняет (фигура 20). Таким образом, GUCY2C-1608 связывается с иным эпитопом ECD GUCY2c, чем антитело MS20.

Пример 30: GUCY2c-1608 связывается с иным эпитопом ECD GUCY2c, чем антитело 5F9

Описано, что антитела, описанные в US2011/0110936, связываются с разными последовательностями эпитопов на ECD GUCY2c из пептида 19 (SEQ ID NO 334), как представлено в настоящем описании ниже.

В лунку 96-луночного планшета добавляли 3×10⁶ клеток, экспрессирующих GUCY2c человека, крысы и курицы (CID1814, 1815 и 1818, соответственно), точечные мутанты CID1941-1950, "патч"-мутанты CID1868-1873 (патч-мутанты состоят из 2-5 аминокислотных остатков GUCY2c человека, замененных аминокислотными остатками из эквивалентных положений в GUCY2c курицы), или химеры GUCY2c человека-курицы CID1874-1881 (>5 аминокислот GUCY2c человека, замененных остатками GUCY2c курицы), или подтверждающие обратные химеры CID1939 и 1940 (>5 аминокислот GUCY2c курицы, замененных остатками GUCY2c человека), или отрицательный контроль CID1431 (конструкция отрицательного контроля, несодержащая последовательность GUCY2s, но имеющая те же эпитопные метки, что и другие конструкции, экспрессирующиеся на поверхности дрожжей). Клетки инкубировали с антителом против V5 (Abcam 27671), моновалентными или бивалентными антителами против GUCY2c, антителом GUCY2C-1608 или антителом 5F9 (антителом Millennium, описанным в US2011/0110936) в течение 1 часа при комнатной температуре. Затем клетки промывали три раза буфером PBS+0,5% BSA. Затем клетки инкубировали с PE-конъюгированным антителом против IgG мыши, или PE-конъюгированным антителом против IgG человека, или PE-конъюгированным антителом против HA (Miltenyi Biotec 130-092-257) в течение 30 минут при 4°C в темноте. Клетки промывали три раза буфером PBS+0,5% BSA, а затем анализировали с помощью проточного цитометра.

MFI (медиану интенсивности флуоресценции) антитела против GUCY2c, связывающегося с клетками, нормализовали по экспрессии на поверхности клетки, измеряемой по MFI антител против меток. Все клетки экспрессировали V5 и HA на поверхности клеток для нормализации экспрессии. В таблице 46 показано нормализованное относительное связывание антител против GUCY2c с каждой конструкцией GUCY2c. Химеры (за исключением CID1939 и CID1940), точечные мутанты и патч-мутанты, не связывающиеся с Ab против GUCY2c, демонстрируют, что остатки GUCY2c, измененные в этих конструкциях, важны для связывания с антителом. Восстановление связывания GUCY2C-1608, но не антитела 5F9 с обратными химерами CID1939 и CID1940 подтверждает, что антитело GUCY2C- 1608 связывается с остатками 68-87 на GUCY2c (SEQ ID NO: 224), и свидетельствует о том, что участок связывания антитела 5F9 не перекрывается с участком связывания антитела GUCY2C-1608.

Таблица 46

Конструкция GUCY2c (SEQ ID) Ab GUCY2Cc-1608 Ab 5F9 CID1814 (410) + + CID1815 (411) + - CID1818 (412) - - CID1868 (413) - + CID1869 (414) + + CID1870 (415) + + CID1871 (416) + + CID1872 (417) + + CID1873 (418) + + CID1874 (419) - + CID1875 (420) + + CID1876 (421) + + CID1877 (422) + + CID1878 (423) + + CID1879 (424) + + CID1880 (425) + + CID1881 (426) + + CID1939 (427) + - CID1940 (428) + - CID1941 (429) + + CID1942 (430) + + CID1943 (431) + + CID1944 (432) + + CID1945 (433) - + CID1946 (434) + + CID1947 (435) + + CID1948 (436) + + CID1949 (437) + + CID1950 (438) + + CID1431 (439) - -

Пример 31: Кристаллизация и определение структуры комплекса scFv против GUCY2C-1608 и GUCY2c-пептида

Для исследований кристаллизации комплекс scFv GUCY2C-1608 (SEQ ID NO 409) и пептида ECD GUCY2c № 19 ⁶⁸NSGDCRSSTCEGLDLLRKIS⁸⁷(SEQ ID NO 334) получали в молярном соотношении 1:1,2 и концентрировали до 8,8 мг/мл в белковом растворе, содержащем TBS, при pH 7,5. Кристаллы получали способом висячей капли посредством диффузии в парах в условиях, содержащих 20% PEG 3350, 200 мМ сульфата лития, бис-Трис, pH 5,5. Стержневые кристаллы имели симметрию, соответствующую моноклинной пространственной группе=P2₁2₁2₁ с параметрами ячейки a=70,68 Å; b=80,57 Å; c=90,7 Å и с двумя копиями пептидных комплексов scFv GUCY2C-1608 в кристаллографической асимметричной единице. Кристаллы криоконсервировали с использованием резервуарного раствора, содержащего 20% этиленгликоля, и быстро замораживали в жидком азоте. Набор данных для разрешения 1,6 Å получали для одного замороженного кристалла с помощью пучка синхротронного излучения IMCA 17-ID в Argonne National Laboratory (APS). Данные обрабатывали и масштабировали с использованием autoPROC, и конечный набор данных являлся на 71,4% полным.

Структуру разрешали посредством молекулярной замены с использованием PHASER, начиная с одноцепочечного Fv-фрагмента, полученного из структуры биспецифического антитела против GUCY2c и CD3 (фигура 22). Разрешения достигали посредством поиска двух копий scFv GUCY2C-1608. На полученных картах электронной плотности, вычисленных с использованием двух копий scFv GUCY2C-1608 в качестве модели, недвусмысленно видны дополнительные электронные плотности для двух пептидов, каждый из которых связан с соответствующей копией scFv GUCY2C-1608.

С помощью нескольких повторяющихся раундов ручной корректировки и перестройки модели с использованием COOT и кристаллографической детализации с использованием autoBUSTER получали конечную модель GUCY2C-1608 scFv+пептид с кристаллографическими показателями R_рабоч. 19,7% и R_{свободн.}21,7%, где R_рабоч.= ||F_набл.|-|F_выч.||/|F_набл.|, и R_{свободн} эквивалентно R_рабоч., но вычислено для случайно выбранных 5% отражений, опущенных во время детализации.

A. Описание структуры scFv GUCY2C-1608-пептид

GUCY2c-пептид длиной 17 остатков принимает, главным образом, α-спиральную конформацию после связывания с областями CDR scFv GUCY2C-1608 (фигура 21). α-спираль прижата дисульфидной SS-связью к N-концу пептида. Общая площадь поверхности связывания, погруженная относительно области взаимодействия, составляет ~1,320 Å², что является неожиданно большим для фрагмента длиной всего лишь 17 аминокислотных остатков. Поверхность связывания является, главным образом, гидрофобной с некоторыми специфическими полярными контактами в центре и контактами водородной связи на периферии (фигура 21).

Связывающие контакты эпитопов, находящиеся в пределах 3,8 Å от scFv GUCY2C-1608, определены подчеркнутыми остатками в пептидной последовательности ⁶⁸NSGDCRSSTCEGLDLLRKIS⁸⁷ и приведены в таблице 47. Аминокислоты, составляющие >75% площади связывающей поверхности, выделены полужирным шрифтом. Связывающий паратоп scFv GUCY2C-1608 определен 5 областями CDR: CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1 и CDR-L3. Аминокислоты scFv GUCY2C-1608 (паратоп) и GUCY2c-пептида (эпитоп), вносящие вклад в контакт в пределах 3,8 Å, приведены в таблице 48.

Таблица 47. Остатки эпитопа GUCY2c

Тип Цепь GUCY2c Положение %BSA Электростатические взаимодействия ARG C 73 50,28431 H SER C 74 56,99118 SER C 75 93,22802 H THR C 76 85,61988 H GLU C 78 46,89699 H GLY C 79 86,96493 W LEU C 80 78,57378 LEU C 82 28,2139 LEU C 83 88,59774 ARG C 84 40,15275 ILE C 86 23,20466

Таблица 48. Аминокислоты, определяющие паратоп (цепи H+L) и эпитоп (цепь C)

Остатки, имеющие атомы в пределах 3,80 Å Цепь антигена Остаток антигена Цепь антитела Остаток антитела (последовательный) (Kabat) C 73 H 33 33 C 73 H 57 56 C 73 H 58 57 C 73 H 59 58 C 74 H 33 33 C 74 H 50 50 C 74 H 59 58 C 75 H 33 33 C 75 H 50 50 C 75 L 99 96 C 76 L 96 92 C 76 L 98 94 C 78 H 33 33 C 79 H 107 100C C 80 H 107 100C C 80 L 31 27D C 80 L 96 92 C 82 H 101 97 C 83 H 104 100 C 83 H 105 100A C 83 L 36 32 C 84 L 31 27D C 84 L 32 28 C 86 H 103 99 C 86 H 104 100 C 86 H 105 100A

B. Кристаллизация и определение структуры биспецифических антител против GUCY2c и CD3

Для исследований кристаллизации получали модифицированную версию GUCY2C-1608 с меткой His6 или меткой FLAG на C-конце каждой цепи субъединицы VL-VH для облегчения очистки. Биспецифическое антитело против GUCY2c и CD3 для кристаллографии получали с использованием последовательностей VH GUCY2C-1637 (SEQ ID NO: 407) и VL GUCY2C-1637 (SEQ ID NO: 408). С помощью конструкций транзиторно трансфицировали клетки FreeStyle™ 293 HEK, как описано выше. После сбора кондиционированных сред 2,5 мл смолы Ni-NTA, заранее уравновешенной TBS, позволяли связываться с белком в течение 1 часа при 4°C с помощью орбитального миксера. Затем смолу собирали и помещали в колонку Applied Biosystems (Life Technologies, Grand Island, NY, USA). Сначала смолу промывали до исходного уровня буфером A (50 мМ фосфата натрия, 300 мМ хлорида натрия, pH 8,0), затем пятью CV буфера A, дополненного 20 мМ имидазола, и, наконец, элюировали буфером A+250 мМ имидазола. Фракции с наибольшей чистотой объединяли и диализовали в PBS с использованием кассеты 30 мл отсечкой по молекулярной массе 10 кДа в течение 2 часов при 4°C. Затем диализованный белок дополнительно очищали посредством хроматографии с использованием метки FLAG. Сорок мл смолы M2 против метки FLAG (Sigma, St. Louis, MO, USA) заранее уравновешивали TBS и позволяли связываться в 1,4 л кондиционированной среды в течение ночи при 4°C. Затем смолу собирали и упаковывали в колонку для хроматографии на M2 против FLAG, промывали до исходного уровня с использованием TBS (20 CV) и сначала элюировали 0,1 M буфером для пептида FLAG, а в конце элюировали с использованием 0,1 M глицина, pH 3,0. Элюированный белок незамедлительно нейтрализовали с помощью 10% 1,0 M Трис, pH 8,0. Затем фракции с наибольшей чистотой объединяли и дополнительно очищали посредством эксклюзионной хроматографии с использованием колонки Superdex200 (GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA) и хранили в TBS.

Для исследований кристаллизации очищенную с помощью His/FLAG версию GUCY2C-1608 концентрировали до 12 мг/мл в растворе белка, содержащем TBS, pH 7,5. Кристаллы получали способом висячей капли посредством диффузии в парах в условиях, включающих 1 М малоната натрия, pH 6, 2% полимера этиленимина. Кристаллы имели симметрию, соответствующую гексагональной пространственной группе=P3₂2₁ с параметрами ячейки a=b=119,55 Å и c=121,85 Å и с одной копией диатела в кристаллографической асимметричной единице. Кристаллы криоконсервировали с использованием резервуарного раствора, содержащего 2,8 M малоната натрия, pH 6, и быстро замораживали в жидком азоте. Набор данных для разрешения 2,03 Å получали для одного замороженного кристалла с помощью пучка синхротронного излучения IMCA 17-ID в Argonne National Laboratory (APS). Данные обрабатывали и масштабировали с использованием autoPROC, и конечный набор данных являлся на 49,3% полным.

Структуру разрешали посредством молекулярной замены с использованием PHASER, начиная с моделей одноцепочечного Fv-фрагмента, полученных с помощью записи в Brookhaven PDB 1moe. Разрешения достигали посредством отдельного поиска для каждой из четырех субъединиц молекулы диатело. С помощью нескольких повторяющихся раундов ручной корректировки и перестройки модели с использованием COOT и кристаллографической детализации с использованием autoBUSTER получали конечную модель диатела с кристаллографическими показателями R_рабоч. 19,1% и R_{свободн.} 20,8%, где R_рабоч.= ||F_набл.|-|F_выч.||/|F_набл.|, и R_{свободн.} эквивалентно R_рабоч., но вычислено для случайно выбранных 5% отражений, опущенных во время детализации.

C. Описание структуры диатела против GUCY2C-CD3

Два антигенсвязывающих участка на биспецифическом антителе против GUCY2c и CD3 разделены приблизительно 70 Å и находятся на противоположных сторонах молекулы, непосредственно друг напротив друга (фигура 22). Области CDR против CD3 и CDR против GUCY2c расположены на отдалении от области контакта субъединиц.

Пример 32: Оценка in vivo комбинации биспецифического антитела против GUCY2c-CD3 с mAb против VEGF-A и акситинибом

PBMC человека размораживали в средах (X-VIVO 15 (Lonza). Добавляли 5% сывороточного альбумина человека (Gemini #100-318), 1% пенициллина/стрептомицина, 0,01 мМ 2-меркаптоэтанола на приблизительно 5 миллионов клеток на мл. Клетки центрифугировали и ресуспендировали в буфере Robosep (Stem Cell Technologies) в концентрации 50 миллионов клеток на мл. T-клетки выделяли с использованием набора для обогащения T-клеток человека EasySep (Stem Cell Technologies). T-клетки активировали и выращивали с использованием набора для активации/экспансии T-клеток человека (Miltenyi). В день 2 T-клетки переносили в устройство для культивирования клеток G-Rex для экспансии и в среду добавляли ИЛ-2 (Stem Cell Technologies) и восполняли через 2 дня. T-клетки собирали через 1 неделю после активации/экспансии. Во время сбора частицы удаляли с помощью магнита и клетки ресуспендировали в DPBS в количестве 1×10⁷ клеток/мл для инокуляции in vivo.

Мышам NSG подкожно в бок инокулировали полученные из пациента фрагменты колоректального ксенотрансплантата PDX-CRX-11201. Опухоли измеряли с использованием цифрового штангенциркуля и вычисляли объемы с помощью модифицированной формулы эллипсоида ½ × длина × ширина2. Мышей рандомизировали и стадировали по размеру опухоли 150-200 мм³. Начальную дозу биспецифического антитела против GUCY2c (GUCY2C-1608), биспецифического антитела отрицательного контроля или носителя вводили животным в день 0 и 2 миллиона культивированных T-клеток инокулировали на следующий день. Мышам вводили дозы в виде болюсных инъекций 0,2 мл еженедельно до 3 раз, и все введения соединений и T-клеток осуществляли внутривенно через хвостовую вену каждого животного. Комбинированные средства вводили, начиная со дня 0. mAb против VEGF (G6-31) вводили каждые 3 дня до 4 раз внутривенно через хвостовую вену. Акситиниб вводили дважды в сутки в течение до 14 дней с помощью желудочного зонда. Опухоли измеряли дважды в неделю вместе с непрерывным мониторингом признаков реакции "трансплантат-против-хозяина".

Биспецифическое антитело против GUCY2c и CD3, вводимое в количестве 0,05 мг/кг, демонстрировало частичный противоопухолевый ответ в модели адоптивного переноса PDX-11201. mAb против VEGF и акситиниб также демонстрировали частичный противоопухолевый ответ в этой модели при введении в отдельности в количестве 5 мг/кг и 15 мг/кг, соответственно. Комбинация биспецифического антитела против GUCY2c и CD3 с mAb против VEGF или акситинибом приводила к аддитивным противоопухолевым ответам, демонстрируя полное ингибирование опухоли.

GUCY2C-1608 демонстрировало повышенное ингибирование роста опухоли при комбинировании с mAb против VEGF, а также акситинибом в модели полученного из пациента ксенотрансплантата колоректальной карциномы PDX-CRX-11201 с адоптивным переносом T-клеток.

Пример 33: Оценка in vivo комбинации биспецифического антитела против GUCY2c и CD3 с антителом против PD1

PBMC человека размораживали в средах (X-VIVO 15 (Lonza). Добавляли 5% сывороточного альбумина человека (Gemini #100-318), 1% пенициллина/стрептомицина, 0,01 мМ 2-меркаптоэтанола на приблизительно 5 миллионов клеток на мл. Клетки центрифугировали и ресуспендировали в буфере Robosep (Stem Cell Technologies) в концентрации 50 миллионов клеток на мл. T-клетки выделяли с использованием набора для обогащения T-клеток человека EasySep (Stem Cell Technologies). T-клетки активировали и выращивали с использованием набора для активации/экспансии T-клеток человека (Miltenyi). В день 2 T-клетки переносили в устройство для культивирования клеток G-Rex для экспансии, в среды добавляли ИЛ-2 (Stem Cell Technologies) и восполняли через 2 дня. T-клетки собирали через 1 неделю после активации/экспансии. Во время сбора частицы удаляли с помощью магнита и клетки ресуспендировали в DPBS в количестве 1×10⁷ клеток/мл для инокуляции in vivo.

Мышам NSG подкожно в бок инокулировали клетки линии колоректального рака LS1034. Опухоли измеряли с использованием цифрового штангенциркуля и вычисляли объемы с помощью модифицированной формулы эллипсоида ½ × длина × ширина2. Мышей рандомизировали и стадировали по размеру опухоли 150-200 мм³. Начальную дозу биспецифического антитела против GUCY2c (GUCY2C-1608) в количестве 0,03 мг/кг, биспецифического антитела отрицательного контроля в количестве 0,1 мг/кг, антитела против PD1 (биоаналог пембролизумаба D265A, мутант по эффекторной функции Fc hIgG1a) в количестве 5 мг/кг или носителя вводили животным в день 0 и 2 миллиона культивированных T-клеток инокулировали на следующий день. Мышам вводили дозы в виде болюсных инъекций 0,2 мл еженедельно до 3 раз, и все введения соединений и T-клеток осуществляли внутривенно через боковую хвостовую вену каждого животного. Опухоли измеряли дважды в неделю вместе с непрерывным мониторингом признаков реакции "трансплантат-против-хозяина".

Биспецифическое антитело против GUCY2c и CD3, вводимое в количестве 0,03 мг/кг, демонстрировало частичный противоопухолевый ответ в модели адоптивного переноса LS1034. Антитело против PD-1 не демонстрировало противоопухолевый ответ в этой модели при введении в количестве 10 мг/кг. Комбинирование биспецифического антитела против GUCY2c и CD3 с антителом против PD-1 приводило к аддитивному противоопухолевому ответу (фигура 24).

GUCY2C-1608 демонстрировало повышенное ингибирование роста опухоли при комбинировании с mAb против PD1 в модели полученного из линии клеток колоректальной карциномы ксенотрансплантата LS1034 с адоптивным переносом T-клеток.

