СТРАТЕГИИ CRISPR И AAV ДЛЯ ТЕРАПИИ Х-СЦЕПЛЕННОГО ЮВЕНИЛЬНОГО РЕТИНОШИЗИСА Российский патент 2025 года по МПК C12N15/11 A61K48/00 A61P27/02 

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

[0001] Данная заявка испрашивает приоритет на основании заявки на патент США №62/932608, поданной 8 ноября 2019 г., которая включена в настоящий документ посредством ссылки в полном объеме для всех целей.

ССЫЛКА НА ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ, ПОДАННЫЙ В ВИДЕ ТЕКСТОВОГО ФАЙЛА ПОСРЕДСТВОМ EFS WEB

[0002] Перечень последовательностей, записанный в файле 694232SEQLIST.txt, имеет размер 1,22 мегабайта, был создан 6 ноября 2020 г. и настоящим включен посредством ссылки.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

[0003] Ген RS1 кодирует высококонсервативный внеклеточный белок, участвующий в клеточной организации сетчатки. Он собирается и секретируется фоторецепторами и биполярными клетками в виде гомоолигомерного белкового комплекса. В RS1 было выявлено более 200 мутаций, многие из которых приводят к раннему началу дегенерации желтого пятна из-за нефункционального белка или отсутствия секреции белка. Отсутствие экспрессии функционального Rs1 вызывает расслоение слоев сетчатки, что приводит к ранней и прогрессирующей потере зрения, связанной с Х-сцепленным ювенильным ретиношизисом (XLRS). Хотя клинические исследования генной терапии XLRS проводились, в них не были достигнуты их конечные точки. Необходимы новые стратегии для лечения XLRS.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0004] Предложены конструкции нуклеиновых кислот и композиции, которые обеспечивают вставку кодирующей последовательности ретиношизина в целевой геномный локус, такой как эндогенный локус RS1, и/или экспрессию кодирующей последовательности ретиношизина. Конструкции нуклеиновых кислот и композиции могут применяться в способах интеграции в целевой геномный локус и/или экспрессии в клетке, или в способах лечения Х-сцепленного ювенильного ретиношизиса.

[0005] В одном из аспектов предложены двунаправленные конструкции нуклеиновых кислот для интеграции в целевой геномный локус. Некоторые такие конструкции нуклеиновых кислот содержат: (а) первый сегмент, содержащий первую кодирующую последовательность для первого белка ретиношизина или его фрагмента; и (b) второй сегмент, содержащий обратный комплемент второй кодирующей последовательности для второго белка ретиношизина или его фрагмента. В некоторых таких конструкциях второй сегмент расположен с 3'-конца (т.е. по ходу транскрипции) от первого сегмента.

[0006] В некоторых таких конструкциях первый белок ретиношизин или его фрагмент представляет собой белок ретиношизин человека или его фрагмент, второй белок ретиношизин или его фрагмент представляет собой белок ретиношизин человека или его фрагмент, или как первый белок ретиношизин или его фрагмент, так и второй белок ретиношизин или его фрагмент представляют собой белок ретиношизин человека или его фрагмент. В некоторых таких конструкциях первая кодирующая последовательность содержит, по существу состоит из или состоит из комплементарной ДНК (кДНК), вторая кодирующая последовательность содержит, по существу состоит из или состоит из кДНК, или как первая кодирующая последовательность, так и вторая кодирующая последовательность содержат, по существу состоят из или состоят из кДНК. В некоторых таких конструкциях первая кодирующая последовательность содержит, по существу состоит из или состоит из экзонов 2-6 RS1 человека или их вырожденных вариантов, вторая кодирующая последовательность содержит, по существу состоит из или состоит из экзонов 2-6 RS1 человека или их вырожденных вариантов, или как первая кодирующая последовательность, так и вторая кодирующая последовательность содержат, по существу состоят из или состоят из экзонов 2-6 RS1 человека или их вырожденных вариантов.

[0007] В некоторых таких конструкциях первый сегмент содержит фрагмент или часть первого интрона7?£7 человека, расположенные с 5'-конца (т.е. против хода транскрипции) от первой кодирующей последовательности, и/или второй сегмент содержит обратный комплемент фрагмента или части второго интрона RS1 человека, расположенный с 3'-конца (т.е. по ходу транскрипции) от обратного комплемента второй кодирующей последовательности.

[0008] В некоторых таких конструкциях первый белок ретиношизин или его фрагмент идентичен второму белку ретиношизину или его фрагменту. В некоторых таких конструкциях вторая кодирующая последовательность характеризуется использованием кодонов, отличным от использования кодонов первой кодирующей последовательности. В некоторых таких конструкциях второй сегмент обладает по меньшей мере примерно 30%, по меньшей мере примерно 35%, по меньшей мере примерно 40%, по меньшей мере примерно 45%, по меньшей мере примерно 50%, по меньшей мере примерно 55%, по меньшей мере примерно 60%, по меньшей мере примерно 65%, по меньшей мере примерно 70%, по меньшей мере примерно 75%, по меньшей мере примерно 80%, по меньшей мере примерно 85%, по меньшей мере примерно 90%, по меньшей мере примерно 95%, по меньшей мере примерно 97% или по меньшей мере примерно 99% комплементарностью первому сегменту. В некоторых таких конструкциях второй сегмент обладает менее чем примерно 30%, менее чем примерно 35%, менее чем примерно 40%, менее чем примерно 45%, менее чем примерно 50%, менее чем примерно 55%, менее чем примерно 60%, менее чем примерно 65%, менее чем примерно 70%, менее чем примерно 75%, менее чем примерно 80%, менее чем примерно 85%, менее чем примерно 90%, менее чем примерно 95%, менее чем примерно 97% или менее чем примерно 99% комплементарностью первому сегменту. В некоторых таких конструкциях обратный комплемент второй кодирующей последовательности: (а) по существу не комплементарен первой кодирующей последовательности; (b) по существу не комплементарен фрагменту первой кодирующей последовательности; (с) высоко комплементарен первой кодирующей последовательности; (d) высоко комплементарен фрагменту первой кодирующей последовательности; (е) по меньшей мере примерно на 60%, по меньшей мере примерно на 70%, по меньшей мере примерно на 80% или по меньшей мере примерно на 90% идентичен обратному комплементу первой кодирующей последовательности; (f) идентичен обратному комплементу первой кодирующей последовательности на от примерно 50% до примерно 80%; или (g) идентичен обратному комплементу первой кодирующей последовательности на от примерно 60% до примерно 100%.

[0009] В некоторых таких конструкциях первый сегмент связан со вторым сегментом линкером. Необязательно, линкер имеет длину от примерно 5 до примерно 2000 нуклеотидов.

[0010] В некоторых таких конструкциях первый сегмент содержит первую сигнальную последовательность полиаденилирования, расположенную с 3'-конца от первой кодирующей последовательности, а второй сегмент содержит обратный комплемент второй сигнальной последовательности полиаденилирования, расположенный с 5'-конца от обратного комплемента второй кодирующей последовательности. Необязательно первая сигнальная последовательность полиаденилирования отличается от второй сигнальной последовательности полиаденилирования.

[0011] В некоторых таких конструкциях нуклеиновокислотная конструкция не содержит промотора, который управляет экспрессией первого белка ретиношизина или его фрагмента или второго белка ретиношизина или его фрагмента. В некоторых таких конструкциях первый сегмент содержит первый акцепторный сайт сплайсинга, расположенный с 5'-конца от первой кодирующей последовательности, а второй сегмент содержит обратный комплемент второго акцепторного сайта сплайсинга, расположенный с 3'-конца от обратного комплемента второй кодирующей последовательности. Необязательно, первый акцепторный сайт сплайсинга происходит из гена RS1, второй акцепторный сайт сплайсинга происходит из гена RS1, или как первый акцепторный сайт сплайсинга, так и второй акцепторный сайт сплайсинга происходят из гена RS1. Необязательно, первый акцепторный сайт сплайсинга происходит из интрона 1 RS1 человека, второй акцепторный сайт сплайсинга происходит из интрона 1 RS1 человека, или как первый акцепторный сайт, так и второй акцепторный сайт сплайсинга происходят из интрона 1 RS1 человека.

[0012] В некоторых таких конструкциях нуклеиновокислотная конструкция не содержит плеча гомологии. В некоторых таких конструкциях нуклеиновокислотная конструкция содержит плечи гомологии. В некоторых таких конструкциях нуклеиновокислотная конструкция является одноцепочечной. В некоторых таких конструкциях нуклеиновокислотная конструкция является двухцепочечной. В некоторых таких конструкциях нуклеиновокислотная конструкция содержит ДНК.

[0013] В некоторых таких конструкциях первая кодирующая последовательность кодон-оптимизирована для экспрессии в клетке-хозяине, вторая кодирующая последовательность кодон-оптимизирована для экспрессии в клетке-хозяине, или как первая кодирующая последовательность, так и вторая кодирующая последовательность кодон-оптимизированы для экспрессии в клетке-хозяине. В некоторых таких конструкциях нуклеиновокислотная конструкция содержит одну или более из следующих концевых структур: шпилька, петля, инвертированный концевой повтор (ITR) или тороид. Необязательно, нуклеиновокислотная конструкция содержит последовательности ITR.

[0014] В некоторых таких конструкциях первый белок ретиношизин или его фрагмент и/или второй белок ретиношизин или его фрагмент содержит, по существу состоит из или состоит из последовательности, по меньшей мере примерно на 90%, по меньшей мере примерно на 91%, по меньшей мере примерно на 92%, по меньшей мере примерно на 93%, по меньшей мере примерно на 94%, по меньшей мере примерно на 95%, по меньшей мере примерно на 96%, по меньшей мере примерно на 97%, по меньшей мере примерно на 98%, по меньшей мере примерно на 99% или на 100% идентичной SEQ ID NO: 5. В некоторых таких конструкциях первая кодирующая последовательность и/или вторая кодирующая последовательность содержит, по существу состоит из или состоит из последовательности, по меньшей мере примерно на 90%, по меньшей мере примерно на 91%, по меньшей мере примерно на 92%, по меньшей мере примерно на 93%, по меньшей мере примерно на 94%, по меньшей мере примерно на 95%, по меньшей мере примерно на 96%, по меньшей мере примерно на 97%, по меньшей мере примерно на 98%, по меньшей мере примерно на 99% или на 100% идентичной SEQ ID NO: 8 или 9. В некоторых таких конструкциях первая кодирующая последовательность содержит, по существу состоит из или состоит из последовательности, по меньшей мере примерно на 90%, по меньшей мере примерно на 91%, по меньшей мере примерно на 92%, по меньшей мере примерно на 93%, по меньшей мере примерно на 94%, по меньшей мере примерно на 95%, по меньшей мере примерно на 96%, по меньшей мере примерно на 97%, по меньшей мере примерно на 98%, по меньшей мере примерно на 99% или на 100% идентичной SEQ ID NO: 8, и вторая кодирующая последовательность содержит, по существу состоит из или состоит из последовательности, по меньшей мере примерно на 90%, по меньшей мере примерно на 91%, по меньшей мере примерно на 92%, по меньшей мере примерно на 93%, по меньшей мере примерно на 94%, по меньшей мере примерно на 95%, по меньшей мере примерно на 96%, по меньшей мере примерно на 97%, по меньшей мере примерно на 98%, по меньшей мере примерно на 99% или на 100% идентичной SEQ ID NO: 9. В некоторых таких конструкциях нуклеиновокислотная конструкция содержит, по существу состоит из или состоит из последовательности, по меньшей мере примерно на 90%, по меньшей мере примерно на 91%, по меньшей мере примерно на 92%, по меньшей мере примерно на 93%, по меньшей мере примерно на 94%, по меньшей мере примерно на 95%, по меньшей мере примерно на 96%, по меньшей мере примерно на 97%, по меньшей мере примерно на 98%, по меньшей мере примерно на 99% или на 100% идентичной SEQ ID NO: 46 или 47.

[0015] В некоторых таких конструкциях второй сегмент расположен с 3'-конца от первого сегмента, как первый белок ретиношизин или его фрагмент, так и второй белок ретиношизин или его фрагмент представляют собой белок ретиношизин человека или его фрагмент, первый белок ретиношизин или его фрагмент идентичен второму белку ретиношизину или его фрагменту, как первая кодирующая последовательность, так и вторая кодирующая последовательность содержат комплементарную ДНК (кДНК), содержащую экзоны 2-6 RS1 человека или их вырожденные варианты, вторая кодирующая последовательность характеризуется использованием кодонов, отличным от использования кодонов первой кодирующей последовательности, первый сегмент содержит первую сигнальную последовательность полиаденилирования, расположенную с 3'-конца от первой кодирующей последовательности, а второй сегмент содержит обратный комплемент второй сигнальной последовательности полиаденилирования, расположенный с 5'-конца от обратного комплемента второй кодирующей последовательности, первый сегмент содержит первый акцепторный сайт сплайсинга, расположенный с 5'-конца от первой кодирующей последовательности, а второй сегмент содержит обратный комплемент второго акцепторного сайта сплайсинга, расположенный с 3'-конца от обратного комплемента второй кодирующей последовательности, нуклеиновокислотная конструкция не содержит промотора, который управляет экспрессией первого белка ретиношизина или его фрагмента или второго белка ретиношизина или его фрагмента, и нуклеиновокислотная конструкция не содержит плеча гомологии.

[0016] В другом аспекте предложены векторы, содержащие любые из указанных выше двунаправленных конструкций нуклеиновых кислот. Некоторые такие векторы являются вирусными векторами. Необязательно, вектор представляет собой вектор на основе аденоассоциированного вируса (AAV). Необязательно, AAV содержит одноцепочечный геном (ssAAV). Необязательно, AAV содержит самокомплементарный геном (scAAV). Необязательно, AAV выбран из группы, состоящей из: AAV2, AAV5, AAV8 или AAV7m8.

[0017] Некоторые такие векторы не содержат промотора, который управляет экспрессией первого белка ретиношизина или его фрагмента или второго белка ретиношизина или его фрагмента. Некоторые такие векторы не содержат плеча гомологии. Некоторые такие векторы содержат плечи гомологии.

[0018] В другом аспекте предложены липидные наночастицы, содержащие любые из указанных выше двунаправленных конструкций нуклеиновых кислот.

[0019] В другом аспекте предложены клетки, содержащие любые из указанных выше двунаправленных конструкций нуклеиновых кислот. Некоторые такие клетки находятся in vitro. Некоторые такие клетки находятся in vivo. Некоторые такие клетки представляют собой клетки млекопитающих. Некоторые такие клетки представляют собой клетки человека. Некоторые такие клетки представляют собой клетки сетчатки.

[0020] Некоторые такие клетки экспрессируют первый белок ретиношизин или его фрагмент или второй белок ретиношизин или его фрагмент. В некоторых таких клетках нуклеиновокислотная конструкция геномно интегрирована в целевой геномный локус. В некоторых таких клетках целевой геномный локус представляет собой эндогенный локус RS1. Необязательно, нуклеиновокислотная конструкция геномно интегрирована в интрон 1 эндогенного локуса. RS1. Необязательно, эндогенный экзон 1 RS1 сплайсируется в первую кодирующую последовательность или вторую кодирующую последовательность нуклеиновокислотной конструкции. Необязательно, модифицированный локус RS1, содержащий геномно интегрированную нуклеиновокислотную конструкцию, кодирует белок, содержащий, по существу состоящий из или состоящий из последовательности, по меньшей мере примерно на 90%, по меньшей мере примерно на 91%, по меньшей мере примерно на 92%, по меньшей мере примерно на 93%, по меньшей мере примерно на 94%, по меньшей мере примерно на 95%, по меньшей мере примерно на 96%, по меньшей мере примерно на 97%, по меньшей мере примерно на 98%, по меньшей мере примерно на 99% или на 100% идентичной SEQ ID NO: 2 или 4.

[0021] В некоторых таких клетках интеграция нуклеиновокислотной конструкции в эндогенный локус RS1 предотвращает транскрипцию эндогенного гена. RS1 по ходу транскрипции от сайта интеграции. Необязательно, интеграция нуклеиновокислотной конструкции в эндогенный локус RS1 снижает или устраняет экспрессию эндогенного белка ретиношизина и заменяет ее экспрессией белка ретиношизина или его фрагмента, кодируемого нуклеиновокислотной конструкцией. Необязательно, эндогенный локус RS1 содержит мутированный ген RS1, содержащий мутацию, вызывающую Х-сцепленный ювенильный ретиношизис, и экспрессия геномно интегрированной нуклеиновокислотной конструкции снижает или устраняет экспрессию мутированного гена. RS1.

[0022] В другом аспекте предложены конструкции нуклеиновых кислот для независимой от гомологии направленной интеграции в целевой геномный локус. Некоторые такие конструкции нуклеиновых кислот содержат кодирующую последовательность для белка ретиношизина или его фрагмента, фланкированную с каждой стороны последовательностью-мишенью нуклеазы для нуклеазного агента. Также предусмотрены конструкции нуклеиновых кислот для гомологичной рекомбинации с целевым локусом. Некоторые такие конструкции нуклеиновых кислот содержат кодирующую последовательность для белка ретиношизина или его фрагмента, фланкированную с каждой стороны плечами гомологии, необязательно, где кодирующая последовательность и плечи гомологии дополнительно фланкированы с каждой стороны последовательностью-мишенью для нуклеазного агента. Необязательно, каждое плечо гомологии имеет длину от примерно 25 нуклеотидов до примерно 2,5 т.п.о.

[0023] В некоторых таких конструкциях для независимой от гомологии направленной интеграции последовательность-мишень нуклеазы в нуклеиновокислотной конструкции идентична последовательности-мишени нуклеазы для интеграции в целевой геномный локус, где последовательность-мишень нуклеазы в целевом геномном локусе разрушается при вставке нуклеиновокислотной конструкции в правильной ориентации, но преобразуется при вставке нуклеиновокислотной конструкции в целевой геномный локус в противоположной ориентации.

[0024] В некоторых таких конструкциях белок ретиношизин или его фрагмент представляет собой белок ретиношизин человека или его фрагмент. В некоторых таких конструкциях кодирующая последовательность для белка ретиношизина или его фрагмента содержит, по существу состоит из или состоит из комплементарной ДНК (кДНК). В некоторых таких конструкциях кодирующая последовательность для белка ретиношизина или его фрагмента содержит, по существу состоит из или состоит из экзонов 2-6 RS1 человека или их вырожденных вариантов.

[0025] В некоторых таких конструкциях нуклеиновокислотная конструкция содержит фрагмент или часть первого интрона RS1 человека, расположенные с 5'-конца от кодирующей последовательности. В некоторых таких конструкциях нуклеиновокислотная конструкция не содержит промотора, который управляет экспрессией белка ретиношизина или его фрагмента. В некоторых таких конструкциях нуклеиновокислотная конструкция содержит сигнальную последовательность полиаденилирования, расположенную с 3'-конца от кодирующей последовательности. В некоторых таких конструкциях нуклеиновокислотная конструкция содержит акцепторный сайт сплайсинга, расположенный с 5'-конца от кодирующей последовательности. Необязательно, акцепторный сайт сплайсинга происходит из гена RS1. Необязательно, акцепторный сайт сплайсинга происходит из интрона 1 RS1 человека.

[0026] Некоторые такие конструкции являются одноцепочечными. Некоторые такие конструкции являются двухцепочечными. Некоторые такие конструкции содержат ДНК. В некоторых таких конструкциях кодирующая последовательность кодон-оптимизирована для экспрессии в клетке-хозяине.

[0027] В некоторых таких конструкциях конструкция содержит одну или более из следующих концевых структур: шпилька, петля, инвертированный концевой повтор (ITR) или тороид. Необязательно, нуклеиновокислотная конструкция, содержащая кодирующую последовательность и последовательности-мишени нуклеазы, фланкирована ITR.

[0028] В некоторых таких конструкциях нуклеазный агент представляет собой белок Cas и гидовую РНК, а последовательность-мишень нуклеазы представляет собой последовательность-мишень гидовой РНК. Необязательно, последовательность-мишень гидовой РНК представляет собой инвертированную последовательность-мишень гидовой РНК. Необязательно, белок Cas представляет собой Cas9.

[0029] В некоторых таких конструкциях белок ретиношизин или его фрагмент содержит, по существу состоит из или состоит из последовательности, по меньшей мере примерно на 90%, по меньшей мере примерно на 91%, по меньшей мере примерно на 92%, по меньшей мере примерно на 93%, по меньшей мере примерно на 94%, по меньшей мере примерно на 95%, по меньшей мере примерно на 96%, по меньшей мере примерно на 97%, по меньшей мере примерно на 98%, по меньшей мере примерно на 99% или на 100% идентичной SEQ ID NO: 5. В некоторых таких конструкциях кодирующая последовательность для белка ретиношизина или его фрагмента содержит, по существу состоит из или состоит из последовательности, по меньшей мере примерно на 90%, по меньшей мере примерно на 91%, по меньшей мере примерно на 92%, по меньшей мере примерно на 93%, по меньшей мере примерно на 94%, по меньшей мере примерно на 95%, по меньшей мере примерно на 96%, по меньшей мере примерно на 97%, по меньшей мере примерно на 98%, по меньшей мере примерно на 99% или на 100% идентичной SEQ ID NO: 8 или 9. В некоторых таких конструкциях нуклеиновокислотная конструкция содержит, по существу состоит из или состоит из последовательности, по меньшей мере примерно на 90%, по меньшей мере примерно на 91%, по меньшей мере примерно на 92%, по меньшей мере примерно на 93%, по меньшей мере примерно на 94%, по меньшей мере примерно на 95%, по меньшей мере примерно на 96%, по меньшей мере примерно на 97%, по меньшей мере примерно на 98%, по меньшей мере примерно на 99% или на 100% идентичной SEQ ID NO: 45.

[0030] В некоторых таких конструкциях нуклеиновокислотная конструкция представляет собой нуклеиновокислотную конструкцию для независимой от гомологии направленной интеграции в целевой геномный локус, белок ретиношизин или его фрагмент представляет собой белок ретиношизин человека или его фрагмент, кодирующая последовательность для белка ретиношизина или его фрагмента содержит комплементарную ДНК (кДНК), содержащую экзоны 2-6 RS1 человека или их вырожденные варианты, нуклеиновокислотная конструкция не содержит промотора, который управляет экспрессией белка ретиношизина или его фрагмента, нуклеиновокислотная конструкция содержит сигнальную последовательность полиаденилирования, расположенную с 3'-конца от кодирующей последовательности, нуклеиновокислотная конструкция содержит акцепторный сайт сплайсинга, расположенный с 5'-конца от кодирующей последовательности, и последовательность-мишень нуклеазы в нуклеиновокислотной конструкции идентична последовательности-мишени нуклеазы для интеграции в целевой геномный локус, где последовательность-мишень нуклеазы в целевом геномном локусе разрушается при вставке нуклеиновокислотной конструкции в правильной ориентации, но преобразуется при вставке нуклеиновокислотной конструкции в целевой геномный локус в противоположной ориентации.

[0031] В некоторых таких конструкциях нуклеиновокислотная конструкция представляет собой нуклеиновокислотную конструкцию для гомологичной рекомбинации с целевым геномным локусом, белок ретиношизин или его фрагмент представляет собой белок ретиношизин человека или его фрагмент, кодирующая последовательность для белка ретиношизина или его фрагмента содержит комплементарную ДНК (кДНК), содержащую экзоны 2-6 RS1 человека или их вырожденные варианты, нуклеиновокислотная конструкция не содержит промотора, который управляет экспрессией белка ретиношизина или его фрагмента, нуклеиновокислотная конструкция содержит сигнальную последовательность полиаденилирования, расположенную с 3'-конца от кодирующей последовательности, нуклеиновокислотная конструкция содержит акцепторный сайт сплайсинга, расположенный с 5'-конца от кодирующей последовательности, и каждое плечо гомологии имеет длину от примерно 25 нуклеотидов до примерно 2,5 т.п.о.

[0032] В другом аспекте предложены векторы, содержащие любые из указанных выше конструкций нуклеиновых кислот для независимой от гомологии направленной интеграции. Некоторые такие векторы являются вирусными векторами. Некоторые такие векторы представляют собой векторы на основе аденоассоциированного вируса (AAV). Необязательно, AAV содержит одноцепочечный геном (ssAAV). Необязательно, AAV содержит самокомплементарный геном (scAAV). Необязательно, AAV выбран из группы, состоящей из: AAV2, AAV5, AAV8 или AAV7m8.

[0033] В некоторых таких векторах вектор не содержит промотора, который управляет экспрессией белка ретиношизина или его фрагмента. В некоторых таких векторах вектор не содержит плеча гомологии.

[0034] В другом аспекте предложены липидные наночастицы, содержащие любые из указанных выше конструкций нуклеиновых кислот для независимой от гомологии направленной интеграции.

[0035] В другом аспекте предложены клетки, содержащие любые из указанных выше конструкций нуклеиновых кислот для независимой от гомологии направленной интеграции. Некоторые такие клетки находятся in vitro. Некоторые такие клетки находятся in vivo. Некоторые такие клетки представляют собой клетки млекопитающих. Некоторые такие клетки представляют собой клетки человека. Некоторые такие клетки представляют собой клетки сетчатки.

[0036] В некоторых таких клетках клетка экспрессирует белок ретиношизин или его фрагмент. В некоторых таких клетках нуклеиновокислотная конструкция геномно интегрирована в целевой геномный локус. Необязательно, целевой геномный локус представляет собой эндогенный локус RS1. Необязательно, нуклеиновокислотная конструкция геномно интегрирована в интрон 1 эндогенного локуса RS1. Необязательно, эндогенный экзон 1 RS1 сплайсируется в кодирующую последовательность для белка ретиношизина или его фрагмента в нуклеиновокислотной конструкции. Необязательно, модифицированный локус RS1, содержащий геномно интегрированную нуклеиновокислотную конструкцию, кодирует белок, содержащий, по существу состоящий из или состоящий из последовательности, по меньшей мере примерно на 90%, по меньшей мере примерно на 91%, по меньшей мере примерно на 92%, по меньшей мере примерно на 93%, по меньшей мере примерно на 94%, по меньшей мере примерно на 95%, по меньшей мере примерно на 96%, по меньшей мере примерно на 97%, по меньшей мере примерно на 98%, по меньшей мере примерно на 99% или на 100% идентичной SEQ ID NO: 2 или 4.

[0037] В некоторых таких клетках интеграция нуклеиновокислотной конструкции в эндогенный локус RS1 предотвращает транскрипцию эндогенного гена. RS1 по ходу транскрипции от сайта интеграции. Необязательно, интеграция нуклеиновокислотной конструкции в эндогенный локус RS1 снижает или устраняет экспрессию эндогенного белка ретиношизина и заменяет ее экспрессией белка ретиношизина или его фрагмента, кодируемого нуклеиновокислотной конструкцией. Необязательно, эндогенный локус RS1 содержит мутированный ген RS1, содержащий мутацию, вызывающую Х-сцепленный ювенильный ретиношизис, и экспрессия геномно интегрированной нуклеиновокислотной конструкции снижает или устраняет экспрессию мутированного гена. RS1.

[0038] В другом аспекте предложены композиции для применения в экспрессии ретиношизина в клетке или для применения в интеграции кодирующей последовательности для белка ретиношизина или его фрагмента в целевой геномный локус в клетке. Некоторые такие композиции содержат: (а) нуклеиновокислотную конструкцию, содержащую кодирующую последовательность для белка ретиношизина или его фрагмента для интеграции в целевой геномный локус; и (b) нуклеазный агент или нуклеиновую кислоту, кодирующую нуклеазный агент, где нуклеазный агент нацелен на последовательность-мишень нуклеазы в целевом геномном локусе.

[0039] Некоторые такие композиции содержат: (а) любую из указанных выше конструкций нуклеиновых кислот для независимой от гомологии направленной интеграции; и (b) нуклеазный агент или нуклеиновую кислоту, кодирующую нуклеазный агент, где нуклеазный агент нацелен на последовательность-мишень нуклеазы в целевом геномном локусе. Необязательно, последовательность-мишень нуклеазы в целевом геномном локусе идентична последовательности-мишени нуклеазы в нуклеиновокислотной конструкции. Необязательно, последовательность-мишень нуклеазы в целевом геномном локусе разрушается при вставке нуклеиновокислотной конструкции в правильной ориентации, но преобразуется при вставке нуклеиновокислотной конструкции в целевой геномный локус в противоположной ориентации.

[0040] Некоторые такие композиции содержат: (а) любую из указанных выше двунаправленных конструкций нуклеиновых кислот; и (b) нуклеазный агент или нуклеиновую кислоту, кодирующую нуклеазный агент, где нуклеазный агент нацелен на последовательность-мишень нуклеазы в целевом геномном локусе.

[0041] В некоторых таких композициях целевой геномный локус находится в гене RS1. Необязательно, последовательность-мишень нуклеазы в целевом геномном локусе находится в первом нитроне в гене RSl. Необязательно, интеграция нуклеиновокислотной конструкции в эндогенный локус RS1 предотвращает транскрипцию эндогенного гена RS1 по ходу транскрипции от сайта интеграции. Необязательно, интеграция нуклеиновокислотной конструкции в эндогенный локус RS1 в клетке снижает или устраняет экспрессию эндогенного белка ретиношизина и заменяет ее экспрессией белка ретиношизина или его фрагмента, кодируемого нуклеиновокислотной конструкцией.

[0042] В некоторых таких композициях нуклеазный агент представляет собой белок Cas и гидовую РНК, а последовательность-мишень нуклеазы представляет собой последовательность-мишень гидовой РНК. Необязательно, белок Cas представляет собой Cas9. Необязательно, композиция содержит гидовую РНК и матричную РНК, кодирующую белок Cas. Необязательно, гидовая РНК и матричная РНК, кодирующая белок Cas, находятся в липидной наночастице. Необязательно, композиция содержит ДНК, кодирующую белок Cas, и ДНК, кодирующую гидовую РНК. Необязательно, ДНК, кодирующая белок Cas, и ДНК, кодирующая гидовую РНК, находятся в одном или более вирусных векторах. Необязательно, один или более вирусных векторов представляют собой вирусные векторы на основе аденоассоциированного вируса (AAV). Необязательно, ДНК, кодирующая белок Cas, и ДНК, кодирующая гидовую РНК, находятся в одном вирусном векторе (например, в одном векторе AAV). Необязательно, ДНК, кодирующая белок Cas, и ДНК, кодирующая гидовую РНК, находятся в отдельных вирусных векторах (например, в отдельных векторах AAV).

[0043] В некоторых таких композициях нуклеиновокислотная конструкция находится в вирусном векторе. Необязательно, вирусный вектор представляет собой вирусный вектор на основе аденоассоциированного вируса (AAV). Необязательно, AAV выбран из группы, состоящей из: AAV2, AAV5, AAV8 или AAV7m8.

[0044] Также предложены композиции, содержащие гидовую РНК или ДНК, кодирующую гидовую РНК, где гидовая РНК содержит ДНК-нацеливающий сегмент, который нацелен на последовательность-мишень гидовой РНК в гене RS1, и где гидовая РНК связывается с белком Cas и нацеливает белок Cas на последовательность-мишень гидовой РНК в гене RS1.

[0045] В некоторых таких композициях или композициях для применения композиция дополнительно содержит белок Cas или нуклеиновую кислоту, кодирующую белок Cas. Необязательно, белок Cas представляет собой белок Cas9. Необязательно, белок Cas происходит из белка Cas9 Streptococcus pyogenes. В некоторых таких композициях или композициях для применения композиция содержит белок Cas в форме белка.

[0046] В некоторых таких композициях или композициях для применения композиция содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую белок Cas, где нуклеиновая кислота содержит ДНК, кодирующую белок Cas, необязательно где композиция содержит ДНК, кодирующую гидовую РНК. Необязательно композиция содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую белок Cas, где нуклеиновая кислота содержит ДНК, кодирующую белок Cas, где композиция содержит ДНК, кодирующую гидовую РНК, и где ДНК, кодирующая белок Cas, и ДНК, кодирующая гидовую РНК, находятся в одном или более вирусных векторах. Необязательно, один или более вирусных векторов представляют собой вирусные векторы на основе аденоассоциированного вируса (AAV). Необязательно, ДНК, кодирующая белок Cas, и ДНК, кодирующая гидовую РНК, находятся в одном вирусном векторе (например, в одном векторе AAV). Необязательно, ДНК, кодирующая белок Cas, и ДНК, кодирующая гидовую РНК, находятся в отдельных вирусных векторах (например, в отдельных векторах AAV). Необязательно, AAV выбран из группы, состоящей из: AAV2, AAV5, AAV8 или AAV7m8.

[0047] В некоторых таких композициях или композициях для применения композиция содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую белок Cas, где нуклеиновая кислота содержит матричную РНК, кодирующую белок Cas, необязательно где композиция содержит гидовую РНК в форме РНК. В некоторых таких композициях или композициях для применения композиция содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую белок Cas, где нуклеиновая кислота содержит матричную РНК, кодирующую белок Cas, где композиция содержит гидовую РНК в форме РНК, и где гидовая РНК и матричная РНК, кодирующая белок Cas, находятся в липидной наночастице.

[0048] В некоторых таких композициях или композициях для применения матричная РНК, кодирующая белок Cas, содержит по меньшей мере одну модификацию. Необязательно, матричная РНК, кодирующая белок Cas, модифицирована таким образом, чтобы она содержала модифицированный уридин в одном или более, или во всех положениях уридина. Необязательно, модифицированный уридин представляет собой псевдоуридин. Необязательно, матричная РНК, кодирующая белок Cas, полностью замещена псевдоуридином. В некоторых таких композициях или композициях для применения матричная РНК, кодирующая белок Cas, содержит 5'-кэп. В некоторых таких композициях или композициях для применения матричная РНК, кодирующая белок Cas, содержит поли(А)-хвост. В некоторых таких композициях или композициях для применения матричная РНК, кодирующая белок Cas, содержит последовательность, представленную в SEQ ID NO: 6243 или 6245.

[0049] В некоторых таких композициях или композициях для применения нуклеиновая кислота, кодирующая белок Cas, кодон-оптимизирована для экспрессии в клетке млекопитающего или клетке человека. В некоторых таких композициях или композициях для применения белок Cas содержит последовательность, представленную в SEQ ID NO: 27, 6242 или 6246.

[0050] В некоторых таких композициях или композициях для применения последовательность-мишень гидовой РНК находится в интроне гена. RS1. Необязательно, интрон представляет собой первый интрон гена RS1.

[0051] В некоторых таких композициях или композициях для применения ген RS1 представляет собой ген RS1 человека.

[0052] В некоторых таких композициях или композициях для применения ДНК-нацеливающий сегмент содержит: (а) по меньшей мере 17, по меньшей мере 18, по меньшей мере 19 или по меньшей мере 20 смежных нуклеотидов последовательности, представленной в любой из SEQ ID NO: 3148-6241; (b) по меньшей мере 17, по меньшей мере 18, по меньшей мере 19 или по меньшей мере 20 смежных нуклеотидов последовательности, представленной в любой из SEQ ID NO: 3148-4989; (с) по меньшей мере 17, по меньшей мере 18, по меньшей мере 19 или по меньшей мере 20 смежных нуклеотидов последовательности, представленной в любой из SEQ ID NO: 3148-3151, 3154-3186, 3188-3247 и 3249-4351; (d) по меньшей мере 17, по меньшей мере 18, по меньшей мере 19 или по меньшей мере 20 смежных нуклеотидов последовательности, представленной в любой из SEQ ID NO: 3150, 3151, 3159, 3675, 4297 и 4304; или (е) по меньшей мере 17, по меньшей мере 18, по меньшей мере 19 или по меньшей мере 20 смежных нуклеотидов последовательности, представленной в любой из SEQ ID NO: 4990-6241.

