Способ дифференциации вакцинного штамма "Рич" от других штаммов и полевых изолятов возбудителя коронавирусной инфекции собак с помощью анализа максимальных экстремумов графиков температур плавления ампликонов с применением фиолетового лазерного красителя SuperNova v428 Российский патент 2024 года по МПК C12Q1/68 

Изобретение относится к ветеринарной вирусологии, к средствам молекулярной диагностики, а именно к дифференциации вакцинного штамма «Рич» от других штаммов и полевых изолятов возбудителя коронавирусной инфекции собак с помощью анализа максимальных экстремумов графиков температур плавления ампликонов с применением фиолетового лазерного красителя SuperNova v428.

Коронавирусная инфекция представляет собой серьезную проблему, которой особенно с 2019 года уделяют огромное внимание международные медицинские организации и ветеринарные службы всех стран мира [1].

Возбудителем данной высококонтагиозной, инфекционной болезни является вид Canine Coronavirus (CCoV), принадлежащий к роду Alphacoronavirus, подсемейству Orthocoronavirinae, семейству Coronaviridae [2].

Нуклеиновая кислота инфекционного агента представлена одноцепочечной молекулой РНК положительной полярности и размером около 29400-29800 н.о. Около 65% вирусной рибонуклеиновой кислоты занимают две большие, частично перекрывающиеся открытые рамки считывания (ORF): ORF1a и ORF1b, которые кодируют два полипротеина. С 3'-конца 1/3 генома (примерно 9000 н.о.) состоит из других ORP, несущих информацию о структурных и неструктурных вирусных белках. Структурные протеины альфа-коронавируса включают S-, Е-, М- и N-белки, кодируемые ORF2-, ORF4-, ORF5- и ORF6-генами, соответственно [3-6].

Система мер борьбы с коронавирусной инфекцией собак и ее профилактика предусматривает иммунизацию животных, а также контроль уровня напряженности поствакцинального иммунитета [4-8].

Для иммунизации животных применяют вакцину, включающую в свой состав антиген производственного штамма «РИЧ» коронавирусной инфекции собак (CCoV).

В случае вспышек данного заболевания важно правильно дифференцировать вакцинный штамм «РИЧ» и полевые изоляты CCoV друг от друга при проведении лабораторной диагностики для подтверждения безопасности производимого вакцинного лекарственного препарата и принятия дальнейших мер, поскольку штаммы существенно отличаются друг от друга генетически и по строению, и по функциям вирусных белков. Следует отметить, что данный анализ также необходим на этапе контроля качества вируссодержащего сырья при изготовлении вакцинных препаратов и при подтверждении использования требуемого штамма для производства вакцин против коронавирусной инфекцией собак.

Штамм «РИЧ» CCoV депонирован во Всероссийской государственной коллекции экзотических типов вируса ящура и других патогенов животных (ГКШМ) ФГБУ «ВНИИЗЖ», под регистрационным номером: №376-деп / 22-10 - ГКШМ ФГБУ «ВНИИЗЖ.

Учитывая, что в настоящее время производственный штамм «РИЧ» CCoV применяется для изготовления вакцин, целесообразно провести поиск способа дифференциации вакцинного штамма «РИЧ» возбудителя коронавирусной инфекции от полевых изолятов. Для решения поставленной задачи требуется провести молекулярно-биологический анализ генома CCoV, что даст возможность разработать способ на основе методов молекулярной биологии для контроля качества и определения специфичности используемого вакцинного сырья.

В настоящее время методы молекулярно-биологического анализа находят широкое применение в диагностике различных инфекционных заболеваний. Благодаря созданию последнего поколения флуоресцирующих красителей и технологическим усовершенствованиям платформ количественной полимеразной цепной реакции (ПЦР) исследование максимальных экстремумов графиков температур плавления ампликонов - стало перспективным методом генотипирования микроорганизмов, который возможно применять для дифференциации вакцинных штаммов вирусов [9-13].

Изучение максимальных значений температур плавления для различных изолятов/штаммов вирусов и других микроорганизмов представляет собой исследование кривой плавления ампликонов в широком диапазоне температур с узким шагом. Сочетание улучшенного инструментария количественной детекции ампликонов и флуоресцирующих красителей последнего поколения позволила выявлять генетические вариации в последовательностях нуклеиновых кислот путем контролируемого плавления двухцепочечных ДНК [14-18].