Пример 34: Оценка in vivo комбинации биспецифического антитела против GUCY2c и CD3 с антителом против PDL1

PBMC человека размораживали в средах (X-VIVO 15 (Lonza). Добавляли 5% сывороточного альбумина человека (Gemini #100-318), 1% пенициллина/стрептомицина, 0,01 мМ 2-меркаптоэтанола на приблизительно 5 миллионов клеток на мл. Клетки центрифугировали и ресуспендировали в буфере Robosep (Stem Cell Technologies) в концентрации 50 миллионов клеток на мл. T-клетки выделяли с использованием набора для обогащения T-клеток человека EasySep (Stem Cell Technologies). T-клетки активировали и выращивали с использованием набора для активации/экспансии T-клеток человека (Miltenyi). В день 2 T-клетки переносили в устройство для культивирования клеток G-Rex для экспансии, в среды добавляли ИЛ-2 (Stem Cell Technologies) и восполняли через 2 дня. T-клетки собирали через 1 неделю после активации/экспансии. Во время сбора частицы удаляли с помощью магнита и клетки ресуспендировали в DPBS в количестве 1×10⁷ клеток/мл для инокуляции in vivo.

Мышам NSG подкожно в бок инокулировали клетки линии колоректального рака LS1034. Опухоли измеряли с использованием цифрового штангенциркуля и вычисляли объемы с помощью модифицированной формулы эллипсоида ½ × длина × ширина2. Мышей рандомизировали и стадировали по размеру опухоли 150-200 мм³. Начальную дозу биспецифического антитела против GUCY2c (GUCY2C-1608) в количестве 0,03 мг/кг, или биспецифического антитела отрицательного контроля в количестве 0,1 мг/кг, или носителя вводили животным в день 0 и 2 миллиона культивированных T-клеток инокулировали на следующий день. Мышам вводили дозы в виде болюсных инъекций 0,2 мл еженедельно до 3 раз, и все введения соединений и T-клеток осуществляли внутривенно через боковую хвостовую вену каждого животного. Антитело против PDL1 вводили внутривенно, начиная со дня 0, каждые 3 дня до 6 раз. Опухоли измеряли дважды в неделю вместе с непрерывным мониторингом признаков реакции "трансплантат-против-хозяина".

Биспецифическое антитело против GUCY2c и CD3, вводимое в количестве 0,03 мг/кг, демонстрировало частичный противоопухолевый ответ в модели адоптивного переноса LS1034. Антитело против PD-L1 не демонстрировало противоопухолевый ответ в этой модели при введении в количестве 10 мг/кг. Комбинирование биспецифического антитела против GUCY2c и CD3 с антителом против PD-L1 приводило к аддитивному противоопухолевому ответу (фигура 25).

GUCY2C-1608 демонстрировало повышенное ингибирование роста опухоли при комбинировании с mAb против PD-L1 в модели полученного из линии клеток колоректальной карциномы ксенотрансплантата LS1034 с адоптивным переносом T-клеток.

Пример 35: Исследование фазы 1 с повышением дозы и изучением ранее установленной максимальной переносимой дозы в расширенной популяции для оценки безопасности, переносимости, фармакокинетики, фармакодинамики и противоопухолевой активности биспецифического антитела GUCY2c-1608 на пациентах с опухолями желудочно-кишечного тракта на поздней стадии

В этом примере описано открытое, многоцентровое, многодозовое исследование фазы 1 безопасности, PK и PD биспецифического антитела GUCY2c-1608. Исследование включает две части, повышения дозы в качестве единственного средства и подбора дозы в комбинации (с антителом против PD-1 или антителом против VEGF) (части 1A и 1B, соответственно) с последующим исследованием ранее установленной максимальной переносимой дозы в расширенной популяции (часть 2). Последовательным когортам пациентов с опухолями желудочно-кишечного тракта на поздней стадии/метастазирующими, включая колоректальную аденокарциному, аденокарциному желудка и пищевода, неявлявшихся кандидатами для схем лечения, о которых известно, что они приносят клиническую пользу, будут вводить увеличивающиеся дозы биспецифического антитела GUCY2c-1608 в части 1A исследования. В части 1B будут проводить подбор доз биспецифического антитела GUCY2c-1608 в комбинации (с антителом против PD-1 или антителом против VEGF) на пациентах с колоректальной аденокарциномой, аденокарциномами желудка и пищевода на поздней стадии/метастазирующими. В части 2 (фазе исследования ранее установленной максимальной переносимой дозы в расширенной популяции) будут оценивать рекомендуемую дозу фазы 2 (RP2D), выбранную в части 1 (фазе повышения дозы), в виде монотерапии или в комбинации (с антителом против PD-1 или антителом против VEGF) на пациентах с колоректальными аденокарциномами, ранее подвергавшимися лечению. Когорты для оценки биомаркеров, для которых необходимы парные биоптаты опухоли этих пациентов, можно использовать в частях 1A и 1B при приближении к максимальной переносимой дозе (MTD) или в случае RP2D/MTD и в подгруппах групп исследования ранее установленной максимальной переносимой дозы в расширенной популяции в части 2.

Увеличивающиеся дозы GUCY2c-1608 будут вводить в виде еженедельных подкожных (SC) инъекций в 21-дневных циклах. Предполагаемая начальная доза SC составляет 0,6 мкг/кг.

После определения GUCY2c-1608 RP2D/MTD в виде монотерапии будут собирать дозовые когорты части 1B для исследования безопасности, переносимости и предварительной противоопухолевой активности при этом уровне доз в комбинации (с антителом против PD-1 или антителом против VEGF). В фазу исследования ранее установленной максимальной переносимой дозы в расширенной популяции (часть 2) будут оценивать RP2D GUCY2c-1608 в виде монотерапии и комбинированного средства (с антителом против PD-1 или антителом против VEGF) на пациентах с колоректальными аденокарциномами на поздней стадии/метастазирующими.

Также будет иметь место по меньшей мере 72-часовой интервал между первой дозой, вводимой каждому из исходных пациентов (т.е. пациентов, включенных в исходную оценку дозолимитирующей токсичности (DLT)), включенных в исследование на новом уровне дозы. Всех пациентов будут наблюдать стационарно в течение по меньшей мере 48 часов или более после первой дозы SC цикла 1 дня 1 (C1D1) части 1.

Лечение с использованием GUCY2c-1608 будут продолжать до прогрессирования заболевания, отказа пациента или возникновения неприемлемой токсичности, в зависимости от того, что произойдет первым, если исследователь и медицинский наблюдатель не согласятся на лечение в условиях прогрессирования заболевания с учетом индивидуальной оценки пользы/риска.

Альтернативная схема дозирования с введением доз IV

Можно оценивать внутривенное (IV) введение, учитывая доступные клинические данные (включая безопасность/переносимость, PK, PD и др.), полученные с помощью когорт повышения дозы с введением SC.

В этом исследовании можно проводить оценку усиленной начальной дозы, чтобы сделать возможным последующий более высокий уровень дозы.

Критерии для повышения дозы

Для когорт введения уровни начальной дозы приведены в таблице 49; промежуточные дозы можно оценивать с учетом клинических результатов. В случае когорт введения SC во время использования начальных уровней повышения доз максимальные повышения дозы будут составлять до 250%, но их будут корректировать до не более 100% после наблюдения DLT.

Таблица 49

Уровни повышения доз SC для введения Уровень дозы Доза (мкг/кг) DL1 (Начальная доза) 0,6 DL2 2,0 DL3 и выше Продолжение повышения до MTD или желаемой фармакологической активности

* Промежуточные дозы можно оценивать с учетом клинических результатов

Повышение дозы будут прекращать при достижении критериев прекращения, что определяет специалист в этой области.

Часть 1A исследования предназначена для определения MTD для схемы введения доз SC, однако, если схему дозирования переключают на IV, то будут определять MTD для введения доз IV. Если для IV необходимо включение усиленной начальной дозы, будут определять MTD для IV с использованием схемы введения усиленной начальной дозы.

Часть 1B будет предназначена для определения MTD GUCY2c-1608 в виде комбинированного средства (с антителом против PD-1 или антителом против VEGF).

RP2D является дозой, выбранной для дальнейшего исследования с учетом результатов фазы 1 исследования.

Выбор пациентов

Для повышения дозы (часть 1A и 1B): гистологическая или цитологическая диагностика колоректальной аденокарциномы или аденокарциномы желудка или пищевода на поздней стадии/метастазирующей, являющейся резистентной к стандартной терапии, или для которой стандартная терапия недоступна.

Для исследования ранее установленной максимальной переносимой дозы в расширенной популяции (часть 2): гистологическая или цитологическая диагностика колоректальной аденокарциномы, ранее подвергавшейся лечению, с по меньшей мере одним измеримым очагом, ранее не облученным, что определяют по RECIST версии 1.1, являющейся резистентной к стандартной терапии, или для которой стандартная терапия недоступна.

Лечение синдрома высвобождения цитокинов

Лечение синдрома высвобождения цитокинов (CRS) и пересмотренная оценочная система CRS адаптированы из D.W.Lee, et al: Current Concepts in the Diagnosis and Management of Cytokine Release Syndrome. Blood 124 (2014) 188-195.

Введение антитела против ИЛ-6: Рассматривают введение 4 мг/кг в течение 1 часа и введение второй дозы в случае отсутствия клинического улучшения в течение от 24 до 48 часов.

Описание каждого патента, патентной заявки и публикации, процитированных в настоящем описании, включено, таким образом, в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме.

Эквивалент

Хотя настоящее изобретение описано со ссылкой на конкретные варианты осуществления, очевидно, что специалисты в этой области могу разрабатывать другие варианты осуществления и варианты настоящего изобретения без отклонения от сущности и объема изобретения. Объект изобретения включает все эти другие варианты осуществления и варианты, включая комбинации и подкомбинации различных элементов, признаков, функций и/или свойств, представленных в настоящем описании. В следующей формуле изобретения конкретно указаны некоторые комбинации и покомбинации, рассматриваемые в качестве новых и неочевидных. Изобретение, воплощенное в других комбинациях и подкомбинациях признаков, функций, элементов и/или свойств, может быть заявлено в настоящей заявке, в заявках, по которым испрашивается приоритет по настоящей заявке, или в связанных заявках. Такие пункты формулы изобретения, направленные на другое изобретение или то же изобретение и имеющие более широкий, более узкий, равный или иной объем по сравнению с исходной формулой изобретения, также считают включенными в объем настоящего изобретения.

--->

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> ПФАЙЗЕР ИНК.

Chang, Chew

Guntas, Gurkan

Katragadda, Madan

Mathur, Divya

Root, Adam

Mosyak, Lidia

LaVallie, Edward

<120> АНТИТЕЛА ПРОТИВ GUCY2C И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ

<130> PC72377

<160> 445

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 121

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая пептидная последовательность

<400> 1

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr

20 25 30

Tyr Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Phe Ile Arg Asn Arg Ala Arg Gly Tyr Thr Ser Asp His Asn Pro

50 55 60

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser

65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr

85 90 95

Tyr Cys Ala Arg Asp Arg Pro Ser Tyr Tyr Val Leu Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 2

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая пептидная последовательность

<400> 2

Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr Tyr Met Thr

1 5 10

<210> 3

<211> 19

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая пептидная последовательность

<400> 3

Phe Ile Arg Asn Arg Ala Arg Gly Tyr Thr Ser Asp His Asn Pro Ser

1 5 10 15

Val Lys Gly

<210> 4

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая пептидная последовательность

<400> 4

Asp Arg Pro Ser Tyr Tyr Val Leu Asp Tyr

1 5 10

<210> 5

<211> 25

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая пептидная последовательность

<400> 5

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser

20 25

<210> 6

<211> 14

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая пептидная последовательность

<400> 6

Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala

1 5 10

<210> 7

<211> 32

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая пептидная последовательность

<400> 7

Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln

1 5 10 15

Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg

20 25 30

<210> 8

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая пептидная последовательность

<400> 8

Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

1 5 10

<210> 9

<211> 121

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая пептидная последовательность

<400> 9

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr

20 25 30

Tyr Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Phe Ile Arg Asn Gln Ala Arg Gly Tyr Thr Ser Asp His Asn Pro

50 55 60

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser

65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr

85 90 95

Tyr Cys Ala Arg Asp Arg Pro Ser Tyr Tyr Val Leu Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 10

<211> 19

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая пептидная последовательность

<400> 10

Phe Ile Arg Asn Gln Ala Arg Gly Tyr Thr Ser Asp His Asn Pro Ser

1 5 10 15

Val Lys Gly

<210> 11

<211> 114

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая пептидная последовательность

<400> 11

Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Asn Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr

20 25 30

Trp Met Gln Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Met Thr Thr Tyr Thr Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Ala Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Val Arg Lys Gly Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val

100 105 110

Ser Ser

<210> 12

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая пептидная последовательность

<400> 12

Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr Trp Met Gln

1 5 10

<210> 13

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая пептидная последовательность

<400> 13

Ala Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Met Thr Thr Tyr Thr Gln Lys Phe Lys

1 5 10 15

Asp

<210> 14

<211> 5

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая пептидная последовательность

<400> 14

Lys Gly Met Asp Tyr

1 5

<210> 15

<211> 25

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая пептидная последовательность

<400> 15

Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Asn Leu Ser Cys Lys Ala Ser

20 25

<210> 16

<211> 14

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая пептидная последовательность

<400> 16

Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly

1 5 10

<210> 17

<211> 32

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая пептидная последовательность

<400> 17

Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln

1 5 10 15

Leu Ser Ser Leu Ala Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Val Arg

20 25 30

<210> 18

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая пептидная последовательность

<400> 18

Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser

1 5 10

<210> 19

<211> 120

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая пептидная последовательность

<400> 19

Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Lys Tyr

20 25 30

Trp Met Gln Trp Ile Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Phe Thr Thr Tyr Thr Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Ala Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Arg Asn Tyr Gly Arg Thr Tyr Gly Gly Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 20

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая пептидная последовательность

<400> 20

Gly Tyr Thr Phe Thr Lys Tyr Trp Met Gln

1 5 10

<210> 21

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая пептидная последовательность

<400> 21

Ala Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Phe Thr Thr Tyr Thr Gln Lys Phe Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 22

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая пептидная последовательность

<400> 22

Arg Asn Tyr Gly Arg Thr Tyr Gly Gly Asp Tyr

1 5 10

<210> 23

<211> 25

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая пептидная последовательность

<400> 23

Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser

20 25

<210> 24

<211> 14

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая пептидная последовательность

<400> 24

Trp Ile Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly

1 5 10

<210> 25

<211> 32

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая пептидная последовательность

<400> 25

Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Asn Thr Ala Tyr Met Gln

1 5 10 15

Leu Ser Ser Leu Ala Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg

20 25 30

<210> 26

<211> 122

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая пептидная последовательность

<400> 26

Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Glu Ile Lys Pro Ser Asn Gly Leu Thr Asn Tyr Ile Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Asn Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ala Thr Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ala Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Arg Thr Ile Thr Thr Thr Glu Gly Tyr Trp Phe Phe Asp Val Trp

100 105 110

Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 27

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая пептидная последовательность

<400> 27

Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Trp Met His

1 5 10

<210> 28

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая пептидная последовательность

<400> 28

Glu Ile Lys Pro Ser Asn Gly Leu Thr Asn Tyr Ile Glu Lys Phe Lys

1 5 10 15

Asn

<210> 29

<211> 13

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая пептидная последовательность

<400> 29

Thr Ile Thr Thr Thr Glu Gly Tyr Trp Phe Phe Asp Val

1 5 10

<210> 30

<211> 25

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая пептидная последовательность

<400> 30

Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser

20 25

<210> 31

<211> 32

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая пептидная последовательность

<400> 31

Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ala Thr Thr Ala Tyr Met Gln

1 5 10 15

Leu Ser Ser Leu Thr Ala Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Arg

20 25 30

<210> 32

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая пептидная последовательность

<400> 32

Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

1 5 10

<210> 33

<211> 115

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая пептидная последовательность

<400> 33

Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr

20 25 30

Tyr Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Ala Asn Tyr Asp Pro Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Phe Tyr Cys

85 90 95

Ser Ser Leu Gly Thr Gly Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr

100 105 110

Val Ser Ser

115

<210> 34

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая пептидная последовательность

<400> 34

Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr Tyr Ile His

1 5 10

<210> 35

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая пептидная последовательность

<400> 35

Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Ala Asn Tyr Asp Pro Lys Phe Gln

1 5 10 15

Gly

<210> 36

<211> 6

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая пептидная последовательность

<400> 36

Leu Gly Thr Gly Thr Tyr

1 5

<210> 37

<211> 25

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая пептидная последовательность

<400> 37

Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser

20 25

<210> 38

<211> 14

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая пептидная последовательность

<400> 38

Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly

1 5 10

<210> 39

<211> 32

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая пептидная последовательность

<400> 39

Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr Leu Gln

1 5 10 15

Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Phe Tyr Cys Ser Ser

20 25 30

<210> 40

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая пептидная последовательность

<400> 40

Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser

1 5 10

<210> 41

<211> 123

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая пептидная последовательность

<400> 41

Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Ile Met Leu Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Asn Ser Asn Pro Tyr Tyr Gly Ser Thr Ser Tyr Asn Leu Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met His Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Gly Tyr Tyr Gly Ser Ser Pro Tyr Trp Tyr Phe Asp Val

100 105 110

Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 42

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая пептидная последовательность

<400> 42

Gly Tyr Ser Phe Thr Asp Tyr Ile Met Leu

1 5 10

<210> 43

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая пептидная последовательность

<400> 43

Asn Ser Asn Pro Tyr Tyr Gly Ser Thr Ser Tyr Asn Leu Lys Phe Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 44

<211> 14

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая пептидная последовательность

<400> 44

Ser Gly Tyr Tyr Gly Ser Ser Pro Tyr Trp Tyr Phe Asp Val

1 5 10

<210> 45

<211> 25

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая пептидная последовательность

<400> 45

Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser

20 25

<210> 46

<211> 14

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая пептидная последовательность

<400> 46

Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile Gly

1 5 10

<210> 47

<211> 32

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая пептидная последовательность

<400> 47

Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met His

1 5 10 15

Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg

20 25 30

<210> 48

<211> 114

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая пептидная последовательность

<400> 48

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr

20 25 30

Trp Met Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Met Thr Thr Tyr Thr Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ala Lys Asn Ser Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Val Arg Lys Gly Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val

100 105 110

Ser Ser

<210> 49

<211> 14

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая пептидная последовательность

<400> 49

Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly

1 5 10

<210> 50

<211> 32

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая пептидная последовательность

<400> 50

Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ala Lys Asn Ser Ala Tyr Leu Gln

1 5 10 15

Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val Arg

20 25 30

<210> 51

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая пептидная последовательность

<400> 51

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

1 5 10

<210> 52

<211> 114

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая пептидная последовательность

<400> 52

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr

20 25 30

Trp Met Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Met Thr Thr Tyr Thr Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Val Arg Lys Gly Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val

100 105 110

Ser Ser

<210> 53

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая пептидная последовательность

<400> 53

Ala Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Met Thr Thr Tyr Thr Gln Lys Phe Gln

