СПОСОБ ИДЕНТИФИКАЦИИ ПРОМЕЖУТОЧНЫХ ПРОДУКТОВ Российский патент 2024 года по МПК G16B15/20 G16B5/30 

Технологическая основа изобретения

В настоящем описании описывается способ идентификации целевых промежуточных продуктов укладки белка, подходящих для испытания в качестве мишеней при процедуре разработки лекарств. Способ осуществляется с помощью средств электронной вычислительной техники.

Описание уровня техники

Вопросы как происходит укладка белков, почему они укладываются таким путем и как путь укладки каждого белка кодируется в его последовательности и структуре имеют фундаментальное значение для структуры и конструкции белка, укладки и неверной укладки, регуляции и функционирования, клинических проблем и промышленной применимости.

B. Nolting, 1999 (Protein Folding Kinetics: Biophysical Methods, Springer, Berlin); W. A. Eaton et al., 2000 (Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 29, 327); V. Daggett and A. Fersht, 2003 (Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 4, 497) описывают попытки понять кинетику укладки белков. Давно ощущается потребность в идентификации новых терапевтических мишеней, на которые можно воздействовать.

В настоящем изобретении впервые показано, как новый вычислительный подход, способствующий идентификации релевантных путей процесса укладки белков, оказался полезным при идентификации лекарственно-ориентированных целевых промежуточных продуктов укладки белка, открывая новые пути для разработки лекарств на фармакологических мишенях, не рассматривавшихся ранее.

Сущность изобретения

Объект изобретения определяется в прилагаемой формуле изобретения.

Конкретнее, изобретение относится к способу идентификации целевых промежуточных продуктов укладки белка, подходящих для испытания в качестве мишеней в процедуре разработки лекарственных средств, и к способу разработки лекарственных средств in silico, основанному на нацеливании на промежуточные продукты укладки.

В частности, изобретение позволяет идентифицировать промежуточные продукты укладки, которые, как только связываются с выбранными лигандами, стабилизируются, что может привести, например, к такому результату, что стабилизированные промежуточные продукты укладки удаляются из клетки, причем таким образом ингибируется их активность.

В другом воплощении изобретение позволяет идентифицировать промежуточные продукты укладки, которые, как только связываются с выбранными лигандами, могут стабилизироваться и возможно активироваться.

Краткое описание чертежей

Фиг. 1. Гистограмма частот конформаций на пути укладки человеческого PrPC, вычисленных с помощью подхода Bias Functional (BF). Траектории проецируют на две коллективные переменные, описанные в тексте: фракцию нативных контактов Q и среднеквадратическое отклонение (RMSD) от нативной структуры (код PDB: 1QLZ).

Фиг. 2. Три основных кластера (названных как кластер С1, С2 и С3), представляющих самые часто наблюдаемые структуры в промежуточных продуктах укладки PrPC.

Фиг. 3. Потенциально лекарственно-ориентированные области в промежуточном продукте укладки белка-приона PrP (Fi-PrP).

Подробное описание изобретения

Описывается способ идентификации целевых промежуточных продуктов укладки белка, подходящих для испытания в качестве мишеней для процедур при разработке лекарств.

Способ включает стадии, поясненные в настоящем описании ниже, которые выполняют с помощью средств электронной вычислительной техники.

Способ предусматривает стадию моделирования последовательности событий во времени, определяющих путь укладки белка, которая включает моделирование и/или расчет структурных и/или энергетических и/или физико-химических свойств одного или нескольких состояний промежуточных продуктов укладки белков в соответствии с указанным путем укладки. Эта стадия моделирования может включать, например, моделирование последовательности состояний промежуточных продуктов укладки белков в соответствии с указанным путем укладки.

Также способ включает стадию идентификации по меньшей мере одного кандидата-промежуточного продукта укладки белка в соответствии с моделированным путем укладки, основанную на идентифицирующих свойствах (включаемых в число указанных структурных и энергетических и/или физико-химических свойств); и стадию отбора одного или нескольких целевых промежуточных продуктах укладки белка, среди которых по меньшей мере один кандидат-промежуточный продукт укладки белка, основанную на свойствах для отбора (включаемых в число указанных структурных и энергетических и/или физико-химических свойств).

Свойства для отбора соотносятся с лекарственной ориентированностью промежуточного продукта укладки белка.

Согласно настоящему описанию «путь укладки» описывает переход белка от развернутого белка в его нативную укладку со временем, т.е. как цепь аминокислот достигает термодинамически устойчивого состояния.

В одном воплощении изобретения в контексте заявки «укладка белка» и «путь укладки», упоминаемые в настоящем описании, предполагаются в рамках эндогенного синтеза белков и не связаны с процессами денатурации или ренатурации или с конформационными вариантами или «короткоживущими конформациями».

Согласно настоящему описанию «лекарственная ориентированность» представляет собой способность белка или любого «конформационного варианта» белка допускать связывание лекарственного средства (например, малой молекулы, любого другого органического соединения, пептида или антитела), вызывая таким образом потенциально благоприятное для пациента терапевтическое действие. «Конформационный вариант» представляет собой каждую альтернативную конформацию одного и того же полипептида. Он отражает конформационную изомерию полипептидов и статистический характер термодинамических состояний макромолекул.