[0053] В некоторых таких композициях или композициях для применения ДНК-нацеливающий сегмент: (а) по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентичен последовательности, представленной в любой из SEQ ID NO: 3148-6241; (b) по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентичен последовательности, представленной в любой из SEQ ID NO: 3148-4989; (с) по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентичен последовательности, представленной в любой из SEQ ID NO: 3148-3151, 3154-3186, 3188-3247 и 3249-4351; (d) по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентичен последовательности, представленной в любой из SEQ ID NO: 3150, 3151, 3159, 3675, 4297 и 4304; или (е) по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентичен последовательности, представленной в любой из SEQ ID NO: 4990-6241.

[0054] В некоторых таких композициях или композициях для применения ДНК-нацеливающий сегмент содержит, по существу состоит из или состоит из последовательности, представленной в: (а) любой из SEQ ID NO: 3148-6241; (b) любой из SEQ ID NO: 3148-4989; (с) любой из SEQ ID NO: 3148-3151, 3154-3186, 3188-3247 и 3249-4351; (d) любой из SEQ ID NO: 3150, 3151, 3159, 3675, 4297 и 4304; или (e) любой из SEQ ID NO: 4990-6241.

[0055] В некоторых таких композициях или композициях для применения ДНК-нацеливающий сегмент содержит по меньшей мере 17, по меньшей мере 18, по меньшей мере 19 или по меньшей мере 20 смежных нуклеотидов последовательности, представленной в любой из SEQ ID NO: 3150, 3151, 3159, 3675, 4297 и 4304.

[0056] В некоторых таких композициях или композициях для применения ДНК-нацеливающий сегмент по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентичен последовательности, представленной в любой из SEQ ID NO: 3150, 3151, 3159, 3675, 4297 и 4304.

[0057] В некоторых таких композициях или композициях для применения ДНК-нацеливающий сегмент содержит, по существу состоит из или состоит из последовательности, представленной в любой из SEQ ID NO: 3150, 3151, 3159, 3675, 4297 и 4304.

[0058] В некоторых таких композициях или композициях для применения композиция содержит гидовую РНК в форме РНК. В некоторых таких композициях или композициях для применения композиция содержит ДНК, кодирующую гидовую РНК.

[0059] В некоторых таких композициях или композициях для применения гидовая РНК содержит по меньшей мере одну модификацию. В некоторых таких композициях или композициях для применения указанная по меньшей мере одна модификация включает 2'-О-метил-модифицированный нуклеотид. В некоторых таких композициях или композициях для применения указанная по меньшей мере одна модификация включает тиофосфатную связь между нуклеотидами. В некоторых таких композициях или композициях для применения указанная по меньшей мере одна модификация включает модификацию в положении одного или более из первых пяти нуклеотидов на 5'-конце гидовой РНК. В некоторых таких композициях или композициях для применения указанная по меньшей мере одна модификация включает модификацию в положении одного или более из последних пяти нуклеотидов на 3'-конце гидовой РНК. В некоторых таких композициях или композициях для применения указанная по меньшей мере одна модификация включает тиофосфатные связи между первыми четырьмя нуклеотидами на 5'-конце гидовой РНК. В некоторых таких композициях или композициях для применения указанная по меньшей мере одна модификация включает тиофосфатные связи между последними четырьмя нуклеотидами на 3'-конце гидовой РНК. В некоторых таких композициях или композициях для применения указанная по меньшей мере одна модификация включает 2'-O-метил-модифицированные нуклеотиды в положениях первых трех нуклеотидов на 5'-конце гидовой РНК. В некоторых таких композициях или композициях для применения указанная по меньшей мере одна модификация включает 2'-О-метил-модифицированные нуклеотиды в положениях последних трех нуклеотидов на 3'-конце гидовой РНК. В некоторых таких композициях или композициях для применения указанная по меньшей мере одна модификация включает: (i) тиофосфатные связи между первыми четырьмя нуклеотидами на 5'-конце гидовой РНК; (ii) тиофосфатные связи между последними четырьмя нуклеотидами на 3'-конце гидовой РНК; (iii) 2'-O-метил-модифицированные нуклеотиды в положениях первых трех нуклеотидов на 5'-конце гидовой РНК; и (iv) 2'-O-метил-модифицированные нуклеотиды в положениях последних трех нуклеотидов на 3'-конце гидовой РНК. В некоторых таких композициях или композициях для применения гидовая РНК содержит модифицированные нуклеотиды согласно SEQ ID NO: 44.

[0060] В некоторых таких композициях или композициях для применения гидовая РНК представляет собой одиночную гидовую РНК (sgPHK). Необязательно, гидовая РНК содержит, по существу состоит или состоит из последовательности, представленной в любой из SEQ ID NO: 33-39 и 53. В некоторых таких композициях или композициях для применения гидовая РНК представляет собой двойную гидовую РНК (dgPHK), содержащую две отдельные молекулы РНК, включающие CRISPR РНК (сrРНК) и транс-активирующую сrРНК (tracrPHK). Необязательно, сrРНК содержит последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 29 и 52. Необязательно, tracrPHK содержит последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 30-32.

[0061] В некоторых таких композициях или композициях для применения композиция связана с липидной наночастицей, необязательно, где композиция содержит гидовую РНК. В некоторых таких композициях или композициях для применения ДНК, кодирующая гидовую РНК, находится в вирусном векторе. В некоторых таких композициях или композициях для применения вирусный вектор представляет собой вирусный вектор на основе аденоассоциированного вируса (AAV). Необязательно, ДНК, кодирующая белок Cas, и ДНК, кодирующая гидовую РНК, находятся в одном вирусном векторе (например, в одном векторе AAV). Необязательно, ДНК, кодирующая белок Cas, и ДНК, кодирующая гидовую РНК, находятся в отдельных вирусных векторах (например, в отдельных векторах AAV). Необязательно, AAV выбран из группы, состоящей из: AAV2, AAV5, AAV8 или AAV7m8.

[0062] В некоторых таких композициях или композициях для применения композиция представляет собой фармацевтическую композицию, содержащую фармацевтически приемлемый носитель.

[0063] В некоторых таких композициях или композициях для применения композиция дополнительно содержит вторую гидовую РНК или ДНК, кодирующую вторую гидовую РНК, где вторая гидовая РНК содержит ДНК-нацеливающий сегмент, который нацелен на последовательность-мишень второй гидовой РНК в гене RS1, и где вторая гидовая РНК связывается с белком Cas и нацеливает белок Cas на последовательность-мишень второй гидовой РНК в гене RS1.

[0064] Также предложены клетки, содержащие любые из указанных выше композиций или композиций для применения. Необязательно, клетка находится in vitro. Необязательно, клетка находится in vivo. Некоторые такие клетки представляют собой клетки млекопитающих. Необязательно, клетка представляет собой клетку человека. Необязательно, клетка представляет собой клетку сетчатки.

[0065] В некоторых таких клетках клетка экспрессирует первый белок ретиношизин или его фрагмент или второй белок ретиношизин или его фрагмент. В некоторых таких клетках нуклеиновокислотная конструкция геномно интегрирована в целевой геномный локус. Необязательно, целевой геномный локус представляет собой эндогенный локус RS1. Необязательно, нуклеиновокислотная конструкция геномно интегрирована в интрон 1 эндогенного локуса. RS1. Необязательно, эндогенный экзон 1 RS1 сплайсируется в первую кодирующую последовательность или вторую кодирующую последовательность нуклеиновокислотной конструкции. Необязательно, модифицированный локус RS1, содержащий геномно интегрированную нуклеиновокислотную конструкцию, кодирует белок, содержащий, по существу состоящий из или состоящий из последовательности, по меньшей мере примерно на 90%, по меньшей мере примерно на 91%, по меньшей мере примерно на 92%, по меньшей мере примерно на 93%, по меньшей мере примерно на 94%, по меньшей мере примерно на 95%, по меньшей мере примерно на 96%, по меньшей мере примерно на 97%, по меньшей мере примерно на 98%, по меньшей мере примерно на 99% или на 100% идентичной SEQ ID NO: 2 или 4.

[0066] В некоторых таких клетках интеграция нуклеиновокислотной конструкции в эндогенный локус RS1 предотвращает транскрипцию эндогенного гена. RS1 по ходу транскрипции от сайта интеграции. Необязательно, интеграция нуклеиновокислотной конструкции в эндогенный локус RS1 снижает или устраняет экспрессию эндогенного белка ретиношизина и заменяет ее экспрессией белка ретиношизина или его фрагмента, кодируемого нуклеиновокислотной конструкцией. Необязательно, эндогенный локус RS1 содержит мутированный ген RS1, содержащий мутацию, вызывающую Х-сцепленный ювенильный ретиношизис, и экспрессия геномно интегрированной нуклеиновокислотной конструкции снижает или устраняет экспрессию мутированного гена RS1.

[0067] В другом аспекте предложены способы интеграции кодирующей последовательности для белка ретиношизина или его фрагмента в целевой геномный локус и экспрессии белка ретиношизина или его фрагмента в клетке. Некоторые такие способы включают введение в клетку любых из указанных выше конструкций нуклеиновых кислот, векторов, липидных наночастиц или композиций, где кодирующая последовательность интегрируется в целевой геномный локус, и белок ретиношизин или его фрагмент экспрессируется в клетке. Необязательно, клетка представляет собой клетку млекопитающего. Необязательно, клетка представляет собой клетку человека. Необязательно, клетка представляет собой клетку сетчатки. Необязательно, клетка находится in vitro. Необязательно, клетка находится in vivo. Необязательно, клетка представляет собой клетку сетчатки in vivo, и введение включает субретинальную инъекцию или интравитреальную инъекцию.

[0068] В некоторых таких способах нуклеиновокислотную конструкцию и нуклеазный агент или нуклеиновую кислоту, кодирующую нуклеазный агент, вводят одновременно. В некоторых таких способах нуклеиновокислотную конструкцию и нуклеазный агент или нуклеиновую кислоту, кодирующую нуклеазный агент, вводят последовательно в любом порядке. Необязательно, нуклеиновокислотную конструкцию вводят перед нуклеазным агентом или нуклеиновой кислотой, кодирующей нуклеазный агент. Необязательно, нуклеиновокислотную конструкцию вводят после нуклеазного агента или нуклеиновой кислоты, кодирующей нуклеазный агент. Необязательно, время между последовательными введениями составляет от примерно 2 часов до примерно 48 часов. В некоторых таких способах нуклеиновокислотную конструкцию и нуклеазный агент или нуклеиновую кислоту, кодирующую нуклеазный агент, вводят в одном и том же средстве доставки. В некоторых таких способах нуклеиновокислотную конструкцию и нуклеазный агент или нуклеиновую кислоту, кодирующую нуклеазный агент, вводят в разных средствах доставки.

[0069] В некоторых таких способах целевой геномный локус находится в эндогенном гене RS1. Необязательно, последовательность-мишень нуклеазы в целевом геномном локусе находится в первом интроне в эндогенном гене RS1. Необязательно, нуклеиновокислотная конструкция геномно интегрирована в интрон 1 эндогенного локуса RS1, где эндогенный экзон 1 RS1 сплайсируется в кодирующую последовательность для белка ретиношизина или его фрагмента в нуклеиновокислотной конструкции. Необязательно, модифицированный локус RS1, содержащий геномно интегрированную нуклеиновокислотную конструкцию, кодирует белок, содержащий, по существу состоящий из или состоящий из последовательности, по меньшей мере примерно на 90%, по меньшей мере примерно на 91%, по меньшей мере примерно на 92%, по меньшей мере примерно на 93%, по меньшей мере примерно на 94%, по меньшей мере примерно на 95%, по меньшей мере примерно на 96%, по меньшей мере примерно на 97%, по меньшей мере примерно на 98%, по меньшей мере примерно на 99% или на 100% идентичной SEQ ID NO: 2 или 4. В некоторых таких способах интеграция нуклеиновокислотной конструкции в эндогенный локус RS1 предотвращает транскрипцию эндогенного гена RS1 по ходу транскрипции от сайта интеграции. Необязательно, интеграция нуклеиновокислотной конструкции в эндогенный локус RS1 снижает или устраняет экспрессию эндогенного белка ретиношизина из эндогенного локуса RS1 и заменяет ее экспрессией белка ретиношизина или его фрагмента, кодируемого нуклеиновокислотной конструкцией.

[0070] В другом аспекте предложены способы лечения субъекта с Х-сцепленным ювенильным ретиношизисом. Некоторые такие способы могут включать введение любой из указанных выше конструкций нуклеиновых кислот, векторов, липидных наночастиц или композиций субъекту, где нуклеиновокислотная конструкция интегрируется в целевой геномный локус и экспрессируется из него в одной или более клетках сетчатки субъекта, и где у субъекта достигается терапевтически эффективный уровень экспрессии ретиношизина. В некоторых таких способах субъект представляет собой человека. В некоторых таких способах субъект имеет эндогенный ген RS1, содержащий по меньшей мере одну мутацию, связанную с Х-сцепленным ювенильным ретиношизисом или вызывающую его. Необязательно, мутация представляет собой мутацию R141C. В некоторых таких способах введение включает субретинальную инъекцию или интравитреальную инъекцию. В некоторых таких способах интеграция нуклеиновокислотной конструкции приводит к структурному восстановлению сетчатки.

[0071] В некоторых таких способах нуклеиновокислотную конструкцию и нуклеазный агент или нуклеиновую кислоту, кодирующую нуклеазный агент, вводят одновременно. В некоторых таких способах нуклеиновокислотную конструкцию и нуклеазный агент или нуклеиновую кислоту, кодирующую нуклеазный агент, вводят последовательно в любом порядке. Необязательно, нуклеиновокислотную конструкцию вводят перед нуклеазным агентом или нуклеиновой кислотой, кодирующей нуклеазный агент. Необязательно, нуклеиновокислотную конструкцию вводят после нуклеазного агента или нуклеиновой кислоты, кодирующей нуклеазный агент. Необязательно, время между последовательными введениями составляет от примерно 2 часов до примерно 48 часов. В некоторых таких способах нуклеиновокислотную конструкцию и нуклеазный агент или нуклеиновую кислоту, кодирующую нуклеазный агент, вводят в одном и том же средстве доставки. В некоторых таких способах нуклеиновокислотную конструкцию и нуклеазный агент или нуклеиновую кислоту, кодирующую нуклеазный агент, вводят в разных средствах доставки.

[0072] В некоторых таких способах целевой геномный локус находится в эндогенном гена RS1. Необязательно, последовательность-мишень нуклеазы в целевом геномном локусе находится в первом интроне в эндогенном гене RS1. Необязательно, нуклеиновокислотная конструкция геномно интегрирована в интрон 1 эндогенного локуса RS1, где эндогенный экзон 1 RS1 сплайсируется в кодирующую последовательность для белка ретиношизина или его фрагмента в нуклеиновокислотной конструкции. Необязательно, модифицированный локус RS1, содержащий геномно интегрированную нуклеиновокислотную конструкцию, кодирует белок, содержащий, по существу состоящий из или состоящий из последовательности, по меньшей мере примерно на 90%, по меньшей мере примерно на 91%, по меньшей мере примерно на 92%, по меньшей мере примерно на 93%, по меньшей мере примерно на 94%, по меньшей мере примерно на 95%, по меньшей мере примерно на 96%, по меньшей мере примерно на 97%, по меньшей мере примерно на 98%, по меньшей мере примерно на 99% или на 100% идентичной SEQ ID NO: 2 или 4. В некоторых таких способах интеграция нуклеиновокислотной конструкции в эндогенный локус RS1 предотвращает транскрипцию эндогенного гена. RS1 по ходу транскрипции от сайта интеграции. Необязательно, интеграция нуклеиновокислотной конструкции в эндогенный локус RS1 снижает или устраняет экспрессию эндогенного белка ретиношизина из эндогенного локуса RS1 и заменяет ее экспрессией белка ретиношизина или его фрагмента, кодируемого нуклеиновокислотной конструкцией.

[0073] В другом аспекте предложены способы модификации гена RS1 в клетке. Некоторые такие способы включают введение в клетку любой из указанных выше композиций, содержащих гидовую РНК или ДНК, кодирующую гидовую РНК, и белок Cas или нуклеиновую кислоту, кодирующую белок Cas, где гидовая РНК связывается с белком Cas и нацеливает белок Cas на последовательность-мишень гидовой РНК в гене RS1, и белок Cas расщепляет последовательность-мишень гидовой РНК. В некоторых таких способах клетка представляет собой клетку млекопитающего. Необязательно, клетка представляет собой клетку человека. Необязательно, клетка представляет собой клетку сетчатки. Необязательно, клетка находится in vitro. Необязательно, клетка находится in vivo. В некоторых таких способах клетка представляет собой клетку сетчатки, и введение включает субретинальную инъекцию или интравитреальную инъекцию. В некоторых таких способах последовательность-мишень гидовой РНК находится в первом интроне в гене RS1.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

[0074] На фиг. 1 (не в масштабе) показана схема локуса Rs1 мыши, включая расположение мутации R141C, связанной с Х-сцепленным ювенильным ретиношизисом (XLRS), и место вставки нуклеиновокислотной конструкции, содержащей экзоны 2-6 RS1 человека.

[0075] На фиг. 2 показано выравнивание ретиношизина мыши, ретиношизина человека, ретиношизина человека с мутацией R141C, ретиношизина мыши с мутацией R141C и гибридного ретиношизина мыши/человека, экспрессируемого при интеграции нуклеиновокислотной конструкции, содержащей экзоны 2-6 RS1 человека, в интрон 1 локуса Rs1 мыши.

[0076] На фиг. 3А (не в масштабе) схематично показана двунаправленная нуклеиновокислотная конструкция, содержащая первый сегмент, содержащий акцептор сплайсинга (А), экзоны 2-6 RS1 человека и полиА гормона роста крупного рогатого скота (bGH), и второй сегмент, содержащий обратный комплемент полиА SV40, обратный комплемент экзонов 2-6 RS1 человека и обратный комплемент акцептора сплайсинга (А). Двунаправленная конструкция также содержит промотор U6, функционально связанный с последовательностью, кодирующей гидовую РНК, нацеленную на интрон 1 локуса Rs1 мыши между двумя сегментами RS1 человека. Горизонтальные стрелки по бокам звезды обозначают ампликоны для направленного пересеквенирования нового поколения, разработанные для NGS. Двунаправленная конструкция ssAAV показана вверху, а двунаправленная конструкция scAAV показана внизу.

[0077] На фиг. 3В (не в масштабе) показана схема нуклеиновокислотной конструкции для независимой от гомологии направленной интеграции, содержащей акцептор сплайсинга (А), экзоны 2-6 RS1 человека и последовательность полиА. Конструкция также содержит промотор U6, функционально связанный с последовательностью, кодирующей гидовую РНК, нацеленную на интрон 1 локуса Rs1 мыши по ходу транскрипции от сегмента RS1 человека. Горизонтальные стрелки по бокам звезды обозначают ампликоны для направленного пересеквенирования нового поколения, разработанные для NGS.

[0078] На фиг. 4 показана оценка полостей сетчатки на сканах оптической когерентной томографии (ОКТ) в глазах мышей ; которым вводили вирусный вектор RS1 версии 1, вирусный вектор RS1 версии 2 или вирусный вектор RS1 версии 3. 1 балл присваивали, если хотя бы на одном отдельном изображении имелось 1-4 полости. 2 балла присваивали, если хотя бы на одном отдельном изображении имелось ≥4 полостей, но полости не сливались. 3 балла присваивали, если хотя бы на одном отдельном изображении имелись слившиеся полости. 4 балла присваивали, если хотя бы на одном отдельном изображении имелись слившиеся полости, и сетчатка была растянута. Средние оценки для каждой группы лечения сравнивали с контрольной группой, содержащей объединенные необработанные глаза, с помощью непараметрического однофакторного дисперсионного анализа по критерию Краскела-Уоллиса и апостериорного анализа по критерию множественных сравнений Данна.

[0079] На фиг. 5 показаны результаты NGS для образцов сетчатки мышей из глаз мышей ; которым вводили вирусный вектор RS1 версии 1 (pssAAV mhRS1-sgu), вирусный вектор RS1 версии 2 (pscAAV rsl_tandem) или вирусный вектор RS1 версии 3 (pssAAV hRs1_HITI). Показано число чтений для четырех ожидаемых вариантов последовательностей: (1) мышь дикого типа, эталонная мышиная последовательность, не содержащая мутанта R141C; (2) мутантная мышь, эталонная мышиная последовательность, несущая мутант R141C; (3) гуманизированный транскрипт 1, эталонная человеческая последовательность; и (4) гуманизированный транскрипт 2, эталонная человеческая последовательность, кодон-оптимизированная для экспрессии у мыши. Ампликоны для направленного пересеквенирования нового поколения были разработаны для областей, изображенных на фиг. 3 (горизонтальные стрелки). мРНК из сетчаток мышей использовали для создания кДНК, которая играла роль матрицы для амплификации секвенирования нового поколения (NGS).

[0080] На фиг. 6А и 6 В показаны результаты NGS для образцов сетчатки мышей из глаз мышей ; которым вводили вирусный вектор RS1 версии 1 (mhRS1-sgu), вирусный вектор RS1 версии 2 (pscAAV_rs1_tandem) или вирусный вектор RS1 версии 3 (hRs1_cDNA HITI). Для этих результатов NGS использовали отдельный ампликон для амплификации последовательности-мишени гидовой РНК интрона 1 Rs1. Чтения, которые соответствовали эталонной мышиной последовательности или содержали негомологичное соединение концов, количественно оценивали, чтобы оценить, как часто гидовая РНК осуществляла разрез без вставки.

[0081] На фиг. 7А-7С показаны результаты NGS для образцов сетчатки мышей из глаз мышей ; которым вводили вирусный вектор RS1 версии 1 (pssAAV mhRS1-sgu; фиг. 7А), вирусный вектор RS1 версии 2 (pscAAVrs1_tandem; фиг. 7В) или вирусный вектор RS1 версии 3 (pssAAV hRs1_HITI; фиг. 7С). Показано число чтений для четырех ожидаемых вариантов последовательностей: (1) мышь дикого типа, эталонная мышиная последовательность, не содержащая мутанта R141C; (2) мутантная мышь, эталонная мышиная последовательность, несущая мутант R141C; (3) гуманизированный транскрипт 1, эталонная человеческая последовательность; и (4) гуманизированный транскрипт 2, эталонная человеческая последовательность, кодон-оптимизированная для экспрессии у мыши. Ампликоны для направленного пересеквенирования нового поколения были разработаны для областей, изображенных на фиг. 3 (горизонтальные стрелки). мРНК из сетчаток мышей использовали для создания кДНК, которая играла роль матрицы для амплификации секвенирования нового поколения (NGS). Чтения, которые соответствовали эталонной мышиной последовательности или содержали негомологичное соединение концов, количественно оценивали, чтобы оценить, как часто гидовая РНК осуществляла разрез без вставки.

[0082] На фиг. 8А и 8В показаны результаты ОТ-кПЦР для клеток ретинобластомы человека, обработанных вирусным вектором RS1 версии 1 (pssAAV mhRSl-sgu; фиг. 8А) или вирусным вектором RS1 версии 2 (pscAAV rs1_tandem; фиг. 8 В) за два часа до обработки липидными наночастицами, содержащими мРНК Cas9 и одну из шести гидовых РНК, нацеленных на интрон 1 RS1 человека. Показаны значения разности Ct (чем меньше число, тем выше экспрессия). «Но» относится к человеческой эталонной последовательности, а «Мо» относится к человеческой эталонной последовательности, кодон-оптимизированной для экспрессии у мыши.

[0083] На фиг. 9А и 9В показаны результаты ОТ-кПЦР для клеток ретинобластомы человека, обработанных вирусным вектором RS1 версии 1 (pssAAV mhRS1-sgu; фиг. 9А) или вирусным вектором RS1 версии 2 (pscAAV rs1_tandem; фиг. 9 В) через два часа после обработки липидными наночастицами, содержащими мРНК Cas9 и одну из шести гидовых РНК, нацеленных на интрон 1 RS1 человека. Показаны значения разности Ct (чем меньше число, тем выше экспрессия). «Но» относится к человеческой эталонной последовательности, а «Мо» относится к человеческой эталонной последовательности, кодон-оптимизированной для экспрессии у мыши.

[0084] На фиг. 10 показана схема нуклеиновокислотной конструкции для гомологичной рекомбинации, содержащей акцептор сплайсинга (А), экзоны 2-6 RS1 человека и последовательность полиА. Конструкция также содержит промотор U6, функционально связанный с последовательностью, кодирующей гидовую РНК, нацеленную на интрон 1 локуса Rs1 мыши по ходу транскрипции от сегмента RS1 человека. Конструкция также содержит плечи гомологии (НА), расположенные выше и ниже по ходу транскрипции. Горизонтальные стрелки по бокам звезды обозначают ампликоны для направленного пересеквенирования нового поколения, разработанные для NGS.

ОПРЕДЕЛЕНИЯ

[0085] Термины «белок», «полипептид» и «пептид», используемые в контексте настоящего документа взаимозаменяемо, включают полимерные формы аминокислот любой длины, включая кодируемые и некодируемые аминокислоты, а также химически или биохимически модифицированные или дериватизированные аминокислоты. Данные термины также включают модифицированные полимеры, такие как полипептиды, имеющие модифицированные пептидные остовы. Термин «домен» относится к любой части белка или полипептида, имеющей конкретную функцию или структуру.

[0086] Термины «нуклеиновая кислота» и «полинуклеотид», используемые в контексте настоящего документа взаимозаменяемо, включают полимерные формы нуклеотидов любой длины, включая рибонуклеотиды, дезоксирибонуклеотиды или их аналоги или модифицированные версии. Они включают одно-, двух- и многоцепочечную ДНК или РНК, геномную ДНК, кДНК, гибриды ДНК-РНК и полимеры, содержащие пуриновые основания, пиримидиновые основания или другие встречающиеся в природе, химически модифицированные, биохимически модифицированные, не встречающиеся в природе или дериватизированные нуклеотидные основания.

[0087] Термин «интегрированная в геном» относится к нуклеиновой кислоте, которая была введена в клетку таким образом, что нуклеотидная последовательность интегрировалась в геном клетки. Для стабильного включения нуклеиновой кислоты в геном клетки может быть использован любой протокол.

[0088] Термин «вектор экспрессии», или «конструкция экспрессии», или «кассета экспрессии» относится к рекомбинантной нуклеиновой кислоте, содержащей желаемую кодирующую последовательность, функционально связанную с соответствующими последовательностями нуклеиновой кислоты, необходимыми для экспрессии функционально связанной кодирующей последовательности в конкретной клетке- или организме-хозяине. Последовательности нуклеиновой кислоты, необходимые для экспрессии в прокариотах, как правило, включают промотор, оператор (необязательно) и сайт связывания рибосомы, а также другие последовательности. Общеизвестно, что эукариотические клетки используют промоторы, энхансеры и сигналы терминации и полиаденилирования, хотя некоторые элементы могут быть удалены, а другие добавлены без ущерба для необходимой экспрессии.

[0089] Термин «вирусный вектор» относится к рекомбинантной нуклеиновой кислоте, которая включает по меньшей мере один элемент вирусного происхождения и включает элементы, достаточные для упаковки в вирусную векторную частицу или допускающие указанную упаковку. Вектор и/или частица могут быть использованы с целью переноса ДНК, РНК или других нуклеиновых кислот в клетки ex vivo либо in vivo. Известно множество форм вирусных векторов.

[0090] Термин «выделенный» применительно к белкам, нуклеиновым кислотам и клеткам включает белки, нуклеиновые кислоты и клетки, которые являются относительно очищенными по сравнению с другими клеточными или организменными компонентами, которые в норме могут присутствовать in situ, вплоть до по существу чистого препарата белка, нуклеиновой кислоты или клетки. Термин «выделенный» может включать белки и нуклеиновые кислоты, не встречающиеся в природе, или белки или нуклеиновые кислоты, которые были химически синтезированы и, таким образом, практически не загрязнены другими белками или нуклеиновыми кислотами. Термин «выделенный» может включать белки, нуклеиновые кислоты или клетки, которые были отделены или очищены от большинства других клеточных компонентов или организменных компонентов, которые сопутствуют им в природе (например, не ограничиваясь перечисленным, других клеточных белков, нуклеиновых кислот или клеточных или внеклеточных компонентов).

[0091] Термин «дикий тип» включает объекты, имеющие структуру и/или активность, которые наблюдаются в нормальном (в отличие от мутантного, патологического, измененного и т.д.) состоянии или контексте. Гены и полипептиды дикого типа часто существуют в нескольких различных формах (например, аллелях).

[0092] Термин «эндогенная последовательность» относится к последовательности нуклеиновой кислоты, которая встречается в природе в клетке или организме животного. Например, эндогенная последовательность RS1 животного относится к нативной последовательности RS1, которая естественным образом находится в локусе RS1 указанного животного.

[0093] «Экзогенные» молекулы или последовательности включают в себя молекулы или последовательности, которые обычно не присутствуют в клетке в данной форме. Нормальное присутствие включает в себя присутствие в зависимости от конкретной стадии развития и условий окружающей среды клетки. Экзогенная молекула или последовательность, например, может включать мутированную версию соответствующей эндогенной последовательности в клетке, такую как гуманизированная версия эндогенной последовательности, или может включать последовательность, соответствующую эндогенной последовательности в клетке, но в другой форме (т.е. не в хромосоме). Напротив, эндогенные молекулы или последовательности включают молекулы или последовательности, которые обычно присутствуют в этой форме в определенной клетке на определенной стадии развития в определенных условиях окружающей среды.

[0094] Термин «гетерологичный» при использовании в контексте нуклеиновой кислоты или белка указывает на то, что данная нуклеиновая кислота или данный белок содержит по меньшей мере два сегмента, которые в природе не встречаются вместе в одной и той же молекуле. Например, термин «гетерологичный», когда он используется применительно к сегментам нуклеиновой кислоты или сегментам белка, означает, что данная нуклеиновая кислота или данный белок содержит две или более субпоследовательностей, которые не находятся в такой взаимосвязи друг с другом (например, соединенными вместе) в природе. В качестве примера, «гетерологичная» область нуклеиново-кислотного вектора представляет собой сегмент нуклеиновой кислоты внутри другой молекулы нуклеиновой кислоты или присоединенный к другой молекуле нуклеиновой кислоты, который не находится в ассоциации с указанной другой молекулой в природе. Например, гетерологичная область нуклеиново-кислотного вектора может включать кодирующую последовательность, фланкированную последовательностями, не находящимися в ассоциации с указанной кодирующей последовательностью в природе. Аналогичным образом, «гетерологичная» область белка представляет собой сегмент из аминокислот внутри другой молекулы пептида или присоединенный к другой молекуле пептида, который не находится в ассоциации с указанной другой молекулой пептида в природе (например, слитый белок или белок с меткой). Аналогичным образом, нуклеиновая кислота или белок могут содержать гетерологичную метку или гетерологичную последовательность секреции или локализации.

[0095] При «оптимизации кодонов» используется свойство вырожденности кодонов, что демонстрируется множеством комбинаций кодонов из трех пар оснований, которые определяют аминокислоту, и, как правило, она включает процесс модификации последовательности нуклеиновой кислоты для усиления экспрессии в определенных клетках-хозяевах путем замены по меньшей мере одного кодона нативной последовательности на кодон, который чаще или наиболее часто используется в генах клетки-хозяина, при сохранении нативной аминокислотной последовательности. Например, нуклеиновая кислота, кодирующая белок Cas9, может быть модифицирована для замены кодонов, имеющих более высокую частоту использования в данной прокариотической или эукариотической клетке, включая бактериальную клетку, дрожжевую клетку, клетку человека, клетку, отличную от человеческой, клетку млекопитающего, клетку грызуна, клетку мыши, клетку крысы, клетку хомяка или любую другую клетку-хозяина, по сравнению с встречающейся в природе последовательностью нуклеиновой кислоты. Таблицы использования кодонов легко доступны, например, в «Базе данных использования кодонов» (Codon Usage Database). Эти таблицы можно адаптировать разными способами. См. источник Nakamura et al. (2000) Nucleic Acids Research 28:292, включенный в настоящий документ посредством ссылки в полном объеме для всех целей. Также доступны компьютерные алгоритмы для оптимизации кодонов конкретной последовательности для экспрессии в конкретном хозяине (см., например, Gene Forge).

[0096] Термин «локус» относится к конкретному местоположению гена (или значимой последовательности), последовательности ДНК, последовательности, кодирующей полипептид, или положению на хромосоме генома организма. Например, «локус RS1» может относиться к конкретному местоположению гена RS1, последовательности ДНК RS1, последовательности, кодирующей ретиношизин, или положению RS1 на хромосоме генома организма, который был идентифицирован как организм, в котором находится такая последовательность. «Локус RS1» может содержать регуляторный элемент гена. RS1, включая, например, энхансер, промотор, 5'- и/или 3'-нетранслируемую область (UTR) или их комбинацию.

[0097] Термин «ген» относится к последовательностям ДНК в хромосоме, которые могут содержать, если они присутствуют в природе, по меньшей мере одну кодирующую и по меньшей мере одну некодирующую область. Последовательность ДНК в хромосоме, которая кодирует продукт (например, не ограничиваясь перечисленным, РНК-продукт и/или полипептидный продукт), может содержать кодирующую область, прерванную некодирующими нитронами, и последовательность, расположенную смежно с кодирующей областью как на 5'-, так и на 3'-конце, таким образом, что ген соответствует полноразмерной мРНК (включая 5'- и 3'-нетранслируемые последовательности). Кроме того, в гене могут присутствовать другие некодирующие последовательности, включая регуляторные последовательности (например, не ограничиваясь перечисленным, промоторы, энхансеры и сайты связывания факторов транскрипции), сигналы полиаденилирования, участки внутренней посадки рибосомы, сайленсеры, изолирующие последовательности и области прикрепления к матриксу. Эти последовательности могут быть близки к кодирующей области гена (например, не ограничиваясь перечисленным, в пределах 10 т.п.о.) или находиться в отдаленных сайтах, и они влияют на уровень или скорость транскрипции и трансляции гена.

[0098] Термин «аллель» относится к вариантной форме гена. Некоторые гены имеют множество различных форм, которые расположены в одном и том же месте, или генетическом локусе, на хромосоме. Диплоидный организм имеет два аллеля в каждом генетическом локусе. Каждая пара аллелей отражает генотип конкретного генетического локуса. Генотипы описываются как гомозиготные, если в определенном локусе находятся два идентичных аллеля, и как гетерозиготные, если эти два аллеля различаются.

[0099] «Промотор» представляет собой регуляторную область ДНК, обычно содержащую ТАТА-бокс, способную управлять РНК-полимеразой II, чтобы инициировать синтез РНК в соответствующем сайте инициации транскрипции для конкретной полинуклеотидной последовательности. Промотор может дополнительно содержать другие области, которые влияют на скорость инициации транскрипции. Раскрытые в настоящем документе промоторные последовательности модулируют транскрипцию функционально связанного полинуклеотида. Промотор может быть активным в одном или более типах клеток, раскрытых в настоящем документе (например, эукариотической клетке, клетке отличного от человека млекопитающего, клетке человека, клетке грызуна, плюрипотентной клетке, находящемся на одноклеточной стадии эмбрионе, дифференцированной клетке или их комбинации). Промотор может представлять собой, например, конститутивно активный промотор, условный промотор, индуцибельный промотор, ограниченный во времени промотор (например, промотор, регулируемый развитием) или пространственно ограниченный промотор (например, клеточноспецифический или тканеспецифический промотор). Примеры промоторов можно найти, например, в публикации WO 2013/176772, включенной в настоящий документ посредством ссылки в полном объеме для всех целей.

