Ссылка на родственные заявки
По этой заявке испрашивается приоритет временной заявки на выдачу патента США № 62/788035, поданной 3 января 2019 года, содержание которой полностью включено в настоящее описание посредством ссылки.
Область техники, к которой относится изобретение
Это раскрытие в общем относится к полипептидам (например, полипептидам слияния, например, слияниям полипептид-Fc-область; или связывающим молекулам, таким как антитела или связывающие лиганды участки слияний рецептор-Fc), которые имеют увеличенный период полужизни у собак по сравнению с их аналогами дикого типа.
Уровень техники
Fc-область антител играет ряд функциональных ролей, включая, но без ограничения, защиту антител от распада посредством лизосомального пути и опосредование эффекторных функций антитела. С увеличением использования собачьих антител в качестве терапевтических средств повышенное внимание уделяется не только выбору оптимальных Fab, но также его сочетанию с подходящим Fc для достижения желаемого периода полужизни и эффекторных функций.
В данной области мало днных относительно увеличения периода полужизни полипептидных терапевтических средств (например, антител) для применения у собак. Это раскрытие устраняет этот недостаток путем предоставления вариантов Fc-области, которые улучшают устойчивость полипептидов (например, антител) в сыворотке у собак.
Сущность изобретения
Изобретение относится к платформенной технологии, относящейся к последовательностям CH2, CH3 и Fc собак, которые применимы в терапевтических полипептидах. В этом раскрытии описаны полипептиды, которые обладают более высоким связыванием с FcRn собак, чем регуляторные полипептиды (например, аналогичные Fc-области IgG собак дикого типа). В некоторых случаях эти полипептиды обладают более высоким связыванием с FcRn собак, чем регуляторные полипептиды при любом pH (например, при любом pH между приблизительно 5,0 и приблизительно 8,0). В некоторых случаях эти полипептиды обладают более высоким связыванием с FcRn собак, чем регуляторные полипептиды при pH 5,5 и/или pH 6,5. В некоторых случаях эти полипептиды могут, например, связываться с FcRn собак на более высоком уровне при кислом pH (например, pH 5,5 или pH6,5), чем при нейтральном pH (например, pH 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4 или 7,5). В некоторых случаях эти полипептиды связываются с FcRn собак на более высоком уровне при pH 5,5, чем при pH 7,4. Это раскрытие частично относится к полипептидам, которые имеют увеличенный период полужизни у собак, чем их аналоги дикого типа. Например, представлены связывающие молекулы (например, антитела или связывающие лиганды участки рецепторов) с увеличенным периодом полужизни относительно вариантов этих связывающих молекул, не соединенных с Fc-областями (например, областями CH2, CH3 или CH2+CH3), раскрытыми в настоящем описании. Также представлены слияния фермент-Fc-область, слияния лиганд-Fc-область и слияния пептид-Fc-область, причем слияния имеют увеличенный период полужизни по сравнению с их аналогами дикого типа. Fc-области, помимо наличия замены или замен (относительно Fc-области собак дикого типа), которые увеличивают период полужизни, также могут содержать другие замены, которые, например, увеличивают эффекторную функцию, снижают эффекторную функцию и/или снижают гетерогенность полипептида (например, путем удаления одной или нескольких посттрансляционных модификаций в Fc-области). Последовательности областей CH2, CH3 и Fc собак могут происходить из любого собачьего антитела. В некоторых случаях последовательности областей CH2, CH3 и Fc собак происходят из IgG собаки (например, IgG.A, IgG.B, IgG.C или IgG.D).
В раскрытии описан рекомбинантный белок, содержащий (1) связывающий домен или его фрагмент, который специфически связывается с лигандом или эпитопом белка, причем связывающий домен соединен с (2) доменом, содержащим CH2-область, CH3-область или Fc-область (область CH2+CH3), раскрытые в настоящем описании. В некоторых случаях связывающий домен содержит (i) шесть определяющих комплементарность областей (CDR) собачьего или человеческого/гуманизированного антитела; (ii) VH и/или VL собачьего, канинизированного, гуманизированного или человеческого антитела; (iii) нанотело; (iv) scFv; (v) Fab; или (vi) растворимый рецепторсвязывающий домен, который связывает лиганд, или его связывающий лиганд фрагмент.
В раскрытии также представлена композиция, содержащая: (1) первый полипептид, содержащий первую Fc-область (например, CH2-область, CH3-область, область CH2+CH3), представляющую собой вариант Fc-области IgG собак, описанный в настоящем описании; и (2) второй полипептид, содержащий вторую Fc-область, представляющую собой вариант Fc-области IgG собак, описанный в настоящем описании. Первый и второй полипептид могут быть связаны посредством первой и второй Fc-областей. В некоторых случаях аминокислотные последовательности первой и второй Fc-областей являются одинаковыми. В других случаях аминокислотные последовательности первой и второй Fc-областей отличаются (например, на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или 25 аминокислот). В некоторых случаях вариант Fc-области представляет собой вариант Fc-области антитела IgG.B собаки. В некоторых случаях вариант Fc-области представляет собой вариант Fc-области антитела IgG.А собаки. В некоторых случаях вариант Fc-области представляет собой вариант Fc-области антитела IgG.С собаки. В некоторых случаях вариант Fc-области представляет собой вариант Fc-области антитела IgG.D собаки.
Также раскрыта молекула слияния, содержащая вариант Fc-области IgG собак, раскрытый в настоящем описании, и полипептид. В некоторых вариантах осуществления вариант Fc-области IgG собак ковалентно соединен с полипептидом (например, посредством шарнирной области или линкера). В некоторых случаях полипептид представляет собой связывающий лиганд домен рецепторного белка собаки, внеклеточный домен рецепторного белка собаки или связывающий антиген домен. В некоторых случаях полипептид выбирают из связывающего лиганд домена или внеклеточного домена IL-13Rα1 или IL-13Rα2 собаки, EPO собаки, CTLA4 собаки, LFA3 собаки, VEGFR1/VEGFR3 собаки, IL-1R собаки, агониста рецептора GLP-1 собаки и связывающего тромбопоэтин пептида собаки. В некоторых случаях полипептид представляет собой scFv, нанотело или однодоменное антитело. В некоторых случаях вариант Fc-области IgG представляет собой вариант Fc-области антитела IgG.B собаки. В некоторых случаях вариант Fc-области IgG представляет собой вариант Fc-области антитела IgG.А собаки. В некоторых случаях вариант Fc-области IgG представляет собой вариант Fc-области антитела IgG.С собаки. В некоторых случаях вариант Fc-области IgG представляет собой вариант Fc-области антитела IgG.D собаки.
В одном аспекте в раскрытии представлен полипептид или полипептиды, содержащие вариант CH2-области Fc IgG собаки, вариант CH2-области, содержащий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 75% идентична последовательности, представленной в SEQ ID NO:1, и содержит по меньшей мере одно из следующего:
аминокислоты, отличной от Ile в положении 250 аминокислоты,
аминокислоты, отличной от Leu в положении 251 аминокислоты,
аминокислоты, отличной от Arg в положении 252 аминокислоты,
аминокислоты, отличной от Thr в положении 254 аминокислоты,
аминокислоты, отличной от Thr в положении 256 аминокислоты,
аминокислоты, отличной от His в положении 285 аминокислоты,
аминокислоты, отличной от Thr в положении 286 аминокислоты,
аминокислоты, отличной от Pro в положении 307 аминокислоты,
аминокислоты, отличной от Ile в положении 308 аминокислоты,
аминокислоты, отличной от Glu в положении 309 аминокислоты,
аминокислоты, отличной от Gln в положении 311 аминокислоты, или
аминокислоты, отличной от Thr в положении 315 аминокислоты.
В некоторых вариантах осуществления полипептид или полипептиды имеет/имеют: (1) увеличенный период полужизни у собаки, чем регуляторный полипептид или регуляторные полипептиды, причем регуляторный полипептид или регуляторные полипептиды идентичны полипептиду или полипептидам за исключением наличия соответствующей CH2-области Fc IgG собаки дикого типа вместо варианта CH2-области Fc IgG; и/или (2) повышенное связывание с FcRn собаки, чем регуляторный полипептид или полипептиды; и при этом положения аминокислот основаны на нумерации ЕС.
В некоторых вариантах осуществления аминокислотная последовательность по меньшей мере на 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентична последовательности, представленной в SEQ ID NO:1.
В одном аспекте в раскрытии представлен полипептид или полипептиды, содержащие вариант CH2-области Fc IgG собаки, вариант CH2-области, содержащий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 75% идентична последовательности, представленной в SEQ ID NO:2, и содержит по меньшей мере одно из следующего:
аминокислоты, отличной от Thr в положении 250 аминокислоты,
аминокислоты, отличной от Leu в положении 251 аминокислоты,
аминокислоты, отличной от Leu в положении 252 аминокислоты,
аминокислоты, отличной от Ala в положении 254 аминокислоты,
аминокислоты, отличной от Thr в положении 256 аминокислоты,
аминокислоты, отличной от Gln в положении 285 аминокислоты,
аминокислоты, отличной от Thr в положении 286 аминокислоты,
аминокислоты, отличной от Pro в положении 307 аминокислоты,
аминокислоты, отличной от Ile в положении 308 аминокислоты,
аминокислоты, отличной от Gly в положении 309 аминокислоты,
аминокислоты, отличной от Gln в положении 311 аминокислоты, или
аминокислоты, отличной от Lys в положении 315 аминокислоты.
В некоторых вариантах осуществления полипептид или полипептиды имеет/имеют: (1) увеличенный период полужизни у собаки, чем регуляторный полипептид или регуляторные полипептиды, причем регуляторный полипептид или регуляторные полипептиды идентичны полипептиду или полипептидам за исключением наличия соответствующей CH2-области Fc IgG собаки дикого типа вместо варианта CH2-области Fc IgG; и/или (2) повышенное связывание с FcRn собаки, чем регуляторный полипептид или полипептиды; и при этом положения аминокислот основаны на нумерации ЕС.
В некоторых вариантах осуществления аминокислотная последовательность по меньшей мере на 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентична последовательности, представленной в SEQ ID NO:2.
В одном аспекте в раскрытии дополнительно представлен полипептид или полипептиды, содержащие вариант CH2-области Fc IgG собаки, вариант CH2-области, содержащий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 75% идентична последовательности, представленной в SEQ ID NO:3, и содержит по меньшей мере одно из следующего:
аминокислоты, отличной от Ile в положении 250 аминокислоты,
аминокислоты, отличной от Leu в положении 251 аминокислоты,
аминокислоты, отличной от Val в положении 252 аминокислоты,
аминокислоты, отличной от Ala в положении 254 аминокислоты,
аминокислоты, отличной от Thr в положении 256 аминокислоты,
аминокислоты, отличной от Gln в положении 285 аминокислоты,
аминокислоты, отличной от Thr в положении 286 аминокислоты,
аминокислоты, отличной от Pro в положении 307 аминокислоты,
аминокислоты, отличной от Ile в положении 308 аминокислоты,
аминокислоты, отличной от Gly в положении 309 аминокислоты,
аминокислоты, отличной от Gln в положении 311 аминокислоты, или
аминокислоты, отличной от Ser в положении 315 аминокислоты.
В некоторых вариантах осуществления полипептид или полипептиды имеет/имеют: увеличенный период полужизни у собаки, чем регуляторный полипептид или регуляторные полипептиды, причем регуляторный полипептид или регуляторные полипептиды идентичны полипептиду или полипептидам за исключением наличия соответствующей CH2-области Fc IgG собаки дикого типа вместо варианта CH2-области Fc IgG.
В некоторых вариантах осуществления аминокислотная последовательность по меньшей мере на 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентична последовательности, представленной в SEQ ID NO:3.
В одном аспекте раскрытие относится к полипептиду или полипептидам, содержащим вариант CH2-области Fc IgG собаки, вариант CH2-области, содержащий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 75% идентична последовательности, представленной в SEQ ID NO:4, и содержит по меньшей мере одно из следующего:
аминокислоты, отличной от Ile в положении 250 аминокислоты,
аминокислоты, отличной от Leu в положении 251 аминокислоты,
аминокислоты, отличной от Arg в положении 252 аминокислоты,
аминокислоты, отличной от Thr в положении 254 аминокислоты,
аминокислоты, отличной от Thr в положении 256 аминокислоты,
аминокислоты, отличной от His в положении 285 аминокислоты,
аминокислоты, отличной от Thr в положении 286 аминокислоты,
аминокислоты, отличной от Pro в положении 307 аминокислоты,
аминокислоты, отличной от Ile в положении 308 аминокислоты,
аминокислоты, отличной от Glu в положении 309 аминокислоты,
аминокислоты, отличной от Gln в положении 311 аминокислоты, или
аминокислоты, отличной от Thr в положении 315 аминокислоты.
В некоторых вариантах осуществления полипептид или полипептиды имеет/имеют: (1) увеличенный период полужизни у собаки, чем регуляторный полипептид или регуляторные полипептиды, причем регуляторный полипептид или регуляторные полипептиды идентичны полипептиду или полипептидам за исключением наличия соответствующей CH2-области Fc IgG собаки дикого типа вместо варианта CH2-области Fc IgG; и/или (2) повышенное связывание с FcRn собаки, чем регуляторный полипептид или полипептиды; и при этом положения аминокислот основаны на нумерации ЕС.
В некоторых вариантах осуществления аминокислотная последовательность по меньшей мере на 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентична последовательности, представленной в SEQ ID NO:4.
В некоторых вариантах осуществления полипептид или полипептиды содержит (содержат) по меньшей мере одно из следующего:
Glu или Gln в положении 250 аминокислоты,
Asp или Glu в положении 251 аминокислоты,
Tyr в положении 252 аминокислоты,
Thr в положении 254 аминокислоты,
Asp, Glu или Phe в положении 256 аминокислоты,
Asn или Asp в положении 285 аминокислоты,
Asp в положении 286 аминокислоты,
Arg, Gln или Ala в положении 307 аминокислоты,
Pro в положении 308 аминокислоты,
Pro в положении 309 аминокислоты,
Val в положении 311 аминокислоты или
Asp в положении 315 аминокислоты.
В некоторых вариантах осуществления полипептид или полипептиды содержит (содержат) по меньшей мере одно из следующего:
Tyr или Met в положении 252 аминокислоты,
Thr в положении 254 аминокислоты или
Glu в положении 256 аминокислоты.
В некоторых вариантах осуществления вариант CH2-области Fc IgG собаки содержит по меньшей мере одно из следующего:
(i) Tyr в положении 252 аминокислоты, Thr в положении 254 аминокислоты и Glu в положении 256 аминокислоты;
(ii) Leu в положении 428 аминокислоты и Ser в положении 434 аминокислоты;
(iii) Asp в положении 256 аминокислоты, Arg в положении 307 аминокислоты и Val в положении 311 аминокислоты;
(iv) Asp в положении 256 аминокислоты, Asp в положении 315 аминокислоты и Val в положении 378 аминокислоты;
(v) Asp в положении 256 аминокислоты, Asp в положении 286 аминокислоты, Arg в положении 307 аминокислоты и Val в положении 311 аминокислоты;
(vi) Asn в положении 285 аминокислоты, Gln в положении 307 аминокислоты и Asp в положении 315 аминокислоты; или
(vii) Asp в положении 251 аминокислоты и Pro в положении 309 аминокислоты.
В одном аспекте в раскрытии представлен полипептид или полипептиды, содержащие вариант CH3-области Fc IgG собаки, содержащий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 75% идентична последовательности, представленной в SEQ ID NO:5, и содержит по меньшей мере одно из следующего:
аминокислоты, отличной от Asp в положении 378 аминокислоты,
аминокислоты, отличной от Glu в положении 380 аминокислоты,
аминокислоты, отличной от Met в положении 428 аминокислоты,
аминокислоты, отличной от Glu в положении 430 аминокислоты,
аминокислоты, отличной от Gln в положении 433 аминокислоты,
аминокислоты, отличной от Asn в положении 434 аминокислоты,
аминокислоты, отличной от His в положении 435 аминокислоты, или
аминокислоты, отличной от Tyr в положении 436 аминокислоты.
В некоторых вариантах осуществления полипептид или полипептиды имеет/имеют: (1) увеличенный период полужизни у собаки, чем регуляторный полипептид или регуляторные полипептиды, причем регуляторный полипептид или регуляторные полипептиды идентичны полипептиду или полипептидам за исключением наличия соответствующей CH3-области Fc IgG собаки дикого типа вместо варианта CH3-области Fc IgG; и/или (2) повышенное связывание с FcRn собаки, чем регуляторный полипептид или полипептиды; и при этом положения аминокислот основаны на нумерации ЕС.
В некоторых вариантах осуществления аминокислотная последовательность по меньшей мере на 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентична последовательности, представленной в SEQ ID NO:5.
В одном аспекте в раскрытии представлен полипептид или полипептиды, содержащие вариант CH3-области Fc IgG собаки, содержащий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 75% идентична последовательности, представленной в SEQ ID NO:6, и содержит по меньшей мере одно из следующего:
аминокислоты, отличной от Asp в положении 378 аминокислоты,
аминокислоты, отличной от Glu в положении 380 аминокислоты,
аминокислоты, отличной от Met в положении 428 аминокислоты,
аминокислоты, отличной от Glu в положении 430 аминокислоты,
аминокислоты, отличной от His в положении 433 аминокислоты,
аминокислоты, отличной от Asn в положении 434 аминокислоты,
аминокислоты, отличной от His в положении 435 аминокислоты, или
аминокислоты, отличной от Tyr в положении 436 аминокислоты.
В некоторых вариантах осуществления полипептид или полипептиды имеет/имеют: (1) увеличенный период полужизни у собаки, чем регуляторный полипептид или регуляторные полипептиды, причем регуляторный полипептид или регуляторные полипептиды идентичны полипептиду или полипептидам за исключением наличия соответствующей CH3-области Fc IgG собаки дикого типа вместо варианта CH3-области Fc IgG; и/или (2) повышенное связывание с FcRn собаки, чем регуляторный полипептид или полипептиды; и при этом положения аминокислот основаны на нумерации ЕС.
В некоторых вариантах осуществления аминокислотная последовательность по меньшей мере на 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентична последовательности, представленной в SEQ ID NO:6.
В одном аспекте в раскрытии представлен полипептид или полипептиды, содержащие вариант CH3-области Fc IgG собаки, содержащий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 75% идентична последовательности, представленной в SEQ ID NO:7, и содержит по меньшей мере одно из следующего:
аминокислоты, отличной от Asp в положении 378 аминокислоты,
аминокислоты, отличной от Glu в положении 380 аминокислоты,
аминокислоты, отличной от Met в положении 428 аминокислоты,
аминокислоты, отличной от Glu в положении 430 аминокислоты,
аминокислоты, отличной от His в положении 433 аминокислоты,
аминокислоты, отличной от Asn в положении 434 аминокислоты,
аминокислоты, отличной от His в положении 435 аминокислоты, или
аминокислоты, отличной от Tyr в положении 436 аминокислоты.
