Способ прогнозирования риска развития диабетической дистальной полинейропатии у женщин с сахарным диабетом 2 типа на основе генотипирования полиморфизма rs7784465 гена RAC1 Российский патент 2023 года по МПК G01N33/52 G01N33/49 C12Q1/6804 C12Q1/6827 C12Q1/6876 C12Q1/6883 

Изобретение относится к области медицинской диагностики, может быть использовано для прогнозирования риска развития диабетической дистальной нейропатии у женщин Центральной России с сахарным диабетом 2 типа.

Сахарный диабет 2 типа является самым распространенным эндокринологическим заболеванием, патогенетическую основу которого составляют нарушения в системе редокс-гомеостаза, такие как дефицит продукции эндогенных антиоксидантов и избыточное образование свободных радикалов [Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADPH) oxidase p22phox subunit polymorphisms, systemic oxidative stress, endothelial dysfunction, and atherosclerosis in type 2 diabetes mellitus / G. Osmenda, P. T. Matusik, T. Sliwa [et al.] // Polish archives of internal medicine. - 2021. - Vol. 131, Iss. 5. - P. 447-454]. Обозначенные патологические изменения способствуют формированию в клетках и тканях окислительного стресса - ведущей причины развития микрососудистых осложнений, включая диабетическую дистальную нейропатию [Oxidative stress and inflammation in renal and cardiovascular complications of diabetes / A. Charlton, J. Garzarella, K. A. Jandeleit-Dahm, J. C. Jha // Biology. - 2021. - Vol. 10, Iss. 1. - Art. 18. - URL: https://doi.org/10.3390/biology10010018 (date of the application: 10.12.2021)]. Основным источником супероксид-радикала в клетках является мультимерный комплекс НАДФН-оксидаза, регуляторной субъединицей которого служит малая ГТФ-аза RAC1, кодируемая соответствующим геном [Sies, H. Reactive oxygen species (ROS) as pleiotropic physiological signalling agents / H. Sies, D. P. Jones // Nature reviews. Molecular cell biology. - 2020. - V. 21, Iss. 7. - P. 363-383]. По данным транскриптомного анализа GTex Portal полиморфный вариант rs7784465 ассоциирован с увеличением экспрессии гена RAC1 в нервной ткани [https://www.gtexportal.org].

Известен способ прогнозирования диабетической периферической нейропатии у детей и подростков, страдающих сахарным диабетом 1 типа, по патенту на изобретение RU 2273028 С1 (публикация: 27.03.2006), включающий забор венозной крови и определение концентрации мозгового нейротрофического фактора, при концентрации более 9000 пг/мл которого диагностируют субклиническую стадию диабетической периферической нейропатии.

Недостаток метода заключается в том, что он разработан для детей и подростков с сахарным диабетом 1 типа и не может быть использован для взрослых пациентов с сахарным диабетом 2 типа.

Известен способ диагностики диабетической дистальной нейропатии (патент на изобретение RU 2687019 C1, дата публикации 06.05.2019), включающий электронейромиографическое исследование чувствительных волокон периферических нервов нижних конечностей, в котором активный электрод (А) накладывают посередине между медиальной лодыжкой и ахилловым сухожилием, референтный электрод (R) накладывают на 3-4 см проксимальнее активного электрода (А), заземляющий электрод накладывают на среднюю треть голени, отличающийся тем, что электронейромиографическое исследование проводят на подошвенной поверхности стоп, стимулируют чувствительные волокна медиального подошвенного нерва и латерального подошвенного нерва, от активного электрода (А) откладывают по диагонали 9-11 см по подошвенной поверхности стопы и фиксируют точку (1), далее от точки (1) измеряют 2-5 см по медиальной подошвенной борозде и фиксируют точку (2), затем в точку (2) устанавливают стимулирующий электрод и выполняют стимуляцию, далее от точки (1) измеряют 2-5 см по латеральной подошвенной борозде и фиксируют точку (3), затем в точку (3) устанавливают стимулирующий электрод и выполняют стимуляцию, далее оборудование для измерения и записи биоэлектрических процессов производит обработку полученных данных и выдает итоговый результат исследования каждого нерва подошвенной поверхности стоп по отдельности на обеих ногах.