Сущность представленного метода заключается в том, что после проведения ПЦР с применением флуоресцирующего красителя смесь постепенно нагревают, и при достижении определенной температуры ампликоны начинают разъединяться, флуорофор постепенно высвобождается, и флуоресценция, которая детектируется оптической системой термоциклера, снижается. Чувствительность анализа достигает одного нуклеотида, благодаря чему с помощью данного метода можно достичь высокой общей точности разработанного способа [15].

Прототипным вариантом проведения дифференциации вакцинного штамма «РИЧ» от полевых изолятов возбудителя коронавирусной инфекции собак является реакция амплификации со специфическими праймерами, гель-электрофорез и секвенирование по Сенгеру [19]. Данный метод является дорогостоящим, трудоемким и продолжительным по времени. Таким образом, необходимо разработать альтернативный способ дифференциации вакцинного штамма «Рич» от других штаммов и полевых изолятов возбудителя коронавирусной инфекции собак с помощью анализа максимумов температур плавления ампликонов с применением фиолетового лазерного красителя SuperNova v428.

Задачей настоящего изобретения является разработка чувствительного и специфичного, экспресс-способа дифференциации вакцинного штамма «Рич» от других штаммов и полевых изолятов возбудителя коронавирусной инфекции собак с помощью анализа максимумов температур плавления ампликонов с применением фиолетового лазерного красителя SuperNova v428 с целью устранения вышеуказанных недостатков.

Данная задача решена благодаря разработке способа дифференциации вакцинного штамма «РИЧ» от других штаммов и полевых изолятов возбудителя коронавирусной инфекции собак с помощью анализа максимумов температур плавления ампликонов с применением фиолетового лазерного красителя SuperNova v428.

Сущность разработанного способа заключается в следующем: 1) создание дизайна оригинальных высокоспецифичных олигонуклеотидных прямого и обратного праймеров для синтеза фрагмента кДНК с мутациями, уникальными для вакцинного штамма «Рич» CCoV; 2) проведение ПЦР с применением фиолетового лазерного красителя SuperNova v428; 3) постепенный нагрев ампликонов в широком диапазоне температур, и при достижении пика температуры плавления двуцепочечная молекула кДНК распадается на отдельные цепи, что вызывает яркий флуоресцентный сигнал, специфичный для красителя SuperNova v428. Для каждого варианта нуклеотидного состава характерна своя температура плавления. Анализируя кривые плавления ампликонов, возможно проводить дифференциацию вакцинного штамма «Рич» от других штаммов и полевых изолятов возбудителя коронавирусной инфекции согбак.

Разработанный способ дает возможность: 1) сократить время проведения анализа до 2,5 ч; 2) применять фиолетовый лазерный краситель последнего поколения SuperNova v428, который не ингибирует реакцию и характеризующийся яркой флуоресценцией после встраивания в ампликоны, что позволяет достичь высокой точности и чувствительности проводимого анализа; 3) увеличить чувствительность и специфичность анализа за счет использования высокоспецифичных оригинальных олигонуклеотидных праймеров, рассчитанных для целевого участка кДНК М-гена (целевой участок в диапазоне 26326…26435 п.н., размер ПЦР-продукта составляет 110 п.н.). Данная разработка позволит расширить арсенал средств для проведения контроля качества сырья при производстве вакцин против коронавирусной инфекции собак из производственного штамма «РИЧ».

Технический результат изобретения заключается в том, что разработанный способ дает возможность: 1) повысить чувствительность и специфичность за счет применения высокоспецифичных оригинальных праймеров CCoV-F-DIFF и CCoV-R-DIFF, рассчитанных для целевого участка М-гена CCoV (размер ПЦР-продукта составляет ПО п.н.); 2) повысить достоверность проводимого анализа благодаря применению фиолетового лазерного красителя последнего поколения SuperNova v428; 3) с помощью анализа максимумов температур плавления ампликонов по найденным константам проводить дифференциацию вакцинного штамма «Рич» от других штаммов и полевых изолятов возбудителя коронавирусной инфекции собак.

Сущность изобретения отражена на графических изображениях:

Фиг. 1 - Дизайн оригинальных высокоспецифичных олигонуклеотидных праймеров для дифференциации вакцинного штамма «Рич» от других штаммов и полевых изолятов возбудителя коронавирусной инфекции собак с помощью анализа максимумов температур плавления ампликонов с применением фиолетового лазерного красителя SuperNova v428. Примечание: revers-complement - перевернутая комплементарная форма обратного праймера.