В некоторых вариантах осуществления полипептид или полипептиды имеет/имеют: увеличенный период полужизни у собаки, чем регуляторный полипептид или регуляторные полипептиды, причем регуляторный полипептид или регуляторные полипептиды идентичны полипептиду или полипептидам за исключением наличия соответствующей CH3-области Fc IgG собаки дикого типа вместо варианта CH3-области Fc IgG.
В некоторых вариантах осуществления аминокислотная последовательность по меньшей мере на 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентична последовательности, представленной в SEQ ID NO:7.
В одном аспекте в раскрытии представлен полипептид или полипептиды, содержащие вариант CH3-области Fc IgG собаки, содержащий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 75% идентична последовательности, представленной в SEQ ID NO:8, и содержит по меньшей мере одно из следующего:
аминокислоты, отличной от Asp в положении 378 аминокислоты,
аминокислоты, отличной от Glu в положении 380 аминокислоты,
аминокислоты, отличной от Met в положении 428 аминокислоты,
аминокислоты, отличной от Glu в положении 430 аминокислоты,
аминокислоты, отличной от Gln в положении 433 аминокислоты,
аминокислоты, отличной от Asn в положении 434 аминокислоты,
аминокислоты, отличной от His в положении 435 аминокислоты, или
аминокислоты, отличной от Tyr в положении 436 аминокислоты.
В некоторых вариантах осуществления полипептид или полипептиды имеет/имеют: (1) увеличенный период полужизни у собаки, чем регуляторный полипептид или регуляторные полипептиды, причем регуляторный полипептид или регуляторные полипептиды идентичны полипептиду или полипептидам за исключением наличия соответствующей CH3-области Fc IgG собаки дикого типа вместо варианта CH3-области Fc IgG; и/или (2) повышенное связывание с FcRn собаки, чем регуляторный полипептид или полипептиды; и при этом положения аминокислот основаны на нумерации ЕС.
В некоторых вариантах осуществления аминокислотная последовательность по меньшей мере на 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентична последовательности, представленной в SEQ ID NO:8.
В некоторых вариантах осуществления полипептид или полипептиды содержит (содержат) по меньшей мере одно из следующего:
Val в положении 378 аминокислоты,
Ala в положении 380 аминокислоты,
Leu в положении 428 аминокислоты,
Ala или Lys в положении 430 аминокислоты,
Lys в положении 433 аминокислоты,
Ser, Ala или Phe в положении 434 аминокислоты,
Try в положении 435 аминокислоты,
His в положении 436 аминокислоты.
В некоторых вариантах осуществления вариант CH3-области Fc IgG собаки содержит:
(i) Leu в положении 428 аминокислоты и Ser в положении 434 аминокислоты;
(ii) Leu в положении 428 аминокислоты и Ala в положении 434 аминокислоты;
(iii) Lys в положении 430 аминокислоты и Lys в положении 433 аминокислоты; или
(iv) Tyr в положении 435 аминокислоты и His в положении 436 аминокислоты.
В некоторых вариантах осуществления полипептид или полипептиды содержит (содержат) Tyr, Trp, Arg или His в положении 434 аминокислоты.
В одном аспекте в раскрытии представлен полипептид или полипептиды, содержащие вариант Fc-области IgG собак, содержащий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 75% идентична последовательности, представленной в SEQ ID NO: 9, и который содержит по меньшей мере одно из следующего:
аминокислоты, отличной от Ile в положении 250 аминокислоты,
аминокислоты, отличной от Leu в положении 251 аминокислоты,
аминокислоты, отличной от Arg в положении 252 аминокислоты,
аминокислоты, отличной от Thr в положении 254 аминокислоты,
аминокислоты, отличной от Thr в положении 256 аминокислоты,
аминокислоты, отличной от His в положении 285 аминокислоты,
аминокислоты, отличной от Thr в положении 286 аминокислоты,
аминокислоты, отличной от Pro в положении 307 аминокислоты,
аминокислоты, отличной от Ile в положении 308 аминокислоты,
аминокислоты, отличной от Glu в положении 309 аминокислоты,
аминокислоты, отличной от Gln в положении 311 аминокислоты,
аминокислоты, отличной от Thr в положении 315 аминокислоты,
аминокислоты, отличной от Asp в положении 378 аминокислоты,
аминокислоты, отличной от Glu в положении 380 аминокислоты,
аминокислоты, отличной от Met в положении 428 аминокислоты,
аминокислоты, отличной от Glu в положении 430 аминокислоты,
аминокислоты, отличной от Gln в положении 433 аминокислоты,
аминокислоты, отличной от Asn в положении 434 аминокислоты,
аминокислоты, отличной от His в положении 435 аминокислоты, или
аминокислоты, отличной от Tyr в положении 436 аминокислоты.
В некоторых вариантах осуществления полипептид или полипептиды имеет/имеют: (1) увеличенный период полужизни у собаки, чем регуляторный полипептид или регуляторные полипептиды, причем регуляторный полипептид или регуляторные полипептиды идентичны полипептиду или полипептидам за исключением наличия соответствующей Fc-области IgG собаки дикого типа вместо варианта Fc-области IgG; и/или (2) повышенное связывание с FcRn собаки, чем регуляторные полипептиды; и при этом положения аминокислот основаны на нумерации ЕС.
В некоторых вариантах осуществления аминокислотная последовательность по меньшей мере на 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентична последовательности, представленной в SEQ ID NO: 9.
В одном аспекте в раскрытии также представлен полипептид или полипептиды, содержащие вариант Fc-области IgG собак, содержащий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 75% идентична последовательности, представленной в SEQ ID NO:10, и который содержит по меньшей мере одно из следующего:
аминокислоты, отличной от Thr в положении 250 аминокислоты,
аминокислоты, отличной от Leu в положении 251 аминокислоты,
аминокислоты, отличной от Leu в положении 252 аминокислоты,
аминокислоты, отличной от Ala в положении 254 аминокислоты,
аминокислоты, отличной от Thr в положении 256 аминокислоты,
аминокислоты, отличной от Gln в положении 285 аминокислоты,
аминокислоты, отличной от Thr в положении 286 аминокислоты,
аминокислоты, отличной от Pro в положении 307 аминокислоты,
аминокислоты, отличной от Ile в положении 308 аминокислоты,
аминокислоты, отличной от Gly в положении 309 аминокислоты,
аминокислоты, отличной от Gln в положении 311 аминокислоты,
аминокислоты, отличной от Lys в положении 315 аминокислоты,
аминокислоты, отличной от Asp в положении 378 аминокислоты,
аминокислоты, отличной от Glu в положении 380 аминокислоты,
аминокислоты, отличной от Met в положении 428 аминокислоты,
аминокислоты, отличной от Glu в положении 430 аминокислоты,
аминокислоты, отличной от His в положении 433 аминокислоты,
аминокислоты, отличной от Asn в положении 434 аминокислоты,
аминокислоты, отличной от His в положении 435 аминокислоты, или
аминокислоты, отличной от Tyr в положении 436 аминокислоты.
В некоторых вариантах осуществления полипептид или полипептиды имеет/имеют: (1) увеличенный период полужизни у собаки, чем регуляторный полипептид или регуляторные полипептиды, причем регуляторный полипептид или регуляторные полипептиды идентичны полипептиду или полипептидам за исключением наличия соответствующей Fc-области IgG собаки дикого типа вместо варианта Fc-области IgG; и/или (2) повышенное связывание с FcRn собаки, чем регуляторные полипептиды; и при этом положения аминокислот основаны на нумерации ЕС.
В некоторых вариантах осуществления аминокислотная последовательность по меньшей мере на 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентична последовательности, представленной в SEQ ID NO:10.
В одном аспекте в раскрытии представлен полипептид или полипептиды, содержащие вариант Fc-области IgG собак, содержащий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 75% идентична последовательности, представленной в SEQ ID NO:11, и которая содержит по меньшей мере одно из следующего:
аминокислоты, отличной от Ile в положении 250 аминокислоты,
аминокислоты, отличной от Leu в положении 251 аминокислоты,
аминокислоты, отличной от Val в положении 252 аминокислоты,
аминокислоты, отличной от Ala в положении 254 аминокислоты,
аминокислоты, отличной от Thr в положении 256 аминокислоты,
аминокислоты, отличной от Gln в положении 285 аминокислоты,
аминокислоты, отличной от Thr в положении 286 аминокислоты,
аминокислоты, отличной от Pro в положении 307 аминокислоты,
аминокислоты, отличной от Ile в положении 308 аминокислоты,
аминокислоты, отличной от Gly в положении 309 аминокислоты,
аминокислоты, отличной от Gln в положении 311 аминокислоты,
аминокислоты, отличной от Ser в положении 315 аминокислоты,
аминокислоты, отличной от Asp в положении 378 аминокислоты,
аминокислоты, отличной от Glu в положении 380 аминокислоты,
аминокислоты, отличной от Met в положении 428 аминокислоты,
аминокислоты, отличной от Glu в положении 430 аминокислоты,
аминокислоты, отличной от His в положении 433 аминокислоты,
аминокислоты, отличной от Asn в положении 434 аминокислоты,
аминокислоты, отличной от His в положении 435 аминокислоты, или
аминокислоты, отличной от Tyr в положении 436 аминокислоты.
В некоторых вариантах осуществления полипептид или полипептиды имеет/имеют: увеличенный период полужизни у собаки, чем регуляторный полипептид или регуляторные полипептиды, причем регуляторный полипептид или регуляторные полипептиды идентичны полипептиду или полипептидам за исключением наличия соответствующей Fc-области IgG собаки дикого типа вместо варианта Fc-области IgG.
В некоторых вариантах осуществления аминокислотная последовательность по меньшей мере на 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентична последовательности, представленной в SEQ ID NO:11.
В одном аспекте в раскрытии представлен полипептид или полипептиды, содержащие вариант Fc-области IgG собак, содержащий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 75% идентична последовательности, представленной в SEQ ID NO:12, и которая содержит по меньшей мере одно из следующего:
аминокислоты, отличной от Ile в положении 250 аминокислоты,
аминокислоты, отличной от Leu в положении 251 аминокислоты,
аминокислоты, отличной от Arg в положении 252 аминокислоты,
аминокислоты, отличной от Thr в положении 254 аминокислоты,
аминокислоты, отличной от Thr в положении 256 аминокислоты,
аминокислоты, отличной от His в положении 285 аминокислоты,
аминокислоты, отличной от Thr в положении 286 аминокислоты,
аминокислоты, отличной от Pro в положении 307 аминокислоты,
аминокислоты, отличной от Ile в положении 308 аминокислоты,
аминокислоты, отличной от Glu в положении 309 аминокислоты,
аминокислоты, отличной от Gln в положении 311 аминокислоты,
аминокислоты, отличной от Thr в положении 315 аминокислоты,
аминокислоты, отличной от Asp в положении 378 аминокислоты,
аминокислоты, отличной от Glu в положении 380 аминокислоты,
аминокислоты, отличной от Met в положении 428 аминокислоты,
аминокислоты, отличной от Glu в положении 430 аминокислоты,
аминокислоты, отличной от Gln в положении 433 аминокислоты,
аминокислоты, отличной от Asn в положении 434 аминокислоты,
аминокислоты, отличной от His в положении 435 аминокислоты, или
аминокислоты, отличной от Tyr в положении 436 аминокислоты.
В некоторых вариантах осуществления полипептид или полипептиды имеет/имеют: (1) увеличенный период полужизни у собаки, чем регуляторный полипептид или регуляторные полипептиды, причем регуляторный полипептид или регуляторные полипептиды идентичны полипептиду или полипептидам за исключением наличия соответствующей Fc-области IgG собаки дикого типа вместо варианта Fc-области IgG; и/или (2) повышенное связывание с FcRn собаки, чем регуляторные полипептиды; и при этом положения аминокислот основаны на нумерации ЕС.
В некоторых вариантах осуществления аминокислотная последовательность по меньшей мере на 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентична последовательности, представленной в SEQ ID NO:12.
В некоторых вариантах осуществления полипептид или полипептиды содержат по меньшей мере одно из следующего:
Glu или Gln в положении 250 аминокислоты,
Asp или Glu в положении 251 аминокислоты,
Tyr в положении 252 аминокислоты,
Thr в положении 254 аминокислоты,
Asp, Glu или Phe в положении 256 аминокислоты,
Asn или Asp в положении 285 аминокислоты,
Asp в положении 286 аминокислоты,
Arg, Gln или Ala в положении 307 аминокислоты,
Pro в положении 308 аминокислоты,
Pro в положении 309 аминокислоты,
Val в положении 311 аминокислоты,
Asp в положении 315 аминокислоты,
Val в положении 378 аминокислоты,
Ala в положении 380 аминокислоты,
Leu в положении 428 аминокислоты,
Ala или Lys в положении 430 аминокислоты,
Lys в положении 433 аминокислоты,
Ser, Ala или Phe в положении 434 аминокислоты,
Try в положении 435 аминокислоты или
His в положении 436 аминокислоты.
В некоторых вариантах осуществления полипептид или полипептиды содержит (содержат) по меньшей мере одно из следующего:
Tyr или Met в положении 252 аминокислоты,
Thr в положении 254 аминокислоты,
Glu в положении 256 аминокислоты или
Tyr, Trp, Arg или His в положении 434 аминокислоты.
В некоторых вариантах осуществления вариант Fc-области IgG собак содержит по меньшей мере одно из следующего:
(i) Tyr в положении 252 аминокислоты, Thr в положении 254 аминокислоты и Glu в положении 256 аминокислоты;
(ii) Leu в положении 428 аминокислоты и Ser в положении 434 аминокислоты;
(iii) Asp в положении 256 аминокислоты, Arg в положении 307 аминокислоты и Val в положении 311 аминокислоты;
(iv) Asp в положении 256 аминокислоты, Asp в положении 315 аминокислоты и Val в положении 378 аминокислоты;
(v) Asp в положении 256 аминокислоты, Asp в положении 286 аминокислоты, Arg в положении 307 аминокислоты и Val в положении 311 аминокислоты;
(vi) Asn в положении 285 аминокислоты, Gln в положении 307 аминокислоты и Asp в положении 315 аминокислоты;
(vii) Asp в положении 256 аминокислоты, Arg в положении 307 аминокислоты, Val в положении 311 аминокислоты и Val в положении 378 аминокислоты;
(viii) Asp в положении 285 аминокислоты, Val в положении 311 аминокислоты и Val в положении 378 аминокислоты;
(ix) Asp в положении 256 аминокислоты, Asp в положении 285 аминокислоты и Val в положении 378 аминокислоты;
(x) Asp в положении 256 аминокислоты, Val в положении 311 аминокислоты и Val в положении 378 аминокислоты;
(xi) Asp в положении 256 аминокислоты, Asp в положении 285 аминокислоты, Asp в положении 286 аминокислоты, Arg в положении 307 аминокислоты и Val в положении 378 аминокислоты;
(xii) Asp в положении 256 аминокислоты, Asp в положении 286 аминокислоты, Arg в положении 307 аминокислоты, Val в положении 311 аминокислоты и Val в положении 378;
(xiii) Gln в положении 307 аминокислоты, Val в положении 311 аминокислоты и Val в положении 378 аминокислоты;
(xiv) Asp в положении 285 аминокислоты, Gln в положении 307 аминокислоты и Val в положении 378 аминокислоты;
(xv) Asp в положении 256 аминокислоты, Asp в положении 285 аминокислоты, Arg в положении 307 аминокислоты, Val в положении 311 аминокислоты и Val в положении 378 аминокислоты;
(xvi) Gln в положении 307 аминокислоты, Ala в положении 380 аминокислоты, Ser или Ala в положении 434 аминокислоты;
(xvii) Leu в положении 428 аминокислоты, и Ser или Ala в положении 434 аминокислоты; или
(xviii) Gln в положении 250 аминокислоты и Leu в положении 428 аминокислоты.
В некоторых вариантах осуществления полипептид или полипептиды представляет/представляют собой антиген связывающий домен (домены).
В некоторых вариантах осуществления антиген связывающий домен (домены) связываются с антигеном, выбранным из группы, состоящей из NGF, TrKA, ADAMTS, IL-1, IL-2, IL-4, IL-4R, рецептора ангиотензина 1 типа (AT1), рецептора ангиотензина 2 типа (AT2), IL-5, IL-12, IL-13, IL-31, IL-33, TNF-альфа, IgE, PD-1, лиганда PD-1, CD3, CD20, CD47, CD52, OX40, лиганда OX40, CTLA4, VEGF, EGFR, NAV 1,7 и комплекса системы комплемента (например, комплекса C1, комплекса C2, комплекса C3, комплекса C4, комплекса C5, комплекса C6, комплекса C7, комплекса C8, комплекса C9).
В некоторых вариантах осуществления антиген связывающий домен (домены) представляет/представляют собой scFv, scFab или нанотело.
В некоторых вариантах осуществления полипептид или полипептиды, описанные в настоящем описании, дополнительно содержат белок. В некоторых вариантах осуществления белок выбирают из группы, состоящей из EPO, CTLA4, LFA3, VEGFR1/VEGFR3, IL-1R, IL-4R, агониста рецептора GLP-1 и связывающего тромбопоэтин пептида.
В одном аспекте в раскрытии представлена фармацевтическая композиция, содержащая (i) полипептид или полипептиды, описанные в настоящем описании, и (ii) фармацевтически приемлемое вспомогательное средство.
В одном аспекте в раскрытии представлена нуклеиновая кислота или нуклеиновые кислоты, кодирующие полипептид или полипептиды, описанные в настоящем описании.
В одном аспекте в раскрытии представлен вектор экспрессии или векторы экспрессии, содержащие нуклеиновую кислоту или нуклеиновые кислоты, описанные в настоящем описании.
В одном аспекте в раскрытии представлена клетка-хозяин, содержащая нуклеиновую кислоту или нуклеиновые кислоты, описанные в настоящем описании, или вектор экспрессии или векторы экспрессии, описанные в настоящем описании.
В одном аспекте в раскрытии представлен способ получения полипептида или полипептидов, причем способ включает
(a) предоставление нуклеиновой кислоты или нуклеиновых кислот, описанных в настоящем описании;
(b) экспрессию нуклеиновой кислоты или нуклеиновых кислот в культуре клеток-хозяев с получением таким образом полипептида или полипептидов; и
(c) сбор полипептида или полипептидов, полученных в (b) из культуры клеток-хозяев.
В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает получение полипептида или полипептидов в виде фармацевтической готовой формы.
В одном аспекте в раскрытии представлен способ лечения заболевания или расстройства у нуждающейся в этом собаки, причем способ включает введение собаке эффективного количества композиции, содержащей фармацевтическую композицию, описанную в настоящем описании.
В одном аспекте в раскрытии представлен способ предотвращения заболевания или расстройства у нуждающейся в этом собаки, причем способ включает введение собаке эффективного количества композиции, содержащей фармацевтическую композицию, описанную в настоящем описании.