Как отмечалось выше, способ предусматривает две различные стадии: «идентификации кандидатов-промежуточных продуктов укладки белка» (основанную на первом наборе свойств промежуточных состояний укладки, называемых в настоящем описании «идентифицирующими свойствами») и «отбор целевых промежуточных продуктов укладки белка» (основанный на втором наборе свойств состояний промежуточных продуктов укладки, называемых в настоящем описании «свойств для отбора»).

В следующей части описания будут поясняться некоторые примеры «идентифицирующих свойств» и «свойств для отбора». Будет очевидно, что «идентифицирующие свойства» и «свойства для отбора» могут быть различными и фактически являются различными в предпочтительных воплощениях изобретения.

Согласно одному воплощению способа, указанные идентифицирующие свойства включают энергетические и/или физико-химические свойства промежуточных продуктов укладки белка.

Согласно одному варианту реализации этого воплощения, идентифицирующие свойства включают барьер свободной энергии между состоянием промежуточного продукта и нативным состоянием белка или между состоянием промежуточного продукта и следующего промежуточного продукта в направлении нативного состояния. В этом случае стадия идентификации включает идентификацию в качестве «кандидата-промежуточного продукта укладки белка» промежуточного продукта, отличающегося тем, что барьер свободной энергии между указанным промежуточным продуктом и нативным состоянием или следующим промежуточным продуктом в направлении нативного состояния является более высоким, чем порог свободной энергии.

В одном варианте реализации порог свободной энергии составляет 7,5 кДж/моль.

Согласно другому варианту реализации этого воплощения, свойства идентификации включают время жизни промежуточного продукта, определенное как обратная скорость переходов из состояния промежуточного продукта в нативное или в состояние следующего промежуточного продукта по пути укладки.

В этом случае способ включает дополнительную стадию оценки указанного времени жизни промежуточного продукта, и стадия идентификации включает идентификацию в качестве «кандидата-промежуточного продукта укладки белка» промежуточного продукта, имеющего время жизни более продолжительное, чем минимальный порог времени жизни.

В примере реализации минимальный порог времени жизни может составлять по меньшей мере трехкратное время полужизни в физиологических условиях.

Согласно одному воплощению способа, стадия идентификции по меньшей мере одного кандидата-промежуточного продукта укладки белка включает идентификацию метастабильных состояний.

Теперь, принимая во внимание второй набор свойств, т.е. «свойств для отбора», приводятся следующие подробности.

Согласно одному воплощению способа, свойства для отбора включают структурные свойства, связанные с лекарственной ориентированностью рассматриваемого кандидата-промежуточного продукта укладки белка.

Согласно другому воплощению способа, свойства отбора включают параметры скоринга для идентификации «горячих точек» белка.

В настоящем описании согласно терминологии, обычно используемой в фармацевтических исследованиях, «горячая точка» означает сайт в целевом белке, которое имеет высокую склонность к связыванию лиганда и, следовательно, является потенциально важным для разработки лекарственного средства.

Согласно одному воплощению способа, стадия отбора дополнительно включает отбор в качестве целевого промежуточного продукта укладки белка того промежуточного продукта, который имеет свойства для отбора, отсутствующие в нативном состоянии.

Согласно одному варианту реализации, стадия отбора дополнительно включает отбор в качестве целевого промежуточного продукта укладки белка того промежуточного продукта, который имеет лекарственно ориентированный «карман», отсутствующий в нативном состоянии.

В настоящем описании согласно терминологии, обычно используемой в области фармацевтических исследований, термин «карман» означает пространственную область третичной структуры белка, подходящую для связывания небольшой молекулы.

В частности, концепция лекарственно ориентированных карманов относится к сайту специфического связывания связанного с заболеванием белка-мишени, способному связывать подобные-лекарству молекулы, приобретая таким образом модуляцию биологической функции белка.

Когда сайт связывания неизвестен из структуры 3D (например, комплекса лиганд-белок) или из других экспериментальных данных (например, мутаций резистентности к лекарству), можно использовать вычислительные методы для предположения вероятных местоположений.

В следующих частях настоящего описания упоминаются некоторые свойства и/или параметры и/или глобальные характеристики карманов (и соответствующие примерные значения), которые используются в описанном способе для характеристики сайтов/карманов связывания.

Согласно другому варианту реализации, стадия отбора дополнительно включает отбор в качестве целевого промежуточного продукта укладки белка того промежуточного продукта, который имеет лекарственно ориентированный карман, характеризующийся среднеквадратическим отклонением (RMSD) большим, чем порог среднеквадратического отклонения, от кармана, присутствующего в нативном состоянии.

В примерах реализации указанный порог среднеквадратического отклонения равен 2 ангстремам (Å) или больше 2 ангстрем (Å).

Согласно одному воплощению способа, свойства для отбора включают присутствие лекарственно ориентированного кармана в рассматриваемом кандидате-промежуточном продукте укладки белка, причем лекарственно ориентированный карман определяется в терминах параметров кармана.