[00100] Конститутивный промотор представляет собой промотор, который активен во всех тканях или отдельных тканях на всех стадиях развития. Примеры конститутивных промоторов включают промоторы предраннего гена цитомегаловируса человека (hCMV), предраннего гена цитомегаловируса мыши (mCMV), фактора элонгации 1-альфа человека (hEF1α), фактора элонгации 1-альфа мыши (mEF1α), фосфоглицератокиназы мыши (PGK), гибридный промотор куриного бета-актина (CAG или CBh), ранний промотор SV40 и промотор бета-2 тубулина.

[00101] Примеры индуцибельных промоторов включают, например, химически регулируемые промоторы и физически регулируемые промоторы. Химически регулируемые промоторы включают, например, алкоголь-регулируемые промоторы (например, промотор гена алкогольдегидрогеназы (alcA)), тетрациклин-регулируемые промоторы (например, тетрациклин-чувствительный промотор, последовательность оператора тетрациклина (tetO), промотор tet-On или промотор tet-Off), регулируемые стероидами промоторы (например, промотор глюкокортикоидного рецептора крысы, промотор рецептора эстрогена или промотор рецептора экдизона) или регулируемые металлами промоторы (например, промотор металлопротеина). Физически регулируемые промоторы включают, например, терморегулируемые промоторы (например, промотор теплового шока) и светорегулируемые промоторы (например, индуцируемый светом промотор или репрессируемый светом промотор).

[00102] Тканеспецифические промоторы могут представлять собой, например, нейрон-специфические промоторы, специфичные для глиальных клеток промоторы, специфичные для мышечных клеток промоторы, специфичные для клеток сердца промоторы, специфичные для клеток почек промоторы, специфичные для клеток костной ткани промоторы, специфичные для эндотелиальных клеток промоторы или специфичные для иммунных клеток промоторы (например, промотор В-клеток или промотор Т-клеток).

[00103] Промоторы, регулируемые развитием, включают, например, промоторы, активные только на эмбриональной стадии развития или только во взрослой клетке.

[00104] Термин «функциональная связь» или «функционально связанный» включает в себя смежное расположение двух или более компонентов (например, промотора и другого элемента последовательности) таким образом, что оба компонента функционируют нормально, и допускается возможность того, что по меньшей мере один из компонентов может опосредовать функцию, которая воздействует на по меньшей мере один другой из компонентов. Например, промотор может быть функционально связан с кодирующей последовательностью, если промотор контролирует уровень транскрипции кодирующей последовательности в ответ на наличие или отсутствие одного или более факторов регуляции транскрипции. Функциональная связь может включать в себя случаи, когда такие последовательности расположены смежно друг с другом или оказывают трансэффект (например, регуляторная последовательность может действовать на расстоянии, контролируя транскрипцию кодирующей последовательности).

[00105] «Комплементарность» нуклеиновых кислот означает, что нуклеотидная последовательность в одной цепи нуклеиновой кислоты из-за ориентации ее групп азотистых оснований образует водородные связи с другой последовательностью на противоположной цепи нуклеиновой кислоты. Комплементарные основания в ДНК обычно представляют собой А с Т и С с G. В РНК они обычно представляют собой С с G и U с А. Комплементарность может быть абсолютной или существенной/достаточной. Абсолютная комплементарность между двумя нуклеиновыми кислотами означает, что эти две нуклеиновые кислоты могут образовывать дуплекс, в котором каждое основание связано с комплементарным основанием путем спаривания по Уотсону-Крику. «Существенная» или «достаточная» комплементарность означает, что последовательность в одной цепи не полностью и/или не абсолютно комплементарна последовательности в противоположной цепи, но что между основаниями на двух цепях имеет место достаточное связывание для образования стабильного гибридного комплекса в наборе условий гибридизации (например, концентрации соли и температуры). Такие условия можно спрогнозировать с помощью последовательностей и стандартных математических расчетов для прогнозирования Tm (температуры плавления) гибрид изо ванных цепей, или путем эмпирического определения Tm рутинными методами. Tm включает температуру, при которой популяция гибридизационных комплексов, образованных между двумя цепями нуклеиновой кислоты, денатурируется на 50% (т.е. популяция двухцепочечных молекул нуклеиновой кислоты становится наполовину диссоциированной на одноцепочечные). При температуре ниже Tm преимущественно происходит образование гибридизационного комплекса, тогда как при температуре выше Tm преимущественно происходит плавление или разделение цепей в гибрид изационно м комплексе. Tm можно оценить для нуклеиновой кислоты, имеющей известное содержание G+C в водном 1 М растворе NaCl, используя, например, формулу Tm=81,5+0,41(% G+C), хотя другие известные вычисления Tm учитывают структурные характеристики нуклеиновой кислоты.

[00106] Для гибридизации требуется, чтобы две нуклеиновые кислоты содержали комплементарные последовательности, хотя возможны несовпадения между основаниями. Условия, подходящие для гибридизации двух нуклеиновых кислот, зависят от длины нуклеиновых кислот и степени комплементарности - переменных, которые хорошо известны. Чем выше степень комплементарности между двумя нуклеотидными последовательностями, тем большее значение будет иметь температура плавления (Tm) для гибридов нуклеиновых кислот, имеющих эти последовательности. Для гибридизации нуклеиновых кислот с короткими участками комплементарности (например, комплементарность в пределах 35 или менее, 30 или менее, 25 или менее, 22 или менее, 20 или менее или 18 или менее нуклеотидов) положение несовпадений становится важным (см. источник Sambrook et al., цитируемый выше, 11.7-11.8). Обычно длина поддающийся гибридизации нуклеиновой кислоты составляет по меньшей мере примерно 10 нуклеотидов. Иллюстративные минимальные длины поддающийся гибридизации нуклеиновой кислоты включают по меньшей мере примерно 15 нуклеотидов, по меньшей мере примерно 20 нуклеотидов, по меньшей мере примерно 22 нуклеотида, по меньшей мере примерно 25 нуклеотидов и по меньшей мере примерно 30 нуклеотидов. Кроме того, температуру и концентрацию соли в промывочном растворе можно регулировать по мере необходимости в соответствии с такими факторами, как длина области комплементарности и степень комплементарности.

[00107] Последовательность полинуклеотида не обязательно должна быть на 100% комплементарной последовательности его нуклеиновой кислоты-мишени для специфичной гибридизации. Более того, полинуклеотид может гибридизоваться с одним или более сегментами, так что промежуточные или соседние сегменты не участвуют в событии гибридизации (например, петлевая структура или шпилечная структура). Полинуклеотид (например, гРНК) может обладать по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 99% или 100% комплементарностью последовательности с целевой областью в последовательности нуклеиновой кислоты-мишени, на которую они нацелены. Например, гРНК, в которой 18 из 20 нуклеотидов комплементарны целевой области и поэтому будут специфично гибридизоваться, будет иметь 90% комплементарности. В этом примере оставшиеся некомплементарные нуклеотиды могут быть сгруппированы или могут перемежаться комплементарными нуклеотидами, и не обязательно должны быть смежными друг с другом или с комплементарными нуклеотидами.

[00108] Процент комплементарности между конкретными участками последовательностей нуклеиновых кислот внутри нуклеиновых кислот может быть определен рутинным образом с использованием программ BLAST (основные инструменты поиска локального сопоставления) и программ PowerBLAST (Altschul et al. (1990) J. Mot. Biol. 215:403-410; Zhang and Madden (1997) Genome Res. 7:649-656) или с использованием программы Gap (Wisconsin Sequence Analysis Package, версия 8 для Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, Мэдисон, штат Висконсин), используя настройки по умолчанию, в которых используется алгоритм Смита-Ватермана (Adv. Appl. Math., 1981, 2, 482-489).

[00109] В способах и композициях, предложенных в настоящем документе, используется множество различных компонентов. Некоторые компоненты в описании могут иметь активные варианты и фрагменты. Такие компоненты включают, например, белки Cas, CRISPR-PHK, tracrPHK и гидовые РНК. Биологическая активность каждого из этих компонентов описана в других местах настоящего документа. Термин «функциональный» относится к присущей белку или нуклеиновой кислоте (или их фрагменту или варианту) способности проявлять биологическую активность или функцию. Такие биологические активности или функции могут включать, например, способность белка Cas связываться с гидовой РНК и с последовательностью ДНК-мишени. Биологические функции функциональных фрагментов или вариантов могут быть такими же или могут, напротив, быть изменены (например, в отношении их специфичности, селективности или эффективности) по сравнению с исходной молекулой, но с сохранением основной биологической функции молекулы.

[00110] Термин «вариант» относится к нуклеотидной последовательности, отличающейся от последовательности, наиболее распространенной в популяции (например, на один нуклеотид), или к последовательности белка, отличной от последовательности, наиболее распространенной в популяции (например, на одну аминокислоту).

[00111] Термин «фрагмент» применительно к белку означает белок, который короче, чем полноразмерный белок, или содержит меньше аминокислот. Термин «фрагмент» применительно к нуклеиновой кислоте означает нуклеиновую кислоту, которая короче, чем полноразмерная нуклеиновая кислота, или содержит меньше нуклеотидов. Фрагмент может представлять собой, например, когда речь идет о фрагменте белка, N-концевой фрагмент (т.е. образованный путем удаления С-концевой части белка), С-концевой фрагмент (т.е. образованный путем удаления N-концевой части белка) или внутренний фрагмент (т.е. образованный путем удаления внутренней части белка).

[00112] «Идентичность последовательностей», или «идентичность», в контексте двух полинуклеотидных или полипептидных последовательностей относится к остаткам в двух последовательностях, которые являются одинаковыми при выравнивании последовательностей для максимального соответствия в пределах установленного окна сравнения. Когда процент идентичности последовательностей используется в отношении белков, положения остатков, которые не являются идентичными, часто отличаются консервативными аминокислотными заменами, при которых аминокислотные остатки заменены на другие аминокислотные остатки с аналогичными химическими свойствами (например, зарядом или гидрофобностью) и, следовательно, не меняют функциональных свойств данной молекулы. Когда последовательности отличаются консервативными аминокислотными заменами, процент идентичности последовательностей может быть увеличен для поправки на консервативный характер замены. Последовательности, отличающиеся такими консервативными заменами, называют обладающими «сходством последовательностей» или «сходством». Средства для выполнения данной поправки хорошо известны. Обычно она включает в себя оценку консервативной замены как частичного, а не полного несоответствия, что тем самым увеличивает процент идентичности последовательностей. Таким образом, например, если идентичной аминокислоте присваивается оценка, равная 1, а неконсервативной замене присваивается оценка, равная нулю, то консервативной замене присваивается оценка в интервале от нуля до 1. Оценка консервативных замен рассчитывается, например, так, как реализовано в программе PC/GENE (Intelligenetics, Маунтин-Вью, Калифорния, США).

[00113] «Процент идентичности последовательностей» включает значение, определяемое путем сравнения двух оптимально выровненных последовательностей (наибольшее количество полностью совпадающих остатков) в пределах окна сравнения, где часть полинуклеотидной последовательности в окне сравнения может содержать добавления или делеции (т.е. гэпы) по сравнению с эталонной последовательностью (которая не содержит добавлений или делеций) для оптимального выравнивания данных двух последовательностей. Этот процент рассчитывают путем определения количества положений, в которых в обеих последовательностях присутствует одно и то же основание нуклеиновой кислоты или один и тот же аминокислотный остаток, чтобы получить количество совпадающих положений, деления количества совпадающих положений на общее количество положений в окне сравнения и умножения полученного результата на 100, с получением процента идентичности последовательностей. Если не указано иное (например, более короткая последовательность включает связанную гетерологичную последовательность), окно сравнения представляет собой полную протяженность более короткой из двух сравниваемых последовательностей.

[00114] Если не указано иное, значения идентичности/сходства последовательностей включают в себя значение, полученное с использованием программного обеспечения GAP версии 10 с использованием следующих параметров: % идентичности и % сходства для нуклеотидной последовательности с использованием штрафа в 50 за открытие гэпа и штрафа в 3 за удлинение гэпа, а также весовой матрицы nwsgapdna.cmp; % идентичности и % сходства для нуклеотидной последовательности с использованием штрафа в 8 за открытие гэпа и штрафа в 2 за удлинение гэпа, а также весовой матрицы BLOSUM62; или с помощью любой эквивалентной программы. «Эквивалентная программа» включает в себя любую программу для сравнения последовательностей, которая для любых двух рассматриваемых последовательностей генерирует выравнивание, имеющее такие же совпадения нуклеотидных или аминокислотных остатков и такой же процент идентичности последовательностей, как при соответствующем выравнивании, созданном в программе GAP версии 10.

[00115] Термин «консервативная аминокислотная замена» относится к замене аминокислоты, которая обычно присутствует в данной последовательности, на другую аминокислоту аналогичного размера, заряда или полярности. Примеры консервативных замен включают в себя замену неполярного (гидрофобного) остатка, такого как изолейцин, валин или лейцин, на другой неполярный остаток. Аналогичным образом, примеры консервативных замен включают в себя замену одного полярного (гидрофильного) остатка на другой, например, замену аргинина на лизин и наоборот, замену глутамина на аспарагин и наоборот или замену глицина на серии и наоборот. Кроме того, дополнительными примерами консервативных замен являются замена основного остатка, такого как лизин, аргинин или гистидин, на другой остаток, или замена одного кислого остатка, такого как аспарагиновая кислота или глутаминовая кислота, на другой кислый остаток. Примеры неконсервативных замен включают в себя замену неполярного (гидрофобного) аминокислотного остатка, такого как изолейцин, валин, лейцин, аланин или метионин, на полярный (гидрофильный) остаток, такой как цистеин, глутамин, глутаминовая кислота или лизин, и/или замену полярного остатка на неполярный остаток. Стандартная классификация аминокислот обобщенно представлена в таблице 1 ниже.

[00117] Термин «гомологичная» последовательность (например, последовательность нуклеиновой кислоты) включает в себя последовательность, которая либо идентична, либо по существу сходна с известной эталонной последовательностью таким образом, что она, например, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 55%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 65%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99% или на 100% идентична известной эталонной последовательности. Гомологичные последовательности могут включать, например, ортологичную последовательность и паралогичные последовательности. Гомологичные гены, например, обычно происходят от общей предковой последовательности ДНК либо в результате видообразующего события (ортологичные гены), либо в результате события генетической дупликации (паралогичные гены). «Ортологичные» гены включают гены разных видов, которые произошли от общего предкового гена путем видообразования. Ортологи обычно сохраняют одну и ту же функцию в ходе эволюции. «Паралогичные» гены включают гены, связанные с дупликацией в геноме. У паралогов в ходе эволюции могут развиться новые функции.

[00118] Термин «in vitro» включает в себя искусственные среды и процессы либо реакции, которые происходят в искусственной среде (например, в пробирке или в выделенной клетке или клеточной линии). Термин «in vivo» включает в себя естественную среду (например, клетку, или организм, или тело) и процессы либо реакции, которые происходят в естественной среде. Термин «ех vivo» включает в себя клетки, которые были удалены из организма индивидуума, а также процессы или реакции, происходящие в таких клетках.

[00119] Репарация в ответ на двухцепочечные разрывы (DSB) происходит главным образом посредством двух консервативных путей репарации ДНК: гомологичной рекомбинации (HR) и негомологичного соединения концов (NHEJ). См. источник Kasparek & Humphrey (2011) Seminars in Cell & Dev. Biol. 22:886-897, включенный в настоящий документ посредством ссылки в полном объеме для всех целей. Аналогичным образом, репарация нуклеиновой кислоты-мишени, опосредованная экзогенной донорной нуклеиновой кислотой, может включать в себя любой процесс обмена генетической информацией между двумя указанными полинуклеотидами.

[00120] Термин «рекомбинация» включает любой процесс обмена генетической информацией между двумя полинуклеотидами и может происходить по любому механизму. Рекомбинация может происходить посредством направляемой гомологией репарации (HDR) или гомологичной рекомбинации (HR). HDR или HR включает в себя вид репарации нуклеиновой кислоты, для которого может требоваться гомология нуклеотидной последовательности, в котором используется «донорная» молекула в качестве матрицы для репарации молекулы-«мишени» (т.е. той, в которой произошел двухцепочечный разрыв), и приводит к переносу генетической информации от донора к мишени. Не ограничиваясь какой-либо конкретной теорией, полагают, что такой перенос может включать в себя исправление ошибки спаривания нуклеотидов гетеродуплексной ДНК, которая образуется между поврежденной мишенью и донором, и/или синтез-зависимый отжиг цепей, при котором донор используется для повторного синтеза генетической информации, которая станет частью мишени, и/или связанные процессы. В некоторых случаях донорный полинуклеотид, часть донорного полинуклеотида, копия донорного полинуклеотида или часть копии донорного полинуклеотида интегрируется в ДНК-мишень. См. источники Wang et al. (2013) Cell 153:910-918; Mandalos et al. (2012) PLOSONE 7:e45768:1-9; и Wang et al. (2013) NatBiotechnol. 31:530-532, каждый из которых включен в настоящий документ посредством ссылки в полном объеме для всех целей.

[00121] Негомологичное соединение концов (NHEJ) включает репарацию двухцепочечных разрывов в нуклеиновой кислоте путем прямого лигирования концов разрыва друг с другом или с экзогенной последовательностью без необходимости в гомологичной матрице. Лигирование несмежных последовательностей с помощью NHEJ часто может приводить к делециям, вставкам или транслокациям вблизи сайта двухцепочечного разрыва. Например, NHEJ может также привести к направленной интеграции экзогенной донорной нуклеиновой кислоты посредством прямого лигирования концов разрыва с концами указанной экзогенной донорной нуклеиновой кислоты (т.е. захвату на основе NHEJ). Такая NHEJ-опосредованная направленная интеграция может быть предпочтительной для вставки экзогенной донорной нуклеиновой кислоты, когда использование путей направляемой гомологией репарации (HDR) затруднительно (например, в неделящихся клетках, первичных клетках и клетках, в которых плохо осуществляется репарация ДНК на основе гомологии). Кроме того, в отличие от направляемой гомологией репарации не требуется информация о больших областях идентичности последовательностей, фланкирующих сайт расщепления, что может быть выгодно при попытке направленной вставки в организмы, о геномной последовательности геномов которых имеются лишь ограниченные сведения. Интеграция может происходить посредством лигирования тупых концов между экзогенной донорной нуклеиновой кислотой и расщепленной геномной последовательностью или посредством лигирования липких концов (т.е. концов, имеющих 5'- или 3'-выступы) с использованием экзогенной донорной нуклеиновой кислоты, фланкированной выступами, которые совместимы с выступами, генерируемыми нуклеазным агентом в указанной расщепленной геномной последовательности. См., например, источники US 2011/020722, WO 2014/033644, WO 2014/089290 и Marescaet al. (2013) Genome Res. 23(3):539-546, каждый из которых включен в настоящий документ посредством ссылки в полном объеме для всех целей. При лигировании тупых концов может потребоваться обрезание последовательности-мишени и/или донорной последовательности для создания областей микрогомологии, необходимых для соединения фрагментов, что может создать нежелательные изменения в последовательности-мишени.

[00122] Композиции или способы, «содержащие» или «включающие» один или более перечисленных элементов, могут включать другие элементы, не перечисленные специально. Например, композиция, которая «содержит» или «включает» белок, может содержать белок отдельно или в комбинации с другими ингредиентами. Переходная фраза «по существу состоящий из» означает, что объем пункта формулы изобретения следует интерпретировать как включающий в себя конкретные указанные в данном пункте формулы изобретения элементы, а также элементы, которые не оказывают существенного влияния на основную и новую характеристику(ки) заявленного изобретения. Таким образом, термин «по существу состоящий из» при использовании в пункте формулы настоящего изобретения не предусматривает интерпретации в качестве эквивалента термина «содержащий».

[00123] «Необязательный» или «необязательно» означает, что описанное далее событие или обстоятельство может произойти или не произойти, и что описание включает случаи, в которых это событие или обстоятельство происходит, и случаи, в которых это событие или обстоятельство не происходит.

[00124] Обозначение диапазона значений включает все целые числа в пределах данного диапазона или все целые числа, определяющие данный диапазон, а также все поддиапазоны, определяемые целыми числами в пределах данного диапазона.

[00125] Если иное не следует из контекста, термин «примерно» охватывает значения ±5 от указанного значения.

[00126] Термин «и/или» относится к комбинациям одного или более связанных перечисленных элементов и охватывает все возможные подобные комбинации, а также отсутствие комбинаций при интерпретации в части альтернативы («или»).

[00127] Термин «или» относится к любому члену конкретного списка, а также включает любую комбинацию элементов этого списка.

[00128] Формы единственного числа включают в себя соответствующие им формы множественного числа, если из контекста явным образом не следует иное. Например, термины «белок» или «по меньшей мере один белок» могут включать множество белков, включая их смеси.

[00129] «Статистически значимое» означает р≤0,05.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

I. Обзор

[00130] Х-сцепленный ювенильный ретиношизис (XLRS) представляет собой ювенильную дегенерацию желтого пятна, которую вызывают мутации ретиношизина (RS1). Ген RS1 кодирует содержащий дискоидиновый домен белок размером 24 кДа, который секретируется в виде гомоолигомерного комплекса. Генные мутации RS1 приводят либо к нефункциональному белку, либо к отсутствию секреции белка, что вызывает расслоение или расщепление слоев сетчатки, приводя к ранней и прогрессирующей потере зрения. Известно более 200 различных мутаций в гене RS1, которые вызывают XLRS. Сорок процентов мутаций, вызывающих заболевание, являются нонсенс-мутациями или мутациями сдвига рамки считывания, которые должны приводить к отсутствию полноразмерного белка ретиношизина. Пятьдесят процентов мутаций, вызывающих заболевание, представляют собой миссенс-мутации, которые обеспечивают продукцию полноразмерного мутантного белка. Большинство из них находятся в дискоидиновом домене и приводят к тому, что неправильно свернутый белок удерживается в ER (эндоплазматическим ретикулуме).

[00131] Поскольку XLRS является рецессивным заболеванием, вызванным потерей функции ретиношизина, заместительная генная терапия является потенциальным вариантом лечения этого заболевания. Кроме того, поскольку ретиношизин функционирует как внеклеточный белок, эффективное лечение не обязательно ограничивается трансфицированной клеткой, экспрессирующей замещающий ген, а может охватывать более широкую область из-за распространения секретируемого белка из места экспрессии.

[00132] В настоящем документе предложены конструкции нуклеиновых кислот и композиции, которые обеспечивают вставку кодирующей последовательности ретиношизина в целевой геномный локус, такой как эндогенный локус RS1, и/или экспрессию кодирующей последовательности ретиношизина. Конструкции нуклеиновых кислот и композиции могут применяться в способах интеграции в целевой геномный локус и/или экспрессии в клетке, или в способах лечения Х-сцепленного ювенильного ретиношизиса. Также предложены нуклеазные агенты (например, нацеленные на эндогенный локус RS1) или нуклеиновые кислоты, кодирующие нуклеазные агенты, для способствования интеграции конструкций нуклеиновых кислот в целевой геномный локус, такой как эндогенный локус RS1.

[00133] Интеграция нуклеиновокислотной конструкции в эндогенный локус RS1, такой как интрон 1 RS1, может предотвратить транскрипцию эндогенного гена. RS1 по ходу транскрипции от сайта интеграции. Интеграция нуклеиновокислотной конструкции в эндогенный локус RS1 может снизить или устранить экспрессию эндогенного белка ретиношизина (например, эндогенного белка ретиношизина с вызывающей XLRS мутацией) и заменить ее экспрессией белка ретиношизина или его фрагмента или варианта, кодируемого нуклеиновокислотной конструкцией (например, ретиношизином без вызывающей XLRS мутации). В качестве примера, интеграция нуклеиновокислотной конструкции в эндогенный локус RS1 снижает экспрессию эндогенного белка ретиношизина. В другом примере интеграция нуклеиновокислотной конструкции в эндогенный локус RS1 устраняет экспрессию эндогенного белка ретиношизина. Таким образом, интеграция нуклеиновокислотной конструкции может одновременно обеспечивать нокаут эндогенного гена RS1 (например, эндогенного гена RS1, содержащего одну или более мутаций, связанных с XLRS или вызывающих его, например, R141C) и нокин последовательности, кодирующей замещающий ретиношизин (например, последовательности, кодирующей замещающий ретиношизин, которая не содержит мутаций, связанных с XLRS или вызывающих его).

II. Конструкции нуклеиновых кислот, содержащие кодирующую последовательность ретиношизина для интеграции в целевой геномный локус и экспрессии из него

[00134] В настоящем документе предложены конструкции нуклеиновых кислот (т.е. экзогенные донорные нуклеиновые кислоты), содержащие кодирующую последовательность ретиношизина (т.е. кодирующую белок ретиношизин или его фрагмент или вариант) для интеграции в целевой геномный локус и экспрессии из него. Конструкции нуклеиновых кислот могут представлять собой выделенные конструкции нуклеиновых кислот.

[00135] Ретиношизин (белок Х-сцепленного ювенильного ретиношизиса) представляет собой белок, необходимый для нормальной структуры и функции сетчатки. Иллюстративному белку ретиношизину человека присвоен учетный номер в UniProt 015537, и он имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2. Также известны ортологи у других видов. Например, иллюстративному белку ретиношизину мыши присвоен учетный номер в UniProt Q9Z1L4, и он имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 1. Ретиношизин кодируется геном RS1 (также известным как XLRS1). TeuRSl человека содержит шесть отдельных экзонов, перемежающихся пятью нитронами. TenyRS1 человека присвоен NCBI GenelD 6247. Гену Rs1 мыши присвоен NCBI GenelD 20147. Иллюстративной кодирующей последовательности для RS1 человека присвоен идентификатор CCDS CCDS 14187.1, и она представлена в SEQ ID NO: 6. Мутации ретиношизина вызывают Х-сцепленный ювенильный ретиношизис (XLRS) -витреоретинальную дистрофию, характеризующуюся макулярной патологией и расщеплением поверхностного слоя сетчатки. Конструкции нуклеиновых кислот, раскрытые в настоящем документе, могут применяться в способах лечения XLRS, как более подробно описано в других местах настоящего документа.

[00136] Функциональные домены RS1 представляют собой домены сигнального пептида (SP), RS1 и дискоидина. Сигнальная последовательность управляет транслокацией растущего RS1 из эндоплазматического ретикулума (места синтеза) к внешнему листку плазматической мембраны, во время которой сигнальная последовательность расщепляется сигнальной пептидазой с образованием зрелого белка с характерным RS1 и высококонсервативным дискоидиновым доменом. Различные субдомены сигнальной последовательности RS1 представляют собой положительно заряженную N-область на аминоконце, которая опосредует транслокацию, гидрофобное ядро (Н), необходимое для нацеливания и встраивания в мембрану, и полярную область «С», которая определяет сайт распознавания и расщепления сигнальной пептидазой. RS1 на значительном уровне экспрессируется фоторецепторными и биполярными клетками сетчатки, а также находится в шишковидной железе.

[00137] Кодирующая последовательность ретиношизина, включенная в раскрытые в настоящем документе конструкции нуклеиновых кислот, может представлять собой кодирующую последовательность для полноразмерного белка ретиношизина или его фрагмента или варианта. В качестве примера, кодирующая последовательность ретиношизина, включенная в нуклеиновокислотную конструкцию, не включает первый экзон RS1. Например, кодирующая последовательность ретиношизина, включенная в нуклеиновокислотную конструкцию, может включать экзоны 2-6 гена RS1, или их варианты или вырожденные варианты. В качестве примера, фрагмент кДНК, содержащий экзоны 2-6 гена RS1, может содержать последовательность, представленную в SEQ ID NO: 8. Хотя каждый из 64 кодонов специфичен только для одной аминокислоты или стоп-сигнала, генетический код является вырожденным (то есть избыточным), поскольку одна аминокислота может кодироваться более чем одним кодоном. Вырожденный вариант гена кодирует тот же белок, но имеет по меньшей мере один отличающийся кодон. Кодирующая последовательность ретиношизина в нуклеиновокислотной конструкции может содержать комплементарную ДНК (кДНК) без промежуточных интронов, или нуклеиновокислотная конструкция может содержать один или более интронов, разделяющих экзоны в кодирующей последовательности ретиношизина. Например, нуклеиновокислотная конструкция может содержать последовательность, соответствующую геномному локусу RS1, содержащему как экзоны, так и интроны.

[00138] Кодирующая последовательность ретиношизина может происходить из любого организма. Например, кодирующая последовательность ретиношизина может принадлежать млекопитающему, отличному от человека млекопитающему, грызуну, мыши, крысе или человеку, или их вариантам. В качестве альтернативы, кодирующая последовательность ретиношизина может быть химерной (например, частично мышиной и частично человеческой). В конкретном примере кодирующая последовательность ретиношизина представляет собой кодирующую последовательность ретиношизина человека.

[00139] Кодирующая последовательность ретиношизина может быть кодон-оптимизирована для эффективной трансляции в ретиношизин в конкретной клетке или организме. В качестве примера, кодон-оптимизированная версия экзонов 2-6 RS1 человека представлена в SEQ ID NO: 9. Например, нуклеиновая кислота может быть модифицирована для замены кодонов, которые чаще используются в клетке человека, клетке отличного от человека животного, клетке млекопитающего, клетке грызуна, клетке мыши, клетке крысы или любой другой представляющей интерес клетке-хозяине.

[00140] Кодирующая последовательность ретиношизина может кодировать белок ретиношизин дикого типа или его фрагмент или вариант. Аналогичным образом, кодирующая последовательность ретиношизина может представлять собой кодирующую последовательность дикого типа или ее вариант. В качестве примера, кодирующая последовательность ретиношизина не содержит каких-либо мутаций, связанных с X-сцепленным ювенильным ретиношизисом или вызывающих его. В качестве альтернативы, кодирующая последовательность ретиношизина может содержать одну или более мутаций, связанных с Х-сцепленным ювенильным ретиношизисом или вызывающих его (например, R141C).

[00141] Нуклеиновокислотная конструкция может дополнительно содержать один или более интронов RS1 или их фрагментов или вариантов (например, один или более интронов RS1 человека или их фрагментов или вариантов). Например, нуклеиновокислотная конструкция может содержать интрон 1 RS1 или его фрагмент или вариант. Интрон RS1 или его фрагмент или вариант могут содержать акцепторный сайт сплайсинга или его фрагмент. Примеры фрагментов интрона 1 RS1 представлены в SEQ ID NO: 15 и 16. В одном конкретном примере нуклеиновокислотная конструкция может содержать интрон 1 RS1 или его фрагмент или вариант, расположенный с 5'-конца от экзонов 2-6 RS1 (например, против хода транскрипции от последовательности кДНК, содержащей, по существу состоящей из или состоящей из экзонов 2-6 RS1).

[00142] Конструкции нуклеиновых кислот могут дополнительно содержать один или более акцепторных сайтов сплайсинга. Примеры последовательностей (например, интронных последовательностей) и их обратных комплементов, содержащих акцепторные сайты сплайсинга, представлены в SEQ ID NO: 15-21. Например, нуклеиновокислотная конструкция может содержать акцепторный сайт сплайсинга, расположенный с 5'-конца от кодирующей последовательности ретиношизина. В конкретном примере кодирующая последовательность ретиношизина содержит, по существу состоит из или состоит из экзонов 2-6 RS1 (например, экзонов 2-6 RS1 человека), а акцепторный сайт сплайсинга представляет собой акцепторный сайт сплайсинга из интрона 1 RS1 (например, RS1 человека), используемый при сплайсинге экзона 1 RS1 в экзон 2 RS1. Термин «последовательность акцепторного сайта сплайсинга» относится к последовательности нуклеиновой кислоты на границе 3'-интрон/экзон, которая может распознаваться и связываться аппаратом сплайсинга.

[00143] Конструкции нуклеиновых кислот, раскрытые в настоящем документе, могут также содержать посттранскрипционные регуляторные элементы, такие как посттранскрипционный регуляторный элемент вируса гепатита сурков.

[00144] Конструкции нуклеиновых кислот могут дополнительно содержать одну или более сигнальных последовательностей полиаденилирования. Примеры сигнальных последовательностей полиаденилирования или последовательностей, содержащих сигнальные последовательности полиаденилирования, или их обратных комплементов представлены в SEQ ID NO: 22-25. Например, нуклеиновокислотная конструкция может содержать сигнальную последовательность полиаденилирования, расположенную с 3'-конца от кодирующей последовательности ретиношизина. Может быть использована любая подходящая сигнальная последовательность полиаденилирования. Термин «сигнальная последовательность полиаденилирования» относится к любой последовательности, которая управляет терминацией транскрипции и добавлением поли-А-хвоста к транскрипту мРНК. У эукариот терминаторы транскрипции распознаются белковыми факторами, и за терминацией следует полиаденилирование - процесс добавления поли(А)-хвоста к транскриптам мРНК в присутствии поли(А)-полимеразы. Поли(А)-сигнал млекопитающих, как правило, состоит из коровой последовательности длиной примерно 45 нуклеотидов, которая может быть фланкирована различными вспомогательными последовательностями, которые служат для повышения эффективности расщепления и полиаденилирования. Коровая последовательность состоит из высококонсервативного расположенного против хода транскрипции элемента (ААТААА или AAUAAA) в мРНК, называемого мотивом распознавания поли(А) или последовательностью распознавания поли(А), распознаваемого фактором специфичности расщепления и полиаденилирования (CPSF), и плохо определенной расположенной по ходу транскрипции области (богатой U или G и U), связываемой фактором стимуляции расщепления (CstF). Примеры терминаторов транскрипции, которые могут быть использованы, включают, например, сигнал полиаденилирования гормона роста человека (HGH), поздний сигнал полиаденилирования вируса обезьян 40 (SV40), сигнал полиаденилирования бета-глобина кролика, сигнал полиаденилирования гормона роста крупного рогатого скота (BGH), сигнал полиаденилирования фосфоглицераткиназы (PGK), последовательность терминации транскрипции АОХ1, последовательность терминации транскрипции CYC1 или любую последовательность терминации транскрипции, о которой известно, что она подходит для регуляции экспрессии генов в эукариотических клетках.

[00145] Конструкции нуклеиновых кислот могут также содержать сигнальную последовательность полиаденилирования против хода транскрипции от кодирующей последовательности ретиношизина. Сигнальная последовательность полиаденилирования, расположенная против хода транскрипции от кодирующей последовательности ретиношизина, может быть фланкирована сайтами распознавания рекомбиназы, распознаваемыми сайт-специфической рекомбиназой. В некоторых конструкциях сайты распознавания рекомбиназы также фланкируют селекционную кассету, содержащую, например, кодирующую последовательность для белка, придающего устойчивость к лекарственному препарату. В других конструкциях сайты распознавания рекомбиназы не фланкируют селекционную кассету. Сигнальная последовательность полиаденилирования предотвращает транскрипцию и экспрессию белка или РНК, кодируемых кодирующей последовательностью. Однако при воздействии сайт-специфической рекомбиназы сигнальная последовательность полиаденилирования будет вырезана, и белок или РНК смогут экспрессироваться.

[00146] Такая конфигурация может обеспечивать тканеспецифическую экспрессию или специфическую для стадии развития экспрессию у животных, имеющих кодирующую последовательность ретиношизина, если сигнальная последовательность полиаденилирования вырезается тканеспецифическим или специфическим для стадии развития образом. Вырезание последовательности сигнала полиаденилирования тканеспецифическим или специфическим для стадии развития образом может быть достигнуто, если животное, имеющее нуклеиновокислотную конструкцию, дополнительно имеет кодирующую последовательность для сайт-специфической рекомбиназы, функционально связанную с тканеспецифическим промотором или специфическим для стадии развития промотором. В этом случае сигнальная последовательность полиаденилирования будет вырезаться только в этих тканях или на этих стадиях развития, обеспечивая тканеспецифическую экспрессию или специфическую для стадии развития экспрессию. В качестве примера, ретиношизин или его фрагмент или вариант, кодируемые конструкциями нуклеиновых кислот, могут быть экспрессированы специфичным для глаза или ретинальной клетки образом.