В некоторых вариантах осуществления заболевание или расстройство представляет собой аллергическое заболевание, хроническую боль, острую боль, воспалительное заболевание, аутоиммунное заболевание, эндокринное заболевание, заболевание желудочно-кишечного тракта, сердечно-сосудистое заболевание, заболевание почек, связанное с фертильностью расстройство, инфекционное заболевание или рак.
В некоторых вариантах осуществления заболевание или расстройство представляет собой атопический дерматит, аллергический дерматит, остеоартритическую боль, артрит, анемию или ожирение.
Если не указано иное все технические и научные термины, использованные в настоящем описании, имеют то же значение, которое обычно понятно специалисту в области, к которой относится данное изобретение. Хотя способы и материалы, аналогичные или эквивалентные описанным в настоящем описании, можно использовать на практике или при тестировании настоящего изобретения, ниже описаны иллюстративные способы и материалы. все публикации, заявки на патенты, патенты и другие ссылки, упомянутые в настоящем описании, полностью включены посредством ссылки. В случае конфликта настоящая заявка, включая определения, будет иметь преимущественную силу. Материалы, способы и примеры являются только иллюстративными и не предназначены для ограничения.
Другие признаки и преимущества изобретения будут очевидны из следующего подробного описания и из формулы изобретения.
Краткое описание чертежей
На фиг. 1 представлено выравнивание аминокислотной последовательности γ-цепей IgG собаки. Эти цепи содержат домены VH, CH1, CH2 и CH3 и шарнирную область между CH1 и CH2. сайт N-гликозилирования показан жирным шрифтом и отмечен квадратом. Этим последовательностям присвоены SEQ ID NO: 13, 14, 15 и 16, соответственно.
На фиг. 2 представлено выравнивание аминокислотной последовательности CH2-области γ-цепей IgG собаки. Этим последовательностям присвоены SEQ ID NO: 1, 2, 3 и 4, соответственно. Остатки, которые заменяют для увеличения периода полужизни, отмечены подчеркиванием.
На фиг. 3 представлено выравнивание аминокислотной последовательности CH3-области γ-цепей IgG собаки. Этим последовательностям присвоены SEQ ID NO: 5, 6, 7 и 8, соответственно. Остатки, которые заменяют для увеличения периода полужизни, отмечены подчеркиванием.
На фиг. 4 представлено выравнивание аминокислотной последовательности Fc-области γ-цепей IgG собаки. Этим последовательностям присвоены SEQ ID NO: 9, 10, 11 и 12, соответственно. Остатки, которые заменяют для увеличения периода полужизни, отмечены подчеркиванием.
На фиг. 5 представлена таблица с нумерацией ЕС для CH2-области IgG собаки.
На фиг. 6 представлена таблица с нумерацией ЕС для CH3-области IgG собаки.
На фиг. 7A-7U представлены сенсограммы Biacore из эксперимента с аланин-сканирующим мутагенезом. более светлая линия на каждой фигуре представляет измеренные данные, а более темная линия представляет построенную по точкам кривую с использованием модели взаимодействия 1:1.
На фиг. 8A-8C представлены сенсограммы Biacore для дикого типа и разных вариантов из библиотек NNK в положении 250. более светлая линия на каждой фигуре представляет измеренные данные, а более темная линия представляет построенную по точкам кривую с использованием модели взаимодействия 1:1.
На фиг. 9A-9C представлены сенсограммы Biacore для дикого типа и разных вариантов из библиотек NNK в положении 252. более светлая линия на каждой фигуре представляет измеренные данные, а более темная линия представляет построенную по точкам кривую с использованием модели взаимодействия 1:1.
На фиг. 10A и 10B представлены сенсограммы Biacore для дикого типа и варианта A254T. более светлая линия представляет измеренные данные, а более темная линия представляет построенную по точкам кривую с использованием модели взаимодействия 1:1.
На фиг. 11A и 11B представлены сенсограммы Biacore для дикого типа и варианта G309P. более светлая линия представляет измеренные данные, а более темная линия представляет построенную по точкам кривую с использованием модели взаимодействия 1:1.
На фиг. 12A и 12B представлены сенсограммы Biacore для дикого типа и варианта Q311V. более светлая линия представляет измеренные данные, а более темная линия представляет построенную по точкам кривую с использованием модели взаимодействия 1:1.
На фиг. 13A и 13B представлены сенсограммы Biacore для дикого типа и варианта D378V. более светлая линия представляет измеренные данные, а более темная линия представляет построенную по точкам кривую с использованием модели взаимодействия 1:1.
На фиг. 14A и 15B представлены сенсограммы Biacore для дикого типа и варианта E380A. более светлая линия представляет измеренные данные, а более темная линия представляет построенную по точкам кривую с использованием модели взаимодействия 1:1.
На фиг. 15A-15F представлены сенсограммы Biacore для дикого типа и разных вариантов из библиотек NNK в положении 434. более светлая линия представляет измеренные данные, а более темная линия представляет построенную по точкам кривую с использованием модели взаимодействия 1:1.
На фиг. 16A-16E представлены сенсограммы Biacore для разных вариантов в серии концентраций. использованные концентрации FcRn собаки составляли 100 нМ (белый кружок), 200 нМ (черный кружок), 400 нМ (черный треугольник) и 800 нМ (белый треугольник). более светлая линия на каждой фигуре представляет измеренные данные, а более темная линия представляет построенную по точкам кривую с использованием модели взаимодействия 1:1.
Подробное описание изобретения
С увеличением использования полипептидов (например, антител, связывающих лиганды доменов рецепторов, ферментов, лигандов, пептидов) в качестве терапевтических средств для предотвращения и лечения большого множества заболеваний собак, важно разрабатывать полипептиды с увеличенным периодом полужизни, особенно в контексте предотвращения или лечения хронических заболеваний, при которых полипептид нужно вводить повторно.
Соответственно, в этом раскрытии описаны области CH2, CH3 и Fc иммуноглобулина собаки, содержащие мутации, которые увеличивают период полужизни полипептида или полипептидов, содержащих эти последовательности. Также раскрыты полипептиды, содержащие эти домены, и способы их применения. Эти пептиды можно использовать для различных терапевтических и диагностических целей.
Собачьи антитела
Собаки имеют четыре тяжелые цепи IgG, называемые A, B, C и D. Эти тяжелые цепи представляют четыре разных подкласса IgG собаки, которые называются IgG.A, IgG.B, IgG.C и IgG.D. Последовательности аминокислот и ДНК для этих тяжелых цепей доступны в Tang et al., Vet. Immunol. Immunopathol., 80: 259-270 (2001) и базе данных GENBANK. Например, аминокислотная последовательность тяжелой цепи IgG.A имеет учетный номер GENBANK AAL35301,1, IgG.B имеет учетный номер GENBANK AAL35302,1, IgG.C имеет учетный номер GENBANK AAL35303,1, а IgG.D имеет учетный номер GENBANK AAL35304,1. Собачьи антитела также содержат два типа легких цепей: каппа и лямбда. Последовательность ДНК и аминокислот этих легких цепей также можно получить из базы данных GENBANK. Например, аминокислотная последовательность легкой цепи каппа собаки имеет учетный номер ABY 57289,1, а легкой цепи лямбда собаки имеет учетный номер ABY 55569,1.
CH2-область Fc-области собаки:
CH2-область собачьих антител содержит или состоит из аминокислот 237-340 (согласно нумерации ЕС) собачьих IgG антител. Понятно, что CH2-область может содержать от одной до шести (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6) дополнительных аминокислот или делеций на их N и/или C-конце.
Ниже представлена аминокислотная последовательность CH2-области IgG.A собаки:
GPSVLI FPPKPKDILR ITRTPEVTCV VLDLGREDPE VQISWFVDGK EVHTAKTQSR EQQFNGTYRV VSVLPIEHQD WLTGKEFKCR VNHIDLPSPI ERTISKAR (SEQ ID NO:1)
ниже представлена аминокислотная последовательность домена CH2 IgG.B собаки:
GPSVFIFPPK PKDTLLIART PEVTCVVVDL DPEDPEVQIS WFVDGKQMQT AKTQPREEQF NGTYRVVSVL PIGHQDWLKG KQFTCKVNNK ALPSPIERTI SKAR (SEQ ID NO:2)
Ниже представлена аминокислотная последовательность домена CH2 IgG.C собаки:
GPSVFIFPP KPKDILVTAR TPTVTCVVVD LDPENPEVQI SWFVDSKQVQ TANTQPREEQ SNGTYRVVSV LPIGHQDWLS GKQFKCKVNN KALPSPIEEI ISKTP (SEQ ID NO:3)
Ниже представлена аминокислотная последовательность домена CH2 IgG.D собаки:
GPSV FIFPPKPKDI LRITRTPEIT CVVLDLGRED PEVQISWFVD GKEVHTAKTQ PREQQFNSTY RVVSVLPIEH QDWLTGKEFK CRVNHIGLPS PIERTISKAR (SEQ ID NO:4)
CH3-область Fc-области собаки:
CH3-область собачьих антител содержит или состоит из аминокислот 345-447 (согласно нумерации ЕС) собачьих IgG антител. Понятно, что CH3-область может содержать от одной до шести (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6) дополнительных аминокислот или делеций на их N и/или C-конце.
Ниже представлена аминокислотная последовательность домена CH3 IgG.A собаки:
KPSVYVLP PSPKELSSSD TVSITCLIKD FYPPDIDVEW QSNGQQEPER KHRMTPPQLD EDGSYFLYSK LSVDKSRWQQ GDPFTCAVMH ETLQNHYTDL SLSHSPGK (SEQ ID NO:5)
Ниже представлена аминокислотная последовательность домена CH3 IgG.B собаки:
QP SVYVLPPSRE ELSKNTVSLT CLIKDFFPPD IDVEWQSNGQ QEPESKYRTT PPQLDEDGSY FLYSKLSVDK SRWQRGDTFI CAVMHEALHN HYTQESLSHS PGK (SEQ ID NO:6)
Ниже представлена аминокислотная последовательность домена CH3 IgG.C собаки:
Q PNVYVLPPSR DEMSKNTVTL TCLVKDFFPP EIDVEWQSNG QQEPESKYRM TPPQLDEDGS YFLYSKLSVD KSRWQRGDTF ICAVMHEALH NHYTQISLSH SPGK (SEQ ID NO:7)
Ниже представлена аминокислотная последовательность домена CH3 IgG.D собаки:
QPSVYV LPPSPKELSS SDTVTLTCLI KDFFPPEIDV EWQSNGQPEP ESKYHTTAPQ LDEDGSYFLY SKLSVDKSRW QQGDTFTCAV MHEALQNHYT DLSLSHSPGK (SEQ ID NO:8)
Fc-область Fc-области собаки:
Fc-область собачьих IgG антител содержит или состоит из аминокислот 231-447 (согласно нумерации ЕС) собачьих IgG антител.
Ниже представлена аминокислотная последовательность домена Fc IgG.A собаки:
VPEPLGGPSVLI FPPKPKDILR ITRTPEVTCV VLDLGREDPE VQISWFVDGK EVHTAKTQSR EQQFNGTYRV VSVLPIEHQD WLTGKEFKCR VNHIDLPSPI ERTISKARGR AHKPSVYVLP PSPKELSSSD TVSITCLIKD FYPPDIDVEW QSNGQQEPER KHRMTPPQLD EDGSYFLYSK LSVDKSRWQQ GDPFTCAVMH ETLQNHYTDL SLSHSPGK (SEQ ID NO: 9)
Ниже представлена аминокислотная последовательность домена Fc IgG.B собаки:
APEMLGGPSVFIFPPK PKDTLLIART PEVTCVVVDL DPEDPEVQIS WFVDGKQMQT AKTQPREEQF NGTYRVVSVL PIGHQDWLKG KQFTCKVNNK ALPSPIERTI SKARGQAHQP SVYVLPPSRE ELSKNTVSLT CLIKDFFPPD IDVEWQSNGQ QEPESKYRTT PPQLDEDGSY FLYSKLSVDK SRWQRGDTFI CAVMHEALHN HYTQESLSHS PGK (SEQ ID NO:10)
Ниже представлена аминокислотная последовательность домена Fc IgG.C собаки:
GCGLLGGPSVFIFPP KPKDILVTAR TPTVTCVVVD LDPENPEVQI SWFVDSKQVQ TANTQPREEQ SNGTYRVVSV LPIGHQDWLS GKQFKCKVNN KALPSPIEEI ISKTPGQAHQ PNVYVLPPSR DEMSKNTVTL TCLVKDFFPP EIDVEWQSNG QQEPESKYRM TPPQLDEDGS YFLYSKLSVD KSRWQRGDTF ICAVMHEALH NHYTQISLSH SPGK (SEQ ID NO: 11)
Ниже представлена аминокислотная последовательность домена Fc IgG.D собаки:
VPESLGGPSV FIFPPKPKDI LRITRTPEIT CVVLDLGRED PEVQISWFVD GKEVHTAKTQ PREQQFNSTY RVVSVLPIEH QDWLTGKEFK CRVNHIGLPS PIERTISKAR GQAHQPSVYV LPPSPKELSS SDTVTLTCLI KDFFPPEIDV EWQSNGQPEP ESKYHTTAPQ LDEDGSYFLY SKLSVDKSRW QQGDTFTCAV MHEALQNHYT DLSLSHSPGK (SEQ ID NO:12)
Замены в Fc IgG собаки, которые улучшают период полужизни
Увеличенная устойчивость в сыворотке является полезным свойством терапевтических полипептидов. В этом раскрытии описаны замены Fc-области IgG.A, IgG.B, IgG.C и IgG.D собаки дикого типа, которые увеличивают период полужизни полипептида или полипептидов, содержащих эти Fc-области у собаки относительно регуляторного полипептида или регуляторных полипептидов, причем регуляторный полипептид или регуляторные полипептиды идентичны полипептиду или полипептидам за исключением наличия соответствующей Fc-области IgG собаки дикого типа вместо варианта Fc-области IgG. для увеличения периода полужизни в CH2-области собаки, CH3-области собаки или в контексте Fc-области (то есть CH2+CH3) собаки можно сделать замены.
В некоторых случаях в этом раскрытии представлен вариант CH2-области IgG собаки, содержащий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности, представленной в любой из SEQ ID NO:1-4. Также представлены варианты CH2-области IgG собаки, содержащие аминокислотную последовательность, которая отличается от любой из SEQ ID NO:1-4 на 1-15 аминокислот.
В других случаях в этом раскрытии описан вариант CH3-области IgG собаки, содержащий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности, представленной в любой из SEQ ID NO:5-8. Также описаны варианты CH3-области IgG собаки, содержащие аминокислотную последовательность, которая отличается от любой из SEQ ID NO:5-8 на 1-15 аминокислот.
В некоторых случаях в этом раскрытии описан вариант Fc-области IgG собак, содержащий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности, представленной в любой из SEQ ID NO: 9-12. Также раскрыты варианты Fc-области IgG собак, содержащие аминокислотную последовательность, которая отличается от любой из SEQ ID NO: 9-12 на 1-20 аминокислот.
В некоторых случаях по меньшей мере одна (например, 1, 2 или 3) из следующих областей в варианте CH2-области Fc IgG собаки идентичны соответствующим областям в CH2-области Fc IgG собаки дикого типа:
положения 250-256 аминокислот;
положения 285-288 аминокислот; и
положения 307-315 аминокислот, причем положения аминокислот основаны на нумерации ЕС. В некоторых случаях все вышеперечисленные области в варианте CH2-области Fc IgG собаки идентичны соответствующим областям в CH2-области Fc IgG собаки дикого типа.
В некоторых случаях по меньшей мере одна (например, 1 или 2) из следующих областей в варианте CH3-области Fc IgG собаки идентичны соответствующим областям в CH3-области Fc IgG собаки дикого типа:
положения 376-380 аминокислот; и
положения 428-436 аминокислот, причем положения аминокислот основаны на нумерации ЕС. В некоторых случаях все вышеперечисленные области в варианте CH3-области Fc IgG собаки идентичны соответствующим областям в CH3-области Fc IgG собаки дикого типа.
В некоторых случаях по меньшей мере одна (например, 1, 2, 3, 4 или 5) из следующих областей в варианте Fc IgG собаки идентичны соответствующим областям в Fc IgG собаки дикого типа:
положения 250-256 аминокислот;
положения 285-288 аминокислот;
положения 307-315 аминокислот;
положения 376-380 аминокислот; и
положения 428-436 аминокислот, причем положения аминокислот основаны на нумерации ЕС. В некоторых случаях все следующих областей в варианте Fc IgG собаки идентичны соответствующим областям в Fc IgG собаки дикого типа.
В других вариантах осуществления представлен полипептид или полипептиды, содержащие вариант CH2-области Fc IgG собаки, вариант CH2-области, содержащий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности, представленной в любой из SEQ ID NO:1-4.
В некоторых вариантах осуществления описан полипептид или полипептиды, содержащие вариант CH3-области Fc IgG собаки, причем вариант CH3-области содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности, представленной в любой из SEQ ID NO:5-8.
В некоторых вариантах осуществления описан полипептид или полипептиды, содержащие вариант Fc-области IgG собак, причем вариант Fc-области содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности, представленной в любой из SEQ ID NO: 9-12.
В некоторых случаях описанный выше полипептид или полипептиды содержит (содержат) CH2-область IgG собаки, содержащую одну или несколько (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12) из:
аминокислоты, отличной от аминокислоты дикого типа, находящейся в положении 250 аминокислоты,
аминокислоты, отличной от аминокислоты дикого типа, находящейся в положении 251 аминокислоты,
аминокислоты, отличной от аминокислоты дикого типа, находящейся в положении 252 аминокислоты,
аминокислоты, отличной от аминокислоты дикого типа, находящейся в положении 254 аминокислоты,
аминокислоты, отличной от аминокислоты дикого типа, находящейся в положении 256 аминокислоты,
аминокислоты, отличной от аминокислоты дикого типа, находящейся в положении 285 аминокислоты,
аминокислоты, отличной от аминокислоты дикого типа, находящейся в положении 286 аминокислоты,
аминокислоты, отличной от аминокислоты дикого типа, находящейся в положении 307 аминокислоты,
аминокислоты, отличной от аминокислоты дикого типа, находящейся в положении 308 аминокислоты,
аминокислоты, отличной от аминокислоты дикого типа, находящейся в положении 309 аминокислоты,
аминокислоты, отличной от аминокислоты дикого типа, находящейся в положении 311 аминокислоты или
аминокислоты, отличной от аминокислоты дикого типа, находящейся в положении 315 аминокислоты,
причем положения аминокислот основаны на нумерации ЕС IgG.A, IgG.B, IgG.C и IgG.D собачьих антител.
