МОДИФИЦИРОВАННОЕ АНТИТЕЛО И СПОСОБ ЕГО ИЗГОТОВЛЕНИЯ Российский патент 2024 года по МПК C07K16/22 C12N15/13 C12N15/63 

[1] Настоящее изобретение относится к улучшенному модифицированному антителу, имеющему повышенную растворимость и способному к концентрированию при высоком уровне и к способу его получения, и, более конкретно, настоящее изобретение относится к модифицированному антителу, в котором заменены аминокислоты в его скелете, и к способу его получения.

[2] ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

[3] Антитела используются в качестве высокоэффективных терапевтических средств в лечении таких заболеваний, как рак и аутоиммунные заболевания. Способность к разработке антител оценивается с учетом высокого выхода, стабильного препарата, высокой физико-химической и in vivo стабильности, высокой растворимости и характеристик РК (фармакокинетика) (Next generation antibody drugs: pursuit of the 'High-hanging fruit'. Nat. Rev. Drug Discovery., 2018, 17:197-223.)

[4] Антитела - белковые фармацевтические средства - могут быть химически нестабильными из-за изменений ковалентных связей или физически нестабильными из-за деформации трехмерной пространственной структуры. Антитела могут быть химически нестабильными из-за гидролиза, окисления, дезамидирования, модификации дисульфидов или рацемизации и могут быть физически нестабильными из-за агрегации, адсорбции или растворения.

[5] Нестабильность антител может влиять на растворимость, эффективность или тому подобное и снижать стабильность и растворимость антитела, таким образом, вызывая снижение продуктивности и выхода продукции, а также увеличение склонности к агрегации, которая увеличивает риск иммуногенности.

[6] При данном предшествующем уровне техники авторы настоящего изобретения сделали попытки разработки модифицированного антитела, которое можно сконцентрировать до высокого уровня посредством улучшения растворимости данного антитела. В результате, авторы настоящего изобретения обнаружили то, что было возможным концентрирование до высокого уровня на основе улучшенной растворимости посредством замены аминокслот в конкретном положении, и на основе этого осуществили настоящее изобретение.

[7]

[8] ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[9] Следовательно, одной из целей настоящего изобретения является именно предложение улучшенного модифицированного антитела, имеющего повышенную растворимость, и его фрагмента.

[10] Другой целью настоящего изобретения является предложение способа получения модифицированного антитела и его фрагмента.

[11] Согласно одному аспекту настоящего изобретения приведенные выше и другие цели могут осуществляться посредством предоставления модифицированного антитела и его фрагмента, в котором заменена по меньшей мере одна аминокислота, выбранная из группы, состоящей из аминокислот в положениях 13 и 42 вариабельной области тяжелой цепи (на основе системы нумерации АНО) и аминокислота в положении 94 вариабельной области легкой цепи (на основе системы нумерации АНО).

[12] Согласно другому аспекту настоящего изобретения предложен способ получения модифицированного антитела и его фрагмента, в котором заменена по меньшей мере одна аминокислота, выбранная из группы, состоящей из аминокислот в положениях 13 и 42 вариабельной области тяжелой цепи (на основе системы нумерации АНО) и аминокислота в положении 94 вариабельной области легкой цепи (на основе системы нумерации АНО).

[13] ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

[14] На ФИГ. 1 показаны результаты моделирования структуры антитела и анализ горячих точек.

[15] На ФИГ. 2 показаны результаты анализа экспрессии для L11T, V13S и V103S (на основе системы нумерации АНО, именуемых далее «L11T», «V12S» и «V93S») в горячих точках антитела.

[16] На ФИГ. 3 показаны результаты анализа экспрессии для N42T, Q77R и N94S (на основе системы нумерации АНО, именуемых далее «N35T», «Q61R» и «N76S») в горячих точках антитела.

[17] На ФИГ. 4 показаны результаты анализа экспрессии для V13S, N42T и N94S (на основе системы нумерации АНО, именуемых далее «V12S», «N35T» и «N76S») в горячих точках антитела.

[18] На ФИГ. 5A-5G показаны результаты очистки антител посредством SDS-PAGE (электрофорез в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия).

[19] На ФИГ. 6 показаны результаты анализа термостабильности антитела против Ang2 согласно настоящего изобретения.

[20] На ФИГ. 7А-7С показаны результаты оценки антиангиогенной эффективности антитела против Ang2 согласно настоящему изобретению с использованием мышиной модели CNV (хороидальная неоваскуляризация).

[21]

[22] Наилучший способ

[23] Если не определено иначе, все технические и научные термины, используемые в данном документе, имеют такие же значения, которые понятны специалистам в области, к которой относится настоящее изобретение. В общем, использованная в данном документе номенклатура хорошо известна в данной области и является обычно используемой.

[24] Авторы настоящего изобретения обнаружили то, что модифицированное антитело и его фрагмент, в котором заменена по меньшей мере одна аминокислота, выбранная из группы, состоящей из аминокислот в положениях 13 (V12) и 42 (N35) вариабельной области тяжелой цепи (на основе системы нумерации АНО) и аминокислота в положении 94 (N76) вариабельной области легкой цепи (на основе системы нумерации АНО), демонстрирует улучшенную растворимость, может быть сконцентрировано до высокого уровня и, таким образом, демонстрирует улучшенную продуктивность.

[25] В частности, авторы настоящего изобретения обнаружили то, что модифицированное антитело и его фрагмент, в котором аминокислота в положении 13 (V12) в вариабельной области тяжелой цепи заменена серином (S), аминокислота в положении 42 (N35) в вариабельной области тяжелой цепи заменена треонином (Т), или аминокислота в положении 94 (N76) в вариабельной области легкой цепи заменена серином (S), где данная нумерация основывается на системе нумерации АНО, демонстрирует улучшенную растворимость, может быть сконцентрировано до высокого уровня и, таким образом, демонстрирует улучшенную продуктивность.

[26] Основываясь на этом, в одном аспекте настоящее изобретение направлено на модифицированное антитело и его фрагмент, в котором заменена по меньшей мере одна аминокислота, выбранная из группы, состоящей из аминокислот в положениях 13 и 42 вариабельной области тяжелой цепи (на основе системы нумерации АНО) и аминокислота в положении 94 вариабельной области легкой цепи (на основе системы нумерации АНО).

[27] В другом аспекте настоящее изобретение направлено на способ получения модифицированного антитела и его фрагмента, в котором заменена по меньшей мере одна аминокислота, выбранная из группы, состоящей из аминокислот в положениях 13 и 42 вариабельной области тяжелой цепи (на основе системы нумерации АНО) и аминокислота в положении 94 вариабельной области легкой цепи (на основе системы нумерации АНО).

[28] Положения аминокислот для антител или их фрагментов, раскрытые в данном документе, могут быть определены или идентифицированы на основе системы нумерации АНО. В некоторых случаях положение аминокислоты антитела или его фрагмента, раскрытое в данном документе, может означать положение, последовательно пронумерованное от №1, соответствующее аминокислоте, начинающей N-конец аминокислотных последовательностей вариабельной области тяжелой цепи SEQ ID NO: 34 и вариабельной области легкой цепи SEQ ID NO: 32.

[29] В одном воплощении аминокислоты в положении 13 и положении 42 (на основе системы нумерации АНО) в вариабельной области тяжелой цепи и аминокислота в положении 94 (на основе системы нумерации АНО) в вариабельной области легкой цепи могут быть заменены серином (S) или треонином (Т).

[30] В конкретных воплощениях данные замены аминокислот могут включать замены аминокислот в одном или более чем одном положении (на основе системы нумерации АНО), выбранном из группы, состоящей из следующих:

[31] замена валина (V) в положении 13 в вариабельной области тяжелой цепи серном (S);

[32] замена аспарагина (N) в положении 42 в вариабельной области тяжелой цепи треонином (Т); и

[33] замена аспарагина (N) в положении 94 в вариабельной области легкой цепи серином (S).

[34] В конкретных воплощениях настоящего изобретения данная замена аминокислот может включать замену аминокислот в следующих положениях (на основе системы нумерации АНО):

[35] замена валина (V) в положении 13 в вариабельной области тяжелой цепи серином (S);

[36] замена аспарагина (N) в положении 42 в вариабельной области тяжелой цепи треонином (Т);

[37] замена аспарагина (N) в положении 94 в вариабельной области легкой цепи серином (S);

[38] замена валина (V) в положении 13 в вариабельной области тяжелой цепи серином (S) и замена аспарагина (N) в положении 42 вариабельной области тяжелой цепи треонином (Т);

[39] замена валина (V) в положении 13 вариабельной области тяжелой цепи серином (S) и замена аспарагина (N) в положении 94 вариабельной области легкой цепи серином (S);

[40] замена аспарагина (N) в положении 42 вариабельной области тяжелой цепи треонином (Т) и замена аспарагина (N) в положении 94 вариабельной области легкой цепи серином (S); или

[41] замена валина (V) в положении 13 вариабельной области тяжелой цепи серином (S), замена аспарагина (N) в положении 42 вариабельной области тяжелой цепи треонином (Т) и замена аспарагина (N) в положении 94 вариабельной области легкой цепи серином (S).

[42] Замены описанных выше аминокислот приводят к улучшению растворимости антитела, концентрированию до высоких уровней и улучшению продуктивности.

[43] В отличие от приведенной выше аминокислотной замены, обнаружили то, что замена лейцина в положении 11 в вариабельной области тяжелой цепи (на основе системы нумерации АНО) треонином, замена валина в положении 103 в вариабельной области тяжелой цепи (на основе системы нумерации АНО) серином или замена глутамина в положении 77 в вариабельной области легкой цепи (на основе системы нумерации АНО) аргинином не демонстрировала желательного эффекта улучшения растворимости.

[44] В конкретных воплощениях модифицированное антитело или его фрагмент согласно настоящему изобретению может включать одну или более чем одну каркасную область, выбранную из группы, состоящей из следующих:

[45] QVQLVESGGGLX₁KPGGSLRLSCAAS (в которой X₁ представляет собой S);

[46] MX₂WVRQAPGKGLEWVSS (в которой Х₂ представляет собой Т); и

[47] NLQSGVSSQFSGSGSGTDFTLTIX₃SLQPEDSATYYC (в которой Х₃ представляет собой S).

[48] В частности, клон антитела против Ang2 - O4, включающий вариабельную область тяжелой цепи с последовательностью SEQ ID NO: 34 и вариабельную область легкой цепи с последовательностью SEQ ID NO: 32, может включать замены серином (S) или треонином (Т) одной или более чем одной аминокислоты, выбранной из группы, состоящей из аминокислот в положениях 12 и 35 в вариабельной области тяжелой цепи и аминокислоты в положении 76 в вариабельной области легкой цепи.