1 5 10 15

Gly

<210> 54

<211> 25

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая пептидная последовательность

<400> 54

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser

20 25

<210> 55

<211> 14

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая пептидная последовательность

<400> 55

Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly

1 5 10

<210> 56

<211> 32

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая пептидная последовательность

<400> 56

Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr Met Glu

1 5 10 15

Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val Arg

20 25 30

<210> 57

<211> 123

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая пептидная последовательность

<400> 57

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Ile Met Leu Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Asn Ser Asn Pro Tyr Tyr Gly Ser Thr Ser Tyr Asn Leu Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Lys Ala Lys Asn Ser Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Gly Tyr Tyr Gly Ser Ser Pro Tyr Trp Tyr Phe Asp Val

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 58

<211> 32

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая пептидная последовательность

<400> 58

Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Lys Ala Lys Asn Ser Ala Tyr Leu Gln

1 5 10 15

Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg

20 25 30

<210> 59

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая пептидная последовательность

<400> 59

Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser

1 5 10

<210> 60

<211> 122

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая пептидная последовательность

<400> 60

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Glu Ile Lys Pro Ser Asn Gly Leu Thr Asn Tyr Ile Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Asn Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Lys Ala Lys Asn Ser Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Arg Thr Ile Thr Thr Thr Glu Gly Tyr Trp Phe Phe Asp Val Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 61

<211> 32

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая пептидная последовательность

<400> 61

Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Lys Ala Lys Asn Ser Ala Tyr Leu Gln

1 5 10 15

Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Arg

20 25 30

<210> 62

<211> 122

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая пептидная последовательность

<400> 62

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Ala Glu Ile Lys Pro Ser Asn Gly Leu Thr Asn Tyr Ile Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Asn Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Thr Ile Thr Thr Thr Glu Gly Tyr Trp Phe Phe Asp Val Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 63

<211> 14

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая пептидная последовательность

<400> 63

Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Ala

1 5 10

<210> 64

<211> 122

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая пептидная последовательность

<400> 64

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Glu Ile Lys Pro Ser Asn Gly Leu Thr Asn Tyr Ile Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Asn Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Thr Ile Thr Thr Thr Glu Gly Tyr Trp Phe Phe Asp Val Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 65

<211> 122

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая пептидная последовательность

<400> 65

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Glu Ile Lys Pro Ser Asn Gly Leu Thr Asn Ile His Pro Lys Phe

50 55 60

Lys Asn Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Lys Ala Lys Asn Ser Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Arg Thr Ile Thr Thr Thr Glu Gly Tyr Trp Phe Phe Asp Val Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 66

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая пептидная последовательность

<400> 66

Glu Ile Lys Pro Ser Asn Gly Leu Thr Asn Ile His Pro Lys Phe Lys

1 5 10 15

Asn

<210> 67

<211> 122

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая пептидная последовательность

<400> 67

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Glu Ile Lys Pro Ser Asn Gly Leu Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Asn Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Lys Ala Lys Asn Ser Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Arg Thr Ile Thr Thr Thr Glu Gly Tyr Trp Phe Phe Asp Val Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 68

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая пептидная последовательность

<400> 68

Glu Ile Lys Pro Ser Asn Gly Leu Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys

1 5 10 15

Asn

<210> 69

<211> 122

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая пептидная последовательность

<400> 69

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Glu Ile Lys Pro Ser Asn Gly Leu Thr Asn Val His Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Asn Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Lys Ala Lys Asn Ser Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Arg Thr Ile Thr Thr Thr Glu Gly Tyr Trp Phe Phe Asp Val Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 70

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая пептидная последовательность

<400> 70

Glu Ile Lys Pro Ser Asn Gly Leu Thr Asn Val His Glu Lys Phe Lys

1 5 10 15

Asn

<210> 71

<211> 122

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая пептидная последовательность

<400> 71

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Glu Ile Lys Pro Ser Asn Gly Leu Thr Asn Tyr Ala Glu Gln Phe

50 55 60

Lys Asn Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Lys Ala Lys Asn Ser Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Arg Thr Ile Thr Thr Thr Glu Gly Tyr Trp Phe Phe Asp Val Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 72

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая пептидная последовательность

<400> 72

Glu Ile Lys Pro Ser Asn Gly Leu Thr Asn Tyr Ala Glu Gln Phe Lys

1 5 10 15

Asn

<210> 73

<211> 122

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая пептидная последовательность

<400> 73

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Glu Ile Lys Pro Ser Asn Glu Leu Thr Asn Val His Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Lys Ala Lys Asn Ser Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Arg Thr Ile Thr Thr Thr Glu Gly Tyr Trp Phe Phe Asp Val Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 74

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая пептидная последовательность

<400> 74

Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Trp Met His

1 5 10

<210> 75

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая пептидная последовательность

<400> 75

Glu Ile Lys Pro Ser Asn Glu Leu Thr Asn Val His Glu Lys Phe Lys

1 5 10 15

Asp

<210> 76

<211> 112

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая пептидная последовательность

<400> 76

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Thr Ser Ser Gln Ser Leu Phe Asn Val

20 25 30

Arg Ser Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys

35 40 45

Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val

50 55 60

Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Lys Gln

85 90 95

Ser Tyr Asp Leu Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 77

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая пептидная последовательность

<400> 77

Thr Ser Ser Gln Ser Leu Phe Asn Val Arg Ser Arg Lys Asn Tyr Leu

1 5 10 15

Ala

<210> 78

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая пептидная последовательность

<400> 78

Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser

1 5

<210> 79

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая пептидная последовательность

<400> 79

Lys Gln Ser Tyr Asp Leu Phe Thr

1 5

<210> 80

<211> 23

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая пептидная последовательность

<400> 80

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys

20

<210> 81

<211> 15

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая пептидная последовательность

<400> 81

Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr

1 5 10 15

<210> 82

<211> 32

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая пептидная последовательность

<400> 82

Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr

1 5 10 15

Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys

20 25 30

<210> 83

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая пептидная последовательность

<400> 83

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

1 5 10

<210> 84

<211> 112

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая пептидная последовательность

<400> 84

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Phe Asn Val

20 25 30

Arg Ser Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Pro Pro Lys Leu Leu Ile Ser Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Gln

85 90 95

Ser Tyr Asp Leu Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 85

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая пептидная последовательность

<400> 85

Lys Ser Ser Gln Ser Leu Phe Asn Val Arg Ser Arg Lys Asn Tyr Leu

1 5 10 15

Ala

<210> 86

<211> 23

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая пептидная последовательность

<400> 86

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys

20

<210> 87

<211> 15

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая пептидная последовательность

<400> 87

Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Ser

1 5 10 15

<210> 88

<211> 32

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая пептидная последовательность

<400> 88

Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr

1 5 10 15

Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys

20 25 30

<210> 89

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая пептидная последовательность

<400> 89

Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

1 5 10

<210> 90

<211> 112

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая пептидная последовательность

<400> 90

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Thr Ser Ser Gln Ser Leu Phe Asn Val

20 25 30

Arg Ser Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys

35 40 45

Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val

50 55 60

Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Lys Gln

85 90 95

Ser Tyr Asp Leu Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 91

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая пептидная последовательность

<400> 91

Thr Ser Ser Gln Ser Leu Phe Asn Val Arg Ser Gln Lys Asn Tyr Leu

1 5 10 15

Ala

<210> 92

<211> 111

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая пептидная последовательность

<400> 92

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asn Tyr

20 25 30

Gly Ile Ser Phe Met Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Pro Gly Ser Gly Val Pro Ala

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Leu Asn Ile His

65 70 75 80

Pro Leu Glu Glu Asp Asp Thr Ala Met Phe Phe Cys Gln Gln Ser Lys

85 90 95

Glu Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 93

<211> 15

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая пептидная последовательность

<400> 93

Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asn Tyr Gly Ile Ser Phe Met Asn

1 5 10 15

<210> 94

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая пептидная последовательность

<400> 94

Ala Ala Ser Asn Pro Gly Ser

1 5

<210> 95

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая пептидная последовательность

<400> 95

Gln Gln Ser Lys Glu Val Pro Tyr Thr

1 5

<210> 96

<211> 23

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая пептидная последовательность

<400> 96

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys

20

<210> 97

<211> 15

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая пептидная последовательность

<400> 97

Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr

1 5 10 15

<210> 98

<211> 32

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая пептидная последовательность

<400> 98

Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser

1 5 10 15

Leu Asn Ile His Pro Leu Glu Glu Asp Asp Thr Ala Met Phe Phe Cys

20 25 30

<210> 99

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая пептидная последовательность

<400> 99

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

1 5 10

<210> 100

<211> 111

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая пептидная последовательность

<400> 100

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asn Phe

20 25 30

Asp Ile Ser Phe Met Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Gln Gly Ser Gly Val Pro Ala

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Leu Asn Ile His

65 70 75 80

Pro Met Glu Glu Asp Asp Thr Ala Met Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Lys

85 90 95

Glu Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 101

<211> 15

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая пептидная последовательность

<400> 101

Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asn Phe Asp Ile Ser Phe Met Asn

1 5 10 15

<210> 102

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая пептидная последовательность

<400> 102

Ala Ala Ser Asn Gln Gly Ser

1 5

<210> 103

<211> 32

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая пептидная последовательность

<400> 103

Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser

1 5 10 15

Leu Asn Ile His Pro Met Glu Glu Asp Asp Thr Ala Met Tyr Phe Cys

20 25 30

<210> 104

<211> 111

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая пептидная последовательность

<400> 104

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Gly Glu Ser Val Asp Asn Phe

20 25 30

Asp Ile Ser Phe Met Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Gln Gly Ser Gly Val Pro Ala

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Leu Asn Ile His

65 70 75 80

Pro Met Glu Glu Asp Asp Thr Ala Met Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Lys

85 90 95

Glu Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 105

<211> 15

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая пептидная последовательность

<400> 105

Arg Ala Gly Glu Ser Val Asp Asn Phe Asp Ile Ser Phe Met Asn

1 5 10 15

<210> 106

<211> 110

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая пептидная последовательность

<400> 106

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Tyr Tyr

20 25 30

Gly Thr Ser Leu Met Gln Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Val Glu Ser Gly Val Pro Ala

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Leu Asn Ile His

65 70 75 80

Pro Val Glu Glu Asp Asp Ile Ala Met Tyr Phe Cys Gln Gln Thr Arg

85 90 95

Lys Val Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 107

<211> 15

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая пептидная последовательность

<400> 107

Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Tyr Tyr Gly Thr Ser Leu Met Gln

1 5 10 15

<210> 108

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая пептидная последовательность

<400> 108

Ala Ala Ser Asn Val Glu Ser

1 5

<210> 109

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая пептидная последовательность

<400> 109

Gln Gln Thr Arg Lys Val Tyr Thr

1 5

<210> 110

<211> 15

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая пептидная последовательность

<400> 110

Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr

1 5 10 15

<210> 111

<211> 32

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая пептидная последовательность

<400> 111

Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser

1 5 10 15

Leu Asn Ile His Pro Val Glu Glu Asp Asp Ile Ala Met Tyr Phe Cys

20 25 30

<210> 112

<211> 111

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 112

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Lys Gly Val Thr Thr Ser

20 25 30

Gly Tyr Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His

65 70 75 80

Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg

85 90 95

Glu Phe Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys

100 105 110

<210> 113

<211> 15

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая пептидная последовательность

<400> 113

Arg Ala Ser Lys Gly Val Thr Thr Ser Gly Tyr Ser Tyr Met His

1 5 10 15

<210> 114

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая пептидная последовательность

<400> 114

Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser

1 5

<210> 115

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая пептидная последовательность

<400> 115

Gln His Ser Arg Glu Phe Pro Leu Thr

1 5

<210> 116

<211> 23

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая пептидная последовательность

<400> 116

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys

20

<210> 117

<211> 32

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая пептидная последовательность

<400> 117

Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr

1 5 10 15

Leu Asn Ile His Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys

20 25 30

<210> 118

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая пептидная последовательность

<400> 118

Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys

1 5 10

<210> 119

<211> 112

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая пептидная последовательность

<400> 119

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Val Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Val Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser

20 25 30

Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln

35 40 45

Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser

65 70 75 80

Ile Ser Ser Val Lys Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln

85 90 95

Tyr Tyr Ser Tyr Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 120

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая пептидная последовательность

<400> 120

Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu

1 5 10 15

Ala

<210> 121

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая пептидная последовательность

<400> 121

Gln Gln Tyr Tyr Ser Tyr Pro Thr

1 5

<210> 122

<211> 23

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая пептидная последовательность

<400> 122

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Val Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Val Ser Cys

20

<210> 123

<211> 15

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая пептидная последовательность

<400> 123

Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr

1 5 10 15

<210> 124

<211> 32

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая пептидная последовательность

<400> 124

Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr

1 5 10 15

Leu Ser Ile Ser Ser Val Lys Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys

20 25 30

<210> 125

<211> 111

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая пептидная последовательность

<400> 125

Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asn Tyr

20 25 30

Gly Ile Ser Phe Met Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Pro Gly Ser Gly Val Pro Ser

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

65 70 75 80

Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Lys

85 90 95

Glu Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 126

<211> 23

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая пептидная последовательность

<400> 126

Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys

20

<210> 127

<211> 15

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая пептидная последовательность

<400> 127

Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr

1 5 10 15

<210> 128

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая пептидная последовательность

<400> 128

Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

1 5 10

<210> 129

<211> 111

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая пептидная последовательность

<400> 129

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asn Tyr

20 25 30

Gly Ile Ser Phe Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro

35 40 45

Arg Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Pro Gly Ser Gly Ile Pro Ala

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

65 70 75 80

Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Lys

85 90 95

Glu Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 130

<211> 23

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая пептидная последовательность

<400> 130

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys

20

<210> 131

<211> 15

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая пептидная последовательность

<400> 131

Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr

1 5 10 15

<210> 132

<211> 32

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая пептидная последовательность

<400> 132

Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr

1 5 10 15

Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys

20 25 30

<210> 133

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая пептидная последовательность

<400> 133

Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

1 5 10

<210> 134

<211> 112

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая пептидная последовательность

<400> 134

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser

20 25 30

Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys

35 40 45

Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val

50 55 60

Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln

85 90 95

Tyr Tyr Ser Tyr Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 135

<211> 15

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая пептидная последовательность

<400> 135

Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr

1 5 10 15

<210> 136

<211> 110

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая пептидная последовательность

<400> 136

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Tyr Tyr

20 25 30

Gly Thr Ser Leu Met Gln Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Val Glu Ser Gly Val Pro Ser

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

65 70 75 80

Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Arg

85 90 95

Lys Val Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 137

<211> 110

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая пептидная последовательность

<400> 137

Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Tyr Tyr

20 25 30

Gly Thr Ser Leu Met Gln Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Val Glu Ser Gly Val Pro Ser

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

65 70 75 80

Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Arg

85 90 95

Lys Val Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 138

<211> 110

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая пептидная последовательность

<400> 138

Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Tyr Tyr

20 25 30

Gly Thr Ser Leu Met Gln Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Pro Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Val Glu Ser Gly Val Pro Ser

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

65 70 75 80

Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Arg

85 90 95

Lys Val Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 139

<211> 15

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая пептидная последовательность

<400> 139

Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr

1 5 10 15

<210> 140

<211> 110

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая пептидная последовательность

<400> 140

Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Tyr Tyr

20 25 30

Gly Thr Ser Leu Met Gln Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Lys Arg Tyr Ser Gly Val Pro Ser

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

65 70 75 80

Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Arg

85 90 95

Lys Ala Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 141

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Artificial Sequene

<220>

<223> Синтетическая пептидная последовательность

<400> 141

Ala Ala Ser Lys Arg Tyr Ser

1 5

<210> 142

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 142

Gln Gln Thr Arg Lys Ala Tyr Thr

1 5

<210> 143

<211> 110

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая пептидная последовательность

<400> 143

Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Tyr Tyr

20 25 30

Gly Thr Ser Leu Met Gln Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Lys Leu Trp Ser Gly Val Pro Ser

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

65 70 75 80

Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Arg

85 90 95

Lys Val Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 144

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая пептидная последовательность

<400> 144

Ala Ala Ser Lys Leu Trp Ser

1 5

<210> 145

<211> 110

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая пептидная последовательность

<400> 145

Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Tyr Tyr

20 25 30

Gly Thr Ser Leu Met Gln Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Lys Val Ala Pro Gly Val Pro Ser

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

65 70 75 80

Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Arg

85 90 95

Lys Ala Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 146

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая пептидная последовательность

<400> 146

Ala Ala Ser Lys Val Ala Pro

1 5

<210> 147

<211> 110

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая пептидная последовательность

<400> 147

Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Tyr Tyr

20 25 30

Gly Ser Ser Leu Leu Gln Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

65 70 75 80

Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Arg

85 90 95

Lys Ala Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 148

<211> 15

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая пептидная последовательность

<400> 148

Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Tyr Tyr Gly Ser Ser Leu Leu Gln

1 5 10 15

<210> 149

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая пептидная последовательность

<400> 149

Ala Ala Ser Lys Leu Ala Ser

1 5

<210> 150

<211> 110

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая пептидная последовательность

<400> 150

Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Tyr Tyr

20 25 30

Gly Thr Ser Leu Met Gln Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Ile Ala Pro Gly Val Pro Ser

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

65 70 75 80

Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Arg

85 90 95

Lys Ala Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 151

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая пептидная последовательность

<400> 151

Ala Ala Ser Asn Ile Ala Pro

1 5

<210> 152

<211> 110

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая пептидная последовательность

<400> 152

Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Tyr Tyr

20 25 30

Gly Ser Ser Leu Met Gln Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Lys Arg Tyr Ser Gly Val Pro Ser

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

65 70 75 80

Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Arg

85 90 95

Lys Glu Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Lys Ile Lys

100 105 110

<210> 153

<211> 15

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая пептидная последовательность

<400> 153

Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Tyr Tyr Gly Ser Ser Leu Met Gln

1 5 10 15

<210> 154

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая пептидная последовательность

<400> 154

Gln Gln Thr Arg Lys Glu Tyr Thr

1 5

<210> 155

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая пептидная последовательность

<400> 155

Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Lys Ile Lys

1 5 10

<210> 156

<211> 110

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая пептидная последовательность

<400> 156

Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Tyr Tyr

20 25 30

Gly Ser Ser Leu Met Gln Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Val Ala Pro Gly Val Pro Ser

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

65 70 75 80

Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Arg

85 90 95

Lys Ala Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 157

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая пептидная последовательность

<400> 157

Ala Ala Ser Asn Val Ala Pro

1 5

<210> 158

<211> 110

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая пептидная последовательность

<400> 158

Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Tyr Tyr

20 25 30

Gly Ser Ser Leu Met Gln Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser His Arg Ala Ser Gly Val Pro Ser

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

65 70 75 80

Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Arg

85 90 95

Lys Ala Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 159

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 159

Ala Ala Ser His Arg Ala Ser

1 5

<210> 160

<211> 110

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая пептидная последовательность

<400> 160

Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Tyr Tyr

20 25 30

Gly Thr Ser Leu Met Gln Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Val Ala Ser Gly Val Pro Ser

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

65 70 75 80

Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Arg

85 90 95

Lys Glu Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 161

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая пептидная последовательность