Согласно одному воплощению способа, стадия отбора включает стадии идентификации кармана связывания, характеризации кармана связывания, предсказание лекарственной ориентированности кармана связывания.

В этом случае стадия отбора включает отбор одного или нескольких целевых промежуточных продуктов укладки белка из числа идентифицированных кандидатов промежуточных продуктов укладки белка на основании сравнения указанных параметров кармана с соответствующими пороговыми величинами.

Согласно различным вариантам реализации этого воплощения вышеуказанные параметры кармана включают размерные параметры и/или параметры формы и/или параметры положения и/или соотношение гидрофобного и гидрофильного характера.

В частности, размерные параметры кармана могут включать объем кармана и/или глубину кармана и/или закрытость и экспонированность кармана. Свойства закрытости и экспонированности дают различную меру того, насколько сайт открыт для растворителя.

В одном примере реализации пороговая величина объема кармана составляет по меньшей мере 350 ų.

В одном примере реализации пороговая величина экспонированности кармана составляет меньше 0,49, и пороговая величина закрытости кармана составляет по меньшей мере 0,78.

В одном примере реализации пороговая величина глубины кармана составляет по меньшей мере 13 Å.

В числе свойств для отбора ранее упоминались параметры скоринга для идентификации горячих точек белка.

Что касается этой характеристики, различные воплощения способа предусматривают, что такие параметры скоринга включают “SiteScore” и/или “Dscore” и/или “DrugScore” и/или баланс кармана.

Эти параметры известны per se в области моделирования и характеризации белка и промежуточных продуктов белка и основаны на множестве величин, относящихся к различным свойствам, подходящим для оценки «лекарственной ориентированности» белка в нативном состоянии или промежуточного продукта укладки белка.

На самом деле такие параметры скоринга выводятся из пакетов оценочных программ.

Например, SiteMap (Halgren TA (2009) “Identifying and characterizing binding sites and assessing druggability”, J. Chem. Inf. Model 49: 377–389) предсказывает оценку сайта (SiteScore) и оценку лекарственной ориентированности (DScore) через линейную комбинацию только трех отдельных дескрипторов: размера кармана связывания, его закрытости и пенальти за его гидрофильность.

Другим примером является DoGSiteScorer (A. Volkamer, D. Kuhn, T. Grombacher, F. Rippmann, M. Rarey, “Combining global and local measures for structure-based druggability predictions” J. Chem. Inf. Model. 2012,52,360-37), которая также генерирует оценку лекарственной ориентированности (DrugScore), которая колеблется от нуля до единицы.

Конечно, в других воплощениях способа по настоящему изобретению можно использовать другие известные параметры скоринга, и/или могут быть определены и адаптированы новые параметры скоринга.

Отбор, также в этом случае, основывается на сравнении параметров скоринга с соответствующими пороговыми величинами.

В некоторых воплощениях способа по настоящему изобретению пороговые параметры скоринга выбирают следующим образом.

В одном примере реализации пороговая величина кармана SiteScore составляет 0,8.

В одном примере реализации пороговая величина кармана DScore составляет 0,98.

В одном примере реализации пороговая величина кармана DrugScore составляет 0,5.

В одном примере реализации пороговая величина баланса кармана составляет 1,0.

Как пояснялось выше, способ по настоящему изобретению предусматривает свойства, используемые в качестве основы для идентификации кандидатов промежуточных продуктов укладки белка и отбора целевых промежуточных продуктов укладки белков.

Кроме того, способ по настоящему изобретению также предусматривает критерии для упомянутых выше стадий идентификации и отбора. Эти критерии основаны, например, на сравнении параметров и/или величин, относящихся к свойствам, выбранным для идентификации и/или отбора, с соответствующими пороговыми величинами.

Примерные значения для пороговых величин приводятся в описании выше. Тем не менее, специалист в данной области техники может понять, что способ не ограничивается указанными примерными значениями, поскольку пороговую величину можно выбирать от случая к случаю согласно типу белка или другим требованиям.

Согласно одному воплощению способа стадию моделирования последовательности во времени пути укладки белка осуществляют с помощью компьютерного моделирования, основанного на подходах Molecular Mechanics (MM) или Quantum-Mechanics Molecular Mechanics (QM-MM).

Согласно различным возможным вариантам реализации этого воплощения вышеуказанное компьютерное моделирование выполняют средствами компьютерного моделирования, основанного на молекулярной динамике храповика с собачкой и/или подхода с вычислением функционального смещения и/или подхода с вычислением взятия проб самосогласованным путем.

Специалист в данной области техники может легко понять, что указанные выше алгоритмы и вычислительные подходы являются только примерами, приведенными для пояснения раскрытия, и что способ можно осуществлять с использованием других алгоритмов и вычислительных подходов, явно не упомянутых в настоящем описании, приводящих к такому же типу результатов.