Недостаток метода заключается в том, что он не позволяет спрогнозировать склонность пациента с сахарным диабетом 2 типа к развитию диабетической периферической нейропатии. Кроме того, регистрируемые электромиографические изменения неспецифичны и могут отмечаться при другой нервно-мышечной патологии.

Известен способ диагностики диабетической дистальной нейропатии (Дедов И.И., Шестакова М.В., Майоров А.Ю., и др. Алгоритмы специализированной медицинской помощи больным сахарным диабетом. 8-й выпуск. Сахарный диабет. 2017; 20 (1S): 1-121. doi: 10.14341/DM20171S8) при помощи диагностических шкал (шкала нейропатического дисфункционального счета (НДС); шкала симптомов нейропатии (Neuropathy Symptom Score, NSS); визуально-аналоговая шкала (для оценки болевого синдрома); Мичиганский опросник для скрининга нейропатии (The Michigan Neuropath Screening Instrument, MNSI). Данные диагностические шкалы используют для определения выраженности симптомов диабетической полинейропатии, которые включают суммарную количественную оценку жалоб, а также определение тактильной, температурной, болевой, вибрационной чувствительности и нарушений сухожильных рефлексов.

Однако данный способ является субъективным, так как основывается на ощущениях и жалобах пациента, зависит от его эмоционального статуса, что ведет к высокому риску получения неточных результатов и их неоднозначной трактовке и как следствие к неверной постановке диагноза.

Известен способ диагностики диабетической дистальной нейропатии заключающийся в биопсии кожи. (Сахарный диабет и нарушения углеводного обмена. Генри М. Кроненберг, Шломо Мелмед, Кеннет С. Полонски, П. Рид Ларсен; пер. с англ. под ред. И.И. Дедова, Г.А. Мельниченко. - М.: ООО «Рид Элсивер», 2010. - 448 с. - (Серия «Эндокринология по Вильямсу»). - Перевод изд. Williams Textbook of Endocrinology, 11thedition / Henry M. Kronenberg, Shlomo Melmed, Kenneth S. Polonsky и P. Reed Larsen). Биопсию проводят в дистальной части нижней конечности с помощью медицинского инструмента, например ножа трубчатой формы с диаметром 2-3 мм.

Однако при использовании данного способа нередко отмечается неудовлетворительная физическая и психологическая переносимость процедуры пациентом, имеет ограничения в виде противопоказаний для лиц с сахарным диабетом при высоких значениях гликемии (более 10-12 ммоль/л), так как высок риск инфекционных осложнений.

Наиболее близок по результату исследования способ прогнозирования риска развития сахарного диабета 2 типа у больных гипертонической болезнью по патенту на изобретение RU 2521202 (дата публикации 27.06.2014), включающий забор образца периферической венозной крови, выделение ДНК и анализ полиморфизма гена лимфотоксина α (+250G/A Ltα), по результатам которого прогнозируют риск развития сахарного диабета 2 типа у больных гипертонической болезнью: высокий - в случае обнаружения аллеля +250G Ltα, низкий - в случае обнаружения генотипа +250А/A Ltα.

Однако данный способ не способен выявить предрасположенность к развитию диабетической периферической нейропатии.

Технический результат заключается в получении критериев оценки риска формирования диабетической периферической нейропатии у женщин Центральной России с сахарным диабетом 2 типа по данным о генетическом полиморфизме rs7784465 (Т>С).

Технический результат достигается тем, что после экстракции ДНК проводят анализ полиморфного варианта гена малой ГТФ-азы RAC1 rs7784465 (Т>С) и прогнозируют повышенный риск формирования диабетической дистальной нейропатии у женщин с сахарным диабетом 2 типа в случае выявления аллеля rs7784465-С, а при обнаружении генотипа rs7784465-Т/Т - низкий риск развития диабетической дистальной нейропатии у женщин с сахарным диабетом 2 типа.