В некоторых вариантах осуществления описанный выше полипептид или полипептиды содержит (содержат) CH3-область IgG собаки, содержащую одну или несколько (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8) из:
аминокислоты, отличной от аминокислоты дикого типа, находящейся в положении 378 аминокислоты,
аминокислоты, отличной от аминокислоты дикого типа, находящейся в положении 380 аминокислоты,
аминокислоты, отличной от аминокислоты дикого типа, находящейся в положении 428 аминокислоты,
аминокислоты, отличной от аминокислоты дикого типа, находящейся в положении 430 аминокислоты,
аминокислоты, отличной от аминокислоты дикого типа, находящейся в положении 433 аминокислоты,
аминокислоты, отличной от аминокислоты дикого типа, находящейся в положении 434 аминокислоты,
аминокислоты, отличной от аминокислоты дикого типа, находящейся в положении 435 аминокислоты, или
аминокислоты, отличной от аминокислоты дикого типа, находящейся в положении 436 аминокислоты,
причем положения аминокислот основаны на нумерации ЕС IgG.A, IgG.B, IgG.C и IgG.D собачьих антител.
В некоторых вариантах осуществления описанный выше полипептид или полипептиды содержат Fc-область IgG собаки, содержащую одну или несколько (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20) из:
аминокислоты, отличной от аминокислоты дикого типа, находящейся в положении 250 аминокислоты,
аминокислоты, отличной от аминокислоты дикого типа, находящейся в положении 251 аминокислоты,
аминокислоты, отличной от аминокислоты дикого типа, находящейся в положении 252 аминокислоты,
аминокислоты, отличной от аминокислоты дикого типа, находящейся в положении 254 аминокислоты,
аминокислоты, отличной от аминокислоты дикого типа, находящейся в положении 256 аминокислоты,
аминокислоты, отличной от аминокислоты дикого типа, находящейся в положении 285 аминокислоты,
аминокислоты, отличной от аминокислоты дикого типа, находящейся в положении 286 аминокислоты,
аминокислоты, отличной от аминокислоты дикого типа, находящейся в положении 307 аминокислоты,
аминокислоты, отличной от аминокислоты дикого типа, находящейся в положении 308 аминокислоты,
аминокислоты, отличной от аминокислоты дикого типа, находящейся в положении 309 аминокислоты,
аминокислоты, отличной от аминокислоты дикого типа, находящейся в положении 311 аминокислоты,
аминокислоты, отличной от аминокислоты дикого типа, находящейся в положении 315 аминокислоты,
аминокислоты, отличной от аминокислоты дикого типа, находящейся в положении 378 аминокислоты,
аминокислоты, отличной от аминокислоты дикого типа, находящейся в положении 380 аминокислоты,
аминокислоты, отличной от аминокислоты дикого типа, находящейся в положении 428 аминокислоты,
аминокислоты, отличной от аминокислоты дикого типа, находящейся в положении 430 аминокислоты,
аминокислоты, отличной от аминокислоты дикого типа, находящейся в положении 433 аминокислоты,
аминокислоты, отличной от аминокислоты дикого типа, находящейся в положении 434 аминокислоты,
аминокислоты, отличной от аминокислоты дикого типа, находящейся в положении 435 аминокислоты,
аминокислоты, отличной от аминокислоты дикого типа, находящейся в положении 436 аминокислоты,
причем положения аминокислот основаны на нумерации ЕС IgG.A, IgG.B, IgG.C и IgG.D собачьих антител.
Настоящее раскрытие охватывает замены, которые, включают одну или несколько (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20) из тех, что раскрыты в таблице 1.
Таблица 1
В некоторых случаях настоящее раскрытие охватывает замены, которые, включают одну или несколько (например, 1, 2, 3 или 4) из тех, что раскрыты в таблице 2.
Таблица 2
Это раскрытие охватывает все возможные комбинации и перестановки замен, раскрытые выше. В некоторых случаях замены включают одну или несколько следующих замен:
(i) Tyr в положении 252 аминокислоты, Thr в положении 254 аминокислоты и Glu в положении 256 аминокислоты;
(ii) Leu в положении 428 аминокислоты и Ser в положении 434 аминокислоты;
(iii) Asp в положении 256 аминокислоты, Arg в положении 307 аминокислоты и Val в положении 311 аминокислоты;
(iv) Asp в положении 256 аминокислоты, Asp в положении 315 аминокислоты и Val в положении 378 аминокислоты;
(v) Asp в положении 256 аминокислоты, Asp в положении 286 аминокислоты, Arg в положении 307 аминокислоты и Val в положении 311 аминокислоты;
(vi) Asn в положении 285 аминокислоты, Gln в положении 307 аминокислоты и Asp в положении 315 аминокислоты;
(vii) Asp в положении 256 аминокислоты, Arg в положении 307 аминокислоты, Val в положении 311 аминокислоты и Val в положении 378 аминокислоты;
(viii) Asp в положении 285 аминокислоты, Val в положении 311 аминокислоты и Val в положении 378 аминокислоты;
(ix) Asp в положении 256 аминокислоты, Asp в положении 285 аминокислоты и Val в положении 378 аминокислоты;
(x) Asp в положении 256 аминокислоты, Val в положении 311 аминокислоты и Val в положении 378 аминокислоты;
(xi) Asp в положении 256 аминокислоты, Asp в положении 285 аминокислоты, Asp в положении 286 аминокислоты, Arg в положении 307 аминокислоты и Val в положении 378 аминокислоты;
(xii) Asp в положении 256 аминокислоты, Asp в положении 286 аминокислоты, Arg в положении 307 аминокислоты, Val в положении 311 аминокислоты и Val в положении 378;
(xiii) Gln в положении 307 аминокислоты, Val в положении 311 аминокислоты и Val в положении 378 аминокислоты;
(xiv) Asp в положении 285 аминокислоты, Gln в положении 307 аминокислоты и Val в положении 378 аминокислоты;
(xv) Asp в положении 256 аминокислоты, Asp в положении 285 аминокислоты, Arg в положении 307 аминокислоты, Val в положении 311 аминокислоты и Val в положении 378 аминокислоты;
(xvi) Gln в положении 307 аминокислоты, Ala в положении 380 аминокислоты, Ser или Ala в положении 434 аминокислоты;
(xvii) Leu в положении 428 аминокислоты, и Ser или Ala в положении 434 аминокислоты;
(xviii) Gln в положении 250 аминокислоты и Leu в положении 428 аминокислоты;
(xix) Glu в положении 250 аминокислоты и Glu в положении 251 аминокислоты;
(xx) Phe в положении 256 аминокислоты и Phe в положении 309 аминокислоты;
(xxi) Ala в положении 430 аминокислоты и Lys в положении 433 аминокислоты;
(xxii) Phe в положении 434 аминокислоты и His в положении 436 аминокислоты;
(xxiii) Tyr в положении 435 аминокислоты и His в положении 436 аминокислоты;
В некоторых случаях замены не содержат комбинацию Tyr в положении 252 аминокислоты, Thr в положении 254 аминокислоты и Glu в положении 256 аминокислоты.
Замены можно сделать в одной или обеих цепях домена CH2, домена CH3 или домена Fc. В некоторых случаях замены в обеих цепях домена CH2, домена CH3 или домена Fc являются идентичными. В некоторых случаях замены в обеих цепях домена CH2, домена CH3 или домена Fc являются не идентичными. В некоторых случаях Fc-область содержит одну или несколько дополнительных замен, которые увеличивают или снижают эффекторную функцию, улучшают гетерогенность продукта.
Другие замены, которые можно комбинировать с заменами, улучшающими период полужизни
Разработка терапевтического полипептида/белка (например, моноклонального антитела) является сложным процессом, который влечет за собой координацию сложного набора действий для получения нужного полипептида/белка. Они включают оптимизацию специфичности, аффинности, функциональной активности, уровня экспрессии в сконструированных клеточных линиях, долгосрочную стабильность, устранение или усиление эффекторных функций и разработку коммерчески жизнеспособных методов получения и очистки. Это раскрытие охватывает любую дополнительную замену, которая способствует достижению одной или нескольких из вышеуказанных целей.
В некоторых вариантах осуществления замены вводят для уменьшения эффекторной функции Fc-области собаки. Такие замены могут быть в одном или нескольких (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6 или 7) из следующих положений IgG собаки (нумерация согласно нумерации ЕС): 238, 265, 297, 298, 299, 327 и 329. замена (замены) могут быть в любой из других 19 аминокислот. В некоторых случаях замена является консервативной. В некоторых неограничивающих случаях замещенной аминокислотой в положении 238 является Ala; замещенной аминокислотой в положении 265 является Ala; замещенной аминокислотой в положении 297 является Ala или Gln; замещенной аминокислотой в положении 298 является Pro; замещенной аминокислотой в положении 299 является Ala; замещенной аминокислотой в положении 327 является Gly; и замещенной аминокислотой в положении 329 является Ala. В некоторых случаях вариантная Fc-область происходит из IgG.B или IgG.C антитела собаки.
В некоторых вариантах осуществления замены вводят в Fc-область IgG собаки дикого типа для улучшения связывания с белком А, чтобы облегчить очистку с помощью хроматографии белка А. Такие замены могут быть в одном или обоих (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6 или 7) из следующих положений IgG собаки (нумерация согласно нумерации ЕС): 252 и 254. замена (замены) могут быть в любой из других 19 аминокислот. В некоторых случаях замена является консервативной. В некоторых неограничивающих случаях замещенной аминокислотой в положении 252 является Met; и замещенной аминокислотой в положении 254 является Ser.
В некоторых вариантах осуществления замены производят для изменения аффинности связывания с FcRn по сравнению с исходным полипептидом или полипептидом дикого типа (например, для увеличения или уменьшения аффинности связывания с FcRn). В некоторых вариантах модификацией может быть одна, две, три или четыре модификации, которые выбирают из группы, состоящей из: 308F, 428L, 434M и 434S, где нумерация соответствует нумерации ЕС. В некоторых вариантах осуществления вариант Fc содержит одну или несколько модификаций, выбранных из группы, состоящей из: 252Y/428L, 428L/434H, 428L/434F, 428L/434Y, 428L/434A, 428L/434M и 428L/434S, где нумерация соответствует нумерации ЕС. В некоторых вариантах осуществления вариант Fc содержит одну или несколько модификаций, выбранных из группы, состоящей из: 428L/434S, 308F/428L/434S, где нумерация соответствует нумерации ЕС. В некоторых вариантах осуществления вариант Fc содержит одну или несколько модификаций, выбранных из группы, состоящей из: 259I/434S, 308F/434S, 308F/428L/434S, 259I/308F/434S, 307Q/308F/434S, 250I/308F/434S и 308F/319L/434S, где нумерация соответствует нумерации ЕС. Подробное описание этих модификаций приведено, например, в US8883973B2, который полностью включен в настоящее описание посредством ссылки.
В некоторых вариантах осуществления полипептид содержит шарнирную область собачьих антител. В некоторых вариантах осуществления для увеличения периода полужизни можно произвести модификации шарнирной области собачьих антител. В некоторых вариантах осуществления модификацией является 228P согласно нумерации ЕС.
В некоторых вариантах осуществления связывание с FcRn зависит от pH. H310 и H435 (нумерация ЕС) могут быть критически важны для для зависимого от pH связывания. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления аминокислотой в положении 310 (нумерация ЕС) является гистидин. В некоторых вариантах осуществления аминокислотой в положении 435 (нумерация ЕС) является гистидин. В некоторых вариантах осуществления аминокислоты в обоих положениях представляют собой гистидин.
В некоторых вариантах осуществления Fc-область имеет мутации LALA (мутации L234A и L235A в нумерации ЕС) или мутации LALA-PG (мутации L234A, L235A, P329G в нумерации ЕС). В некоторых вариантах осуществления аминокислотный остаток в положении 234 (нумерация ЕС) представляет собой Ala. В некоторых вариантах осуществления аминокислотный остаток в положении 234 (нумерация ЕС) представляет собой Ala. В некоторых вариантах осуществления аминокислотные остатки в положениях 234 и 235 (нумерация ЕС) представляют собой Ala.
Полипептиды, содержащие варианты Fc IgG собаки
Раскрытие охватывает любой полипептид, для которого может быть полезно увеличенный период полужизни у собаки. Для увеличения периода полужизни эти полипептиды конструируют так, чтобы они содержали вариант Fc-области (например, CH2-область, CH3-область, область CH2+CH3), раскрытый выше.
Иллюстративные полипептиды включают, но без ограничения, целые антитела, scFv, нанотела, связывающие лиганды части рецептора, цитокины, факторы роста, ферменты и пептиды. Например, вариант домена CH3, раскрытый выше, может быть соединен с нанотелом scFv, связывающей лиганд частью рецептора (например, связывающей лиганд частью IL-13Rα1 или IL-13Rα2 собаки), цитокином, фактором роста, ферментом или пептидом. Альтернативно, вариант Fc-области, раскрытый выше, может быть соединен с этими полипептидами. В другом варианте осуществления собачье или канинизированное антитело модифицируют таким образом, чтобы оно содержало вариант Fc-области, раскрытый в настоящем описании.
В некоторых вариантах осуществления полипептиды согласно данному раскрытию содержат шарнирную область антитела. шарнирную область можно поместить между антигеном или связывающим лиганд доменом полипептида и варианта Fc-области. В некоторых случаях шарнирная область соединена с C-концом цитокина, фактором роста, ферментом или пептидом, и шарнирная область соединена с N-концом варианта Fc-области. Ниже представлены иллюстративные последовательности шарнирной области.
IgG.A: FNECRCTDTPPCPVPEP (SEQ ID NO: 17);
IgG.B: PKRENGRVPRPPDCPKCPAPEM (SEQ ID NO: 18);
IgG.C: AKECECKCNCNNCPCPGCGL (SEQ ID NO: 19);
IgG.D: PKESTCKCISPCPVPES (SEQ ID NO: 20); и
IgG.Dmut: PKESTCKCIPPCPVPES (SEQ ID NO: 21).
При использовании, шарнирная область в рекомбинантном белке согласно данному раскрытию может содержать от нуля до шести (то есть 0, 1, 2, 3, 4, 5 или 6) аминокислотных замен относительно аминокислотной последовательности, представленной в любой из SEQ ID NO:17-21. В некоторых случаях шарнирная область, использованная в рекомбинантном белке согласно данному раскрытию, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности, представленной в любой из SEQ ID NO:17-21.
В некоторых вариантах осуществления для соединения полипептида (например, антител, связывающих лиганды доменов рецепторов, ферментов, лигандов, пептидов) с вариантами Fc-области собаки, раскрытыми в настоящем описании, вместо шарнирной последовательности антитела можно использовать линкерную последовательность. В некоторых вариантах осуществления линкер состоит из 1-20 аминокислот, связанных пептидными связями, причем аминокислоты выбирают из 20 существующих в природе аминокислот. Некоторые из этих аминокислот можно гликозилировать, как хорошо понятно специалистам в данной области. В других вариантах осуществления 1-20 аминокислот выбирают из глицина, аланина, пролина, аспарагина, глутамина и лизина. В других вариантах осуществления линкер состоит в основном из аминокислот, которые являются стерически незатрудненными, таких как глицин и аланин. Примеры пептидных линкеров включают: Gly, Ser; Gly Ser; Gly Gly Ser; Ser Gly Gly; Gly Gly Gly Ser (SEQ ID NO:22); Ser Gly Gly Gly (SEQ ID NO:23); Gly Gly Gly Gly Ser (SEQ ID NO:24); Ser Gly Gly Gly Gly (SEQ ID NO:25); Gly Gly Gly Gly Gly Ser (SEQ ID NO:26); Ser Gly Gly Gly Gly Gly (SEQ ID NO:27); Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser (SEQ ID NO:28); Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly (SEQ ID NO:29); (Gly Gly Gly Gly Ser)n (SEQ ID NO:24)n, где n представляет целое число из одного или более (например, 1, 2, 3, 4, 5); и (Ser Gly Gly Gly Gly)n (SEQ ID NO:25)n, где n представляет целое число из одного или более (например, 1, 2, 3, 4, 5).