Больше подробностей о примерах алгоритмов, которые можно эффективно использовать для выполнения вышеуказанной стадии моделирования развития во времени пути укладки белков, можно найти в научных работах “S. Orioli, S. a Beccara, and P. Faccioli, J. Chem. Phys. 147, 064108 (2017)”; “C. Camilloni, R. A. Broglia, and G. Tiana, J. Chem. Phys. 134, 045105 (2011)”; “S. a Beccara, L. Fant, and P. Faccioli, Phys. Rev. Lett. 114, 098103 (2015)”.

Согласно другим возможным воплощениям способа стадию моделирования во времени пути укладки белка выполняют средствами компьютерного моделирования, основанного на любом другом подходе in silico, дающим на выходе реконструкцию путей укладки белков или идентификацию промежуточных продуктов укладки.

Согласно другим возможным воплощениям способа стадию моделирования во времени пути укладки белка выполняют с помощью любого экспериментального подхода, дающего на выходе реконструкцию путей укладки белков или идентификацию промежуточных продуктов укладки.

Способ для разработки лекарственных средств in silico, основанный на таргетинге промежуточных продуктов укладки, включенный в изобретение, описывается в настоящем описании ниже.

Такой способ включает стадии осуществления способа идентификации целевых промежуточных продуктов укладки белка, подходящих для тестирования в качестве мишеней для процедур для разработки лекарственных средств in silico, согласно любому из воплощений, описанных в настоящем описании.

На основании этого, способ разработки лекарственных средств in silico предусматривает осуществление разработки лекарственных средств in silico на выбранных целевых промежуточных продуктах укладки белка.

Согласно воплощению этого способа стадия осуществления разработки лекарственных средств in silico, на которой идентифицируют лекарственно ориентированный карман или горячую точку, включает идентификацию потенциальных лигандов, основанную на свойствах одного или нескольких лекарственно ориентированных карманов и/или горячих точек, идентифицированных в целевом промежуточном продукте укладки белка, причем указанные один или несколько лекарственно ориентированных карманов и/или горячих точек считаются возможными сайтами связывания; затем моделирование взаимодействия каждого из идентифицированных лигандов с каждым из идентифицированных сайтов связывания через вычисления in silico; и наконец, отбор лигандов на основании указанного выше моделирования.

В различных вариантах реализации способа в принципе можно использовать любую известную процедуру для разработки лекарственных средств in silico.

Настоящее изобретение также охватывает компьютерную программу, включающую по меньшей мере одну команду программирования, которая при выполнении компьютером, заставляет компьютер выполнять способ идентификации целевых промежуточных продуктов укладки белка, описанный в любом из иллюстрированных выше воплощений.

Настоящее раскрытие также охватывает по меньшей мере одну компьютерную программу, которая при выполнении компьютером, заставляет компьютер выполнять способ разработки лекарственных средств in silico, описанный в любом из иллюстрированных выше воплощений.

Очевидно, что термин «компьютер» следует понимать в контексте настоящего описания в его самом широком смысле, включая суперкомпьютеры и компьютерные кластеры или любой другой тип известного электронного процессора.

Настоящее раскрытие также включает носитель и/или среды и/или обеспечение, несущие вышеуказанную компьютерную программу или программы.

В следующей части описания приводятся другие сведения о примерных неограничивающих воплощениях изобретения.

Этапы, указанные ниже, описывают фактические действия, выполняемые специалистами при выполнении способа.

(i) Идентификация мишени

Задачи идентификации и отбора мишени подробно описаны выше.

(ii) Идентификация лекарственно ориентированного кармана

Поисковые анализы in silico отобранного целевого промежуточного продукта укладки белка ведут к отбору целевых промежуточных продуктов укладки белка, имеющих доступные для растворителя лекарственно ориентированные карманы, которые являются уникальными в отобранных промежуточных продуктах укладки белка и не присутствуют в нативной форме белка.

(iii а) Идентификация небольших молекул

В одном воплощении согласно настоящему изобретению стадия отбора включает отбор кармана(ов) с самым высоким рейтингом, т.е. целевого(ых) промежуточного(ых) продукта(ов) укладки белка с самым высоким рейтингом, который(е) затем используют для осуществления виртуальных операций по скринингу лекарственных средств для идентификации потенциальных небольших лигандов. В зависимости от области/цели исследования, создают и строят виртуальные химические библиотеки на данный случай. Для отбора наиболее перспективных кандидатов применяют вычислительные методы/инструменты, доступные на известном уровне техники, такие как виртуальный скрининг на основе докинга, оценка аффинности лиганда, эффективность лиганда (LE) и эффективность липофильности лиганда (LLE), удаление пан-аналитических интерференционных соединений и потенциальных агрегаторов, оценка физико-химических и ADMET свойств соединений, анализ подобия и кластеризации виртуальных соединений.

Описанный и заявленный в настоящем описании подход позволяет эффективно отобрать наиболее перспективных кандидатов для дальнейшего тестирования в более дорогих и затратных по времени экспериментах in vitro.

(iii b) Идентификация других молекул

В других воплощениях согласно настоящему изобретению соединения, определенные согласно описанному способу, могут включать антитела (и производные антител), токсины, нуклеиновые кислоты; такие молекулы также могут быть представлены эндогенными метаболитами.