Фиг. 2 - Карта нуклеотидных замен для участка М-гена вакцинного штамма «Рич» по сравнению с другими штаммами/изолятами. Примечание: анализировали диапазон 26326…26408 п.н.; для исследования использовали следующие вакцинные штаммы/полевые изоляты CCoV: «NL-18», «Matias», «Bigotes», «NTU336/F/2008», «HuPn-2018», «СВ/05», «TN-449», «Lola», «Karat», «№49», «Konam».

Фиг. 3 - Диаграмма максимумов температур плавления ампликонов при анализе вакцинных штаммов/полевых изолятов CCoV. Примечание: для исследования использовали следующие вакцинные штаммы возбудителя коронавирусной инфекции: «NL-18», «Matias», «Bigotes», «NTU336/F/2008», «HuPn-2018», «СВ/05», «TN-449», «Lola», «Karat», «№49», «Konam».

Сущность изобретения пояснена в перечне последовательностей, в котором:

SEQ ID NO: 1 представляет последовательность нуклеотидов кДНК М-гена вакцинного штамма «Рич» CCoV;

SEQ ID NO: 2 представляет последовательность аминокислот, кодируемых кДНК М-гена вакцинного штамма «Рич» CCoV.

Заявляемый способ основан на проведении следующих этапов анализа: 1) экстрагирование РНК из образца; 2) проведение ПЦР специфического фрагмента кДНК М-гена CCoV размером 110 п.н. с применением разработанных оригинальных олигонуклеотидных высокоспецифичных праймеров:

CCoV-F-DIFF с дизайном 5'-CTAACTGGAACTTCAGCTGGTC-3' и

CCoV-R-DIFF с дизайном 5'-CATTATAAGCATTTTAATGCCATACACG-3' (фиг. 1, таблицы 1, 2) и фиолетового лазерного красителя SuperNova v428; 3) детекция результатов анализа с определением максимумов температуры плавления и проведение инструментального дифференциального анализа геномов вакцинного штамма «Рич» от других производственных штаммов/полевых изолятов CCoV.

По результатам анализа опубликованных в научной литературе данных, в настоящее время используется только прототипный способ дифференциации штаммов и изолятов возбудителя коронавирусной инфекции собак с помощью секвенирования по Сенгеру [19], однако, как указано выше, он очень дорогостоящий, трудоемкий и продолжительный по времени проводимого исследования. При анализе публикаций способ дифференциации вакцинного штамма «Рич» от других штаммов и полевых изолятов возбудителя коронавирусной инфекции собак с помощью анализа максимумов температур плавления ампликонов с применением фиолетового лазерного красителя SuperNova v428 не представлен. Таким образом, сведений об аналогах предлагаемого способа авторами не обнаружено.

Разработанный способ дифференциации вакцинного штамма «Рич» от других штаммов и полевых изолятов возбудителя коронавирусной инфекции собак с помощью анализа максимумов температур плавления ампликонов с применением фиолетового лазерного красителя SuperNova v428 по сравнению с прототипом отличается экономической выгодой, легкостью и экспрессностью выполнения анализа, что позволяет быстро проводить анализ. Фиолетовый лазерный краситель SuperNova v428 более чувствителен своих аналогов, для обнаружения различных типов нуклеиновых кислот.Максимум возбуждения для красителя SuperNova v428 отмечается при длине волны 414 нм, а максимум излучения - при 428 нм [20].

В отличие от прототипа разработанный способ позволяет провести анализ выравнивания множественных нуклеотидных последовательностей целевого участка кДНК М-гена вакцинных штаммов/полевых изолятов CCoV. Разработанный способ предусматривает проведение ПЦР специфического фрагмента М-гена кДНК CCoV в диапазоне 26326…26408 п.н. с применением разработанных оригинальных олигонуклеотидных высокоспецифичных праймеров. Разработанный способ предусматривает проведение плавления ампликонов в разработанном режиме с учетом пиков температур плавления двуцепочечных ДНК и применение фиолетового лазерного красителя SuperNova v428, а также детекцию результатов анализа с определением максимальных значений температур плавления для решения задачи по дифференциации вакцинного штамма «Рич» от других штаммов и полевых изолятов возбудителя коронавирусной инфекции собак. Таким образом, разработан способ дифференциации вакцинного штамма «Рич» от других штаммов и полевых изолятов возбудителя коронавирусной инфекции собак с помощью анализа максимумов температур плавления ампликонов с применением фиолетового лазерного красителя SuperNova v428.