[00147] Сайт-специфические рекомбиназы включают ферменты, которые могут способствовать рекомбинации между сайтами распознавания рекомбиназы, где два сайта рекомбинации физически разделены в одной нуклеиновой кислоте или находятся на отдельных нуклеиновых кислотах. Примеры рекомбиназ включают рекомбиназы Cre, Flp и Dre. Одним из примеров гена рекомбиназы Cre является Crei, в котором два экзона, кодирующие рекомбиназу Cre, разделены интроном для предотвращения ее экспрессии в прокариотической клетке. Такие рекомбиназы могут дополнительно содержать сигнал ядерной локализации для способствования локализации в ядре (например, NLS-Crei). Сайты распознавания рекомбиназы включают нуклеотидные последовательности, которые распознаются сайт-специфической рекомбиназой и могут служить субстратом для события рекомбинации. Примеры сайтов распознавания рекомбиназы включают сайты FRT, FRT11, FRT71, attp, att, rox и lox, такие как loxP, lox511, lox2272, lox66, lox71, loxM2 и lox5171.

[00148] Конструкции нуклеиновых кислот могут дополнительно содержать промотор, функционально связанный с кодирующей последовательностью ретиношизина. Кодирующая последовательность ретиношизина в нуклеиновокислотной конструкции может быть функционально связана с любым подходящим промотором для экспрессии in vivo в организме животного или in vitro в выделенной клетке. Промотор может представлять собой конститутивно активный промотор (например, промотор CAG или промотор U6), условный промотор, индуцибельный промотор, временно ограниченный промотор (например, промотор, регулируемый развитием) или пространственно ограниченный промотор (например, клеточноспецифический или тканеспецифический промотор). Такие промоторы хорошо известны и обсуждаются в других местах настоящего документа. Промоторы, которые могут быть использованы в конструкции экспрессии, включают промоторы, активные, например, в одной или более из эукариотической клетки, клетки человека, клетки, отличной от клетки человека, клетки млекопитающего, клетки отличного от человека млекопитающего, клетки грызуна, клетки мыши, клетки крысы, клетки хомяка, клетки кролика, плюрипотентной клетки, клетки глаза, клетки сетчатки, эмбриональной стволовой (ЭС) клетки или зиготы. В конкретном примере промотор активен в клетке глаза или в клетке сетчатки.

[00149] В качестве альтернативы, некоторые конструкции нуклеиновых кислот не содержат промотора, функционально связанного с кодирующей последовательностью ретиношизина (например, некоторые конструкции нуклеиновых кислот представляют собой конструкции без промотора). Такие конструкции нуклеиновых кислот могут быть сконструированы, например, так, чтобы они были функционально связаны с эндогенным промотором в целевом геномном локусе (например, с эндогенным промотором RS1 в эндогенном локусе RS1) после интеграции в целевой геномный локус.

[00150] Может быть использован любой целевой геномный локус, способный экспрессировать ген, например, локус «безопасной гавани» (ген «безопасной гавани») или эндогенный локус RS1. Взаимодействия между интегрированной экзогенной ДНК и геномом хозяина могут ограничивать надежность и безопасность интеграции и могут приводить к выраженным фенотипическим эффектам, которые возникают не из-за целевой генетической модификации, а из-за непреднамеренных эффектов интеграции на окружающие эндогенные гены. Например, случайным образом вставленные трансгены могут подвергаться позиционным эффектам и сайленсингу, что делает их экспрессию ненадежной и непредсказуемой. Аналогичным образом, интеграция экзогенной ДНК в хромосомный локус может повлиять на окружающие эндогенные гены и хроматин, тем самым изменяя клеточное поведение и фенотипы. Локусы «безопасной гавани» включают хромосомные локусы, в которых трансгены или другие экзогенные вставки нуклеиновых кислот могут стабильно и надежно экспрессироваться во всех представляющих интерес тканях без выраженного изменения клеточного поведения или фенотипа (т.е. без какого-либо отрицательного воздействия на клетку-хозяина). См., например, источник Sadelain et al. (2012) Nat. Rev. Cancer 12:51-58, включенный в настоящий документ посредством ссылки в полном объеме для всех целей. Например, локус «безопасной гавани» может представлять собой локус, в котором экспрессия вставленной последовательности гена не нарушается какой-либо «сквозной» экспрессией из соседних генов. Например, локусы «безопасной гавани» могут включать хромосомные локусы, в которых экзогенная ДНК может интегрироваться и функционировать предсказуемым образом без неблагоприятного воздействия на структуру или экспрессию эндогенного гена. Локусы «безопасной гавани» могут включать внегенные области или внутригенные области, такие как, например, локусы в генах, которые не относятся к незаменимым, являются необязательными или могут быть нарушены без выраженных фенотипических последствий.

[00151] Такие локусы «безопасной гавани» могут обеспечивать открытую конфигурацию хроматина во всех тканях и могут повсеместно экспрессироваться во время эмбрионального развития и у взрослых. См., например, источник Zambrowicz et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94:3789-3794, включенный в настоящий документ посредством ссылки в полном объеме для всех целей. Кроме того, на локусы «безопасной гавани» можно осуществлять нацеливание с высокой эффективностью, и локусы «безопасной гавани» могут быть нарушены без выраженного фенотипа. Примеры локусов «безопасной гавани» включают альбумин, CCR5, HPRT, AAVS1 и Rosa26. См., например, патенты США№№7888121; 7972854; 7914796; 7951925; 8110379; 8409861; 8586526; и публикации патентов США №№2003/0232410; 2005/0208489; 2005/0026157; 2006/0063231; 2008/0159996; 2010/00218264; 2012/0017290; 2011/0265198; 2013/0137104; 2013/0122591; 2013/0177983; 2013/0177960; и 2013/0122591, каждый из которых включен в настоящий документ посредством ссылки в полном объеме для всех целей.

[00152] Целевой геномный локус также может представлять собой эндогенный локус RS1, такой как эндогенный локус RS1, содержащий одну или более мутаций, связанных с XLRS или вызывающих его (например, мутацию R141C в кодируемом белке ретиношизине). Интеграция нуклеиновокислотной конструкции в эндогенный локус RS1 может в некоторых случаях предотвращать транскрипцию эндогенного гена RS1 по ходу транскрипции от сайта интеграции. Интеграция нуклеиновокислотной конструкции в эндогенный локус RS1 может снизить или устранить экспрессию эндогенного белка ретиношизина и заменить ее экспрессией белка ретиношизина или его фрагмента или варианта, кодируемого нуклеиновокислотной конструкцией. В качестве примера, интеграция нуклеиновокислотной конструкции в эндогенный локус RS1 снижает экспрессию эндогенного белка ретиношизина. В другом примере интеграция нуклеиновокислотной конструкции в эндогенный локус RS1 устраняет экспрессию эндогенного белка ретиношизина. Таким образом, интеграция нуклеиновокислотной конструкции может одновременно обеспечивать нокаут эндогенного гена RS1 (например, эндогенного гена. RS1, содержащего одну или более мутаций, связанных с XLRS или вызывающих его) и нокин последовательности, кодирующей замещающий ретиношизин (например, последовательности, кодирующей замещающий ретиношизин, которая не содержит мутаций, связанных с XLRS или вызывающих его).

[00153] Нуклеиновокислотная конструкция может быть интегрирована в любую часть целевого геномного локуса. Например, нуклеиновокислотная конструкция могут быть вставлена в интрон или экзон целевого геномного локуса или может заменять один или более интронов и/или экзонов целевого геномного локуса. В конкретном примере нуклеиновокислотная конструкция может быть интегрирована в интрон целевого геномного локуса, такой как первый интрон целевого геномного локуса (например, интрон 1 RS1). Кассеты экспрессии, интегрированные в целевой геномный локус, могут быть функционально связаны с эндогенным промотором в целевом геномном локусе (например, эндогенным промотором RS1) или могут быть функционально связаны с экзогенным промотором, гетерологичным по отношению к целевому геномному локусу (например, промотором CMV).

[00154] Конструкции нуклеиновых кислот могут содержать дезоксирибонуклеиновую кислоту (ДНК) или рибонуклеиновую кислоту (РНК), они могут быть одноцепочечными или двухцепочечными, и они могут иметь линейную или кольцевую форму. Например, нуклеиновокислотная конструкция может представлять собой одноцепочечный олигодезоксинуклеотид (ssODN). См., например, источник Yoshimi et al. (2016)Ato. Commun. 7:10431, включенный в настоящий документ посредством ссылки в полном объеме для всех целей. Конструкции нуклеиновых кислот могут представлять собой «голые» нуклеиновые кислоты или могут доставляться с помощью векторов, таких как векторы AAV. В конкретном примере нуклеиновокислотная конструкция может быть доставлена посредством AAV и может быть способна вставляться в эндогенный локус RS1 посредством негомологичного соединения концов (например, нуклеиновокислотная конструкция может представлять собой конструкцию, не содержащую плеч гомологии). При введении в линейной форме концы нуклеиновокислотной конструкции (например, донорной последовательности) можно защитить (например, от экзонуклеолитической деградации) хорошо известными способами. Например, к 3'-концу линейной молекулы могут быть добавлены один или более остатков дидезоксинуклеотидов, и/или с одним или обоими концами могут быть лигированы самокомплементарные олигонуклеотиды. См., например, источники Chang et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84:4959-4963 и Nehls et al. (1996) Science 272:886-889, каждый из которых включен в настоящий документ посредством ссылки в полном объеме для всех целей. Дополнительные способы защиты экзогенных полинуклеотидов от деградации включают, не ограничиваясь перечисленным, добавление концевой аминогруппы (аминогрупп) и использование модифицированных межнуклеотидных связей, таких как, например, тиофосфаты, амидофосфаты и остатки О-метилрибозы или дезоксирибозы.

[00155] Иллюстративная нуклеиновокислотная конструкция имеет длину от примерно 50 нуклеотидов до примерно 5 т.п.о. или от примерно 50 нуклеотидов до примерно 3 т.п.о. В качестве альтернативы, нуклеиновокислотная конструкция может иметь длину от примерно 1 т.п.о. до примерно 1,5 т.п.о., от примерно 1,5 т.п.о. до примерно 2 т.п.о., от примерно 2 т.п.о. до примерно 2,5 т.п.о., от примерно 2,5 т.п.о. до примерно 3 т.п.о., от примерно 3 т.п.о. до примерно 3,5 т.п.о., от примерно 3,5 т.п.о. до примерно 4 т.п.о., от примерно 4 т.п.о. до примерно 4,5 т.п.о. или от примерно 4,5 т.п.о. до примерно 5 т.п.о. В качестве альтернативы, нуклеиновокислотная конструкция может иметь длину, например, не более 5 т.п.о., 4,5 т.п.о., 4 т.п.о., 3,5 т.п.о., 3 т.п.о. или 2,5 т.п.о.

[00156] Интеграция нуклеиновокислотной конструкции в целевой геномный локус может привести к добавлению представляющей интерес последовательности нуклеиновой кислоты в указанный целевой геномный локус или замене представляющей интерес последовательности нуклеиновой кислоты в указанном целевом геномном локусе (т.е. делеции и вставке). Некоторые конструкции нуклеиновых кислот предназначены для вставки нуклеиновокислотной конструкции в целевой геномный локус без какой-либо соответствующей делеции в указанном целевом геномном локусе. Другие конструкции нуклеиновых кислот предназначены для удаления представляющей интерес последовательности нуклеиновой кислоты из целевого геномного локуса и замены ее нуклеиновокислотной конструкцией.

[00157] Нуклеиновокислотная конструкция или соответствующая нуклеиновая кислота в целевом геномном локусе, подвергаемая удалению и/или замене, может иметь различную длину. Иллюстративная нуклеиновокислотная конструкция или соответствующая нуклеиновая кислота в целевом геномном локусе, подвергаемая удалению и/или замене, имеет длину от примерно 1 нуклеотида до примерно 5 т.п.о. или от примерно 1 нуклеотида до примерно 3 т.п.о. нуклеотидов. Например, нуклеиновокислотная конструкция или соответствующая нуклеиновая кислота в целевом геномном локусе, подвергаемая удалению и/или замене, может иметь длину в диапазоне от примерно 1 до примерно 100, от примерно 100 до примерно 200, от примерно 200 до примерно 300, от примерно 300 до примерно 400, от примерно 400 до примерно 500, от примерно 500 до примерно 600, от примерно 600 до примерно 700, от примерно 700 до примерно 800, от примерно 800 до примерно 900 или от примерно 900 до примерно 1000 нуклеотидов. Аналогичным образом, нуклеиновокислотная конструкция или соответствующая нуклеиновая кислота в целевом геномном локусе, подвергаемая удалению и/или замене, может иметь длину в диапазоне от примерно 1 т.п.о. до примерно 1,5 т.п.о., от примерно 1,5 т.п.о. до примерно 2 т.п.о., от примерно 2 т.п.о. до примерно 2,5 т.п.о., от примерно 2,5 т.п.о. до примерно 3 т.п.о., от примерно 3 т.п.о. до примерно 3,5 т.п.о., от примерно 3,5 т.п.о. до примерно 4 т.п.о., от примерно 4 т.п.о. до примерно 4,5 т.п.о., от примерно 4,5 т.п.о. до примерно 5 т.п.о., или больше.

[00158] Нуклеиновокислотная конструкция или соответствующая нуклеиновая кислота в целевом геномном локусе, подвергаемая удалению и/или замене, может представлять собой кодирующую область, такую как экзон; некодирующую область, такую как интрон, нетранслируемую область или регуляторную область (например, промотор, энхансер или элемент, связывающий транскрипционный репрессор); или любую их комбинацию.

[00159] Конструкции нуклеиновых кислот могут в некоторых случаях содержать одну или более из следующих концевых структур: шпилька, петля, инвертированный концевой повтор (ITR) или тороид. Например, нуклеиновокислотная конструкция может содержать ITR.

[00160] Некоторые такие конструкции нуклеиновых кислот могут модифицировать целевой геномный локус (например, не ограничиваясь перечисленным, эндогенный локус RS1) после расщепления или никования целевого геномного локуса нуклеазным агентом, таким как белок Cas. Нуклеиновокислотная конструкция может быть сконструирована для репарации расщепленного или никованного локуса посредством лигирования, опосредованного негомологичным соединением концов (NHEJ), или направляемой гомологией репарации. Необязательно, репарация нуклеиновокислотной конструкцией удаляет или нарушает последовательность-мишень нуклеазы, так чтобы на аллели, выступавшие в качестве мишеней, не мог быть повторно нацелен нуклеазный агент.

[00161] Некоторые конструкции нуклеиновых кислот содержат плечи гомологии. Плечи гомологии могут быть симметричными (например, длиной 40 нуклеотидов или 60 нуклеотидов каждое) или они могут быть асимметричными (например, одно плечо гомологии или комплементарная область длиной 36 нуклеотидов и одно плечо гомологии или комплементарная область длиной 91 нуклеотид). Другие конструкции нуклеиновых кислот не содержат плеч гомологии.

[00162] Некоторые раскрытые в настоящем документе конструкции нуклеиновых кислот содержат плечи гомологии. Плечи гомологии могут фланкировать кодирующую последовательность ретиношизина. Для простоты обозначения плечи гомологии обозначаются в настоящем документе как 5'- и 3'- (т.е. расположенные против хода и по ходу транскрипции) плечи гомологии. Эта терминология относится к положению плеч гомологии относительно вставки нуклеиновой кислоты (например, кодирующей последовательности ретиношизина) в нуклеиновокислотной конструкции. 5'-и 3'-плечи гомологии соответствуют областям в целевом геномном локусе, которые называются в настоящем документе «5'-последовательностью-мишенью» и «3'-последовательностью-мишенью», соответственно.

[00163] Плечо гомологии и последовательность-мишень «соответствуют» или являются «соответствующими» друг другу тогда, когда эти две области обладают достаточным уровнем идентичности последовательностей, чтобы выступать в качестве субстратов для реакции гомологичной рекомбинации. Термин «гомология» включает последовательности ДНК, которые либо идентичны, либо обе обладают определенной идентичностью соответствующей последовательности. Идентичность последовательностей между данной последовательностью-мишенью и соответствующим плечом гомологии, содержащимся в нуклеиновокислотной конструкции, может представлять собой любую степень идентичности последовательностей, обеспечивающую протекание гомологичной рекомбинации. Например, степень идентичности последовательностей плеча гомологии нуклеиновокислотной конструкции (или ее фрагмента) и последовательности-мишени (или ее фрагмента) может составлять по меньшей мере 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичность последовательностей, так что последовательности претерпевают гомологичную рекомбинацию. Кроме того, соответствующая область гомологии между плечом гомологии и соответствующей последовательностью-мишенью может иметь любую длину, достаточную для способствования гомологичной рекомбинации. Иллюстративные плечи гомологии имеют длину от примерно 25 нуклеотидов до примерно 2,5 т.п.о., от примерно 25 нуклеотидов до примерно 1,5 т.п.о. или от примерно 25 до примерно 500 нуклеотидов. Например, отдельно взятое плечо гомологии (или каждое из плеч гомологии) и/или соответствующая последовательность-мишень могут содержать соответствующие области гомологии, которые имеют длину в диапазоне от примерно 25 до примерно 30, от примерно 30 до примерно 40, от примерно 40 до примерно 50, от примерно 50 до примерно 60, от примерно 60 до примерно 70, от примерно 70 до примерно 80, от примерно 80 до примерно 90, от примерно 90 до примерно 100, от примерно 100 до примерно 150, от примерно 150 до примерно 200, от примерно 200 до примерно 250, от примерно 250 до примерно 300, от примерно 300 до примерно 350, от примерно 350 до примерно 400, от примерно 400 до примерно 450 или от примерно 450 до примерно 500 нуклеотидов, так что плечи гомологии обладают достаточной гомологией, чтобы претерпевать гомологичную рекомбинацию с соответствующими последовательностями-мишенями в нуклеиновой кислоте-мишени. В качестве альтернативы, отдельно взятое плечо гомологии (или каждое из плеч гомологии) и/или соответствующая последовательность-мишень могут содержать соответствующие области гомологии, которые имеют длину в диапазоне от примерно 0,5 т.п.о. до примерно 1 т.п.о., от примерно 1 т.п.о. до примерно 1,5 т.п.о., от примерно 1,5 т.п.о. до примерно 2 т.п.о. или от примерно 2 т.п.о. до примерно 2,5 т.п.о. Например, каждое плечо гомологии может иметь длину примерно 750 нуклеотидов. В другом примере каждое плечо гомологии может иметь длину от примерно 150 до примерно 750, от примерно 200 до примерно 700, от примерно 250 до примерно 650, от примерно 300 до примерно 600, от примерно 350 до примерно 550, от примерно 400 до примерно 500, от примерно 150 до примерно 450, от примерно 200 до примерно 450, от примерно 250 до примерно 450, от примерно 300 до примерно 450, от примерно 350 до примерно 450, от примерно 400 до примерно 450, от примерно 450 до примерно 500, от примерно 450 до примерно 550, от примерно 450 до примерно 600, от примерно 450 до примерно 650, от примерно 450 до примерно 700, от примерно 450 до примерно 750 или примерно 450 нуклеотидов. В другом примере каждое плечо гомологии может иметь длину от примерно 500 до примерно 1300, от примерно 550 до примерно 1250, от примерно 600 до примерно 1200, от примерно 650 до примерно 1150, от примерно 700 до примерно 1100, от примерно 750 до примерно 1050, от примерно 800 до примерно 1000, от примерно 850 до примерно 950, от примерно 500 до примерно 900, от примерно 550 до примерно 900, от примерно 600 до примерно 900, от примерно 650 до примерно 900, от примерно 700 до примерно 900, от примерно 750 до примерно 900, от примерно 800 до примерно 900, от примерно 850 до примерно 900, от примерно 900 до примерно 950, от примерно 900 до примерно 1000, от примерно 900 до примерно 1050, от примерно 900 до примерно 1100, от примерно 900 до примерно 1150, от примерно 900 до примерно 1200, от примерно 900 до примерно 1250, от примерно 900 до примерно 1300 или примерно 900 нуклеотидов. В другом примере каждое плечо гомологии может составлять от примерно 1500 до примерно 2100, от примерно 1550 до примерно 2050, от примерно 1600 до примерно 2000, от примерно 1650 до примерно 1950, от примерно 1700 до примерно 1900, от примерно 1750 до примерно 1850, от примерно 1500 до примерно 1800, от примерно 1550 до примерно 1800, от примерно 1600 до примерно 1800, от примерно 1650 до примерно 1800, от примерно 1700 до примерно 1800, от примерно 1750 до примерно 1800, от примерно 1800 до примерно 1850, от примерно 1800 до примерно 1900, от примерно 1800 до примерно 1950, от примерно 1800 до примерно 2000, от примерно 1800 до примерно 2050, от примерно 1800 до примерно 2100 или примерно 1800 нуклеотидов. В другом примере каждое плечо гомологии составляет не более примерно 450 нуклеотидов, не более примерно 900 нуклеотидов или не более примерно 1800 нуклеотидов. В другом примере каждое плечо гомологии составляет по меньшей мере примерно 450 нуклеотидов, по меньшей мере примерно 900 нуклеотидов или по меньшей мере примерно 1800 нуклеотидов. Плечи гомологии могут быть симметричными (каждое плечо примерно одинакового размера по длине) или асимметричными (одно плечо длиннее другого).

[00164] Когда система CRISPR/Cas или другой нуклеазный агент используется в комбинации с нуклеиновокислотной конструкцией, раскрытой в настоящем документе, 5'- и 3'-последовательности-мишени могут быть расположены в достаточной близости от сайта расщепления нуклеазой (например, в достаточной близости от последовательности-мишени гидовой РНК), чтобы способствовать возникновению события гомологичной рекомбинации между последовательностями-мишенями и плечами гомологии при одноцепочечном разрыве (нике) или двухцепочечном разрыве в сайте расщепления нуклеазой или сайте расщепления нуклеазой. Термин «сайт расщепления нуклеазой» включает последовательность ДНК, в которой нуклеазный агент создает ник или двухцепочечный разрыв (например, белок Cas9 в комплексе с гидовой РНК). Последовательности-мишени в целевом локусе, которые соответствуют 5'- и 3'-плечам гомологии нуклеиновокислотной конструкции, «расположены в достаточной близости» от сайта расщепления нуклеазой, если расстояние таково, что способствует возникновению события гомологичной рекомбинации между 5'- и 3'-последовательностями-мишенями и плечами гомологии при одноцепочечном или двухцепочечном разрыве в сайте расщепления нуклеазой. Таким образом, последовательности-мишени, соответствующие 5'- и/или 3'-плечам гомологии нуклеиновокислотной конструкции, могут находиться, например, в пределах по меньшей мере 1 нуклеотида от данного сайта расщепления нуклеазой или в пределах от по меньшей мере 10 нуклеотидов до примерно 1000 нуклеотидов от данного сайта расщепления нуклеазой. В качестве примера, сайт расщепления нуклеазой может непосредственно прилегать к по меньшей мере одной или обеим последовательностям-мишеням.

[00165] Пространственное взаимное расположение последовательностей-мишеней, которые соответствуют плечам гомологии нуклеиновокислотной конструкции и сайту расщепления нуклеазой, может варьировать. Например, последовательности-мишени могут быть расположены с 5'-конца от сайта расщепления нуклеазой, последовательности-мишени могут быть расположены с 3'-конца от сайта расщепления нуклеазой, или последовательности-мишени могут фланкировать сайт расщепления нуклеазой.

[00166] Другие конструкции нуклеиновых кислот не содержат каких-либо плеч гомологии. Такие конструкции нуклеиновых кислот могут быть способны вставляться путем негомологичного соединения концов. Например, такие конструкции нуклеиновых кислот могут быть вставлены в двухцепочечный разрыв с тупыми концами после расщепления нуклеазным агентом. В конкретном примере нуклеиновокислотная конструкция может быть доставлена посредством AAV и может быть способна к вставке в целевой геномный локус посредством негомологичного соединения концов (например, нуклеиновокислотная конструкция может представлять собой конструкцию, которая не содержит плеч гомологии).

[00167] В конкретном примере нуклеиновокислотная конструкция может быть вставлена посредством независимой от гомологии направленной интеграции. Например, кодирующая последовательность ретиношизина в нуклеиновокислотной конструкции может быть фланкирована с каждой стороны сайтом-мишенью для нуклеазного агента (например, тем же сайтом-мишенью, что и в целевом геномном локусе, и для того же нуклеазного агента, который используется для расщепления сайта-мишени в целевом геномном локусе). Затем нуклеазный агент может расщеплять сайты-мишени, фланкирующие кодирующую последовательность ретиношизина. В конкретном примере нуклеиновокислотную конструкцию доставляют с помощью AAV-опосредованной доставки, и расщепление сайтов-мишеней, фланкирующих кодирующую последовательность ретиношизина, может удалить инвертированные концевые повторы (ITR) AAV. В некоторых способах сайт-мишень в целевом геномном локусе (например, последовательность-мишень гРНК, включая фланкирующий мотив, прилегающий к протоспейсеру) больше не присутствует при вставке кодирующей последовательности ретиношизина в целевой геномный локус в правильной ориентации, но преобразуется при вставке кодирующей последовательности ретиношизина в целевой геномный локус в противоположной ориентации. Это может помочь обеспечить вставку кодирующей последовательности ретиношизина в правильной ориентации для экспрессии.

[00168] В одной иллюстративной нуклеиновокислотной конструкции для независимой от гомологии направленной интеграции в целевой геномный локус белок ретиношизин или его фрагмент представляет собой белок ретиношизин человека или его фрагмент, кодирующая последовательность для белка ретиношизина или его фрагмента содержит комплементарную ДНК (кДНК), содержащую экзоны 2-6 RS1 человека или их вырожденные варианты, нуклеиновокислотная конструкция не содержит промотора, который управляет экспрессией белка ретиношизина или его фрагмента, нуклеиновокислотная конструкция содержит сигнальную последовательность полиаденилирования, расположенную с 3'-конца от кодирующей последовательности, нуклеиновокислотная конструкция содержит акцепторный сайт сплайсинга, расположенный с 5'-конца от кодирующей последовательности, и последовательность-мишень нуклеазы в нуклеиновокислотной конструкции идентична последовательности-мишени нуклеазы для интеграции в целевой геномный локус, где последовательность-мишень нуклеазы в целевом геномном локусе разрушается при вставке нуклеиновокислотной конструкции в правильной ориентации, но преобразуется при вставке нуклеиновокислотной конструкции в целевой геномный локус в противоположной ориентации.

[00169] В одной иллюстративной нуклеиновокислотной конструкции для независимой от гомологии направленной интеграции в целевой геномный локус белок ретиношизин или его фрагмент содержит, по существу состоит из или состоит из последовательности, по меньшей мере примерно на 90%, по меньшей мере примерно на 91%, по меньшей мере примерно на 92%, по меньшей мере примерно на 93%, по меньшей мере примерно на 94%, по меньшей мере примерно на 95%, по меньшей мере примерно на 96%, по меньшей мере примерно на 97%, по меньшей мере примерно на 98%, по меньшей мере примерно на 99% или на 100% идентичной SEQ ID NO: 2 или 5. В одной иллюстративной нуклеиновокислотной конструкции для независимой от гомологии направленной интеграции в целевой геномный локус кодирующая последовательность для белка ретиношизина или его фрагмента содержит, по существу состоит из или состоит из последовательности, по меньшей мере примерно на 90%, по меньшей мере примерно на 91%, по меньшей мере примерно на 92%, по меньшей мере примерно на 93%, по меньшей мере примерно на 94%, по меньшей мере примерно на 95%, по меньшей мере примерно на 96%, по меньшей мере примерно на 97%, по меньшей мере примерно на 98%, по меньшей мере примерно на 99% или на 100% идентичной SEQ ID NO: 6, 8 или 9 или их вырожденным вариантам. В одной иллюстративной нуклеиновокислотной конструкции для независимой от гомологии направленной интеграции в целевой геномный локус нуклеиновокислотная конструкция содержит, по существу состоит из или состоит из последовательности, по меньшей мере примерно на 90%, по меньшей мере примерно на 91%, по меньшей мере примерно на 92%, по меньшей мере примерно на 93%, по меньшей мере примерно на 94%, по меньшей мере примерно на 95%, по меньшей мере примерно на 96%, по меньшей мере примерно на 97%, по меньшей мере примерно на 98%, по меньшей мере примерно на 99% или на 100% идентичной SEQ ID NO: 45.

[00170] Другие конструкции нуклеиновых кислот имеют короткие одноцепочечные области на 5'-конце и/или 3'-конце, которые являются комплементарными одному или более выступам, созданным в результате опосредованного нуклеазным агентом расщепления в целевом геномном локусе. Например, некоторые конструкции нуклеиновых кислот имеют короткие о дно цепочечные области на 5'-конце и/или 3'-конце, которые являются комплементарными одному или более выступам, созданным в результате опосредованного нуклеазой расщепления на 5'- и/или 3'-последовательностях-мишенях в целевом геномном локусе. Некоторые из таких конструкций нуклеиновых кислот имеют комплементарную область только на 5'-конце или только на 3'-конце. Например, некоторые такие конструкции нуклеиновых кислот имеют комплементарную область только на 5'-конце, комплементарную выступу, созданному на 5'-последовательности-мишени в целевом геномном локусе, или только на 3'-конце, комплементарную выступу, созданному на 3'-последовательности-мишени в целевом геномном локусе. Другие такие конструкции нуклеиновых кислот имеют комплементарные области как на 5'-, так и на 3'-конце. Например, другие такие конструкции нуклеиновых кислот имеют комплементарные области как на 5'-, так и на 3'-конце (например, комплементарные первому и второму выступам, соответственно), созданные в результате опосредованного нуклеазой расщепления в целевом геномном локусе. Например, если нуклеиновокислотная конструкция является двухцепочечной, одноцепочечные комплементарные области могут выступать с 5'-конца верхней цепи нуклеиновокислотной конструкции и 5'-конца нижней цепи нуклеиновокислотной конструкции, создавая 5'-выступы на каждом конце. В качестве альтернативы, одноцепочечная комплементарная область может выступать с 3'-конца верхней цепи нуклеиновокислотной конструкции и с 3'-конца нижней цепи матрицы, создавая 3'-выступы.

[00171] Комплементарные области могут иметь любую длину, достаточную для способствования лигированию между экзогенной донорной нуклеиновой кислотой и нуклеиновой кислотой-мишенью. Иллюстративные комплементарные области имеют длину от примерно 1 до примерно 5 нуклеотидов, от примерно 1 до примерно 25 нуклеотидов или от примерно 5 до примерно 150 нуклеотидов. Например, комплементарная область может иметь длину по меньшей мере примерно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или 25 нуклеотидов. В качестве альтернативы, комплементарная область может иметь длину от примерно 5 до примерно 10, от примерно 10 до примерно 20, от примерно 20 до примерно 30, от примерно 30 до примерно 40, от примерно 40 до примерно 50, от примерно 50 до примерно 60, от примерно 60 до примерно 70, от примерно 70 до примерно 80, от примерно 80 до примерно 90, от примерно 90 до примерно 100, от примерно 100 до примерно 110, от примерно 110 до примерно 120, от примерно 120 до примерно 130, от примерно 130 до примерно 140, от примерно 140 до примерно 150 нуклеотидов, или больше.

[00172] Такие комплементарные области могут быть комплементарными выступам, созданным двумя парами никаз. Два двухцепочечных разрыва со ступенчатыми концами могут быть созданы с использованием первой и второй никаз, которые расщепляют противоположные цепи ДНК, создавая первый двухцепочечный разрыв, и третьей и четвертой никаз, которые расщепляют противоположные цепи ДНК, создавая второй двухцепочечный разрыв. Например, белок Cas может быть использован для никования первой, второй, третьей и четвертой последовательностей-мишеней гидовой РНК, соответствующих первой, второй, третьей и четвертой гидовым РНК. Первая и вторая последовательности-мишени гидовой РНК могут быть расположены таким образом, чтобы создать первый сайт расщепления, так что ники, созданные первой и второй никазами на первой и второй цепях ДНК, создают двухцепочечный разрыв (т.е. первый сайт расщепления содержит ники в первой и второй последовательностях-мишенях гидовой РНК). Аналогичным образом, третья и четвертая последовательности-мишени гидовой РНК могут быть расположены таким образом, чтобы создать второй сайт расщепления, так что пики, созданные третьей и четвертой никазами на первой и второй цепях ДНК, создают двухцепочечный разрыв (т.е. первый сайт расщепления содержит ники в третьей и четвертой последовательностях-мишенях гидовой РНК). Ники в первой и второй последовательностях-мишенях гидовой РНК и/или третьей и четвертой последовательностях-мишенях гидовой РНК могут представлять собой смещенные ники, которые создают выступы. Окно смещения может составлять, например, по меньшей мере примерно 5 п.о., 10 п.о., 20 п.о., 30 п.о., 40 п.о., 50 п.о., 60 п.о., 70 п.о., 80 п.о., 90 п.о., 100 п.о. или более. См. источники Ran et al. (2013) Cell 154:1380-1389; Mali et al. (2013) Nat. Biotechnol. 31:833-838; и Shen et al. (2014) Nat. Methods 11:399-404, каждый из которых включен в настоящий документ посредством ссылки в полном объеме для всех целей. В таких случаях двухцепочечная нуклеиновокислотная конструкция может быть разработана с одноцепочечными комплементарными областями, которые комплементарны выступам, создаваемым никами в первой и второй последовательностях-мишенях гидовой РНК и никами в третьей и четвертой последовательностях-мишенях гидовой РНК. Такая нуклеиновокислотная конструкция затем может быть вставлена путем лигирования, опосредованного негомологичным соединением концов.

[00173] Некоторые из раскрытых в настоящем документе конструкций нуклеиновых кислот представляют собой двунаправленные конструкции, которые могут быть вставлены в целевой геномный локус и экспрессированы из него в любой ориентации. Такие конструкции нуклеиновых кислот могут содержать первый сегмент, содержащий первую кодирующую последовательность для первого белка ретиношизина или его фрагмента или варианта, и второй сегмент, содержащий обратный комплемент второй кодирующей последовательности для второго белка ретиношизина или его фрагмента или варианта. Второй сегмент может быть, например, расположен с 3'-конца от первого сегмента в нуклеиновокислотной конструкции.

[00174] Первый сегмент и второй сегмент могут быть связаны непосредственно друг с другом или могут быть связаны линкером, таким как пептидный линкер. Пептидный линкер может иметь любую подходящую длину. Например, линкер может иметь длину от примерно 5 до примерно 2000 нуклеотидов. Например, линкерная последовательность может иметь длину примерно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 150, 200, 250, 300, 500, 1000, 1500, 2000 или более нуклеотидов.

[00175] В некоторых двунаправленных конструкциях первый белок ретиношизин или его фрагмент или вариант идентичен второму белку ретиношизину или его фрагменту или варианту. В других двунаправленных конструкциях первый белок ретиношизин или его фрагмент или вариант отличается от второго белка ретиношизина или его фрагмента или варианта.

[00176] В некоторых двунаправленных конструкциях использование кодонов в первой кодирующей последовательности является таким же, как использование кодонов во второй кодирующей последовательности. В других двунаправленных конструкциях вторая кодирующая последовательность характеризуется использованием кодонов, отличным от использования кодонов первой кодирующей последовательности, чтобы снизить образование шпилек. Такой обратный комплемент образует пары оснований с меньшим количеством нуклеотидов, чем все нуклеотиды кодирующей последовательности в первом сегменте, но он необязательно может кодировать тот же полипептид.