(iv) Клеточный анализ

Как пример, лиганды, предсказанные виртуальным скринингом, проверяют в стабильно трансфицированной гетерологичной клеточной системе путем испытания их способности к посттрансляционному снижению экспрессии целевого белка в зависимости от дозы.

В принципе любое соединение, связывающееся с промежуточным продуктом укладки белка с достаточно высокой аффинностью, может снизить состояние его энергии, стабилизируя его структуру и таким образом продлевая его период полужизни. В контексте клеток такой стабилизирующий эффект может продуцировать необычно длительно живущий промежуточный продукт укладки, который узнается механизмом контроля качества укладки клетки, препятствуя правильному добавлению посттрансляционных модификаций и/или приводя к его деградации (например, через протеасом-ассоциированную деградацию и/или аутофагию). Следуя этому принципу, предсказанные in silico лиганды-кандидаты идентифицированного промежуточного продукта укладки испытывают в стандартных гетерологичных клеточных системах (например, клетках HEK293, CHO, SH-SY5Y или HeLa) для того, чтобы отобрать соединения, способные снижать или полностью подавлять общую экспрессию целевого белка (например, белка, для которого идентифицирован подходящий промежуточный продукт укладки) в зависимости от дозы при анализе стандартными биохимическими методами (например, вестерн-блоттингом). В случае, когда целевой белок не экспрессируется эндогенно в доступных клеточных системах, для того чтобы получить экспрессию целевого белка, создают экспрессирующие векторы и стабильно трансфицируют клетки.

Пример

Прионовые болезни ассоциируются с конформационной конверсией PrPC, эндогенного заякоренного гликозилфосфатидилинозитолом (ГФИ) гликопротеина клеточной поверхности, в неправильно сложенную изоформу, называемую «связанной со скрейпи формой PrP» (или PrPSc), которая накапливается в центральной нервной системе пораженных индивидуумов. PrPSc является инфекционным белком (прионом), не имеющим какой-либо кодирующей его нуклеиновой кислоты, который реплицируется посредством прямого связывания с PrPC, запускающим конформационную перегруппировку последнего в новые молекулы PrPSc. Множество данных показывает, что необходимая информация, определяющая биологические свойства прионов, кодируется исключительно структурой PrPSc, и что различные конформационные варианты PrPSc могут генерировать различные свойства линий, включая нейропаталогические и клинические особенности, лежащие в основе различных форм прионовых болезней. Полагают, что ассоциированные с заболеваниями мутации в гене PrP благоприятствуют неправильной укладке PrPC в агрегированные и патогенные PrPSc-подобные формы. Несмотря на эти своеобразные особенности, возрастающее число данных генетических, биофизических и биохимических исследований показывает, что патогенные механизмы, действующие при приорных болезнях, могут лежать в основе нейродегенеративных каскадов, встречающихся при некоторых других расстройствах. Большое и возрастающее число данных подводят к выводу, что соединения, способные модулировать экспрессию и/или активность PrPC, могут предоставить полностью новую терапевтическую перспективу в случае некоторых нейродегенеративных расстройств.

Способ, описанный в настоящем описании, применяют для идентификации небольших молекул, нацеленных на промежуточные продукты укладки PrPC и таким образом потенциально способные к посттрансляционному ингибированию экспрессии PrPC.

Пути укладки PrP вычисляют с использованием процедуры BF в хорошем растворителе с использованием модели силового поля Amber ff99SB-ILDN с растворителем TIP3P с использованием Gromacs 4.6.5, где подход BF интегрирован в разъеме Plumed 2.0.2. Рассматриваются 12 независимых развернутых конформаций, полученных имитационным моделированием MD теплового развертывания, инициированного из энергетически минимизированной нативной структуры PrP. Для каждого из 12 начальных развернутых состояний путем оценки их BF функционала оценены все 20 rMD экспериментальных траекторий, генерированных rMD. Три набора траекторий отбрасывают, поскольку ни один из путей укладки не сходится с нативным состоянием. С использованием этой схемы собраны 9 независимых траекторий укладки путем отбора наименее смещенных траекторий (LBTs) согласно процедуре BF, что подробно описано в S. a Beccara, L. Fant, and P. Faccioli, Phys. Rev. Lett., 114, 098103 (2015).

Чтобы найти кандидаты-промежуточные продукты укладки, используют траектории укладки, вычисленные с использованием алгоритма, названного молекулярной динамикой храповика с собачкой (как подробно описано в S. a Beccara, L. Fant, and P. Faccioli, Phys. Rev. Lett., 114, 098103 (2015)), для вычисления двумерной гистограммы частот фракции коллективной переменной Q нативных контактов и RMSD от нативной структуры. Переменную Q конфигурации белка получают путем деления числа пар атомов в указанной конфигурации с относительным расстоянием меньше 7,5 ангстрем на число пар атомов с относительным расстоянием меньше 7,5 ангстрем в нативной конфигурации.

Наблюдают существование промежуточного продукта на пути укладки при 0,5 нм < RMSD < 0,9 нм и 0,65 < Q < 0,85 (см. фиг. 1, обведен). Для того, чтобы экстрагировать конформации, описывающие полученный путь укладки, применяют двухстадийную фильтрацию LBT.

