Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к способу опосредованного определения концентрации рибонуклеопротеина производственного штамма «РИЧ» возбудителя коронавирусной инфекции в сырье для культуральных вакцин по данным цикла количественной оценки для ампликонов таргетного участка М-гена коронавируса.
Коронавирусное заболевание собак проявляется воспалением тонкого отдела кишечника от легкой до тяжелой степени. При хроническом течении приводит к атрофии ее слизистой оболочки у щенков [1]. Данное заболевание особенно в последние годы представляет собой серьезную проблему, которой уделяют внимание как медицинские международные организации, так и ветеринарные службы всех стран мира [2].
Возбудитель коронавирусной инфекции собак принадлежит виду Canine Coronavirus (CCoV), роду Alphacoronavirus, подсемейству Orthocoronavirinae, семейству Coronaviridae [3].
Геном коронавируса представлен одноцепочечной положительно заряженной молекулой РНК длиной 29400-30000 н.о. Около 2/3 геномной РНК вируса занимают две большие, частично перекрывающиеся открытые рамки считывания (ORF), ORF1a и ORF1b, которые кодируют два полипротеина, приводящих к образованию вирусной репликазы. C 3'-конца 1/3 генома (примерно 9000 н.о.) состоит из других ORF, кодирующих структурные и неструктурные белки. Структурные белки включают белки S, Е, М и N, кодируемые ORF2, ORF4, ORF5 и ORF6 соответственно [4].
Пять основных генов кодируют следующие белки: шипообразный белок (S-белок), мембранный гликопротеин (М-белок), нуклеокапсид (N-белок), белок оболочки (Е-белок) и ORF1ab (большой полипротеин, известный как репликаза/протеаза). М-белок - мембранный белок с тройным охватом, который является наиболее распространенным белком в вирионе. Он играет центральную роль в сборке и морфогенезе вирионов, а также определяет форму вирусной оболочки. Взаимодействия между М-белками являются основной движущей силой формирования оболочки вириона. Кроме того, для полного формирования вириона ему необходимо взаимодействовать с другими структурными белками коронавируса. Взаимодействие спайкового S- с М-белком не требуется для процесса сборки. Связывание М- и N-протеинов стабилизирует нуклеокапсид (комплекс N-белок-РНК), а также внутреннее ядро вирионов и, таким образом, способствует завершению сборки вируса [3, 5]. Геномная РНК коронавируса, N-, М-белки и ORF1ab формируют рибонуклеопротеин, который является не менее важным иммуногенным компонентом культуральных вакцинных препаратов против коронавирусной инфекции собак, чем S-белок. Плавучая плотность рибонуклеопротеина составляет 1,65±0,04 г/см3 [6].
Система мер борьбы с альфа-коронавирусной инфекцией у собак и ее профилактики предусматривает иммунизацию животных, а также контроль уровня напряженности поствакцинального иммунитета [4, 7].
Для вакцинации щенков применяют культуральные вакцины против альфа-коронавирусной инфекции собак. В процессе производства данных вакцин промышленное сырье исследуют на определение концентрации рибонуклеопротеина альфа-коронавируса собак.
Как правило, для определения данного компонента применяют спектрометрический метод, который предусматривает процесс ультрацентрифугирования по выделению фракции рибонуклеопротеина [2] (прототип). Существенными недостатками указанного способа являются: 1) ограничения по чувствительности из-за фона анализируемого соединения; 2) трудоемкость процесса по причине использования процесса ультрацентрифугирования; 3) субъективность получаемых результатов по причине сложности отбора опалесцирующей фракции после центрифугирования в градиенте плотности хлористого цезия; 4) продолжительность проводимого анализа (не менее 48 ч); 5) высокая вероятность контаминации исследуемых образцов [8-11].
В связи с этим целесообразно провести поиск способа опосредованного определения концентрации рибонуклеопротеина производственного штамма «РИЧ» возбудителя коронавирусной инфекции в сырье для культуральных вакцин с помощью современных методов исследования.
Данный метод позволяет опосредованно определять концентрацию рибонуклеопротеина в производственном сырье для изготовления культуральных вакцин против коронавирусной инфекции собак в течение 2,5 часов (быстрее в 19 раз по сравнению с прототипом); не имеет ограничений по чувствительности по причине вычитания фоновых значений; менее трудоемкий по сравнению с прототипом; высокочувствительный и объективный.
Задачей настоящего изобретения является разработка, высокочувствительного и высокоспецифичного способа опосредованного определения концентрации рибонуклеопротеина производственного штамма «РИЧ» возбудителя коронавирусной инфекции в сырье для культуральных вакцин по данным цикла количественной оценки для ампликонов таргетного участка М-гена коронавируса с целью устранения вышеуказанных недостатков.
Данная задача решена благодаря созданию способа опосредованного определения концентрации рибонуклеопротеина производственного штамма «РИЧ» возбудителя коронавирусной инфекции в сырье для культуральных вакцин по данным цикла количественной оценки для ампликонов таргетного участка М-гена коронавируса, который позволяет:
1) сократить время проведения анализа промышленного сырья для изготовления культуральных вакцин против коронавирусной инфекции собак по определению концентрации рибонуклеопротеина вируса до 2,5 ч;
2) исключить вероятность контаминации;
3) повысить чувствительность и специфичность анализа;
4) исключить фактор субъективности получаемых результатов по причине использования приборного обеспечения для детекции результатов;
5) повысить достоверность проводимого анализа благодаря установлению зависимости между концентрацией рибонуклеопротеина штамма «РИЧ» коронавируса собак (СРНП CCoV-РИЧ) и циклом количественной оценки ампликонов таргетного участка М-гена (CQ-М), представленной в виде квадратичной функции:
СРНП CCoV-РИЧ = -0,0016 × CQ-М2 - 0,2402 × CQ-M + 9,2609
с высокой достоверностью аппроксимации (R2=0,9995) и эффективностью амплификации (Е) 100,06%.
Предложенная модель позволяет опосредованно определять концентрацию рибонуклеопротеина производственного штамма «РИЧ» возбудителя коронавирусной инфекции в сырье для изготовления культуральных вакцин по данным цикла количественной оценки для ампликонов таргетного участка М-гена коронавируса.