[00177] Второй сегмент может обладать любым процентом комплементарности первому сегменту. Например, последовательность второго сегмента может обладать по меньшей мере примерно 30%, по меньшей мере примерно 35%, по меньшей мере примерно 40%, по меньшей мере примерно 45%, по меньшей мере примерно 50%, по меньшей мере примерно 55%, по меньшей мере примерно 60%, по меньшей мере примерно 65%, по меньшей мере примерно 70%, по меньшей мере примерно 75%, по меньшей мере примерно 80%, по меньшей мере примерно 85%, по меньшей мере примерно 90%, по меньшей мере примерно 95%, по меньшей мере примерно 97% или по меньшей мере примерно 99% комплементарностью первому сегменту. В качестве другого примера, последовательность второго сегмента может обладать менее чем примерно 30%, менее чем примерно 35%, менее чем примерно 40%, менее чем примерно 45%, менее чем примерно 50%, менее чем примерно 55%, менее чем примерно 60%, менее чем примерно 65%, менее чем примерно 70%, менее чем примерно 75%, менее чем примерно 80%, менее чем примерно 85%, менее чем примерно 90%, менее чем примерно 95%, менее чем примерно 97% или менее чем примерно 99% комплементарностью первому сегменту. Обратный комплемент второй кодирующей последовательности в некоторых конструкциях нуклеиновых кислот может быть по существу не комплементарным (например, комплементарным не более чем на 70%) первой кодирующей последовательности, по существу не комплементарным фрагменту первой кодирующей последовательности, высоко комплементарным (например, комплементарным по меньшей мере на 90%) первой кодирующей последовательности, высоко комплементарным фрагменту первой кодирующей последовательности, идентичным обратному комплементу первой кодирующей последовательности на от примерно 50% до примерно 80% или идентичным обратному комплементу первой кодирующей последовательности на от примерно 60% до примерно 100%.

[00178] Двунаправленные конструкции могут в некоторых случаях содержать одну или более (например, две) сигнальных последовательностей полиаденилирования. В некоторых двунаправленных конструкциях первый сегмент может содержать первую сигнальную последовательность полиаденилирования. В некоторых двунаправленных конструкциях первый сегмент может содержать вторую сигнальную последовательность полиаденилирования. В некоторых двунаправленных конструкциях первый сегмент может содержать первую сигнальную последовательность полиаденилирования, а второй сегмент может содержать вторую сигнальную последовательность полиаденилирования (например, обратный комплемент сигнальной последовательности полиаденилирования). В некоторых двунаправленных конструкциях первый сегмент может содержать первую сигнальную последовательность полиаденилирования, расположенную с 3'-конца от первой кодирующей последовательности. В некоторых двунаправленных конструкциях второй сегмент может содержать обратный комплемент второй сигнальной последовательности полиаденилирования, расположенный с 5'-конца от обратного комплемента второй кодирующей последовательности. В некоторых двунаправленных конструкциях первый сегмент может содержать первую сигнальную последовательность полиаденилирования, расположенную с 3'-конца от первой кодирующей последовательности, а второй сегмент может содержать обратный комплемент второй сигнальной последовательности полиаденилирования, расположенный с 5'-конца от обратного комплемента второй кодирующей последовательности. Первая и вторая сигнальные последовательности полиаденилирования могут быть одинаковыми или разными. В качестве примера, первый и второй сигналы полиаденилирования различаются.

[00179] Двунаправленные конструкции могут, в некоторых случаях, содержать один или более (например, два) акцепторных сайта сплайсинга. В некоторых двунаправленных конструкциях первый сегмент может содержать первый акцепторный сайт сплайсинга. В некоторых двунаправленных конструкциях первый сегмент может содержать второй акцепторный сайт сплайсинга. В некоторых двунаправленных конструкциях первый сегмент может содержать первый акцепторный сайт сплайсинга, а второй сегмент может содержать второй акцепторный сайт сплайсинга (например, обратный комплемент акцепторного сайта сплайсинга). В некоторых двунаправленных конструкциях первый сегмент содержит первый акцепторный сайт сплайсинга, расположенный с 5'-конца от первой кодирующей последовательности. В некоторых двунаправленных конструкциях второй сегмент содержит обратный комплемент второго акцепторного сайта сплайсинга, расположенный с 3'-конца от обратного комплемента второй кодирующей последовательности. В некоторых двунаправленных конструкциях первый сегмент содержит первый акцепторный сайт сплайсинга, расположенный с 5'-конца от первой кодирующей последовательности, а второй сегмент содержит обратный комплемент второго акцепторного сайта сплайсинга, расположенный с 3'-конца от обратного комплемента второй кодирующей последовательности. Первый и второй акцепторные сайты сплайсинга могут быть одинаковыми или разными. В качестве примера, первый и второй акцепторные сайты сплайсинга различаются. Первый и/или второй акцепторный сайт сплайсинга может происходить из гена RS1 (например, из интрона 1 гена RS1), такого как ген RS1 человека.

[00180] Некоторые двунаправленные конструкции могут содержать промотор, который управляет экспрессией первого белка ретиношизина или его фрагмента или варианта, и/или обратный комплемент промотора, который управляет экспрессией второго белка ретиношизина или его фрагмента или варианта. В качестве альтернативы, двунаправленная конструкция может представлять собой конструкцию, не содержащую промотора, который управляет экспрессией первого белка ретиношизина или его фрагмента или варианта, или второго белка ретиношизина или его фрагмента или варианта (т.е. конструкцию без промотора).

[00181] Одна или обе кодирующие последовательности могут быть кодон-оптимизированы для экспрессии в клетке-хозяине. В некоторых двунаправленных конструкциях только одна из кодирующих последовательностей является кодон-оптимизированной. В некоторых двунаправленных конструкциях первая кодирующая последовательность является кодон-оптимизированной. В некоторых двунаправленных конструкциях вторая кодирующая последовательность является кодон-оптимизированной. В некоторых двунаправленных конструкциях обе кодирующие последовательности являются кодон-оптимизированными.

[00182] В иллюстративной двунаправленной конструкции второй сегмент расположен с 3'-конца от первого сегмента, как первый белок ретиношизин или его фрагмент, так и второй белок ретиношизин или его фрагмент представляют собой белок ретиношизин человека или его фрагмент, первый белок ретиношизин или его фрагмент идентичен второму белку ретиношизину или его фрагменту, как первая кодирующая последовательность, так и вторая кодирующая последовательность содержат комплементарную ДНК (кДНК), содержащую экзоны 2-6 RS1 человека или их вырожденные варианты, вторая кодирующая последовательность характеризуется использованием кодонов, отличным от использования кодонов первой кодирующей последовательности, первый сегмент содержит первую сигнальную последовательность полиаденилирования, расположенную с 3'-конца от первой кодирующей последовательности, а второй сегмент содержит обратный комплемент второй сигнальной последовательности полиаденилирования, расположенный с 5'-конца от обратного комплемента второй кодирующей последовательности, первый сегмент содержит первый акцепторный сайт сплайсинга, расположенный с 5'-конца от первой кодирующей последовательности, а второй сегмент содержит обратный комплемент второго акцепторного сайта сплайсинга, расположенный с 3'-конца от обратного комплемента второй кодирующей последовательности, нуклеиновокислотная конструкция не содержит промотора, который управляет экспрессией первого белка ретиношизина или его фрагмента или второго белка ретиношизина или его фрагмента, и, необязательно, нуклеиновокислотная конструкция не содержит плеча гомологии.

[00183] В иллюстративной двунаправленной конструкции первый белок ретиношизин или его фрагмент и/или второй белок ретиношизин или его фрагмент содержит, по существу состоит из или состоит из последовательности, по меньшей мере примерно на 90%, по меньшей мере примерно на 91%, по меньшей мере примерно на 92%, по меньшей мере примерно на 93%, по меньшей мере примерно на 94%, по меньшей мере примерно на 95%, по меньшей мере примерно на 96%, по меньшей мере примерно на 97%, по меньшей мере примерно на 98%, по меньшей мере примерно на 99% или на 100% идентичной SEQ ID NO: 2 или 5. В иллюстративной двунаправленной конструкции первая кодирующая последовательность и/или вторая кодирующая последовательность содержит, по существу состоит из или состоит из последовательности, по меньшей мере примерно на 90%, по меньшей мере примерно на 91%, по меньшей мере примерно на 92%, по меньшей мере примерно на 93%, по меньшей мере примерно на 94%, по меньшей мере примерно на 95%, по меньшей мере примерно на 96%, по меньшей мере примерно на 97%, по меньшей мере примерно на 98%, по меньшей мере примерно на 99% или на 100% идентичной SEQ ID NO: 6, 8 или 9, или их вырожденным вариантам. В иллюстративной двунаправленной конструкции первая кодирующая последовательность содержит, по существу состоит из или состоит из последовательности, по меньшей мере примерно на 90%, по меньшей мере примерно на 91%, по меньшей мере примерно на 92%, по меньшей мере примерно на 93%, по меньшей мере примерно на 94%, по меньшей мере примерно на 95%, по меньшей мере примерно на 96%, по меньшей мере примерно на 97%, по меньшей мере примерно на 98%, по меньшей мере примерно на 99% или на 100% идентичной SEQ ID NO: 8, и вторая кодирующая последовательность содержит, по существу состоит из или состоит из последовательности, по меньшей мере примерно на 90%, по меньшей мере примерно на 91%, по меньшей мере примерно на 92%, по меньшей мере примерно на 93%, по меньшей мере примерно на 94%, по меньшей мере примерно на 95%, по меньшей мере примерно на 96%, по меньшей мере примерно на 97%, по меньшей мере примерно на 98%, по меньшей мере примерно на 99% или на 100% идентичной SEQ ID NO: 9. В иллюстративной двунаправленной конструкции нуклеиновокислотная конструкция содержит, по существу состоит из или состоит из последовательности, по меньшей мере примерно на 90%, по меньшей мере примерно на 91%, по меньшей мере примерно на 92%, по меньшей мере примерно на 93%, по меньшей мере примерно на 94%, по меньшей мере примерно на 95%, по меньшей мере примерно на 96%, по меньшей мере примерно на 97%, по меньшей мере примерно на 98%, по меньшей мере примерно на 99% или на 100% идентичной SEQ ID NO: 46 или 47.

[00184] Конструкции нуклеиновых кислот могут включать модификации или последовательности, которые обеспечивают дополнительные желательные свойства (например, модифицированную или регулируемую стабильность; отслеживание или обнаружение с помощью флуоресцентной метки; сайт связывания для белка или белкового комплекса и так далее). Конструкции нуклеиновых кислот могут содержать одну или более флуоресцентных меток, меток очистки, эпитопных меток или их комбинацию. Например, нуклеиновокислотная конструкция может содержать одну или более флуоресцентных меток (например, флуоресцентные белки или другие флуорофоры или красители), например, по меньшей мере 1, по меньшей мере 2, по меньшей мере 3, по меньшей мере 4 или по меньшей мере 5 флуоресцентных меток. Примеры флуоресцентных меток включают флуорофоры, такие как флуоресцеин (например, 6-карбоксифлуоресцеин (6-FAM)), Texas Red, HEX, Су3, Су5, Су5.5, Pacific Blue, 5-(и-6)-карбокситетраметилродамин (TAMRA) и Су7. Для мечения олигонуклеотидов коммерчески доступен широкий спектр флуоресцентных красителей (например, от Integrated DNA Technologies). Такие флуоресцентные метки (например, внутренние флуоресцентные метки) могут быть использованы, например, для обнаружения нуклеиновокислотной конструкции, которая была непосредственно интегрирована в расщепленную нуклеиновую кислоту-мишень, имеющую выступающие концы, совместимые с концами нуклеиновокислотной конструкции. Маркер или метка может находиться на 5'-конце, 3'-конце или внутри нуклеиновокислотной конструкции. Например, нуклеиновокислотная конструкция может быть конъюгирована на 5'-конце с флуорофором IR700 от Integrated DNA Technologies (5'IRDYE®700).

[00185] Нуклеиновокислотная конструкция также может содержать условный аллель. Условный аллель может быть многофункциональным аллелем, как описано в публикации US 2011/0104799, включенной в настоящий документ посредством ссылки в полном объеме для всех целей. Например, условный аллель может содержать: (а) активирующую последовательность в смысловой ориентации относительно транскрипции целевого гена; (b) кассету для отбора по чувствительности к лекарственному препарату (DSC) в смысловой или антисмысловой ориентации; (с) представляющую интерес нуклеотидную последовательность (NSI) в антисмысловой ориентации; и (d) условный по инверсии модуль (COIN, в котором используется разделяющий экзон интрон и инвертируемый модуль, подобный генной ловушке) в обратной ориентации. См., например, публикацию US 2011/0104799. Условный аллель может дополнительно содержать рекомбинируемые блоки, которые рекомбинируются при воздействии первой рекомбиназы с образованием условного аллеля, который (i) лишен активирующей последовательности и DSC; и (ii) содержит NSI в смысловой ориентации и COIN в антисмысловой ориентации. См., например, публикацию US 2011/0104799.

[00186] Конструкции нуклеиновых кислот также могут содержать полинуклеотид, кодирующий селективный маркер. В качестве альтернативы, в конструкциях нуклеиновых кислот может отсутствовать полинуклеотид, кодирующий селективный маркер. Селективный маркер может содержаться в селекционной кассете. Необязательно, селекционная кассета может представлять собой самоудаляющуюся кассету. См., например, публикации US 8697851 и US 2013/0312129, каждая из которых включена в настоящий документ посредством ссылки в полном объеме для всех целей. В качестве примера, самоудаляющаяся кассета может содержать ген Crei (содержит два экзона, кодирующих рекомбиназу Cre, которые разделены интроном), функционально связанный с промотором Prm1 мыши, и ген устойчивости к неомицину, функционально связанным с промотором убиквитина человека. С помощью промотора Prm1 самоудаляющаяся кассета может быть удалена специфически в мужских половых клетках животных F0. Примеры селективных маркеров включают неомицинфосфотрансферазу (neo^r), гигромицин-В-фосфотрансферазу (hyg^r), пуромицин-N-ацетилтрансферазу (puro^r), бластицидин-S-дезаминазу (bsr^r), ксантин-гуанинфосфорибозилтрансферазу (gpt) или тимидинкиназу вируса простого герпеса (HSV-k), или их комбинацию. Полинуклеотид, кодирующий селективный маркер, может быть функционально связан с промотором, активным в целевой клетке. Примеры промоторов описаны в других местах настоящего документа.

[00187] Нуклеиновокислотная конструкция также может содержать репортерный ген. Иллюстративные репортерные гены включают гены, кодирующие люциферазу, β-галактозидазу, зеленый флуоресцентный белок (GFP), усиленный зеленый флуоресцентный белок (eGFP), голубой флуоресцентный белок (CFP), желтый флуоресцентный белок (YFP), усиленный желтый флуоресцентный белок (eYFP), синий флуоресцентный белок (BFP), усиленный синий флуоресцентный белок (eBFP), DsRed, ZsGreen, MmGFP, mPlum, mCherry, tdTomato, mStrawberry, J-Red, mOrange, mKO, mCitrine, Venus, YPet, Emerald, CyPet, Cerulean, T-Sapphire и щелочную фосфатазу. Такие репортерные гены могут быть функционально связаны с промотором, активным в целевой клетке. Примеры промоторов описаны в других местах настоящего документа.

[00188] Нуклеиновокислотная конструкция может также содержать одну или более кассет экспрессии или кассет делеции. Отдельно взятая кассета может содержать одну или более представляющих интерес нуклеотидных последовательностей, полинуклеотид, кодирующий селективный маркер, и репортерный ген, а также различные регуляторные компоненты, которые влияют на экспрессию. Примеры селективных маркеров и репортерных генов, которые могут быть включены, подробно обсуждаются в других местах настоящего документа.

[00189] Нуклеиновокислотная конструкция может содержать нуклеиновую кислоту, фланкированную последовательностями-мишенями сайт-специфической рекомбинации. В качестве альтернативы, Нуклеиновокислотная конструкция может содержать одну или более последовательностей-мишеней сайт-специфической рекомбинации. Хотя вся Нуклеиновокислотная конструкция может быть фланкирована такими последовательностями-мишенями сайт-специфической рекомбинации, любая представляющая интерес область или отдельный полинуклеотид внутри нуклеиновокислотной конструкции также может быть фланкирован такими сайтами. Последовательности-мишени сайт-специфической рекомбинации, которые могут фланкировать нуклеиновокислотную конструкцию или любой представляющий интерес полинуклеотид в нуклеиновокислотной конструкции, могут включать, например, loxP, lox511, lox2272, lox66, lox71, loxM2, lox5171, FRT, FRT11, FRT71, attp, an, FRT, rox или их комбинацию. В качестве примера, сайты сайт-специфической рекомбинации фланкируют полинуклеотид, кодирующий селективный маркер и/или репортерный ген, содержащийся в нуклеиновокислотной конструкции. После интеграции нуклеиновокислотной конструкции в целевой локус последовательности между сайтами сайт-специфической рекомбинации могут быть удалены.

[00190] Конструкции нуклеиновых кислот могут также содержать один или более сайтов рестрикции для эндонуклеаз рестрикции (т.е. ферментов рестрикции), которые включают эндонуклеазы типа I, типа II, типа III и типа IV. Эндонуклеазы рестрикции типа I и типа III распознают определенные сайты рестрикции, но, как правило, расщепляют в варьирующемся положении от сайта связывания нуклеазы, который может находиться на расстоянии сотен пар оснований от сайта расщепления (сайта распознавания). В системах типа II рестрикционная активность не зависит от какой-либо активности метилазы, а расщепление, как правило, происходит в определенных сайтах внутри сайта связывания или рядом с ним. Большинство ферментов типа II разрезают палиндромные последовательности, однако ферменты типа На распознают непалиндромные сайты распознавания и расщепляют за пределами сайта распознавания, ферменты типа ПЬ дважды разрезают последовательности, при этом оба сайта находятся за пределами сайта распознавания, а ферменты типа Us распознают асимметричный сайт распознавания и расщепляют с одной стороны и на определенном расстоянии в примерно 1-20 нуклеотидов от сайта распознавания. Ферменты рестрикции типа IV нацелены на метилированную ДНК. Ферменты рестрикции дополнительно описаны и классифицированы, например, в базе данных REBASE (веб-страница на rebase.neb.com; Roberts et al., (2003) Nucleic Acids Res. 31:418-420; Roberts et al., (2003) Nucleic Acids Res. 31:1805-1812; и Belfbrt et al. (2002) в Mobile DNA II, стр. 761-783, Eds. Craigie et al., (ASM. Press, Вашингтон, округ Колумбия)).

[00191] Конструкции нуклеиновых кислот, раскрытые в настоящем документе, могут также содержать дополнительные кодирующие последовательности. Например, некоторые конструкции нуклеиновых кислот, раскрытые в настоящем документе, могут содержать последовательность, кодирующую гидовую РНК, нацеленную на целевой геномный локус (например, нацеленную на RS1, например, интрон 1 RS1). Последовательность, кодирующая гидовую РНК, может быть функционально связана с промотором, таким как промотор U6. В некоторых конструкциях нуклеиновых кислот кассета экспрессии гидовой РНК расположена с 3'-конца (по ходу транскрипции) от кодирующей последовательности (последовательностей) ретиношизина. В некоторых двунаправленных конструкциях нуклеиновых кислот кассета экспрессии гидовой РНК расположена между первым сегментом и вторым сегментом.

III. Векторы, содержащие конструкции нуклеиновых кислот

[00192] В настоящем документе также предложены векторы, содержащие конструкции нуклеиновых кислот (т.е. экзогенные донорные нуклеиновые кислоты), содержащие кодирующую последовательность ретиношизина (т.е. кодирующую белок ретиношизин или его фрагмент или вариант) для интеграции в целевой геномный локус и экспрессии из него. В настоящем документе также предложены векторы, содержащие нуклеиновые кислоты, кодирующие нуклеазные агенты (например, нацеленные на эндогенный локус RS1), раскрытые в других местах настоящего документа. В настоящем документе также предложены векторы, содержащие конструкции нуклеиновых кислот и/или нуклеиновые кислоты, кодирующие нуклеазные агенты (например, нацеленные на эндогенный локус RS1), раскрытые в других местах настоящего документа (например, векторы, содержащие нуклеиновокислотную конструкцию и ДНК, кодирующую гидовую РНК). Вектор может содержать дополнительные последовательности, такие как, например, точки начала репликации, промоторы и гены, кодирующие устойчивость к антибиотикам. Некоторые такие векторы содержат плечи гомологии, соответствующие целевым сайтам в целевом геномном локусе. Другие такие векторы не содержат каких-либо плеч гомологии.

[00193] Некоторые векторы могут быть кольцевыми. В качестве альтернативы, вектор может быть линейным. Вектор может быть упакован для доставки с помощью липидной наночастицы, липосомы, нелипидной наночастицы или вирусного капсида. Неограничивающие иллюстративные векторы включают плазмиды, фагмиды, космиды, искусственные хромосомы, минихромосомы, транспозоны, вирусные векторы и векторы экспрессии.

[00194] Векторы могут представлять собой, например, вирусные векторы, такие как векторы на основе аденоассоциированного вируса (AAV). AAV может быть любого подходящего серотипа и может представлять собой одноцепочечный AAV (ssAAV) или самокомплементарный AAV (scAAV). Другие иллюстративные вирусы/вирусные векторы включают ретровирусы, аденовирусы, вирусы осповакцины, поксвирусы и вирусы простого герпеса. Вирусы могут инфицировать делящиеся клетки, неделящиеся клетки или как делящиеся, так и неделящиеся клетки. Вирусы могут интегрироваться в геном хозяина или, в качестве альтернативы, не интегрироваться в геном хозяина. Такие вирусы также могут быть разработаны таким образом, чтобы они имели сниженный иммунитет. Вирусы могут быть репликационно-компетентными или могут быть репликационно-дефектными (например, дефектными в одном или нескольких генах, необходимых для дополнительных раундов репликации и/или упаковки вириона). Вирусы могут вызывать временную экспрессию, длительную экспрессию (например, по меньшей мере 1 неделю, 2 недели, 1 месяц, 2 месяца или 3 месяца) или постоянную экспрессию (например, Cas9 и/или гРНК). Иллюстративные вирусные титры (например, титры AAV) включают 10¹², 10¹³, 10¹⁴, 10¹⁵, и 10¹⁶ векторных геномов/мл. Иллюстративные вирусные титры (например, титры AAV) включают примерно 10¹², примерно 10¹³, примерно 10¹⁴, примерно 10¹⁵ и примерно 10¹⁶ векторных геномов (вг)/мл, или от примерно 10¹² до примерно 10¹⁶, от примерно 10¹² до примерно 10¹⁵, от примерно 10¹² до примерно 10¹⁴, от примерно 10¹² до примерно 10¹³, от примерно 10¹³ до примерно 10¹⁶, от примерно 10¹⁴ до примерно 10¹⁶, от примерно 10¹⁵ до примерно 10¹⁶ или от примерно 10¹³ до примерно 10¹⁵ вг/мл. Другие иллюстративные вирусные титры (например, титры AAV) включают примерно 10¹², примерно 10¹³, примерно 10¹⁴, примерно 10¹⁵ и примерно 10¹⁶ векторных геномов (вг)/кг массы тела, или от примерно 10¹² до примерно 10¹⁶, от примерно 10¹² до примерно 10¹⁵, от примерно 10¹² до примерно 10¹⁴, от примерно 10¹² до примерно 10¹³, от примерно 10¹³ до примерно 10¹⁶, от примерно 10¹⁴ до примерно 10¹⁶, от примерно 10¹⁵ до примерно 10¹⁶ или от примерно 10¹³ до примерно 10¹⁵ вг/кг массы тела.

[00195] Геном оцДНК AAV состоит из двух открытых рамок считывания. Rep и Cap; фланкированных двумя инвертированными концевыми повторами, которые обеспечивают синтез комплементарной цепи ДНК. При конструировании плазмиды для переноса AAV трансген помещают между двумя ITR, и Rep и Cap могут быть представлены в трансположении. Помимо Rep и Cap для AAV может потребоваться хелперная плазмида, содержащая гены аденовируса. Эти гены (Е4, Е2а и VA) опосредуют репликацию AAV. Например, плазмида для переноса, Rep/Cap и хелперная плазмида могут быть транс фицированы в клетки HEK293, содержащие ген аденовируса Е1+, для продуцирования инфекционных частиц AAV. В качестве альтернативы. Rep, Cap и хелперные гены аденовируса могут быть объединены в одной плазмиде. Аналогичные упаковывающие клетки и способы могут быть использованы для других вирусов, например, ретровирусов.

[00196] Идентифицировано несколько серотипов AAV. Эти серотипы различаются типами клеток, которые они инфицируют (т.е. их тропизмом), что позволяет осуществлять избирательную трансдукцию определенных типов клеток. Серотипы для фоторецепторных клеток включают AAV2, AAV5 и AAV8. Серотипы для пигментного эпителия сетчатки включают AAV1, AAV2, AAV4, AAV5 и AAV8. В конкретном примере вектор AAV, содержащий нуклеиновокислотную конструкцию, может представлять собой AAV2, AAV5 или AAV8.

[00197] Тропизм может быть дополнительно уточнен с помощью псевдотипирования, которое представляет собой смешение капсида и генома разных вирусных серотипов. Например, AAV2/5 означает вирус, содержащий геном серотипа 2, упакованный в капсид из серотипа 5. Применение псевдотипированных вирусов может улучшить эффективность трансдукции, а также изменить тропизм. Гибридные капсиды, полученные из разных серотипов, также могут быть использованы для изменения вирусного тропизма. Например, AAV-DJ содержит гибридный капсид из восьми серотипов и демонстрирует высокую инфицирующую способность в широком диапазоне типов клеток in vivo. AAV-DJ8 представляет собой еще один пример, который демонстрирует свойства AAV-DJ, но с улучшенным захватом в головном мозге. Серотипы AAV также могут быть модифицированы посредством мутаций. Примеры мутационных модификаций AAV2 включают Y444F, Y500F, Y730F и S662V. Примеры мутационных модификаций AAV3 включают Y705F, Y731F и T492V. Примеры мутационных модификаций AAV6 включают S663V и T492V. Другие псевдотипированные/модифицированные варианты AAV включают AAV2/1, AAV2/6, AAV2/7, AAV2/8, AAV2/9, AAV2.5, AAV8.2 и AAV/SASTG. В конкретном примере AAV представляет собой AAV7m8 - вариант AAV, который обеспечивает высокоэффективную доставку ко всем слоям сетчатки и к фоторецепторам. См., например, источник Dalkara et al. (2013) Sci. Transl. Med. 5:189ra76, включенной в настоящий документ посредством ссылки в полном объеме для всех целей.

[00198] Для ускорения экспрессии трансгена можно использовать самокомплементарные варианты AAV (scAAV). Поскольку AAV зависит от аппарата репликации ДНК клетки для синтеза комплементарной цепи генома в виде одноцепочечной ДНК AAV, экспрессия трансгена может быть отсрочена. Чтобы устранить эту задержку, можно использовать scAAV, содержащие комплементарные последовательности, которые способны спонтанно отжигаться при инфицировании, что устраняет потребность в синтезе ДНК клетки-хозяина. Однако, также можно использовать одноцепочечные векторы AAV (ssAAV).

[00199] Чтобы увеличить упаковочную способность, более длинные трансгены могут быть разделены между двумя плазмидами для переноса AAV, первая с 3'-донором сплайсинга, а вторая с 5'-акцептором сплайсинга. При совместном инфицировании клетки эти вирусы образуют конкатемеры, подвергаются совместному сплайсингу и обеспечивают возможность экспрессии полноразмерного трансгена. Хотя это обеспечивает более длительную экспрессию трансгена, такая экспрессия менее эффективна. В аналогичных способах увеличения способности используется гомологичная рекомбинация. Например, трансген может быть разделен между двумя плазмидами для переноса, но со значительным перекрытием последовательностей, так что совместная экспрессия вызывает гомологичную рекомбинацию и экспрессию полноразмерного трансгена.

IV. Липидные наночастицы, содержащие конструкции нуклеиновых кислот

[00200] В настоящем документе также предложены липидные наночастицы, содержащие конструкции нуклеиновых кислот (т.е. экзогенные донорные нуклеиновые кислоты), содержащие кодирующую последовательность ретиношизина (т.е. кодирующую белок ретиношизин или его фрагмент или вариант) для интеграции в целевой геномный локус и экспрессии из него. В настоящем документе также предложены липидные наночастицы, содержащие нуклеиновые кислоты, кодирующие нуклеазные агенты (например, нацеленные на эндогенный локус RS1), раскрытые в других местах настоящего документа. В настоящем документе также предложены липидные наночастицы, содержащие конструкции нуклеиновых кислот и нуклеиновые кислоты, кодирующие нуклеазные агенты (например, нацеленные на эндогенный локус RS1), раскрытые в других местах настоящего документа.

[00201] Липидные препараты могут защищать биологические молекулы от деградации, улучшая при этом их клеточный захват. Липидные наночастицы представляют собой частицы, содержащие множество липидных молекул, физически связанных друг с другом межмолекулярными силами. К ним относятся микросферы (включая однослойные и многослойные везикулы, например, липосомы), дисперсная фаза в эмульсии, мицеллы или внутренняя фаза в суспензии. Такие липидные наночастицы могут быть использованы для инкапсуляции одной или более нуклеиновых кислот или белков для доставки. Препараты, содержащие катионные липиды, пригодны для доставки полианионов, таких как нуклеиновые кислоты. Другие липиды, которые могут быть включены, представляют собой нейтральные липиды (т.е. незаряженные или цвиттерионные липиды), анионные липиды, вспомогательные липиды, которые усиливают трансфекцию, и липиды-невидимки, которые увеличивают продолжительность существования наночастиц in vivo. Примеры подходящих катионных липидов, нейтральных липидов, анионных липидов, вспомогательных липидов и липидов-невидимок можно найти в публикациях WO 2016/010840 А1 и WO 2017/173054 А1, каждая из которых включена в настоящий документ посредством ссылки в полном объеме для всех целей. Иллюстративная липидная наночастица может содержать катионный липид и один или более других компонентов. В качестве примера, другой компонент может включать вспомогательный липид, такой как холестерин. В еще одном примере другие компоненты могут включать вспомогательный липид, такой как холестерин, и нейтральный липид, такой как DSPC (дипальмитоилфосфатидилхолин). В качестве еще одного примера, другие компоненты могут включать вспомогательный липид, такой как холестерин, необязательный нейтральный липид, такой как DSPC, и липид-невидимку, такой как S010, S024, S027, S031 или S033.

[00202] LNP может содержать одно или более, или все из следующего: (i) липид для инкапсуляции и для эндосомального высвобождения; (ii) нейтральный липид для стабилизации; (iii) вспомогательный липид для стабилизации; и (iv) липид-невидимка. См., например, источники Finn et al. (2018) Cell Rep.22(9):2227-2235 и WO 2017/173054 A1, каждый из которых включен в настоящий документ посредством ссылки в полном объеме для всех целей. В некоторых LNP груз может дополнительно содержать нуклеазный агент. В некоторых LNP груз может дополнительно содержать гидовую РНК или нуклеиновую кислоту, кодирующую гидовую РНК. В некоторых LNP груз может дополнительно содержать мРНК, кодирующую нуклеазу Cas, такую как Cas9, и гидовую РНК или нуклеиновую кислоту, кодирующую гидовую РНК. В некоторых LNP груз может включать мРНК, кодирующую нуклеазу Cas, такую как Cas9, гидовую РНК или нуклеиновую кислоту, кодирующую гидовую РНК, и нуклеиновокислотную конструкцию.

[00203] Липид для инкапсуляции и эндосомального высвобождения может представлять собой катионный липид. Липид также может представлять собой биоразлагаемый липид, такой как биоразлагаемый ионизируемый липид. Одним из примеров подходящего липида является липид А или LP01, который представляет собой (9Z,12Z)-3-((4,4-бис(октилокси)бутаноил)окси)-2-((((3-(диэтиламино)пропокси)карбонил)окси)метил)пропилоктадека-9,12-диеноат, также называемый 3-((4,4-бис(октилокси)бутаноил)окси)-2-((((3-(диэтиламино)пропокси)карбонил)окси)метил)пропил(9Z,12Z)-октадека-9,12-диеноат. См., например, источники Finn et al. (2018) Cell Rep.22(9):2227-2235 и WO 2017/173054 A1, каждый из которых включен в настоящий документ посредством ссылки в полном объеме для всех целей. Еще одним примером подходящего липида является липид В, который представляет собой ((5-((диметиламино)метил)-1,3-фенилен)бис(окси))бис(октан-8,1-диил)бис(деканоат), также называемый ((5-((диметиламино)метил)-1,3-фенилен)бис(окси))бис(октан-8,1-диил)бис(деканоатом). Еще одним примером подходящего липида является липид С, который представляет собой 2-(4-(((3-(диметиламино)пропокси)карбонил)окси)гексадеканоил)окси)пропан-1,3-диил(9Z,9'Z,12Z,12'Z)-бис(октадека-9,12-диеноат). Еще одним примером подходящего липида является липид D, который представляет собой 3-(((3-(диметиламино)пропокси)карбонил)окси)-13-(октаноилокси)тридецил-3-октилундеканоат. Другие подходящие липиды включают: гептатриаконта-6,9,28,31-тетраен-19-ил 4-(диметиламино)бутаноат (также известный как Dlin-MC3-DMA (MC3))).

[00204] Некоторые такие липиды, подходящие для применения в описанных в настоящем документе LNP, являются биоразлагаемыми in vivo. Например, LNP, содержащие такой липид, включают те, в которых по меньшей мере 75% липида выводится из плазмы в течение 8, 10, 12, 24 или 48 часов, или 3, 4, 5, 6, 7 или 10 дней. В качестве другого примера, по меньшей мере 50% LNP выводится из плазмы в течение 8, 10, 12, 24 или 48 часов, или 3, 4, 5, 6, 7 или 10 дней.

[00205] Такие липиды могут быть ионизируемыми в зависимости от рН среды, в которой они находятся. Например, в слабокислой среде липиды могут быть протонированы и, таким образом, нести положительный заряд. И наоборот, в слабощелочной среде, такой как, например, кровь, где рН составляет примерно 7,35, липиды не могут протонироваться и, таким образом, не имеют заряда. В некоторых вариантах осуществления липиды могут быть протонированы при рН по меньшей мере примерно 9, 9,5 или 10. Способность такого липида нести заряд связана с его собственной pKa. Например, липид может независимо иметь pKa в диапазоне от около 5,8 до около 6,2.