<400> 161

Ala Ala Ser Asn Val Ala Ser

1 5

<210> 162

<211> 110

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 162

Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Tyr Tyr

20 25 30

Gly His Ser Leu Met Gln Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Arg Tyr Ser Gly Val Pro Ser

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

65 70 75 80

Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Arg

85 90 95

Lys Ala Tyr Ser Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 163

<211> 15

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая пептидная последовательность

<400> 163

Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Tyr Tyr Gly His Ser Leu Met Gln

1 5 10 15

<210> 164

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая пептидная последовательность

<400> 164

Ala Ala Ser Asn Arg Tyr Ser

1 5

<210> 165

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая пептидная последовательность

<400> 165

Gln Gln Thr Arg Lys Ala Tyr Ser

1 5

<210> 166

<211> 110

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая пептидная последовательность

<400> 166

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Tyr

20 25 30

Gly Ser Ser Leu Leu Gln Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

65 70 75 80

Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Glu Arg

85 90 95

Lys Ala Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 167

<211> 15

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая пептидная последовательность

<400> 167

Arg Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Tyr Gly Ser Ser Leu Leu Gln

1 5 10 15

<210> 168

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая пептидная последовательность

<400> 168

Asp Ala Ser Lys Leu Ala Ser

1 5

<210> 169

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая пептидная последовательность

<400> 169

Gln Gln Glu Arg Lys Ala Tyr Thr

1 5

<210> 170

<211> 110

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая пептидная последовательность

<400> 170

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Tyr

20 25 30

Gly Ser Ser Leu Leu Gln Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

65 70 75 80

Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Glu Arg

85 90 95

Lys Ala Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 171

<211> 110

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая пептидная последовательность

<400> 171

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Tyr

20 25 30

Gly Ser Ser Leu Leu Gln Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

65 70 75 80

Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Arg

85 90 95

Lys Ala Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 172

<211> 110

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая пептидная последовательность

<400> 172

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Tyr

20 25 30

Gly Ser Ser Leu Leu Gln Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

65 70 75 80

Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Arg

85 90 95

Lys Ala Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 173

<211> 110

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая пептидная последовательность

<400> 173

Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Tyr Tyr

20 25 30

Gly Ser Ser Leu Leu Gln Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

65 70 75 80

Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Glu Arg

85 90 95

Lys Ala Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 174

<211> 110

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая пептидная последовательность

<400> 174

Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Tyr Tyr

20 25 30

Gly Ser Ser Leu Leu Gln Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

65 70 75 80

Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Glu Arg

85 90 95

Lys Ala Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 175

<211> 110

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая пептидная последовательность

<400> 175

Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Tyr Tyr

20 25 30

Gly Ser Ser Leu Leu Gln Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

65 70 75 80

Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Arg

85 90 95

Lys Ala Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 176

<211> 107

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая пептидная последовательность

<400> 176

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Asn Ile Lys Gln Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val

100 105

<210> 177

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая пептидная последовательность

<400> 177

Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Trp Met Ser

1 5 10

<210> 178

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая пептидная последовательность

<400> 178

Asn Ile Lys Gln Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 179

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая пептидная последовательность

<400> 179

Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val

1 5

<210> 180

<211> 107

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая пептидная последовательность

<400> 180

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 181

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая пептидная последовательность

<400> 181

Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn

1 5 10

<210> 182

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая пептидная последовательность

<400> 182

Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser

1 5

<210> 183

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая пептидная последовательность

<400> 183

Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Tyr Thr

1 5

<210> 184

<211> 107

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 184

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

1 5 10 15

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

20 25 30

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

35 40 45

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

50 55 60

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

65 70 75 80

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

85 90 95

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

100 105

<210> 185

<211> 98

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 185

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Lys Val

<210> 186

<211> 15

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 186

Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro

1 5 10 15

<210> 187

<211> 217

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 187

Ala Pro Glu Ala Ala Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys

1 5 10 15

Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val

20 25 30

Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr

35 40 45

Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu

50 55 60

Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His

65 70 75 80

Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys

85 90 95

Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln

100 105 110

Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met

115 120 125

Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro

130 135 140

Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn

145 150 155 160

Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu

165 170 175

Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val

180 185 190

Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln

195 200 205

Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

210 215

<210> 188

<211> 216

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая пептидная последовательность

<400> 188

Ala Pro Glu Ala Ala Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys

1 5 10 15

Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val

20 25 30

Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr

35 40 45

Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu

50 55 60

Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His

65 70 75 80

Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys

85 90 95

Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln

100 105 110

Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met

115 120 125

Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro

130 135 140

Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn

145 150 155 160

Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu

165 170 175

Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val

180 185 190

Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln

195 200 205

Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

210 215

<210> 189

<211> 216

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая пептидная последовательность

<400> 189

Ala Pro Glu Ala Ala Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys

1 5 10 15

Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val

20 25 30

Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr

35 40 45

Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu

50 55 60

Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His

65 70 75 80

Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys

85 90 95

Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln

100 105 110

Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Glu Glu Met

115 120 125

Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro

130 135 140

Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn

145 150 155 160

Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu

165 170 175

Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val

180 185 190

Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln

195 200 205

Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

210 215

<210> 190

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая пептидная последовательность

<400> 190

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

1 5

<210> 191

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая пептидная последовательность

<400> 191

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

1 5

<210> 192

<211> 6

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая пептидная последовательность

<400> 192

Gly Cys Pro Pro Cys Pro

1 5

<210> 193

<211> 16

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая пептидная последовательность

<400> 193

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

1 5 10 15

<210> 194

<211> 5

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая пептидная последовательность

<400> 194

Arg Thr Ser Asp Gln

1 5

<210> 195

<211> 15

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая пептидная последовательность

<400> 195

Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro

1 5 10 15

<210> 196

<211> 462

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая пептидная последовательность

<400> 196

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asn Tyr

20 25 30

Gly Ile Ser Phe Met Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Pro Gly Ser Gly Val Pro Ala

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Leu Asn Ile His

65 70 75 80

Pro Leu Glu Glu Asp Asp Thr Ala Met Phe Phe Cys Gln Gln Ser Lys

85 90 95

Glu Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly

100 105 110

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly

115 120 125

Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser

130 135 140

Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr Tyr Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro

145 150 155 160

Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Phe Ile Arg Asn Arg Ala Arg Gly

165 170 175

Tyr Thr Ser Asp His Asn Pro Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser

180 185 190

Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg

195 200 205

Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Arg Pro Ser Tyr

210 215 220

Tyr Val Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

225 230 235 240

Gly Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Ala Pro Ser Val

245 250 255

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr

260 265 270

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu

275 280 285

Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys

290 295 300

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser

305 310 315 320

Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

325 330 335

Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile

340 345 350

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro

355 360 365

Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu

370 375 380

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn

385 390 395 400

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser

405 410 415

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

420 425 430

Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

435 440 445

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

450 455 460

<210> 197

<211> 456

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая пептидная последовательность

<400> 197

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Phe Asn Val

20 25 30

Arg Ser Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Pro Pro Lys Leu Leu Ile Ser Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Gln

85 90 95

Ser Tyr Asp Leu Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly

115 120 125

Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala Ser Val Asn Leu Ser Cys Lys Ala

130 135 140

Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr Trp Met Gln Trp Val Lys Gln Arg

145 150 155 160

Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asp Gly

165 170 175

Met Thr Thr Tyr Thr Gln Lys Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala

180 185 190

Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Ala Ser

195 200 205

Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Val Arg Lys Gly Met Asp Tyr Trp

210 215 220

Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Gly Cys Pro Pro Cys Pro

225 230 235 240

Ala Pro Glu Ala Ala Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys

245 250 255

Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val

260 265 270

Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr

275 280 285

Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu

290 295 300

Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His

305 310 315 320

Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys

325 330 335

Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln

340 345 350

Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Glu Glu Met

355 360 365

Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro

370 375 380

Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn

385 390 395 400

Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu

405 410 415

Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val

420 425 430

Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln

435 440 445

Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

450 455

<210> 198

<211> 918

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая пептидная последовательность

<400> 198

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asn Tyr

20 25 30

Gly Ile Ser Phe Met Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Pro Gly Ser Gly Val Pro Ala

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Leu Asn Ile His

65 70 75 80

Pro Leu Glu Glu Asp Asp Thr Ala Met Phe Phe Cys Gln Gln Ser Lys

85 90 95

Glu Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly

100 105 110

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly

115 120 125

Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser

130 135 140

Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr Tyr Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro

145 150 155 160

Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Phe Ile Arg Asn Arg Ala Arg Gly

165 170 175

Tyr Thr Ser Asp His Asn Pro Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser

180 185 190

Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg

195 200 205

Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Arg Pro Ser Tyr

210 215 220

Tyr Val Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

225 230 235 240

Gly Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Ala Pro Ser Val

245 250 255

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr

260 265 270

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu

275 280 285

Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys

290 295 300

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser

305 310 315 320

Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

325 330 335

Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile

340 345 350

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro

355 360 365

Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu

370 375 380

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn

385 390 395 400

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser

405 410 415

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

420 425 430

Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

435 440 445

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Asp Ile

450 455 460

Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly Glu Arg

465 470 475 480

Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Phe Asn Val Arg Ser

485 490 495

Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro

500 505 510

Lys Leu Leu Ile Ser Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val Pro Asp

515 520 525

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

530 535 540

Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Gln Ser Tyr

545 550 555 560

Asp Leu Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly

565 570 575

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu

580 585 590

Leu Ala Arg Pro Gly Ala Ser Val Asn Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly

595 600 605

Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr Trp Met Gln Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly

610 615 620

Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Met Thr

625 630 635 640

Thr Tyr Thr Gln Lys Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys

645 650 655

Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Ala Ser Glu Asp

660 665 670

Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Val Arg Lys Gly Met Asp Tyr Trp Gly Gln

675 680 685

Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Gly Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro

690 695 700

Glu Ala Ala Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys

705 710 715 720

Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val

725 730 735

Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp

740 745 750

Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr

755 760 765

Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp

770 775 780

Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu

785 790 795 800

Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg

805 810 815

Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Glu Glu Met Thr Lys

820 825 830

Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp

835 840 845

Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys

850 855 860

Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser

865 870 875 880

Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser

885 890 895

Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser

900 905 910

Leu Ser Leu Ser Pro Gly

915

<210> 199

<211> 461

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая пептидная последовательность

<400> 199

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Tyr Tyr

20 25 30

Gly Thr Ser Leu Met Gln Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Val Glu Ser Gly Val Pro Ala

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Leu Asn Ile His

65 70 75 80

Pro Val Glu Glu Asp Asp Ile Ala Met Tyr Phe Cys Gln Gln Thr Arg

85 90 95

Lys Val Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly

100 105 110

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly

115 120 125

Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly

130 135 140

Phe Thr Phe Ser Asp Tyr Tyr Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly

145 150 155 160

Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Phe Ile Arg Asn Arg Ala Arg Gly Tyr

165 170 175

Thr Ser Asp His Asn Pro Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg

180 185 190

Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala

195 200 205

Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Arg Pro Ser Tyr Tyr

210 215 220

Val Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly

225 230 235 240

Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Ala Pro Ser Val Phe

245 250 255

Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro

260 265 270

Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val

275 280 285

Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr

290 295 300

Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val

305 310 315 320

Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys

325 330 335

Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser

340 345 350

Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro

355 360 365

Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val

370 375 380

Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly

385 390 395 400

Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp

405 410 415

Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp

420 425 430

Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His

435 440 445

Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

450 455 460

<210> 200

<211> 464

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая пептидная последовательность

<400> 200

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Phe Asn Val

20 25 30

Arg Ser Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Pro Pro Lys Leu Leu Ile Ser Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Gln

85 90 95

Ser Tyr Asp Leu Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly

115 120 125

Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala

130 135 140

Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg

145 150 155 160

Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Glu Ile Lys Pro Ser Asn Gly

165 170 175

Leu Thr Asn Tyr Ile Glu Lys Phe Lys Asn Lys Ala Thr Leu Thr Val

180 185 190

Asp Lys Ser Ala Thr Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ala

195 200 205

Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Arg Thr Ile Thr Thr Thr Glu

210 215 220

Gly Tyr Trp Phe Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val

225 230 235 240

Ser Ser Gly Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Ala Pro

245 250 255

Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser

260 265 270

Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp

275 280 285

Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn

290 295 300

Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val

305 310 315 320

Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu

325 330 335

Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys

340 345 350

Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr

355 360 365

Leu Pro Pro Cys Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser

370 375 380

Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu

385 390 395 400

Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu

405 410 415

Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys

420 425 430

Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu

435 440 445

Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

450 455 460

<210> 201

<211> 925

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая пептидная последовательность

<400> 201

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Tyr Tyr

20 25 30

Gly Thr Ser Leu Met Gln Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Val Glu Ser Gly Val Pro Ala

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Leu Asn Ile His

65 70 75 80

Pro Val Glu Glu Asp Asp Ile Ala Met Tyr Phe Cys Gln Gln Thr Arg

85 90 95

Lys Val Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly

100 105 110

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly

115 120 125

Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly

130 135 140

Phe Thr Phe Ser Asp Tyr Tyr Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly

145 150 155 160

Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Phe Ile Arg Asn Arg Ala Arg Gly Tyr

165 170 175

Thr Ser Asp His Asn Pro Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg

180 185 190

Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala

195 200 205

Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Arg Pro Ser Tyr Tyr

210 215 220

Val Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly

225 230 235 240

Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Ala Pro Ser Val Phe

245 250 255

Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro

260 265 270

Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val

275 280 285

Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr

290 295 300

Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val

305 310 315 320

Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys

325 330 335

Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser

340 345 350

Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro

355 360 365

Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val

370 375 380

Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly

385 390 395 400

Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp

405 410 415

Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp

420 425 430

Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His

435 440 445

Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Asp Ile Val

450 455 460

Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly Glu Arg Ala

465 470 475 480

Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Phe Asn Val Arg Ser Arg

485 490 495

Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys

500 505 510

Leu Leu Ile Ser Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg

515 520 525

Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser

530 535 540

Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Gln Ser Tyr Asp

545 550 555 560

Leu Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly

565 570 575

Ser Gly Gly Gly Gly Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu

580 585 590

Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr

595 600 605

Thr Phe Thr Ser Tyr Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln

610 615 620

Gly Leu Glu Trp Ile Gly Glu Ile Lys Pro Ser Asn Gly Leu Thr Asn

625 630 635 640

Tyr Ile Glu Lys Phe Lys Asn Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser

645 650 655

Ala Thr Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ala Glu Asp Ser

660 665 670

Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Arg Thr Ile Thr Thr Thr Glu Gly Tyr Trp

675 680 685

Phe Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly

690 695 700

Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Ala Pro Ser Val Phe

705 710 715 720

Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro

725 730 735

Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val

740 745 750

Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr

755 760 765

Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val

770 775 780

Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys

785 790 795 800

Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser

805 810 815

Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro

820 825 830

Cys Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val

835 840 845

Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly

850 855 860

Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp

865 870 875 880

Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp

885 890 895

Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His

900 905 910

Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

915 920 925

<210> 202

<211> 463

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая пептидная последовательность

<400> 202

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Val Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Val Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser

20 25 30

Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln

35 40 45

Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser

65 70 75 80

Ile Ser Ser Val Lys Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln

85 90 95

Tyr Tyr Ser Tyr Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly

115 120 125

Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala

130 135 140

Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr Tyr Met Thr Trp Val Arg Gln Ala

145 150 155 160

Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Phe Ile Arg Asn Arg Ala Arg

165 170 175

Gly Tyr Thr Ser Asp His Asn Pro Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile

180 185 190

Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu

195 200 205

Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Arg Pro Ser

210 215 220

Tyr Tyr Val Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser

225 230 235 240

Ser Gly Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Ala Pro Ser

245 250 255

Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg

260 265 270

Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro

275 280 285

Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala

290 295 300

Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val

305 310 315 320

Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr

325 330 335

Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr

340 345 350

Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu

355 360 365

Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys

370 375 380

Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser

385 390 395 400

Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp

405 410 415

Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser

420 425 430

Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala

435 440 445

Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

450 455 460

<210> 203

<211> 465

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая пептидная последовательность

<400> 203

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Phe Asn Val

20 25 30

Arg Ser Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Pro Pro Lys Leu Leu Ile Ser Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Gln

85 90 95

Ser Tyr Asp Leu Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly

115 120 125

Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala

130 135 140

Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asp Tyr Ile Met Leu Trp Val Lys Gln Ser

145 150 155 160

His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile Gly Asn Ser Asn Pro Tyr Tyr Gly

165 170 175

Ser Thr Ser Tyr Asn Leu Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val

180 185 190

Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met His Leu Asn Ser Leu Thr Ser

195 200 205

Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Gly Tyr Tyr Gly Ser

210 215 220

Ser Pro Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr

225 230 235 240

Val Ser Ser Gly Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Ala

245 250 255

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

260 265 270

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

275 280 285

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

290 295 300

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg

305 310 315 320

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

325 330 335

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu

340 345 350

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

355 360 365

Thr Leu Pro Pro Cys Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

370 375 380

Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

385 390 395 400

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

405 410 415

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp

420 425 430

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

435 440 445

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

450 455 460

Gly

465

<210> 204

<211> 928

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая пептидная последовательность

<400> 204

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Val Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Val Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser

20 25 30

Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln

35 40 45

Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser

65 70 75 80

Ile Ser Ser Val Lys Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln

85 90 95

Tyr Tyr Ser Tyr Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly

115 120 125

Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala

130 135 140

Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr Tyr Met Thr Trp Val Arg Gln Ala

145 150 155 160

Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Phe Ile Arg Asn Arg Ala Arg

165 170 175

Gly Tyr Thr Ser Asp His Asn Pro Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile

180 185 190

Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu

195 200 205

Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Arg Pro Ser

210 215 220

Tyr Tyr Val Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser

225 230 235 240

Ser Gly Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Ala Pro Ser

245 250 255

Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg

260 265 270

Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro

275 280 285

Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala

290 295 300

Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val

305 310 315 320

Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr

325 330 335

Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr

340 345 350

Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu

355 360 365

Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys

370 375 380

Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser

385 390 395 400

Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp

405 410 415

Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser

420 425 430

Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala

435 440 445

Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Asp

450 455 460

Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly Glu

465 470 475 480

Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Phe Asn Val Arg

485 490 495

Ser Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro

500 505 510

Pro Lys Leu Leu Ile Ser Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val Pro

515 520 525

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile

530 535 540

Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Gln Ser

545 550 555 560

Tyr Asp Leu Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly

565 570 575

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro

580 585 590

Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser

595 600 605

Gly Tyr Ser Phe Thr Asp Tyr Ile Met Leu Trp Val Lys Gln Ser His

610 615 620

Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile Gly Asn Ser Asn Pro Tyr Tyr Gly Ser

625 630 635 640

Thr Ser Tyr Asn Leu Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp

645 650 655

Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met His Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu

660 665 670

Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Gly Tyr Tyr Gly Ser Ser

675 680 685

Pro Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val

690 695 700

Ser Ser Gly Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Ala Pro

705 710 715 720

Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser

725 730 735

Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp

740 745 750

Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn

755 760 765

Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val

770 775 780

Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu

785 790 795 800

Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys

805 810 815

Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr

820 825 830

Leu Pro Pro Cys Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser

835 840 845

Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu

850 855 860

Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu

865 870 875 880

Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys

885 890 895

Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu

900 905 910

Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

915 920 925

<210> 205

<211> 462

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая пептидная последовательность

<400> 205

Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asn Tyr

20 25 30

Gly Ile Ser Phe Met Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Pro Gly Ser Gly Val Pro Ser