(I) Для каждого набора конформаций, выявленных LBT, сохраняют только конформации, располагающиеся в сильно заполненных областях на графике на фиг. 1. Для того, чтобы решить эту задачу, вычисляют кологарифм вероятности наблюдения данной конформации (определенной в терминах Q и RMSD), и исключают все точки, имеющие отклонение устойчивости относительно глобального минимума выше 3,5 kBT (области долгоживущего состояния).

(II) Для того, чтобы сфокусироваться только на представляющей интерес области, конформации дополнительно фильтруют путем сохранения только конформаций, отображающих 0,5 нм < RMSD < 0,9 нм и 0,65 < Q < 0,85.

Кластеризацию конформаций промежуточных продуктов выполняют с использованием k-средних [RStudio: Integrated Development for R. RStudio, Inc., Boston, MA]. Число кластеров выбирают с использованием «метода локтя». Расстояние contact map используют в качестве метрики кластеризации. Процедура кластеризации дает 3 различные заполненные группы, обозначенные как кластер C1, C2 и C3 (см. фиг. 2). Образцы конформаций из самых заполненных таких кластеров (C2 и C3) показывают отображенную спираль-1, предлагающую потенциальный сайт связывания. Для того, чтобы идентифицировать отдельную характерную конформацию в каждом из трех кластеров (C1, C2 и C2), авторы изобретения сначала рассчитали средний contact map в группе и затем идентифицировали такую структуру в этой группе, чтобы расстояние между ее contact map и средним contact map в кластере было наименьшим.

Выполняют моделирование in silico и виртуальный скрининг лекарственных средств для того, чтобы идентифицировать потенциальные лиганды для FI-PrP, сосредоточиваясь на уникальном сайте связывания, который присутствует в характерном элементе C3 и отсутствует в нативной форме PrPC (фиг. 3). In silico скрининг лекарственных средств выполняют согласно процедуре, описанной далее.

1) Начиная с характерной конформации кластера С3, авторы изобретения выполнили 50 нс молекулярной динамики (MD) в модели хорошего растворителя при ~27°С (300 К). При таком моделировании относительное положение атомов главной цепи остается фиксированным для того, чтобы можно было судить исключительно о расположении боковых цепей.

2) Конформации, задетые такой траекторией MD, структурно сгруппированы в две группы, так как траектория MD предполагает присутствие двух главных карманов. Авторы произвольно экстрагировали 10 конформаций из каждой группы.

3) Анализировали полученные 20 конформаций с использованием Sitemap для того, чтобы идентифицировать конформацию, содержащую сайты с наивысшей податливостью терапии.

4) Конформацию, идентифицированную на предыдущей стадии, используют в качестве мишени для скрининга лекарственных средств с использованием коммерческой библиотеки Asinex, которая включает примерно 250000 небольших молекул.

5) Результат такого виртуального скрининга авторы фильтруют согласно расчетной фармакодинамике и фармакокинетики, и приходят к конечному пулу, состоящему из 275 виртуальных совпадений. В целях пояснения в настоящем описании приводится химическая структура кандидата в лекарство в этой группе, которая предсказана как имеющая наивысшую аффинность связывания.

В принципе соединение, связывающееся с промежуточным продуктом укладки белка с достаточной аффинностью, может снизить его состояние энергии, стабилизируя его структуру и таким образом продлевая его период полужизни. В контексте клетки, в случае белков, синтезированных непосредственно в просвете эндоплазматического ретикулума (ER), подобных PrPC, такой стабилизирующий эффект может продуцировать необычно длительно живущий промежуточный продукт, который может быть узнан механизмом контроля качества ER (ERQC), препятствующим правильному добавлению модификаций и приводящим вероятно к деградации (например, ER-ассоциированной деградации и/или аутофагии). Следуя этому принципу, предполагаемые лиганды FI-PrP, идентифицированные с помощью предложенного протокола скрининга, можно испытать на их способность индуцировать деградацию и/или изменять посттрансляционный процессинг PrPC дикого типа (WT), экспрессированного в стабильно трансфицированных клетках HEK293. Сначала клетки следует инкубировать с возрастающими концентрациями каждой молекулы (показательно 0,01-50 мкМ). Затем полученный уровень экспрессии PrPC следует анализировать вестерн-блоттингом. Ожидается, что небольшие молекулы с высокой аффинностью индуцируют зависимое от дозы снижение клеточной экспрессии PrP.

Как отмечалось выше, описанный способ, в силу его особенностей, показанных выше, позволяет достичь объема изобретения.

В частности, способ позволяет, уникальным путем, идентифицировать карманы связывания в промежуточных продуктах укладки (не идентифицируемые известным решением), ведущим к явным преимуществам, связанным с идентификацией потенциальных мишеней для лекарственных средств.