Непептидные линкеры также можно использовать для связывания интересующего полипептида или полипептидов с вариантом Fc-области, раскрытым в настоящем описании. Например, можно использовать алкильные линкеры, такие как −NH(CH2)nC(O)−, где n=2-20. Эти алкильные линкеры могут быть дополнительно замещены любой стерически незатрудненной группой, такой как низший алкил (например, C1-C6) низший ацил, галоген (например, Cl, Br), CN, NH2, фенил и так далее
полипептид или полипептиды согласно данному раскрытию могут содержать связывающий домен. связывающий домен может специфически связываться с белком, субъединицей, доменом, мотивом и/или эпитопом выбранной мишени, описанной в настоящем описании. В некоторых вариантах осуществления полипептид или полипептиды (например, полипептид слияния) могут содержать белок, причем белок представляет собой терапевтический белок, описанный в настоящем описании. В некоторых вариантах осуществления мишень (например, для мишени связывающего домена) или терапевтических белок (например, для полипептида слияния) выбирают из группы, состоящей из: 17-IA, 4-1BB, 4Dc, 6-кето-PGF1a, 8-изо-PGF2a, 8-оксо-dG, аденозинового рецептора A1, A33, ACE, ACE-2, активина, активина A, активина AB, активина B, активина C, активина RIA, активина RIA ALK-2, активина RIB ALK-4, активина RIIA, активина RIIB, ADAM, ADAM10, ADAM12, ADAM15, ADAM17/TACE, ADAMS, ADAM9, ADAMTS, ADAMTS4, ADAMTS5, адрессинов, aFGF, ALCAM, ALK, ALK-1, ALK-7, альфа-1-антитрипсина, антагониста альфа-V/бета-1, ANG, Ang, APAF-1, APE, APJ, APP, APRIL, AR, IgE, рецептора ангиотензина 1 типа (AT1), рецептора ангиотензина 2 типа (AT2), ARC, ART, артемина, анти-Id, ASPARTIC, предсердного натрийуретического фактора, интегрин av/b3, Axl, b2M, B7-1, B7-2, B7-H, стимулятора B-лимфоцитов (BlyS), BACE, BACE-1, Bad, BAFF, BAFF-R, Bag-1, BAK, Bax, BCA-1, BCAM, Bcl, BCMA, BDNF, b-ECGF, bFGF, BID, Bik, BIM, BLC, BL-CAM, BLK, BMP, BMP-2 BMP-2a, остеогенина BMP-3, BMP-4 BMP-2b, BMP-5, BMP-6 Vgr-1, BMP-7 (OP-1), BMP-8 (BMP-8a, OP-2), BMPR, BMPR-IA (ALK-3), BMPR-IB (ALK-6), BRK-2, RPK-1, BMPR-II (BRK-3), BMP, b-NGF, BOK, бомбензина, костного нейротрофического фактора, BPDE, BPDE-DNA, BTC, фактора комплемента 3 (C3), C3a, C4, C5, C5a, C10, CA125, CAD-8, кальцитонина, cAMP, карциноэмбрионального антигена (CEA), связанного с карциномой антигена, катепсина A, катепсина B, катепсина C/DPPI, катепсина D, катепсина E, катепсина H, катепсина L, катепсина O, катепсина S, катепсина V, катепсина X/Z/P, CBL, CC1, CCK2, CCL, CCL1, CCL11, CCL12, CCL13, CCL14, CCL15, CCL16, CCL17, CCL18, CCL19, CCL2, CCL20, CCL21, CCL22, CCL23, CCL24, CCL25, CCL26, CCL27, CCL28, CCL3, CCL4, CCL5, CCL6, CCL7, CCL8, CCL9/10, CCR, CCR1, CCR10, CCR10, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, CCR9, CD1, CD2, CD3, CD3E, CD4, CD5, CD6, CD7, CD8, CD10, CD11a, CD11b, CD11c, CD13, CD14, CD15, CD16, CD18, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD25, CD27L, CD28, CD29, CD30, CD30L, CD32, CD33 (белков p67), CD34, CD38, CD40, CD40L, CD44, CD45, CD46, CD47, CD49a, CD52, CD54, CD55, CD56, CD61, CD64, CD66e, CD74, CD80 (B7-1), CD89, CD95, CD123, CD137, CD138, CD140a, CD146, CD147, CD148, CD152, CD164, CEACAM5, CFTR, cGMP, CINC, токсина Clostridium botulinum, токсина Clostridium perfringens, CKb8-1, CLC, CMV, CMV UL, CNTF, CNTN-1, COX, C-Ret, CRG-2, CT-1, CTACK, CTGF, CTLA-4, CX3CL1, CX3CR1, CXCL, CXCL1, CXCL2, CXCL3, CXCL4, CXCL5, CXCL6, CXCL7, CXCL8, CXCL9, CXCL10, CXCL11, CXCL12, CXCL13, CXCL14, CXCL15, CXCL16, CXCR, CXCR1, CXCR2, CXCR3, CXCR4, CXCR5, CXCR6, опухолеассоциированного антигена цитокератина, DAN, DCC, DcR3, DC-SIGN, фактора ускорения распада, des(1-3)-IGF-I (IGF-1 головного мозга), Dhh, дигоксина, DNAM-1, Dnase, Dpp, DPPIV/CD26, Dtk, ECAD, EDA, EDA-A1, EDA-A2, EDAR, EGF, EGFR (ErbB-1), EMA, EMMPRIN, ENA, рецептора эндотелина, энкефалиназы, eNOS, Eot, эотаксина1, EpCAM, эфрина B2/EphB4, EPO, ERCC, E-селектина, ET-1, фактора IIa, фактора VII, фактора VIIIc, фактора IX, белка активации фибробластов (FAP), Fas, FcR1, FEN-1, ферритина, FGF, FGF-19, FGF-2, FGF3, FGF-8, FGFR, FGFR-3, фибрина, FL, FLIP, Flt-3, Flt-4, фолликулостимулирующего гормона, фракталкина, FZD1, FZD2, FZD3, FZD4, FZD5, FZD6, FZD7, FZD8, FZD9, FZD10, G250, Gas 6, GCP-2, GCSF, GD2, GD3, GDF, GDF-1, GDF-3 (Vgr-2), GDF-5 (BMP-14, CDMP-1), GDF-6 (BMP-13, CDMP-2), GDF-7 (BMP-12, CDMP-3), GDF-8 (миостатина), GDF-9, GDF-15 (MIC-1), GDNF, GDNF, GFAP, GFRa-1, GFR-альфа1, GFR-альфа2, GFR-альфа3, GITR, GLP1, GLP2, глюкагона, Glut 4, гликопротеина IIb/IIIa (GP IIb/IIIa), GM-CSF, gp130, gp72, GRO, GnRH, фактора высвобождения гормона роста, гаптена (NP-cap или NIP-cap), HB-EGF, HCC, гликопротеин оболочки gB HCMV, гликопротеин оболочки gH HCMV, HCMV UL, гемопоэтического фактора роста (HGF), Hep B gp120, гепараназы, Her2, Her2/neu (ErbB-2), Her3 (ErbB-3), Her4 (ErbB-4), гликопротеина gB вируса простого герпеса (HSV), гликопротеина gD HSV, HGFA, высокомолекулярного антигена, ассоциированного с меланомой (HMW-MAA), HIV gp120, HIV IIIB gp120 V3 петли, HLA, HLA-DR, HM1,24, HMFG PEM, HRG, Hrk, кардиомиозина, цитомегаловируса (CMV), гормона роста (GH), HVEM, 1-309, IAP, ICAM, ICAM-1, ICAM-3, ICE, ICOS, IFNg, Ig, рецептора IgA, IgE, IGF, связывающих IGF белков, IGF-1R, IGFBP, IGF-I, IGF-II, IL, IL-1, IL-1R, IL-2, IL-2R, IL-4, IL-4R, IL-5, IL-5R, IL-6, IL-6R, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, IL-13, IL-15, IL-17, IL-18, IL-18R, IL-21, IL-22, IL-23, IL-25, IL-31, IL-33, рецептора интерлейкина (например, IL-1R, IL-2R, IL-4R, IL-5R, IL-6R, IL-8R, IL-9R, IL-10R, IL-12R, IL-13R, IL-15R, IL-17R, IL-18R, IL-21R, IL-22R, IL-23R, IL-25R, IL-31R, IL-33R), интерферона (INF)-альфа, INF-бета, INF-гамма, ингибина, iNOS, A-цепи инсулина, B-цепи инсулина, инсулиноподобного фактора роста 1, интегрина альфа2, интегрина альфа3, интегрина альфа4, интегрина альфа4/бета1, интегрина альфа4/бета7, интегрина альфа5 (альфаV), интегрина альфа5/бета1, интегрина альфа5/бета3, интегрина альфа6, интегрина бета1, интегрина бета2, интерферона гамма, IP-10, I-TAC, JE, калликреина 2, калликреина 5, калликреина 6, калликреина 11, калликреина 12, калликреина 14, калликреина 15, калликреина L1, калликреина L2, калликреина L3, калликреина L4, KC, KDR, фактора роста кератиноцитов (KGF), ламинина 5, LAMP, LAP, LAP (TGF-1), латентного TGF-1, латентного TGF-1 bp1, LBP, LDGF, LECT2, Lefty, антигена Lewis-Y, родственного Lewis-Y антигена, LFA-1, LFA-3, Lfo, LIF, LIGHT, липопротеинов, LIX, LKN, Lptn, L-селектина, LT-a, LT-b, LTB4, LTBP-1, сурфактанта легких, лютеинизирующего гормона, бета-рецептора лимфотоксина, Mac-1, MAdCAM, MAG, MAP2, MARC, MCAM, MCAM, MCK-2, MCP, M-CSF, MDC, Mer, металлопротеиназ, рецептора MGDF, MGMT, MHC(HLA-DR), MIF, MIG, MIP, MIP-1-альфа, MK, MMAC1, MMP, MMP-1, MMP-10, MMP-11, MMP-12, MMP-13, MMP-14, MMP-15, MMP-2, MMP-24, MMP-3, MMP-7, MMP-8, MMP-9, MPIF, Mpo, MSK, MSP, муцина (Muc1), MUC18, субстанция ингибитора Мюллера, Mug, MuSK, NAIP, NAP, NAV 1,7, NCAD, N-кадгерина, NCA 90, NCAM, NCAM, неприлизина, нейротрофина-3, -4 или -6, нейрурина, фактор роста нейронов (NGF), NGFR, NGF-бета, nNOS, NO, NOS, Npn, NRG-3, NT, NTN, OB, OGG1, OPG, OPN, OSM, OX40L, OX40R, p150, p95, PADPr, паратироидного гормона, PARC, PARP, PBR, PBSF, PCAD, P-кадгерина, PCNA, PD1, PDL1,PDGF, PDGF, PDK-1, PECAM, PEM, PF4, PGE, PGF, PGI2, PGJ2, PIN, PLA2, плацентарной щелочной фосфатазы (PLAP), P1GF, PLP, PP14, проинсулина, прорелаксина, белка C, PS, PSA, PSCA, простатоспецифического мембранного антигена (PSMA), PTEN, PTHrp, Ptk, PTN, R51, RANK, RANKL, RANTES, RANTES, A-цепи релаксина, релаксина B-цепи, ренина, респираторно-синцитиального вируса (RSV) F, RSV Fgp, Ret, ревматоидных факторы, RLIP76, RPA2, RSK, S100, SCF/KL, SDF-1, серина, сывороточного альбумина, sFRP-3, Shh, SIGIRR, SK-1, SLAM, SLPI, SMAC, SMDF, SMOH, SOD, SPARC, Stat, STEAP, STEAP-II, TACE, TACI, TAG-72 (ассоциированный с опухолью гликопротеина-72), TARC, TCA-3, Т-клеточных рецепторов (например, Т-клеточного рецептора альфа/бета), TdT, TECK, TEM1, TEM5, TEM7, TEM8, TERT, тестикулярной PLAP-подобной щелочной фосфатазы, TfR, TGF, TGF-альфа, TGF-бета, специфичного для панкреатина TGF-бета, TGF-бета R1 (ALK-5), TGF-бета R11, TGF-бета RIIb, TGF-бета RIII, TGF-бета1, TGF-бета2, TGF-бета3, TGF-бета4, TGF-бета5, тромбина, Ck-1 тимуса, тиреотропного гормона, Tie, TIMP, TIQ, тканевого фактора, TMEFF2, Tmpo, TMPRSS2, TNF, TNF-альфа, TNF-альфа бета, TNF-бета2, TNFc, TNF-RI, TNF-RII, TNFRSF10A (TRAIL R1Apo-2, DR4), TNFRSF10B (TRAIL R2DR5, KILLER, TRICK-2A, TRICK-B), TNFRSF10C (TRAIL R3DcR1, LIT, TRID), TNFRSF10D (TRAIL R4 DcR2, TRUNDD), TNFRSF11A (RANK ODF R, TRANCE R), TNFRSF11B (OPG OCIF, TR1), TNFRSF12 (TWEAK R FN14), TNFRSF13B (TACI), TNFRSF13C (BAFF R), TNFRSF14 (HVEM ATAR, HveA, LIGHT R, TR2), TNFRSF16 (NGFR p75NTR), TNFRSF17 (BCMA), TNFRSF18 (GITR AITR), TNFRSF19 (TROY TAJ, TRADE), TNFRSF19L (RELT), TNFRSF1A (TNF R1CD120a, p55-60), TNFRSF1B (TNF RII CD120b, p75-80), TNFRSF26 (TNFRH3), TNFRSF3 (LTbR TNF RIII, TNFC R), TNFRSF4 (OX40 ACT35, TXGP1 R), TNFRSF5 (CD40 p50), TNFRSF6 (Fas Apo-1, APT1, CD95), TNFRSF6B (DcR3M68, TR6), TNFRSF7 (CD27), TNFRSF8 (CD30), TNFRSF9 (4-1BB CD137, ILA), TNFRSF21 (DR6), TNFRSF22 (DCTRAIL R2 TNFRH2), TNFRST23 (DCTRAIL R1TNFRH1), TNFRSF25 (DR3Apo-3, LARD, TR-3, TRAMP, WSL-1), TNFSF10 (лиганда Apo-2 TRAIL, TL2), TNFSF11 (TRANCE/RANK лиганда ODF, лиганда OPG), TNFSF12 (лиганда Apo-3 TWEAK, лиганда DR3), TNFSF13 (APRIL TALL2), TNFSF13B (BAFF BLYS, TALL1, THANK, TNFSF20), TNFSF14 (лиганда LIGHT HVEM, LTg), TNFSF15 (TL1A/VEGI), TNFSF18 (лиганда GITR лиганда AITR, TL6), TNFSF1A (конектина TNF-a, DIF, TNFSF2), TNFSF1B (TNF-b LTa, TNFSF1), TNFSF3 (LTb TNFC, p33), TNFSF4 (лиганда OX40 gp34, TXGP1), TNFSF5 (лиганда CD40 CD154, gp39, HIGM1, IMD3, TRAP), TNFSF6 (лиганда Fas лиганда Apo-1, лиганда APT1), TNFSF7 (лиганда CD27 CD70), TNFSF8 (лиганда CD30 CD153), TNFSF9 (лиганда 4-1BB лиганда CD137), TP-1, t-PA, Tpo, TRAIL, TRAIL R, TRAIL-R1, TRAIL-R2, TRANCE, рецептора трансферрина, TRF, Trk (например, TrkA), TROP-2, TSG, TSLP, ассоциированного с опухолью антигена CA 125, родственного Lewis Y углевода, экспрессирующего ассоциированный с опухолью антиген, TWEAK, TXB2, Ung, UPAR, uPAR-1, урокиназы, VCAM, VCAM-1, VECAD, VE-кадгерина, VE-кадгерина-2, VEFGR-1 (fit-1), VEGF, VEGFR, VEGFR-3 (flt-4), VEGI, VIM, вирусных антигенов, VLA, VLA-1, VLA-4, интегрина VNR, фактора фон Виллебранда, WIF-1, WNT1, WNT2, WNT2B/13, WNT3, WNT3A, WNT4, WNT5A, WNT5B, WNT6, WNT7A, WNT7B, WNT8A, WNT8B, WNT9A, WNT9A, WNT9B, WNT10A, WNT10B, WNT11, WNT16, XCL1, XCL2, XCR1, XCR1, XEDAR, XIAP, XPD и рецепторов для гормонов и фактора роста.
В некоторых вариантах осуществления связывающий домен специфически связывается с одной или несколькими терапевтическими мишенями или антигенами у собак, такими как, но без ограничения, ACE, ACE-2, активин, активин A, активин AB, активин B, активин C, активин RIA, активин RIA ALK-2, активин RIB ALK-4, активин RIIA, активин RIIB, ADAM, ADAM10, ADAM12, ADAM15, ADAM17/TACE, ADAMS, ADAM9, ADAMTS, ADAMTS4, ADAMTS5, ANG, Ang, рецептор ангиотензина 1 типа (AT1), рецептор ангиотензина 2 типа (AT2), предсердный натрийуретический фактор, интегрин av/b3, b-ECGF, CD19, CD20, CD30, CD34, CD40, CD40L, CD47, COX, CTLA-4, EGFR (ErbB-1), EPO, фолликулостимулирующий гормон, GDF-8 (миостатин), GLP1, GLP2, GnRH, фактор высвобождения гормона роста, IgE, IL, IL-1, IL-1R, IL-2, IL-2R, IL-4, IL-4R, IL-5, IL-5R, IL-6, IL-6R, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, IL-13, IL-15, IL-17, IL-18, IL-18R, IL-21, IL-22, IL-23, IL-25, IL-31, IL-33, рецептор интерлейкина (например, IL-1R, IL-2R, IL-4R, IL-5R, IL-6R, IL-8R, IL-9R, IL-10R, IL-12R, IL-13R, IL-15R, IL-17R, IL-18R, IL-21R, IL-22R, IL-23R, IL-25R, IL-31R, IL-33R), LAP (TGF-1), латентный TGF-1, латентный TGF-1 bp1, LFA-1, фактор роста нейронов (NGF), NGFR, NGF-бета, OX40L, OX40R, PD1, PDL1, TGF, TGF-альфа, TGF-бета, специфичный для панкреатина TGF-бета, TGF-бета R1 (ALK-5), TGF-бета R11, TGF-бета RIIb, TGF-бета RIII, TGF-бета1, TGF-бета2, TGF-бета3, TGF-бета4, TGF-бета5, TNF, TNF-альфа, TNF-альфа бета, TNF-бета2, TNFc, TNF-RI, TNF-RII, TNFRSF16 (NGFR p75NTR), TNFRSF9 (4-1BB CD137, ILA), VEFGR-1 (fit-1), VEGF, VEGFR и VEGFR-3 (flt-4).
В некоторых вариантах осуществления полипептид или полипептиды могут содержать белок, причем белок представляет собой терапевтический белок, например, EPO, CTLA4, LFA3, VEGFR1/VEGFR3, IL-1R, IL-4R, агонист рецептора GLP-1 или связывающий тромбопоэтин пептид. В некоторых вариантах осуществления терапевтический белок представляет собой ACE, ACE-2, активин, активин A, активин AB, активин B, активин C, активин RIA, активин RIA ALK-2, активин RIB ALK-4, активин RIIA, активин RIIB, ADAM, ADAM10, ADAM12, ADAM15, ADAM17/TACE, ADAMS, ADAM9, ADAMTS, ADAMTS4, ADAMTS5, ANG, Ang, рецептор ангиотензина 1 типа (AT1), рецептор ангиотензина 2 типа (AT2), предсердный натрийуретический фактор, интегрин av/b3, b-ECGF, CD19, CD20, CD30, CD34, CD40, CD40L, CD47, COX, CTLA-4, EGFR (ErbB-1), EPO, фолликулостимулирующий гормон, GDF-8 (миостатин), GLP1, GLP2, GnRH, фактор высвобождения гормона роста, IgE, IL, IL-1, IL-1R, IL-2, IL-2R, IL-4, IL-4R, IL-5, IL-5R, IL-6, IL-6R, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, IL-13, IL-15, IL-17, IL-18, IL-18R, IL-21, IL-22, IL-23, IL-25, IL-31, IL-33, рецептор интерлейкина (например, IL-1R, IL-2R, IL-4R, IL-5R, IL-6R, IL-8R, IL-9R, IL-10R, IL-12R, IL-13R, IL-15R, IL-17R, IL-18R, IL-21R, IL-22R, IL-23R, IL-25R, IL-31R, IL-33R), LAP (TGF-1), латентный TGF-1, латентный TGF-1 bp1, LFA-1, фактор роста нейронов (NGF), NGFR, NGF-бета, OX40L, OX40R, PD1, PDL1, TGF, TGF-альфа, TGF-бета, специфичный для панкреатина TGF-бета, TGF-бета R1 (ALK-5), TGF-бета R11, TGF-бета RIIb, TGF-бета RIII, TGF-бета1, TGF-бета2, TGF-бета3, TGF-бета4, TGF-бета5, TNF, TNF-альфа, TNF-альфа бета, TNF-бета2, TNFc, TNF-RI, TNF-RII, TNFRSF16 (NGFR p75NTR), TNFRSF9 (4-1BB CD137, ILA), VEFGR-1 (fit-1), VEGF, VEGFR или VEGFR-3 (flt-4).
В некоторых вариантах осуществления терапевтический белок представляет собой любой белок, описанный в настоящем описании. В некоторых вариантах осуществления полипептид или полипептиды дополнительно содержат домен CH2 IgG собаки, домен CH3 IgG или Fc-область IgG, как описано в настоящем описании. модифицированный домен CH2 IgG собаки, домен CH3 IgG или Fc-область IgG могут увеличивать период полужизни терапевтических белков in vivo.
Фармацевтические композиции
Для получения фармацевтических или стерильных композиций полипептида или полипептидов, описанных в настоящем описании, полипептид или полипептиды можно смешать с фармацевтически приемлемым носителем или эксципиентом. (см., например, Remington’s Pharmaceutical Sciences and U.S. Pharmacopeia: National Formulary, Mack Publishing Company, Easton, Pa. (1984)).