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

65 70 75 80

Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Lys

85 90 95

Glu Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly

100 105 110

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly

115 120 125

Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser

130 135 140

Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr Tyr Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro

145 150 155 160

Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Phe Ile Arg Asn Arg Ala Arg Gly

165 170 175

Tyr Thr Ser Asp His Asn Pro Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser

180 185 190

Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg

195 200 205

Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Arg Pro Ser Tyr

210 215 220

Tyr Val Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

225 230 235 240

Gly Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Ala Pro Ser Val

245 250 255

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr

260 265 270

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu

275 280 285

Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys

290 295 300

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser

305 310 315 320

Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

325 330 335

Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile

340 345 350

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro

355 360 365

Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu

370 375 380

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn

385 390 395 400

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser

405 410 415

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

420 425 430

Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

435 440 445

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

450 455 460

<210> 206

<211> 456

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая пептидная последовательность

<400> 206

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Phe Asn Val

20 25 30

Arg Ser Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Pro Pro Lys Leu Leu Ile Ser Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Gln

85 90 95

Ser Tyr Asp Leu Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly

115 120 125

Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala

130 135 140

Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr Trp Met Gln Trp Val Arg Gln Ala

145 150 155 160

Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asp Gly

165 170 175

Met Thr Thr Tyr Thr Gln Lys Phe Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Ala

180 185 190

Asp Lys Ala Lys Asn Ser Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala

195 200 205

Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val Arg Lys Gly Met Asp Tyr Trp

210 215 220

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Cys Pro Pro Cys Pro

225 230 235 240

Ala Pro Glu Ala Ala Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys

245 250 255

Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val

260 265 270

Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr

275 280 285

Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu

290 295 300

Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His

305 310 315 320

Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys

325 330 335

Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln

340 345 350

Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Glu Glu Met

355 360 365

Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro

370 375 380

Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn

385 390 395 400

Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu

405 410 415

Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val

420 425 430

Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln

435 440 445

Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

450 455

<210> 207

<211> 918

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая пептидная последовательность

<400> 207

Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asn Tyr

20 25 30

Gly Ile Ser Phe Met Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Pro Gly Ser Gly Val Pro Ser

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

65 70 75 80

Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Lys

85 90 95

Glu Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly

100 105 110

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly

115 120 125

Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser

130 135 140

Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr Tyr Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro

145 150 155 160

Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Phe Ile Arg Asn Arg Ala Arg Gly

165 170 175

Tyr Thr Ser Asp His Asn Pro Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser

180 185 190

Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg

195 200 205

Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Arg Pro Ser Tyr

210 215 220

Tyr Val Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

225 230 235 240

Gly Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Ala Pro Ser Val

245 250 255

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr

260 265 270

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu

275 280 285

Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys

290 295 300

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser

305 310 315 320

Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

325 330 335

Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile

340 345 350

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro

355 360 365

Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu

370 375 380

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn

385 390 395 400

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser

405 410 415

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

420 425 430

Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

435 440 445

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Asp Ile

450 455 460

Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly Glu Arg

465 470 475 480

Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Phe Asn Val Arg Ser

485 490 495

Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro

500 505 510

Lys Leu Leu Ile Ser Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val Pro Asp

515 520 525

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

530 535 540

Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Gln Ser Tyr

545 550 555 560

Asp Leu Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly

565 570 575

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly

580 585 590

Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly

595 600 605

Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr Trp Met Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly

610 615 620

Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Met Thr

625 630 635 640

Thr Tyr Thr Gln Lys Phe Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Lys

645 650 655

Ala Lys Asn Ser Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp

660 665 670

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val Arg Lys Gly Met Asp Tyr Trp Gly Gln

675 680 685

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro

690 695 700

Glu Ala Ala Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys

705 710 715 720

Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val

725 730 735

Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp

740 745 750

Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr

755 760 765

Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp

770 775 780

Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu

785 790 795 800

Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg

805 810 815

Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Glu Glu Met Thr Lys

820 825 830

Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp

835 840 845

Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys

850 855 860

Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser

865 870 875 880

Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser

885 890 895

Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser

900 905 910

Leu Ser Leu Ser Pro Gly

915

<210> 208

<211> 217

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая пептидная последовательность

<400> 208

Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Tyr Tyr

20 25 30

Gly Thr Ser Leu Met Gln Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Val Glu Ser Gly Val Pro Ser

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

65 70 75 80

Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Arg

85 90 95

Lys Val Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr

100 105 110

Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu

115 120 125

Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro

130 135 140

Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly

145 150 155 160

Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr

165 170 175

Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His

180 185 190

Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val

195 200 205

Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 209

<211> 451

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая пептидная последовательность

<400> 209

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Glu Ile Lys Pro Ser Asn Gly Leu Thr Asn Tyr Ile Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Asn Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Lys Ala Lys Asn Ser Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Arg Thr Ile Thr Thr Thr Glu Gly Tyr Trp Phe Phe Asp Val Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro

115 120 125

Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr

130 135 140

Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr

145 150 155 160

Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro

165 170 175

Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr

180 185 190

Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn

195 200 205

His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser

210 215 220

Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala

225 230 235 240

Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu

245 250 255

Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser

260 265 270

His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu

275 280 285

Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr

290 295 300

Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn

305 310 315 320

Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro

325 330 335

Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln

340 345 350

Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val

355 360 365

Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val

370 375 380

Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro

385 390 395 400

Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr

405 410 415

Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val

420 425 430

Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu

435 440 445

Ser Pro Gly

450

<210> 210

<211> 461

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая пептидная последовательность

<400> 210

Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Tyr Tyr

20 25 30

Gly Thr Ser Leu Met Gln Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Pro Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Val Glu Ser Gly Val Pro Ser

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

65 70 75 80

Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Arg

85 90 95

Lys Val Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly

100 105 110

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly

115 120 125

Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly

130 135 140

Phe Thr Phe Ser Asp Tyr Tyr Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly

145 150 155 160

Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Phe Ile Arg Asn Arg Ala Arg Gly Tyr

165 170 175

Thr Ser Asp His Asn Pro Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg

180 185 190

Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala

195 200 205

Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Arg Pro Ser Tyr Tyr

210 215 220

Val Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly

225 230 235 240

Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Ala Pro Ser Val Phe

245 250 255

Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro

260 265 270

Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val

275 280 285

Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr

290 295 300

Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val

305 310 315 320

Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys

325 330 335

Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser

340 345 350

Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro

355 360 365

Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val

370 375 380

Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly

385 390 395 400

Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp

405 410 415

Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp

420 425 430

Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His

435 440 445

Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

450 455 460

<210> 211

<211> 464

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая пептидная последовательность

<400> 211

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Phe Asn Val

20 25 30

Arg Ser Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Pro Pro Lys Leu Leu Ile Ser Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Gln

85 90 95

Ser Tyr Asp Leu Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly

115 120 125

Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala

130 135 140

Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala

145 150 155 160

Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Glu Ile Lys Pro Ser Asn Gly

165 170 175

Leu Thr Asn Tyr Ile Glu Lys Phe Lys Asn Arg Phe Thr Ile Ser Val

180 185 190

Asp Lys Ala Lys Asn Ser Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala

195 200 205

Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Arg Thr Ile Thr Thr Thr Glu

210 215 220

Gly Tyr Trp Phe Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val

225 230 235 240

Ser Ser Gly Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Ala Pro

245 250 255

Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser

260 265 270

Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp

275 280 285

Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn

290 295 300

Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val

305 310 315 320

Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu

325 330 335

Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys

340 345 350

Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr

355 360 365

Leu Pro Pro Cys Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser

370 375 380

Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu

385 390 395 400

Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu

405 410 415

Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys

420 425 430

Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu

435 440 445

Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

450 455 460

<210> 212

<211> 925

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая пептидная последовательность

<400> 212

Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Tyr Tyr

20 25 30

Gly Thr Ser Leu Met Gln Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Pro Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Val Glu Ser Gly Val Pro Ser

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

65 70 75 80

Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Arg

85 90 95

Lys Val Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly

100 105 110

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly

115 120 125

Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly

130 135 140

Phe Thr Phe Ser Asp Tyr Tyr Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly

145 150 155 160

Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Phe Ile Arg Asn Arg Ala Arg Gly Tyr

165 170 175

Thr Ser Asp His Asn Pro Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg

180 185 190

Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala

195 200 205

Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Arg Pro Ser Tyr Tyr

210 215 220

Val Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly

225 230 235 240

Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Ala Pro Ser Val Phe

245 250 255

Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro

260 265 270

Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val

275 280 285

Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr

290 295 300

Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val

305 310 315 320

Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys

325 330 335

Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser

340 345 350

Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro

355 360 365

Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val

370 375 380

Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly

385 390 395 400

Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp

405 410 415

Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp

420 425 430

Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His

435 440 445

Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Asp Ile Val

450 455 460

Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly Glu Arg Ala

465 470 475 480

Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Phe Asn Val Arg Ser Arg

485 490 495

Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys

500 505 510

Leu Leu Ile Ser Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg

515 520 525

Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser

530 535 540

Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Gln Ser Tyr Asp

545 550 555 560

Leu Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly

565 570 575

Ser Gly Gly Gly Gly Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu

580 585 590

Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr

595 600 605

Thr Phe Thr Ser Tyr Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys

610 615 620

Gly Leu Glu Trp Ile Gly Glu Ile Lys Pro Ser Asn Gly Leu Thr Asn

625 630 635 640

Tyr Ile Glu Lys Phe Lys Asn Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Lys Ala

645 650 655

Lys Asn Ser Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr

660 665 670

Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Arg Thr Ile Thr Thr Thr Glu Gly Tyr Trp

675 680 685

Phe Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly

690 695 700

Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Ala Pro Ser Val Phe

705 710 715 720

Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro

725 730 735

Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val

740 745 750

Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr

755 760 765

Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val

770 775 780

Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys

785 790 795 800

Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser

805 810 815

Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro

820 825 830

Cys Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val

835 840 845

Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly

850 855 860

Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp

865 870 875 880

Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp

885 890 895

Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His

900 905 910

Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

915 920 925

<210> 213

<211> 483

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая пептидная последовательность

<400> 213

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Glu Ile Lys Pro Ser Asn Gly Leu Thr Asn Val His Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Asn Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Lys Ala Lys Asn Ser Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Arg Thr Ile Thr Thr Thr Glu Gly Tyr Trp Phe Phe Asp Val Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

115 120 125

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Asp Ile Gln Leu Thr Gln

130 135 140

Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr

145 150 155 160

Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Tyr Tyr Gly Ser Ser Leu Leu Gln

165 170 175

Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala

180 185 190

Ala Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly

195 200 205

Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp

210 215 220

Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Arg Lys Ala Tyr Thr Phe Gly

225 230 235 240

Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Ser Asp Gln Glu Pro Lys

245 250 255

Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala

260 265 270

Ala Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr

275 280 285

Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val

290 295 300

Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val

305 310 315 320

Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser

325 330 335

Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu

340 345 350

Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala

355 360 365

Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro

370 375 380

Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln

385 390 395 400

Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala

405 410 415

Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr

420 425 430

Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu

435 440 445

Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser

450 455 460

Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser

465 470 475 480

Leu Ser Pro

<210> 214

<211> 217

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая пептидная последовательность

<400> 214

Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Tyr Tyr

20 25 30

Gly Ser Ser Leu Leu Gln Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

65 70 75 80

Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Arg

85 90 95

Lys Ala Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr

100 105 110

Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu

115 120 125

Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro

130 135 140

Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly

145 150 155 160

Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr

165 170 175

Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His

180 185 190

Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val

195 200 205

Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 215

<211> 451

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая пептидная последовательность

<400> 215

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Glu Ile Lys Pro Ser Asn Gly Leu Thr Asn Val His Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Asn Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Lys Ala Lys Asn Ser Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Arg Thr Ile Thr Thr Thr Glu Gly Tyr Trp Phe Phe Asp Val Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro

115 120 125

Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr

130 135 140

Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr

145 150 155 160

Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro

165 170 175

Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr

180 185 190

Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn

195 200 205

His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser

210 215 220

Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala

225 230 235 240

Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu

245 250 255

Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser

260 265 270

His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu

275 280 285

Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr

290 295 300

Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn

305 310 315 320

Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro

325 330 335

Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln

340 345 350

Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val

355 360 365

Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val

370 375 380

Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro

385 390 395 400

Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr

405 410 415

Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val

420 425 430

Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu

435 440 445

Ser Pro Gly

450

<210> 216

<211> 461

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая пептидная последовательность

<400> 216

Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Tyr Tyr

20 25 30

Gly Ser Ser Leu Leu Gln Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

65 70 75 80

Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Arg

85 90 95

Lys Ala Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly

100 105 110

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly

115 120 125

Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly

130 135 140

Phe Thr Phe Ser Asp Tyr Tyr Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly

145 150 155 160

Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Phe Ile Arg Asn Gln Ala Arg Gly Tyr

165 170 175

Thr Ser Asp His Asn Pro Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg

180 185 190

Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala

195 200 205

Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Arg Pro Ser Tyr Tyr

210 215 220

Val Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly

225 230 235 240

Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Ala Pro Ser Val Phe

245 250 255

Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro

260 265 270

Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val

275 280 285

Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr

290 295 300

Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val

305 310 315 320

Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys

325 330 335

Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser

340 345 350

Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro

355 360 365

Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val

370 375 380

Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly

385 390 395 400

Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp

405 410 415

Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp

420 425 430

Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His

435 440 445

Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

450 455 460

<210> 217

<211> 465

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая пептидная последовательность

<400> 217

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Thr Ser Ser Gln Ser Leu Phe Asn Val

20 25 30

Arg Ser Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys

35 40 45

Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val

50 55 60

Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Lys Gln

85 90 95

Ser Tyr Asp Leu Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Glu Val Gln Leu Val Glu Ser

115 120 125

Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala

130 135 140

Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Trp Met His Trp Val Arg Gln

145 150 155 160

Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Glu Ile Lys Pro Ser Asn

165 170 175

Gly Leu Thr Asn Val His Glu Lys Phe Lys Asn Arg Phe Thr Ile Ser

180 185 190

Val Asp Lys Ala Lys Asn Ser Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg

195 200 205

Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Arg Thr Ile Thr Thr Thr

210 215 220

Glu Gly Tyr Trp Phe Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr

225 230 235 240

Val Ser Ser Gly Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Ala

245 250 255

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

260 265 270

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

275 280 285

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

290 295 300

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg

305 310 315 320

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

325 330 335

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu

340 345 350

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

355 360 365

Thr Leu Pro Pro Cys Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

370 375 380

Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

385 390 395 400

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

405 410 415

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp

420 425 430

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

435 440 445

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

450 455 460

Gly

465

<210> 218

<211> 926

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая пептидная последовательность

<400> 218

Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Tyr Tyr

20 25 30

Gly Ser Ser Leu Leu Gln Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

65 70 75 80

Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Arg

85 90 95

Lys Ala Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly

100 105 110

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly

115 120 125

Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly

130 135 140

Phe Thr Phe Ser Asp Tyr Tyr Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly

145 150 155 160

Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Phe Ile Arg Asn Gln Ala Arg Gly Tyr

165 170 175

Thr Ser Asp His Asn Pro Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg

180 185 190

Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala

195 200 205

Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Arg Pro Ser Tyr Tyr

210 215 220

Val Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly

225 230 235 240

Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Ala Pro Ser Val Phe

245 250 255

Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro

260 265 270

Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val

275 280 285

Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr

290 295 300

Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val

305 310 315 320

Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys

325 330 335

Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser

340 345 350

Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro

355 360 365

Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val

370 375 380

Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly

385 390 395 400

Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp

405 410 415

Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp

420 425 430

Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His

435 440 445

Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Asp Ile Gln

450 455 460

Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val

465 470 475 480

Thr Ile Thr Cys Thr Ser Ser Gln Ser Leu Phe Asn Val Arg Ser Gln

485 490 495

Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys

500 505 510

Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg

515 520 525

Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser

530 535 540

Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Lys Gln Ser Tyr Asp

545 550 555 560

Leu Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly

565 570 575

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly

580 585 590

Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly

595 600 605

Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly

610 615 620

Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Glu Ile Lys Pro Ser Asn Gly Leu Thr

625 630 635 640

Asn Val His Glu Lys Phe Lys Asn Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Lys

645 650 655

Ala Lys Asn Ser Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp

660 665 670

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Arg Thr Ile Thr Thr Thr Glu Gly Tyr

675 680 685

Trp Phe Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

690 695 700

Gly Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Ala Pro Ser Val

705 710 715 720

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr

725 730 735

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu

740 745 750

Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys

755 760 765

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser

770 775 780

Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

785 790 795 800

Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile

805 810 815

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro

820 825 830

Pro Cys Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala

835 840 845

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn

850 855 860

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser

865 870 875 880

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

885 890 895

Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

900 905 910

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

915 920 925

<210> 219

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 219

Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr

1 5 10

<210> 220

<211> 465

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая пептидная последовательность

<400> 220

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Thr Ser Ser Gln Ser Leu Phe Asn Val

20 25 30

Arg Ser Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys

35 40 45

Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val

50 55 60

Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Lys Gln

85 90 95

Ser Tyr Asp Leu Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Glu Val Gln Leu Val Glu Ser

115 120 125

Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala

130 135 140

Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Trp Met His Trp Val Arg Gln

145 150 155 160

Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Glu Ile Lys Pro Ser Asn

165 170 175

Glu Leu Thr Asn Val His Glu Lys Phe Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser

180 185 190

Val Asp Lys Ala Lys Asn Ser Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg

195 200 205

Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Arg Thr Ile Thr Thr Thr

210 215 220

Glu Gly Tyr Trp Phe Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr

225 230 235 240

Val Ser Ser Gly Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Ala

245 250 255

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

260 265 270

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

275 280 285

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

290 295 300

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg

305 310 315 320

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

325 330 335

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu

340 345 350

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

355 360 365

Thr Leu Pro Pro Cys Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

370 375 380

Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

385 390 395 400

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

405 410 415

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp

420 425 430

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

435 440 445

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

450 455 460

Gly

465

<210> 221

<211> 926

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая пептидная последовательность

<400> 221

Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Tyr Tyr

20 25 30

Gly Ser Ser Leu Leu Gln Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

65 70 75 80

Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Arg

85 90 95

Lys Ala Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly

100 105 110

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly

115 120 125

Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly

130 135 140

Phe Thr Phe Ser Asp Tyr Tyr Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly

145 150 155 160

Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Phe Ile Arg Asn Gln Ala Arg Gly Tyr

165 170 175

Thr Ser Asp His Asn Pro Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg

180 185 190

Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala

195 200 205

Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Arg Pro Ser Tyr Tyr

210 215 220

Val Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly

225 230 235 240

Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Ala Pro Ser Val Phe

245 250 255

Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro

260 265 270

Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val

275 280 285

Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr

290 295 300

Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val

305 310 315 320

Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys

325 330 335

Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser

340 345 350

Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro

355 360 365

Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val

370 375 380

Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly

385 390 395 400

Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp

405 410 415

Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp

420 425 430

Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His

435 440 445

Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Asp Ile Gln

450 455 460

Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val

465 470 475 480

Thr Ile Thr Cys Thr Ser Ser Gln Ser Leu Phe Asn Val Arg Ser Gln

485 490 495

Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys

500 505 510

Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg

515 520 525

Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser

530 535 540

Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Lys Gln Ser Tyr Asp

545 550 555 560

Leu Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly

565 570 575

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly

580 585 590

Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly

595 600 605

Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly

610 615 620

Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Glu Ile Lys Pro Ser Asn Glu Leu Thr

625 630 635 640

Asn Val His Glu Lys Phe Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Lys

645 650 655

Ala Lys Asn Ser Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp

660 665 670

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Arg Thr Ile Thr Thr Thr Glu Gly Tyr