Изобретение относится к биотехнологии. Описан способ идентификации целевых промежуточных продуктов укладки белка, подходящих для испытания в качестве мишеней в процедурах разработки лекарственных средств. С помощью средств электронной вычислительной техники осуществляют: моделирование последовательности событий, определяющих путь укладки белка, во времени, включающее моделирование и/или расчет структурных и/или энергетических и/или физико-химических свойств одного или нескольких состояний промежуточных продуктов укладки в соответствии с указанным путем укладки, где указанную стадию моделирования развития во времени пути укладки белка выполняют с помощью средств компьютерного моделирования, основанного на подходах Molecular Mechanics (MM) или Quantum-Mechanics Molecular Mechanics (QM-MM); идентификация по меньшей мере одного кандидата-промежуточного продукта укладки белка в соответствии с моделированным путем укладки, основанная на идентифицирующих свойствах из числа указанных структурных и энергетических и/или физико-химических свойств, причем указанная стадия идентификации включает идентификацию в качестве кандидата-промежуточного продукта укладки белка промежуточного продукта, имеющего время жизни более продолжительное, чем минимальный порог времени жизни; отбор одного или нескольких целевых промежуточных продуктов укладки белка, среди которых по меньшей мере один кандидат – промежуточный продукт укладки белка, основанный на свойствах для отбора из числа указанных структурных и энергетических и/или физико-химических свойств, причем указанные свойства для отбора соотносятся с лекарственной ориентированностью промежуточного продукта укладки белка. При этом отбор далее включает: отбор в качестве целевого промежуточного продукта укладки белка того промежуточного продукта, который имеет свойства для отбора, отсутствующие в нативном состоянии, и/или отбор в качестве целевого промежуточного продукта укладки белка того промежуточного продукта, который имеет лекарственно ориентированный карман, отсутствующий в нативном состоянии, или промежуточного продукта, имеющего лекарственно ориентированный карман, характеризующийся среднеквадратическим отклонением от кармана, присутствующего в нативном состоянии, большим, чем пороговая величина среднеквадратического отклонения. Также описан способ разработки лекарственных средств in silico, основанный на таргетинге промежуточных продуктов укладки, включающий осуществление способа идентификации целевых промежуточных продуктов укладки белка, подходящих для тестирования в качестве мишеней для процедур для разработки лекарственных средств in silico; осуществление разработки лекарственных средств in silico на выбранных целевых промежуточных продуктах укладки белка. Также раскрыты носители, содержащие соответствующие компьютерные программы для реализации описанных способов. Изобретение расширяет арсенал средств для идентификации целевых промежуточных продуктов укладки белка, подходящих для испытания в качестве мишеней при процедуре разработки лекарств. 4 н. и 13 з.п. ф-лы, 3 ил., 1 пр.

1. Способ идентификации целевых промежуточных продуктов укладки белка, подходящих для испытания в качестве мишеней в процедурах разработки лекарственных средств, включающий следующие стадии, выполняемые с помощью средств электронной вычислительной техники:

- моделирование последовательности событий, определяющих путь укладки белка, во времени, включающее моделирование и/или расчет структурных и/или энергетических и/или физико-химических свойств одного или нескольких состояний промежуточных продуктов укладки в соответствии с указанным путем укладки, где указанную стадию моделирования развития во времени пути укладки белка выполняют с помощью средств компьютерного моделирования, основанного на подходах Molecular Mechanics (MM) или Quantum-Mechanics Molecular Mechanics (QM-MM);

- идентификация по меньшей мере одного кандидата-промежуточного продукта укладки белка в соответствии с моделированным путем укладки, основанная на идентифицирующих свойствах из числа указанных структурных и энергетических и/или физико-химических свойств, причем указанная стадия идентификации включает идентификацию в качестве кандидата-промежуточного продукта укладки белка промежуточного продукта, имеющего время жизни более продолжительное, чем минимальный порог времени жизни;

- отбор одного или нескольких целевых промежуточных продуктов укладки белка, среди которых по меньшей мере один кандидат – промежуточный продукт укладки белка, основанный на свойствах для отбора из числа указанных структурных и энергетических и/или физико-химических свойств, причем указанные свойства для отбора соотносятся с лекарственной ориентированностью промежуточного продукта укладки белка, где указанный этап отбора далее включает:

отбор в качестве целевого промежуточного продукта укладки белка того промежуточного продукта, который имеет свойства для отбора, отсутствующие в нативном состоянии, и/или

отбор в качестве целевого промежуточного продукта укладки белка того промежуточного продукта, который имеет лекарственно ориентированный карман, отсутствующий в нативном состоянии,

или промежуточного продукта, имеющего лекарственно ориентированный карман, характеризующийся среднеквадратическим отклонением от кармана, присутствующего в нативном состоянии, большим, чем пороговая величина среднеквадратического отклонения.

2. Способ по п. 1, причем указанные свойства идентификации включают энергетические и/или физико-химические свойства промежуточного продукта укладки белка.

3. Способ по любому из пп. 1 или 2, причем указанные свойства для отбора включают:

- структурные свойства, соотнесенные с лекарственной ориентированностью рассматриваемого кандидата-промежуточного продукта укладки белка,

и/или

- параметры скоринга для идентификации горячих точек белка.