Обоснованием выбранного участка М-гена CCoV является наличие уникальных нуклеотидных мутаций, характерных для вакцинного штамма «Рич» CCoV в сравнении со штаммами и изолятами возбудителя коронавирусной инфекции собак, а именно в позиции 26353 п.н. замена А на Т, 26378-26379 п.н. - GG на АС, 26403 п.н. - С на Т (относительно некоторых штаммов/изолятов CCoV) (фиг. 2).

Ключевым элементом заявляемого способа является применение разработанных высокоспецифичных олигонуклеотидных праймеров и анализа максимальных экстремумов графиков температур плавления ампликонов с применением фиолетового лазерного красителя SuperNova v428 для дифференциации вакцинного штамма «РИЧ» от других штаммов и полевых изолятов возбудителя коронавирусной инфекции собак.

Сопоставительный анализ с прототипом позволяет сделать вывод, что новизна и изобретательский уровень заявляемого изобретения заключаются в применении разработанных высокоспецифичных олигонуклеотидных праймеров CCoV-F-DIFF и CCoV-R-DIFF, рассчитанных для амплификации целевого участка кДНК М-гена CCoV размером ПО п.н. и анализа максимальных значений температур плавления ампликонов с применением фиолетового лазерного красителя SuperNova v428.

Сущность предлагаемого изобретения пояснена на графическом материале - Диаграмма максимумов температур плавления ампликонов при анализе вакцинных штаммов/полевых изолятов CCoV. Примечание: для исследования использовали следующие вакцинные штаммы возбудителя коронавирусной инфекции: «NL-18», «Matias», «Bigotes», «NTU336/F/2008», «HuPn-2018», «СВ/05», «TN-449», «Lola», «Karat», «№49», «Konam» (фиг. 3).

На основном этапе исследования проводят выделение РНК из образцов с использованием набора «РИБО-сорб» в соответствии с инструкцией производителя («Интерлабсервис», РФ).

На следующем этапе проводят ПЦР с применением высокоспецифичных оригинальных разработанных олигонуклеотидных праймеров и фиолетового лазерного красителя SuperNova v428 для исследования стандартного образца и проб. Стандартным образцом является культуральная суспензия CCoV вакцинного штамма «Рич», которая изначально исследована с помощью секвенирования по Сенгеру для подтверждения наличия именно требуемого штамма в стандарте (n=5). В качестве отрицательного контроля используют деионизированную воду без нуклеаз MilliQ.

Для постановки ПЦР готовят реакционную смесь, которая включает в свой состав следующие компоненты:

PCR buffer 10х - 3 мкл,

хлорид магния 25 мМ - 2,5 мкл,

олигонуклеотидные праймеры - по 5 мкл,

краситель SuperNova v428 - 2,5 мкл,

MMLV-ревертаза - 1 e.a. (0,1 мкл),

Taq ДНК-полимераза - 1 е.а. (0,1 мкл),

элюат ДНК - 6 мкл,

деионизированная вода - 5,8 мкл.

Итоговый объем смеси для проведения одной реакции составляет 30 мкл. Обратную транскрипцию проводят при температуре 42°С в течение 15 мин.

Постановку ПЦР осуществляют в детектирующем термоциклере CFX-96 (Bio-Rad, США), или аналоге при температурных и временных параметрах, сведения о которых представлены в таблице 3.

Предварительную денатурацию проводят при температуре 96°С в течение 3 минут. ПЦР в режиме реального времени включает в себя 3 подэтапа: денатурацию, отжиг олигонуклеотидов, элонгацию. Денатурацию осуществляют при температуре 96°С в течение 5 секунд, отжиг олигонуклеотидов и элонгацию - при температуре 63°С в течение 40 секунд. Далее проводят плавление при температуре, начиная с 65 до 90°С. Увеличение температуры составляет - 0,1°С за каждый шаг. При этом после первого шага плавления требуется ждать 90 секунд при температуре первого шага. Для каждого последующего шага время ожидания составляет 2 секунды.

Исследование кривой плавления двуцепочечных фрагментов кДНК представленных выше вакцинных штаммов/полевых изолятов CCoV для анализа данных и профилей плавления образцов выполняют с использованием программного обеспечения для сканирования с помощью детектирующего амплификатора. Проводят построение кривых плавления в виде параболы и детектируют пики температур плавления для полученных графиков. Выявляют, какие максимумы температур плавления характерны для указанных выше штаммов/изолятов CCoV, что позволяет проводить дифференциацию вакцинного штамма «Рич» от других штаммов и полевых изолятов возбудителя коронавирусной инфекции собак с помощью анализа максимумов температур плавления ампликонов с применением фиолетового лазерного красителя SuperNova v428.