[49] В одном воплощении клон антитела против Ang2 - O4, включающий вариабельную область тяжелой цепи с последовательностью SEQ ID NO: 34 и вариабельную область легкой цепи с последовательностью SEQ ID NO: 32, может включать одну или более чем одну аминокислотную замену, выбранную из группы, состоящей из следующих:

[50] замена валина (V) в положении 12 в вариабельной области тяжелой цепи серином (S);

[51] замена аспарагина (N) в положении 35 в вариабельной области тяжелой цепи треонином (Т); и

[52] замена аспарагина (N) в положении 76 в вариабельной области легкой цепи серином (S).

[53] В частности, согласно настоящему изобретению клон антитела против Ang2 - O4 - может включать следующую аминокислотную замену:

[54] замена валина (V) в положении 12 в вариабельной области тяжелой цепи серином (S);

[55] замена аспарагина (N) в положении 35 в вариабельной области тяжелой цепи треонином (Т);

[56] замена аспарагина (N) в положении 76 в вариабельной области легкой цепи серином (S);

[57] замена валина (V) в положении 12 вариабельной области тяжелой цепи серином (S); и замена аспарагина (N) в положении 35 вариабельной области тяжелой цепи треонином (Т);

[58] замена валина (V) в положении 12 вариабельной области тяжелой цепи серином (S); и замена аспарагина (N) в положении 76 вариабельной области легкой цепи серином (S);

[59] замена аспарагина (N) в положении 35 в вариабельной области тяжелой цепи треонином (Т) и замена аспарагина (N) в положении 76 в вариабельной области легкой цепи серином (S); или

[60] замена валина (V) в положении 12 вариабельной области тяжелой цепи серином (S), замена аспарагина (N) в положении 35 вариабельной области тяжелой цепи треонином (Т) и замена аспарагина (N) в положении 76 вариабельной области легкой цепи серином (S).

[61] Сделали попытки улучшения физических свойств O4 - клона антитела против Ang2, включающего вариабельную область тяжелой цепи с последовательностью SEQ ID NO: 34 и вариабельную область легкой цепи с последовательностью SEQ ID NO: 32. Результаты показали то, что, когда O4 имеет каркасную область, имеющую последовательность QVQLVESGGGLX₁KPGGSLRLSCAAS (где X₁ представляет собой S) в FR1 вариабельной области тяжелой цепи, или каркасную область, имеющую последовательность MX₂WVRQAPGKGLEWVSS (где Х₂ представляет собой Т) в FR3 или QVQLVESGGGLX₁KPGGSLRLSCAAS (где X₁ в FR1 представляет собой S) в FR1 и MX₂WVRQAPGKGLEWVSS в FR3 (где Х₂ представляет собой Т), оно может быть сконцентрировано до высокого уровня из-за улучшенной растворимости данного антитела и, таким образом, демонстрирует улучшенную продуктивность.

[62] Результаты продемонстрировали то, что, когда O4 имеет каркасную область, имеющую последовательность NLQSGVSSQFSGSGSGTDFTLTIX₃SLQPEDSATYYC (где Х₃ представляет собой S) в FR3 вариабельной области легкой цепи, оно может быть сконцентрировано до высокого уровня из-за улучшенной растворимости антитела и, таким образом, демонстрирует улучшенную продуктивность.

[63] Результаты продемонстрировали то, что, когда O4 имеет каркасную область, имеющую последовательность QVQLVESGGGLX1KPGGSLRLSCAAS (где X₁ представляет собой S) в FR1 вариабельной области тяжелой цепи и каркасную область, имеющую последовательность NLQSGVSSQFSGSGSGTDFTLTIX₃SLQPEDSATYYC (где X₃ представляет собой S) в FR3 вариабельной области легкой цепи, или

[64] O4 имеет каркасную область, имеющую последовательность MX₂WVRQAPGKGLEWVSS (где Х₂ представляет собой Т) в FR3 вариабельной области тяжелой цепи и каркасную область, имеющую последовательность NLQSGVSSQFSGSGSGTDFTLTIX₃SLQPEDSATYYC (где Х₃ представляет собой S) в FR3 вариабельной области легкой цепи, или

[65] O4 имеет каркасную область, имеющую последовательность QVQLVESGGGLX1KPGGSLRLSCAAS (где X₁ представляет собой S) в FR1 вариабельной области тяжелой цепи, каркасную область, имеющую последовательность MX₂WVRQAPGKGLEWVSS (где Х₂ представляет собой Т) в FR3 вариабельной области тяжелой цепи, и каркасную область, имеющую последовательность NLQSGVSSQFSGSGSGTDFTLTIX₃SLQPEDSATYYC (где Х₃ представляет собой S) в FR3 вариабельной области легкой цепи, оно может быть сконцентрировано до высокого уровня из-за улучшенной растворимости антитела и, таким образом, демонстрирует улучшенную продуктивность.

[66] В некоторых случаях модифицированное антитело или его фрагмент согласно настоящему изобретению может представлять собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которое связывается с Ang2 (ангиопоэтин-2).

[67] В данном случае антитело или его антигенсвязывающий фрагмент может включать следующее:

[68] вариабельная область тяжелой цепи, включающая CDR1 тяжелой цепи, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, 7, 13, 19 и 25,

[69] CDR2 тяжелой цепи, выбранная из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2, 8, 14, 20 и 26, и

[70] CDR3 тяжелой цепи, выбранная из группы, состоящей из SEQ ID NO: 3, 9, 15, 21, 27, 43, 44 и 45, и

[71] вариабельная область легкой цепи, включающая CDR1 легкой цепи, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 4, 10, 16, 22 и 28,

[72] CDR2 легкой цепи, выбранная из группы, состоящей из SEQ ID NO: 5, 11, 17, 23 и 29, и

[73] CDR3 легкой цепи, выбранная из группы, состоящей из SEQ ID NO: 6, 12, 18, 24 и 30.

[74]

[75]

[76]

[77] Термин «антитело» в том виде, как он используется в данном документе, относится к антителу против Ang2, которое специфично связывается с Ang2. Полное антитело и антигенсвязывающий фрагмент молекул данного антитела попадает в пределы объема настоящего изобретения.

[78] Полное антитело имеет структуру, имеющую две полноразмерные легкие цепи и две полноразмерные тяжелые цепи, и каждая легкая цепь связывается с тяжелой цепью дисульфидной связью. Константная область тяжелой цепи имеет типы гамма (γ), мю (μ), альфа (α), дельта (δ) и эпсилон (ε) и подразделяется на подклассы гамма 1 (γ1), гамма 2 (γ2), гамма 3 (γ3), гамма 4 (γ4), альфа 1 (α1) и альфа 2 (α2). Константная область легкой цепи имеет типы каппа (κ) и лямбда (λ).

[79] Антигенсвязывающий фрагмент антитела или фрагмент антитела представляет собой фрагмент, который имеет антигенсвязывающую способность, и включает Fab, F(ab'), F(ab')2, Fv и тому подобные. Среди фрагментов антитела Fab относится к структуре, включающей вариабельную область каждой из тяжелой цепи и легкой цепи, константную область легкой цепи и первый константный домен (СН1) тяжелой цепи, причем каждая имеет один антигенсвязывающий сайт.Fab' отличается от Fab тем, что он дополнительно включает шарнирную область, включающую по меньшей мере один остаток цистеина на С-конце домена СН1 тяжелой цепи. F(ab')2 создается дисульфидной связью между остатками цистеина в шарнирной области Fab'. Fv представляет собой минимальный фрагмент антитела, имеющий только вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи. Двухцепочечный Fv представляет собой фрагмент, в котором вариабельная область тяжелой цепи и вариабельная область легкой цепи связываются нековалентной связью, и одноцепочечный Fv (scFv) представляет собой фрагмент, в котором вариабельная область тяжелой цепи и вариабельная область легкой цепи обычно связываются ковалентной связью через пептидный линкер между ними или непосредственно связываются на С-конце, образую структуру в форме димера, подобно двухцепочечному Fv. Такие фрагменты антитела могут быть получены с использованием протеаз (например, Fab может быть получен посредством рестрикционного расщепления полного антитела папаином, и фрагмент F(ab')2 может быть получен посредством расщепления полного антитела пепсином) и также могут быть получены с использованием методик генной инженерии.

[80] В одном воплощении антитело по настоящему изобретению находится в виде Fv (например, scFv) или в виде полного антитела. Кроме того, константная область тяжелой цепи может быть выбрана из изотипов гамма (γ), мю (μ), альфа (α), дельта (δ) и эпсилон (ε). Например, константная область может представлять собой гамма 1 (IgG1), гамма 3 (IgG3) или гамма 4 (IgG4). Константная область легкой цепи может представлять собой каппа или лямбда.

[81] Термин «тяжелая цепь» в том виде, как он используется в данном документе, охватывает и полноразмерную тяжелую цепь, которая включает вариабельный домен (VH), содержащий аминокислотную последовательность, имеющую достаточную последовательность вариабельной области для придания специфичности в отношении антигена, и три константных домена (СН1, СН2 и СН3), и ее фрагмент. Термин «легкая цепь» в том виде, как он используется в данном документе, охватывает и полноразмерную легкую цепь, которая включает вариабельный домен (VL), содержащий аминокислотную последовательность, имеющую достаточную последовательность вариабельной области для придания специфичности в отношении антигена, и константный домен (CL), и ее фрагмент.

[82] Антитело по настоящему изобретению включает моноклональные антитела, мультиспецифичные антитела, человеческие антитела, гуманизированные антитела, химерные антитела, одноцепочечные FV (scFV), одноцепочечные антитела, Fab фрагменты, F(ab') фрагменты, связанные дисульфидной связью Fv (sdFV), антиидиотипические (анти-ld) антитела, эпитопсвязывающие фрагменты таких антител и тому подобное, но не ограничиваются ими.

[83] Термин «моноклональное антитело» относится к идентичному антителу, которое получают из популяции по существу гомогенных антител, то есть, каждое антитело, составляющее данную популяцию, исключая возможные встречающиеся в природе мутации, которые могут присутствовать в ничтожных количествах. Моноклональные антитела являются высокоспецифичными и, таким образом, индуцируются против одного антигенного сайта. В отличие от препаратов традиционных (поликлональных) антител, которые типично включают разные антитела, направленные против разных детерминант (эпитопов), каждое моноклональное антитело направлено против одной детерминанты на антигене.

[84] Термин «эпитоп» относится к белковой детерминанте, с которой может специфично связываться антитело. Эпитопы обычно состоят из группы химически активных поверхностных молекул, таких как боковые цепи аминокислот или Сахаров, и обычно имеют не только специфические трехмерные структурные характеристики, но также специфические характеристики заряда. Трехмерные эпитопы отличаются от нетрехмерных эпитопов тем, что связь с первыми разрушается в присутствии денатурирующего растворителя, тогда как связь с последними не разрушается.