Сущность изобретения отражена на графических изображениях:
Фиг. 1 - Электрофореграмма очищенного рибонуклеопротеина штамма «РИЧ» возбудителя коронавирусной инфекции собак. Примечание: в первой позиции представлен маркер молекулярного веса, во второй позиции - положительный контрольный образец.
Фиг. 2 - Зависимость концентрации рибонуклеопротеина штамма «РИЧ» коронавируса собак (СРНП CCoV-РИЧ) и цикла количественной оценки ампликонов таргетного участка М-гена (CQ-М) (n=3, отмечены точки, отображающие средние значения циклов количественной оценки).
Фиг. 3 - Дизайн оригинальных специфичных олигонуклеотидных праймеров и молекулярного зонда для разработки способа опосредованного определения концентрации рибонуклеопротеина штамма «РИЧ» коронавируса собак (СРНП CCoV-РИЧ) по данным цикла количественной оценки ампликонов таргетного участка М-гена.
Сущность изобретения пояснена в перечне последовательностей, в котором:
SEQ ID NO: 1 представляет последовательность нуклеотидов М-гена кДНК коронавируса собак производственного штамма «РИЧ»;
SEQ ID NO: 2 представляет последовательность аминокислот М-гена кДНК коронавируса собак производственного штамма «РИЧ».
Сущность изобретения заключается в особом подходе по опосредованному определения концентрации рибонуклеопротеина производственного штамма «РИЧ» возбудителя коронавирусной инфекции в сырье для культуральных вакцин по данным цикла количественной оценки для ампликонов таргетного участка М-гена коронавируса.
Заявляемый способ основан на: 1) твердофазной экстракции РНК возбудителя коронавирусной инфекции собак с применением частиц диоксида кремния диаметром 300-310 нм, обработанных 5 М гидроксидом натрия; 2) обратной транскрипции и амплификации специфического фрагмента М-гена кДНК коронавируса собак с применением оригинальных специфических праймеров и молекулярного зонда, меченого флуоресцентным красителем FAM (λmax флуоресценции = 520 нм) и тушителем свечения RHQ-1 (λmax поглощения = 520 нм); 3) детектировании ампликонов с помощью флуоресцентного свечения и отображения накопления сигнала в виде сигмоидного графика; 4) определении значений циклов количественной оценки CQ-М; 5) расчете концентрации рибонуклеопротеина штамма «РИЧ» возбудителя коронавирусной инфекции собак с применением функции второй степени:
СРНП CCoV-РИЧ=-0,0016×CQ-М2-0,2402×CQ-M+9,2609
с высокой достоверностью аппроксимации (R2=0,9995) и эффективностью амплификации (Е) 100,06%.
В настоящее время обратная транскрипция и реакция амплификации в режиме реального времени используется для выявления нуклеиновой кислоты и генотипирования возбудителя коронавирусной инфекции собак. Для количественной оценки антигена коронавируса в промышленном сырье для изготовления культуральных вакцин против коронавирусной инфекции собак, в частности, для определения концентрации рибонуклеопротеина штамма «РИЧ» коронавируса собак, ранее данный метод с применением разработанной системы оригинальных олигонуклеотидов не применялся. Таким образом, сведений об аналогах предлагаемого способа опосредованного определения концентрации рибонуклеопротеина производственного штамма «РИЧ» возбудителя коронавирусной инфекции в сырье для культуральных вакцин по данным цикла количественной оценки для ампликонов таргетного участка М-гена коронавируса авторами не обнаружено.
Разработанный способ опосредованного определения концентрации рибонуклеопротеина производственного штамма «РИЧ» возбудителя коронавирусной инфекции в сырье для культуральных вакцин по данным цикла количественной оценки для ампликонов таргетного участка М-гена коронавируса по сравнению с прототипом отличается более высокой чувствительностью и специфичностью, быстротой выполнения анализа и снижением риска контаминации исследуемых образцов.
В отличие от прототипа разработанный способ включает следующие этапы анализа: 1) выделение РНК возбудителя коронавирусной инфекции собак с применением частиц диоксида кремния диаметром 300-310 нм, обработанных 5 М гидроксидом натрия; 2) реверсия РНК и ПНР в режиме реального времени при амплификации специфического фрагмента М-гена кДНК штамма «РИЧ» коронавируса собак с применением оригинальных специфических праймеров и молекулярного зонда; 3) детектирование ампликонов с помощью флуоресцентного свечения и отображения накопления сигнала в виде сигмоидного графика; 4) определение значений циклов количественной оценки CQ-М; 5) расчет концентрации рибонуклеопротеина штамма «РИЧ» возбудителя коронавирусной инфекции собак с применением функции второй степени:
СРНП CCoV-РИЧ =-0,0016×CQ-М2 -0,2402×CQ-М+9,2609
c высокой достоверностью аппроксимации (R2=0,9995) и эффективностью амплификации (Е) 100,06%.
Применение предложенного способа позволит сократить время проведения анализа промышленного сырья при изготовлении культуральных вакцин против коронавирусной инфекции собак по определению концентрации рибонуклеопротеина вируса до 2,5 ч; исключить вероятность контаминации; повысить чувствительность и специфичность анализа; исключить фактор субъективности получаемых результатов по причине наличия приборного обеспечения для детекции результатов; повысить достоверность проводимого анализа благодаря установлению зависимости между концентрацией рибонуклеопротеина штамма «РИЧ» коронавируса собак (СРНП CCoV-РИЧ) и циклом количественной оценки ампликонов таргетного участка М-гена (CQ-М). Исходя их этого, актуально применять разработанный способ для опосредованного определения концентрации рибонуклеопротеина производственного штамма «РИЧ» возбудителя коронавирусной инфекции в сырье для культуральных вакцин по данным цикла количественной оценки для ампликонов таргетного участка М-гена коронавируса.
Ключевым элементом заявляемого способа является определение циклов количественной оценки для ампликонов таргетного участка М-гена коронавируса (CQ-М) и расчет концентрации рибонуклеопротеина производственного штамма «РИЧ» возбудителя коронавирусной инфекции в сырье для культуральных вакцин с использованием разработанной квадратичной функции.
Сопоставительный анализ с прототипами позволяет сделать вывод, что новизна и изобретательский уровень заявляемого изобретения заключается в применении реакции амплификации с использованием разработанных оригинальных специфичных олигонуклеотидов, рассчитанных на участок М-гена кДНК штамма «РИЧ» коронавируса собак, и разработанной функции второй степени зависимости СРНП CCoV-РИЧ и CQ-М (фиг. 2).