Сущность изобретения пояснена примерами его использования, которые не ограничивают объем изобретения.

Пример 1. Разработка способа дифференциации вакцинного штамма «Рич» от других штаммов и полевых изолятов возбудителя коронавирусной инфекции собак с помощью анализа максимумов температур плавления ампликонов с применением фиолетового лазерного красителя SuperNova v428.

Для определения показателей, позволяющих проводить дифференциацию вакцинного штамма «Рич» от других штаммов и полевых изолятов возбудителя коронавирусной инфекции собак с помощью анализа максимумов температур плавления ампликонов с применением фиолетового лазерного красителя SuperNova v428, осуществляли этапы работы, представленные ниже.

На первом этапе исследования проводили выделение нуклеиновой кислоты из вируссодержащего образца, как указано выше.

На следующем этапе проводили ОТ-ПЦР для исследования проб в соответствии с описанием, представленным выше. Для постановки реакции готовили реакционную смесь, как отражено выше. Проведение анализа осуществляли, как отражено выше.

Исследование кривой плавления для анализа данных пиков температуры плавления ампликонов участка М-гена кДНК штаммов/полевых изолятов CCoV и профилей плавления образцов выполняли с использованием программного обеспечения CFX-96, или аналога. Проводили построение кривых плавления в виде параболы и детектировали максимумы температур плавления для полученных графиков. Тестировали кДНК CCoV указанных штаммов и полевых изолятов в 32 повторностях для каждого образца для получения результатов с высокой степенью достоверности (табл. 4).

Выявили, что для вакцинного штамма «Рич» данная температура составила 72,18±0,04°С (n=32, р<0,001), «NL-18» и «Konam» - 76,54±0,03°С (n=32, р<0,001), для остальных исследуемых штаммов/изолятов - 75,94±0,05°С (n=32, р<0,001) (табл. 4).

Таким образом, для исследуемых штаммов/изолятов CCoV характерны определенные максимальные экстремумы графиков температуры плавления. При этом значительно отличается именно вакцинный штамм «Рич» CCoV. Таким образом, разработан способ дифференциации вакцинного штамма «РИЧ» возбудителя коронавирусной инфекции от других штаммов и полевых изолятов с помощью анализа максимумов температур плавления ампликонов с применением фиолетового лазерного красителя SuperNova v428.

Пример 2. Исследование аналитической специфичности разработанного способа дифференциации вакцинного штамма «Рич» от других штаммов и полевых изолятов возбудителя коронавирусной инфекции собак с помощью анализа максимумов температур плавления ампликонов с применением фиолетового лазерного красителя SuperNova v428.

Специфичность анализа дифференциации вакцинного штамма «Рич» от других штаммов и полевых изолятов возбудителя коронавирусной инфекции собак с помощью анализа максимумов температур плавления ампликонов с применением фиолетового лазерного красителя SuperNova v428 оценивали при исследовании суспензий штамма «РВ-97» вируса бешенства, штамма «Грей» возбудителя парвовирусного энтерита, штамма «А №2269/ВНИИЗЖ/2015» вируса ящура, штамма «Мира» калицивируса кошек. Количество инфекционных доз вирусов в суспензиях составлял не менее 6,0 lg ТЦД₅₀/см³ или 6,0 lg ККИД₅₀/см³. Исследования проводили в 5 повторностях.

В качестве положительного контроля использовали суспензию вакцинного штамма «Рич» CCoV. Отрицательным контролем служила деионизированная вода. Для проведения исследования использовали детектирующий амплификатор марки CFX-96 (Bio-Rad, США). В результате исследования амплификация с неспецифичными нуклеиновыми кислотами других инфекционных агентов графики не были сформированы, что подтверждало высокую специфичность компонентов реакционной смеси данного способа для CCoV.

В результате исследования обнаружили, что для проб, не содержащих нуклеиновую кислоту CCoV, и отрицательного контроля не формировались графики плавления и не были обнаружены пиковые значения при анализе высокого разрешения. При исследовании положительного контроля получены следующие значения температур плавления: 72,18±0,04°С (n=3, р<0,005). Результаты анализа контролей подтверждают стандартные данные, отраженные в примере 1.