Изобретение поясняется следующей фигурой: дискриминация генотипов локусу гена RAC1 rs7784465 при генотипировании на основе масс-спектрометрии: генотипы rs7784465-Т/Т показаны оранжевым цветом, генотипы rs7784465-T/C показаны зеленым цветом, генотипы rs7784465-C/С показаны голубым цветом.

Способ осуществляют следующим образом:

1. Выделение ДНК из периферической венозной крови. На первом этапе к 0,5 мл крови добавляли 0,5 мл PBS и центрифугировали 10 мин при 12 тыс. об/мин. Надосадочную жидкость сливали, добавляли 1 мл PBS и вновь центрифугировали при тех же условиях. Надосадочную жидкость сливали, добавляли 200 мкл ТЕ-буфера, пипетировали до растворения осадка и затем последовательно добавляли 10 мкл 1% раствора додецилсульфата натрия SDS и 5 мкл протеиназы К. Пробирки инкубировали в термостате при t=37°C 12 ч. В ходе второго этапа проводили четыре последовательных центрифугирования с фенолом и хлороформом согласно протоколу методики (10 мин, 8 тыс. об/мин), после чего ДНК осаждали ледяным раствором 95% этилового спирта и центрифугировали 10 мин при 14,3 тыс. об/мин. По испарении спирта ДНК растворяли в 100 мкл деионизированной дистиллированной воды. Получаемый раствор ДНК в воде имел чистоту в диапазоне А260/280=1,5-2,0 и среднюю концентрацию около 180-200 нг/мкл.

Экстракция геномной ДНК из цельной крови колоночным методом проводилась с помощью набора QIAamp DNA blood mini kit (QIAGEN, Германия) на автоматической станции QiaCube (QIAGEN, Германия). Роботизированный протокол продолжительностью 58 минут включал этап лизиса клеток 0,2 мл цельной крови с помощью лизирующего буфера и протеиназы К QIAGEN, инкубирование, перенос лизата в колонку, связывание ДНК с мембраной колонки, центрифугирование, двукратное промывание колонки буфером AW1 и AW2, центрифугирование колонки и, наконец, элюирование очищенной ДНК. Получаемый раствор ДНК в воде имел идеальную чистоту А260/280=1,7-1,9 и среднюю концентрацию около 40-50 нг/мкл. Экстрагированные из крови образцы ДНК хранились в морозильниках Thermo Fisher Scientific (США) при -20°С.

2. Подготовка образцов ДНК к масс-спектрометрическому анализу. Качество выделенной ДНК оценивали по степени чистоты и концентрации раствора на спектрофотометре NanoDrop (Thermo Fisher Scientific, США). Все анализируемые образцы ДНК были разведены деионизированной водой до концентрации 10 нг/мкл при А260/280=1,5-2,0.