4. Способ по любому из предшествующих пунктов, причем

указанные свойства идентификации включают барьер свободной энергии между состоянием промежуточного продукта и нативным состоянием белка или между состоянием промежуточного продукта и следующего промежуточного продукта в направлении нативного состояния, и

указанная стадия идентификации включает идентификацию в качестве кандидата-промежуточного продукта укладки белка промежуточного продукта, отличающегося тем, что барьер свободной энергии между указанным промежуточным продуктом и нативным состоянием или следующим промежуточным продуктом в направлении нативного состояния является более высоким, чем порог свободной энергии.

5. Способ по любому из предшествующих пунктов, также включающий

- оценку времени жизни промежуточного продукта, определенного как обратная скорость переходов из состояния промежуточного продукта в нативное или в состояние следующего промежуточного продукта по пути укладки.

6. Способ по любому из предшествующих пунктов, причем указанная стадия идентификации по меньшей мере одного кандидата-промежуточного продукта укладки белка включает идентификацию метастабильных состояний.

7. Способ по любому из предшествующих пунктов, причем

указанные свойства для отбора включают присутствие лекарственно ориентированного кармана в рассматриваемом кандидате-промежуточном продукте укладки белка, причем лекарственно ориентированный карман определен в терминах параметров кармана, и

указанная стадия отбора включает отбор одного или нескольких целевых промежуточных продуктов укладки из числа кандидатов промежуточных продуктов укладки белка, основанный на сравнении указанных параметров кармана с соответствующими пороговыми величинами.

8. Способ по п. 7, причем указанные параметры кармана включают размерные параметры и/или параметры формы и/или параметры положения и/или отношение гидрофобного характера к гидрофильному.

9. Способ по п. 7, причем указанные размерные параметры кармана включают объем кармана, и/или глубину кармана, и/или закрытость, и/или экспонированность кармана.

10. Способ по любому из пп. 3-9, причем указанные параметры скоринга включают "SiteScore", и/или "Dscore", и/или "DrugScore", и/или баланс кармана.

11. Способ по пп. 3-5, 9, 10, причем

- указанный порог свободной энергии составляет 7,5 кДж/моль; и/или

- указанный порог времени жизни промежуточного продукта составляет по меньшей мере трехкратное время полужизни белка в физиологических условиях; и/или

- указанная пороговая величина среднеквадратического отклонения равна или больше и/или

- указанная пороговая величина объема кармана составляет по меньшей мере 350 и/или

- указанная пороговая величина глубины кармана составляет по меньшей мере 13 и/или

- указанная доступность кармана ≤0,49; и/или

- указанное окружение кармана ≥0,78; и/или

- указанная пороговая величина кармана SiteScore составляет ≥0,8; и/или

- указанная пороговая величина кармана DScore составляет ≥0,98; и/или

- указанная пороговая величина кармана DrugScore составляет ≥0,5; и/или

- указанная пороговая величина баланса кармана составляет ≥1.

12. Способ по п. 1, причем указанную стадию моделирования развития во времени пути укладки белка выполняют с помощью средств компьютерного моделирования, основанного на молекулярной динамике храповика с собачкой и/или подхода с вычислением функционального смещения и/или подхода с вычислением взятия проб самосогласованным путем.

13. Способ по любому из пп. 1-11, причем стадию моделирования последовательности во времени пути укладки белка выполняют с помощью любого подхода in silico или экспериментального подхода, дающего на выходе реконструкцию путей укладки белка или идентификацию промежуточных продуктов укладки.

14. Способ разработки лекарственных средств in silico, основанный на таргетинге промежуточных продуктов укладки, включающий

- осуществление способа идентификации целевых промежуточных продуктов укладки белка, подходящих для тестирования в качестве мишеней для процедур для разработки лекарственных средств in silico, по любому из пп. 1-13;

- осуществление разработки лекарственных средств in silico на выбранных целевых промежуточных продуктах укладки белка.

15. Способ по п. 14, причем стадия осуществления разработки лекарственных средств in silico на каждом выбранном целевом промежуточном продукте укладки белка, в котором идентифицирован лекарственно ориентированный карман или горячая точка, включает

- идентификацию потенциальных лигандов, основанную на свойствах одного или нескольких лекарственно ориентированных карманов и/или горячих точек, идентифицированных в указанном целевом промежуточном продукте укладки белка, причем указанные один или несколько лекарственно ориентированных карманов и/или горячих точек считаются возможными сайтами связывания;

- моделирование взаимодействия каждого из идентифицированных лигандов с каждым из идентифицированных сайтов связывания через моделирование in silico;

- отбор лигандов на основе указанного выше моделирования.

16. Носитель, содержащий компьютерную программу, где указанная программа включает по меньшей мере одну команду программирования, которая, при выполнении указанным носителем, заставляет его выполнять способ идентификации целевого промежуточных продуктов укладки по любому из пп. 1-13.

17. Носитель, содержащий компьютерную программу, которая включает по меньшей мере одну команду программирования, которая, при выполнении указанным носителем, заставляет его выполнять способ разработки лекарственных средств in silico по любому из пп. 14 или 15.