[00206] Нейтральные липиды стабилизируют и улучшают процессинг LNP. Примеры подходящих нейтральных липидов включают множество нейтральных, незаряженных или цвиттерионных липидов. Примеры нейтральных фосфолипидов, подходящих для применения в настоящем изобретении, включают, не ограничиваясь перечисленным, 5-гептадецилбензол-1,3-диол (резорцин), дипальмитоилфосфатидилхолин (DPPC), дистеароилфосфатидилхолин (DSPC), фосфохолин (DOPC), димиристоилфосфатидилхолин (DMPC), фосфатидилхолин (PLPC), 1,2-диарахидоноил-sn-глицеро-3-фосфохолин (DAPC), фосфатидилэтаноламин (РЕ), яичный фосфатидилхолин (ЕРС), дилаурилоилфосфатидилхолин (DLPC), димиристоилфосфатидилхолин (DMPC), 1-миристоил-2-пальмитоилфосфатилфосфатил-2-пальмитоилфосфатилхолин (МРРС), 1-пальмоитил-2-миристоилфосфатидилхолин (РМРС), 1-пальмитоил-2-стеароилфосфатидилхолин (PSPC), 1,2-диарахидоил-sn-глицеро-3-фосфохолин (DBPC), 1-стеароил-2-пальмитоилфосфатидилхолин (SPPC), 1,2-диэйкозеноил-sn глицеро-3-фосфохолин (DEPC), пальмитоилолеоилфосфатидилхолин (РОРС), лизофосфатидилхолин, диолеоилфосфатидилэтаноламин (DOPE), дилинолеоилфосфатидилхолин дистеароилфосфатидилэтаноламин (DSPE), димиристоилфосфатидилэтаноламин (DMPE), дипальмитоилфосфатидилэтаноламин (DPPE), пальмитоилолеилфосфатидилэтаноламин (POPE), лизофосфатидилэтаноламин и их комбинации. Например, нейтральный фосфолипид может быть выбран из группы, состоящей из дистеароилфосфатидилхолина (DSPC) и димиристоилфосфатидилэтаноламина (DMPE).

[00207] Вспомогательные липиды включают липиды, которые усиливают трансфекцию. Механизм, с помощью которого вспомогательный липид усиливает трансфекцию, может включать повышение стабильности частиц. В некоторых случаях вспомогательный липид может усиливать фузогенность мембран. Вспомогательные липиды включают стероиды, стерины и алкилрезорцины. Примеры подходящих вспомогательных липидов включают холестерин, 5-гептадецилрезорцин и холестерин гемисукцинат. В качестве примера, вспомогательный липид может представлять собой холестерин или холестерин гемисукцинат.

[00208] Липиды-невидимки включают липиды, которые изменяют продолжительность существования наночастиц in vivo. Липиды-невидимки могут способствовать процессу приготовления препарата, например, уменьшая агрегацию частиц и контролируя размер частиц. Липиды-невидимки могут модулировать фармакокинетические свойства LNP. Подходящие Липиды-невидимки включают липиды, имеющие гидрофильную головную группу, связанную с липидным фрагментом.

[00209] Гидрофильная головная группа липида-невидимки может содержать, например, полимерный фрагмент, выбранный из полимеров на основе PEG (иногда называемый поли(этиленоксидом)), поли(оксазолина), поли(винилового спирта), поли(глицерина), поли(N-винилпирролидона), полиаминокислот и поли-N-(2-гидроксипропил)метакриламида). Термин «PEG» означает любой полиэтиленгликоль или другой полимер на основе простого полиалкиленового эфира. В некоторых препаратах LNP PEG представляет собой PEG-2K, также называемый PEG 2000, который имеет среднюю молекулярную массу примерно 2000 Дальтон. См., например, публикацию WO 2017/173054 А1, включенную в настоящий документ посредством ссылки в полном объеме для всех целей.

[00210] Липидный фрагмент липида-невидимки может быть получен, например, из диацилглицерина или диацилгликамида, включая группы, содержащие диалкилглицериновую или диалкилгликамидную группу, имеющую длину алкильной цепи, независимо содержащую от примерно С4 до примерно С40 насыщенных или ненасыщенных атомов углерода, где цепь может содержать одну или более функциональных групп, таких как, например, амид или сложный эфир. Диалкилглицериновая или диалкилгликамидная группа может дополнительно содержать одну или более замещенных алкильных групп.

[00211] В качестве примера, липид-невидимка может быть выбран из PEG-дилауроилглицерина, PEG-димиристоилглицерина (PEG-DMG), PEG-дипальмитоилглицерина, PEG-дистеароилглицерина (PEG-DSPE), PEG-дилаурилгликамида, PEG-димиристилгликамида, PEG-дипальмитоилгликамида и PEG-дистеароилгликамида, PEG-холестерина (1-[8'-(холест-5-ен-3[бета]-окси)карбоксамидо-3',6'-диоксаоктанил]карбамоил-[омега]-метилполи(этиленгликоль), PEG-DMB (3,4-дитетрадекоксилбензил-[омега]-метилполи(этиленгликоль)эфир), 1,2-димиристоил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин-N-[метокси(полиэтиленгликоль)-2000] (PEG2k-DMG), 1,2-дистеароил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин-N-[метокси(полиэтиленгликоль)-2000] (PEG2k-DSPE), 1,2-дистеароил-sn-глицерин метоксиполиэтиленгликоля (PEG2k-DSG), поли(этиленгликоль)-2000-диметакрилата (PEG2k-DMA) и 1,2-дистеарилоксипропил-3-амин-N-[метокси(полиэтиленгликоль)-2000] (PEG2k-DSA). В одном конкретном примере липид-невидимка может представлять собой PEG2k-DMG.

[00212] LNP могут содержать различные соответствующие молярные соотношения входящих в состав препарата липидов. Мол. % липида CCD может составлять, например, от примерно 30 мол. % до примерно 60 мол. %, от примерно 35 мол. % до примерно 55 мол. %, от примерно 40 мол. % до примерно 50 мол. %, от примерно 42 мол. % до примерно 47 мол. %, или примерно 45%. Мол. % вспомогательного липида может составлять, например, от примерно 30 мол. % до примерно 60 мол. %, от примерно 35 мол. % до примерно 55 мол. %, от примерно 40 мол. % до примерно 50 мол. %, от примерно 41 мол. % до примерно 46 мол. %, или примерно 44 мол. %. Мол. % нейтрального липида может составлять, например, от примерно 1 мол. % до примерно 20 мол. %, от примерно 5 мол. % до примерно 15 мол. %, от примерно 7 мол. % до примерно 12 мол. %, или примерно 9 мол. %. Мол. % липида-невидимки может составлять, например, от около 1 мол. % до около 10 мол. %, от около 1 мол. % до около 5 мол. %, от около 1 мол. % до около 3 мол. %, около 2 мол. % или около 1 мол. %.

[00213] LNP могут иметь разные соотношения между положительно заряженными аминогруппами биоразлагаемого липида (N) и отрицательно заряженными фосфатными группами (Р) нуклеиновой кислоты, которую необходимо инкапсулировать. Это может быть математически представлено уравнением N/P. Например, соотношение N/P может составлять от примерно 0,5 до примерно 100, от примерно 1 до примерно 50, от примерно 1 до примерно 25, от примерно 1 до примерно 10, от примерно 1 до примерно 7, от примерно 3 до примерно 5, от примерно 4 до примерно 5, примерно 4, примерно 4,5 или примерно 5.

[00214] В некоторых LNP груз может содержать мРНК Cas и гРНК. мРНК Cas и гРНК могут присутствовать в разных соотношениях. Например, препарат LNP может включать соотношение мРНК Cas и нуклеиновой кислоты гРНК в диапазоне от примерно 25:1 до примерно 1:25, в диапазоне от примерно 10:1 до примерно 1:10, в диапазоне от примерно 5:1 до примерно 1:5, или примерно 1:1. В качестве альтернативы, препарат LNP может включать соотношение мРНК Cas и нуклеиновой кислоты гРНК от примерно 1:1 до примерно 1:5, или примерно 10:1. В качестве альтернативы, препарат LNP может включать соотношение мРНК Cas и нуклеиновой кислоты гРНК, равное примерно 1:10, 25:1, 10:1, 5:1,3:1, 1:1, 1:3, 1:5, 1:10 или 1:25. В качестве альтернативы, препарат LNP может включать соотношение мРНК Cas и нуклеиновой кислоты гРНК от примерно 1:1 до примерно 1:2. В конкретных примерах соотношение мРНК Cas и гРНК может составлять примерно 1:1 или примерно 1:2.

[00215] Иллюстратвная дозировка LNP включает примерно 0,1, примерно 0,25, примерно 0,3, примерно 0,5, примерно 1, примерно 2, примерно 3, примерно 4, примерно 5, примерно 6, примерно 8 или примерно 10 мг/кг массы тела (mpk), или от примерно 0,1 до примерно 10, от примерно 0,25 до примерно 10, от примерно 0,3 до примерно 10, от примерно 0,5 до примерно 10, от примерно 1 до примерно 10, от примерно 2 до примерно 10, от примерно 3 до примерно 10, от примерно 4 до примерно 10, от примерно 5 до примерно 10, от примерно 6 до примерно 10, от примерно 8 до примерно 10, от примерно 0,1 до примерно 8, от примерно 0,1 до примерно 6, от примерно 0,1 до примерно 5, от примерно 0,1 до примерно 4, от примерно 0,1 до примерно 3, от примерно 0,1 до примерно 2, от примерно 0,1 до примерно 1, от примерно 0,1 до примерно 0,5, от примерно 0,1 до примерно 0,3, от примерно 0,1 до примерно 0,25, от примерно 0,25 до примерно 8, от примерно 0,3 до примерно 6, от примерно 0,5 до примерно 5, от примерно 1 до примерно 5 или от примерно 2 до примерно 3 мг/кг массы тела относительно всей РНК (мРНК Cas9 и гРНК) содержимого груза. Такие LNP могут быть введены, например, внутривенно. В качестве примера, могут быть использованы дозы LNP от примерно 0,01 мг/кг до примерно 10 мг/кг, от примерно 0,1 до примерно 10 мг/кг или от примерно 0,01 до примерно 0,3 мг/кг. Например, могут быть использованы дозы LNP, равные примерно 0,01, примерно 0,03, примерно 0,1, примерно 0,3, примерно 1, примерно 3 или примерно 10 мг/кг. Дополнительные иллюстративные дозировки LNP включают примерно 0,1, примерно 0,25, примерно 0,3, примерно 0,5, примерно 1, примерно 2, примерно 3, примерно 4, примерно 5, примерно 6, примерно 8 или примерно 10 мг/кг (mpk) массы тела, или от примерно 0,1 до примерно 10, от примерно 0,25 до примерно 10, от примерно 0,3 до примерно 10, от примерно 0,5 до примерно 10, от примерно 1 до примерно 10, от примерно 2 до примерно 10, от примерно 3 до примерно 10, от примерно 4 до примерно 10, от примерно 5 до примерно 10, от примерно 6 до примерно 10, от примерно 8 до примерно 10, от примерно 0,1 до примерно 8, от примерно 0,1 до примерно 6, от примерно 0,1 до примерно 5, от примерно 0,1 до примерно 4, от примерно 0,1 до примерно 3, от примерно 0,1 до примерно 2, от примерно 0,1 до примерно 1, от примерно 0,1 до примерно 0,5, от примерно 0,1 до примерно 0,3, от примерно 0,1 до примерно 0,25, от примерно 0,25 до примерно 8, от примерно 0,3 до примерно 6, от примерно 0,5 до примерно 5, от примерно 1 до примерно 5 или от примерно 2 до примерно 3 мг/кг массы тела относительно всей РНК (мРНК Cas9 и гРНК) содержимого груза. Такие LNP могут быть введены, например, внутривенно. В качестве примера, могут быть использованы дозы LNP от примерно 0,01 мг/кг до примерно 10 мг/кг, от примерно 0,1 до примерно 10 мг/кг или от примерно 0,01 до примерно 0,3 мг/кг. Например, могут быть использованы дозы LNP, равные примерно 0,01, примерно 0,03, примерно 0,1, примерно 0,3, примерно 0,5, примерно 1, примерно 2, примерно 3 или примерно 10 мг/кг. В другом примере могут быть использованы дозы LNP от примерно 0,5 до примерно 10, от примерно 0,5 до примерно 5, от примерно 0,5 до примерно 3, от примерно 1 до примерно 10, от примерно 1 до примерно 5, от примерно 1 до примерно 3 или от примерно 1 до примерно 2 мг/кг.

V. Композиции, содержащие конструкции нуклеиновых кислот и/или нуклеазный агент, или нуклеиновую кислоту, кодирующую нуклеазный агент

[00216] В настоящем документе также предложены композиции, содержащие конструкции нуклеиновых кислот, содержащие кодирующую последовательность ретиношизина (т.е. кодирующую белок ретиношизин или его фрагмент или вариант) для интеграции в целевой геномный локус и экспрессии из него, векторы или липидные наночастицы, раскрытые в настоящем документе, и нуклеазный агент или нуклеиновую кислоту, кодирующую нуклеазный агент. В настоящем документе также предложены композиции, содержащие конструкции нуклеиновых кислот, содержащие кодирующую последовательность ретиношизина (т.е. кодирующую белок ретиношизин или его фрагмент или вариант) для интеграции в целевой геномный локус и экспрессии из него, векторы или липидные наночастицы, раскрытые в настоящем документе. В настоящем документе также предложены композиции, содержащие нуклеазный агент или нуклеиновую кислоту, кодирующую нуклеазный агент (например, где нуклеазный агент нацелен на ген или локус RS1), или векторы или липидные наночастицы, содержащие нуклеазный агент или нуклеиновую кислоту, кодирующую нуклеазный агент. Такие композиции могут быть предназначены, например, для применения в экспрессии ретиношизина в клетке или для применения в интеграции кодирующей последовательности для белка ретиношизина или его фрагмента или варианта в целевой геномный локус в клетке. Такие композиции также могут быть предназначены, например, для применения в лечении субъекта с Х-сцепленным ювенильным ретиношизисом (XLRS). Такие композиции могут содержать нуклеиновокислотную конструкцию, содержащую кодирующую последовательность для белка ретиношизина или его фрагмента для интеграции в целевой геномный локус (или вектор, или липидную наночастицу, содержащую нуклеиновокислотную конструкцию), и нуклеазный агент или нуклеиновую кислоту, кодирующую нуклеазный агент, где нуклеазный агент нацелен на последовательность-мишень нуклеазы в целевом геномном локусе. Нуклеазный агент может представлять собой систему CRISPR/Cas (например, белок Cas и гидовую РНК) или любой другой подходящий нуклеазный агент. Примеры подходящих нуклеазных агентов приведены ниже.

А. Системы CRISPR/Cas

[00217] В способах и композициях, описанных в настоящем документе, могут быть использованы системы «коротких палиндромных повторов, регулярно расположенных группами (CRISPR)/CRISPR-ассоциированных белков (Cas)» или компоненты таких систем для модификации генома в клетке (например, локуса RS1). Системы CRISPR/Cas включают в себя транскрипты и другие элементы, участвующие в экспрессии генов Cas или управляющие активностью генов Cas. Система CRISPR/Cas может представлять собой, например, систему типа I, типа II, типа III или систему типа V (например, подтип V-A или подтип V-B). В способах и композициях, описанных в настоящем документе, могут быть использованы системы CRISPR/Cas путем использования комплексов CRISPR (содержащих гидовую РНК (гРНК) в комплексе с белком Cas) для сайт-направленного связывания или расщепления нуклеиновых кислот.

[00218] Системы CRISPR/Cas, используемые в раскрытых в настоящем документе композициях и способах, могут быть не встречающимися в природе. «Не встречающаяся в природе» система включает в себя то, что было создано деятельностью человека, например, один или более компонентов системы, измененных или мутированных по сравнению с тем состоянием, в котором они встречаются в природе, по меньшей мере по существу не содержащих по меньшей мере одного другого компонента, с которым они естественным образом связаны в природе, или связанных с по меньшей мере одним другим компонентом, с которым они не связаны естественным образом. Например, в некоторых системах CRISPR/Cas используются не встречающиеся в природе комплексы CRISPR, содержащие гРНК и белок Cas, которые вместе не встречаются в природе, используется белок Cas, который не встречается в природе, или используется гРНК, которая не встречается в природе.

1. Белки Cas

[00219] Белки Cas обычно содержат по меньшей мере один РНК-распознающий или связывающий домен, который может взаимодействовать с гидовыми РНК. Белки Cas также могут содержать нуклеазные домены (например, ДНКазные домены или РНКазные домены), ДНК-связывающие домены, хеликазные домены, домены белок-белкового взаимодействия, домены димеризации и другие домены. Некоторые такие домены (например, ДНКазные домены) могут происходить из природного белка Cas. Другие такие домены могут быть добавлены для получения модифицированного белка Cas. Нуклеазный домен обладает каталитической активностью в отношении расщепления нуклеиновой кислоты, которое включает разрыв ковалентных связей молекулы нуклеиновой кислоты. Расщепление может приводить к образованию тупых или ступенчатых концов, и оно может быть одноцепочечным или двухцепочечным. Например, белок Cas9 дикого типа обычно создает продукт расщепления с тупыми концами. В качестве альтернативы, белок Cpf1 дикого типа (например, FnCpf1) может приводить к образованию продукта расщепления с 5'-выступом из 5 нуклеотидов, при этом расщепление происходит после 18-й пары оснований от последовательности РАМ в нецелевой цепи и после 23-го основания в целевой цепи. Белок Cas может обладать полной активностью расщепления для создания двухцепочечного ника в целевом геномном локусе (например, двухцепочечного разрыва с тупыми концами), или может представлять собой никазу, которая создает одноцепочечный разрыв в целевом геномном локусе.

[00220] Примеры белков Cas включают Cas1, Cas1B, Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas5e (CasD), Cas6, Cas6e, Cas6f, Cas7, Cas8a1, Cas8a2, Cas8b, Cas8c, Cas9 (Csnl or Csx12), Cas10, Cas10d, CasF, CasG, CasH, Csy1, Csy2, Csy3, Cse1 (CasA), Cse2 (CasB), Cse3 (CasE), Cse4 (CasC), Csc1, Csc2, Csa5, Csn2, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmr1, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Csb1, Csb2, Csb3, Csx17, Csx14, Csx10, Csx16, CsaX, Csx3, Csx1, Csx15, Csf1, Csf2, Csf3, Csf4 и Cu1966, а также их гомологи или модифицированные версии.

[00221] Иллюстративный белок Cas представляет собой белок Cas9 или белок, производный от белка Cas9. Белки Cas9 происходят из системы CRISPR/Cas II типа и обычно имеют четыре общих ключевых мотива с консервативной структурой. Мотивы 1, 2 и 4 представляют собой RuvC-подобные мотивы, а мотив 3 представляет собой мотив HNH. Иллюстративные белки Cas9 происходят из Streptococcus pyogenes, Streptococcus thermophilus. Streptococcus sp., Staphylococcus aureus, Nocardiopsis dassonvillei, Streptomyces pristinaespiralis, Streptomyces viridochromogenes, Streptomyces viridochromogenes, Streptosporangium roseum, Streptosporangium roseum, Alicyclobacillus acidocaldarius, Bacillus pseudomycoides. Bacillus selenitireducens, Exiguobacterium sibiricum, Lactobacillus delbrueckii, Lactobacillus salivarius, Microscilla marina, Burkholderiales bacterium, Polaromonas naphthalenivorans, Polaromonas sp., Crocosphaera watsonil, Cyanothece sp., Microcystis aeruginosa, Synechococcus sp., Acetohalobium arabaticum, Ammonifex degensii, Caldicelulosiruptor becscii, Candidatus Desulforudis, Clostridium botulinum, Clostridium difficile, Finegoldia magna, Natranaerobius thermophilus, Pelotomaculum thermopropionicum, Acidithiobacillus caldus, Acidithiobacillusferrooxidans, Allochromatium vinosum, Marinobacter sp., Nitrosococcus halophilus, Nitrosococcus watsoni, Pseudoalteromonas haloplanktis, Ktedonobacter racemifer, Methanohalobium evestigatum, Anabaena variabilis, Nodularia spumigena, Nostoc sp., Arthrospira maxima, Arthrospira platensis, Arthrospira sp., Lyngbya sp., Microcoleus chthonoplastes, Oscillatoria sp., Petrotoga mobilis, Thermosipho africanus, Acaryochloris marina, Neisseria meningitidis или Campylobacter jejuni. Дополнительные примеры представителей семейства Cas9 описаны в публикации WO 2014/131833, включенной в настоящий документ посредством ссылки в полном объеме для всех целей. Cas9 из S. pyogenes (SpCas9) (например, которой присвоен учетный номер UniProt Q99ZW2) представляет собой пример белка Cas9. Иллюстративная последовательность белка SpCas9 представлена в SEQ ID NO: 27 (кодируется последовательностью ДНК, представленной в SEQ ID NO: 26). Иллюстративная последовательность кРНК SpCas9 представлена в SEQ ID NO: 28. Белки Cas9 меньшего размера (например, белки Cas9, чьи кодирующие последовательности совместимы с максимальной упаковочной способностью AAV при сочетании с кодирующей последовательностью гидовой РНК и регуляторными элементами для Cas9 и гидовой РНК, такими как SaCas9 и CjCas9 и Nme2Cas9) представляют собой другие примеры белков Cas9. Например, Cas9 из S. aureus (SaCas9) (например, которой присвоен учетный номер UniProt J7RUA5) представляет собой еще один пример белка Cas9. Аналогичным образом, Cas9 из Campylobacter jejuni (CjCas9) (например, которой присвоен учетный номер UniProt QOP897) представляет собой еще один иллюстративный белок Cas9. См., например, источник Kim et al. (2017) Nat. Commun. 8:14500, включенный в настоящий документ посредством ссылки в полном объеме для всех целей. SaCas9 имеет меньший размер, чем SpCas9, а CjCas9 имеет меньший размер, чем оба из SaCas9 и SpCas9. Cas9 из Neisseria meningitidis (Nme2Cas9) представляет собой еще один иллюстративный белок Cas9. См., например, источник Edraki et al. (2019) Mol. Cell 73(4):714-726, включенный в настоящий документ посредством ссылки в полном объеме для всех целей. Белки Cas9 из Streptococcus thermophilus (например, Cas9 Streptococcus thermophilus LMD-9, кодируемая локусом CRISPR1 (St1Cas9), или Cas9 Streptococcus thermophilus из локуса CRISPR3 (St3Cas9)) представляют собой другие примеры белков Cas9. Cas9 из Francisella novicida (FnCas9) или вариант Cas9 RHA Francisella novicida, который распознает альтернативный РАМ (замены E1369R/E1449H/R1556A), представляют собой другие примеры белков Cas9. Обзор этих и других иллюстративных белков Cas9 приведен, например, в источнике Cebrian-Serrano and Davies (2017) Mamm. Genome 28(7):247-261, включенном в настоящий документ посредством ссылки в полном объеме для всех целей. Примеры кодирующих последовательностей Cas9, мРНК Cas9 и белковых последовательностей Cas9 представлены в публикациях WO 2013/176772, WO 2014/065596, WO 2016/106121 и WO 2019/067910, каждая из которых полностью включена в настоящий документ посредством ссылки в полном объеме для всех целей. Конкретные примеры аминокислотных последовательностей ORF и Cas9 представлены в таблице 30 в параграфе [0449] публикации WO 2019/067910, а конкретные примеры мРНК Cas9 и ORF представлены в параграфах [0214]-[0234] публикации WO 2019/067910. В качестве примера, белок Cas9 может содержать, по существу состоять из или состоять из последовательности, представленной в SEQ ID NO: 6242. Такой белок Cas9 может кодироваться мРНК, содержащей, по существу состоящей из или состоящей из SEQ ID NO: 6243. В качестве другого примера белок Cas9 может содержать, по существу состоять из или состоять из последовательности, представленной в SEQ ID NO: 6246. Такой белок Cas9 может кодироваться мРНК, содержащей, по существу состоящей из или состоящей из SEQ ID NO: 6245.

[00222] Другим примером белка Cas является белок Cpf1 (CRISPR из Prevotella и Francisella I). Cpf1 представляет собой большой белок (около 1300 аминокислот), который содержит RuvC-подобный нуклеазный домен, гомологичный соответствующему домену Cas9, вместе с аналогом характерного богатого аргинином кластера Cas9. Тем не менее, в Cpf1 отсутствует нуклеазный домен HNH, который присутствует в белках Cas9, а RuvC-подобный домен в последовательности Cpf1 является непрерывным, в отличие от Cas9, где он содержит длинные вставки, включая домен HNH. См., например, источник Zetsche et al. (2015) Cell 163(3):759-771, включенный в настоящий документ посредством ссылки в полном объеме для всех целей. Иллюстративные белки Cpf1 происходят из Francisella tularensis I, Francisella tularensis subsp. novicida, Prevotella albensis, Lachnospiraceae bacterium MC2017 1, Butyrivibrio proteoclasticus, Peregrinibacteria bacterium GW2011_GWA2_33_10, Parcubacteria bacterium GW2011_GWC2_44_17, Smithella sp. SCADC, Acidaminococcus sp. BV3L6, Lachnospiraceae bacterium MA2020, Candidatus Methanoplasma termitum, Eubacterium eligens, Moraxella bovoculi 237, Leptospira inadai, Lachnospiraceae bacterium ND2006, Porphyromonas crevioricanis 3, Prevotella disiens и Porphyromonas macacae. Cpf1 из Francisella novicida U112 (FnCpf1; присвоен учетный номер UniProt AOQ7Q2) представляет собой пример белка Cpf1.

[00223] Белки Cas могут представлять собой белки дикого типа (т.е. белки, которые встречаются в природе), модифицированные белки Cas (т.е. вариантные белки Cas) или фрагменты белков Cas дикого типа или модифицированных белков Cas. Белки Cas также могут представлять собой активные варианты или фрагменты в отношении каталитической активности белков Cas дикого типа или модифицированных белков Cas. Активные варианты или фрагменты в отношении каталитической активности могут обладать по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или большей идентичностью последовательности с белком Cas дикого типа или модифицированным белком Cas, или его частью, при этом активные варианты сохраняют способность делать разрез в желаемом сайте расщепления и, следовательно, сохраняют активность индукции ников или двухцепочечных разрывов. Анализы на активность индукции ников или двухцепочечных разрывов известны, и обычно в них измеряют общую активность и специфичность белка Cas на ДНК-субстратах, содержащих сайт расщепления.

[00224] Белки Cas могут быть модифицированы для увеличения или уменьшения одного или более из аффинности связывания нуклеиновой кислоты, специфичности связывания нуклеиновой кислоты и ферментативной активности. Белки Cas также могут быть модифицированы для изменения любой другой активности или свойства белка, например, стабильности. Например, один или более нуклеазных доменов белка Cas могут быть модифицированы, удалены или инактивированы, или белок Cas может быть усечен для удаления доменов, которые не являются существенными для функции белка, или для оптимизации (например, увеличения или уменьшения) активности или свойства белка Cas.

[00225] Одним из примеров модифицированного белка Cas является модифицированный белок SpCas9-HF1, который представляет собой высокоточный вариант Cas9 Streptococcus pyogenes, несущий изменения (N497A/R661A/Q695A/Q926A), предназначенные для уменьшения неспецифических контактов с ДНК. См., например, источник Kleinstiver et al. (2016) Nature 529(7587):490-495, включенный в настоящий документ посредством ссылки в полном объеме для всех целей. Еще одним примером модифицированного белка Cas является модифицированный вариант eSpCas9 (K848A/K1003A/R1060A), разработанный для уменьшения нецелевых эффектов. См., например, источник Slaymaker et al. (2016) Science 351(6268):84-88, включенный в настоящий документ посредством ссылки в полном объеме для всех целей. Другие варианты SpCas9 включают K855A и K810A/K1003A/R1060A. Обзор этих и других модифицированных белков Cas приведен, например, в источнике Cebrian-Serrano and Davies (2017) Mamm. Genome 28(7):247-261, включенном в настоящий документ посредством ссылки в полном объеме для всех целей. Еще одним примером модифицированного белка Cas9 является xCas9, который представляет собой вариант SpCas9, который может распознавать более широкий диапазон последовательностей РАМ. См., например, источник Hu et al. (2018) Nature 556:57-63, включенный в настоящий документ посредством ссылки в полном объеме для всех целей.

[00226] Белки Cas могут содержать по меньшей мере один нуклеазный домен, такой как ДНКазный домен. Например, белок Cpf1 дикого типа обычно содержит RuvC-подобный домен, который расщепляет обе цепи ДНК-мишени, возможно, в димерной конфигурации. Белки Cas также могут содержать по меньшей мере два нуклеазных домена, таких как ДНКазные домены. Например, белок Cas9 дикого типа обычно содержит RuvC-подобный нуклеазный домен и HNH-подобный нуклеазный домен. Каждый из доменов RuvC и HNH может разрезать разные цепи двухцепочечной ДНК с образованием двухцепочечного разрыва в ДНК. См., например, источник Jinek et al. (2012) Science 337:816-821, включенный в настоящий документ посредством ссылки в полном объеме для всех целей.

[00227] Один или более, или все нуклеазные домены могут быть удалены или мутированы таким образом, чтобы они больше не были функциональны или имели пониженную нуклеазную активность. Например, если один из нуклеазных доменов в белке Cas9 удален или мутирован, то полученный в результате белок Cas9 может называться никазой и может генерировать одноцепочечный разрыв в двухцепочечной ДНК-мишени, но не двухцепочечный разрыв (т.е. он может расщеплять комплементарную цепь или некомплементарную цепь, но не обе из них). Если оба нуклеазных домена удалены или мутированы, то полученный в результате белок Cas (например, Cas9) будет иметь пониженную способность расщеплять обе цепи двухцепочечной ДНК (например, белок Cas с нулевой нуклеазной активностью или белок Cas с инактивированной нуклеазной активностью, или каталитически мертвый белок Cas (dCas)). Если ни один из нуклеазных доменов не удален или не мутирован в белке Cas9, белок Cas9 сохранит активность индукции двухцепочечных разрывов. Примером мутации, которая превращает Cas9 в никазу, является мутация D10A (аспартат в аланин в положении 10 Cas9) в домене RuvC Cas9 из S. pyogenes. Аналогичным образом, Н939А (гистидин в аланин в аминокислотном положении 839), Н840А (гистидин в аланин в аминокислотном положении 840) или N863A (аспарагин в аланин в аминокислотном положении N863) в домене HNH белка Cas9 из S. pyogenes могут превращать Cas9 в никазу. Другие примеры мутаций, которые превращают Cas9 в никазу, включают соответствующие мутации белка Cas9 из S. thermophilus. См.; например, источники Sapranauskas et al. (2011) Nucleic Acids Res. 39(21):9275-9282 и WO 2013/141680, каждый из которых включен в настоящий документ посредством ссылки в полном объеме для всех целей. Такие мутации могут быть получены с использованием таких способов, как сайт-направленный мутагенез, ПЦР-опосредованный мутагенез или полный генный синтез. Примеры других мутаций, создающих никазы, можно найти, например, в публикациях WO 2013/176772 и WO 2013/142578, каждая из которых включена в настоящий документ посредством ссылки в полном объеме для всех целей. Если в белке Cas удалены или мутированы все нуклеазные домены (например, в белке Cas9 удалены или мутированы оба нуклеазных домена), то полученный в результате белок Cas (например, Cas9) будет иметь пониженную способность расщеплять обе цепи двухцепочечной ДНК (например, белок Cas с нулевой нуклеазной активностью или с белок Cas с инактивированной нуклеазной активностью). Одним из конкретных примеров является двойной мутант D10A/H840A Cas9 S. pyogenes или соответствующий двойной мутант Cas9 из другого вида при оптимальном выравнивании с последовательностью Cas9 S. pyogenes. Еще одним конкретным примером является двойной мутант D10A/N863A Cas9 S. pyogenes или соответствующий двойной мутант Cas9 из другого вида при оптимальном выравнивании с Cas9 S. pyogenes.

[00228] Примеры инактивирующих мутаций в каталитических доменах xCas9 являются такими же, как описанные выше для SpCas9. Также известны примеры инактивирующих мутаций в каталитических доменах белков Cas9 Staphylococcus aureus. Например, фермет Cas9 Staphylococcus aureus (SaCas9) может содержать замену в положении N580 (например, замену N580A) и замену в положении D10 (например, замену D10A) для создания белка Cas с инактивированной нуклеазной активностью. См., например, публикацию WO 2016/106236, включенную в настоящий документ посредством ссылки в полном объеме для всех целей. Также известны примеры инактивирующих мутаций в каталитических доменах Nme2Cas9 (например, комбинация D16A и Н588А). Также известны примеры инактивирующих мутаций в каталитических доменах St1Cas9 (например, комбинация D9A, D598A, Н599А и N622A). Также известны примеры инактивирующих мутаций в каталитических доменах St3Cas9 (например, комбинация D10A и N870 А). Также известны примеры инактивирующих мутаций в каталитических доменах CjCas9 (например, комбинация D8A и Н559А). Также известны примеры инактивирующих мутаций в каталитических доменах FnCas9 и RHA FnCas9 (например, N995A).

[00229] Также известны примеры инактивирующих мутаций в каталитических доменах белков Cpf1. Для белков Cpf1 из Francisella novicida U112 (FnCpf1), Acidaminococcus sp.BV3L6 (AsCpf1), Lachnospiraceae bacterium ND2006 (LbCpf1) и Moraxella bovoculi 237 (MbCpf1 Cpf1) такие мутации могут включать мутации в положениях 908, 993 или 1263 в AsCpf1, или в соответствующих положениях в ортологах Cpf1, либо в положениях 832, 925, 947 или 1180 в LbCpf1, или в соответствующих положениях в ортологах Cpf1. Такие мутации могут включать, например, одну или более из мутаций D908A, Е993А и D1263A в AsCpf1, или соответствующие мутации в ортологах Cpf1, или D832A, Е925А, D947A и D1180A в LbCpf1, или соответствующие мутации в ортологах Cpf1. См., например, публикацию US 2016/0208243, включенную в настоящий документ посредством ссылки в полном объеме для всех целей.

[00230] Белки Cas также могут быть функционально связаны с гетерологичными полипептидами в виде слитых белков. Например, белок Cas может быть слит с доменом расщепления или доменом эпигенетической модификации. См. публикацию WO 2014/089290, включенную в настоящий документ посредством ссылки в полном объеме для всех целей. Белки Cas также могут быть слиты с гетерологичным полипептидом, обеспечивающим повышенную или пониженную стабильность. Слитый домен или гетерологичный полипептид может быть расположен на N-конце, С-конце или внутри белка Cas.

[00231] В качестве примера, белок Cas может быть слит с одним или более гетерологичными полипептидами, которые обеспечивают субклеточную локализацию. Такие гетерологичные полипептиды могут включать, например, один или более сигналов ядерной локализации (NLS), таких как одинарный NLS SV40 и/или двойной NLS импортина-альфа, для нацеливания на ядро, сигнал митохондриальной локализации для нацеливания на митохондрии, сигнал ER-удержания и т.п. См., например, источник Lange et al. (2007) J. Biol. Chem. 282(8):5101-5105, включенный в настоящий документ посредством ссылки в полном объеме для всех целей. Такие сигналы субклеточной локализации могут быть расположены на N-конце, С-конце или в любой области в пределах белка Cas. NLS может содержать участок основных аминокислот и может быть одинарной последовательностью или двойной последовательностью. Необязательно, белок Cas может содержать два или более NLS, включая NLS (например, NLS импортина-альфа или одинарный NLS) на N-конце и NLS (например, NLS SV40 или двойной NLS) на С-конце. Белок Cas также может содержать два или более NLS на N-конце и/или два или более NLS на С-конце.

[00232] Белок Cas может, например, быть слит с 1-10 NLS (например, слит с 1-5 NLS или слит с одним NLS). Когда используется один NLS, NLS может быть связан с N-концом или С-концом последовательности белка Cas. Он также может быть вставлен в последовательность белка Cas. В качестве альтернативы, белок Cas может быть слит более чем с одним NLS. Например, белок Cas может быть слит с 2, 3, 4 или 5 NLS. В конкретном примере белок Cas может быть слит с двумя NLS. В определенных обстоятельствах две NLS могут быть одинаковыми (например, две NLS SV40) или разными. Например, белок Cas может быть слит с двумя последовательностями NLS SV40, связанными с карбоксиконцом. В качестве альтернативы, белок Cas может быть слит с двумя NLS, один из которых связан с N-концом, а другой - с С-концом. В других примерах белок Cas может быть слит с 3 NLS или не слит с NLS. NLS может представлять собой одинарную последовательность, такую как, например, NLS SV40, PKKKRKV (SEQ ID NO: 49) или PKKKRRV (SEQ ID NO: 50). NLS может представлять собой двойную последовательность, такую как NLS нуклеоплазмина, KRPAATKKAGQAKKKK (SEQ ID NO: 51). В конкретном примере один NLS PKKKRKV (SEQ ID NO: 49) может быть связан с С-концом белка Cas. В сайт слияния необязательно включают один или несколько линкеров.