Технический результат изобретения заключается в том, что разработанный способ дает возможность: 1) повысить чувствительность и специфичность за счет применения высокоспецифичных оригинальных праймеров и молекулярного зонда, рассчитанных для таргетного участка М-гена кДНК штамма «РИЧ» коронавируса собак; 2) увеличить достоверность проводимого анализа благодаря подбору оптимальных температурного и временного режимов термоциклирования; 3) быстрее в 19 раз по сравнению с прототипом опосредованно проводить определение концентрации рибонуклеопротеина производственного штамма «РИЧ» возбудителя коронавирусной инфекции в сырье для культуральных вакцин по данным цикла количественной оценки для ампликонов таргетного участка М-гена коронавируса.
Сущность предлагаемого изобретения пояснена на графических материалах - «Зависимость концентрации концентрацией рибонуклеопротеина штамма «РИЧ» коронавируса собак (СРНП CCoV-РИЧ) и цикла количественной оценки ампликонов таргетного участка М-гена (CQ-М)» (фиг. 2) и «Дизайн оригинальных специфичных олигонуклеотидных праймеров и молекулярного зонда для разработки способа опосредованного определения концентрации рибонуклеопротеина штамма «РИЧ» коронавируса собак (СРНП CCoV-РИЧ) по данным цикла количественной оценки ампликонов таргетного участка М-гена (фиг. 3).
С целью определения концентрации рибонуклеопротеина производственного штамма «РИЧ» возбудителя коронавирусной инфекции в сырье для культуральных вакцин по данным цикла количественной оценки для ампликонов таргетного участка М-гена коронавируса отдельно подготавливают положительный контрольный образец. Для этого проводят репродукцию штамма «РИЧ» коронавируса собак в монослойной перевиваемой клеточной линии почки кошки Крэнделла Риса CRFK (Crandell Feline Kidney) до получения 95-100% поражения клеток в течение 72 ч.
Полученную вируссодержащую суспензию после культивирования подвергают центрифугированию при 2000 g в течение 10 минут. Супернатант отбирают для последующих исследований. Проводят ультрацентрифугирование в ступенчатом градиенте хлорида цезия (CsCl) (17-24%) при 60000 g в течение 2 ч при температуре 15±2°С. Опалесцирующий слой отбирают в отдельный пенициллиновый флакон, переносят в центрифужные пробирки, доливают объем пробирок с помощью 1/15 М буферного раствора ФСБ. Осаждают рибонуклеопротеин для очищения от остатков хлористого цезия с помощью центрифугирования при 60000 g в течение 1 ч при 15±2°С. Полученный осадок растворяют в необходимом количестве буферного 1/15 М раствора ФСБ.
В готовой суспензии определяют концентрацию рибонуклеопротеина с помощью спектрометрического метода. Проводят вертикальный белковый гель-электрофорез в полиакриламидном геле, содержащем додецилсульфат натрия, для оценки степени чистоты положительного контрольного препарата. Таким образом, получают охарактеризованный положительный контрольный образец, который вместе с исследуемыми пробами используют в дальнейшей работе.
На следующем этапе исследования составляют контрольную панель положительных стандартов рибонуклеопротеина штамма «РИЧ» возбудителя коронавирусной инфекции собак, в качестве которых используют очищенные препараты со следующими концентрациями аналита: 0,01; 1,0; 2,0; 3,0; 4,0; 5,0; 6,0; 7,0; 8,0 мкг/мл. В качестве отрицательного контроля применяют суспензию клеток линии CRFK, не контаминированную микроорганизмами.
Из всех стандартных положительных и отрицательного контролей, а также тестируемых проб промышленного сырья выделяют нуклеиновую кислоту. Для этого применяют метод твердофазной экстракции с применением частиц гидроокиси кремния диаметром 300-310 нм, обработанных 5 М раствором гидроксида натрия.
К 100 мкл исследуемого образца добавляют 400 мкл хаотропного денатурирующего агента 5 М гуанидинизотиоцианата (ГТЦ), перемешивают на вортексе в течение 5 минут для денатурирования белковых составляющих. К полученному лизату добавляют 20 мкл суспензии частиц диоксида кремния диаметром 300-310 нм, обработанных 5 М раствором гидроксида натрия. Проводят инкубирование в процессе медленного перемешивания на вортексе в течение 5 мин. Суспензию центрифугируют при 250 g, удаляют супернатант, и проводят промывание частиц от ингибиторов реакции амплификации с помощью 5 М раствора ГТЦ, добавляя его к осадку в объеме 400 мкл. Смесь центрифугируют при 250 g, удаляют надосадочную жидкость. Проводят отмывание частиц сорбента с применением 85%-ного раствора изопропилового спирта в объеме по 400 мкл. Осуществляют центрифугирование содержимого пробирки при тех же условиях. Данную процедуру проводят дважды. Осадок частиц сорбента с адсорбированными молекулами нуклеиновой кислоты высушивают от остатков изопропилового спирта с помощью сухого твердотельного термостата при температуре 60±2°С в течение 5 минут. К высушенному осадку добавляют 50 мкл деионизированной воды MilliQ, свободной от РНКаз и ионов Mg2+, прогревают содержимое пробирки при температуре 60±2°С в течение 2 минут для получения элюата. Содержимое пробирки центрифугируют при 10 000 g в течение 1 минуты, и отбирают экстракт РНК.
Проводят обратную транскрипцию для получения комплементарной ДНК (кДНК) коронавируса собак и реакцию амплификации. Для этого готовят реакционную смесь, рецептура которой представлена в таблице 1. Дизайн олигонуклеотидов отражен в таблице 2. Расчет праймеров и зонда осуществляли на основании нуклеотидной последовательности М-гена штамма «РИЧ» возбудителя коронавирусной инфекции собак.