Таким образом, полученные данные свидетельствовали о 100%-ной специфичности разработанного способа дифференциации вакцинного штамма «Рич» от других штаммов и полевых изолятов возбудителя коронавирусной инфекции собак с помощью анализа максимумов температур плавления ампликонов с применением фиолетового лазерного красителя SuperNova v428.

Пример 3. Определение диагностических показателей разработанного способа дифференциации вакцинного штамма «Рич» возбудителя коронавирусной инфекции от других штаммов и полевых изолятов с помощью анализа максимумов температур плавления ампликонов с применением фиолетового лазерного красителя SuperNova v428.

Для исследования разработанного способа дифференциации вакцинного штамма «Рич» от других штаммов и полевых изолятов возбудителя коронавирусной инфекции собак с помощью анализа максимумов температур плавления ампликонов с применением фиолетового лазерного красителя SuperNova v428 исследовали стандартные диагностические показатели. Для определения диагностической чувствительности разработанного способа анализировали 440 заведомо положительных проб суспензий CCoV штамма «Рич» с титрами инфекционной активности не ниже 6,0 lg ТЦД₅₀/см³.

Проведение ПЦР с последующим плавлением ампликонов осуществляли, как отражено выше. С помощью разработанного способа (предлагаемое изобретение) определили, что из 440 исследуемых проб CCoV все определены в качестве положительных и подтверждено наличие именно того штамма, который содержался в анализируемых суспензиях.

Для исследования специфичности метода тестировали 244 суспензии CCoV различных штаммов и изолятов, за исключением вакцинного штамма «Рич». В результате исследования с помощью разработанного способа (предлагаемое изобретение) определили, что все 244 пробы содержали геном CCoV, но не штамма «Рич». Пользуясь представленными выше статистическими методами анализа определили, что в 95%-ном доверительном интервале диагностическая чувствительность (Dse) составила 99,17-100,00%, диагностическая специфичность (DSp) - 98,50-100,0%, It-критерий - 1,000; общая точность (DAc) - 99,46-100,00% (табл. 5).

Основными преимуществами предлагаемого изобретения является возможность проводить за короткий промежуток времени (не более 2,5 ч) дифференциацию вакцинного штамма «Рич» от других штаммов и полевых изолятов возбудителя коронавирусной инфекции собак с помощью анализа максимумов температур плавления ампликонов с применением фиолетового лазерного красителя SuperNova v428. Разработанный способ впервые применили для решения данной задачи. Выявили, что в целевом участке М-гена кДНК CCoV имеется несколько нуклеотидных мутаций, уникальных для вакцинного штамма «Рич», что позволило разработать высокоспецифические оригинальные олигонуклеотидные праймеры CCoV-F-DIFF и CCoV-R-DIFF, рассчитанные для амплификации целевого участка кДНК М-гена CCoV размером ПО п.н. и анализа максимальных экстремумов графиков температур плавления ампликонов с применением фиолетового лазерного красителя SuperNova v428.

Разработанный способ характеризуется 100%-ной аналитической специфичностью. В 95%-ном доверительном интервале диагностическая чувствительность для данного способа составляет 99,17-100,00%, диагностическая специфичность - 98,50-100,0%, точность - 99,46-100,00%.

Источники информации, принятые во внимание при составлении описания изобретения к заявке на выдачу патента РФ на изобретение «Способ дифференциации вакцинного штамма «Рич» от других штаммов и полевых изолятов возбудителя коронавирусной инфекции собак с помощью анализа максимальных экстремумов графиков температур плавления ампликонов с применением фиолетового лазерного красителя SuperNova v428»:

1. Naylor M.J., Harrison G.A., Monckton R.P., McOrist S., Lehrbach P.R., Deane E.M. Identification of canine coronavirus strains from faeces by S gene nested PCR and molecular characterization of a new Australian isolate // J. Clin. Microbiol - 2001. - V. 39. - P. 1036-1041.

2. Bandai C., Ishiguro S., Masuya N. et al. Canine coronavirus infections in Japan: virological and epidemiological aspects // J. Vet. Med. Sci. - 1999. - V. 61. - P. 731-736.

3. Enjuanes, L., Brian, D., Cavanagh, D. et al., Virus Taxonomy, Classification and Nomenclature of Viruses. - Academic Press, New York. - 2000. - P. 835-849.