3. Анализ полиморфизма гена RAC1 - генотипирование методом матрично-активированной лазерной десорбционно-ионизационной масс-спектрометрии MALDI-TOF. Использовали следующие последовательности праймеров: прямой F: 5`-ACGTTGGATGGCAATTTAATTGAGATTGGC-3`, обратный R: 5`-ACGTTGGATGTAGACCCCATGCTCAGAAAG-3`, праймер удлинения E: 5`-tgAATTGAGATTGGCCAAGAAATA-3`. Для приготовления ПЦР-микса (в расчете на один спектральный чип) в центрифужную микропробирку вносили 80,6 мкл ddH2O, 50,4 мкл 10x буфера, 40,3 мкл MgCl2 (концентрация 25 ммоль/л), 10,1 мкл смеси дНТФ (концентрация 25 ммоль/л), 100,8 мкл смеси ПЦР-праймеров (концентрация 0,5 мкмоль/л) и 20,16 мкл HotStartTaq полимеразы (концентрация 5 ЕД/мкл). Смесь вортексировали и раскапывали в 96-луночный ПЦР-планшет по 3 мкл в лунку, после чего с помощью восьмиканального дозатора вносили по 2 мкл ДНК (концентрация 10 нг/мкл). Планшет заклеивали, центрифугировали 20 сек при 1000 об/мин и загружали в термоциклер CFX96 Bio-Rad на 125 мин при следующем режиме: денатурация 2 мин при 95°С, амплификация 44 цикла, состоящая из денатурации 30 сек при 95°С, отжига 30 сек при 56°С и элонгации 60 сек при 72°С. После чего пробы инкубировали 5 мин при 72°С. Не прореагировавшие в ходе ПЦР дНТФ удаляли с помощью реакции SAP (shrimp alkaline phosphatase), в ходе которой щелочная фосфатаза креветки гидролизовала дНТФ до нуклеозидов и фосфатов. Для приготовления SAP-микса в микропробирке смешивали 161,6 мкл ddH2O, 18 мкл 10хTS буфера и 31,7 мкл SAP фермента. Далее вносили по 2 мкл SAP-смеси в каждую лунку, планшет заклеивали, центрифугировали 20 сек при 1000 об/мин и загружали в термоциклер CFX96 Bio-Rad на 55 мин при следующем режиме: 45 мин при 37°С и 10 мин при 85°С. Для проведения третьей реакции iPLEX готовили Е-праймер-микс из расчета 8,8 мкл праймеров Е1-Е9, 11,7 мкл праймеров Е10-Е18, 14,6 мкл праймеров Е19-Е27, 17,5 мкл праймеров Е28-Е35 и 45,1 мкл ddH2O. После масс-спектрометрической оценки интенсивности пиков Е-праймеров в полученной смеси, в микс добавляли Е-праймеры в количествах, необходимых для достижения одинаковой интенсивности сигнала. Для приготовления iPLEX-микса в микропробирке смешивали 65,4 мкл ddH2O, 21,2 мкл iPLEX буфера, 21,2 мкл терминирующей смеси, 99,3 мкл Е-праймер-микса и 4,33 мкл iPLEX-фермента, вортексировали и раскапывали в лунки по 2 мкл. Планшет заклеивали, центрифугировали 20 секунд при 1000 об/мин и загружали в термоциклер CFX96 Bio-Rad на 135 мин при следующем режиме: денатурация 30 сек при 94°С, затем 40 циклов, состоящие из денатурации 5 сек при 94°С, отжига 5 сек при 52°С, элонгации 5 сек при 80°С, с последующим инкубированием в течение 3 мин при 72°С. По завершении реакции iPLEX, планшет охлаждали до +4°С, добавляли по 30 мкл воды во все лунки, центрифугировали 1 мин при 1000 об/мин и загружали в масс-спектрометр. Ввиду того, что небольшие полярные молекулы и положительно заряженные катионы натрия и калия могут образовывать аддукты с олигонуклеотидами и создавать серию контаминантных пиков, ампликоны были подвергнуты роботизированному обессоливанию путем их обработки смолой SpectroCLEAN (Agena Bioscience). Перенос образцов на спектральный чип с матрицей для ионизации осуществлялся в автоматическом режиме на рабочей станции Nanodispenser. Пример кластерного распределения генотипов по SNP rs7784465 в результате масс-спектрометрического анализа на геномном масс-спектрометре MassArray analyzer 4 (Agena Bioscience) показан на рисунке 1.

Статистические расчеты проводили с помощью программы SNPStats (Solé, X., Guinó, E., Valls, J., Iniesta, R., & Moreno, V. (2006). SNPStats: a web tool for the analysis of association studies. Bioinformatics, 22(15), 1928-1929).

4. Прогнозирование повышенного риска формирования диабетической периферической нейропатии в случае выявления аллеля rs7784465-С и пониженного риска развития этого осложнения сахарного диабета 2 типа при выявлении генотипа rs7784465-Т/Т.