В качестве гомологичных участку М-гена производственного штамма «РИЧ» коронавируса собак используют следующие олигонуклеотиды:
CCoV-RNP-F- праймер с дизайном
5'-GAACTTCAGCTGGTCTATAATATTGA-3',
CCoV-RNP-R-праймер с дизайном
5'-GCATTTTAATGCCATACACGAACC-3',
CCoV-RNP-P-FAM/RTQ1-зонд с дизайном
5'- FAM-ACTGTGTTACATTACGGTAGACCT-RTQ1 -3',
в концентрации 8 пМ на реакцию. Для формирования нуклеотидных цепей продуктов реакции применяют дезоксирибонуклеозидтрифосфаты с их суммарной концентрацией в реакционной смеси 2,3 мМ. В качестве основы используют буферный раствор (5-кратный), содержание которого составляет 20% от общего объема реакционной смеси. Буферный раствор включает в свой состав ионы калия (К+) (5⋅10-2М) и диметилсульфооксид (DMSO) (1%). DMSO включают в реакционную смесь для сведения к минимуму неспецифического связывания олигонуклеотидов. В смесь также добавляют 3,2 мМ хлорида магния. В качестве катализатора реакции амплификации применяют Taq-ДЦК - зависимую ДНК - полимеразу (2 е.а.). Элюаты суммарной РНК вируса бешенства каждого образца добавляют к реакционной смеси по 5 мкл. Итоговый объем смеси для проведения одной реакции составляет 25 мкл.
Олигонуклеотиды подбирали в соответствии с рядом общих правил, которые отражены в работах В. Deiman и R. Sooknanan [12, 13]. Длины прямого, обратного праймеров и зонда составляют 26, 24 и 24 и.о., что соответствует требованиям (20-30 и.о.). Молекулярный вес олигонуклеотидов равен 7984,3; 7280,8 и 7342,9 (с учетом флуорофора и гасителя свечения), соответственно. Праймеры и зонд очищены в полиакриламидном геле и с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии, соответственно. Нуклеотидная последовательность зонда не комплементарна олигонуклеотидным праймерам. Отсутствуют 4 и более подряд одинаковых нуклеотидов в цепи праймеров и зонда. Флуорофор FAM присоединен к 5'-концу, а гаситель флуоресценции RHQ1 - к 3'-концу. Данные условия соответствуют требованиям, предъявляемым к олигонуклеотидным праймерам и молекулярному зонду, которые участвуют в реакции амплификации. В качестве флуоресцентного красителя был выбран FAM с длиной волны максимальной флуоресценцией 520 нм. Для тушения свечения использовали гаситель флуоресценции RHQ1 с длиной волны максимального поглощения при 520 нм и возможном диапазоне гашения 470-570 нм. Таким образом, была выбрана подходящая пара «флуорофор-гаситель».
При анализе нуклеотидных последовательностей олигонуклеотидов установили, что для праймеров и зонда не характерно образование «шпилек», а также не выявлено 3'-комплементарности и сайтов, отжигающих сами на себя при условии, когда минимальное количество пар оснований, необходимое для димеризации праймера и минимальное количество пар оснований, необходимое для образования шпильки - 4.
Проведено определение температур плавления (Tm) для олигонуклеотидов методом, учитывающим концентрации ионов K+ и диметилсульфооксида (DMSO) [14]
Физические, термодинамические константы и расчет температур плавления (Tm) разработанных олигонуклеотидных праймеров и зонда представлены в таблице 3, из которой следует, что энтропия, энергия Гиббса и энтальпия для прямого праймера составили 195,0 ккал/моль, 29,7 ккал/моль, 516,8 кал/(°K⋅моль), соответственно. Энтропия, энергия Гиббса и энтальпия для обратного праймера составили 194,4 ккал/моль, 29,9 ккал/моль, 514,5 кал/(°K⋅моль), соответственно. Энтропия, энергия Гиббса и энтальпия для молекулярного зонда составили 194,0 ккал/моль, 29,6 ккал/моль, 514,2 кал/(°K⋅моль), соответственно [15]. Полученные значения использовались для расчета температур плавления представленных олигонуклеотидов. Tm при использовании алгоритма ближайших соседей для всех олигонуклеотидов составили по 62°С.
Экспериментально температуру отжига определяли по кривым плавления гетеродимера олигонуклеотида и матрицы с помощью модели фолдинга с использованием программного обеспечения Hybrid. В результате проведения эксперимента было выявлено, что температура отжига рассматриваемых олигонуклеотидов составляет 63°С. Для проведения реакции амплификации было решено проводить гибридизацию праймеров и зонда с участком М-гена кДНК штамма «РИЧ» коронавируса собак при температуре 63°С.
Последовательности оригинальных олигонуклеотидов проверили на наличие нежелательных совпадений с другими последовательностями нуклеиновых кислот с использованием Банка данных последовательности нуклеиновых кислот вируса бешенства. Последовательности праймеров и зонда также проанализировали на наличие внутренних вторичных структур с помощью программы сворачивания нуклеиновых кислот с помощью программы Mfold [16, 17]. Выявлено, что для разработанных олигонуклеотидов нежелательных совпадений с другими последовательностями нуклеиновых кислот, а также наличия внутренних вторичных структур не обнаружено.
Проведение обратной транскрипции и реакции амплификации в режиме реального времени осуществляли в детектирующем термоциклере любой марки при температурных и временных параметрах, сведения о которых представлены в таблице 4.
Обратную транскрипцию проводят при температуре 50°С в течение 15 минут. Перед проведением реакции амплификации осуществляют предварительный прогрев смеси при температуре 96°С в течение 3 минут для активации фермента Taq-ДНК-полимеразы и инактивации AMV-ревертазы. Амплификация включает в себя 3 подэтапа: денатурацию, отжиг олигонуклеотидов, элонгацию. Денатурацию проводят при температуре 96°С в течение 10 с, отжиг праймеров и зонда и элонгацию - при температуре 63°С в течение 60 с.
Результаты реакции амплификации анализируют, оценивая и сравнивая графики накопления флуоресцентного сигнала по значениям циклов количественной оценки (CQ-М, определенных с помощью пересечения пороговой линии и сигмоидной функции вида F1=f (CQ-М). Учет результатов в реакции происходит на каждом цикле. Прибор определяет уровень флуоресценции и строит кинетическую кривую в координатах: уровень флуоресценции - цикл реакции амплификации. При наличии в исследуемой пробе специфической кДНК-матрицы сигмоида имеет экспоненциальную зависимость. Положительными считаются пробы, которым соответствуют сигмоидные графики, полученные при анализе флуоресценции красителя FAM, входящего в состав молекулярного зонда. Пробы оцениваются как отрицательные, если при их анализе отсутствует экспоненциальная кривая.