4. Keenan K.P., Jervis H.R., Marchwicki R.H., Binn L.N. Intestinal infection of neonatal dogs with canine coronavirus 1-71: studies by virologic, histologic, histochemical and immunofluorescent techniques // Am. J. Vet. Res. - 1976. - V. 37. - P. 247-256.

5. Pratelli A., Tinelli A., Decaro N., Camero M., Elia G., Gentile A., Buonavoglia C. PCR assay for the detection and the identification of atypical canine coronavirus in dogs // J. Virol. Methods - 2002. - V. 106. - P. 209-213.

6. Диагностика и профилактика инфекционных болезней кошек и собак: Руководство для практикующих ветеринарных врачей под редакцией Т.И. Алипера. Москва, 2017; 207-212.

7. Naylor M.J., Harrison G.A., Monckton R.P., McOrist S., Lehrbach P.R., Deane E.M. Identification of canine coronavirus strains from faeces by S gene nested PCR and molecular characterization of a new Australian isolate // J. Clin. Microbiol. - 2001. - V. 39. - P. 1036-1041.

8. Pratelli A., Tempesta M., Greco G., Martella V., Buonavoglia C. Development of a nested PCR assay for the detection of canine coronavirus // J. Virol. Methods - 1999. - V. 80. - P. 11-15.

9. Pratelli A., Buonavoglia D., Martella V., Tempesta M., Lavazza A., Buonavoglia C. Diagnosis of canine coronavirus infection using nested-PCR // J. Virol. Methods - 2000. - V. 84. - P. 91-94.

10. Pratelli A., Martella V., Elia G., Decaro N., Aliberti A., Buonavoglia D., Tempesta M., Buonavoglia C. Variation of the sequence in the gene encoding for transmembrane protein M of canine coronavirus (CCoV) // Mol. Cell. Probes. - 2001. - V. 15. - P. 229-233.

11. Pratelli A., Tinelli A., Decaro N., Camero M., Elia G., Gentile A., Buonavoglia C. PCR assay for the detection and the identification of atypical canine coronavirus in dogs // J. Virol. Methods - 2002. - V. 106. - P. 209-213.

12. Erali M, Voelkerding KV, Wittwer CT. High resolution melting applications for clinical laboratory medicine. Exp Mol Pathol. 2008 Aug; 85(1): 50-8.

13. Lung O, Fisher M, Beeston A, Hughes KB, Clavijo A, Goolia M, Pasick J, Mauro W, Deregt D. Multiplex RT-PCR detection and microarray typing of vesicular disease viruses. J Virol Methods. 2011 Aug; 175(2): 236-45.

14. Zhou L, Wang L, Palais R, Pryor R, Wittwer CT. High-resolution DNA melting analysis for simultaneous mutation scanning and genotyping in solution. Clin Chem. 2005 Oct; 51(10): 1770-7.

15. Shi X, Liu X, Wang Q, Das A, Ma G et al. A multiplex real-time PCR panel assay for simultaneous detection and differentiation of 12 common swine viruses. J Virol Methods. 2016 Oct; 236: 258-265.

16. Ambagala A, Fisher M, Goolia M, Nfon C, Furukawa-Stoffer T, Ortega Polo R, Lung O. Field-Deployable Reverse Transcription-Insulated Isothermal PCR (RT-iiPCR) Assay for Rapid and Sensitive Detection of Foot-and-Mouth Disease Virus. Transbound Emerg Dis. 2017 Oct; 64(5): 1610-1623.

17. Reid SM, Pierce KE, Mistry R, Bharya S, Dukes JP, Volpe C, Wangh LJ, King DP. Pan-serotypic detection of foot-and-mouth disease virus by RT linear-after-the-exponential PCR. Mol Cell Probes. 2010 Oct; 24(5): 250-5.

18. Liu YL, Ding YZ, Dai JF, Ma B, et al. Development of a New RT-PCR with Multiple Primers for Detecting Southern African Territories Foot-and-mouth Disease Viruses. J Vet Res. 2018 Dec 31; 62(4): 431-437.

19. Estrada-Rivadeneyra D. Sanger sequencing. FEBS J. 2017 Dec; 284(24): 4174.

20. Флуоресцентные полимерные красители SuperNova. URL: https://www.beckman.co.il/ru/reagents/coulter-flow-cytometry/supernova-fluorescent-polymer-dyes. (Дата обращения: 21.08.2023).