Возможность использования предложенного способа для определения риска развития диабетической дистальной нейропатии у женщин подтверждает анализ результатов наблюдений 938 пациенток с СД2, у 888 из которых установлена диабетическая дистальная нейропатия. В исследование включались лица славянской национальности Центральной России. Диагноз СД2 был установлен врачами-эндокринологами ОБУЗ ГК БСМП на основе клинического и лабораторно-инструментального обследования. Установлено, что генотип rs7784465-T/T значимо чаще встречался у женщин без диабетической дистальной нейропатии (82%) по сравнению с больными СД2, имеющими данное осложнение основного заболевания (63,4%). Генотипы rs7784465-T/С и rs7784465-С/С в два раза чаще встречались у пациенток с СД2 и диабетической дистальной нейропатией (36,6%) по сравнению с больными СД2 без данного осложнения (18%). Носительство генотипов rs7784465-T/С и rs7784465-С/С RAC1 ассоциировалось с повышенным риском развития диабетической дистальной нейропатии: OR=2,77, 95% CI 1,30-5,89, P=0,0039 (таблица 1).

Таблица 1
Ассоциация полиморфного варианта rs7784465 гена RAC1 с диабетической дистальной нейропатией у женщин с сахарным диабетом 2 типа Ген
(SNP ID) Гено-
тип, аллель Больные с СД2, n (%) _adjР³ _adjOR (95% CI)⁴ Без диабетической дистальной нейропатии
(n=50) С диабетической дистальной нейропатии
(n=888) RAC1
Т>С
rs7784465 T/T 41 (82%) 563 (63.4%) 0.0039 1.00 C/T-C/C 9 (18%) 325 (36.6%) 2.77 (1.30-5.89) С 11,0% 20,6% - - ¹Уровень значимости ассоциации с поправками на ковариаты - возраст и индекс массы тела;
²Отношения шансов и 95% доверительный интервал с поправками на ковариаты - возраст и индекс массы тела.

Резюме

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что аллель rs7784465-С гена RAC1 является генетическим фактором риска развития диабетической дистальной нейропатии у пациенток с сахарным диабетом 2 типа (OR=2,77).

Использование предложенного способа позволит прогнозировать развитие диабетической дистальной нейропатии у пациенток с сахарным диабетом 2 типа, что даст возможность осуществлять мероприятия по профилактике дистальной нейропатии - диспансерное наблюдение, регулярный контроль уровня глюкозы в крови, нормализацию массы тела, достаточную физическую активность, правильное питание с ежедневным включением в рацион свежих овощей и фруктов и ограничением рафинированных углеводов и жиров.

Изобретение относится к медицине, а именно к медицинской диагностике, и может быть использовано для прогнозирования риска развития диабетической дистальной полинейропатии у женщин с сахарным диабетом 2 типа. Осуществляют забор образца периферической венозной крови. После экстракции ДНК проводят анализ полиморфного варианта гена малой ГТФ-азы RAC1 rs7784465 (T>C). В случае выявления аллеля rs7784465-C прогнозируют повышенный риск формирования диабетической дистальной полинейропатии у женщин с сахарным диабетом 2 типа. При обнаружении генотипа rs7784465-Т/Т прогнозируют низкий риск развития диабетической дистальной полинейропатии у женщин с сахарным диабетом 2 типа. Способ обеспечивает получение новых критериев оценки риска формирования диабетической периферической нейропатии у женщин Центральной России с сахарным диабетом 2 типа по данным о генетическом полиморфизме rs7784465 (Т>С). 1 ил., 1 табл.

Способ прогнозирования риска развития диабетической дистальной полинейропатии у женщин с сахарным диабетом 2 типа, включающий забор образца периферической венозной крови, отличающийся тем, что после экстракции ДНК проводят анализ полиморфного варианта гена малой ГТФ-азы RAC1 rs7784465 (T>C) и прогнозируют повышенный риск формирования диабетической дистальной полинейропатии у женщин с сахарным диабетом 2 типа в случае выявления аллеля rs7784465-C, а при обнаружении генотипа rs7784465-Т/Т – низкий риск развития диабетической дистальной полинейропатии у женщин с сахарным диабетом 2 типа.