[85] Не являющееся человеческим (например, мышиное) антитело «гуманизированной» формы представляет собой химерное антитело, включающее одну или более чем одну аминокислотную последовательность (например, последовательности CDR), происходящую из одного или более чем одного не являющегося человеческим антитела (донорские или исходные антитела), содержащего минимальные последовательности, происходящие от не являющихся человеческими иммуноглобулинов. В большинстве случаев гуманизированное антитело представляет собой человеческий иммуноглобулин (антитело-реципиент), в котором остаток из гипервариабельной области реципиента заменяется остатком из гипервариабельной области вида, не являющегося человеком (антитело-донор), такого как мышь, крыса, кролик или примат, не являющийся человеком, имеющей желательную специфичность, аффинность и способность.

[86] Термин «человеческое антитело» в том виде, как он используется в данном документе, относится к молекуле, происходящей от человеческого

иммуноглобулина, в которой все аминокислотные последовательности, составляющие данное антитело, включая область, определяющую комплементарность и структурную область, составлены из человеческих иммуноглобулинов.

[87] Часть тяжелой цепи и/или легкой цепи является идентичной или

гомологичной соответствующей последовательности в антителе, происходящем от конкретного вида или принадлежащем к конкретному классу или подклассу антитела, тогда как остальная(ные) цепь(пи) включает(ют) «химерные» антитела (иммуноглобулины), которые являются идентичными или гомологичными соответствующим последовательностям в антителе, происходящем от другого вида или принадлежащем к другому классу или подклассу антитела, а также фрагменты таких антител, демонстрирующие желательную биологическую активность.

[88] Термин «вариабельный домен антитела» в том виде, как он используется в данном документе, относится к областям легкой и тяжелой цепи 35 молекулы антитела, включающим аминокислотные последовательности области, определяющей комплементарность (CDR; т.е. CDR1, CDR2 и CDR3), и каркасной области (FR). VH относится к вариабельному домену тяжелой цепи. VL относится к вариабельному домену легкой цепи.

[89] Термин «область, определяющая комплементарность» (CDR, то есть, CDR1, CDR2 и CDR3) относится к аминокислотному остатку вариабельного домена антитела, который необходим для связывания антигена. Каждый вариабельный домен типично имеет три области CDR, идентифицированные как CDR1, CDR2 и CDR3. Область, определяющая комплементарность, по настоящему изобретению включает вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR3 тяжелой цепи SEQ ID NO: 1, и вариабельную область легкой цепи, включающую CDR3 легкой цепи SEQ ID NO: 2.

[90] В частности, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, связывающийся с Ang2, включает: вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи SEQ ID NO: 1, CDR2 тяжелой цепи SEQ ID NO: 2 и CDR3 тяжелой цепи SEQ ID NO: 3, и вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи SEQ ID NO: 4, CDR2 легкой цепи SEQ ID NO: 5 и CDR3 легкой цепи SEQ ID NO: 6,

[91] вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи SEQ ID NO: 7, CDR2 тяжелой цепи SEQ ID NO: 8 и CDR3 тяжелой цепи SEQ ID NO: 9, и вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи SEQ ID NO: 10, CDR2 легкой цепи SEQ ID NO: 11 и CDR3 легкой цепи SEQ ID NO: 12,

[92] вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи SEQ ID NO: 13, CDR2 тяжелой цепи SEQ ID NO: 14 и CDR3 тяжелой цепи SEQ ID NO: 15, и вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи SEQ ID NO: 16, CDR2 легкой цепи SEQ ID NO: 17 и CDR3 легкой цепи SEQ ID NO: 18,

[93] вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи SEQ ID NO: 19, CDR2 тяжелой цепи SEQ ID NO: 20 и CDR3 тяжелой цепи SEQ ID NO: 21, и вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи SEQ ID NO: 22, CDR2 легкой цепи SEQ ID NO: 23 и CDR3 легкой цепи SEQ ID NO: 24,

[94] вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи SEQ ID NO: 25, CDR2 тяжелой цепи SEQ ID NO: 26 и CDR3 тяжелой цепи SEQ ID NO: 27, и вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи SEQ ID NO: 28, CDR2 легкой цепи SEQ ID NO: 29 и CDR3 легкой цепи SEQ ID NO: 30,

[95] вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи SEQ ID NO: 13, CDR2 тяжелой цепи SEQ ID NO: 14 и CDR3 тяжелой цепи SEQ ID NO: 43, и вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи SEQ ID NO: 16, CDR2 легкой цепи SEQ ID NO: 17 и CDR3 легкой цепи SEQ ID NO: 18,

[96] вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи SEQ ID NO: 13, CDR2 тяжелой цепи SEQ ID NO: 14 и CDR3 тяжелой цепи SEQ ID NO: 44, и вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи SEQ ID NO: 16, CDR2 легкой цепи SEQ ID NO: 17 и CDR3 легкой цепи SEQ ID NO: 18, или

[97] вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи SEQ ID NO: 13, CDR2 тяжелой цепи SEQ ID NO: 14 и CDR3 тяжелой цепи SEQ ID NO: 45, и вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи SEQ ID NO: 16, CDR2 легкой цепи SEQ ID NO: 17 и CDR3 легкой цепи SEQ ID NO: 18.

[98] Термин «каркасная область» (FR) относится к другому остатку вариабельного домена, чем остаток CDR. Каждый вариабельный домен типично имеет четыре FR, идентифицированных как FR1, FR2, FR3 и FR4. Авторы настоящей заявки индуцировали мутации в каркасных областях с целью улучшения продуктивности и растворимости для того, чтобы разработать препараты с улучшенной продуктивностью и высокой концентрацией.

[99] «Fv» фрагмент представляет собой фрагмент антитела, содержащий сайты распознавания и связывания полного антитела. Такая область включает димер, который состоит из одного вариабельного домена тяжелой цепи и одного вариабельного домена легкой цепи, по существу прочно ковалентно связанных друг с другом, например, посредством scFv.

[100] «Fab» фрагмент содержит вариабельный домен и константный домен легкой цепи и вариабельный домен и первый константный домен (СН1) тяжелой цепи. Фрагмент антитела F(ab')2 обычно включает пару Fab фрагментов, ковалентно связанных около их карбоксильных концов через шарнирный цистеин между ними.

[101] Фрагмент антитела «одноцепочечный Fv» или «scFv» включает домены VH и VL антитела, где данные домены присутствуют в одной полипептидной цепи. Полипептид Fv может дополнительно включать полипептидный линкер между доменом VH и доменом VL для того, чтобы scFv образовал желательную структуру для связывания антигена.

[102] Функционально аффинность связывания антитела согласно настоящему изобретению варьирует от 10^-5 М до 10^-12 М. Аминокислотная замена согласно настоящему изобретению возможно ни снижает аффинность в отношении антигена, ни оказывает вредного влияния на аффинность.

[103] Например, аффинность связывания модифицированного антитела согласно настоящему изобретению в отношении антигена составляет от 10^-6 М до 10^-12 М, от 10^-7 М до 10^-12 М до 10^-8 М до 10^-12 М, от 10^-9 М до 10^-12 М, от 10^-5 М до 10^-11 М, от 10^-6 М до 10-¹¹ М, от 10-⁷ М до 10^-11 М, от 10^-8 М до 10^-11 М, от 10^-9 М до 10^-11 М, от 10^-10 М до 10^-11 М, от 10^-5 М до 10^-10 М, от 10^-6 М до 10^-10 М, от 10^-7 М до 10^-10 М, от 10^-8 М до 10^-10, от 10^-9 М до 10^-10 М, от 10^-5 M до 10^-9 М, от 10^-6 М до 10^-9 М, от 10^-7 М до 10^-9 М, от 10^-8 М до 10^-9 М, от 10^-5 М до 10^-8 М, от 10^-6 М до 10^-8 М, от 10^-7 М до 10^-8 М, от 10^-5 М до 10^-7 М, от 10^-6 М до 10^-7 М или от 10^-5 М до 10^-6 М.

[104] Модифицированное антитело согласно настоящему изобретению может включать вариабельную область тяжелой цепи, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 31, 33 и 39 и/или вариабельную область легкой цепи с последовательностью SEQ ID NO: 35.

[105] В конкретном воплощении согласно настоящему изобретению модифицированное антитело согласно настоящему изобретению может включать вариабельную область тяжелой цепи с последовательностью SEQ ID NO: 31 и вариабельную область легкой цепи с последовательностью SEQ ID NO: 32;

[106] вариабельную область тяжелой цепи с последовательностью SEQ ID NO: 33 и вариабельную область легкой цепи с последовательностью SEQ ID NO: 32;

[107] вариабельную область тяжелой цепи с последовательностью SEQ ID NO: 34 и вариабельную область легкой цепи с последовательностью SEQ ID NO: 35;

[108] вариабельную область тяжелой цепи с последовательностью SEQ ID NO: 36 и вариабельную область легкой цепи с последовательностью SEQ ID NO: 32;

[109] вариабельную область тяжелой цепи с последовательностью SEQ ID NO: 31 и вариабельную область легкой цепи с последовательностью SEQ ID NO: 35;

[110] вариабельную область тяжелой цепи с последовательностью SEQ ID NO: 33 и вариабельную область легкой цепи с последовательностью SEQ ID NO: 35; или

[111] вариабельную область тяжелой цепи с последовательностью SEQ ID NO: 36 и вариабельную область легкой цепи с последовательностью SEQ ID NO: 35.

[112] Модифицированное антитело или его фрагмент по настоящему изобретению может включать не только последовательности антител, но также и их биологические эквиваленты, при условии, что он может поддерживать желательные функции. Например, в отношении аминокислотной последовательности антитела могут быть сделаны дополнительные изменения для того, чтобы дополнительно улучшать аффинность связывания и/или другие биологические свойства антитела. Такие вариации включают, например, делецию, вставку и/или замену остатков аминокислотной последовательности данного антитела. Такие мутации аминокислот основаны на относительном сходстве заместителей боковых цепей аминокислот, как, например, их гидрофобности, гидрофильности, заряда и размера. Это можно понять посредством анализа размера, формы и типа заместителей боковых цепей аминокислот, которые все у аргинина, лизина и гистидина являются положительно заряженными остатками; аланин, глицин и серии имеют аналогичный размер; а фенилаланин, триптофан и тирозин имеют аналогичную форму. Таким образом, на основе данных соображений аргинин, лизин и гистидин; аланин, глицин и серии; и фенилаланин, триптофан и тирозин считаются биологическими функциональными эквивалентами.

[113] При рассмотрении мутаций, имеющих биологически эквивалентную активность, антитело или кодирующая его молекула нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению интерпретируется как включающие последовательность, имеющую существенную идентичность с последовательностью, изложенной в номере последовательности. Термин «существенная идентичность» означает то, что последовательность имеет гомологию по меньшей мере 90%, предпочтительно гомологию по меньшей мере 90%, наиболее предпочтительно по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% и по меньшей мере 99% при выравнивании последовательности по настоящему изобретению и любой другой последовательности таким образом, чтобы они соответствовали друг другу, насколько это возможно, и осуществлении анализа выровненной последовательности с использованием алгоритмов, обычно используемых в данной области. Способы выравнивания для сравнения последовательности хорошо известны в данной области. Средство поиска базового местного выравнивания NCBI (Национальный центр биотехнологической информации США) (BLAST) доступно через NCBI или тому подобные и может использоваться в сочетании с программами анализа последовательности, такими как BLASTP, BLASTM, BLASTX, TBLASTN и TBLASTX в Интернете. BLAST доступен на www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/. Способ сравнения гомологии последовательности с использованием данной программы можно найти на www.ncbi.nim.nih.gov/BLAST/blast_help.html.