Составы терапевтических и диагностических средств можно получать путем смешивания с приемлемыми носителями, эксципиентами или стабилизаторами в виде, например, лиофилизированных порошков, полужидких масс, водных растворов или суспензий (см., например, Hardman, et al. (2001) Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, McGraw-Hill, New York, N.Y.; Gennaro (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott, Williams, and Wilkins, New York, N.Y.; Avis, et al. (eds.) (1993) Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications, Marcel Dekker, NY; Lieberman, et al. (eds.) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets, Marcel Dekker, NY; Lieberman, et al. (eds.) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems, Marcel Dekker, NY; Weiner and Kotkoskie (2000) Excipient Toxicity and Safety, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y.). В одном варианте осуществления полипептид или полипептиды согласно настоящему изобретению разбавляют до подходящей концентрации в растворе ацетата натрия pH 5-6, а для придания тоничности добавляют NaCl или сахарозу. для повышения стабильности можно добавлять дополнительные средства, такие как полисорбат 20 или полисорбат 80.
Токсичность и терапевтическая эффективность полипептидных композиций, вводимых отдельно или в комбинации с другим средством, можно определить стандартными фармацевтическими процедурами на культурах клеток или экспериментальных животных, например, для определения LD50 (летальной дозы до 50% популяции) и ED50 (дозы, терапевтически эффективной в 50% популяции). Соотношение доз между токсическим и терапевтическим эффектами представляет собой терапевтический индекс (LD50/ED50). В конкретных аспектах нужны полипептиды или полипептиды, демонстрирующие высокие терапевтические индексы. Данные, полученные в результате этих анализов клеточных культур и исследований на животных, можно использовать для определения диапазона дозировок для применения у собак. дозировка таких соединений предпочтительно находится в диапазоне циркулирующих концентраций, которые включают ED50 с небольшой токсичностью или без нее. дозировку можно менять в этом диапазоне в зависимости от применяемой лекарственной формы и пути введения.
Режим введения может варьировать. Подходящие пути введения включают пероральный, ректальный, трансмукозальный, кишечный, парентеральный; внутримышечный, подкожный, внутрикожный, интрамедуллярный, интратекальный, прямой внутрижелудочковый, внутривенный, внутрибрюшинный, интраназальный, внутриглазный, ингаляционный, инсуффляционный, местный, кожный, трансдермальный или внутриартериальный. В некоторых вариантах осуществления полипептид или полипептиды можно вводить инвазивным путем, например, путем инъекции. В дополнительных вариантах осуществления полипептид или полипептиды вводят внутривенно, подкожно, внутримышечно, внутриартериально, внутриопухолево или путем ингаляции, с доставкой в виде аэрозоля.
Фармацевтические композиции, раскрытые в настоящем описании, также можно вводить путем инфузии. Примеры хорошо известных имплантатов и модулей для введения фармацевтических композиций включают: патент США № 4487603, в котором раскрыт имплантируемый микроинфузионный насос для дозирования лекарства с контролируемой скоростью; патент США № 4447233, в котором раскрыт насос для инфузии лекарств с доставкой лекарства с точной скоростью инфузии; патент США № 4447224, в котором раскрыт имплантируемое инфузионное устройство с регулируемым потоком для непрерывной доставки лекарственного средства; патент США № 4439196, в котором раскрыта осмотическая система доставки лекарственного средства, имеющая многокамерные отделения. специалистам в данной области хорошо известны многие другие такие имплантаты, системы доставки и модули.
Альтернативно, можно вводить полипептид или полипептиды местным, а не системным образом, например, путем инъекции антитела непосредственно в артритный сустав или вызванное патогеном поражение, характеризующееся иммунопатологией, часто в виде готовой формы с депо или замедленным высвобождением. Кроме того, можно вводить полипептид или полипептиды в системе направленной доставки лекарственного средства, например, в липосоме, покрытой тканеспецифическим антителом, нацеленной, например, на артритный сустав или вызванное патогеном поражение, характеризующееся иммунопатологией. липосомы будут нацелены на пораженную ткань и избирательно поглощаются ею.
Схема введения зависит от нескольких факторов, включая, без ограничения, возраст, массу тела и физическое состояние собаки, подлежащей лечению, скорость кругооборота терапевтического антитела в сыворотке или ткани, уровень симптомов, иммуногенность терапевтического полипептида или полипептидов и доступность клеток-мишеней в биологической матрице. Предпочтительно, схема введения обеспечивает доставку терапевтического полипептида или полипептидов в количестве, достаточном для улучшения целевого болезненного состояния, одновременно сводя к минимуму нежелательные побочные эффекты. Соответственно, количество доставляемого биологического вещества частично зависит от конкретного терапевтического полипептида или полипептидов и тяжести подлежащего лечению состояния. Доступны рекомендации по выбору подходящих доз терапевтических антител (см., например, Wawrzynczak Antibody Therapy, Bios Scientific Pub. Ltd, Oxfordshire, UK (1996); Milgrom et al. New Engl. J. Med. 341:1966-1973 (1999); Slamon et al. New Engl. J. Med. 344:783-792 (2001); Beniaminovitz et al. New Engl. J. Med. 342:613-619 (2000); Ghosh et al. New Engl. J. Med. 348:24-32 (2003); Lipsky et al. New Engl. J. Med. 343:1594-1602 (2000)).
Специалист в данной области производит определение подходящей дозы полипептида или полипептидов, например, с использованием параметров или факторов, известных или предполагаемых в данной области как влияющие на лечение. Обычно дозу начинают с количества, несколько меньшего, чем оптимальная доза, и после этого ее увеличивают с небольшими приращениями до тех пор, пока не будет достигнут желаемый или оптимальный эффект относительно любых отрицательных побочных эффектов. Важные диагностические измерения включают измерения симптомов, например, воспаления или уровня продуцируемых воспалительных цитокинов.
Нуклеиновые кислоты, векторы, клетки-хозяева и способы получения
Раскрытие также охватывает нуклеиновую кислоту или нуклеиновые кислоты, кодирующие полипептид или полипептиды, описанные в настоящем описании, вектор или векторы, содержащие нуклеиновую кислоту или нуклеиновые кислоты, и клетки-хозяева, содержащие нуклеиновую кислоту или нуклеиновые кислоты, или вектор или векторы.
Полипептид или полипептиды, описанные в настоящем описании, можно получать в бактериальных или эукариотических клетках. Некоторые полипептиды, например, Fab, можно получать в бактериальных клетках, например, клетках E. coli. Полипептиды также можно получать в эукариотических клетках, таких как трансформированные клеточные линии (например, CHO, 293E, COS, 293T, Hela). Кроме того, полипептиды (например, scFv) можно экспрессировать в дрожжевых клетках, таких как Pichia (см., например, Powers et al., J Immunol Methods. 251:123-35 (2001)), Hanseula или Saccharomyces. Для получения интересующего антитела конструируют полинуклеотид или полинуклеотиды, кодирующие полипептид или полипептиды, вводят в вектор экспрессии или векторы экспрессии, а затем, экспрессируют в подходящих клетках-хозяевах. Для улучшения экспрессии нуклеотидные последовательности генов можно перекодировать без изменения (или минимального изменения - например, удаления С-концевого остатка тяжелой или легкой цепи) аминокислотной последовательности. области для потенциального перекодирования включают области, связанные с инициацией трансляции, использованием кодонов и возможным непреднамеренным сплайсингом мРНК. рядовой специалист в данной области может легко представить полинуклеотиды, кодирующие вариант Fc-области, описанный в настоящем описании.
Стандартные методы молекулярной биологии можно использовать для получения рекомбинантного вектора (векторов) экспрессии, трансфекции клеток-хозяев, отбора трансформантов, культивирования клеток-хозяев и выделения полипептида (например, антитела).
Если полипептид или полипептиды нужно экспрессировать в бактериальных клетках (например, E. coli), вектор экспрессии должен иметь характеристики, позволяющие амплифицировать вектор в бактериальных клетках. Кроме того, когда в качестве хозяина используют E. coli, такую как JM109, DH5α, HB101 или XL1-Blue, вектор должен иметь промотор, например, промотор lacZ (Ward et al., 341:544-546 (1989). Промотор araB (Better et al., Science, 240:1041-1043 (1988)) или промотор T7, который может обеспечивать эффективную экспрессию в E. coli. Примеры таких векторов включают, например, векторы серии M13, векторы серии pUC, pBR322, pBluescript, pCR-Script, pGEX-5X-1 (Pharmacia), «QIAexpress system» (QIAGEN), pEGFP и pET (когда используют этот вектор экспрессии, хозяином предпочтительно является BL21, экспрессирующая РНК-полимеразу Т7. Вектор экспрессии может содержать сигнальную последовательность для секреции антител. Для продуцирования в периплазму E. coli сигнальную последовательность pelB (Lei et al., J. Bacteriol., 169:4379 (1987)) можно использовать в качестве сигнальной последовательности для секреции антитела. Для бактериальной экспрессии для введения вектора экспрессии в бактериальную клетку можно использовать методы хлорида кальция или методы электропорации.
Если полипептид или полипептиды нужно экспрессировать в клетках животных, таких как клетки CHO, COS и NIH3T3, вектор экспрессии содержит промотор, необходимый для экспрессии в этих клетках, например, промотор SV40 (Mulligan et al., Nature, 277:108 (1979)) (например, ранний промотор обезьяньего вируса 40), промотор MMLV-LTR, промотор EF1α (Mizushima et al., Nucleic Acids Res., 18:5322 (1990)) или промотор CMV (например, предранний промотор цитомегаловируса человека). В дополнение к последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей вариант Fc-области, рекомбинантные векторы экспрессии могут нести дополнительные последовательности, такие как последовательности, которые регулируют репликацию вектора в клетках-хозяевах (например, точки начала репликации) и селектируемые маркерные гены. селектируемый маркерный ген облегчает отбор клеток-хозяев, в которые был введен вектор (см., например, патенты США №№ 4399216, 4634665 и 5179017). Например, обычно селектируемый маркерный ген придает устойчивость к лекарственным средствам, таким как G418, гигромицин или метотрексат, клетке-хозяину, в которую был введен вектор. Примеры векторов с селектируемыми маркерами включают pMAM, pDR2, pBK-RSV, pBK-CMV, pOPRSV и pOP13.
В некоторых вариантах осуществления полипептид или полипептиды получают в клетках млекопитающих. Примеры клеток-хозяев млекопитающих для экспрессии полипептида или полипептидов включают яичник китайского хомячка (клетки СНО) (включая клетки dhfr-CHO, описанные в Urlaub and Chasin (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220, используемые с селектируемым маркером DHFR, например, как описано в Kaufman and Sharp (1982) Mol. Biol. 159:601 621), клетки эмбриональной почки человека 293 (например, 293, 293E, 293T), клетки COS, клетки NIH3T3, линии лимфоцитарных клеток, например, клетки миеломы NS0 и клетки SP2, а также клетки трансгенного животного, например трансгенного млекопитающего. Например, клетка представляет собой эпителиальную клетку молочной железы.
В иллюстративной системе экспрессии антитела рекомбинантный вектор экспрессии, кодирующий как тяжелую цепь антитела, так и легкую цепь антитела, вводят в клетки dhfr-CHO посредством трансфекции, опосредованной фосфатом кальция. В рекомбинантном векторе экспрессии каждый из генов тяжелой и легкой цепи антитела функционально связан с регуляторными элементами энхансера/промотора (например, происходящими из SV40, CMV, аденовируса и тому подобное, такими как регуляторный элемент энхансера CMV/промотора AdMLP или регуляторный элемент энхансера SV40/промотора AdMLP) для управления высокими уровнями транскрипции генов. Рекомбинантный вектор экспрессии также несет ген DHFR, который позволяет отобрать клетки СНО, трансфицированные вектором, с использованием отбора/амплификации метотрексатом. Отобранные трансформантные клетки-хозяева культивируют, чтобы обеспечить экспрессию тяжелой и легкой цепей антитела, и антитело выделяют из культуральной среды.
Способы лечения
Полипептид или полипептиды, раскрытые в настоящем описании, можно использовать для лечения или предотвращения любого заболевания или расстройства у собаки, которая в этом нуждается. Это изобретение особенно полезно при лечении хронических состояний, когда требуется повторное введение. Из-за увеличенного периода полужизни терапевтического белка возможны менее частое введение и/или снижение уровней доз.
В некоторых вариантах осуществления заболевание, расстройство, состояние или симптомы, которые лечат или предотвращают, представляют собой аллергическое заболевание, хроническую боль, острую боль, воспалительное заболевание, аутоиммунное заболевание, эндокринное заболевание, заболевание желудочно-кишечного тракта, скелетное заболевание/заболевание опорно-двигательного аппарата, сердечно-сосудистое заболевание, неврологическое заболевание, заболевание почек, нарушение обмена веществ, иммунологическое заболевание, генетическое/наследственное заболевание, заболевание, связанное с фертильностью, инфекционное заболевание или рак. В некоторых вариантах осуществления заболевание или расстройство, которое лечат или предотвращает, представляет собой атопический дерматит, аллергический дерматит, пищевую аллергию, боль при остеоартрите, периоперационную боль, зубную боль, боль при раке, артрит, анемию, ожирение или диабет.
Антитела можно использовать не только для лечения или профилактики заболевания, но также для модуляции нормальной биологической функции, например, для управления фертильностью или поведением.
Диагностика
Полипептид или полипептиды, раскрытые в настоящем описании, также можно использовать для различных диагностических целей, например, для определения, имеет ли собака какое-либо конкретное заболевание или расстройство. В некоторых вариантах осуществления полипептид или полипептиды могут содержать связывающий домен. связывающий домен может специфически связываться с белком, субъединицей, доменом, мотивом и/или эпитопом, описанным в настоящем описании (например, маркером раковых клеток). В некоторых вариантах осуществления полипептид или полипептиды также содержат меченую группу. обычно меченыегруппы делятся на множество классов в зависимости от анализа, в котором они должны быть обнаружены: a) изотопные метки, которые могут быть радиоактивными или тяжелыми изотопами; b) магнитные метки (например, магнитные частицы); c) окислительно-восстановительные фрагменты; d) оптические красители; ферментные группы (например, пероксидаза хрена, β-галактозидаза, люцифераза, щелочная фосфатаза); e) биотинилированные группы; и f) заданные полипептидные эпитопы, распознаваемые вторичным репортером (например, последовательности пары лейциновых застежек, сайты связывания для вторичных антител, связывающие металлы домены, метки эпитопа и так далее). В некоторых вариантах осуществления меченная группа соединена с антителом посредством спейсерных групп различной длины для уменьшения стерического затруднения. в данной области известны различные способы мечения белков, которые можно использовать при осуществлении настоящего изобретения.
В некоторых вариантах осуществления меченая группа представляет собой зонд, краситель (например, флуоресцентный краситель) или радиоактивный изотоп (например, 3H, 14C, 22Na, 36Cl, 35S, 33P или 125I).
Конкретные метки также могут включать в себя оптические красители, включая, но без ограничения, хромофоры, люминофоры и флуорофоры, причем последние во многих случаях являются специфическими. Флуорофоры могут быть либо «микромолекулярными» флуорофорами, либо белковоподобными белками.
Флуоресцентная метка может быть любой молекулой, которую можно обнаружить по присущим ей флуоресцентным свойствам. Подходящие флуоресцентные метки включают, но без ограничения, флуоресцеин, родамин, тетраметилродамин, эозин, эритрозин, кумарин, метил-кумарины, пирен, малацитовый зеленый, стильбен, Люцифер желтый, Cascade BlueJ, техасский красный, IAEDANS, EDANS, BODIPY FL, LC Red 640, Cy 5, Cy 5,5, LC Red 705, зеленый Орегон, красители Alexa-Fluor (Alexa Fluor 350, Alexa Fluor 430, Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 546, Alexa Fluor 568, Alexa Fluor 594, Alexa Fluor 633, Alexa Fluor 660, Alexa Fluor 680), Cascade Blue, Cascade Yellow и R-фикоэритрин (PE) (Molecular Probes, Eugene, Oreg), FITC, родамин и техасский красный (Pierce, Rockford, Ill.), Cy5, Cy5,5, Cy7 (Amersham Life Science, Pittsburgh, Pa.). Подходящие оптические красители, включая флуорофоры, описаны в «Справочнике по молекулярным зондам» Ричарда П. Хогланда, который полностью включен посредством ссылки.
Подходящие белковоподобные флуоресцентные метки также включают, но без ограничения, зеленый флуоресцентный белок, в том числе виды GFP Renilla, Ptilosarcus или Aequorea (Chalfie et al., 1994, Science 263:802-805), EGFP (Clontech Laboratories, Inc., учетный номер Genbank U55762), синий флуоресцентный белок BFP, Quantum Biotechnologies, Inc. 1801 de Maisonneuve Blvd. West, 8th Floor, Montreal, Quebec, Canada H3H1J9; Stauber, 1998, Biotechniques 24:462-471; Heim et al., 1996, Curr. Biol. 6:178-182), усиленный желтый флуоресцентный белок (EYFP, Clontech Laboratories, Inc.), люциферазу (Ichiki et al., 1993, J. Immunol. 150: 5408-5417), β-галактозидазу (Nolan et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2603-2607) и Renilla (WO92/15673, WO95/07463, WO98/14605, WO98/26277, WO99/49019, патенты США №№ 5292658 5418155 5683888 5741668 5777079 5804387 5874304 5876995 5925558). Все ссылки, приведенные выше в этом абзаце, полностью включены в настоящий документ посредством ссылки.
Анализы
Связывание FcγRI:
Связывание с FcγRI является мерой способности антитела опосредовать ADCC. Чтобы оценить это свойство антитела, можно провести анализ связывания антитела с FcγRI с использованием методов, известных в данной области.
Связывание C1q:
Связывание с первым компонентом комплемента, C1q, является мерой способности антитела опосредовать зависимую от комплемента цитотоксичность (CDC). Чтобы оценить это свойство антитела, можно провести анализ связывания антитела с C1q с использованием методов, известных в данной области.
Период полужизни:
Способы измерения периода полужизни антитела хорошо известны в данной области. См., например, Booth et al., MAbs, 10 (7):1098-1110 (2018). Например, период полужизни антитела можно измерить путем инъекции антитела в животной модели и измерения уровней антитела в сыворотке в течение определенного периода времени. Примеры животных моделей включают модели приматов, не являющихся человеком, и модели трансгенных мышей. Модели трансгенных мышей (например, трансгенных мышей Tg32 или Tg276) могут быть нулевыми для альфа-цепи мышиного FcRn и экспрессировать трансген альфа-FcRn человека (например, под управлением конститутивного промотора). Альфа-цепь человеческого FcRn может спариваться in vivo с белком β2-микроглобулина мыши, образуя функциональный химерный гетеродимер FcRn.