675 680 685

Trp Phe Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

690 695 700

Gly Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Ala Pro Ser Val

705 710 715 720

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr

725 730 735

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu

740 745 750

Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys

755 760 765

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser

770 775 780

Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

785 790 795 800

Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile

805 810 815

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro

820 825 830

Pro Cys Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala

835 840 845

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn

850 855 860

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser

865 870 875 880

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

885 890 895

Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

900 905 910

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

915 920 925

<210> 222

<211> 5

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 222

Cys Pro Pro Cys Pro

1 5

<210> 223

<211> 451

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая пептидная последовательность

<400> 223

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Glu Ile Lys Pro Ser Asn Glu Leu Thr Asn Val His Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Lys Ala Lys Asn Ser Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Arg Thr Ile Thr Thr Thr Glu Gly Tyr Trp Phe Phe Asp Val Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro

115 120 125

Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr

130 135 140

Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr

145 150 155 160

Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro

165 170 175

Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr

180 185 190

Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn

195 200 205

His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser

210 215 220

Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala

225 230 235 240

Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu

245 250 255

Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser

260 265 270

His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu

275 280 285

Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr

290 295 300

Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn

305 310 315 320

Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro

325 330 335

Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln

340 345 350

Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val

355 360 365

Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val

370 375 380

Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro

385 390 395 400

Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr

405 410 415

Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val

420 425 430

Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu

435 440 445

Ser Pro Gly

450

<210> 224

<211> 1080

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 224

Ser Gln Val Ser Gln Asn Cys His Asn Gly Ser Tyr Glu Ile Ser Val

1 5 10 15

Leu Met Met Gly Asn Ser Ala Phe Ala Glu Pro Leu Lys Asn Leu Glu

20 25 30

Asp Ala Val Asn Glu Gly Leu Glu Ile Val Arg Gly Arg Leu Gln Asn

35 40 45

Ala Gly Leu Asn Val Thr Val Asn Ala Thr Phe Met Tyr Ser Asp Gly

50 55 60

Leu Ile His Asn Ser Gly Asp Cys Arg Ser Ser Thr Cys Glu Gly Leu

65 70 75 80

Asp Leu Leu Arg Lys Ile Ser Asn Ala Gln Arg Met Gly Cys Val Leu

85 90 95

Ile Gly Pro Ser Cys Thr Tyr Ser Thr Phe Gln Met Tyr Leu Asp Thr

100 105 110

Glu Leu Ser Tyr Pro Met Ile Ser Ala Gly Ser Phe Gly Leu Ser Cys

115 120 125

Asp Tyr Lys Glu Thr Leu Thr Arg Leu Met Ser Pro Ala Arg Lys Leu

130 135 140

Met Tyr Phe Leu Val Asn Phe Trp Lys Thr Asn Asp Leu Pro Phe Lys

145 150 155 160

Thr Tyr Ser Trp Ser Thr Ser Tyr Val Tyr Lys Asn Gly Thr Glu Thr

165 170 175

Glu Asp Cys Phe Trp Tyr Leu Asn Ala Leu Glu Ala Ser Val Ser Tyr

180 185 190

Phe Ser His Glu Leu Gly Phe Lys Val Val Leu Arg Gln Asp Lys Glu

195 200 205

Phe Gln Asp Ile Leu Met Asp His Asn Arg Lys Ser Asn Val Ile Ile

210 215 220

Met Cys Gly Gly Pro Glu Phe Leu Tyr Lys Leu Lys Gly Asp Arg Ala

225 230 235 240

Val Ala Glu Asp Ile Val Ile Ile Leu Val Asp Leu Phe Asn Asp Gln

245 250 255

Tyr Leu Glu Asp Asn Val Thr Ala Pro Asp Tyr Met Lys Asn Val Leu

260 265 270

Val Leu Thr Leu Ser Pro Gly Asn Ser Leu Leu Asn Ser Ser Phe Ser

275 280 285

Arg Asn Leu Ser Pro Thr Lys Arg Asp Phe Ala Leu Ala Tyr Leu Asn

290 295 300

Gly Ile Leu Leu Phe Gly His Met Leu Lys Ile Phe Leu Glu Asn Gly

305 310 315 320

Glu Asn Ile Thr Thr Pro Lys Phe Ala His Ala Phe Arg Asn Leu Thr

325 330 335

Phe Glu Gly Tyr Asp Gly Pro Val Thr Leu Asp Asp Trp Gly Asp Val

340 345 350

Asp Ser Thr Met Val Leu Leu Tyr Thr Ser Val Asp Thr Lys Lys Tyr

355 360 365

Lys Val Leu Leu Thr Tyr Asp Thr His Val Asn Lys Thr Tyr Pro Val

370 375 380

Asp Met Ser Pro Thr Phe Thr Trp Lys Asn Ser Lys Leu Pro Asn Asp

385 390 395 400

Ile Thr Gly Arg Gly Pro Gln Ile Leu Met Ile Ala Val Phe Thr Leu

405 410 415

Thr Gly Ala Val Val Leu Leu Leu Leu Val Ala Leu Leu Met Leu Arg

420 425 430

Lys Tyr Arg Lys Asp Tyr Glu Leu Arg Gln Lys Lys Trp Ser His Ile

435 440 445

Pro Pro Glu Asn Ile Phe Pro Leu Glu Thr Asn Glu Thr Asn His Val

450 455 460

Ser Leu Lys Ile Asp Asp Asp Lys Arg Arg Asp Thr Ile Gln Arg Leu

465 470 475 480

Arg Gln Cys Lys Tyr Asp Lys Lys Arg Val Ile Leu Lys Asp Leu Lys

485 490 495

His Asn Asp Gly Asn Phe Thr Glu Lys Gln Lys Ile Glu Leu Asn Lys

500 505 510

Leu Leu Gln Ile Asp Tyr Tyr Asn Leu Thr Lys Phe Tyr Gly Thr Val

515 520 525

Lys Leu Asp Thr Met Ile Phe Gly Val Ile Glu Tyr Cys Glu Arg Gly

530 535 540

Ser Leu Arg Glu Val Leu Asn Asp Thr Ile Ser Tyr Pro Asp Gly Thr

545 550 555 560

Phe Met Asp Trp Glu Phe Lys Ile Ser Val Leu Tyr Asp Ile Ala Lys

565 570 575

Gly Met Ser Tyr Leu His Ser Ser Lys Thr Glu Val His Gly Arg Leu

580 585 590

Lys Ser Thr Asn Cys Val Val Asp Ser Arg Met Val Val Lys Ile Thr

595 600 605

Asp Phe Gly Cys Asn Ser Ile Leu Pro Pro Lys Lys Asp Leu Trp Thr

610 615 620

Ala Pro Glu His Leu Arg Gln Ala Asn Ile Ser Gln Lys Gly Asp Val

625 630 635 640

Tyr Ser Tyr Gly Ile Ile Ala Gln Glu Ile Ile Leu Arg Lys Glu Thr

645 650 655

Phe Tyr Thr Leu Ser Cys Arg Asp Arg Asn Glu Lys Ile Phe Arg Val

660 665 670

Glu Asn Ser Asn Gly Met Lys Pro Phe Arg Pro Asp Leu Phe Leu Glu

675 680 685

Thr Ala Glu Glu Lys Glu Leu Glu Val Tyr Leu Leu Val Lys Asn Cys

690 695 700

Trp Glu Glu Asp Pro Glu Lys Arg Pro Asp Phe Lys Lys Ile Glu Thr

705 710 715 720

Thr Leu Ala Lys Ile Phe Gly Leu Phe His Asp Gln Lys Asn Glu Ser

725 730 735

Tyr Met Asp Thr Leu Ile Arg Arg Leu Gln Leu Tyr Ser Arg Asn Leu

740 745 750

Glu His Leu Val Glu Glu Arg Thr Gln Leu Tyr Lys Ala Glu Arg Asp

755 760 765

Arg Ala Asp Arg Leu Asn Phe Met Leu Leu Pro Arg Leu Val Val Lys

770 775 780

Ser Leu Lys Glu Lys Gly Phe Val Glu Pro Glu Leu Tyr Glu Glu Val

785 790 795 800

Thr Ile Tyr Phe Ser Asp Ile Val Gly Phe Thr Thr Ile Cys Lys Tyr

805 810 815

Ser Thr Pro Met Glu Val Val Asp Met Leu Asn Asp Ile Tyr Lys Ser

820 825 830

Phe Asp His Ile Val Asp His His Asp Val Tyr Lys Val Glu Thr Ile

835 840 845

Gly Asp Ala Tyr Met Val Ala Ser Gly Leu Pro Lys Arg Asn Gly Asn

850 855 860

Arg His Ala Ile Asp Ile Ala Lys Met Ala Leu Glu Ile Leu Ser Phe

865 870 875 880

Met Gly Thr Phe Glu Leu Glu His Leu Pro Gly Leu Pro Ile Trp Ile

885 890 895

Arg Ile Gly Val His Ser Gly Pro Cys Ala Ala Gly Val Val Gly Ile

900 905 910

Lys Met Pro Arg Tyr Cys Leu Phe Gly Asp Thr Val Asn Thr Ala Ser

915 920 925

Arg Met Glu Ser Thr Gly Leu Pro Leu Arg Ile His Val Ser Gly Ser

930 935 940

Thr Ile Ala Ile Leu Lys Arg Thr Glu Cys Gln Phe Leu Tyr Glu Val

945 950 955 960

Arg Gly Glu Thr Tyr Leu Lys Gly Arg Gly Asn Glu Thr Thr Tyr Trp

965 970 975

Leu Thr Gly Met Lys Asp Gln Lys Phe Asn Leu Pro Thr Pro Pro Thr

980 985 990

Val Glu Asn Gln Gln Arg Leu Gln Ala Glu Phe Ser Asp Met Ile Ala

995 1000 1005

Asn Ser Leu Gln Lys Arg Gln Ala Ala Gly Ile Arg Ser Gln Lys

1010 1015 1020

Pro Arg Arg Val Ala Ser Tyr Lys Lys Gly Thr Leu Glu Tyr Leu

1025 1030 1035

Gln Leu Asn Thr Thr Asp Lys Glu Ser Thr Tyr Phe Thr Arg Thr

1040 1045 1050

Arg Pro Leu Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Ala Ala

1055 1060 1065

Asn Asp Ile Leu Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys

1070 1075 1080

<210> 225

<211> 3240

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 225

tcccaggtga gtcagaactg ccacaatggc agctatgaaa tcagcgtcct gatgatgggc 60

aactcagcct ttgcagagcc cctgaaaaac ttggaagatg cggtgaatga ggggctggaa 120

atagtgagag gacgtctgca aaatgctggc ctaaatgtga ctgtgaacgc tactttcatg 180

tattcggatg gtctgattca taactcaggc gactgccgga gtagcacctg tgaaggcctc 240

gacctactca ggaaaatttc aaatgcacaa cggatgggct gtgtcctcat agggccctca 300

tgtacatact ccaccttcca gatgtacctt gacacagaat tgagctaccc catgatctca 360

gctggaagtt ttggattgtc atgtgactat aaagaaacct taaccaggct gatgtctcca 420

gctagaaagt tgatgtactt cttggttaac ttttggaaaa ccaacgatct gcccttcaaa 480

acttattcct ggagcacttc gtatgtttac aagaatggta cagaaactga ggactgtttc 540

tggtacctta atgctctgga ggctagcgtt tcctatttct cccacgaact cggctttaag 600

gtggtgttaa gacaagataa ggagtttcag gatatcttaa tggaccacaa caggaaaagc 660

aatgtgatta ttatgtgtgg tggtccagag ttcctctaca agctgaaggg tgaccgagca 720

gtggctgaag acattgtcat tattctagtg gatcttttca atgaccagta cttggaggac 780

aatgtcacag cccctgacta tatgaaaaat gtccttgttc tgacgctgtc tcctgggaat 840

tcccttctaa atagctcttt ctccaggaat ctatcaccaa caaaacgaga ctttgctctt 900

gcctatttga atggaatcct gctctttgga catatgctga agatatttct tgaaaatgga 960

gaaaatatta ccacccccaa atttgctcat gctttcagga atctcacttt tgaagggtat 1020

gacggtccag tgaccttgga tgactggggg gatgttgaca gtaccatggt gcttctgtat 1080

acctctgtgg acaccaagaa atacaaggtt cttttgacct atgataccca cgtaaataag 1140

acctatcctg tggatatgag ccccacattc acttggaaga actctaaact tcctaatgat 1200

attacaggcc ggggccctca gatcctgatg attgcagtct tcaccctcac tggagctgtg 1260

gtgctgctcc tgctcgtcgc tctcctgatg ctcagaaaat atagaaaaga ttatgaactt 1320

cgtcagaaaa aatggtccca cattcctcct gaaaatatct ttcctctgga gaccaatgag 1380

accaatcatg ttagcctcaa gatcgatgat gacaaaagac gagatacaat ccagagacta 1440

cgacagtgca aatacgacaa aaagcgagtg attctcaaag atctcaagca caatgatggt 1500

aatttcactg aaaaacagaa gatagaattg aacaagttgc ttcagattga ctattacaac 1560

ctgaccaagt tctacggcac agtgaaactt gataccatga tcttcggggt gatagaatac 1620

tgtgagagag gatccctccg ggaagtttta aatgacacaa tttcctaccc tgatggcaca 1680

ttcatggatt gggagtttaa gatctctgtc ttgtatgaca ttgctaaggg aatgtcatat 1740

ctgcactcca gtaagacaga agtccatggt cgtctgaaat ctaccaactg cgtagtggac 1800

agtagaatgg tggtgaagat cactgatttt ggctgcaatt ccattttacc tccaaaaaag 1860

gacctgtgga cagctccaga gcacctccgc caagccaaca tctctcagaa aggagatgtg 1920

tacagctatg ggatcatcgc acaggagatc attctgcgga aagaaacctt ctacactttg 1980

agctgtcggg accggaatga gaagattttc agagtggaaa attccaatgg aatgaaaccc 2040

ttccgcccag atttattctt ggaaacagca gaggaaaaag agctagaagt gtacctactt 2100

gtaaaaaact gttgggagga agatccagaa aagagaccag atttcaaaaa aattgagact 2160

acacttgcca agatatttgg actttttcat gaccaaaaaa atgaaagcta tatggatacc 2220

ttgatccgac gtctacagct atattctcga aacctggaac atctggtaga ggaaaggaca 2280

cagctgtaca aggcagagag ggacagggct gacagactta actttatgtt gcttccaagg 2340

ctagtggtaa agtctctgaa ggagaaaggc tttgtggagc cggaactata tgaggaagtt 2400

acaatctact tcagtgacat tgtaggtttc actactatct gcaaatacag cacccccatg 2460

gaagtggtgg acatgcttaa tgacatctat aagagttttg accacattgt tgatcatcat 2520

gatgtctaca aggtggaaac catcggtgat gcgtacatgg tggctagtgg tttgcctaag 2580

agaaatggca atcggcatgc aatagacatt gccaagatgg ccttggaaat cctcagcttc 2640

atggggacct ttgagctgga gcatcttcct ggcctcccaa tatggattcg cattggagtt 2700

cactctggtc cctgtgctgc tggagttgtg ggaatcaaga tgcctcgtta ttgtctattt 2760

ggagatacgg tcaacacagc ctctaggatg gaatccactg gcctcccttt gagaattcac 2820

gtgagtggct ccaccatagc catcctgaag agaactgagt gccagttcct ttatgaagtg 2880

agaggagaaa catacttaaa gggaagagga aatgagacta cctactggct gactgggatg 2940

aaggaccaga aattcaacct gccaacccct cctactgtgg agaatcaaca gcgtttgcaa 3000

gcagaatttt cagacatgat tgccaactct ttacagaaaa gacaggcagc agggataaga 3060

agccaaaaac ccagacgggt agccagctat aaaaaaggca ctctggaata cttgcagctg 3120

aataccacag acaaggagag cacctatttt acgcgtacgc ggccgctcga gcagaaactc 3180

atctcagaag aggatctggc agcaaatgat atcctggatt acaaggatga cgacgataag 3240

<210> 226

<211> 1080

<212> БЕЛОК

<213> Macaca fascicularis

<400> 226

Ser Gln Val Ser Gln Asn Cys His Asn Gly Ser Tyr Glu Ile Ser Val

1 5 10 15

Leu Met Met Asp Asn Ser Ala Phe Ala Glu Pro Leu Glu Asn Val Glu

20 25 30

Asp Ala Val Asn Glu Gly Leu Glu Ile Val Arg Gly Arg Leu Gln Asn

35 40 45

Ala Gly Leu Asn Val Thr Val Asn Ala Ser Phe Met Tyr Ser Asp Gly

50 55 60

Leu Ile His Asn Ser Gly Asp Cys Arg Ser Ser Thr Cys Glu Gly Leu

65 70 75 80

Asp Leu Leu Arg Lys Ile Ser Asn Ala Lys Arg Met Gly Cys Val Leu

85 90 95

Met Gly Pro Ser Cys Thr Tyr Ser Thr Phe Gln Met Tyr Leu Asp Thr

100 105 110

Glu Leu Ser Tyr Pro Met Ile Ser Ala Gly Ser Phe Gly Leu Ser Cys

115 120 125

Asp Tyr Lys Glu Thr Leu Thr Arg Leu Met Ser Pro Ala Arg Lys Leu

130 135 140

Thr Tyr Phe Leu Val Asn Phe Trp Lys Thr Asn Asp Leu Pro Phe Lys

145 150 155 160

Thr Tyr Ser Trp Ser Thr Ser Tyr Val Tyr Lys Asn Gly Thr Glu Ser

165 170 175

Glu Asp Cys Phe Trp Tyr Leu Asn Ala Leu Glu Ala Ser Val Ser Tyr

180 185 190

Phe Ser His Glu Leu Ser Phe Lys Leu Val Leu Arg Gln Asp Lys Glu

195 200 205

Phe Gln Asp Ile Leu Met Asp His Asn Arg Lys Ser Asn Val Ile Val

210 215 220

Met Cys Gly Asp Pro Glu Phe Leu Tyr Lys Leu Lys Gly Asp Arg Ala

225 230 235 240

Val Ala Glu Asp Ile Val Ile Ile Leu Val Asp Leu Phe Asn Asp Gln

245 250 255

Tyr Phe Glu Asp Asn Val Thr Ala Pro Asp Tyr Met Lys Asn Val Leu

260 265 270

Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Asn Ser Leu Leu Asn Ser Ser Phe Ser