На следующем этапе анализа устанавливают зависимость между циклом количественной оценки и концентрацией рибонуклеопротеина штамма «РИЧ» коронавируса собак в неинактивированном сырье для культуральных вакцин. Оценивают величину эффективности реакции амплификации, а также достоверность аппроксимации (R2). На основе разработанной квадратичной модели рассчитывают значение концентрации рибонуклеопротеина штамма «РИЧ» коронавируса собак в неинактивирвоанном сырье для культуральных вакцин.
Сущность предлагаемого изобретения пояснена примерами его использования, которые не ограничивают объем изобретения.
Пример 1. Получение положительного контрольного образца для выявления зависимости между циклом количественной оценки и концентрации ри6онуклеопротеина штамма «РИЧ» коронавируса собак в неинактивированном сырье для культуральных вакцин.
Для получения положительного контрольного образца проводили репродукцию штамма «РИЧ» коронавируса собак в монослойной перевиваемой клеточной линии почки кошки CRFK до получения 95-100% поражения клеток в течение 72 ч.
Полученную вируссодержащую суспензию после культивирования подвергали центрифугированию при 2000 g в течение 10 минут. Супернатант отбирают для последующих исследований. Проводили ультрацентрифугирование в ступенчатом градиенте хлорида цезия (CsC1) (17-24%) в соответствии с протоколом, описанным Dietzschold (1996) [8] при 60000 g в течение 2 ч при температуре 15±2°С. Опалесцирующий слой отбирали в отдельный пенициллиновый флакон, переносят в центрифужные пробирки, доливали объем пробирок с помощью 1/15 М буферного раствора ФСБ. Осаждали рибонуклеопротеин для очищения от остатков хлористого цезия с помощью центрифугирования при 60000 g в течение 1 ч при 15±2°С. Полученный осадок растворяли в необходимом количестве буферного 1/15 М раствора ФСБ.
В готовой суспензии определяли концентрацию рибонуклеопротеина с помощью спектрометрического метода (прототип). По данным прототипного способа анализа концентрация рибонуклеопротеина составляла 5500 мкг/мл. Проводили вертикальный белковый гель-электрофорез в полиакриламидном геле, содержащем додецилсульфат натрия, для оценки степени чистоты положительного контрольного препарата. Результаты вертикального электрофореза отражены на фиг. 1, из которого следует, что получен чистый препарат рибонуклеопротеина коронавируса собак. Из данного препарата с помощью 1/15 М раствора ФСБ приготовили положительный контрольный образец с концентрацией рибонуклеопротеина штамма «РИЧ» возбудителя коронавирусной инфекции собак 8,0 мкг/мл. Таким образом, получили охарактеризованный положительный контрольный образец, который вместе с исследуемыми пробами использовали в дальнейшей работе.
Пример 2. Выражение функции зависимости концентрации рибонуклеопротеина штамма «РИЧ» коронавируса собак в сырье для изготовления культурных вакцин и цикла количественной оценки.
Для выражения функции зависимости концентрации рибонуклеопротеина штамма «РИЧ» коронавируса собак в сырье для изготовления культуральных вакцин и цикла количественной оценки составляли контрольную панель положительных стандартов рибонуклеопротеина штамма «РИЧ» возбудителя коронавирусной инфекции собак, в качестве которых использовали очищенные препараты со следующими концентрациями аналита: 0,01; 1,0; 2,0; 3,0; 4,0; 5,0; 6,0; 7,0; 8,0 мкг/мл. В качестве отрицательного контроля применяли суспензию клеток линии CRFK, не контаминированную микроорганизмами.
Из всех стандартных положительных и отрицательного контролей, а также тестируемых проб промышленного сырья выделяли нуклеиновую кислоту, как описано выше.
Проводили обратную транскрипцию для получения комплементарной ДНК (кДНК) коронавируса собак и реакцию амплификации, как указано выше.
Результаты реакции амплификации анализировали, оценивали и сравнивали графики накопления флуоресцентного сигнала по значениям циклов количественной оценки CQ-М, определенных с помощью пересечения пороговой линии и сигмоидной функции вида Fl=f (CQ-М). Устанавливали зависимость между циклом количественной оценки и концентрацией рибонуклеопротеина штамма «РИЧ» коронавируса собак в сырье для культуральной вакцины в процессе построения графика квадратичной функции. Полученные данные отражены на фиг. 2 и выражены в виде математической модели второй степени:
СРНП CCoV- РИЧ=-0,0016×CQ-.М2 -0,2402×CQ-М+9,2609
с высокой достоверностью аппроксимации (R2=0,9995) и эффективностью амплификации (Е) 100,06%, что соответствовало общепринятым требованиям, предъявляемым к молекулярно-биологическим тест-системам [18].
Пример 3. Тестирование способа опосредованного определения концентрации рибонуклеопротеина производственного штамма «РИЧ» возбудителя коронавирусной инфекции в сырье для культуральных вакцин по данным цикла количественной оценки для ампликонов таргетного участка М-гена коронавируса
Для анализа использовали 6 суспензий культурального коронавируса собак производственного штамма «РИЧ» со следующими концентрациями рибонуклеопротеина: 0,52; 1,45; 2,98; 3,54; 4,65; 5,78 мкг/мл, соответственно (пробы №1-6). В качестве положительного контроля применяли суспензию рибонуклеопротеина штамма «РИЧ» коронавируса собак с концентрацией аналита 8,00 мкг/мл. Отрицательным контролем служила суспензия клеток линии CRFK, не контаминированную микроорганизмами. Испытуемые пробы и контрольные образцы исследовали в трех повторностях. Все этапы исследования проводили, как представлено выше.
По результатам исследования определили, что средние значения циклов количественной оценки для проб №1-6 составляли 30,52±0,01, 27,39±0,01, 22,35±0,02, 20,45±0,01, 16,80±0,01, 13,08±0,01, соответственно.