[114] На основе этого антитело или его антигенсвязывающий фрагмент согласно настоящему изобретению может иметь гомологию 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более по сравнению с последовательностью, раскрытой в данном документе или во всей его полноте. Гомология может определяться посредством сравнения и/или выравнивания последовательностей способами, известыми в данной области. Например, процентную долю гомологии последовательности нуклеиновой кислоты или белка согласно настоящему изобретению можно определять с использованием алгоритма сравнения последовательностей (т.е. BLAST или BLAST 2.0), выравнивания вручную или визуальной проверки.

[115] В другом аспекте настоящее изобретение направлено на нуклеиновую кислоту, кодирующую модифицированное антитело или его фрагмент.

[116] Данное модифицированное антитело или его фрагмент может продуцироваться рекомбинантно посредством выделения нуклеиновой кислоты, кодирующей данное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению. Данную нуклеиновую кислоту выделяют и вставляют в реплицируемый вектор, с последующим дальнейшим клонированием (амплификация ДНК) или дальнейшей экспрессией. На основе этого в другом аспекте настоящее изобретение направлено на вектор, включающий данную нуклеиновую кислоту.

[117] Подразумевается то, что термин «нуклеиновая кислота» охватывает молекулы и ДНК (гДНК (геномная ДНК) и кДНК (комплементарная ДНК)), и РНК, а нуклеотид, который является базовым составным компонентом нуклеиновых кислот, включает нуклеотиды природного происхождения, а также их аналоги, в которых группировки сахара или основания модифицированы. Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая вариабельные области тяжелой и легкой цепи по настоящему изобретению, может варьировать. Такое варьирование включает присоединение, делецию или неконсервативную, или консервативную замену нуклеотидов.

[118] В конкретном воплощении согласно настоящему изобретению данная нуклеиновая кислота может включать следующую последовательность:

[119] последовательность, кодирующая вариабельную область тяжелой цепи с последовательностью SEQ ID NO: 37, и последовательность, кодирующая вариабельную область легкой цепи с последовательностью SEQ ID NO: 38;

[120] последовательность, кодирующая вариабельную область тяжелой цепи с последовательностью SEQ ID NO: 39, и последовательность, кодирующая вариабельную область легкой цепи с последовательностью SEQ ID NO: 38;

[121] последовательность, кодирующая вариабельную область тяжелой цепи с последовательностью SEQ ID NO: 40, и последовательность, кодирующая вариабельную область легкой цепи с последовательностью SEQ ID NO: 41;

[122] последовательность, кодирующая вариабельную область тяжелой цепи с последовательностью SEQ ID NO: 42, и последовательность, кодирующая вариабельную область легкой цепи с последовательностью SEQ ID NO: 38;

[123] последовательность, кодирующая вариабельную область тяжелой цепи с последовательностью SEQ ID NO: 37, и последовательность, кодирующая вариабельную область легкой цепи с последовательностью SEQ ID NO: 41;

[124] последовательность, кодирующая вариабельную область тяжелой цепи с последовательностью SEQ ID NO: 39, и последовательность, кодирующая вариабельную область легкой цепи с последовательностью SEQ ID NO: 41; или

[125] последовательность, кодирующая вариабельную область тяжелой цепи с последовательностью SEQ ID NO: 42, и последовательность, кодирующая вариабельную область легкой цепи с последовательностью SEQ ID NO: 41.

[126] ДНК, кодирующую данное антитело, можно легко отделять или синтезировать с использованием традиционных методик (например, с использованием олигонуклеотидного зонда, способного к специфичному связыванию с ДНК, кодирующей тяжелую и легкую цепи данного антитела). Можно получать целый ряд векторов. Компоненты вектора обычно включают, но не ограничиваются одним или более чем одним из следующих компонентов: сигнальные последовательности, репликаторы, один или более чем один маркерный ген, энхансерные элементы, промоторы и последовательности терминации транскрипции.

[127] Термин «вектор» в том виде, как он здесь используется, относится к средствам осуществления экспрессии генов-мишеней в клетках-хозяевах и включает плазмидные векторы, космидные векторы и вирусные векторы, такие как бактериофаговые векторы, аденовирусные векторы, ретровирусные векторы и векторы на основе аденосателлитных вирусов. Нуклеиновая кислота, кодирующая антитело в векторе, связана функциональным образом с промотором.

[128] Термин «связан функциональным образом» означает функциональную связь между последовательностью регуляции экспрессии нуклеиновой кислоты (например, группа из сайта связывания промотора, сигнальной последовательности или регулятора транскрипции) и другой последовательности нуклеиновой кислоты, и она обеспечивает то, что данная регуляторная последовательность регулирует транскрипцию и/или трансляцию другой последовательности нуклеиновой кислоты.

[129] При использовании в качестве хозяина прокариотической клетки она обычно включает мощный промотор, способный осуществлять транскрипцию (такой как промотор tac, промотор lac, промотор lacUV5, промотор lpp, промотор pLλ, промотор pRλ, промотор rac5, промотор amp, промотор recA, промотор SP6, промотор trp или промотор Т7), сайт связывания рибосомы для инициации трансляции и последовательность терминации транскрипции/трансляции. Кроме того, например, при использовании эукариотической клетки в качестве хозяина, она включает промотор, происходящий из генома клетки млекопитающего (например, промотор металлотионеина, промотор β-актина, промотор человеческого гемоглобина или промотор человеческого мышечного креатинина), или промотор, происходящий от вируса млекопитающего (например, поздний промотор аденовируса, промотор 7.5K вируса осповакцины, промотор SV40, промотор цитомегаловируса (CMV), промотор tk HSV (вирус простого герпеса), промотор вируса опухоли молочной железы мышей (MMTV), промотор LTR ВИЧ (вирус иммунодефицита человека), промотор вируса Молони, промотор вируса Эпштейна-Барр (EBV) или промотор вируса саркомы Рауса (RSV)) и обычно имеет последовательность полиаденилирования в качестве последовательности терминации транскрипции.

[130] Возможно данный вектор можно сливать с другой последовательностью для того, чтобы облегчать очистку экспрессируемого посредством его антитела. Последоваельность, подлежащая слиянию с ним, может включать, например, последовательность глутатион-S-трансферазы (Pharmacia, США), мальтозосвязывающего белка (NEB, США), FLAG (IBI, США), 6× His (гексагистидин; Qiagen, США) и тому подобные.

[131] Данный вектор включает гены устойчивости к антибиотику, обычно используемые в данной области в качестве селектируемых маркеров, и их примеры включают гены, придающие устойчивость к ампициллину, гентамицину, карбенициллину, хлорамфениколу, стрептомицину, канамицину, генетицину, неомицину и тетрациклину.

[132] В другом аспекте настоящее изобретение направлено на клетку, трансформированную вышеупомянутым вектором. Клетка, используемая для продукции антитела по настоящему изобретению, может представлять собой прокариота, дрожжей или клетку высшего эукариота, но не ограничиваясь ими.

[133] Можно использовать прокариотические клетки-хозяева, такие как Escherichia coli, штаммы рода Bacillus, такие как Bacillus subtilis и Bacillus thuringiensis, виды рода Streptomyces, виды рода Pseudomonas (например, Pseudomonas putida), Proteus mirabilis и виды рода Staphylococcus (например, Staphylococcus carnosus).

[134] Наибольшим является интерес к клеткам животных, и примеры полезных линий клеток-хозяев включают COS-7, ВНК, СНО, СНОК1, DXB-11, DG-44, CHO/-DHFR, CV1, COS-7, НЕК293, ВНК, ТМ4, VERO, HELA, MDCK, BRL 3А, W138, Hep G2, SK-Hep, ММТ, TRI, MRC 5, FS4, 3Т3, RIN, А549, РС12, К562, PER.C6, SP2/0, NS-0, U20S и НТ1080, но не ограничиваются ими.

[135] В другом аспекте настоящее изобретение направлено на способ получения модифицированного антитела или его фрагмента, в котором по меньшей мере одна аминокислота в положении 12 или 35 вариабельной области тяжелой цепи (на основе системы нумерации АНО) и/или аминокислота в положении 76 вариабельной области легкой цепи (на основе системы нумерации АНО) заменена серином (S) или треонином (Т).

[136] Нуклеиновая кислота, кодирующая модифицированное антитело или его фрагмент, может быть введена в клетки. Данные клетки могут культивироваться в разных средах. В качестве культуральной среды можно использовать любую имеющуюся в продаже среду без ограничения. В подходящих концентрациях могут быть включены все другие важные добавки, хорошо известные специалистам в данной области. Культуральными условиями, такими как температура и рН, являются условия, которые традиционно используются с клетками-хозяевами, выбранными для экспрессии, как будет очевидно специалистам в данной области.

[137] Выделение антитела или его фрагмента можно проводить, например, центрифугированием или ультрафильтрацией для удаления примесей из и очистки образующегося продукта с использованием, например, аффинной хроматографии. Можно использовать другие дополнительные методики очистки, такие как анионо- или катионообменная хроматография, хроматография на основе гидрофобных взаимодействий и хроматография на гидроксиапатите (НА).

[138] В другом аспекте настоящее изобретение направлено на композицию для предупреждения или лечения опухолей, содержащих антитело или его фрагмент в качестве активного ингредиента. Данное антитело может представлять собой IgG или фрагмент, включающий вариабельную область, то есть, scFv или Fab. Кроме того, вариабельная область тяжелой цепи может происходить из IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4.

[139] В другом аспекте настоящее изобретение направлено на фармацевтическую композицию для предупреждения или лечения глазных заболеваний, включающую (а) фармацевтически эффективное количество антитела или его фрагмента согласно настоящему изобретению и (б) фармацевтически приемлемый носитель. В другом аспекте настоящее изобретение направлено на способ предупреждения или лечения глазных заболеваний, включающий введение антитела или его фрагмента согласно настоящему изобретению пациенту с глазным заболеванием. Кроме того, настоящее изобретение направлено на применение антитела или его антигенсвязывающего фрагмента для ингибирования механизма Ang2 и его применение для предупреждения или лечения глазных заболеваний на его основе.

[140] Относительно глазных заболеваний, роговица представляет собой бессосудистую ткань и всегда должна поддерживать прозрачность для сохранения зрения. Однако также известно то, что в глазу происходит ангиогенез, который вызывает связанные с ангиогенезом глазные заболевния. Другими словами, неоваскуляризация в роговице ухудшает прозрачность глазного яблока, приводя к потере зрения, и неоваскуляризация в сетчатке индуцирует образование ненормальных кровеносных сосудов и экссудацию крови, вызывая слепоту посредством дегенерации клеток сетчатки.