275 280 285

Arg Asn Leu Ser Pro Thr Lys Arg Asp Phe Ala Leu Ala Tyr Leu Asn

290 295 300

Gly Ile Leu Leu Phe Gly His Met Leu Lys Thr Phe Leu Glu Asn Gly

305 310 315 320

Glu Asn Ile Thr Thr Pro Lys Phe Ala His Ala Phe Arg Asn Leu Thr

325 330 335

Phe Glu Gly Tyr Asp Gly Pro Val Thr Leu Asp Asp Trp Gly Asp Val

340 345 350

Asp Ser Thr Met Val Leu Leu Tyr Thr Ser Val Asp Thr Lys Lys Tyr

355 360 365

Lys Val Leu Leu Thr Tyr Asp Thr His Val Asn Gln Thr Asn Pro Val

370 375 380

Asp Met Ser Pro Thr Phe Thr Trp Lys Asn Ser Lys Leu Pro Asn Asp

385 390 395 400

Ile Thr Asp Arg Gly Pro Gln Ile Leu Met Ile Ala Val Phe Thr Leu

405 410 415

Thr Gly Ala Val Val Leu Leu Leu Leu Val Ala Leu Leu Met Leu Arg

420 425 430

Lys Tyr Lys Lys Asp Tyr Glu Leu Arg Gln Lys Lys Trp Ser His Ile

435 440 445

Pro Pro Glu Asn Ile Phe Pro Leu Glu Thr Asn Glu Thr Asn His Val

450 455 460

Ser Leu Lys Ile Asp Asp Asp Lys Arg Arg Asp Thr Ile Gln Arg Leu

465 470 475 480

Arg Gln Cys Lys Tyr Asp Lys Lys Arg Val Ile Leu Lys Asp Leu Lys

485 490 495

His Asn Asp Gly Asn Phe Thr Glu Lys Gln Lys Ile Glu Leu Asn Lys

500 505 510

Leu Leu Gln Ile Asp Tyr Tyr Asn Leu Thr Lys Phe Tyr Gly Thr Val

515 520 525

Lys Leu Asp Thr Met Ile Phe Gly Val Ile Glu Tyr Cys Glu Arg Gly

530 535 540

Ser Leu Arg Glu Val Leu Asn Asp Thr Ile Ser Tyr Pro Asp Gly Thr

545 550 555 560

Phe Met Asp Trp Glu Phe Lys Ile Ser Val Leu Tyr Asp Ile Ala Lys

565 570 575

Gly Met Ser Tyr Leu His Ser Ser Lys Thr Glu Val His Gly Arg Leu

580 585 590

Lys Ser Thr Asn Cys Val Val Asp Ser Arg Met Val Val Lys Ile Thr

595 600 605

Asp Phe Gly Cys Asn Ser Ile Leu Pro Pro Lys Lys Asp Leu Trp Thr

610 615 620

Ala Pro Glu His Leu Arg Gln Ala Asn Val Ser Gln Lys Gly Asp Val

625 630 635 640

Tyr Ser Tyr Gly Ile Ile Ala Gln Glu Ile Ile Leu Arg Lys Glu Thr

645 650 655

Phe Tyr Thr Ser Ser Cys Arg Asp Arg Asn Glu Lys Ile Phe Arg Val

660 665 670

Glu Asn Ser Asn Gly Met Lys Pro Phe Arg Pro Asp Leu Phe Leu Glu

675 680 685

Thr Ala Glu Glu Lys Glu Leu Glu Val Tyr Leu Leu Val Lys Ser Cys

690 695 700

Trp Glu Glu Asp Pro Glu Lys Arg Pro Asp Phe Lys Lys Ile Glu Thr

705 710 715 720

Thr Leu Ala Lys Ile Phe Gly Leu Phe His Asp Gln Lys Asn Glu Ser

725 730 735

Tyr Met Asp Thr Leu Ile Arg Arg Leu Gln Leu Tyr Ser Arg Asn Leu

740 745 750

Glu His Leu Val Glu Glu Arg Thr Gln Leu Tyr Lys Ala Glu Arg Asp

755 760 765

Arg Ala Asp Arg Leu Asn Phe Met Leu Leu Pro Arg Leu Val Val Lys

770 775 780

Ser Leu Lys Glu Lys Gly Phe Val Glu Pro Glu Leu Tyr Glu Glu Val

785 790 795 800

Thr Ile Tyr Phe Ser Asp Ile Val Gly Phe Thr Thr Ile Cys Lys Tyr

805 810 815

Ser Thr Pro Met Glu Val Val Asp Met Leu Asn Asp Ile Tyr Lys Ser

820 825 830

Phe Asp His Ile Val Asp His His Asp Val Tyr Lys Val Glu Thr Ile

835 840 845

Gly Asp Ala Tyr Met Val Ala Ser Gly Leu Pro Lys Arg Asn Gly Asn

850 855 860

Arg His Ala Ile Asp Ile Ala Lys Met Ala Leu Glu Ile Leu Ser Phe

865 870 875 880

Met Gly Thr Phe Glu Leu Glu His Leu Pro Gly Leu Pro Ile Trp Ile

885 890 895

Arg Ile Gly Val His Ser Gly Pro Cys Ala Ala Gly Val Val Gly Ile

900 905 910

Lys Met Pro Arg Tyr Cys Leu Phe Gly Asp Thr Val Asn Thr Ala Ser

915 920 925

Arg Met Glu Ser Thr Gly Leu Pro Leu Arg Ile His Val Ser Gly Ser

930 935 940

Thr Ile Ala Ile Leu Lys Arg Thr Glu Cys Gln Phe Leu Tyr Glu Val

945 950 955 960

Arg Gly Glu Thr Tyr Leu Lys Gly Arg Gly Asn Glu Thr Thr Tyr Trp

965 970 975

Leu Thr Gly Met Lys Asp Gln Lys Phe Asn Leu Pro Thr Pro Pro Thr

980 985 990

Val Glu Asn Gln Gln Arg Leu Gln Ala Glu Phe Ser Asp Met Ile Ala

995 1000 1005

Asn Ser Leu Gln Lys Arg Gln Ala Ala Gly Ile Arg Ser Gln Lys

1010 1015 1020

Pro Arg Arg Val Ala Ser Tyr Lys Lys Gly Thr Leu Glu Tyr Leu

1025 1030 1035

Gln Leu Asn Thr Thr Asp Lys Glu Ser Thr Tyr Phe Thr Arg Thr

1040 1045 1050

Arg Pro Leu Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Ala Ala

1055 1060 1065

Asn Asp Ile Leu Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys

1070 1075 1080

<210> 227

<211> 3240

<212> ДНК

<213> Macaca fascicularis

<400> 227

tcacaggtga gtcagaactg ccacaatggc agctatgaaa tcagcgtcct gatgatggac 60

aactcagcct ttgcagagcc cctggaaaac gtggaagatg cggtgaatga ggggctggaa 120

atagtgagag gacgtctgca aaacgctggc ctaaatgtga ctgtgaatgc ttctttcatg 180

tattcggatg gtctgattca taactccggc gactgccgga gcagcacctg tgaaggcctt 240

gacctactca ggaaaatttc aaatgcaaaa cggatgggct gtgtcctcat ggggccctca 300

tgtacatact ccaccttcca gatgtacctt gacacagaat tgagctaccc catgatctca 360

gctggaagtt ttggattgtc atgtgactat aaagaaacct taaccaggct gatgtctcca 420

gctagaaagt tgacatactt cttggttaac ttttggaaaa ccaatgatct acccttcaaa 480

acttattcct ggagcacttc gtatgtttac aagaatggta cggagtccga ggactgtttc 540

tggtacctta acgctctgga ggccagtgtt tcctatttct cccacgaact cagttttaag 600

ttggtgttaa gacaagataa ggagtttcag gatatcttaa tggaccacaa caggaaaagc 660

aatgtgattg ttatgtgtgg tgatccagag ttcctctaca agttgaaggg tgaccgagca 720

gtggctgaag acattgtcat tattctagtg gatcttttca atgaccagta ctttgaggac 780

aatgtcacag cccctgacta tatgaaaaat gtccttgttc tgacgcagtc tcctggcaat 840

tccctcctaa atagctcttt ctccaggaat ctatccccaa caaaacgaga ctttgctctt 900

gcctatttga atggaatcct gctctttgga catatgctaa agacatttct tgaaaatgga 960

gaaaatatta ccacccccaa atttgctcat gctttcagga atctcacttt tgaagggtat 1020

gacggtccag tgaccttgga tgactggggg gatgtggaca gtaccatggt gcttctgtat 1080

acgtctgtgg acaccaagaa atacaaggtt cttttgacct atgataccca cgtaaatcag 1140

accaaccctg tggatatgag ccccacattc acttggaaga actctaaact tcctaatgat 1200

attacagacc ggggccctca gatcctgatg attgcagtct tcaccctcac cggagctgtg 1260

gtgctgctcc tgcttgtcgc tctcctgatg ctcagaaaat ataaaaaaga ttatgaactt 1320

cgtcagaaaa aatggtccca cattcctcct gaaaatatct ttcctctgga gaccaatgag 1380

accaatcacg ttagcctgaa gatcgatgat gacaaaagac gagatacaat ccagagacta 1440

cgacagtgca aatacgacaa aaagcgagtg attctcaaag atctcaagca caatgatggt 1500

aatttcactg aaaaacagaa gatagaattg aacaagttgc ttcagattga ctattacaac 1560

ctgaccaagt tctatggcac cgtgaaactt gataccatga tcttcggggt gatagaatac 1620

tgtgagagag gatccctccg ggaagtttta aatgacacaa tttcctaccc tgatggcaca 1680

ttcatggatt gggagtttaa gatctctgtc ctgtatgaca ttgctaaggg aatgtcatat 1740

ctgcactcca gtaagacaga agtccatggt cgtctgaaat ctaccaactg cgtagtggac 1800

agtagaatgg tggtgaagat cactgatttt ggctgcaatt ccattttacc tccaaaaaaa 1860

gacctgtgga cagctccaga gcacctccgc caagccaacg tctctcagaa aggagatgtg 1920

tacagctacg ggatcatcgc acaggagatc atcctgcgga aagaaacctt ctacacttcg 1980

agctgtcgag accggaacga gaagattttc agagtggaaa attccaatgg aatgaaaccc 2040

ttccgtccag atttattctt ggaaacggca gaggaaaaag agctagaagt gtacctactt 2100

gtaaaaagct gttgggaaga agatccagaa aagagaccag atttcaaaaa aattgagact 2160

acacttgcca agatatttgg actttttcat gaccaaaaaa atgaaagcta tatggatacc 2220

ttgatccgac gtctacagct atattctcga aacctggaac atctggtaga ggaaaggaca 2280

cagctataca aggcagagag ggacagggct gacagactta actttatgtt gcttccaagg 2340

ctagtggtaa agtctctgaa ggagaaaggc tttgtagagc cggaactata tgaggaagtt 2400

acaatctact tcagtgacat tgtaggtttc actactatct gcaaatacag cacccccatg 2460

gaagtggtgg acatgcttaa tgacatctat aagagttttg accacattgt tgatcatcat 2520

gatgtctaca aggtggaaac cattggtgat gcctacatgg tggctagtgg tttgcctaag 2580

agaaatggca atcggcatgc aatagacatt gccaagatgg ccttggaaat cctcagcttc 2640

atggggacct ttgagctgga gcatcttcct ggcctcccaa tatggattcg cattggcgtt 2700

cactctggtc cctgcgctgc tggagttgtg ggaatcaaga tgcctcgtta ttgtctattt 2760

ggagatacag tcaacacagc ctctaggatg gaatccactg gcctcccttt gaggattcat 2820

gtgagtggct ccaccatagc cattctgaag agaactgagt gccagttcct gtatgaagtg 2880

agaggagaaa cgtacttaaa gggaagagga aatgagacta cctactggct gaccgggatg 2940

aaggaccaga aattcaacct gccaacccct cctactgtgg agaatcaaca gcgtttgcaa 3000

gcagaatttt cagacatgat tgccaactct ttacagaaaa gacaggcggc agggataaga 3060

agccaaaaac ccagacgagt agccagctat aaaaaaggca ctctggaata cttgcaactg 3120

aataccacgg acaaggagag cacctatttt acgcgtactc ggccgctcga gcagaaactc 3180

atctcagaag aggatctggc agcaaatgat atcctggatt acaaggatga cgacgataag 3240

<210> 228

<211> 1083

<212> БЕЛОК

<213> Mus musculus

<400> 228

Val Phe Trp Ala Ser Gln Val Arg Gln Asn Cys Arg Asn Gly Ser Tyr

1 5 10 15

Glu Ile Ser Val Leu Met Met Asp Asn Ser Ala Tyr Lys Glu Pro Met

20 25 30

Gln Asn Leu Arg Glu Ala Val Glu Glu Gly Leu Asp Ile Val Arg Lys

35 40 45

Arg Leu Arg Glu Ala Asp Leu Asn Val Thr Val Asn Ala Thr Phe Ile

50 55 60

Tyr Ser Asp Gly Leu Ile His Lys Ser Gly Asp Cys Arg Ser Ser Thr

65 70 75 80

Cys Glu Gly Leu Asp Leu Leu Arg Glu Ile Thr Arg Asp His Lys Met

85 90 95

Gly Cys Ala Leu Met Gly Pro Ser Cys Thr Tyr Ser Thr Phe Gln Met

100 105 110

Tyr Leu Asp Thr Glu Leu Asn Tyr Pro Met Ile Ser Ala Gly Ser Tyr

115 120 125

Gly Leu Ser Cys Asp Tyr Lys Glu Thr Leu Thr Arg Ile Leu Pro Pro

130 135 140

Ala Arg Lys Leu Met Tyr Phe Leu Val Asp Phe Trp Lys Val Asn Asn

145 150 155 160

Ala Ser Phe Lys Pro Phe Ser Trp Asn Ser Ser Tyr Val Tyr Lys Asn

165 170 175

Gly Ser Glu Pro Glu Asp Cys Phe Trp Tyr Leu Asn Ala Leu Glu Ala

180 185 190

Gly Val Ser Tyr Phe Ser Glu Val Leu Asn Phe Lys Asp Val Leu Arg

195 200 205

Arg Ser Glu Gln Phe Gln Glu Ile Leu Thr Gly His Asn Arg Lys Ser

210 215 220

Asn Val Ile Val Met Cys Gly Thr Pro Glu Ser Phe Tyr Asp Val Lys

225 230 235 240

Gly Asp Leu Gln Val Ala Glu Asp Thr Val Val Ile Leu Val Asp Leu

245 250 255

Phe Ser Asn His Tyr Phe Glu Glu Asn Thr Thr Ala Pro Glu Tyr Met

260 265 270

Asp Asn Val Leu Val Leu Thr Leu Pro Ser Glu Gln Ser Thr Ser Asn

275 280 285

Thr Ser Val Ala Glu Arg Phe Ser Ser Gly Arg Ser Asp Phe Ser Leu

290 295 300

Ala Tyr Leu Glu Gly Thr Leu Leu Phe Gly His Met Leu Gln Thr Phe

305 310 315 320

Leu Glu Asn Gly Glu Asn Val Thr Gly Pro Lys Phe Ala Arg Ala Phe

325 330 335

Arg Asn Leu Thr Phe Gln Gly Phe Ala Gly Pro Val Thr Leu Asp Asp

340 345 350

Ser Gly Asp Ile Asp Asn Ile Met Ser Leu Leu Tyr Val Ser Leu Asp

355 360 365

Thr Arg Lys Tyr Lys Val Leu Met Lys Tyr Asp Thr His Lys Asn Lys

370 375 380

Thr Ile Pro Val Ala Glu Asn Pro Asn Phe Ile Trp Lys Asn His Lys

385 390 395 400

Leu Pro Asn Asp Val Pro Gly Leu Gly Pro Gln Ile Leu Met Ile Ala

405 410 415

Val Phe Thr Leu Thr Gly Ile Leu Val Val Leu Leu Leu Ile Ala Leu

420 425 430

Leu Val Leu Arg Lys Tyr Arg Arg Asp His Ala Leu Arg Gln Lys Lys

435 440 445

Trp Ser His Ile Pro Ser Glu Asn Ile Phe Pro Leu Glu Thr Asn Glu

450 455 460

Thr Asn His Ile Ser Leu Lys Ile Asp Asp Asp Arg Arg Arg Asp Thr

465 470 475 480

Ile Gln Arg Val Arg Gln Cys Lys Tyr Asp Lys Lys Lys Val Ile Leu

485 490 495

Lys Asp Leu Lys His Ser Asp Gly Asn Phe Ser Glu Lys Gln Lys Ile

500 505 510

Asp Leu Asn Lys Leu Leu Gln Ser Asp Tyr Tyr Asn Leu Thr Lys Phe

515 520 525

Tyr Gly Thr Val Lys Leu Asp Thr Arg Ile Phe Gly Val Val Glu Tyr

530 535 540

Cys Glu Arg Gly Ser Leu Arg Glu Val Leu Asn Asp Thr Ile Ser Tyr

545 550 555 560

Pro Asp Gly Thr Phe Met Asp Trp Glu Phe Lys Ile Ser Val Leu Asn

565 570 575

Asp Ile Ala Lys Gly Met Ser Tyr Leu His Ser Ser Lys Ile Glu Val

580 585 590

His Gly Arg Leu Lys Ser Thr Asn Cys Val Val Asp Ser Arg Met Val

595 600 605

Val Lys Ile Thr Asp Phe Gly Cys Asn Ser Ile Leu Pro Pro Lys Lys

610 615 620

Asp Leu Trp Thr Ala Pro Glu His Leu Arg Gln Ala Thr Ile Ser Gln

625 630 635 640

Lys Gly Asp Val Tyr Ser Phe Ala Ile Ile Ala Gln Glu Ile Ile Leu

645 650 655

Arg Lys Glu Thr Phe Tyr Thr Leu Ser Cys Arg Asp His Asn Glu Lys

660 665 670

Ile Phe Arg Val Glu Asn Ser Tyr Gly Lys Pro Phe Arg Pro Asp Leu

675 680 685

Phe Leu Glu Thr Ala Asp Glu Lys Glu Leu Glu Val Tyr Leu Leu Val

690 695 700

Lys Ser Cys Trp Glu Glu Asp Pro Glu Lys Arg Pro Asp Phe Lys Lys

705 710 715 720

Ile Glu Ser Thr Leu Ala Lys Ile Phe Gly Leu Phe His Asp Gln Lys

725 730 735

Asn Glu Ser Tyr Met Asp Thr Leu Ile Arg Arg Leu Gln Leu Tyr Ser

740 745 750

Arg Asn Leu Glu His Leu Val Glu Glu Arg Thr Gln Leu Tyr Lys Ala

755 760 765

Glu Arg Asp Arg Ala Asp His Leu Asn Phe Met Leu Leu Pro Arg Leu

770 775 780

Val Val Lys Ser Leu Lys Glu Lys Gly Ile Val Glu Pro Glu Leu Tyr

785 790 795 800

Glu Glu Val Thr Ile Tyr Phe Ser Asp Ile Val Gly Phe Thr Thr Ile

805 810 815

Cys Lys Tyr Ser Thr Pro Met Glu Val Val Asp Met Leu Asn Asp Ile

820 825 830

Tyr Lys Ser Phe Asp Gln Ile Val Asp His His Asp Val Tyr Lys Val

835 840 845

Glu Thr Ile Gly Asp Ala Tyr Val Val Ala Ser Gly Leu Pro Met Arg

850 855 860

Asn Gly Asn Arg His Ala Val Asp Ile Ser Lys Met Ala Leu Asp Ile

865 870 875 880

Leu Ser Phe Ile Gly Thr Phe Glu Leu Glu His Leu Pro Gly Leu Pro

885 890 895

Val Trp Ile Arg Ile Gly Val His Ser Gly Pro Cys Ala Ala Gly Val

900 905 910

Val Gly Ile Lys Met Pro Arg Tyr Cys Leu Phe Gly Asp Thr Val Asn

915 920 925

Thr Ala Ser Arg Met Glu Ser Thr Gly Leu Pro Leu Arg Ile His Met

930 935 940

Ser Ser Ser Thr Ile Thr Ile Leu Lys Arg Thr Asp Cys Gln Phe Leu

945 950 955 960

Tyr Glu Val Arg Gly Glu Thr Tyr Leu Lys Gly Arg Gly Thr Glu Thr

965 970 975

Thr Tyr Trp Leu Thr Gly Met Lys Asp Gln Glu Tyr Asn Leu Pro Ser

980 985 990

Pro Pro Thr Val Glu Asn Gln Gln Arg Leu Gln Thr Glu Phe Ser Asp

995 1000 1005

Met Ile Val Ser Ala Leu Gln Lys Arg Gln Ala Ser Gly Lys Lys

1010 1015 1020

Ser Arg Arg Pro Thr Arg Val Ala Ser Tyr Lys Lys Gly Phe Leu

1025 1030 1035

Glu Tyr Met Gln Leu Asn Asn Ser Asp His Asp Ser Thr Tyr Phe

1040 1045 1050

Thr Arg Thr Arg Pro Leu Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp

1055 1060 1065

Leu Ala Ala Asn Asp Ile Leu Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys

1070 1075 1080

<210> 229

<211> 3249

<212> ДНК

<213> Mus musculus

<400> 229

gtgttctggg cctctcaggt gaggcagaac tgccgcaatg gcagctacga gatcagcgtc 60

ctgatgatgg acaactcagc ctacaaagaa cctatgcaaa acctgaggga ggctgtggag 120

gaaggactgg acatagtgcg aaagcgcctg cgtgaagccg acctaaatgt gactgtgaac 180

gcgactttca tctactccga cggtctgatt cataagtcag gtgactgccg gagcagcacc 240

tgtgaaggcc ttgacctact cagggagatt acaagagatc ataagatggg ctgcgccctc 300

atggggccct cgtgcacgta ttccaccttc cagatgtacc tcgacacaga gttgaactat 360

cccatgattt ccgctggaag ttatggattg tcctgtgact ataaggaaac cctaaccagg 420

atcctgcctc cagccaggaa gctgatgtac ttcttggtcg atttctggaa agtcaacaat 480

gcatctttca aacccttttc ctggaactct tcgtatgttt acaagaatgg atcggaacct 540

gaagattgtt tctggtacct caatgctctg gaggctgggg tgtcctattt ttctgaggtg 600

ctcaacttca aggatgtact gagacgcagc gaacagttcc aggaaatctt aacaggccat 660

aacagaaaga gcaatgtgat tgttatgtgt ggcacgccag aaagcttcta tgatgtgaaa 720

ggtgacctcc aagtggctga agatactgtt gtcatcctgg tagatctgtt cagtaaccat 780

tactttgagg agaacaccac agctcctgag tatatggaca atgtcctcgt cctgacgctg 840

ccgtctgaac agtccacctc aaacacctct gtcgccgaga ggttttcatc ggggagaagt 900

gacttttctc tcgcttactt ggagggaacc ttgctatttg gacacatgct gcagacgttt 960

cttgaaaatg gagaaaatgt cacgggtccc aagtttgctc gtgcattcag gaatctcact 1020

tttcaaggct ttgcaggacc tgtgactctg gatgacagtg gggacattga caacattatg 1080

tcccttctgt atgtgtctct ggataccagg aaatacaagg ttcttatgaa gtatgacacc 1140

cacaaaaaca aaactattcc ggtggctgag aaccccaact tcatctggaa gaaccacaag 1200

ctccccaatg acgttcctgg gctgggccct caaatcctga tgattgccgt cttcacgctc 1260

acggggatcc tggtagttct gctgctgatt gccctcctcg tgctgagaaa atacagaaga 1320

gatcatgcac ttcgacagaa gaaatggtcc cacattcctt ctgaaaacat ctttcctctg 1380

gagaccaacg agaccaacca catcagcctg aagattgacg atgacaggag acgagacaca 1440

atccagagag tgcgacagtg caaatacgac aagaagaaag tgattctgaa agacctcaag 1500

cacagcgacg ggaacttcag tgagaagcag aagatagacc tgaacaagtt gctgcagtct 1560

gactactaca acctgactaa gttctacggc accgtgaagc tggacaccag gatctttggg 1620

gtggttgagt actgcgagag gggatccctc cgggaagtgt taaacgacac aatttcctac 1680

cctgacggca cgttcatgga ttgggagttt aagatctctg tcttaaatga catcgctaag 1740

gggatgtcct acctgcactc cagtaagatt gaagtccacg ggcgtctcaa atccaccaac 1800

tgcgtggtgg acagccgcat ggtggtgaag atcaccgact ttgggtgcaa ttccatcctg 1860

cctccaaaaa aagacctgtg gacggccccg gagcacctgc gccaggccac catctctcag 1920

aaaggagacg tgtacagctt cgccatcatt gcccaggaga tcatcctccg taaggagact 1980

ttttacacgc tgagctgtcg ggatcacaat gagaagattt tcagagtgga aaattcatac 2040

gggaaacctt tccgcccaga cctcttcctg gagactgcag atgagaagga gctggaggtc 2100

tatctacttg tcaaaagctg ttgggaggag gatccagaaa agaggccaga tttcaagaaa 2160

atcgagagca cactggccaa gatatttggc cttttccatg accagaaaaa cgagtcttac 2220

atggacacct tgatccgacg tctccagctg tactctcgaa acctggaaca tctggtggag 2280

gaaaggactc agctgtacaa ggcggagagg gacagggctg accaccttaa cttcatgctc 2340

ctcccacggc tggtggtaaa gtcactgaag gagaaaggca tcgtggagcc agagctgtac 2400

gaagaagtca caatctactt cagtgacatt gtgggcttca ccaccatctg caagtatagc 2460

acgcccatgg aggtggtgga catgctcaac gacatctaca agagctttga ccagattgtg 2520

gaccaccatg acgtctacaa ggtagaaacc atcggtgacg cctacgtggt ggccagcggt 2580

ctgcctatga gaaacggcaa ccgacacgcg gtagacattt ccaagatggc cttggacatc 2640

ctcagcttca tagggacctt tgagttggag catctccctg gcctccccgt gtggatccgc 2700

attggagttc attctgggcc ctgcgctgct ggtgttgtgg ggatcaagat gcctcgctat 2760

tgcctgtttg gagacactgt caacactgcc tccaggatgg aatccaccgg cctccccttg 2820

aggattcaca tgagcagctc caccataacc atcctgaaga gaacggattg ccagttcctg 2880

tatgaagtga ggggagaaac ctacttaaag ggaagaggga cagagaccac atactggctg 2940

actgggatga aggaccaaga atacaacctg ccatccccac cgacagtgga gaaccaacag 3000

cgtctgcaga ctgagttctc agacatgatc gttagcgcct tacagaaaag acaggcctcg 3060

ggcaagaaga gccggaggcc cactcgggtg gccagctaca agaaaggctt tctggaatac 3120

atgcagctga acaattcaga ccacgatagc acctatttta cgcgtacgcg gccgctcgag 3180

cagaaactca tctcagaaga ggatctggca gcaaatgata tcctggatta caaggatgac 3240

gacgataag 3249

<210> 230

<211> 672

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 230

Ser Gln Val Ser Gln Asn Cys His Asn Gly Ser Tyr Glu Ile Ser Val

1 5 10 15

Leu Met Met Gly Asn Ser Ala Phe Ala Glu Pro Leu Lys Asn Leu Glu

20 25 30

Asp Ala Val Asn Glu Gly Leu Glu Ile Val Arg Gly Arg Leu Gln Asn

35 40 45

Ala Gly Leu Asn Val Thr Val Asn Ala Thr Phe Met Tyr Ser Asp Gly

50 55 60

Leu Ile His Asn Ser Gly Asp Cys Arg Ser Ser Thr Cys Glu Gly Leu

65 70 75 80

Asp Leu Leu Arg Lys Ile Ser Asn Ala Gln Arg Met Gly Cys Val Leu

85 90 95

Ile Gly Pro Ser Cys Thr Tyr Ser Thr Phe Gln Met Tyr Leu Asp Thr

100 105 110

Glu Leu Ser Tyr Pro Met Ile Ser Ala Gly Ser Phe Gly Leu Ser Cys

115 120 125

Asp Tyr Lys Glu Thr Leu Thr Arg Leu Met Ser Pro Ala Arg Lys Leu

130 135 140

Met Tyr Phe Leu Val Asn Phe Trp Lys Thr Asn Asp Leu Pro Phe Lys

145 150 155 160

Thr Tyr Ser Trp Ser Thr Ser Tyr Val Tyr Lys Asn Gly Thr Glu Thr

165 170 175

Glu Asp Cys Phe Trp Tyr Leu Asn Ala Leu Glu Ala Ser Val Ser Tyr

180 185 190

Phe Ser His Glu Leu Gly Phe Lys Val Val Leu Arg Gln Asp Lys Glu

195 200 205

Phe Gln Asp Ile Leu Met Asp His Asn Arg Lys Ser Asn Val Ile Ile

210 215 220

Met Cys Gly Gly Pro Glu Phe Leu Tyr Lys Leu Lys Gly Asp Arg Ala

225 230 235 240

Val Ala Glu Asp Ile Val Ile Ile Leu Val Asp Leu Phe Asn Asp Gln

245 250 255

Tyr Phe Glu Asp Asn Val Thr Ala Pro Asp Tyr Met Lys Asn Val Leu

260 265 270

Val Leu Thr Leu Ser Pro Gly Asn Ser Leu Leu Asn Ser Ser Phe Ser

275 280 285

Arg Asn Leu Ser Pro Thr Lys Arg Asp Phe Ala Leu Ala Tyr Leu Asn

290 295 300

Gly Ile Leu Leu Phe Gly His Met Leu Lys Ile Phe Leu Glu Asn Gly

305 310 315 320

Glu Asn Ile Thr Thr Pro Lys Phe Ala His Ala Phe Arg Asn Leu Thr

325 330 335

Phe Glu Gly Tyr Asp Gly Pro Val Thr Leu Asp Asp Trp Gly Asp Val

340 345 350

Asp Ser Thr Met Val Leu Leu Tyr Thr Ser Val Asp Thr Lys Lys Tyr

355 360 365

Lys Val Leu Leu Thr Tyr Asp Thr His Val Asn Lys Thr Tyr Pro Val

370 375 380

Asp Met Ser Pro Thr Phe Thr Trp Lys Asn Ser Lys Leu Pro Asn Asp

385 390 395 400

Ile Thr Gly Arg Gly Pro Gln Gly Gly Gly Gly Ser Glu Asn Leu Tyr

405 410 415

Phe Gln Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Pro Arg Gly

420 425 430

Pro Thr Ile Lys Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys Pro Ala Pro Asn Leu

435 440 445

Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Ile Lys Asp Val

450 455 460

Leu Met Ile Ser Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys Val Val Val Asp Val

465 470 475 480

Ser Glu Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn Val

485 490 495

Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn Ser

500 505 510

Thr Leu Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Met

515 520 525

Ser Gly Lys Ala Phe Ala Cys Ala Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro Ala

530 535 540

Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly Ser Val Arg Ala Pro

545 550 555 560

Gln Val Tyr Val Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu Met Thr Lys Lys Gln

565 570 575

Val Thr Leu Thr Cys Met Val Thr Asp Phe Met Pro Glu Asp Ile Tyr

580 585 590

Val Glu Trp Thr Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu Asn Tyr Lys Asn Thr

595 600 605

Glu Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Met Tyr Ser Lys Leu

610 615 620

Arg Val Glu Lys Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn Ser Tyr Ser Cys Ser

625 630 635 640

Val Val His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Thr Lys Ser Phe Ser

645 650 655

Arg Thr Pro Gly Gly Gly Pro Pro Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys

660 665 670

<210> 231

<211> 2076

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 231

atggagacag acacactgct cctgtgggtg ctgcttctgt gggtgccagg ttccactgga 60

tcacaggtga gtcagaactg ccacaatggc agctatgaaa tcagcgtcct gatgatgggc 120

aactcagcct ttgcagagcc cctgaaaaac ttggaagatg cggtgaatga ggggctggaa 180

atagtgagag gacgtctgca aaatgctggc ctaaatgtga ctgtgaacgc tactttcatg 240

tattcggatg gtctgattca taactcaggc gactgccgga gtagcacctg tgaaggcctc 300

gacctactca ggaaaatttc aaatgcacaa cggatgggct gtgtcctcat agggccctca 360

tgtacatact ccaccttcca gatgtacctt gacacagaat tgagctaccc catgatctca 420

gctggaagtt ttggattgtc atgtgactat aaagaaacct taaccaggct gatgtctcca 480

gctagaaagt tgatgtactt cttggttaac ttttggaaaa ccaacgatct gcccttcaaa 540

acttattcct ggagcacttc gtatgtttac aagaatggta cagaaactga ggactgtttc 600

tggtacctta atgctctgga ggctagcgtt tcctatttct cccacgaact cggctttaag 660

gtggtgttaa gacaagataa ggagtttcag gatatcttaa tggaccacaa caggaaaagc 720

aatgtgatta ttatgtgtgg tggtccagag ttcctctaca agctgaaggg tgaccgagca 780

gtggctgaag acattgtcat tattctagtg gatcttttca atgaccagta ctttgaggac 840

aatgtcacag cccctgacta tatgaaaaat gtccttgttc tgacgctgtc tcctgggaat 900

tcccttctaa atagctcttt ctccaggaat ctatcaccaa caaaacgaga ctttgctctt 960

gcctatttga atggaatcct gctctttgga catatgctga agatatttct tgaaaatgga 1020

gaaaatatta ccacccccaa atttgctcat gctttcagga atctcacttt tgaagggtat 1080

gacggtccag tgaccttgga tgactggggg gatgttgaca gtaccatggt gcttctgtat 1140

acctctgtgg acaccaagaa atacaaggtt cttttgacct atgataccca cgtaaataag 1200

acctatcctg tggatatgag ccccacattc acttggaaga actctaaact tcctaatgat 1260

attacaggcc ggggccctca gggaggcgga ggttccgaga atttatactt ccagggcgga 1320

ggcggttccg gcggcggagg aagcgagccc cgcggaccga caatcaagcc ctgtcctcca 1380

tgcaaatgcc cagcacctaa cctcgagggt ggaccatccg tcttcatctt ccctccaaag 1440

atcaaggatg tactcatgat ctccctgagc cccatagtca catgtgtggt ggtggatgtg 1500

agcgaggatg acccagatgt ccagatcagc tggtttgtga acaacgtgga agtacacaca 1560

gctcagacac aaacccatag agaggattac aacagtactc tccgggtggt cagtgccctc 1620

cccatccagc accaggactg gatgagtggc aaggctttcg catgcgccgt caacaacaaa 1680

gacctcccag cgcccatcga gagaaccatc tcaaaaccca aagggtcagt aagagctcca 1740

caggtatatg tcttgcctcc accagaagaa gagatgacta agaaacaggt cactctgacc 1800

tgcatggtca cagacttcat gcctgaagac atttacgtgg agtggaccaa caacgggaaa 1860

acagagctaa actacaagaa cactgaacca gtcctggact ctgatggttc ttacttcatg 1920

tacagcaagc tgagagtgga aaagaagaac tgggtggaaa gaaatagcta ctcctgttca 1980

gtggtccacg agggtctgca caatcaccac acgactaaga gcttctcccg gactccgggt 2040

ggcgggccac ccgactacaa ggacgacgat gacaaa 2076

<210> 232

<211> 418

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 232

Ser Gln Val Ser Gln Asn Cys His Asn Gly Ser Tyr Glu Ile Ser Val

1 5 10 15

Leu Met Met Gly Asn Ser Ala Phe Ala Glu Pro Leu Lys Asn Leu Glu

20 25 30

Asp Ala Val Asn Glu Gly Leu Glu Ile Val Arg Gly Arg Leu Gln Asn

35 40 45

Ala Gly Leu Asn Val Thr Val Asn Ala Thr Phe Met Tyr Ser Asp Gly

50 55 60

Leu Ile His Asn Ser Gly Asp Cys Arg Ser Ser Thr Cys Glu Gly Leu

65 70 75 80

Asp Leu Leu Arg Lys Ile Ser Asn Ala Gln Arg Met Gly Cys Val Leu

85 90 95

Ile Gly Pro Ser Cys Thr Tyr Ser Thr Phe Gln Met Tyr Leu Asp Thr

100 105 110

Glu Leu Ser Tyr Pro Met Ile Ser Ala Gly Ser Phe Gly Leu Ser Cys

115 120 125

Asp Tyr Lys Glu Thr Leu Thr Arg Leu Met Ser Pro Ala Arg Lys Leu

130 135 140

Met Tyr Phe Leu Val Asn Phe Trp Lys Thr Asn Asp Leu Pro Phe Lys

145 150 155 160

Thr Tyr Ser Trp Ser Thr Ser Tyr Val Tyr Lys Asn Gly Thr Glu Thr

165 170 175

Glu Asp Cys Phe Trp Tyr Leu Asn Ala Leu Glu Ala Ser Val Ser Tyr

180 185 190

Phe Ser His Glu Leu Gly Phe Lys Val Val Leu Arg Gln Asp Lys Glu

195 200 205

Phe Gln Asp Ile Leu Met Asp His Asn Arg Lys Ser Asn Val Ile Ile

210 215 220

Met Cys Gly Gly Pro Glu Phe Leu Tyr Lys Leu Lys Gly Asp Arg Ala

225 230 235 240

Val Ala Glu Asp Ile Val Ile Ile Leu Val Asp Leu Phe Asn Asp Gln

245 250 255

Tyr Phe Glu Asp Asn Val Thr Ala Pro Asp Tyr Met Lys Asn Val Leu

260 265 270

Val Leu Thr Leu Ser Pro Gly Asn Ser Leu Leu Asn Ser Ser Phe Ser

275 280 285

Arg Asn Leu Ser Pro Thr Lys Arg Asp Phe Ala Leu Ala Tyr Leu Asn

290 295 300

Gly Ile Leu Leu Phe Gly His Met Leu Lys Ile Phe Leu Glu Asn Gly

305 310 315 320

Glu Asn Ile Thr Thr Pro Lys Phe Ala His Ala Phe Arg Asn Leu Thr

325 330 335

Phe Glu Gly Tyr Asp Gly Pro Val Thr Leu Asp Asp Trp Gly Asp Val

340 345 350

Asp Ser Thr Met Val Leu Leu Tyr Thr Ser Val Asp Thr Lys Lys Tyr

355 360 365

Lys Val Leu Leu Thr Tyr Asp Thr His Val Asn Lys Thr Tyr Pro Val

370 375 380

Asp Met Ser Pro Thr Phe Thr Trp Lys Asn Ser Lys Leu Pro Asn Asp

385 390 395 400

Ile Thr Gly Arg Gly Pro Gln Gly Gly Gly Gly Ser Glu Asn Leu Tyr

405 410 415

Phe Gln

<210> 233

<211> 1254

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 233

tcacaggtga gtcagaactg ccacaatggc agctatgaaa tcagcgtcct gatgatgggc 60