[00233] Белки Cas также могут быть функционально связаны с доменом проникновения в клетку или доменом белковой трансдукции. Например, домен проникновения в клетку может происходить из белка ТАТ ВИЧ-1, проникающего в клетку мотива TLM из вируса гепатита В человека, MPG, Pep-1, VP22, проникающего в клетку белка из вируса простого герпеса или из полиаргининовой пептидной последовательности. См., например, публикации WO 2014/089290 и WO 2013/176772, каждая из которых включена в настоящий документ посредством ссылки в полном объеме для всех целей. Домен проникновения в клетку может быть расположен на N-конце, С-конце или в любой области в пределах белка Cas.

[00234] Белки Cas также могут быть функционально связаны с гетерологичным полипептидом для облегчения отслеживания или очистки, например, с флуоресцентным белком, меткой очистки или эпитопной меткой. Примеры флуоресцентных белков включают зеленые флуоресцентные белки (например, GFP, GFP-2, tagGFP, turboGFP, eGFP, Emerald, Azami Green, мономерный Azami Green, CopGFP, AceGFP, ZsGreen1), желтые флуоресцентные белки (например, YFP, eYFP, Citrine, Venus, YPet, PhiYFP, ZsYellow1), синие флуоресцентные белки (например, eBFP, eBFP2, Azurite, mKalama1, GFPuv, Sapphire, T-sapphire), голубые флуоресцентные белки (например, eCFP, Cerulean, CyPet, AmCyan1, Midoriishi-Cyan), красные флуоресцентные белки (например, mKate, mKate2, mPlum, мономер DsRed, mCherry, mRFP1, DsRed-Express, DsRed2, мономер DsRed, тандем HcRed, HcRed1, AsRed2, eqFP611, mRaspberry, mStrawberry, Jred), оранжевые флуоресцентные белки (например, mOrange, mKO, Kusabira-Orange, мономерный Kusabira-Orange, mTangerine, tdTomato) и любой другой подходящий флуоресцентный белок. Примеры меток включают глутатион-S-трансферазу (GST), хитин-связывающий белок (СВР), мальтозо-связывающий белок, тиоредоксин (TRX), nonn(NANP), метку для тандемной аффинной очистки (ТАР), myc, AcV5, AU1, AU5, Е, ECS, E2, FLAG, гемагглютинин (НА), nus, Softag 1, Softag 3, Strep, SBP, Glu-Glu, HSV, KT3, S, S1, T7, V5, VSV-G, гистидин (His), белок-носитель карбоксила биотина (ВССР) и кальмодулин.

[00235] Белки Cas также могут быть присоединены к меченым нуклеиновым кислотам или донорным последовательностям. Такое присоединение (т.е. физическое связывание) может быть достигнуто посредством ковалентных взаимодействий или нековалентных взаимодействий, и присоединение может быть прямым (например, посредством прямого слияния или химической конъюгации, что может быть достигнуто путем модификации остатков цистеина или лизина в белке или интеиновой модификации), или может быть достигнуто с помощью одного или более промежуточных линкеров или адаптерных молекул, таких как стрептавидин или аптамеры. См., например, источники Pierce et al. (2005) Mini Rev. Med. Chem. 5(1):41-55; Duckworth et al. (2007) Angew. Chem. Int. Ed Engl. 46(46):8819-8822; Schaeffer and Dixon (2009) Australian J. Chem. 62(10): 1328-1332; Goodman et al. (2009) Chembiochem. 10(9):1551-1557; и Khatwani et al. (2012) Bioorg. Med. Chem. 20(14):4532-4539, каждый из которых включен в настоящий документ посредством ссылки в полном объеме для всех целей. Нековалентные стратегии синтеза конъюгатов белок-нуклеиновая кислота включают биотин-стрептавидиновые и никель-гистидиновые методы. Ковалентные конъюгаты белок-нуклеиновая кислота могут быть синтезированы путем соединения соответствующим образом функционализированных нуклеиновых кислот и белков с использованием широкого спектра химических процессов. Некоторые из этих химических процессов включают прямое присоединение олигонуклеотида к аминокислотному остатку на поверхности белка (например, амину лизина или тиолу цистеина), в то время как другие более сложные схемы требуют посттрансляционной модификации белка или участия каталитического или реакционноспособного белкового домена. Способы ковалентного присоединения белков к нуклеиновым кислотам могут включать, например, химическое сшивание олигонуклеотидов с остатками лизина или цистеина белка, лигирование экспрессированного белка, химиоферментные методы и использование фотоаптамеров. Меченая нуклеиновая кислота или донорная последовательность может быть присоединена к С-концу, N-концу или к внутренней области в белке Cas. В качестве примера, меченая нуклеиновая кислота или донорная последовательность присоединена к С-концу или N-концу белка Cas. Аналогичным образом, белок Cas может быть привязан к 5'-концу, 3'-концу или к внутренней области внутри меченой нуклеиновой кислоты или донорной последовательности. То есть меченая нуклеиновая кислота или донорная последовательность может быть присоединена в любой ориентации и полярности. Например, белок Cas может быть присоединен к 5'-концу или 3'-концу меченой нуклеиновой кислоты или донорной последовательности.

[00236] Белки Cas могут быть представлены в любой форме. Например, белок Cas может быть представлен в форме белка, такого как белок Cas в комплексе с гРНК. В качестве альтернативы, белок Cas может быть представлен в форме нуклеиновой кислоты, кодирующей белок Cas, такой как РНК (например, матричная РНК (мРНК)) или ДНК. Необязательно, нуклеиновая кислота, кодирующая белок Cas, может быть кодон-оптимизирована для эффективной трансляции в белок в конкретной клетке или организме. Например, нуклеиновая кислота, кодирующая белок Cas, может быть модифицирована для замены кодонов, которые чаще используются в бактериальной клетке, дрожжевой клетке, клетке человека, клетке, отличной от клетки человека, клетке млекопитающего, клетке грызуна, клетке мыши, клетке крымы или любой другой представляющей интерес клетке-хозяине по сравнению со встречающейся в природе полинуклеотидной последовательностью. Когда нуклеиновую кислоту, кодирующую белок Cas, вводят в клетку, белок Cas может временно, условно или конститутивно экспрессироваться в клетке.

[00237] Белки Cas, представленные в виде мРНК, могут быть модифицированы для улучшения свойств стабильности и/или иммуногенности. Модификации могут быть внесены в один или более нуклеозидов в мРНК. Примеры химических модификаций азотистых оснований мРНК включают псевдоуридин, 1-метил-псевдоуридин и 5-метилцитидин. Например, может быть использована кэпированная и полиаденилированная мРНК Cas, содержащая N1-метилпсевдоуридин. Аналогичным образом, мРНК Cas могут быть модифицированы за счет обеднения уридином с использованием синонимичных кодонов.

[00238] Нуклеиновые кислоты, кодирующие белки Cas, могут быть стабильно интегрированы в геном клетки и функционально связаны с активным в клетке промотором. В качестве альтернативы, нуклеиновые кислоты, кодирующие белки Cas, могут быть функционально связаны с промотором в конструкции экспрессии. Конструкции экспрессии включают любые конструкции нуклеиновых кислот, способные регулировать экспрессию гена или другой представляющей интерес последовательности нуклеиновой кислоты (например, гена Cas), и которые могут переносить такую представляющую интерес последовательность нуклеиновой кислоты в целевую клетку. Например, нуклеиновая кислота, кодирующая белок Cas, может находиться в векторе, содержащем ДНК, кодирующую гРНК. В качестве альтернативы, она может находиться в векторе или плазмиде, отдельных от вектора, содержащего ДНК, кодирующую гРНК. Промоторы, которые могут быть использованы в конструкции экспрессии, включают промоторы, активные, например, в одной или более из эукариотической клетки, клетки человека, клетка, отличной от клетки человека, клетки млекопитающего, клетки отличного от человека млекопитающего, клетки грызуна, клетки мыши, клетки крысы, плюрипотентной клетки, эмбриональной стволовой (ЭС) клетки, взрослой стволовой клетки, ограниченной стадией развития клетки-предшественника, индуцированной плюрипотентной стволовой (иПС) клетки или находящегося на одноклеточной стадии эмбриона. Такие промоторы могут представлять собой, например, условные промоторы, индуцибельные промоторы, конститутивные промоторы или тканеспецифические промоторы. Необязательно, промотор может представлять собой двунаправленный промотор, управляющий экспрессией как белка Cas в одном направлении, так и гидовой РНК в другом направлении. Такие двунаправленные промоторы могут состоять из (1) полного обычного однонаправленного промотора Pol III, который содержит 3 внешних контрольных элемента: дистальный промоторный элемент (DSE), проксимальный промоторный элемент (PSE) и ТАТА-бокс; и (2) второго базового промотора Pol III, включающего PSE и ТАТА-бокс, слитого с 5'-концом DSE в обратной ориентации. Например, в промоторе HI DSE прилегает к PSE и ТАТА-боксу, и промотор можно сделать двунаправленным путем создания гибридного промотора, в котором транскрипция в обратном направлении контролируется путем добавления PSE и ТАТА-бокса, происходящих из промотора U6. См., например, публикацию US 2016/0074535, включенную в настоящий документ посредством ссылки в полном объеме для всех целей. Применение двунаправленного промотора для одновременной экспрессии генов, кодирующих белок Cas и гидовую РНК, позволяет создавать компактные кассеты экспрессии для облегчения доставки.

[00239] Для управления экспрессией Cas или Cas9 можно использовать разные промоторы. В некоторых способах используются небольшие промоторы, чтобы кодирующую последовательность Cas или Cas9 можно было поместить в конструкцию AAV. Например, Cas или Cas9 и одна или более гРНК (например, 1 гРНК, или 2 гРНК, или 3 гРНК, или 4 гРНК) могут быть доставлены с помощью LNP-опосредованной доставки (например, в форме РНК) или опосредованной аденоассоциированным вирусом (AAV) доставки (например; AAV2-опосредованной доставки, AAV5-опосредованной доставки, AAV8-опосредованной доставки или AAV7m8-опосредованной доставки). Например, нуклеазный агент может представлять собой CRISPR/Cas9, и мРНК Cas9 и гРНК, нацеленная на эндогенный локус RS1 (например, интрон 1 RS1), могут быть доставлены с помощью LNP-опосредованной доставки, или ДНК, кодирующая Cas9, и ДНК, кодирующая гРНК, нацеленную на эндогенный локус RS1 (например, интрон 1 RS1), могут быть доставлены с помощью AAV-опосредованной доставки. Cas или Cas9 и одна или более гРНК могут быть доставлены в одном AAV или с помощью двух отдельных AAV. Например, первый AAV может нести кассету экспрессии Cas или Cas9, а второй AAV может нести кассету экспрессии гРНК. Аналогичным образом, первый AAV может нести кассету экспрессии Cas или Cas9, а второй AAV может нести две или более кассет экспрессии гРНК. В качестве альтернативы, один AAV может нести кассету экспрессии Cas или Cas9 (например, кодирующую последовательность Cas или Cas9, функционально связанную с промотором) и кассету экспрессии гРНК (например, кодирующую последовательность гРНК, функционально связанную с промотором). Аналогичным образом, один AAV может нести кассету экспрессии Cas или Cas9 (например, кодирующую последовательность Cas или Cas9, функционально связанную с промотором) и две или более кассет экспрессии гРНК (например, кодирующие последовательности гРНК, функционально связанные с промоторами). Для управления экспрессией нРНК могут быть использованы разные промоторы, такие как промотор U6 или малая тРНК Gln. Аналогичным образом, для управления экспрессией Cas9 могут быть использованы разные промоторы. Например, используют небольшие промоторы, чтобы кодирующую последовательность Cas9 можно было поместить в конструкцию AAV. Аналогичным образом, для максимизации упаковочной способности AAV используют небольшие белки Cas9 (например, SaCas9 или CjCas9).

[00240] Белки Cas, представленные в виде мРНК, могут быть модифицированы для улучшения свойств стабильности и/или иммуногенности. Модификации могут быть внесены в один или более нуклеозидов в мРНК. Примеры химических модификаций азотистых оснований мРНК включают псевдоуридин, 1-метил-псевдоуридин и 5-метилцитидин. мРНК, кодирующие белки Cas, также могут быть кэпированы. Кэп может представлять собой, например, структуру кэпа типа 1, в которой рибонуклеотид +1 метилирован в положении 2'О рибозы. Кэпирование может, например, давать превосходную активность in vivo (например, путем имитации естественного кэпа), может приводить к естественной структуре, которая снижает стимуляцию врожденной иммунной системы хозяина (например, может снижать активацию образ-распознающих рецепторов врожденной иммунной системы). мРНК, кодирующая белки Cas, также может быть полиаденилирована (с образованием поли(А)-хвоста). мРНК, кодирующая белки Cas, также может быть модифицирована для включения псевдоуридина (например, может быть полностью заменена псевдоуридином). В качестве другого примера, может быть использована кэпированная и полиаденилированная мРНК Cas, содержащая N1-метилпсевдоуридин. В качестве другого примера, может быть использована мРНК Cas, полностью замещенная псевдоуридином (т.е. все стандартные остатки урацила заменены псевдоуридином - изомером уридина, в котором урацил присоединен связью углерод-углерод, а не азот-углерод). Аналогичным образом, мРНК Cas могут быть модифицированы за счет обеднения уридином с использованием синонимичных кодонов. Например, может быть использована кэпированная и полиаденилированная мРНК Cas, полностью замещенная псевдоуридином.

[00241] мРНК Cas могут содержать модифицированный уридин по меньшей мере в одном, во множестве или во всех положениях уридина. Модифицированный уридин может представлять собой уридин, модифицированный в положении 5 (например, галогеном, метилом или этилом). Модифицированный уридин может представлять собой псевдоуридин, модифицированный в положении 1 (например, галогеном, метилом или этилом). Модифицированный уридин может представлять собой, например, псевдоуридин, N1-метилпсевдоуридин, 5-метоксиуридин, 5-иодоуридин или их комбинацию. В некоторых примерах модифицированный уридин представляет собой 5-метоксиуридин. В некоторых примерах модифицированный уридин представляет собой 5-иодоуридин. В некоторых примерах модифицированный уридин представляет собой псевдоуридин. В некоторых примерах модифицированный уридин представляет собой N1-метилпсевдоуридин. В некоторых примерах модифицированный уридин представляет собой комбинацию псевдоуридина и N1-метилпсевдоуридина. В некоторых примерах модифицированный уридин представляет собой комбинацию псевдоуридина и 5-метоксиуридина. В некоторых примерах модифицированный уридин представляет собой комбинацию N1-метилпсевдоуридина и 5-метоксиуридина. В некоторых примерах модифицированный уридин представляет собой комбинацию 5-иодоуридина и N1-метилпсевдоуридина. В некоторых примерах модифицированный уридин представляет собой комбинацию псевдоуридина и 5-иодоуридина. В некоторых примерах модифицированный уридин представляет собой комбинацию 5-иодоуридина и 5-метоксиуридина.

[00242] Раскрытые в настоящем документе мРНК Cas также могут содержать 5'-кэп, такой как Сар0, Cap1 или Сар2. 5'-кэп обычно представляет собой 7-метилгуанин-рибонуклеотид (который может быть дополнительно модифицирован, например, в отношении ARCA), связанный через 5'-трифосфат с 5'-положением первого нуклеотида цепи мРНК в направлении 5'-к-3' (т.е. первый кэп-проксимальный нуклеотид). В Сар0 рибозы первого и второго кэп-проксимальных нуклеотидов мРНК обе содержат 2'-гидроксил. В Cap1 рибозы первого и второго транскрибируемых нуклеотидов мРНК содержат 2'-метокси и 2'-гидроксил соответственно. В Сар2 рибозы первого и второго кэп-проксимальных нуклеотидов мРНК обе содержат 2'-метокси. См., например, источники Katibah et al. (2014) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 111(33): 12025-30 и Abbas et al. (2017) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 114(11):E2106-E2115. каждый из которых включен в настоящий документ посредством ссылки в полном объеме для всех целей. Большинство эндогенных мРНК высших эукариот, включая мРНК млекопитающих, такие как мРНК человека, содержат Cap1 или Сар2. Сар0 и другие структуры кэпа, отличные от Cap1 и Сар2, могут быть иммуногенными у млекопитающих, таких как люди, из-за распознавания как чужеродного компонентами врожденной иммунной системы, такими как IFIT-1 и IFIT-5, что может привести к повышению уровней цитокинов, включая интерферон I типа. Компоненты врожденной иммунной системы, такие как IFIT-1 и IFIT-5, могут также конкурировать с eIF4E за связывание мРНК с кэпом, отличным от Cap1 или Сар2, потенциально ингибируя трансляцию мРНК.

[00243] Кэп может быть включен котранскрипционно. Например, ARCA (антиреверсивный аналог кэпа; Thermo Fisher Scientific кат. № АМ8045) представляет собой аналог кэпа, содержащий 7-метилгуанин-3'-метокси-5'-трифосфат, связанный с 5'-положением гуанинового рибонуклеотида., который может быть включен in vitro в транскрипт при инициации. ARCA приводит к кэпу Сар0, в котором 2'-положение первого кэп-проксимального нуклеотида представляет собой гидроксил. См., например, источник Stepinski et al. (2001) RNA 7:1486-1495, включенный в настоящий документ посредством ссылки в полном объеме для всех целей.

[00244] CleanCap™ AG (m7G(5 ')ppp(5')(2'OMeA)pG; TriLink Biotechnologies Cat. No. N-7113) или CleanCap™ GG (m7G(5')ppp(5')(2'OMeG)pG; TriLink Biotechnologies Cat. No. N-7133) могут быть использованы для котранскрипционного обеспечения структуры Capl. 3'-O-метилированные версии CleanCap™ AG и CleanCap™ GG также доступны от TriLink Biotechnologies как кат. № N-7413 и N-7433, соответственно.

[00245] В качестве альтернативы, кэп может быть добавлен к РНК посттранскрипционно. Например, коммерчески доступен кэпирующий фермент Vaccinia (New England Biolabs кат. № M2080S), который обладает РНК-трифосфатазной и гуанилилтрансферазной активностью, обеспечиваемой его субъединицей D1, и гуанинметилтрансферазной активностью, обеспечиваемой его субъединицей D12. Таким образом, он может добавлять 7-метилгуанин к РНК, обеспечивая Сар0, в присутствии S-аденозилметионина и GTP. См., например, источники Guo and Moss (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87:4023-4027 и Мао and Shuman (1994) J. Biol. Chem. 269:24472-24479, каждый из которых включен в настоящий документ посредством ссылки в полном объеме для всех целей.

[00246] мРНК Cas могут дополнительно содержать полиаденилированный (поли-А или поли(А) или полиаденильный) хвост. Поли-А-хвост может, например, содержать по меньшей мере 20, по меньшей мере 30, по меньшей мере 40, по меньшей мере 50, по меньшей мере 60, по меньшей мере 70, по меньшей мере 80, по меньшей мере 90 или по меньшей мере 100 аденинов, и необязательно до 300 аденинов. Например, поли-А-хвост может содержать 95, 96, 97, 98, 99 или 100 адениновых нуклеотидов.

2. Гидовые РНК

[00247] «Гидовая РНК» или «гРНК» представляет собой молекулу РНК, которая связывается с белком Cas (например, с белком Cas9) и нацеливает белок Cas на определенное местоположение в ДНК-мишени. Гидовые РНК могут включать два сегмента: «ДНК-нацеливающий сегмент» (также называемый «гидовой последовательностью») и «белок-связывающий сегмент». «Сегмент» включает часть или область молекулы, такую как непрерывный участок нуклеотидов в РНК. Некоторые гРНК, например, гРНК для Cas9, могут содержать две отдельные молекулы РНК: «активирующую РНК» (например, tracrPHК) и «нацеливающую РНК» (например, CRISPR РНК или сrРНК). Другие гРНК представляют собой одинарную молекулу РНК (полинуклеотид одинарной РНК), которую также можно назвать «одномолекулярной гРНК», «одиночной гидовой РНК» или «sgPHК». См., например, публикации WO 2013/176772, WO 2014/065596, WO 2014/089290, WO 2014/093622, WO 2014/099750, WO 2013/142578 и WO 2014/131833, каждая из которых включен в настоящий документ посредством ссылки в полном объеме для всех целей. Гидовая РНК может относиться либо к РНК CRISPR (сrРНК), либо к комбинации сrРНК и транс-активирующей РНК CRISPR (tracrPHК). сrРНК и tracrPHК могут быть связаны в виде одной молекулы РНК (одиночная гидовая РНК или sgPHК) или присутствовать в виде двух отдельных молекул РНК (двойная гидовая РНК или dgPHК). Для Cas9, например, одиночная гидовая РНК может содержать сrРНК, слитую с tracrPHК (например, с помощью линкера). Для Cpf1, например, для достижения связывания и/или расщепления последовательности-мишени необходима только сrРНК. Термины «гидовая РНК» и «гРНК» включают в себя как двухмолекулярные (т.е. модульные) гРНК, так и одномолекулярные гРНК. В некоторых способах и композициях, раскрытых в настоящем документе, гРНК представляет собой гРНК Cas9 S. pyogenes или ее эквивалент. В некоторых способах и композициях, раскрытых в настоящем документе, гРНК представляет собой гРНК Cas9 S. aureus или ее эквивалент.

[00248] Иллюстративная двухмолекулярная гРНК содержит сrРНК-подобную («CRISPR РНК», или «нацеливающую РНК», или «сrРНК», или «сrРНК-повтор») молекулу и соответствующую tracrPHК-подобную («транс-активирующая CRISPR РНК», или «активирующая РНК», или «tracrPHК») молекулу. сrРНК содержит как ДНК-нацеливающий сегмент (одноцепочечный) гРНК, так и участок нуклеотидов (т.е. хвост сrРНК), который формирует половину дуплекса дцРНК белок-связывающего сегмента гРНК. Пример хвоста сrРНК, расположенного по ходу транскрипции (с 3'-конца) от ДНК-нацеливающего сегмента, содержит, по существу состоит из или состоит из GUUUUAGAGCUAUGCU (SEQ ID NO: 29) или GUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG (SEQ ID NO: 52). Любой из описанных в настоящем документе ДНК-нацеливающих сегментов может быть присоединен к 5'-концу SEQ ID NO: 29 или 52 с образованием сrРНК.

[00249] Соответствующая tracrPHК (активирующая РНК) содержит участок нуклеотидов, который образует другую половину дуплекса дцРНК белок-связывающего сегмента гРНК. Участок нуклеотидов сrРНК комплементарен участку нуклеотидов tracrPHК и гибридизуется с ним с образованием дуплекса дцРНК белок-связывающего домена гРНК. Таким образом, можно сказать, что каждая сrРНК имеет соответствующую tracrPHК. Иллюстративные последовательности tracrPHК содержат, по существу состоят из или состоят из

AGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUU (SEQ ID NO: 30),

AAACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU (SEQ ID NO: 31) или

GUUGGAACCAUUCAAAACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC (SEQ ID NO: 32).

[00250] В системах, в которых необходимы как сrРНК, так и tracrPHК, сrРНК и соответствующая tracrPHК гибридизуются с образованием гРНК. В системах, в которых необходима только сrРНК, сrРНК может представлять собой гРНК. сrРНК дополнительно обеспечивает одноцепочечный ДНК-нацеливающий сегмент, который гибридизуется с комплементарной цепью ДНК-мишени. При использовании для модификации в клетке точная последовательность отдельно взятой молекулы сrРНК или tracrPHК может быть разработана таким образом, чтобы она была специфичной для видов, в которых будут использоваться данные молекулы РНК. См., например, источники Mali et al. (2013) Science 339(6121):823-826; Jineketal. (2012) Science 337(6096):816-821; Hwang et al. (2013) Nat. Biotechnol. 31(3):227-229; Jiang et al. (2013) Nat. Biotechnol. 31(3):233-239; и Cong et al. (2013) Science 339(6121): 819-823, каждый из которых включен в настоящий документ посредством ссылки в полном объеме для всех целей.

[00251] ДНК-нацеливающий сегмент (сrРНК) отдельно взятой гРНК содержит нуклеотидную последовательность, комплементарную последовательности на комплементарной цепи ДНК-мишени, как более подробно описано ниже. ДНК-нацеливающий сегмент гРНК взаимодействует с ДНК-мишенью сиквенс-специфичным образом посредством гибридизации (т.е. спаривания оснований). Как таковая, нуклеотидная последовательность ДНК-нацеливающего сегмента может варьировать и определяет местоположение в ДНК-мишени, с которым будут взаимодействовать гРНК и ДНК-мишень. ДНК-нацеливающий сегмент рассматриваемой гРНК может быть модифицирован путем гибридизации с любой желаемой последовательностью в ДНК-мишени. Встречающиеся в природе сrРНК различаются в зависимости от системы CRISPR/Cas и организма, но часто содержат нацеливающий сегмент длиной от 21 до 72 нуклеотидов, фланкированный двумя прямыми повторами (DR) длиной от 21 до 46 нуклеотидов (см., например, публикацию WO 2014/131833, включенную в настоящий документ посредством ссылки в полном объеме для всех целей). В случае S. pyogenes длина DR составляет 36 нуклеотидов, а длина нацеливающего сегмента составляет 30 нуклеотидов. Расположенный с 3'-конца DR комплементарен соответствующей tracrPHК и гибридизуется с ней, а она, в свою очередь, связывается с белком Cas.

[00252] ДНК-нацеливающий сегмент может иметь длину, например, по меньшей мере примерно 12, по меньшей мере примерно 15, по меньшей мере примерно 17, по меньшей мере примерно 18, по меньшей мере примерно 19, по меньшей мере примерно 20, по меньшей мере примерно 25, по меньшей мере примерно 30, по меньшей мере примерно 35 или по меньшей мере примерно 40 нуклеотидов. Такие ДНК-нацеливающие сегменты могут иметь длину, например, от примерно 12 до примерно 100, от примерно 12 до примерно 80, от примерно 12 до примерно 50, от примерно 12 до примерно 40, от примерно 12 до примерно 30, от примерно 12 до примерно 25 или от примерно 12 до примерно 20 нуклеотидов. Например, ДНК-нацеливающий сегмент может состоять из от примерно 15 до примерно 25 нуклеотидов (например, из от примерно 17 до примерно 20 нуклеотидов, или примерно 17, 18, 19 или 20 нуклеотидов). См., например, публикацию US 2016/0024523, включенную в настоящий документ посредством ссылки в полном объеме для всех целей. Для Cas9 из S. pyogenes типичный ДНК-нацеливающий сегмент имеет длину от 16 до 20 нуклеотидов или длину от 17 до 20 нуклеотидов. Для Cas9 из S. aureus типичный ДНК-нацеливающий сегмент имеет длину от 21 до 23 нуклеотидов. Для Cpf1 типичный ДНК-нацеливающий сегмент имеет длину по меньшей мере 16 нуклеотидов или длину по меньшей мере 18 нуклеотидов.

[00253] В качестве примера, ДНК-нацеливающий сегмент может иметь длину примерно 20 нуклеотидов. Однако для нацеливающего сегмента также можно использовать более короткие и более длинные последовательности (например, длиной 15-25 нуклеотидов, например, длиной 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или 25 нуклеотидов). Степень идентичности между ДНК-нацеливающим сегментом и соответствующей последовательностью-мишенью гидовой РНК (или степень комплементарности между ДНК-нацеливающим сегментом и другой цепью последовательности-мишени гидовой РНК) может составлять, например, примерно 75%, примерно 80%, примерно 85%, примерно 90%, примерно 95%, примерно 96%, примерно 97%, примерно 98%, примерно 99% или примерно 100%. ДНК-нацеливающий сегмент и соответствующая последовательность-мишень гидовой РНК могут содержать одно или более несовпадений. Например, ДНК-нацеливающий сегмент гидовой РНК и соответствующая последовательность-мишень гидовой РНК могут содержать 1-4, 1-3, 1-2, 1, 2, 3 или 4 несовпадения (например, если общая длина последовательности-мишени гидовой РНК составляет по меньшей мере 17, по меньшей мере 18, по меньшей мере 19 или по меньшей мере 20 или более нуклеотидов). Например, ДНК-нацеливающий сегмент гидовой РНК и соответствующая последовательность-мишень гидовой РНК могут содержать 1-4, 1-3, 1-2, 1, 2, 3 или 4 несовпадения, причем общая длина последовательности-мишени гидовой РНК составляет 20 нуклеотидов.

[00254] В качестве примера, гидовая РНК, нацеленная на ген RS1, может содержать ДНК-нацеливающий сегмент (т.е. гидовую последовательность), содержащий, по существу состоящий из или состоящий из последовательности (ДНК-нацеливающего сегмента), представленной в любой из SEQ ID NO: 3148-6241. В качестве альтернативы, гидовая РНК, нацеленная на ген RS1, может содержать ДНК-нацеливающий сегмент, содержащий, по существу состоящий из или состоящий из по меньшей мере 17, по меньшей мере 18, по меньшей мере 19 или по меньшей мере 20 смежных нуклеотидов последовательности (ДНК-нацеливающего сегмента), представленной в любой из SEQ ID NO: 3148-6241. В качестве альтернативы, гидовая РНК, нацеленная на ген RS1, может содержать ДНК-нацеливающий сегмент, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентичный последовательности (ДНК-нацеливающему сегменту), представленной в любой из SEQ ID NO: 3148-6241. В качестве альтернативы, гидовая РНК, нацеленная на ген RS1, может содержать ДНК-нацеливающий сегмент, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентичный последовательности (ДНК-нацеливающему сегменту), представленной в любой из SEQ ID NO: 3148-6241. В качестве альтернативы, гидовая РНК, нацеленная на ген RS1, может содержать ДНК-нацеливающий сегмент, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентичный по меньшей мере 17, по меньшей мере 18, по меньшей мере 19 или по меньшей мере 20 смежным нуклеотидам последовательности (ДНК-нацеливающего сегмента), представленной в любой из SEQ ID NO: 3148-6241. В качестве альтернативы, гидовая РНК, нацеленная на ген RS1, может содержать ДНК-нацеливающий сегмент, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентичный по меньшей мере 17, по меньшей мере 18, по меньшей мере 19 или по меньшей мере 20 смежным нуклеотидам последовательности (ДНК-нацеливающего сегмента), представленной в любой из SEQ ID NO: 3148-6241. В качестве альтернативы, гидовая РНК, нацеленная на ген RS1, может содержать ДНК-нацеливающий сегмент, содержащий, по существу состоящий из или состоящий из последовательности, которая отличается не более чем на 3, не более чем на 2 или не более чем на 1 нуклеотид от последовательности (ДНК-нацеливающего сегмента), представленной в любой из SEQ ID NO: 3148-6241. В качестве альтернативы, гидовая РНК, нацеленная на ген RS1, может содержать ДНК-нацеливающий сегмент, содержащий, по существу состоящий из или состоящий из последовательности, которая отличается не более чем на 3, не более чем на 2 или не более чем на 1 нуклеотид от по меньшей мере 17, по меньшей мере 18, по меньшей мере 19 или по меньшей мере 20 смежных нуклеотидов последовательности (ДНК-нацеливающего сегмента), представленной в любой из SEQ ID NO: 3148-6241. Примеры таких гидовых последовательностей приведены в таблицах 2 и 3.

[00255] Гидовая РНК может быть нацелена на ген RS1 человека. В качестве примера, гидовая РНК, нацеленная на ген RS1, может содержать ДНК-нацеливающий сегмент (т.е. гидовую последовательность), содержащий, по существу состоящий из или состоящий из последовательности (ДНК-нацеливающего сегмента), представленной в любой из SEQ ID NO: 3148-4989. В качестве альтернативы, гидовая РНК, нацеленная на ген RS1, может содержать ДНК-нацеливающий сегмент, содержащий, по существу состоящий из или состоящий из по меньшей мере 17, по меньшей мере 18, по меньшей мере 19 или по меньшей мере 20 смежных нуклеотидов последовательности (ДНК-нацеливающего сегмента), представленной в любой из SEQ ID NO: 3148-4989. В качестве альтернативы, гидовая РНК, нацеленная на ген RS1, может содержать ДНК-нацеливающий сегмент, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентичный последовательности (ДНК-нацеливающему сегменту), представленной в любой из SEQ ID NO: 3148-4989. В качестве альтернативы, гидовая РНК, нацеленная на ген RS1, может содержать ДНК-нацеливающий сегмент, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентичный последовательности (ДНК-нацеливающему сегменту), представленной в любой из SEQ ID NO: 3148-4989. В качестве альтернативы, гидовая РНК, нацеленная на ген RS1, может содержать ДНК-нацеливающий сегмент, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентичный по меньшей мере 17, по меньшей мере 18, по меньшей мере 19 или по меньшей мере 20 смежным нуклеотидам последовательности (ДНК-нацеливающего сегмента), представленной в любой из SEQ ID NO: 3148-4989. В качестве альтернативы, гидовая РНК, нацеленная на ген RS1, может содержать ДНК-нацеливающий сегмент, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентичный по меньшей мере 17, по меньшей мере 18, по меньшей мере 19 или по меньшей мере 20 смежным нуклеотидам последовательности (ДНК-нацеливающего сегмента), представленной в любой из SEQ ID NO: 3148-4989. В качестве альтернативы, гидовая РНК, нацеленная на ген RS1, может содержать ДНК-нацеливающий сегмент, содержащий, по существу состоящий из или состоящий из последовательности, которая отличается не более чем на 3, не более чем на 2 или не более чем на 1 нуклеотид от последовательности (ДНК-нацеливающего сегмента), представленной в любой из SEQ ID NO: 3148-4989. В качестве альтернативы, гидовая РНК, нацеленная на ген RS1, может содержать ДНК-нацеливающий сегмент, содержащий, по существу состоящий из или состоящий из последовательности, которая отличается не более чем на 3, не более чем на 2 или не более чем на 1 нуклеотид от по меньшей мере 17, по меньшей мере 18, по меньшей мере 19 или по меньшей мере 20 смежных нуклеотидов последовательности (ДНК-нацеливающего сегмента), представленной в любой из SEQ ID NO: 3148-4989.