[141] На основе этого настоящее изобретение можно использовать для предупреждения или лечения глазных заболеваний, таких как ретинопатия недоношенных, неоваскуляризация роговицы, диабетическая ретинопатия, хороидальная неоваскуляризация, макулодистрофия (например, возрастная макулодистрофия) и тому подобных.

[142] В другом аспекте настоящее изобретение направлено на фармацевтическую композицию для предупреждения или лечения опухолей, включающую (а) фармацевтически эффективное количество антитела или его фрагмента по настоящему изобретению и (б) фармацевтически приемлемый носитель. В другом аспекте настоящее изобретение направлено на способ предупреждения или лечения опухолей, включающий введение антитела или его фрагмента согласно настоящему изобретению пациенту с опухолью. Кроме того, настоящее изобретение направлено на применение антитела или его антигенсвязывающего фрагмента для ингибирования механизма Ang2 и его применение для предупреждения или лечения опухолей на его основе.

[143] Опухоли, которые представляют собой заболевания, при которых может применяться данная композиция, включают типичные опухоли или раковые заболевания, которые сверхэкспрессируют Ang2, а также опухоли или раковые заболевания, которые не экспрессируют Ang2. Неограничивающие примеры опухолей или раковых заболеваний, которые являются мишенями лечения, включают меланому (например, метастатическую злокачественную меланому), рак почки (например, светлоклеточный рак), рак простаты (например, не поддающаяся лечению гормонами аденокарцинома простаты), аденокарциному поджелудочной железы, рак молочной железы (в некоторых случаях тройной негативный рак молочной железы), рак толстой кишки, рак легкого (например, немелкоклеточный рак легкого), рак пищевода, плоскоклеточную карциному головы и шеи, рак печени, рак яичника, рак шейки матки, рак щитовидной железы, глиобластому, глиому, лейкоз, лимфому и другие неопластические карциномы. Кроме того, опухоли или раковые заболевания согласно настоящему изобретению включают трудно поддающиеся лечению или рецидивирующие раковые заболевания, которые можно лечить с использованием антитела по настоящему изобретению.

[144] В другом аспекте настоящее изобретение направлено на композицию для ингибирования ангиогенеза, включающую антитело или его фрагмент в качестве активного ингредиента. В другом аспекте настоящее изобретение направлено на фармацевтическую композицию для предупреждения и/или лечения заболеваний, ассоциированных с активацией и/или сверхпродукцией Ang2, включающую антитело или его фрагмент в качестве активного ингредиента.

[145] Согласно настоящему изобретению, например, предложен способ ингибирования ангиогенеза, включающий введение терапевтически эффективного количества антитела или его фрагмента пациенту, нуждающемуся в этом. Данный способ ингибирования ангиогенеза может дополнительно включать осуществление идентификации пациента, нуждающегося в ингибировании ангиогенеза перед введением. В другом аспекте настоящее изобретение направлено на способ предупреждения и/или лечения заболеваний, ассоциированных с активацией и/или сверхпродукцией Ang2, включающий введение терапевтически эффективного количества антитела или его фрагмента пациенту, нуждающемуся в этом. Способ предупреждения и/или лечения заболеваний, ассоциированных с активацией и/или сверхпродукцией Ang2, может дополнительно включать осуществление идентификации пациента, нуждающегося в предупреждении и/или лечении заболеваний, ассоциированных с активацией и/или сверхпродукцией Ang2 перед введением.

[146] Данная фармацевтическая композиция может дополнительно включать фармацевтически приемлемый носитель и может включать, без ограничения, по меньшей мере один, выбранный из лактозы, декстрозы, сахарозы, сорбита, маннита, крахмала, аравийской камеди, фосфата кальция, альгината, желатина, силиката кальция, микрокристаллической целлюлозы, поливинилпирролидона, целлюлозы, воды, сиропа, метилцеллюлозы, метилгидроксибензоата, пропилгидроксибензоата, талька, стеарата магния, минерального масла и тому подобных, которые обычно используются для приготовления лекарственных средств. Данная фармацевтическая композиция может дополнительно включать по меньшей мере один, выбранный из группы, состоящей из разбавителя, эксципиента, смазки, увлажнителя, подсластителя, корригента, эмульгатора, суспендирующего агента и консерванта, которые обычно используют при приготовлении фармацевтических композиций.

[147] Данная фармацевтическая композиция или антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент может вводиться в эффективном количестве перорально или парентерально. Парентеральное введение включает внутривенную инъекцию, подкожную инъекцию, внутримышечную инъекцию, внутрибрюшинную инъекцию, внутрикожное введение, местное введение, введение в нос, внутрилегочное введение, интраректальное введение или тому подобное. При пероральном введении, поскольку белки или пептиды расщепляются, пероральная композиция должна быть покрыта активным лекарственным средством или приготовлена таким образом, чтобы защищать ее от деградации в желудке. Кроме того, данную фармацевтическую композицию можно вводить с использованием любого устройства, способного доставлять активное вещество в клетки-мишени.

[148] Содержание или доза антитела или его фрагмента в фармацевтической композиции может варьировать, в зависимости от таких факторов, как способ приготовления, способ введения и возраст, масса тела, пол, патологические состояния, диета, время введения, интервал введения, путь введения, скорость экскреции и восприимчивость пациента. Например, ежесуточная доза антитела или его фрагмента может находиться в пределах интервала от 0,001 до 1000 мг/кг, в частности, от 0,01 до 100 мг/кг и, более конкретно, от 0,1 до 50 мг/кг, даже более конкретно от 0,1 до 20 мг/кг, но настоящее изобретение не ограничивается ими. Ежесуточная доза может быть получена приготовлением в единичную лекарственную форму с единичной дозой, приготовлением в подходящую дозу или упаковкой в многодозовый контейнер.

[149] Данную фармацевтическую композицию можно вводить в комбинации с другими лекарственными средствами, такими как другие ингибиторы ангиогенеза или терапевтические средства против заболеваний, ассоциированных с антивацией и/или сверхпродукцией Ang, и дозировка, способ введения и тип других лекарственных средств подходящим образом выбирают согласно состоянию пациента.

[150] Данная фармацевтическая композиция может находиться в виде раствора, суспезии, сиропа или эмульсии в масляной или водной среде, или может быть приготовлена в виде экстракта, порошка, гранулы, таблетки или капсулы. Данная фармацевтическая композиция может дополнительно включать диспергент или стабилизатор.

[151] В частности, фармацевтическая композиция, содержащая антитело или его фрагмент, может быть приготовлена в иммунолипосому, так как она включает антитело и его антигенсвязывающий фрагмент. Липосома, содержащая антитело, может быть получена согласно способу, хорошо известному в данной области. Иммунолипосома представляет собой липидную композицию, содержащую фосфатидилхолин, холестерин и фосфатидилэтаноламин, дериватизированный полиэтиленгликолем, и может быть получена посредством обращенно-фазового выпаривания (Корейский патент №10-2015-0089329). Например, фрагмент Fab' антитела может быть конъюгирован с липосомой посредством реакции обмена дисульфида.

[152] Тем временем, антитело или его фрагмент специфично связывается с Ang2 и, таким образом, может использоваться для определения того, активируется ли и/или сверхпродуцируется ли Ang2. Таким образом, в другом аспекте настоящее изобретение направлено на фармацевтическую композицию для осуществления диагностики активации и/или сверхпродукции Ang2, и/или заболевания, ассоциированного с активацией и/или сверхпродукцией Ang2, включающую антитело или его антигенсвязыващий фрагмент. В другом аспекте настоящее изобретение направлено на диагностический способ или предоставление информации для постановки диагноза, включающий обработку биологического образца, полученного от пациента, антителом или его фрагментом, осуществление идентификации реакции антиген-антитело и определение того, что данный пациент имеет симптом активации и/или сверхпродукции Ang2 или заболевание, ассоциированное с активацией и/или сверхпродукцией Ang2, когда выявляется реакция антиген-антитело. Данный биологический образец может быть выбран из группы, состоящей из клеток, тканей и жидкостей организма, полученных от пациента.

[153] Осуществление идентификации того, происходит ли или нет реакция антиген-антитело, можно проводить посредством разных способов, известных в данной области, например, выявлением традиционной ферментативной реакции, флуоресценции, люминисценции и/или излучения, в частности, способом, выбранным из группы, состоящей из иммунохроматографии, иммуногистохимии, твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA), радиоиммуноанализа (RIA), иммуноферментного анализа (EIA), флуоресцентного иммуноанализа (FIA), люминисцентного иммуноанализа (LIA), вестерн-блоттинга и тому подобных, но настоящее изобретение не ограничивается ими.

[154] Пациент, которому вводили данную фармацевтическую композицию, или диагностированный пациент может представлять собой млекопитающее, включая примата, включающего человека, обезьяну или тому подобных, или грызуна, включающего мышь, крысу или тому подобных.

[155] Заболевания, ассоциированные с активацией и/или сверхпродукцией Ang2, включают следующие: рак; метастаз рака; глазные заболевания, такие как ретинопатия недоношенных, неоваскуляризация роговицы, диабетическая ретинопатия, хороидальная неоваскуляризация и макулодистрофия (например, возрастная макулодистрофия); астма; ревматоидный артрит; псориаз; воспалительные заболевания, такие как пневмония и хроническое воспаление; и сердечно-сосудистые заболевания, такие как гипертензия или артериосклероз, или сепсис. При раковом заболевании может сверхэкспрессироваться Ang2, и оно может представлять собой солидный рак или гематологический рак, но не ограничивается им, и может включать по меньшей мере одно, выбранное из группы, состоящей из плоскоклеточной карциномы, мелкоклеточного рака легкого, немелкоклеточного рака легкого, аденокарциномы легкого, плоскоклеточной карциномы легкого, перитонеального рака, рака кожи, меланомы кожи или внутриглазной меланомы, рака прямой кишки, перианального рака, рака пищевода, рака тонкого кишечника, рака эндокринной железы, рака паращитовидной железы, рака надпочечнка, саркомы мягкой ткани, рака уретры, хронического или острого лейкоза, лимфоцитарной лимфомы, печеночно-клеточной карциномы, желудочно-кишечного рака, рака поджелудочной железы, глиобластомы, рака шейки матки, рака яичника, рака печени, рака мочевого пузыря, опухоли печени, рака молочной железы (в некоторых случаях, тройного негативного рака молочной железы), рака толстой кишки, колоректального рака, рака эндометрия или матки, рака слюнной железы, рака почки, рака печени, рака предстательной железы, рака вульвы, рака щитовидной железы, рака печени, рака головы и шеи, рака мозга, остеосаркомы и тому подобных. Данное раковое заболевание может представлять собой первичный рак или метастатический рак.

[156]

[157] Пример

[158] Ниже настоящее изобретение будет более подробно описано со ссылкой на примеры. Однако специалистам в данной области будет очевидно, что данные примеры приводятся только для иллюстрации настоящего изобретения, и их не следует истолковывать как ограничивающие объем настоящего изобретения.