Пользуясь разработанной квадратичной функцией:
СРНП CCoV-РИЧ=-0,0016×CQ-М2-0,2402×CQ-М+9,2603, рассчитали средние значения концентрации рибонуклеопротеина для проб №1-6, которые составили 0,52; 1,46; 2,98; 3,55; 4,65; 5,77 мкг/мл, соответственно (различия не существенны, p<0,005). Для положительного контроля значение CQ-М составило 5,68±0,01, что соответствовало концентрации рибонуклеопротеина коронавируса собак, равной 8,0 мкг/мл. Для отрицательного контроля сигмоида не была сформирована, что означало отсутствие возбудителя коронавирусной инфекции в данном контроле.
Таким образом, разработанный способ позволяет опосредованно определять концентрацию рибонуклеопротеина производственного штамма «РИЧ» возбудителя коронавирусной инфекции в сырье для культуральных вакцин по данным цикла количественной оценки для ампликонов таргетного участка М-гена коронавируса.
Пример 4. Определение степени достоверности способа опосредованного определения концентрации рибонуклеопротеина производственного штамма «РИЧ» возбудителя коронавирусной инфекции в сырье для культуральных вакцин по данным цикла количественной оценки для ампликонов таргетного участка М-гена коронавируса.
Для подтверждения степени достоверности использовали 350 суспензий культурального коронавируса производственного штамма «РИЧ» с концентрациями рибонуклеопротеина 0,01-8,00 мкг/мл. Анализ проводили, как описано выше, в трех повторностях.
Интерпретацию результатов проводили, пользуясь разработанной квадратичной функцией, представленной выше, с получением значений СРНП CCoV-РИЧ для каждой из 350 проб. Для положительного контроля значение CQ-М составило 5,68±0,01, что соответствовало концентрации рибонуклеопротеина коронавируса собак, равному 8,00 мкг/мл. Для отрицательных контролей сигмоида не была сформирована, что означало отсутствие в нем возбудителя коронавирусной инфекции.
Данные, полученные с помощью разработанного способа (табл. 5), коррелировали со значениями стандартов на 99,90-100,00% для 8,0-5,0 мкг/мл (n=70), на 99,42-99,87% для 4,9-2,0 мкг/мл (n=70), на 99,01-99,78% для 1,9-0,3 мкг/мл (n=70), на 97,06-99,58% для 0,29-0,01 мкг/мл (n=70), на 91,23-97,06% для концентрации менее 0,01 мкг/мл (n=70).
Аналитическая чувствительность составила не менее 0,01 мкг/мл с достоверностью определения концентрации рибонуклеопротеина 97,06%. Таким образом, полученные результаты свидетельствовали о высокой степени точности разработанного способа опосредованного определения концентрации рибонуклеопротеина производственного штамма «РИЧ» возбудителя коронавирусной инфекции в сырье для культуральных вакцин по данным цикла количественной оценки для ампликонов таргетного участка М-гена коронавируса.
Пример 5. Определение специфичности разработанного способа опосредованного определения концентрации рибонуклеопротеина производственного штамма «РИЧ» возбудителя коронавирусной инфекции в сырье для культуральных вакцин по данным цикла количественном оценки для таргетного участка М-гена коронавируса.
Для оценки специфичности разработанного способа опосредованного определения концентрации рибонуклеопротеина производственного штамма «РИЧ» возбудителя коронавирусной инфекции в сырье для культуральных вакцин по данным цикла количественной оценки для ампликонов таргетного участка М-гена коронавируса, исследовали суспензии вируса ящура серотипа Азия-1, а также возбудителей парвовирусного энтерита собак и аденовируса 1 серотипа. Количество инфекционных доз вирусов в суспензиях составляло не менее 4,0 lg ТЦД50/см3 или 4,0 lg ККИД50/см3 Исследования проводили в 5 повторностях.
Этапы исследования проводили, как описано выше. Для проб, содержащих другие вирусы, не наблюдалось формирования графиков экспоненты, и они не выходили за пороговый уровень флуоресцентного сигнала (0,0025 у.е.). Таким образом, разработанный способ является специфичным по отношению к возбудителю коронавирусного заболевания у собак и может быть использован для опосредованного определения концентрации рибонуклеопротеина производственного штамма «РИЧ» возбудителя коронавирусной инфекции в сырье для культуральных вакцин.
Пример 6. Определение диагностических показателей разработанного способа опосредованного определения концентрации рибонуклеопротеина производственного штамма «РИЧ» возбудителя коронавирусной инфекции в сырье для культуральных вакцин по данным цикла количественной оценки для таргетного участка М-гена коронавируса.
Для определения диагностической чувствительности разработанного способа анализировали 450 культуральных суспензий вакцинного штамма «РИЧ» коронавируса собак с разными значениями концентрации рибонуклеопротеина вируса (0,01-8,00 мкг/мл). Данные пробы являлись заведомо положительными. Постановку обратной транскрипции и реакции амплификации в режиме реального времени проводили, как отражено выше. С помощью разработанного способа (предлагаемое изобретение) определили, что из 450 исследуемых образцов в 448 пробах концентрация определена верно, в 2 - отличия были существенными.
Для исследования специфичности метода тестировали 154 отрицательных суспензий клеток линии CRFK, не содержащих коронавирус собак. В результате исследования с помощью разработанного способа (предлагаемое изобретение) определили, что все 154 пробы были отрицательными. Пользуясь представленными выше статистическими методами анализа определили, что в 95% - ном доверительном интервале диагностическая чувствительность (DSe) составила 98,41-99,95%, диагностическая специфичность (DSp) - 97,63-100,0%, k-критерий - 0,991; прогностичность отрицательного результата (NPV) - 95,08-99,68%, общая точность (DAc) - 98,81-99,96% (табл. 6).
Основными преимуществами предлагаемого изобретения является сокращение времени проведения анализа промышленного сырья для изготовления культуральных вакцин против коронавирусной инфекции собак по определению концентрации рибонуклеопротеина вируса до 2,5 часов (в 19 раз быстрее по сравнению с прототипом); исключение вероятности контаминации; повышение аналитической, диагностической чувствительности и специфичности анализа; исключение фактора субъективности получаемых результатов за счет использования приборного обеспечения для детекции результатов; повышение достоверности проводимого анализа благодаря установлению зависимости между концентрацией рибонуклеопротеина штамма «РИЧ» коронавируса собак (СРНП CCoV-РИЧ) и циклом количественной оценки ампликонов таргетного участка М-гена (CQ-М), представленной в виде квадратичной функции:
СРНП CCoV=-0,0016 × CQ-м2-0,2402×CQ-м+9,260
с высокой достоверностью аппроксимации (R2=0,9995) и эффективностью амплификации (Е) 100,06%.