Перечень последовательностей

--->

<ST26SequenceListing dtdVersion="V1_3" fileName="CCoV RICH DIFF 2024-06-04.xml" softwareName="WIPO Sequence" softwareVersion="2.1.2" productionDate="2024-06-04">

<ApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText>0</ApplicationNumberText>

<FilingDate>2023-08-29</FilingDate>

</ApplicationIdentification>

<ApplicantFileReference>537</ApplicantFileReference>

<EarliestPriorityApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText>0</ApplicationNumberText>

<FilingDate>2023-08-29</FilingDate>

</EarliestPriorityApplicationIdentification>

<ApplicantName languageCode="ru">

</ApplicantName>

<ApplicantNameLatin>

Federal State-Financed Institution Federal Centre for Animal Health (FGBI ARRIAH)

</ApplicantNameLatin>

<InventorName languageCode="ru">Доронин Максим Игоревич</InventorName>

<InventorNameLatin>Doronin Maksim Igorevich </InventorNameLatin>

<InventionTitle languageCode="ru">

Способ дифференциации вакцинного штамма «Рич» возбудителя коронавирусной инфекции от других штаммов и полевых изолятов с помощью анализа максимальных экстремумов графиков температур плавления ампликонов с применением фиолетового лазерного красителя SuperNova v428

</InventionTitle>

<SequenceTotalQuantity>4</SequenceTotalQuantity>

<SequenceData sequenceIDNumber="1">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>318</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..318</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q1">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>CCoV</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>

tttatactttggattatgtattttgttagatccattcagttatacagaacgactaagtcttggtggtcttttaaccctgagactaacgcaattctttgccttagtgcattgggaagaagctatgtacttccgcttgaaggtgtgccaactggtgtcactctaacattgctttcagggaatctgtatgcggaagggttcaaaattgcaggtggtatgaacatcgacaatttgccaaagtacgtaatggttgcattacctagcaggaccattgtctacacacttgttggtaagaaattgaaagcaagtagcccccccggg

</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="2">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>106</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..106</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q2">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>CCoV</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>

FILWIMYFVRSIQLYRTTKSWWSFNPETNAILCLSALGRSYVLPLEGVPTGVTLTLLSGNLYAEGFKIAGGMNIDNLPKYVMVALPSRTIVYTLVGKKLKASSPPG

</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="3">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>22</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..22</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q3">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>CCoV</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>ctaactggaacttcagctggtc</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="4">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>28</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..28</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q4">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>CCoV</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>cattataagcattttaatgccatacacg</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

</ST26SequenceListing>

<---

Изобретение относится к ветеринарной вирусологии, к средствам молекулярной диагностики. Описан способ дифференциации вакцинного штамма «Рич» от других штаммов и полевых изолятов возбудителя коронавирусной инфекции собак с помощью анализа максимальных экстремумов графиков температур плавления ампликонов с применением фиолетового лазерного красителя SuperNova v428. Основными преимуществами предлагаемого изобретения является возможность проводить за короткий промежуток времени, не более 2,5 ч, дифференциацию вакцинного штамма «Рич» от других штаммов и полевых изолятов возбудителя коронавирусной инфекции собак. Разработанный способ характеризуется 100%-ной аналитической специфичностью. В 95%-ном доверительном интервале диагностическая чувствительность для данного способа составляет 99,17-100,00%, диагностическая специфичность - 98,50-100,0%, точность - 99,46-100,00%. 1 з.п. ф-лы, 3 ил., 5 табл., 3 пр.

1. Способ дифференциации вакцинного штамма «Рич» от других штаммов и полевых изолятов возбудителя коронавирусной инфекции собак с помощью анализа максимальных экстремумов графиков температур плавления ампликонов с применением фиолетового лазерного красителя SuperNova v428, включающий применение высокоспецифичных олигонуклеотидных праймеров: CCoV-F-DIFF с дизайном 5’-CTAACTGGAACTTCAGCTGGTC-3’ и CCoV-R-DIFF с дизайном 5’-CATTATAAGCATTTTAATGCCATACACG-3’ для амплификации специфического фрагмента кДНК М-гена CCoV размером 110 п.н. и фиолетового лазерного красителя SuperNova v428; и анализа максимальных экстремумов графиков температур плавления ампликонов, при этом для вакцинного штамма «Рич» CCoV температура плавления ампликонов имеет значения 72,18±0,04°С.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что аналитическая специфичность составляет 100%, диагностическая чувствительность в 95%-ном доверительном интервале - 99,17-100,00%, диагностическая специфичность - 98,50-100,0%.