[159]

[160] Ожидается то, что применение больших количеств антител против Ang2 посредством инъекции в глазные заболевания дает лучшие эффекты. Поскольку подходящий объем для инъекции в глаза был ограничен, требовался стабильный препарат при условиях более высокой концентрации, чем традиционные вещества. Для того, чтобы получить более высококонцентрированный препарат, чем традиционное антитело против Ang2, препарат с высокой концентрацией был успешно приготовлен с использованием анализа горячих точек на основе структуры антитела и буфера для приготовления.

[161]

[162] Пример 1. Получение вариантов для улучшеия физических свойств

[163]

[164] Предпринимали попытки для улучшения физических свойств клона O4 антитела против Ang2 (включающего вариабельную область тяжелой цепи с последовательностью SEQ ID NO: 34 и вариабельную область легкой цепи с последовательностью SEQ ID NO: 32).

[165]

[167] Аминокислоты, которые вероятно вызывают агрегацию антитела против Ang2, анализировали с использованием программы Discovery Studio (BIOBIA). Аминокислоты Leu 11, Val 12, Asn 35, Val 93 в VH и Gln 61, и Asn 76 в VL анализировали в качестве горячих точек, которые влияют на физические свойства (ФИГ. 1, Таблица 2). Аминокислоты, проанализированные в качестве горячих точек, мутировали, экспрессировали в вариантах с улучшенными физическими свойствами и отбирали.

[168]

[170]

[171] Пример 2. Получение вариантов для улучшения физических свойств

[172]

[173] Для того чтобы улучшать физические свойства антитела против Ang2 (O4), заменяли аминокислоты, выбранные посредством анализа горячих точек. Проводили анализ экспрессии конструкции с измененными аминокислотами. Клоны с точечными мутациями в гене антитела против Ang2 (O4) амплифицировали с использованием ПЦР (полимеразная цепная реакция). Клонирование завершали посредством вставки амплифицированного гена в экспрессионный вектор (Merck Millipore, рЕТ 22b(+)). Трансформацию осуществляли посредством вставки клонированной плазмиды в клетку-хозяина экспрессии (Merck Millipore, BL21(DE3)). Для анализа экспрессии 100 мкг/мл ампициллина добавляли в среду 2XYT, и трансформированные клетки инокулировали и культивировали при 37°С в течение 8 часов. После снижения температуры до 25°С добавляли 0,5 мМ IPTG (изопропилтиогалактозид) для индукции экспрессии, и проводили инкубацию в течение 18 часов. Клетки отбирали после центрифугирования при 8000 об./мин в течение 10 минут. Осажденные клетки суспендировали в 50 мМ Tris, 150 мМ NaCl буфере с рН 7,4 и разрушали посредством обработки ультразвуком. Разрушенные клетки отделяли от супернатанта посредством центрифугирования при 1300 об./мин в течение 1 часа, и экспрессию выявляли посредством SDS-PAGE (ФИГ. 2, 3 и 4).

[174]

[175] Пример 3. Получение scFv оптимизированного антитела против Ang2

[176]

[177] Антитело против Ang2 с улучшенными физическими свойствами клонировали в вектор pET-22b (Novagen) для того, чтобы экспрессировать данное антитело в Е. coli. Отбирали колонии, генерированные трансформацией в BL21 (DE3), и 1% Е. coli, предварительно культивированной при 37°С при 200 об./мин в среде LB, содержащей 100 мкг/мл ампициллина, инокулировали в среду LB (лизогенный бульон), содержащую 100 мкг/мл ампициллина. Данные колонии культивировали при 37°С и 200 об./мин, температуру инкубатора снижали до 20°С при достижении ОП₆₀₀ (оптическая плотность при длине волны 600 нм) от 0,6 до 0,8, и добавляли в него 0,5 мМ IPTG с последующим культивированием в течение 16 часов.

[178] Культивируемую Е. coli отбирали посредством центрифугирования при 8000 об./мин в течение 10 минут. После удаления данной среды клетки ресуспендировали с использованием 10 мл лизирующего буфера (50 мМ Tris-HCl, рН 7,4, 150 мМ NaCl, 1 мМ PMSF (фенилметилсульфонилфторид) на г массы клеток. Данные клетки разрушали с использованием соникатора при следующих условиях (мощность: 20 Вт, покой: 3 с, работа: 3 с, время: 10 мин). Разрушенные клетки центрифугировали при 13000 об./мин в течение 1 часа для отделения супернатанта и осаждения друг от друга.

[179] scFv экспрессировали в нерастворимой форме и подвергали промывки осадка для осуществления повторного сворачивания. После гомогенизации гомогенизатором с использованием буфера на основе 50 мМ Tris-HCl, рН 7,4, и 150 мМ NaCl осадок дважды промывали центрифугированием при 13000 об./мин в течение 1 часа. Вещества, полученные от Е coli, остающиеся в осадке, удаляли с использованием буфера, содержащего 50 мМ Tris-HCl, рН 7,4, 150 мМ NaCl, 2 М мочевины и 0,5% Triton Х-100, и повторно промывали три раза буфером с рН 7,4, содержащим 50 мМ Tris-HCl и 150 мМ NaCl. После ресуспендирования телец включения буфером, содержащим 50 мМ Tris-HCl, рН 7,4, 150 мМ NaCl, 8 М мочевину и 10 мМ DTT (дитиотрейтол), проводили реакцию в течение примерно 30 минут с получением несвернутого scFv и центрифугировали при 13000 об./мин в течение 1 часа для отделения супернатанта от осадка.

[180] Антитело scFv повторно сворачивали удалением мочевины посредством ступенчатого диализа. Буфер для диализа получали снижением концентрации мочевины 1/2 на основе 50 мМ Tris-HCl, рН 7,4, и 150 мМ NaCl. В интервале концентрации мочевины 4-2-1 М, где образуется большинство структур, добавляли 0,1 М L-аргинин и 10% глицерин для ингибирования агрегации и осуществления, посредством этого, повторного сворачивания. Повторно свернутое антитело scFv отделяли и очищали с использованием колонок HisTrap и Capo L.

[181] Отделение и очистку проводили в следующем способе. Очистку проводили с использованием системы очистки АКТА (GE Heaithcare), и использовали 5 мл набивочную колонку HisTrap. После уравновешивания буфером с рН 7,4, содержащим 50 мМ Tris, 500 мМ NaCl и 10 мМ имидазол, в объеме колонки, соответствующем 10-кратному объему колонки HisTrap, образцу антитела scFv давали протекать через колонку HisTrap со скоростью тока 3 мл/мин для связывания со смолой в данной колонке. Для того чтобы удалить вещества неспецифичного связывания, присутствующие в данной смоле, давали протекать буферу с рН 7,4, содержащему 50 мМ Tris, 150 мМ NaCl и 400 мМ имидазол, в количестве, соответствующем примерно 10-кратному объему колонки, и затем давали протекать буферу с рН 7,4, содержащему 50 мМ Tris, 150 мМ NaCl и 400 мМ имидазол, в концентрационном градиенте для элюции антитела scFv. Образец элюированного антитела очищали с использованием 5 мл колонки Capto L следующим образом. После уравновешивания колонки Capto L буфером с рН 7,4, содержащим 50 мМ Tris и 150 мМ NaCl, данному образцу давали протекать через колонку Capto L со скоростью тока 3 мл/мин и связываться со смолой в данной колонке. Буферу PBS (фосфатно-солевой буферный раствор) давали проходить через данную колонку в количестве, примерно в 10 раз превышающем объем колонки, для удаления неспецифично связанных веществ. Неспецифично связанные вещества, которые не могли быть удалены буфером PBS, удаляли пропусканием 10 CV (объем колонки) буфера с рН 5,5, содержащего 50 мМ MES (морфолиноэтансульфоновая кислота), 400 мМ NaCl и 0,2% Tween 20. Давали протекать через колонку буферу с рН 2,5, содержащему 0,1 М глицин и 50 мМ NaCl, в количестве примерно 10-кратного объема колонки для элюции антитела scFv. рН элюированного образца нейтрализовали 1 М Tris буфером с рН 7,4. На ФИГ. 5A-5G показаны результаты SDS-PAGE (электрофорез в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия) на белке, полученном после конечной очистки. В результате, получали высокочистое антитело ScFv.

[182] Специфическая последовательность антитела против Ang2 с улучшенными физическими свойствами является следующей.

[183]

[185]

[186]

[187] Пример 4. Концентрация scFv оптимизированного антитела против Ang2

[188]

[189] Для того, чтобы проанализировать наивысшую концентрацию, которая не вызывает агрегации, осуществляли концентрирование с использованием центрифугирования. Очищенное антитело против Ang2 диализировали с использованием PBS и буфера для приготовления (10 мМ фосфат натрия, 40 мМ NaCl, 0,03% полисорбат, 5% сахарозы, рН 6,2), содержащего композицию для приготовления, используемую в имеющихся в продаже продуктах, для осуществления замены буфера. 10 мл PBS или буфера для приготовления добавляли в пробирку с MWCO (порог отсечения молекулярной массы) 5000 в отношении PEG (полиэтиленгликоль) Viva Spin Turbo (Sartorius) и центрифугировали при 3400 g в течение 10 минут для уравновешивания, и 10 мл образца с заменой буфера инъецировали в пробирку и концентрировали центрифугированием при 3400 g и при 4°С в течение 10 минут. Поглощение измеряли NamoDrop (Thermo) для измерения концентрации (Таблица 4).

[190]

[192]

[193] Пример 5. Анализ специфичности связывания оптимизированного антитела scFv против Ang2

[194]

[195] Для анализа специфичности связывания измеряли константы связывания с использованием системы Octet (Pall Fortebio LLC. US).

[196] Способность к связыванию очищенного антитела scFv с человеческим Ang2 и мышиным Ang2 измеряли с использованием системы Octet (Fortebio inc. US). Биосенсор AR2G гидратировали в течение 20 минут. Биосенсор AR2G активировали с использованием раствора 5% s-NHS и 5% EDC в 90% трижды дистиллированной воды. Антитело против Ang2 иммобилизовали на сенсоре AR2G при концентрации 1 мкг/мл. Данное антитело гасили 1 М этаноламином. Данное антитело уравновешивали PBS, и измеряли кинетику ассоциации при концентрациях 50, 40, 30 и 20 нМ человеческого Ang2 для расчета константы скорости ассоциации (k_a), константы скорости диссоциации (k_dis) и константы ассоциации (K_D) (Таблица 5).