Предложенная модель позволяет быстро опосредованно определять концентрацию рибонуклеопротеина производственного штамма «РИЧ» возбудителя коронавирусной инфекции в сырье при изготовлении культуральных вакцин по данным цикла количественной оценки для ампликонов таргетного участка М-гена коронавируса.
Источники информации, принятые во внимание при составлении описания изобретения к заявке на выдачу патента РФ на изобретение «Способ опосредованного определения концентрации рибонуклеопротеина производственного штамма «РИЧ» возбудителя коронавирусной инфекции в сырье для культуральных вакцин по данным цикла количественной оценки для ампликонов таргетного участка М-гена коронавируса»:
1. Naylor M.J, Harrison G.A, Monckton R.P, McOrist S., Lehrbach P.R., Deane E.M. Identification of canine coronavirus strains from faeces by S gene nested PCR and molecular characterization of a new Australian isolate // J. Clin. Microbiol.-2001.-V. 39.-P. 1036-1041.
2. Bandai C, Ishiguro S., Masuya N., Hohdatsu Т., Mochizuki M. Canine coronavirus infections in Japan: virological and epidemiological aspects // J. Vet. Med. Sci. - 1999. -V. 61. - P. 731-736.
3. Enjuanes, L., Brian, D., Cavanagh, D., Holmes, K., Lai, M.M.C., Laude, H., Masters, P., Rottier, P., Siddell, S., Spaan, W.J.M., Taguchi, F., Talbot, P. Coronaviridae. In: van Regenmortel, M.H.V., Fauquet, С.М., Bishop, D.H.L., Carstens, E.B., Estes, M.K., Lemon, S.M., Maniloff, J., Mayo, M.A., McGeoch, D.J., Pringle, C.R., Wickner, R.B. (Eds.), Virus Taxonomy, Classification and Nomenclature of Viruses. - Academic Press, New York. - 2000. - P. 835-849.
4. Keenan K.P., Jervis H.R., Marchwicki R.H., Binn L.N. Intestinal infection of neonatal dogs with canine coronavirus 1-71: studies by virologic, histologic, histochemical and immunofluorescent techniques // Am. J. Vet. Res. -1976.-V. 37.-P. 247-256.
5. Pratelli A., Tinelli A., Decaro N., Camero M., Elia G., Gentile A., Buonavoglia С. PCR assay for the detection and the identification of atypical canine coronavirus in dogs // J. Virol. Methods - 2002. - V. 106. - P.209-213.
6. Диагностика и профилактика инфекционных болезней кошек и собак: Руководство для практикующих ветеринарных врачей под редакцией Т.И. Алипера. Москва, 2017; 207-212.
7. Naylor M.J., Harrison G.A., Monckton R.P., McOrist S., Lehrbach P.R., Deane E.M. Identification of canine coronavirus strains from faeces by S gene nested PCR and molecular characterization of a new Australian isolate // J. Clin. Microbiol.-2001.-V. 39.-P. 1036-1041.
8. Pratelli A., Tempesta M., Greco G., Martella V., Buonavoglia C. Development of a nested PCR assay for the detection of canine coronavirus // J. Virol. Methods - 1999. - V. 80. - P. 11-15.
9. Pratelli A., Buonavoglia D., Martella V., Tempesta M., Lavazza A., Buonavoglia C. Diagnosis of canine coronavirus infection using nested-PCR // J. Virol. Methods - 2000. - V. 84. - P. 91-94.
10. Pratelli A., Martella V., Elia G., Decaro N., Aliberti A., Buonavoglia D., Tempesta M., Buonavoglia C. Variation of the sequence in the gene encoding for transmembrane protein M of canine coronavirus (CCoV) // Mol. Cell. Probes. -2001.-V. 15.-P. 229-233.
11. Pratelli A., Tinelli A., Decaro N., Camero M., Elia G., Gentile A., Buonavoglia C. PCR assay for the detection and the identification of atypical canine coronavirus in dogs // J. Virol. Methods - 2002. - V. 106. - P. 209-213.
12. Deiman В., van Aarle P., Sillekens P. Characteristics and applications of nucleic acid sequence based amplification // Mol. Biotech. - 2002. - Vol. 20. - P. 163-179.
13. Sooknanan R., van Gemen В., Malek L. Nucleis acid sequence-based amplification // Molecular methods for virus detection-London: Academic press, 1995.-P. 261-285.
14. SantaLucia J. J., Hicks D. The thermodynamics of DNA structural motifs // Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure: journal. -2004.-Vol. 33.-P. 11-14.
15. Молекулярный олигокалькулятор. [Электронный ресурс] / URL: http://www.bio.bsu.by/molbiol/oligocalc.html. (Дата обращения: 25.04.2020).
16. Nicolas von Ahsen, Carl Т. Wittwer, Ekkehard Schütz. Oligonucleotide melting temperatures under per conditions: nearest-neighbor corrections for Mg2+, deoxynucleotide triphosphate, and dimethyl sulfoxide concentrations with comparison to alternative empirical formulas (англ.) // Clinical Chemistry: journal.-2001.-Vol. 47, no. 11.-P. 1956-1961.
17. SantaLucia J. J. A unified view of polymer, dumbbell, and oligonucleotide DNA nearest-neighbor thermodynamics (англ.) // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America: journal. -1998. - Vol. 95, no. 4. - P. 1460-1465.
18. Vallat B. OIE Quality Standard and Guidelines for Veterinary Laboratories : Infectious Diseases. - 2nd ed. - Paris, France, 2008. - 67 p.