ПРИМЕРЫ
Пример 1. Аланин-сканирующий мутагенез доменов CH2 и CH3 IgG.B собаки
Аланин-сканирующий мутагенез (Morrison and Weiss, Curr. Opin. Chem. Biol. 5:302-307 (2001)) провели на остатках 250, 251, 252, 254, 256, 285, 286, 307, 309, 311, 315 в домене CH2 и остатках 378, 380, 428, 430, 433, 434, 435 и 436 в домене CH3. Для этого эксперимента синтезировали последовательность дикого типа (wt) доменов CH2 и CH3 IgG.B собаки и использовали в качестве матрицы для мутагенеза. Каждое указанное положение, за исключением положения 254, индивидуально заменяли на аланин с помощью мутагенеза ПЦР с использованием праймера, кодирующего изменение. Положение 254 представляет собой аланин в последовательности дикого типа, и он был изменен на серин. Продукт ПЦР субклонировали в плазмиду GenScript FASEBA, трансформировали в E. coli и проверяли последовательность на наличие варианта. Перед доменом CH2 находится метка SASA (однодоменное антитело против сывороточного альбумина) (см., например, US 2013/0129727A1), которая имеет аффинность pM к альбумину. Сигнальный пептид PelB (пектатлиаза B) находится на N-конце для облегчения секреции Fc в среду. Экспрессию белка CH2-CH3 регулировали с помощью промотора Lac. Супернатанты кондиционированной среды анализировали на связывание с FcRn собаки (UniProtKB - E2R0L6 [FcRn] и UniProtKB - E2RN10 [собачий бета-2-микроглобулин]) при pH 5,5 с использованием поверхностного плазмонного резонанса (SPR).
Для анализа SPR с использованием Biacore 8K бычий сывороточный альбумин (BSA) иммобилизовали на сенсорном чипе CM5. Поверхность сенсорного чипа проточных ячеек 1 и 2 активировали свежей смесью 50 ммоль/л N-гидроксисукцинимида и 200 ммоль/л 1-этил-3-(3-диметиламинопропил) гидрохлорида карбодиимида в течение 420 с (10 мкл/мин). После этого BSA, разбавленный 10 мМ ацетатом натрия (pH 4,5), вводили в проточную ячейку 2 для достижения конъюгации, в то время как проточная ячейка 1 была установлена пустой. После реакции связывания амина оставшиеся активные сайты связывания на поверхности чипа блокировали инъекцией 1 мМ гидрохлорида этаноламина в течение 420 с. Рабочим буфером для эксперимента по связыванию был HBS-EP (10 мМ HEPES, 500 мМ NaCl, 3 мМ EDTA, 0,05% Tween 20, pH 5,5), и его запускали при 25°C. Супернатанты из вариантов аланина инъецировали на поверхность чипа и фиксировали с помощью метки SASA на иммобилизованном BSA в течение 60 сек. FcRn собаки в концентрации 400 нМ вводили в течение 120 сек, и диссоциацию завершали с помощью имеющугося буфера в течение 120 сек. Скорость потока для фазы иммобилизации BSA составляла 10 мкл/мин, а скорость потока для фазы ассоциации и диссоциации составляла 30 мкл/мин. Все данные обрабатывали с использованием оценочного программного обеспечения Biacore 8K версии 1,1. Табличные данные показаны в Таблице 3, причем последний столбец содержит среднее значение KD дикого типа, разделенное на значение KD варианта. Сенсограммы показаны на фиг. 7А-7U.
Таблица 3
Пример 2: Создание библиотек мутагенеза насыщения NNK в выбранных положениях и анализ индивидуальных вариантов
Метод мутагенеза с насыщением NNK представляет собой эффективную стратегию для получения всех 20 возможных аминокислот в нужном положении (Hogrefe et al., Biotechniques. 33:1158-1165 (2002)). Были созданы отдельные библиотеки NNK в положениях 250, 252, 254, 309, 311, 378, 380 и 434 (нумерация ЕС). Для этого метода использовали праймеры NNK (N=A/C/G/T, K=G/T) в указанном положении с набором QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit (Agilent). Супернатанты от девяноста индивидуальных трансформантов из каждой библиотеки анализировали на связывание с FcRn собаки при pH 5,5 с использованием метода Biacore, описанного в примере 1. Единственная разница заключалась в том, что концентрация FcRn собаки, использованного в анализе, составляла 200 нМ, а не 400 нМ. Сенсограммы для всех вариантов библиотеки NNK показаны на фиг. 8-15.
Для библиотеки NNK в положении 250 ни один из вариантов не показал повышенного связывания с FcRn собаки при pH 5,5. Данные для вариантов T250E и T250Q и Fc дикого типа показаны в таблице 4. В анализе конкурентного связывания было продемонстрировано, что варианты T250E и T250Q в IgG2 человека сильнее связываются с FcRn человека при pH 6,0 по сравнению с Fc IgG2 человека дикого типа. (Hinton et al., J. Biol. Chem. 279:6213-6216 (2004)).
Таблица 4
Для библиотеки NNK в положении 252 только варианты L252Y и L252M имели явно более высокую аффинность с FcRn собаки при pH 5,5 (см. Таблицу 5 ниже). В 90 трансформантах не было вариантов L252F, поэтому данные о связывании с этим вариантом получены не были.
Таблица 5
Для библиотеки NNK в положении 254 ни один из протестированных вариантов не имел очевидной более высокой аффинности с FcRn собаки при pH 5,5. Данные для варианта A254T показаны в таблице 6, и соответствующий вариант IgG1 человека использовали в варианте YTE (M252Y/S254T/T256E), который имеет повышенную аффинность с FcRn человека при pH 6,0 (Dall'Acqua et al., J. Immunol. 169:5171-5180 (2002)), и было продемонстрировано увеличение периода полужизни IgG человека на доклинических моделях, а также у людей (Borrok et al., J. Biol. Chem. 290:4282-4290 (2015); Robbie et al., Antimicrob. Agents Ch. 57:6147-6153 (2013)). В 90 трансформантах не было вариантов A254H, поэтому по этому варианту не было получено никаких данных.
Таблица 6
Для библиотек NNK в положениях 309 и 311 ни один из протестированных вариантов не имел явно более высокой аффинности с FcRn собаки при pH 5,5. Данные для вариантов G309P и Q311V показаны в таблицах 7 и 8, и было продемонстрировано, что соответствующие человеческие варианты (L309P и Q311V) в IgG1 человека в нескольких комбинациях с другими вариантами имеют более высокую аффинность с FcRn человека при pH 6,0 (Dall ' Acqua et al., J. Immunol. 169:5171-5180 (2002); Booth et al., MAbs, 10 (7):1098-1110 (2018)). Варианты G309D, G309K и Q311D не были идентифицированы в библиотеках NNK и поэтому не тестировались на связывание с FcRn.
Таблица 7
таблица 8
Для библиотек NNK в положениях 378 и 380 ни один из протестированных вариантов не имел явно более высокой аффинности с FcRn собаки при pH 5,5. Данные для варианта D378V показаны в таблице 9, и соответствующий вариант IgG1 человека использовали в комбинациях с другими вариантами IgG для демонстрации более высокой аффинности с FcRn человека pH 6,0 по сравнению с Fc дикого типа и увеличения периода полураспала IgG человека у трансгенных мышей с FcRn человека (Monnet et al., MABS.6:422-436 (2014); Booth et al., 2018). Кроме того, данные для варианта E380A показаны в таблице 10, и было показано, что соответствующий вариант IgG человека имеет более высокую аффинность связывания с FcRn человека при pH 6,0 (Shields et al., J. Biol. Chem. 276:6591-6604 (2001)). Варианты D378E, D378I, D378K и E380F не присутствовали в библиотеках NNK и не подвергали скринингу на связывание с FcRn собаки.
Таблица 9
таблица 10
Для библиотеки NNK в положении 434 варианты N434Y, N434W и N434R имели более высокую аффинность с FcRn собаки при pH 5,5, показанном в таблице 11. Варианты N434S и N434A не имели более высокой аффинности с FcRn собаки при низком pH в отличии от соответствующих вариантов IgG1 человека (Petkova et al., Int. Immunol. 18:1759-1769 (2006); Yeung et al., J. Immunol. 182: 7663-7671 (2009); Zalevsky et al., Nat. Biotechnol. 28:157-159 (2010); Deng et al., Drug Metab. Dispos. 38:600-605 (2010)). Библиотека NNK, скринированная в положении 434, не содержала варианта N434F, поэтому связывание этого варианта с FcRn собаки не тестировали.
Таблица 11
Пример 3: Кинетика связывания для вариантов L252Y, N434Y, N434W, N434R, N434H и YTE (L252Y/A254T/T256E) и Fc дикого типа
Несколько вариантов IgG.B собаки, которые продемонстрировали более высокую аффинность с FcRn собаки при pH 5,5, дополнительно оценивали на кинетику связывания с FcRn собаки. В этом исследовании оценивали связывание вариантов (L252Y, N434Y, N434W, N434R, N434H), варианта YTE (L252Y/A254T/T256E) и Fc собаки дикого типа с FcRn собаки при pH 5,5 и pH 7,4. Метод Biacore для условий pH 5,5 был таким же, как описано в примере 1, за исключением того, что были протестированы четыре концентрации FcRn (100 нМ, 200 нМ, 400 нМ, 800 нМ), что дает более точную кинетику связывания. Для условий Biacore при pH 7,4 используемый рабочий буфер составлял 10 мМ HEPES, 500 мМ NaCl, 3 мМ EDTA, 0,05% Tween 20, pH 7,4, и концентрация тестируемого FcRn собаки составляла 200 нМ. Все варианты, включая YTE и дикий тип, не связывались с FcRn собаки при pH 7,4. Кинетика связывания при pH 5,5 показана в таблице 12, а сенсограммы показаны на фиг. 16A-16E. Испытанные варианты показали повышенную аффинность с FcRn собаки при pH 5,5 по сравнению с Fc дикого типа.
Таблица 12
Другие Варианты осуществления
Хотя изобретение было описано вместе с его подробным описанием, вышеприведенное описание предназначено для иллюстрации, а не для ограничения объема изобретения, который определяется объемом прилагаемой формула изобретения. Другие аспекты, преимущества и модификации входят в объем следующей формулы изобретения.
--->
СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> Invetx Inc.
<120> КОМПОЗИЦИИ ДЛЯ УВЕЛИЧЕНИЯ ПЕРИОДА ПОЛУРАСПАДА
ТЕРАПЕВТИЧЕСКОГО СРЕДСТВА У СОБАК И СПОСОБЫ ПРИМЕНЕНИЯ
<130> 47406-0007WO1
<140> PCT/US2020/012081
<141> 2020-01-02
<150> US 62/788,035
<151> 2019-01-03
<160> 29
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 104
<212> белок
<213> Собака
<400> 1
Gly Pro Ser Val Leu Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Ile Leu Arg
1 5 10 15
Ile Thr Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Leu Asp Leu Gly Arg
20 25 30
Glu Asp Pro Glu Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asp Gly Lys Glu Val
35 40 45
His Thr Ala Lys Thr Gln Ser Arg Glu Gln Gln Phe Asn Gly Thr Tyr
50 55 60
Arg Val Val Ser Val Leu Pro Ile Glu His Gln Asp Trp Leu Thr Gly
65 70 75 80
Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn His Ile Asp Leu Pro Ser Pro Ile
85 90 95
Glu Arg Thr Ile Ser Lys Ala Arg
100
<210> 2
<211> 104
<212> белок
<213> Собака
<400> 2
Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Leu
1 5 10 15
Ile Ala Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Leu Asp Pro
20 25 30
Glu Asp Pro Glu Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asp Gly Lys Gln Met
35 40 45
Gln Thr Ala Lys Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Gly Thr Tyr
50 55 60
Arg Val Val Ser Val Leu Pro Ile Gly His Gln Asp Trp Leu Lys Gly
65 70 75 80
Lys Gln Phe Thr Cys Lys Val Asn Asn Lys Ala Leu Pro Ser Pro Ile
85 90 95
Glu Arg Thr Ile Ser Lys Ala Arg
100
<210> 3
<211> 104
<212> белок
<213> Собака
<400> 3
Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Ile Leu Val
1 5 10 15
Thr Ala Arg Thr Pro Thr Val Thr Cys Val Val Val Asp Leu Asp Pro
20 25 30
Glu Asn Pro Glu Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asp Ser Lys Gln Val
35 40 45
Gln Thr Ala Asn Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln Ser Asn Gly Thr Tyr
50 55 60
Arg Val Val Ser Val Leu Pro Ile Gly His Gln Asp Trp Leu Ser Gly
65 70 75 80
Lys Gln Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Ala Leu Pro Ser Pro Ile
85 90 95
Glu Glu Ile Ile Ser Lys Thr Pro
100
<210> 4
<211> 104
<212> белок
<213> Собака
<400> 4
Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Ile Leu Arg
1 5 10 15
Ile Thr Arg Thr Pro Glu Ile Thr Cys Val Val Leu Asp Leu Gly Arg
20 25 30
Glu Asp Pro Glu Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asp Gly Lys Glu Val
35 40 45
His Thr Ala Lys Thr Gln Pro Arg Glu Gln Gln Phe Asn Ser Thr Tyr
50 55 60
Arg Val Val Ser Val Leu Pro Ile Glu His Gln Asp Trp Leu Thr Gly
65 70 75 80
Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn His Ile Gly Leu Pro Ser Pro Ile
85 90 95
Glu Arg Thr Ile Ser Lys Ala Arg
100
<210> 5
<211> 106
<212> белок
<213> Собака
<400> 5
Lys Pro Ser Val Tyr Val Leu Pro Pro Ser Pro Lys Glu Leu Ser Ser
1 5 10 15
Ser Asp Thr Val Ser Ile Thr Cys Leu Ile Lys Asp Phe Tyr Pro Pro
20 25 30
Asp Ile Asp Val Glu Trp Gln Ser Asn Gly Gln Gln Glu Pro Glu Arg
35 40 45
Lys His Arg Met Thr Pro Pro Gln Leu Asp Glu Asp Gly Ser Tyr Phe
50 55 60
Leu Tyr Ser Lys Leu Ser Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asp
65 70 75 80
Pro Phe Thr Cys Ala Val Met His Glu Thr Leu Gln Asn His Tyr Thr
85 90 95
Asp Leu Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys
100 105
<210> 6
<211> 105
<212> белок
<213> Собака
<400> 6
Gln Pro Ser Val Tyr Val Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Leu Ser Lys
1 5 10 15
Asn Thr Val Ser Leu Thr Cys Leu Ile Lys Asp Phe Phe Pro Pro Asp
20 25 30
Ile Asp Val Glu Trp Gln Ser Asn Gly Gln Gln Glu Pro Glu Ser Lys
35 40 45
Tyr Arg Thr Thr Pro Pro Gln Leu Asp Glu Asp Gly Ser Tyr Phe Leu
50 55 60
Tyr Ser Lys Leu Ser Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Arg Gly Asp Thr
65 70 75 80
Phe Ile Cys Ala Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
85 90 95
Glu Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys
100 105
<210> 7
<211> 105
<212> белок
<213> Собака
<400> 7
Gln Pro Asn Val Tyr Val Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Met Ser Lys
1 5 10 15
Asn Thr Val Thr Leu Thr Cys Leu Val Lys Asp Phe Phe Pro Pro Glu
20 25 30
Ile Asp Val Glu Trp Gln Ser Asn Gly Gln Gln Glu Pro Glu Ser Lys
35 40 45
Tyr Arg Met Thr Pro Pro Gln Leu Asp Glu Asp Gly Ser Tyr Phe Leu
50 55 60
Tyr Ser Lys Leu Ser Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Arg Gly Asp Thr
65 70 75 80
Phe Ile Cys Ala Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
85 90 95
Ile Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys
100 105
<210> 8
<211> 106
<212> белок
<213> Собака
<400> 8
Gln Pro Ser Val Tyr Val Leu Pro Pro Ser Pro Lys Glu Leu Ser Ser
1 5 10 15
Ser Asp Thr Val Thr Leu Thr Cys Leu Ile Lys Asp Phe Phe Pro Pro
20 25 30
Glu Ile Asp Val Glu Trp Gln Ser Asn Gly Gln Pro Glu Pro Glu Ser
35 40 45
Lys Tyr His Thr Thr Ala Pro Gln Leu Asp Glu Asp Gly Ser Tyr Phe
50 55 60
Leu Tyr Ser Lys Leu Ser Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asp
65 70 75 80
Thr Phe Thr Cys Ala Val Met His Glu Ala Leu Gln Asn His Tyr Thr
85 90 95
Asp Leu Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys
100 105
<210> 9
<211> 220
<212> белок
<213> Собака
<400> 9
Val Pro Glu Pro Leu Gly Gly Pro Ser Val Leu Ile Phe Pro Pro Lys
1 5 10 15
Pro Lys Asp Ile Leu Arg Ile Thr Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
20 25 30
Val Leu Asp Leu Gly Arg Glu Asp Pro Glu Val Gln Ile Ser Trp Phe
35 40 45
Val Asp Gly Lys Glu Val His Thr Ala Lys Thr Gln Ser Arg Glu Gln
50 55 60
Gln Phe Asn Gly Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Pro Ile Glu His
65 70 75 80
Gln Asp Trp Leu Thr Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn His Ile
85 90 95
Asp Leu Pro Ser Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Ala Arg Gly Arg
100 105 110
Ala His Lys Pro Ser Val Tyr Val Leu Pro Pro Ser Pro Lys Glu Leu
115 120 125
Ser Ser Ser Asp Thr Val Ser Ile Thr Cys Leu Ile Lys Asp Phe Tyr
130 135 140
Pro Pro Asp Ile Asp Val Glu Trp Gln Ser Asn Gly Gln Gln Glu Pro
145 150 155 160
Glu Arg Lys His Arg Met Thr Pro Pro Gln Leu Asp Glu Asp Gly Ser
165 170 175
Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Ser Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln
180 185 190
Gly Asp Pro Phe Thr Cys Ala Val Met His Glu Thr Leu Gln Asn His
195 200 205
Tyr Thr Asp Leu Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys
210 215 220
<210> 10
<211> 219
<212> белок
<213> Собака
<400> 10
Ala Pro Glu Met Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys
1 5 10 15
Pro Lys Asp Thr Leu Leu Ile Ala Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
20 25 30
Val Val Asp Leu Asp Pro Glu Asp Pro Glu Val Gln Ile Ser Trp Phe
35 40 45
Val Asp Gly Lys Gln Met Gln Thr Ala Lys Thr Gln Pro Arg Glu Glu
50 55 60
Gln Phe Asn Gly Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Pro Ile Gly His
65 70 75 80
Gln Asp Trp Leu Lys Gly Lys Gln Phe Thr Cys Lys Val Asn Asn Lys
85 90 95
Ala Leu Pro Ser Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Ala Arg Gly Gln
100 105 110
Ala His Gln Pro Ser Val Tyr Val Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Leu