[197]

[199]

[200] Пример 6: анализ термостабильности антитела scFv против Ang2 [201]

[201]

[202] Для анализа термостабильности антитела scFv против Ang2, измеряли Tm с использованием ПЦР-ОТ (полимеразная цепная реакция, сопряженная с обратной транскрипцией). Образец для анализа готовили так, чтобы он имел следующий состав: 5 мкл буфера для термосдвига белка (Thermo Fisher), 12,5 мкл антитела scFv против Ang2 (1 мг/мл в буфере PBS, рН 7,4) и 2,5 мкл 8× красителя для термосдвига белка и для обеспечения двух повторов данного эксперимента. Анализ Tm проводили увеличением температуры от 25°С до 99°С при скорости 1,6°С/с с использованием способа эксперимента по кривой плавления в термоциклере QuantStudio 5 (Thermo Fisher), измеряя интенсивность флуоресценции (поглощение (580 плюс/минус 10 нм) - поглощение b (623 плюс/минус 14 нм) и рассчитывая значения Tm с использованием программы анализа термосдвига белка (Thermo Fisher). Значение Tm В антитела scFv против Ang2, рассчитанное согласно уравнению Больцмана, составляло 77,31°С, что представляет собой увеличение больше, чем на 7°С по сравнению со значением до технической модификации, указывая на то, что термостабильность значительно улучшалась из-за технической модификации (ФИГ. 6).

[203]

[204] Пример 7: оценка антиангиогенной эффективности антитела scFv против Ang2 с использованием мышиной модели CNV

[205]

[206] Для того, чтобы определить имеет ли или нет антитело scFv против Ang2 ингибирующее влияние на ангиогенез, проводили анализ эффективности лекарственного средства в мышиной модели индуцированной лазером хороидальной неоваскуляризации. Данную эффективность анализировали с использованием имеющегося в продаже лекарственного средства - афлиберцепта - в качестве контроля. После общей анестезии мышей с использованием кетамина, на глаза наносили анестетические глазные капли для дополнительной местной анестезии, и далее добавляли в глаза мидриатическое средство для индукции расширения зрачка. Мышь клали на стол для экспериментов, и индуцировали ожог лазером с использованием Micron-IV при условиях индукции CNV (хороидальная неоваскуляризация) (длина волны 532 нм, диаметр 50 мкм, продолжительность 80 мс, уровень мощности 200 мВт) для разрушения оболочки Бруха. Поражения, в которых не наблюдали образования пузырьков во время процесса индукции ожога лазером, классифицировали как неуспешные ожоги лазером и исключали из анализа и способа статистической обработки на основе критериев исключения, модифицированных из критериев, предложенных Gong Y. et al.

[207]

[208] Для того, чтобы определять влияние ингибирования ангиогенеза посредством индукции CNV и лекарственного средства, мышей анестезировали кетамином в сутки 10 после индукции CNV, и внутрибрюшинно инъецировали мышам флуоресцентный контрастный агент. Добавляли по каплям в глаза анестетические глазные капли для индукции дополнительной местной анестезии, и далее добавляли на них мидриатическое средство для индукции расширения зрачка. Мышь клали на стол для экспериментов, использовали камеру для визуализации Micron-IV для фокусировки на глазном дне, наносили на глазное яблоко смазывающий гель, и приводили в контакт с роговицей линзы ОСТ (оптическая когерентная томография). После визуализации FFA (флуоресцентная ангиография глазного дна)/ОСТ в глаз мыши добавляли каплю глазного раствора антибиотика. Анализ изображений FFA и ОСТ проводили с использованием программы «Image-J».

[209]

[210] Анализ электроретинограммы (ERG) проводили для определения 5 эффекта восстановления оптического нерва. Мышь адаптировали к темоте в темной комнате за 12 часов до оценки ERG (электроретинография). В сутки оценки (через 11 суток после индукции CNV), после общей анестезии с использованием Rumpun^® и Ketamine^®, в глаз добавляли Alkyne^® для индукции дополнительной местной анестезии, и в него далее добавляли мидриатическое средство для индукции расширения зрачка. Мышь размещали на столе для экспериментов по ERG, и зонды ERG приводили в контакт с хвостом, головой и роговицей соответственно. ERG измеряли как изменение электроретинограммы для стимула в виде одиночной вспышки (0,9 log кд./м² (10 ответов/интенсивность)). При завершении оценки EGR в глаз мыши добавляли каплю тобрекса. Анализ ERG проводили с использованием программы «LabScribeERG (iWorx DataAcquisition Software)».

[211]

[212] Афлиберцепт разводили в дозе 20 мкг/мл/глаз в стерильном PBS, и данное разведение вводили один раз посредством IVT (интравитреальная инъекция) к антителу scFv против Ang2 в дозах 5 мкг/мкл/глаз, 10 мкг/мкл/глаз и 20 мкг/мкл/глаз в сутки после индукции CNV. На 10-е сутки после индукции CNV осуществляли оценку изображения сетчатки с использованием FFA (флуоресцентная ангиография глазного дна) и ОСТ (оптическая когерентная томография), и на их основе измеряли размеры и площади поперечного сечения поражений CNV, с последующим сравнением и оценкой. Кроме того, обобщали изменения электроретинограммы для стимуляции моновспышкой (0,9 log кд./м²) в скотопической ERG (электроретинограмма) на 11-е сутки после индукции CNV в виде амплитуды от А-волны до В-волны, с последующим сравнением и оценкой. В результате, в показателях размера поражений CNV, измеренных на FFA, размеры поражения в группе с введением афлиберцепта (Р меньше 0,07) и в группе с введением антитела scFv против Ang2 в дозе 10 мкг/мкл/глаз и 20 мкг/мкл/глаз были статистически значимо меньшими, чем поражения в группе с введением носителя (Р меньше 0,05 для каждого) (ФИГ. 7А). Кроме того, результаты измерения объема поражений CNV, измеренных на ОСТ, продемонстрировали то, что объемы поражений CNV в группах с введением 10 мкг/мкл/глаз и 20 мкг/мкл/глаз антитела scFv против Ang2 были статистически значимо меньшими (Р меньше 0,07 и Р меньше 0,007 соответственно) (ФИГ. 7В). При сравнении электроретинограммы на ERG с группой с введением носителя и группа с введением афлиберцепта, и группа с введением антитела scFv против Ang2 (G3, G4 и G5) демонстрировали значимо повышенную электроретинограмму по сравнению с контрольной группой CNV, группой G1 (Р меньше 0,0007, Р меньше 0,0007, Р меньше 0,0007 и Р меньше 0,07 соответственно) (ФИГ. 7С).

[213] Промышленная применимость

[214] Антитело или его фрагмент согласно настоящему изобретению включает мутации в каркасной области, улучшающие, посредством этого, растворимость, обеспечивая высокий уровень концентрации и, таким образом, улучшая продуктивность антитела.

[215]

[216]

[217] Несмотря на то, что специфические конфигурации настоящего изобретения были подробно описаны, специалистам в данной области будет понятно то, что данное подробное описание приводится в качестве предпочтительных воплощений и не должно истолковываться как ограничивающее объем настоящего изобретения. Следовательно, существенный объем настоящего изобретения определяется сопровождающей зарегистрированной формулой изобретения и ее эквивалентами.

[218]

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> PHARMABCINE INC.

<120> МОДИФИЦИРОВАННОЕ АНТИТЕЛО И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ

<130> 4240-666

<150> PCT/KR2021/010984

<151> 2021-08-19

<150> KR10-2020-0103945

<151> 2020-08-19

<160> 51

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 8

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 1

Gly Phe Ser Phe Asp Asp Tyr Ala

1 5

<210> 2

<211> 8

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 2

Ile Lys Asp Asp Gly Ser Gln Thr

1 5

<210> 3

<211> 13

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 3

Thr Thr Glu Gly Leu Met Asn Gly Leu His Phe Asp Met

1 5 10

<210> 4

<211> 9

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 4

Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly Tyr Asp

1 5

<210> 5

<400> 5

000

<210> 6

<211> 10

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 6

Gln Ser Tyr Asp Ser Arg Leu Gly Val Val

1 5 10

<210> 7

<211> 8

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 7

Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr Trp

1 5

<210> 8

<211> 8

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 8

Ile Tyr Pro Gly Asn Ser Asp Thr

1 5

<210> 9

<211> 13

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 9

Thr Thr Glu Gly Leu Met Asn Gly Leu His Phe Asp Met

1 5 10

<210> 10

<211> 11

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 10

Gln Ser Leu Leu His Ser Leu Gly Asp Asn Tyr

1 5 10

<210> 11

<400> 11

000

<210> 12

<211> 10

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 12

Met Gln Ser Leu Gln Thr Pro Pro Tyr Thr

1 5 10

<210> 13

<211> 8

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 13

Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ser

1 5

<210> 14

<211> 8

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 14

Ile Ser Ala Ser Asp Gly Ala Thr

1 5

<210> 15

<211> 16

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 15

Ala Lys Ile Leu Ala Gly Tyr Ser Gly Pro Met Gly Gly Met Asp Val

1 5 10 15

<210> 16

<211> 6

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 16

Arg Asp Ile Ser Asn Tyr

1 5

<210> 17

<400> 17

000

<210> 18

<211> 9

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 18

Gln Gln Tyr Tyr Ser Tyr Pro Leu Thr

1 5

<210> 19

<211> 8

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 19

Gly Phe Ala Phe Gly Arg Tyr Glu

1 5

<210> 20

<211> 8

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 20

Ile Asp Thr Gly Gly Gly Ala Lys

1 5

<210> 21

<211> 13

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 21

Thr Thr Glu Gly Leu Met Asn Gly Leu His Phe Asp Met

1 5 10

<210> 22

<211> 6

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 22

Gln Ala Ile Ser Thr Trp

1 5

<210> 23

<400> 23

000

<210> 24

<211> 9

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 24

Gln Gln Leu Asn Ser Tyr Pro Tyr Thr

1 5

<210> 25

<211> 8

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 25

Gly Phe Thr Phe Asp Asp Cys Ala

1 5

<210> 26

<211> 8

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 26

Ile Ser Gly Asn Ser Lys Asn Val

1 5

<210> 27

<211> 11

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 27

Ala Arg Asp Pro Ala Tyr Ser Gln Phe Asp Tyr

1 5 10

<210> 28

<211> 8

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 28

Ser Ser Asn Val Gly Gly Tyr Pro

1 5

<210> 29

<400> 29

000

<210> 30

<211> 11

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 30

Ala Thr Trp Asp Asp Asn Leu Asn Gly Tyr Val

1 5 10

<210> 31

<211> 123

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 31

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ser Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Ala Ser Asp Gly Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Arg Ser Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Thr Leu Ala Gly Tyr Ser Gly Pro Met Gly Gly Met Asp Val

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 32

<211> 108

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 32

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Arg Asp Ile Ser Asn Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile

35 40 45

Tyr Gly Ala Ser Asn Leu Gln Ser Gly Val Ser Ser Gln Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Ser Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ser Tyr Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys Arg

100 105

<210> 33

<211> 123

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 33

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ser Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Ala Ser Asp Gly Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Arg Ser Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Thr Leu Ala Gly Tyr Ser Gly Pro Met Gly Gly Met Asp Val

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 34

<211> 123

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 34

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Ala Ser Asp Gly Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Arg Ser Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Thr Leu Ala Gly Tyr Ser Gly Pro Met Gly Gly Met Asp Val