--->
<?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?>
<!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing
1.3//EN" "ST26SequenceListing_V1_3.dtd">
<ST26SequenceListing dtdVersion="V1_3" fileName="1710498327038.xml"
softwareName="WIPO Sequence" softwareVersion="2.1.2"
productionDate="2024-03-15">
<ApplicationIdentification>
<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>
<ApplicationNumberText>0</ApplicationNumberText>
<FilingDate>2024-03-12</FilingDate>
</ApplicationIdentification>
<ApplicantFileReference>528</ApplicantFileReference>
<EarliestPriorityApplicationIdentification>
<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>
<ApplicationNumberText>0</ApplicationNumberText>
<FilingDate>2023-07-26</FilingDate>
</EarliestPriorityApplicationIdentification>
<ApplicantName languageCode="ru">ФГБУ "Федеральный центр охраны
здоровья животных" (ФГБУ "ВНИИЗЖ")</ApplicantName>
<ApplicantNameLatin> Federal State-Financed Institution Federal
Centre for Animal Health (FGBI ARRIAH)</ApplicantNameLatin>
<InventorName languageCode="ru">Доронин Максим
Игоревич</InventorName>
<InventorNameLatin>Doronin Maksim Igorevich </InventorNameLatin>
<InventionTitle languageCode="ru">Способ опосредованного определения
концентрации рибонуклеопротеина производственного штамма «РИЧ»
возбудителя коронавирусной инфекции в сырье для культуральных вакцин
по данным цикла количественной оценки для ампликонов таргетного
участка M-гена коронавируса</InventionTitle>
<SequenceTotalQuantity>5</SequenceTotalQuantity>
<SequenceData sequenceIDNumber="1">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>318</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..318</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q1">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>CCoV</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>tttatactttggattatgtattttgttagatccattcagttatacagaa
cgactaagtcttggtggtcttttaaccctgagactaacgcaattctttgccttagtgcattgggaagaag
ctatgtacttccgcttgaaggtgtgccaactggtgtcactctaacattgctttcagggaatctgtatgcg
gaagggttcaaaattgcaggtggtatgaacatcgacaatttgccaaagtacgtaatggttgcattaccta
gcaggaccattgtctacacacttgttggtaagaaattgaaagcaagtagcccccccggg</INSDSeq_s
equence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="2">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>106</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..106</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q3">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>CCoV</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>FILWIMYFVRSIQLYRTTKSWWSFNPETNAILCLSALGRSYVLPLEGVP
TGVTLTLLSGNLYAEGFKIAGGMNIDNLPKYVMVALPSRTIVYTLVGKKLKASSPPG</INSDSeq_seq
uence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="3">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>26</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..26</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>unassigned DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q4">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>CCoV</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>gaacttcagctggtctataatattga</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="4">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>24</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..24</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>unassigned DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q5">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>CCoV</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>gcattttaatgccatacacgaacc</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="5">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>24</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..24</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>unassigned DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q6">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>CCoV</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>actgtgttacattacggtagacct</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
</ST26SequenceListing>
<---
Изобретение относится к области биотехнологии. Описан способ опосредованного определения концентрации рибонуклеопротеина производственного штамма «РИЧ» возбудителя коронавирусной инфекции в сырье для культуральных вакцин по данным цикла количественной оценки для ампликонов таргетного участка М-гена коронавируса. Основными преимуществами предлагаемого изобретения является сокращение времени проведения анализа промышленного сырья для изготовления культуральных вакцин против коронавирусной инфекции собак по определению концентрации рибонуклеопротеина вируса до 2,5 часов, что в 19 раз быстрее по сравнению с прототипом; исключение вероятности контаминации; повышение аналитической и диагностической чувствительности и специфичности анализа; исключение фактора субъективности получаемых результатов за счет наличия приборного обеспечения для детекции результатов; повышение достоверности проводимого анализа благодаря установлению зависимости между концентрацией рибонуклеопротеина штамма «РИЧ» коронавируса собак (СРНП CCoV-РИЧ) и циклом количественной оценки ампликонов таргетного участка М-гена (CQ-М), представленной в виде квадратичной функции с высокой достоверностью аппроксимации (R2=0,9995) и эффективностью амплификации (Е) 100,06%. 3 з.п. ф-лы, 3 ил., 6 табл., 6 пр.
1. Способ опосредованного определения концентрации рибонуклеопротеина производственного штамма «РИЧ» возбудителя коронавирусной инфекции в сырье для культуральных вакцин по данным цикла количественной оценки для ампликонов таргетного участка М-гена коронавируса, включающий амплификацию специфического фрагмента М-гена кДНК штамма «РИЧ» возбудителя коронавирусной инфекции собак с применением следующих специфических олигонуклеотидов:
CCoV-RNP-праймер с дизайном
5'-GAACTTCAGCTGGTCTATAATATTGA-3',
CCoV-RNP-R-праймер с дизайном
5'-GCATTTTAATGCCATACACGAACC-3',
CCoV-RNP-P-FAM/RTQ1-зонд с дизайном
5'-FAM-ACTGTGTTACATTACGGTAGACCT-RTQ1-3',
и определение значений цикла количественной оценки с применением функции второй степени:
СРНП CCoV-РИЧ = -0,0016 × CQ-М2 - 0,2402 × CQ-М + 9,2609.
2. Способ по п. 1, где аналитическая чувствительность составляет не менее 0,01 мкг/мл с достоверностью определения концентрации рибонуклеопротеина 97,06%, в 95%-ном доверительном интервале диагностическая чувствительность составляет 98,41-99,95%, диагностическая специфичность - 97,63-100,0%, k-критерий - 0,991; прогностичность отрицательного результата - 95,08-99,68%, общая точность - 98,81-99,96%.
3. Способ по п. 1, где время проведения анализа сокращается в 19 раз.
4. Способ по п. 1, где достоверность аппроксимации 0,9995 и эффективность амплификации 100,06%.
| Bandai C, Ishiguro S., Masuya N., Hohdatsu Т., Mochizuki M | |||
| Canine coronavirus infections in Japan: virological and epidemiological aspects // J | |||
| Vet | |||
| Med | |||
| Sci | |||
| Металлический водоудерживающий щит висячей системы | 1922 |
|
SU1999A1 |
| -V | |||
| Устройство для сортировки каменного угля | 1921 |
|
SU61A1 |
| - P | |||
| ПРИБОР ДЛЯ СОЖИГАНИЯ НЕФТИ | 1922 |
|
SU731A1 |
| Штамм "Рич" вируса коронавирусного энтерита собак для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики коронавирусного энтерита собак | 2022 |
|
RU2796988C1 |
| Способ опосредованного определения концентрации иммуногенного RNP-комплекса вируса бешенства в сырье для антирабических вакцин методом амплификации и гибридизационно-флуоресцентной детекции ДНК-ампликонов | 2020 |
|
RU2760436C1 |