115 120 125
Ser Lys Asn Thr Val Ser Leu Thr Cys Leu Ile Lys Asp Phe Phe Pro
130 135 140
Pro Asp Ile Asp Val Glu Trp Gln Ser Asn Gly Gln Gln Glu Pro Glu
145 150 155 160
Ser Lys Tyr Arg Thr Thr Pro Pro Gln Leu Asp Glu Asp Gly Ser Tyr
165 170 175
Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Ser Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Arg Gly
180 185 190
Asp Thr Phe Ile Cys Ala Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
195 200 205
Thr Gln Glu Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys
210 215
<210> 11
<211> 219
<212> белок
<213> Собака
<400> 11
Gly Cys Gly Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys
1 5 10 15
Pro Lys Asp Ile Leu Val Thr Ala Arg Thr Pro Thr Val Thr Cys Val
20 25 30
Val Val Asp Leu Asp Pro Glu Asn Pro Glu Val Gln Ile Ser Trp Phe
35 40 45
Val Asp Ser Lys Gln Val Gln Thr Ala Asn Thr Gln Pro Arg Glu Glu
50 55 60
Gln Ser Asn Gly Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Pro Ile Gly His
65 70 75 80
Gln Asp Trp Leu Ser Gly Lys Gln Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys
85 90 95
Ala Leu Pro Ser Pro Ile Glu Glu Ile Ile Ser Lys Thr Pro Gly Gln
100 105 110
Ala His Gln Pro Asn Val Tyr Val Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Met
115 120 125
Ser Lys Asn Thr Val Thr Leu Thr Cys Leu Val Lys Asp Phe Phe Pro
130 135 140
Pro Glu Ile Asp Val Glu Trp Gln Ser Asn Gly Gln Gln Glu Pro Glu
145 150 155 160
Ser Lys Tyr Arg Met Thr Pro Pro Gln Leu Asp Glu Asp Gly Ser Tyr
165 170 175
Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Ser Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Arg Gly
180 185 190
Asp Thr Phe Ile Cys Ala Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
195 200 205
Thr Gln Ile Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys
210 215
<210> 12
<211> 220
<212> белок
<213> Собака
<400> 12
Val Pro Glu Ser Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys
1 5 10 15
Pro Lys Asp Ile Leu Arg Ile Thr Arg Thr Pro Glu Ile Thr Cys Val
20 25 30
Val Leu Asp Leu Gly Arg Glu Asp Pro Glu Val Gln Ile Ser Trp Phe
35 40 45
Val Asp Gly Lys Glu Val His Thr Ala Lys Thr Gln Pro Arg Glu Gln
50 55 60
Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Pro Ile Glu His
65 70 75 80
Gln Asp Trp Leu Thr Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn His Ile
85 90 95
Gly Leu Pro Ser Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Ala Arg Gly Gln
100 105 110
Ala His Gln Pro Ser Val Tyr Val Leu Pro Pro Ser Pro Lys Glu Leu
115 120 125
Ser Ser Ser Asp Thr Val Thr Leu Thr Cys Leu Ile Lys Asp Phe Phe
130 135 140
Pro Pro Glu Ile Asp Val Glu Trp Gln Ser Asn Gly Gln Pro Glu Pro
145 150 155 160
Glu Ser Lys Tyr His Thr Thr Ala Pro Gln Leu Asp Glu Asp Gly Ser
165 170 175
Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Ser Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln
180 185 190
Gly Asp Thr Phe Thr Cys Ala Val Met His Glu Ala Leu Gln Asn His
195 200 205
Tyr Thr Asp Leu Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys
210 215 220
<210> 13
<211> 468
<212> белок
<213> Собака
<400> 13
Met Glu Ser Val Phe Cys Trp Val Phe Leu Val Val Ile Leu Lys Gly
1 5 10 15
Val Gln Gly Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys
20 25 30
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe
35 40 45
Ser Ser Tyr Tyr Met His Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
50 55 60
Gln Arg Val Ala His Ile Arg Gly Asp Gly Arg Thr Thr His Tyr Ala
65 70 75 80
Asp Ala Met Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn
85 90 95
Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Thr Val Glu Asp Thr Ala Ile
100 105 110
Tyr Tyr Cys Val Lys Asp Ile Tyr Tyr Gly Val Gly Asp Tyr Trp Gly
115 120 125
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Thr Ala Pro Ser
130 135 140
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Cys Gly Ser Thr Ser Gly Ser Thr Val
145 150 155 160
Ala Leu Ala Cys Leu Val Ser Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
165 170 175
Ser Trp Asn Ser Gly Ser Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ser
180 185 190
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu His Ser Leu Ser Ser Met Val Thr Val
195 200 205
Pro Ser Ser Arg Trp Pro Ser Glu Thr Phe Thr Cys Asn Val Val His
210 215 220
Pro Ala Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Pro Val Phe Asn Glu Cys Arg
225 230 235 240
Cys Thr Asp Thr Pro Pro Cys Pro Val Pro Glu Pro Leu Gly Gly Pro
245 250 255
Ser Val Leu Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Ile Leu Arg Ile Thr
260 265 270
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Leu Asp Leu Gly Arg Glu Asp
275 280 285
Pro Glu Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asp Gly Lys Glu Val His Thr
290 295 300
Ala Lys Thr Gln Ser Arg Glu Gln Gln Phe Asn Gly Thr Tyr Arg Val
305 310 315 320
Val Ser Val Leu Pro Ile Glu His Gln Asp Trp Leu Thr Gly Lys Glu
325 330 335
Phe Lys Cys Arg Val Asn His Ile Asp Leu Pro Ser Pro Ile Glu Arg
340 345 350
Thr Ile Ser Lys Ala Arg Gly Arg Ala His Lys Pro Ser Val Tyr Val
355 360 365
Leu Pro Pro Ser Pro Lys Glu Leu Ser Ser Ser Asp Thr Val Ser Ile
370 375 380
Thr Cys Leu Ile Lys Asp Phe Tyr Pro Pro Asp Ile Asp Val Glu Trp
385 390 395 400
Gln Ser Asn Gly Gln Gln Glu Pro Glu Arg Lys His Arg Met Thr Pro
405 410 415
Pro Gln Leu Asp Glu Asp Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Ser
420 425 430
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asp Pro Phe Thr Cys Ala Val
435 440 445
Met His Glu Thr Leu Gln Asn His Tyr Thr Asp Leu Ser Leu Ser His
450 455 460
Ser Pro Gly Lys
465
<210> 14
<211> 96
<212> белок
<213> Собака
<400> 14
Leu Phe Thr Arg Thr Lys Arg Arg Ser Asp Val Ser Trp Gly Asn Thr
1 5 10 15
Gly Ser Ser Gln Thr Val Ile Arg Ala Ser Val Ala Ser Trp Ser Arg
20 25 30
Asn Gly Asp Leu Tyr Ala Pro Lys Pro Lys Arg Glu Asn Gly Arg Val
35 40 45
Pro Arg Pro Pro Asp Cys Lys Ala Met Phe Thr Leu Leu Ala Val Asp
50 55 60
Pro Gln Met Gln Pro Glu Gly Lys Gln Thr Lys Asn Lys Ala Gln Gln
65 70 75 80
Arg Glu Lys Asn Leu Phe Ser Tyr Thr Arg Thr Ile Ala His Gln Glu
85 90 95
<210> 15
<211> 105
<212> белок
<213> Собака
<400> 15
Leu Tyr Ala Asp Cys Ala Ser Val Ser Pro Trp Thr Tyr Ser Asp Ile
1 5 10 15
Tyr Ser Val Arg Ala Val Ala Ala Pro Tyr Asp Ser His Tyr Met Pro
20 25 30
Ser Leu Phe Gln Ile Val Tyr Ala Thr Ala Lys Glu Lys Cys Asn Cys
35 40 45
Asn Asn Cys Gly Cys Gly Leu Phe Val Thr Ala Thr Val Asp Pro Asn
50 55 60
Ser Gln Gln Asn Pro Glu Ser Gly Ser Gln Lys Asn Lys Ala Glu Ile
65 70 75 80
Thr Pro Gln Gln Asn Arg Asp Met Lys Asn Thr Leu Val Phe Glu Ser
85 90 95
Tyr Met Arg Thr Ile Ala His Gln Ile
100 105
<210> 16
<211> 66
<212> белок
<213> Собака
<400> 16
Leu Ser Asp Gly Ser Val Ser Trp Ala Val Ser Asn Arg Asp Tyr Ser
1 5 10 15
Lys Ala Ile His Val Thr Gly Val Trp Pro Arg His Met His Asn Ser
20 25 30
Leu Phe Tyr Thr Pro Lys Ser Thr Lys Cys Ile Ser Pro Glu Ser Phe
35 40 45
Ile Pro Ser Gly Gln Gln Thr Leu Phe Glu Pro Ser Tyr His Thr Ala
50 55 60
Thr Ala
65
<210> 17
<211> 17
<212> белок
<213> Собака
<400> 17
Phe Asn Glu Cys Arg Cys Thr Asp Thr Pro Pro Cys Pro Val Pro Glu
1 5 10 15
Pro
<210> 18
<211> 22
<212> белок
<213> Собака
<400> 18
Pro Lys Arg Glu Asn Gly Arg Val Pro Arg Pro Pro Asp Cys Pro Lys
1 5 10 15
Cys Pro Ala Pro Glu Met
20
<210> 19
<211> 20
<212> белок
<213> Собака
<400> 19
Ala Lys Glu Cys Glu Cys Lys Cys Asn Cys Asn Asn Cys Pro Cys Pro
1 5 10 15
Gly Cys Gly Leu
20
<210> 20
<211> 17
<212> белок
<213> Собака
<400> 20
Pro Lys Glu Ser Thr Cys Lys Cys Ile Ser Pro Cys Pro Val Pro Glu
1 5 10 15
Ser
<210> 21
<211> 17
<212> белок
<213> Собака
<400> 21
Pro Lys Glu Ser Thr Cys Lys Cys Ile Pro Pro Cys Pro Val Pro Glu
1 5 10 15
Ser
<210> 22
<211> 4
<212> белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> синтетический полипептид
<400> 22
Gly Gly Gly Ser
1
<210> 23
<211> 4
<212> белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> синтетический полипептид
<400> 23
Ser Gly Gly Gly
1
<210> 24
<211> 5
<212> белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> синтетический полипептид
<400> 24
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 25
<211> 5
<212> белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> синтетический полипептид
<400> 25
Ser Gly Gly Gly Gly
1 5
<210> 26
<211> 6
<212> белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> синтетический полипептид
<400> 26
Gly Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 27
<211> 6
<212> белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> синтетический полипептид
<400> 27
Ser Gly Gly Gly Gly Gly
1 5
<210> 28
<211> 7
<212> белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> синтетический полипептид
<400> 28
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 29
<211> 7
<212> белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> синтетический полипептид
<400> 29
Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly
1 5
<---
| название | год | авторы | номер документа |
|---|---|---|---|
| ВАРИАНТЫ IgG-FC ДЛЯ ПРИМЕНЕНИЯ В ВЕТЕРИНАРИИ | 2018 |
|
RU2814952C2 |
| МУТАНТНЫЕ ВАРИАНТЫ Fc IgG1, ЛИШЕННЫЕ ЭФФЕКТОРНЫХ ФУНКЦИЙ | 2018 |
|
RU2764559C2 |
| Биспецифическое антитело или его антигенсвязывающий фрагмент и способ их получения | 2021 |
|
RU2818312C1 |
| АНТИГЕНСВЯЗЫВАЮЩАЯ МОЛЕКУЛА ДЛЯ УСКОРЕНИЯ ИСЧЕЗНОВЕНИЯ АНТИГЕНА ЧЕРЕЗ FcγRIIB | 2013 |
|
RU2812226C1 |
| АНТИГЕНСВЯЗЫВАЮЩАЯ МОЛЕКУЛА ДЛЯ УСКОРЕНИЯ ИСЧЕЗНОВЕНИЯ АНТИГЕНА ЧЕРЕЗ FcγRIIB | 2013 |
|
RU2736349C2 |
| СОДЕРЖАЩИЙ ЛЕКАРСТВЕННОЕ СРЕДСТВО ПЕРЕНОСЧИК В КЛЕТКУ ДЛЯ ФОРМИРОВАНИЯ ИММУННОГО КОМПЛЕКСА | 2012 |
|
RU2739792C1 |
| СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВАРИАНТОВ FcyRIIB-СПЕЦИФИЧЕСКОЙ Fc-ОБЛАСТИ | 2013 |
|
RU2820161C1 |
| ПОЛИВАЛЕНТНЫЕ МОДУЛЯТОРЫ РЕГУЛЯТОРНЫХ T-КЛЕТОК | 2017 |
|
RU2769871C2 |
| ВАРИАНТЫ FcγRIIB-СПЕЦИФИЧЕСКОЙ Fc-ОБЛАСТИ | 2013 |
|
RU2729831C2 |
| ВАРИАНТ Fc-ОБЛАСТИ | 2014 |
|
RU2757124C2 |
Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к полипептидам на основе варианта Fc-области IgG собаки, и может быть использовано в ветеринарии в терапии боли и атопического дерматита у собак. Предложены полипептиды, содержащие варианты Fc-области IgG собаки с заменой на Arg или His в положении, которое соответствует положению аминокислоты 434 области Fc IgG собаки дикого типа, или с заменами на Met в положении, которое соответствует положению аминокислоты 252 Fc-области IgG собаки дикого типа, и на His в положении, которое соответствует положению аминокислоты 434 Fc-области IgG собаки дикого типа, причем положения аминокислот основаны на нумерации ЕС. При этом IgG собаки дикого типа выбран из (a) IgG.A собаки, содержащего домен Fc с SEQ ID NO: 9; (b) IgG.B собаки, содержащего домен Fc с SEQ ID NO: 10; (c) IgG.C собаки, содержащего домен Fc с SEQ ID NO: 11; и (d) IgG.D собаки, содержащего домен Fc с SEQ ID NO: 12. Изобретение обеспечивает получение полипептида с повышенной аффинностью связывания с FcRn собаки по сравнению с контрольным полипептидом, содержащим Fc-область IgG собаки дикого типа. 14 н. и 1 з.п. ф-лы, 16 ил., 12 табл., 3 пр.
1. Полипептид, содержащий вариант Fc-области IgG собаки, причем вариант Fc-области IgG собаки отличается от Fc-области IgG собаки дикого типа не более чем одной аминокислотой, причем одна аминокислотная разница представляет собой Arg в положении, которое соответствует положению аминокислоты 434 области Fc IgG собаки дикого типа, причем положение аминокислот основано на нумерации ЕС, причем полипептид имеет повышенную аффинность связывания с FcRn собаки по сравнению с контрольным полипептидом, причем контрольный полипептид идентичен полипептиду, за исключением того, что он содержит Fc-область IgG собаки дикого типа вместо варианта Fc-области IgG собаки, и причем IgG собаки дикого типа выбран из группы, состоящей из:
(a) IgG.A собаки, содержащего домен Fc, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9;
(b) IgG.B собаки, содержащего домен Fc, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10;
(c) IgG.C собаки, содержащего домен Fc, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11; и
(d) IgG.D собаки, содержащего домен Fc, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12.
2. Полипептид, содержащий вариант Fc-области IgG собаки, причем вариант Fc-области IgG собаки отличается от Fc-области IgG собаки дикого типа не более чем одной аминокислотой, причем одна аминокислотная разница представляет собой His в положении, которое соответствует положению аминокислоты 434 области Fc IgG собаки дикого типа, причем положение аминокислот основано на нумерации ЕС, причем полипептид имеет повышенную аффинность связывания с FcRn собаки по сравнению с контрольным полипептидом, причем контрольный полипептид идентичен полипептиду, за исключением того, что он содержит Fc-область IgG собаки дикого типа вместо варианта Fc-области IgG собаки, и причем IgG собаки дикого типа выбран из группы, состоящей из:
(a) IgG.A собаки, содержащего домен Fc, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9;
(b) IgG.B собаки, содержащего домен Fc, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10;
(c) IgG.C собаки, содержащего домен Fc, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11; и
(d) IgG.D собаки, содержащего домен Fc, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12.
3. Полипептид, содержащий вариант Fc-области IgG собаки, причем вариант Fc-области IgG собаки содержит: (i) Met в положении, которое соответствует положению аминокислоты 252 Fc-области IgG собаки дикого типа; и (ii) His в положении, которое соответствует положению аминокислоты 434 Fc-области IgG собаки дикого типа, причем положение аминокислот основано на нумерации ЕС, причем полипептид имеет повышенную аффинность связывания с FcRn собаки по сравнению с контрольным полипептидом, причем контрольный полипептид идентичен полипептиду, за исключением того, что он содержит Fc-область IgG собаки дикого типа вместо варианта Fc-области IgG собаки, и причем IgG собаки дикого типа выбран из группы, состоящей из:
(a) IgG.A собаки, содержащего домен Fc, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9;
(b) IgG.B собаки, содержащего домен Fc, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10;
(c) IgG.C собаки, содержащего домен Fc, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11; и
(d) IgG.D собаки, содержащего домен Fc, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12.
4. Полипептид по п.1 или 2, причем полипептид связывается с FcRn собаки на более высоком уровне при рН 5,5, чем при рН 7,4.
5. Фармацевтическая композиция для лечения или профилактики боли у нуждающейся в этом собаки, содержащая:
(i) полипептид, содержащий:
(а) полипептид по любому из пп. 1-4 и
(b) антигенсвязывающий домен, который связывает фактор роста нервов; и
(ii) фармацевтически приемлемый эксципиент.
(i) полипептид, содержащий:
(a) полипептид по любому из пп. 1-4, и
(b) связывающий домен, который связывает интерлейкин-31; и
(ii) фармацевтически приемлемый эксципиент.
(i) полипептид, содержащий:
(а) полипептид по любому из пп. 1-4, и
(b) связывающий домен, который связывает рецептор интерлейкина-31; и
(ii) фармацевтически приемлемый эксципиент.
8. Способ лечения боли у нуждающейся в этом собаки, включающий введение собаке эффективного количества фармацевтической композиции по п.5.
10. Способ профилактики боли у нуждающейся в этом собаки, включающий введение собаке эффективного количества композиции по п.5.
12. Применение фармацевтической композиции по п.5 в получении лекарственного средства для лечения боли у нуждающейся в этом собаки.
14. Применение фармацевтической композиции по п.5 в получении лекарственного средства для профилактики боли у нуждающейся в этом собаки.
| WO 2018073185 А1, 26.04.2018, US 2018009869 A1, 11.01.2018, WO 2017186928 А1, 02.11.2017, RU 2367667 C2, 20.09.2009, EL‐AMINE M | |||
| et al | |||
| In vivo induction of tolerance by an Ig peptide is not affected by the deletion of FcR or a mutated IgG Fc fragment, International immunology, 2002, v | |||
| Паровоз для отопления неспекающейся каменноугольной мелочью | 1916 |
|
SU14A1 |
| Способ восстановления хромовой кислоты, в частности для получения хромовых квасцов | 1921 |
|
SU7A1 |
| et al | |||
| Chimeric | |||