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 35

<211> 108

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 35

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Arg Asp Ile Ser Asn Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile

35 40 45

Tyr Gly Ala Ser Asn Leu Gln Ser Gly Val Ser Ser Gln Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Ser Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ser Tyr Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys Arg

100 105

<210> 36

<211> 123

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 36

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ser Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ser Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Ala Ser Asp Gly Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Arg Ser Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Thr Leu Ala Gly Tyr Ser Gly Pro Met Gly Gly Met Asp Val

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 37

<211> 369

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 37

caggtgcagc tggtagagtc tgggggaggc ctgtccaagc ctggggggtc cctgagactc

60

tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt agctatagca tgaactgggt ccgccaggct

120

ccagggaagg ggctggagtg ggtctcatcc attagtgcta gtgatggtgc cacatactac

180

gcagactccg tgaggggccg gttcaccatc tccagagaca attccaggag cacactgtat

240

ctgcaaatga acagtctgag agccgaggac acggccgtgt attactgtgc gaaaactctc

300

gcgggatata gtggcccaat gggtggcatg gacgtctggg gccaagggac cacggtcacc

360

gtctcctca

369

<210> 38

<211> 324

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 38

gacatccaga tgacccagtc tccatcctca ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc

60

atcacttgtc gggcgagtcg ggacattagc aactatttag cctggtatca gcagaaacca

120

gggaaagccc ctaagtccct gatctatgga gcatccaatt tacaaagtgg ggtctcatca

180

cagttcagcg gcagtggatc cgggacagat ttcaccctca ccatcaacag cctgcagcct

240

gaagattctg caacttatta ctgtcaacag tactatagtt acccgctcac ttttggcgga

300

gggaccaagg tggatatcaa acgt

324

<210> 39

<211> 369

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 39

caggtgcagc tggtagagtc tgggggaggc ctggtcaagc ctggggggtc cctgagactc

60

tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt agctatagca tgacctgggt ccgccaggct

120

ccagggaagg ggctggagtg ggtctcatcc attagtgcta gtgatggtgc cacatactac

180

gcagactccg tgaggggccg gttcaccatc tccagagaca attccaggag cacactgtat

240

ctgcaaatga acagtctgag agccgaggac acggccgtgt attactgtgc gaaaactctc

300

gcgggatata gtggcccaat gggtggcatg gacgtctggg gccaagggac cacggtcacc

360

gtctcctca

369

<210> 40

<211> 369

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 40

caggtgcagc tggtagagtc tgggggaggc ctggtcaagc ctggggggtc cctgagactc

60

tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt agctatagca tgaactgggt ccgccaggct

120

ccagggaagg ggctggagtg ggtctcatcc attagtgcta gtgatggtgc cacatactac

180

gcagactccg tgaggggccg gttcaccatc tccagagaca attccaggag cacactgtat

240

ctgcaaatga acagtctgag agccgaggac acggccgtgt attactgtgc gaaaactctc

300

gcgggatata gtggcccaat gggtggcatg gacgtctggg gccaagggac cacggtcacc

360

gtctcctca

369

<210> 41

<211> 324

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 41

gacatccaga tgacccagtc tccatcctca ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc

60

atcacttgtc gggcgagtcg ggacattagc aactatttag cctggtatca gcagaaacca

120

gggaaagccc ctaagtccct gatctatgga gcatccaatt tacaaagtgg ggtctcatca

180

cagttcagcg gcagtggatc cgggacagat ttcaccctca ccatcagcag cctgcagcct

240

gaagattctg caacttatta ctgtcaacag tactatagtt acccgctcac ttttggcgga

300

gggaccaagg tggatatcaa acgt

324

<210> 42

<211> 369

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 42

caggtgcagc tggtagagtc tgggggaggc ctgtccaagc ctggggggtc cctgagactc

60

tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt agctatagca tgacctgggt ccgccaggct

120

ccagggaagg ggctggagtg ggtctcatcc attagtgcta gtgatggtgc cacatactac

180

gcagactccg tgaggggccg gttcaccatc tccagagaca attccaggag cacactgtat

240

ctgcaaatga acagtctgag agccgaggac acggccgtgt attactgtgc gaaaactctc

300

gcgggatata gtggcccaat gggtggcatg gacgtctggg gccaagggac cacggtcacc

360

gtctcctca

369

<210> 43

<211> 16

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 43

Ala Lys Thr Leu Ala Gly Tyr Ser Gly Pro Met Gly Gly Met Asp Val

1 5 10 15

<210> 44

<211> 16

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 44

Ala Lys Ile Leu Val Gly Tyr Ser Gly Pro Met Gly Gly Met Asp Val

1 5 10 15

<210> 45

<211> 16

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 45

Ala Lys Ser Leu Ala Ser Tyr Ser Gly Pro Met Gly Gly Met Asp Val

1 5 10 15

<210> 46

<211> 123

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 46

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Thr Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Ala Ser Asp Gly Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Arg Ser Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Thr Leu Ala Gly Tyr Ser Gly Pro Met Gly Gly Met Asp Val

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 47

<211> 369

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 47

caggtgcagc tggtagagtc tgggggaggc acggtcaagc ctggggggtc cctgagactc

60

tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt agctatagca tgaactgggt ccgccaggct

120

ccagggaagg ggctggagtg ggtctcatcc attagtgcta gtgatggtgc cacatactac

180

gcagactccg tgaggggccg gttcaccatc tccagagaca attccaggag cacactgtat

240

ctgcaaatga acagtctgag agccgaggac acggccgtgt attactgtgc gaaaactctc

300

gcgggatata gtggcccaat gggtggcatg gacgtctggg gccaagggac cacggtcacc

360

gtctcctca

369

<210> 48

<211> 123

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 48

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Ala Ser Asp Gly Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Arg Ser Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Ser Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Thr Leu Ala Gly Tyr Ser Gly Pro Met Gly Gly Met Asp Val

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 49

<211> 369

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 49

caggtgcagc tggtagagtc tgggggaggc ctggtcaagc ctggggggtc cctgagactc

60

tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt agctatagca tgaactgggt ccgccaggct

120

ccagggaagg ggctggagtg ggtctcatcc attagtgcta gtgatggtgc cacatactac

180

gcagactccg tgaggggccg gttcaccatc tccagagaca attccaggag cacactgtat

240

ctgcaaatga acagtctgag agccgaggac acggcctcgt attactgtgc gaaaactctc

300

gcgggatata gtggcccaat gggtggcatg gacgtctggg gccaagggac cacggtcacc

360

gtctcctca

369

<210> 50

<211> 108

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 50

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Arg Asp Ile Ser Asn Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile

35 40 45

Tyr Gly Ala Ser Asn Leu Gln Ser Gly Val Ser Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Ser Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ser Tyr Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys Arg

100 105

<210> 51

<211> 324

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 51

gacatccaga tgacccagtc tccatcctca ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc

60

atcacttgtc gggcgagtcg ggacattagc aactatttag cctggtatca gcagaaacca

120

gggaaagccc ctaagtccct gatctatgga gcatccaatt tacaaagtgg ggtctcatca

180

cggttcagcg gcagtggatc cgggacagat ttcaccctca ccatcaacag cctgcagcct

240

gaagattctg caacttatta ctgtcaacag tactatagtt acccgctcac ttttggcgga

300

gggaccaagg tggatatcaa acgt

324

<---

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложены модифицированное антитело или его фрагмент, связывающиеся с ангиопоэтином-2, нуклеиновая кислота, кодирующая указанные антитело или его фрагмент, экспрессионный вектор и клетка, содержащие указанную нуклеиновую кислоту, способ получения антитела или его фрагмента. Улучшенное модифицированное антитело по изобретению, в котором заменены аминокислоты, расположенные в каркасной области, обладает повышенной растворимостью, что обеспечивает возможность его концентрирования до высокого уровня. 5 н. и 4 з.п. ф-лы, 15 ил., 5 табл., 7 пр.

1. Модифицированное антитело или его фрагмент, связывающиеся с ангиопоэтином-2 (Ang2), содержащие вариабельную область тяжелой цепи, имеющую последовательность SEQ ID NO: 34, и вариабельную область легкой цепи, имеющую последовательность SEQ ID NO: 32, где указанные последовательности содержат аминокислотные замены в одном или более положениях, выбранные из группы, состоящей из следующего:

замена валина в положении 13 в вариабельной области тяжелой цепи серином;

замена аспарагина в положении 42 в вариабельной области тяжелой цепи треонином; и

замена аспарагина в положении 94 в вариабельной области легкой цепи серином,

где нумерация основывается на системе нумерации АНО.

2. Модифицированное антитело или его фрагмент по п. 1, где указанное антитело или его фрагмент содержит следующее:

вариабельная область тяжелой цепи, включающая CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи SEQ ID NO: 13, 14 и 43, соответственно; и

вариабельная область легкой цепи, включающая CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи SEQ ID NO: 16, 17 и 18, соответственно.

3. Модифицированное антитело или его фрагмент по п. 1, где указанное модифицированное антитело или его фрагмент содержит вариабельную область тяжелой цепи, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 31, 33 и 36.

4. Модифицированное антитело или его фрагмент по п. 1, где указанное модифицированное антитело или его фрагмент содержит вариабельную область легкой цепи с последовательностью SEQ ID NO: 35.

5. Модифицированное антитело или его фрагмент по п. 1, где указанное модифицированное антитело и его фрагмент содержит:

вариабельную область тяжелой цепи с последовательностью SEQ ID NO: 31 и вариабельную область легкой цепи с последовательностью SEQ ID NO: 32;

вариабельную область тяжелой цепи с последовательностью SEQ ID NO: 33 и вариабельную область легкой цепи с последовательностью SEQ ID NO: 32;

вариабельную область тяжелой цепи с последовательностью SEQ ID NO: 34 и вариабельную область легкой цепи с последовательностью SEQ ID NO: 35;

вариабельную область тяжелой цепи с последовательностью SEQ ID NO: 36 и вариабельную область легкой цепи с последовательностью SEQ ID NO: 32;

вариабельную область тяжелой цепи с последовательностью SEQ ID NO: 31 и вариабельную область легкой цепи с последовательностью SEQ ID NO: 35;

вариабельную область тяжелой цепи с последовательностью SEQ ID NO: 33 и вариабельную область легкой цепи с последовательностью SEQ ID NO: 35; или

вариабельную область тяжелой цепи с последовательностью SEQ ID NO: 36 и вариабельную область легкой цепи с последовательностью SEQ ID NO: 35.

6. Нуклеиновая кислота, кодирующая модифицированное антитело или его фрагмент по п. 1.

7. Экспрессионный вектор, содержащий нуклеиновую кислоту по п. 6.

8. Клетка для получения модифицированного антитела или его фрагмента, трансформированная экспрессионным вектором по п. 7.

9. Способ получения модифицированного антитела или его фрагмента, включающий следующее:

(а) культивирование клетки по п. 8; и

(b) сбор модифицированного антитела или его фрагмента из культивируемой клетки.