[00256] Гидовая РНК может нацеливаться на ген RS1 человека и быть выбрана таким образом, чтобы избежать нецелевых эффектов. В качестве примера, гидовая РНК, нацеленная на ген RS1, может содержать ДНК-нацеливающий сегмент (т.е. гидовую последовательность), содержащий, по существу состоящий из или состоящий из последовательности (ДНК-нацеливающего сегмента), представленной в любой из SEQ ID NO: 3148-3151, 3154-3186, 3188-3247 и 3249-4351. В качестве альтернативы, гидовая РНК, нацеленная на ген RS1, может содержать ДНК-нацеливающий сегмент, содержащий, по существу состоящий из или состоящий из по меньшей мере 17, по меньшей мере 18, по меньшей мере 19 или по меньшей мере 20 смежных нуклеотидов последовательности (ДНК-нацеливающего сегмента), представленной в любой из SEQ ID NO: 3148-3151, 3154-3186, 3188-3247 и 3249-4351. В качестве альтернативы, гидовая РНК, нацеленная на ген RS1, может содержать ДНК-нацеливающий сегмент, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентичный последовательности (ДНК-нацеливающему сегменту), представленной в любой из SEQ ID NO: 3148-3151, 3154-3186, 3188-3247 и 3249-4351. В качестве альтернативы, гидовая РНК, нацеленная на ген RS1, может содержать ДНК-нацеливающий сегмент, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентичный последовательности (ДНК-нацеливающему сегменту), представленной в любой из SEQ ID NO: 3148-3151, 3154-3186, 3188-3247 и 3249-4351. В качестве альтернативы, гидовая РНК, нацеленная на ген RS1, может содержать ДНК-нацеливающий сегмент, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентичный по меньшей мере 17, по меньшей мере 18, по меньшей мере 19 или по меньшей мере 20 смежным нуклеотидам последовательности (ДНК-нацеливающего сегмента), представленной в любой из SEQ ID NO: 3148-3151, 3154-3186, 3188-3247 и 3249-4351. В качестве альтернативы, гидовая РНК, нацеленная на ген RS1, может содержать ДНК-нацеливающий сегмент, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентичный по меньшей мере 17, по меньшей мере 18, по меньшей мере 19 или по меньшей мере 20 смежным нуклеотидам последовательности (ДНК-нацеливающего сегмента), представленной в любой из SEQ ID NO: 3148-3151, 3154-3186, 3188-3247 и 3249-4351. В качестве альтернативы, гидовая РНК, нацеленная на ген RS1, может содержать ДНК-нацеливающий сегмент, содержащий, по существу состоящий из или состоящий из последовательности, которая отличается не более чем на 3, не более чем на 2 или не более чем на 1 нуклеотид от последовательности (ДНК-нацеливающего сегмента), представленной в любой из SEQ ID NO: 3148-3151, 3154-3186, 3188-3247 и 3249-4351. В качестве альтернативы, гидовая РНК, нацеленная на ген RS1, может содержать ДНК-нацеливающий сегмент, содержащий, по существу состоящий из или состоящий из последовательности, которая отличается не более чем на 3, не более чем на 2 или не более чем на 1 нуклеотид от по меньшей мере 17, по меньшей мере 18, по меньшей мере 19 или по меньшей мере 20 смежных нуклеотидов последовательности (ДНК-нацеливающего сегмента), представленной в любой из SEQ ID NO: 3148-3151, 3154-3186, 3188-3247 и 3249-4351.

[00257] Гидовая РНК может быть нацелена на ген RS1 человека. В качестве примера, гидовая РНК, нацеленная на ген RS1, может содержать ДНК-нацеливающий сегмент (т.е. гидовую последовательность), содержащий, по существу состоящий из или состоящий из последовательности (ДНК-нацеливающего сегмента), представленной в любой из SEQ ID NO: 3150, 3151, 3159, 3675, 4297 и 4304. В качестве альтернативы, гидовая РНК, нацеленная на ген RS1, может содержать ДНК-нацеливающий сегмент, содержащий, по существу состоящий из или состоящий из по меньшей мере 17, по меньшей мере 18, по меньшей мере 19 или по меньшей мере 20 смежных нуклеотидов последовательности (ДНК-нацеливающего сегмента), представленной в любой из SEQ ID NO: 3150, 3151, 3159, 3675, 4297 и 4304. В качестве альтернативы, гидовая РНК, нацеленная на ген RS1, может содержать ДНК-нацеливающий сегмент, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентичный последовательности (ДНК-нацеливающему сегменту), представленной в любой из SEQ ID NO: 3150, 3151, 3159, 3675, 4297 и 4304. В качестве альтернативы, гидовая РНК, нацеленная на ген RS1, может содержать ДНК-нацеливающий сегмент, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентичный последовательности (ДНК-нацеливающему сегменту), представленной в любой из SEQ ID NO: 3150, 3151, 3159, 3675, 4297 и 4304. В качестве альтернативы, гидовая РНК, нацеленная на ген RS1, может содержать ДНК-нацеливающий сегмент, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентичный по меньшей мере 17, по меньшей мере 18, по меньшей мере 19 или по меньшей мере 20 смежным нуклеотидам последовательности (ДНК-нацеливающего сегмента), представленной в любой из SEQ ID NO: 3150, 3151, 3159, 3675, 4297 и 4304. В качестве альтернативы, гидовая РНК, нацеленная на ген RS1, может содержать ДНК-нацеливающий сегмент, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентичный по меньшей мере 17, по меньшей мере 18, по меньшей мере 19 или по меньшей мере 20 смежным нуклеотидам последовательности (ДНК-нацеливающего сегмента), представленной в любой из SEQ ID NO: 3150, 3151, 3159, 3675, 4297 и 4304. В качестве альтернативы, гидовая РНК, нацеленная на ген RS1, может содержать ДНК-нацеливающий сегмент, содержащий, по существу состоящий из или состоящий из последовательности, которая отличается не более чем на 3, не более чем на 2 или не более чем на 1 нуклеотид от последовательности (ДНК-нацеливающего сегмента), представленной в любой из SEQ ID NO: 3150, 3151, 3159, 3675, 4297 и 4304. В качестве альтернативы, гидовая РНК, нацеленная на ген RS1, может содержать ДНК-нацеливающий сегмент, содержащий, по существу состоящий из или состоящий из последовательности, которая отличается не более чем на 3, не более чем на 2 или не более чем на 1 нуклеотид от по меньшей мере 17, по меньшей мере 18, по меньшей мере 19 или по меньшей мере 20 смежных нуклеотидов последовательности (ДНК-нацеливающего сегмента), представленной в любой из SEQ ID NO: 3150, 3151, 3159,3675, 4297 и 4304.

[00258] Гидовая РНК может быть нацелена на ген Rs1 мыши. В качестве примера, гидовая РНК, нацеленная на ген RS1, может содержать ДНК-нацеливающий сегмент (т.е. гидовую последовательность), содержащий, по существу состоящий из или состоящий из последовательности (ДНК-нацеливающего сегмента), представленной в любой из SEQ ID NO: 4990-6241 (например, SEQ ID NO: 5477 или 5981). В качестве альтернативы, гидовая РНК, нацеленная на ген RS1, может содержать ДНК-нацеливающий сегмент, содержащий, по существу состоящий из или состоящий из по меньшей мере 17, по меньшей мере 18, по меньшей мере 19 или по меньшей мере 20 смежных нуклеотидов последовательности (ДНК-нацеливающего сегмента), представленной в любой из SEQ ID NO: 4990-6241 (например, SEQ ID NO: 5477 или 5981). В качестве альтернативы, гидовая РНК, нацеленная на ген RS1, может содержать ДНК-нацеливающий сегмент, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентичный последовательности (ДНК-нацеливающему сегменту), представленной в любой из SEQ ID NO: 4990-6241 (например, SEQ ID NO: 5477 или 5981). В качестве альтернативы, гидовая РНК, нацеленная на ген RS1, может содержать ДНК-нацеливающий сегмент, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентичный последовательности (ДНК-нацеливающему сегменту), представленной в любой из SEQ ID NO: 4990-6241 (например, SEQ ID NO: 5477 или 5981). В качестве альтернативы, гидовая РНК, нацеленная на ген RS1, может содержать ДНК-нацеливающий сегмент, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентичный по меньшей мере 17, по меньшей мере 18, по меньшей мере 19 или по меньшей мере 20 смежным нуклеотидам последовательности (ДНК-нацеливающего сегмента), представленной в любой из SEQ ID NO: SEQ ID NO: 4990-6241 (например, SEQ ID NO: 5477 или 5981). В качестве альтернативы, гидовая РНК, нацеленная на ген RS1, может содержать ДНК-нацеливающий сегмент, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентичный по меньшей мере 17, по меньшей мере 18, по меньшей мере 19 или по меньшей мере 20 смежным нуклеотидам последовательности (ДНК-нацеливающего сегмента), представленной в любой из SEQ ID NO: SEQ ID NO: 4990-6241 (например, SEQ ID NO: 5477 или 5981). В качестве альтернативы, гидовая РНК, нацеленная на ген RS1, может содержать ДНК-нацеливающий сегмент, содержащий, по существу состоящий из или состоящий из последовательности, которая отличается не более чем на 3, не более чем на 2 или не более чем на 1 нуклеотид от последовательности (ДНК-нацеливающего сегмента), представленной в любой из SEQ ID NO: 4990-6241 (например, SEQ ID NO: 5477 или 5981). В качестве альтернативы, гидовая РНК, нацеленная на ген RS1, может содержать ДНК-нацеливающий сегмент, содержащий, по существу состоящий из или состоящий из последовательности, которая отличается не более чем на 3, не более чем на 2 или не более чем на 1 нуклеотид от по меньшей мере 17, по меньшей мере 18, по меньшей мере 19 или по меньшей мере 20 смежных нуклеотидов последовательности (ДНК-нацеливающего сегмента), представленной в любой из SEQ ID NO: SEQ ID NO: 4990-6241 (например, SEQ ID NO: 5477 или 5981).

[00259] TracrPHК могут быть в любой форме (например, полноразмерных tracrPHК или активных частичных tracrPHК) и различной длины. Они могут включать первичные транскрипты или процессированные формы. Например, tracrPHК (как часть одиночной гидовой РНК или как отдельная молекула, представляющая собой часть двухмолекулярной гРНК) могут содержать, по существу состоять из или состоять из всей или части последовательности tracrPHК дикого типа (например, из примерно или более чем примерно 20, 26, 32, 45, 48, 54, 63, 67, 85 или более нуклеотидов из последовательности tracrPHК дикого типа). Примеры последовательностей tracrPHК дикого типа из S. pyogenes включают 171-нуклеотидную, 89-нуклеотидную, 75-нуклеотидную и 65-нуклеотидную версии. См., например, источники Deltcheva et al. (2011) Nature 471(7340):602-607; WO 2014/093661, каждый из которых включен в настоящий документ посредством ссылки в полном объеме для всех целей. Примеры tracrPHК в одиночных гидовых РНК (sgPHК) включают сегменты tracrPHК, присутствующие в +48, +54, +67 и +85 версиях sgPHК, где «+n» означает, что в sgPHК включено вплоть до +n нуклеотидов из tracrPHК дикого типа. См. публикацию US 8697359, включенную в настоящий документ посредством ссылки в полном объеме для всех целей.

[00260] Процент комплементарности между ДНК-нацеливающим сегментом гидовой РНК и комплементарной цепью ДНК-мишени может составлять по меньшей мере 60% (например, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100%). Процент комплементарности между ДНК-нацеливающим сегментом и комплементарной цепью ДНК-мишени может составлять по меньшей мере 60% по примерно 20 смежным нуклеотидам. Например, процент комплементарности между ДНК-нацеливающим сегментом и комплементарной цепью ДНК-мишени может составлять 100% по 14 смежным нуклеотидам на 5'-конце комплементарной цепи ДНК-мишени и до 0% по оставшимся нуклеотидам. В таком случае можно считать, что ДНК-нацеливающий сегмент имеет длину 14 нуклеотидов. В качестве другого примера, процент комплементарности между ДНК-нацеливающим сегментом и комплементарной цепью ДНК-мишени может составлять 100% по семи смежным нуклеотидам на 5'-конце комплементарной цепи ДНК-мишени и до 0% по оставшимся нуклеотидам. В таком случае можно считать, что ДНК-нацеливающий сегмент имеет длину 7 нуклеотидов. В некоторых гидовых РНК по меньшей мере 17 нуклеотидов в ДНК-нацеливающем сегменте комплементарны комплементарной цепи ДНК-мишени. Например, ДНК-нацеливающий сегмент может иметь длину 20 нуклеотидов и может содержать 1, 2 или 3 несовпадения с комплементарной цепью ДНК-мишени. В качестве примера, несовпадения не прилегают к области комплементарной цепи, соответствующей последовательности мотива, прилегающего к протоспейсеру (РАМ) (т.е. обратному комплементу последовательности РАМ) (например, несовпадения находятся на 5'-конце ДНК-нацеливающего сегмента гидовой РНК, или несовпадения находятся по меньшей мере в 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 или 19 парах оснований от области комплементарной цепи, соответствующей последовательности РАМ).

[00261] Белок-связывающий сегмент гРНК может содержать два участка нуклеотидов, которые комплементарны друг другу. Комплементарные нуклеотиды белок-связывающего сегмента гибридизуются с образованием двухцепочечного РНК-дуплекса (дцРНК). Белок-связывающий сегмент рассматриваемой гРНК взаимодействует с белком Cas, и гРНК направляет связанный белок Cas к определенной нуклеотидной последовательности в ДНК-мишени посредством ДНК-нацеливающего сегмента.

[00262] Одиночные гидовые РНК могут содержать ДНК-нацеливающий сегмент и каркасную последовательность (т.е. белок-связывающую или Cas-связывающую последовательность гидовой РНК). Например, такие одиночные гидовые РНК могут иметь 5'-ДНК-нацеливающий сегмент, соединенный с 3'-каркасной последовательностью. Иллюстративные каркасные последовательности содержат, по существу состоят из или состоят из:

GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCU (версия 1; SEQ ID NO: 33);

GUUGGAACCAUUCAAAACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC (версия 2; SEQ ID NO: 34);

GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC (версия 3; SEQ ID NO: 35);

GUUUAAGAGCUAUGCUGGAAACAGCAUAGCAAGUUUAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC (версия 4; SEQ ID NO: 36);

GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUUU (версия 5; SEQ ID NO: 37);

GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU (версия 6; SEQ ID NO: 38);

GUUUAAGAGCUAUGCUGGAAACAGCAUAGCAAGUUUAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUU (версия 7; SEQ ID NO: 39);

или

GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGGUGC (версия 8; SEQ ID NO: 53). В некоторых гидовых sgPHК четыре концевых остатка U версии 6 отсутствуют. В некоторых sgPHК присутствуют только 1, 2 или 3 из четырех концевых остатков U версии 6.. Гидовые РНК, нацеленные на любую из описанных в настоящем документе последовательностей-мишеней гидовых РНК, могут включать, например, ДНК-нацеливающий сегмент на 5'-конце гидовой РНК, слитый с любой из иллюстративных каркасных последовательностей гидовой РНК на 3'-конце гидовой РНК. То есть, любой из раскрытых в настоящем документе ДНК-нацеливающих сегментов может быть присоединен к 5'-концу любой из указанных выше каркасных последовательностей с образованием одиночной гидовой РНК (химерной гидовой РНК).

[00263] Гидовые РНК могут включать модификации или последовательности, которые обеспечивают дополнительные желательные свойства (например, модифицированную или регулируемую стабильность; субклеточное нацеливание; отслеживание с помощью флуоресцентной метки; сайт связывания для белка или белкового комплекса и т.п.). То есть, гидовые РНК могут включать один или более модифицированных нуклеозидов или нуклеотидов, или один или более неприродных и/или встречающихся в природе компонентов или конфигураций, которые используются вместо или в дополнение к каноническим остаткам A, G, С и U. Примеры таких модификаций включают, например, 5'-кэп (например, 7-метилгуанилатный кэп (m7G)); 3'-полиаденилированный хвост (т.е. 3'-поли(А) хвост); последовательность рибопереключателя (например, для обеспечения регулируемой стабильности и/или регулируемой доступности для белков и/или белковых комплексов); последовательность контроля устойчивости; последовательность, которая образует дуплекс дцРНК (т.е. шпильку); модификацию или последовательность, которая нацеливает РНК на суб клеточную локализацию (например, ядро, митохондрии, хлоропласты и тому подобное); модификацию или последовательность, которая обеспечивает отслеживание (например, прямая конъюгация с флуоресцентной молекулой, конъюгация с фрагментом, который облегчает флуоресцентное детектирование, последовательность, которая позволяет проводить флуоресцентное детектирование и тому подобное); модификацию или последовательность, которая обеспечивает формирование сайта связывания для белков (например, белков, которые действуют на ДНК, включая транскрипционные активаторы, транскрипционные репрессоры, ДНК-метилтрансферазы, ДНК-деметилазы, гистоновые ацетилтрансферазы, гистоновые деацетилазы и тому подобное); и их комбинации. Другие примеры модификаций включают сконструированные дуплексные структуры «стебель-петля», сконструированные области петель, сконструированные шпильки на 3'-конце дуплексной структуры «стебель-петля» или любую их комбинацию. См., например, публикацию US 2015/0376586, включенную в настоящий документ посредством ссылки в полном объеме для всех целей. Петля может представлять собой область неспаренных нуклеотидов внутри дуплекса, состоящую из сrРНК-подобной области и минимальной tracrPHК-подобной области. Петля может содержать на одной стороне дуплекса неспаренный 5'-XXXY-3', где Х представляет собой любой пурин, a Y может представлять собой нуклеотид, который может формировать неоднозначную пару с нуклеотидом на противоположной цепи, и область неспаренных нуклеотидов на другой стороне дуплекса.

[00264] Немодифицированные нуклеиновые кислоты могут быть подвержены деградации. Экзогенные нуклеиновые кислоты могут также вызывать врожденный иммунный ответ. Модификации могут способствовать повышению стабильности и снижению иммуногенности. Гидовые РНК могут содержать модифицированные нуклеозиды и модифицированные нуклеотиды, включая, например, одно или более из следующего: (1) изменение или замена одного или обоих несвязывающих фосфатных атомов кислорода и/или одного или более связывающих фосфатных атомов кислорода в связи фосфодиэфирного остова (иллюстративная модицикация остова); (2) изменение или замена компонента сахара рибозы, такая как изменение или замена 2'-гидроксила в сахаре рибозы (иллюстративная модификация сахара); (3) замена (например, полная замена) фосфатного фрагмента дефосфорилированными линкерами (иллюстративная модицикация остова); (4) модификация или замена встречающегося в природе азотистого основания, включая неканоническое азотистое основание (иллюстративная модификация основания); (5) замена или модификация рибозо-фосфатного остова (иллюстративная модицикация остова); (6) модификация 3'-конца или 5'-конца олигонуклеотида (например, удаление, модификация или замена концевой фосфатной группы или конъюгация фрагмента, кэпа или линкера (такие модификации 3'- или 5'-кэпом могут включать модификацию сахара и/или остова)); и (7) модификация или замена сахара (иллюстративная модификация сахара). Другие возможные модификации гидовой РНК включают в себя модификации или замену урацилов или полиурациловых трактов. См., например, публикации WO 2015/048577 и US 2016/0237455, каждая из которых включена в настоящий документ посредством ссылки в полном объеме для всех целей. Похожие модификации могут быть внесены в нуклеиновые кислоты, кодирующие Cas, такие как мРНК Cas. Например, мРНК Cas могут быть модифицированы за счет обеднения уридином с использованием синонимичных кодонов.

[00265] Химические модификации, такие как перечисленные выше, можно комбинировать для получения модифицированных гРНК и/или мРНК, содержащих остатки (нуклеозиды и нуклеотиды), которые могут иметь две, три, четыре или более модификаций. Например, модифицированный остаток может содержать модифицированный сахар и модифицированное азотистое основание. В качестве примера, каждое основание гРНК модифицировано (например, все основания имеют модифицированную фосфатную группу, такую как тиофосфатная группа). Например, все или по существу все фосфатные группы гРНК могут быть заменены тиофосфатными группами. В качестве альтернативы или дополнительно, модифицированная гРНК может содержать по меньшей мере один модифицированный остаток на 5'-конце или вблизи него. В качестве альтернативы или дополнительно, модифицированная гРНК может содержать по меньшей мере один модифицированный остаток на 3'-конце или вблизи него.

[00266] Некоторые гРНК содержат один, два, три или более модифицированных остатков. Например, по меньшей мере 5%, по меньшей мере 10%, по меньшей мере 15%, по меньшей мере 20%, по меньшей мере 25%, по меньшей мере 30%, по меньшей мере 35%, по меньшей мере 40%, по меньшей мере 45%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 55%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95% или 100% положений в модифицированной гРНК могут представлять собой модифицированные нуклеозиды или нуклеотиды.

[00267] Немодифицированные нуклеиновые кислоты могут быть подвержены деградации. Экзогенные нуклеиновые кислоты могут также вызывать врожденный иммунный ответ. Модификации могут способствовать повышению стабильности и снижению иммуногенности. Некоторые гРНК, описанные в настоящем документе, могут содержать один или более модифицированных нуклеозидов или нуклеотидов для обеспечения стабильности по отношению к внутриклеточным или сывороточным нуклеазам. Некоторые модифицированные гРНК, описанные в настоящем документе, могут демонстрировать сниженный врожденный иммунный ответ при введении в популяцию клеток.

[00268] Раскрытые в настоящем документе гРНК могут содержать модификацию остова, при которой фосфатная группа модифицированного остатка может быть модифицирована путем замены одного или более атомов кислорода другим заместителем. Модификация может включать полную замену немодифицированного фосфатного фрагмента модифицированной фосфатной группой, как описано в настоящем документе. Модификации остова фосфатного остова могут также включать изменения, которые приводят либо к незаряженному линкеру, либо к заряженному линкеру с несимметричным распределением заряда.

[00269] Примеры модифицированных фосфатных групп включают тиофосфаты, фосфороселенаты, боранофосфаты, сложные эфиры боранофосфатов, гидрофосфонаты, амидофосфаты, алкил- или арилфосфонаты и фосфотриэфиры. Атом фосфора в немодифицированной фосфатной группе ахирален. Однако замена одного из немостиковых атомов кислорода одним из указанных выше атомов или групп атомов может сделать атом фосфора хиральным. Стереогенный атом фосфора может иметь либо R-конфигурацию (Rp), либо S-конфигурацию (Sp). Остов также может быть модифицирован путем замены мостикового атома кислорода (т.е. кислорода, который связывает фосфат с нуклеозидом) на азот (мостиковые амидофосфаты), серу (мостиковые тиофосфаты) и углерод (мостиковые метиленфосфонаты). Замена может иметь место либо на одном из связывающих атомов кислорода, либо на обоих связывающих атомах кислорода.

[00270] При определенных модификациях остова фосфатная группа может быть заменена не содержащими фосфора линкерами. В некоторых вариантах осуществления заряженная фосфатная группа может быть заменена нейтральным фрагментом. Примеры фрагментов, которые могут заменять фосфатную группу, могут включать, не ограничиваясь перечисленным, например, метилфосфонат, гидроксиламино, силоксан, карбонат, карбоксиметил, карбамат, амид, тиоэфир, этиленоксидный линкер, сульфонат, сульфонамид, тиоформацеталь, формацеталь, оксим, метиленимино, метиленметилимино, метиленгидразо, метилендиметилгидразо и метиленоксиметилимино.

[00271] Также могут быть сконструированы каркасы, которые могут имитировать нуклеиновые кислоты, в которых фосфатный линкер и сахар рибозы заменены устойчивыми к нуклеазам нуклеозидами или заменителями нуклеотидов. Такие модификации могут включать модификации остова и сахара. В некоторых вариантах осуществления азотистые основания могут быть связаны суррогатным остовом. Примеры могут включать, не ограничиваясь перечисленным, заменители нуклеозидов, представляющие собой морфолино, циклобутил, пирролидин и пептидную нуклеиновую кислоту (ПНК).

[00272] Модифицированные нуклеозиды и модифицированные нуклеотиды могут включать одну или более модификаций сахарной группы (модификацию сахара). Например, 2'-гидроксильная группа (ОН) может быть модифицирована (например, заменена рядом различных окси- или дезокси-заместителей. Модификации 2'-гидроксильной группы могут повысить стабильность нуклеиновой кислоты, поскольку гидроксил больше не может быть депротонирован с образованием 2'-алкоксид-иона.

[00273] Примеры модификаций 2'-гидроксильной группы могут включать алкокси или арилокси (OR, где «R» может представлять собой, например, алкил, циклоалкил, арил, арилалкил, гетероарил или сахар); полиэтиленгликоли (PEG), O(CH₂CH₂O)_nCH₂CH₂OR, где R может представлять собой, например, Н или необязательно замещенный алкил, и n может представлять собой целое число от 0 до 20 (например, от 0 до 4, от 0 до 8, от 0 до 10, от 0 до 16, от 1 до 4, от 1 до 8, от 1 до 10, от 1 до 16, от 1 до 20, от 2 до 4, от 2 до 8, от 2 до 10, от 2 до 16, от 2 до 20, от 4 до 8, от 4 до 10, от 4 до 16 и от 4 до 20). Модификация 2'-гидроксильной группы может представлять собой 2'-O-Ме. Аналогичным образом, модификация 2'-гидроксильной группы может представлять собой 2'-фтор-модификацию, при которой 2'-гидроксильная группа заменяется фторидом. Модификация 2'-гидроксильной группы может включать закрытые нуклеиновые кислоты (LNA), в которых 2'-гидроксил может быть соединен, например, с помощью C_1-6 алкиленового или C_1-6 гетероалкиленового мостика с 4'-углеродом того же сахара рибозы, где иллюстративные мостики могут включать метиленовые, пропиленовые, простые эфирные или аминные мостики; O-амино (где амино может представлять собой, например, NH₂, алкиламино, диалкиламино, гетероциклил, ариламино, диариламино, гетероариламино или дигетероариламино, этилендиамин или полиамино) и аминоалкокси, O(СН₂)_n-амино, (где амино может представлять собой, например, NH₂; алкиламино, диалкиламино, гетероциклил, ариламино, диариламино, гетероариламино или дигетероариламино, этилендиамин или полиамино). Модификация 2'-гидроксильной группы может включать разблокированные нуклеиновые кислоты (UNA), в которых в кольце рибозы отсутствует связь С2'-С3'. Модификация 2'-гидроксильной группы может включать метоксиэтильную группу (МОЕ) (OCH₂CH₂OCH₃, например, производное PEG).

[00274] Дезокси-2'-модификации могут включать водород (т.е. дезоксирибозные сахара, например, в выступающих частях частично дцРНК); галоген (например, бром, хлор, фтор или иод); амино (где амино может представлять собой, например, NH₂; алкиламино, диалкиламино, гетероциклил, ариламино, диариламино, гетероариламино, дигетероариламино или аминокислоту); NH(CH₂CH₂NH)_nCH₂CH₂-амино (где амино может представлять собой, например, такой, как описано в настоящем документе), -NHC(O)R (где R может представлять собой, например, алкил, циклоалкил, арил, арилалкил, гетероарил или сахар), циано; меркапто; алкилтиоалкил; тиоалкокси; и алкил, циклоалкил, арил, алкенил и алкинил, которые могут быть необязательно замещены, например, амино, как описано в настоящем документе.

[00275] Модификация сахара может включать сахарную группу, которая также может содержать один или более атомов углерода, обладающих стереохимической конфигурацией, противоположной конфигурации соответствующего атома углерода в рибозе. Таким образом, модифицированная нуклеиновая кислота может включать нуклеотиды, содержащие, например, арабинозу, в качестве сахара. Модифицированные нуклеиновые кислоты могут также включать абазические сахара. Эти абазические сахара также могут быть дополнительно модифицированы по одному или более составляющим атомам сахара. Модифицированные нуклеиновые кислоты могут также включать один или более сахаров в L-форме (например, L-нуклеозиды).

[00276] Описанные в настоящем документе модифицированные нуклеозиды и модифицированные нуклеотиды, которые могут быть включены в модифицированную нуклеиновую кислоту, могут включать модифицированное основание, также называемое азотистым основанием. Примеры азотистых оснований включают, не ограничиваясь перечисленным, аденин (А), гуанин (G), цитозин (С) и урацил (U). Эти азотистые основания могут быть модифицированы или полностью заменены для обеспечения модифицированных остатков, которые могут быть включены в модифицированные нуклеиновые кислоты. Азотистое основание нуклеотида может быть независимо выбрано из пурина, пиримидина, аналога пурина или аналога пиримидина. В некоторых вариантах осуществления азотистое основание может включать, например, встречающиеся в природе и синтетические производные основания.

[00277] В двойной гидовой РНК каждая из сrРНК и tracrPHК может содержать модификации. Такие модификации могут присутствовать на одном или обоих концах сrРНК и/или tracrPHК. В sgPHК один или более остатков на одном или обоих концах sgPHК могут быть химически модифицированы, и/или внутренние нуклеозиды могут быть модифицированы, и/или вся sgPHК может быть химически модифицирована. Некоторые гРНК содержат модификацию на 5'-конце. Некоторые гРНК содержат модификацию на 3'-конце.

[00278] Гидовые РНК, раскрытые в настоящем документе, могут включать один из паттернов модификации, раскрытых в публикации WO 2018/107028 А1, включенной в настоящий документ посредством ссылки в полном объеме для всех целей. Гидовые РНК, раскрытые в настоящем документе, также могут включать одну из структур/паттернов модификации, раскрытых в публикации US 2017/0114334, включенной в настоящий документ посредством ссылки в полном объеме для всех целей. Гидовые РНК, раскрытые в настоящем документе, также могут включать одну из структур/паттернов модификации, раскрытых в публикациях WO 2017/136794, WO 2017/004279, US 2018/0187186 или US 2019/0048338, каждая из которых включена в настоящий документ посредством ссылки в полном объеме для всех целей.

[00279] В качестве примера, нуклеотиды на 5'- или 3'-конце гидовой РНК могут включать тиофосфатные связи (например, основания могут иметь модифицированную фосфатную группу, представляющую собой тиофосфатную группу). Например, гидовая РНК может включать тиофосфатные связи между 2, 3 или 4 концевыми нуклеотидами на 5'- или 3'-конце гидовой РНК. В качестве другого примера, нуклеотиды на 5'- и/или 3'-конце гидовой РНК могут иметь 2'-О-метальные модификации. Например, гидовая РНК может включать 2'-O-метильные модификации в 1, 3 или 4 концевых нуклеотидах на 5'-и/или 3'-конце гидовой РНК (например, на 5'-конце). См., например, источники WO 2017/173054 А1 и Finn et al. (2018) Cell Rep.22(9):2227-2235, каждый из которых включен в настоящий документ посредством ссылки в полном объеме для всех целей. Другие возможные модификации более подробно описаны в других местах настоящего документа. В одном конкретном примере гидовая РНК включает 2'-O-метильные аналоги и 3'-тиофосфатные межнуклеотидные связи в первых трех 5'- и 3'-концевых остатках РНК. В другом конкретном примере гидовая РНК модифицирована таким образом, что все группы 2'ОН, которые не взаимодействуют с белком Cas9, заменены 2'-O-метильными аналогами, а хвостовая часть гидовой РНК, которая характеризуется минимальным взаимодействием с белком Cas9, модифицирована с помощью 5'- и 3'-тиофосфатных межнуклеотидных связей. Кроме того, ДНК-нацеливающий сегмент также имеет 2'-фтор-модификации при некоторых основаниях. См., например, источник Yin et al. (2017) Nat. Biotech. 35(12): 1179-1187, включенный в настоящий документ посредством ссылки в полном объеме для всех целей. Другие примеры модифицированных гидовых РНК приведены, например, в публикации WO 2018/107028 A1, включенной в настоящий документ посредством ссылки в полном объеме для всех целей. Такие химические модификации могут, например, придавать гидовым РНК большую стабильность и защиту от экзонуклеаз, позволяя им сохраняться в клетках дольше, чем немодифицированные гидовые РНК. Такие химические модификации могут также, например, защищать от врожденных внутриклеточных иммунных ответов, которые могут активно разрушать РНК или запускать иммунные каскады, ведущие к гибели клеток.

[00280] В качестве примера, любая из описанных в настоящем документе гидовых РНК может содержать по меньшей мере одну модификацию. В качестве примера, указанная по меньшей мере одна модификация включает 2'-O-метил (2'-O-Ме) модифицированный нуклеотид, тиофосфатную (PS) связь между нуклеотидами, 2'-фтор (2'-F) модифицированный нуклеотид или их комбинацию. Например, указанная по меньшей мере одна модификация может включать 2'-O-метил (2'-O-Ме) модифицированный нуклеотид. В качестве альтернативы или дополнительно, указанная по меньшей мере одна модификация может включать тиофосфатную (PS) связь между нуклеотидами. В качестве альтернативы или дополнительно, указанная по меньшей мере одна модификация может включать 2'-фтор (2'-F) модифицированный нуклеотид. В качестве примера, гидовая РНК, описанная в настоящем документе, содержит один или более 2'-O-метил (2'-O-Ме) модифицированных нуклеотидов и одну или более тиофосфатных (PS) связей между нуклеотидами.

[00281] Модификации могут содержаться в любом месте гидовой РНК. В качестве примера, гидовая РНК содержит модификацию одного или более из первых пяти нуклеотидов на 5'-конце гидовой РНК, гидовая РНК содержит модификацию одного или более из последних пяти нуклеотидов на 3'-конце гидовой РНК, или их комбинацию. Например, гидовая РНК может содержать тиофосфатные связи между первыми четырьмя нуклеотидами гидовой РНК, тиофосфатные связи между последними четырьмя нуклеотидами гидовой РНК или их комбинацию. В качестве альтернативы или дополнительно, гидовая РНК может содержать 2'-O-Ме модифицированные нуклеотиды в положениях первых трех нуклеотидов на 5'-конце гидовой РНК, может содержать 2'-O-Ме модифицированные нуклеотиды в положениях последних трех нуклеотидов на 3'-конце гидовой РНК или их комбинацию.

[00282] В качестве примера, модифицированная гРНК может содержать следующую последовательность:

mN*mN*mN*NNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU (SEQ ID NO: 44), где «N» может представлять собой любой природный или неприродный нуклеотид, и где совокупность остатков N составляет RS1 ДНК-нацеливающий сегмент, как описано в настоящем документе (например, последовательность, представленная в SEQ ID NO: 44, где остатки N заменены ДНК-нацеливающим сегментом согласно любой из SEQ ID NO: 3148-6241, или любой из SEQ ID NO: 3148-4989, или любой из SEQ ID NO: 3148-3151, 3154-3186, 3188-3247 и 3249-4351, или любой из SEQ ID NO: 3150, 3151, 3159, 3675, 4297 и 4304, или любой из SEQ ID NO: 4990-6241 (например, 5477 или 5981). Термины «mA», «mC», «mU» и «mG» обозначают нуклеотид (А, С, U и G соответственно), который был модифицирован группой 2'-O-Ме. Символ «*» обозначает тиофосфатную модификацию. Тиофосфатная связь относится к связи, в которой сера замещена одним немостиковым фосфатным кислородом в фосфодиэфирной связи, например, в связях между нуклеотидными основаниями. Когда тиофосфаты используются для получения олигонуклеотидов, модифицированные олигонуклеотиды также могут называться S-олиго нуклеотидами. Термины А*, С*, U* или G* обозначают нуклеотид, который связан со следующим (например, 3') нуклеотидом тиофосфатной связью. Термины «mA*», «mC*», «mU*» и «mG*» обозначают нуклеотид (А, С, U и G соответственно), который был замещен посредством 2'-O-Ме и который связан со следующим (например, 3') нуклеотидом тиофосфатной связью.

[00283] Еще одной химической модификацией, которая, как было показано, влияет на нуклеотидные сахарные кольца, является замещение галогеном. Например, замещение 2'-фтором (2'-F) в нуклеотидных сахарных кольцах может повысить аффинность связывания олигонуклеотидов и стабильность к действию нуклеаз. Абазические нуклеотиды относятся к нуклеотидам, в которых отсутствуют азотистые основания. Инвертированные основания относятся к основаниям со связями, которые инвертированы относительно нормальной связи от 5' к 3' (т.е. либо связи от 5' к 5', либо связи от 3' к 3').

[00284] Абазический нуклеотид может быть присоединен с помощью инвертированной связи. Например, абазический нуклеотид может быть присоединен к концевому 5'-нуклеотиду связью 5'-5', или абазический нуклеотид может быть присоединен к концевому 3'-нуклеотиду связью 3'-3'. Инвертированный абазический нуклеотид либо при 5'-, либо при 3'-концевом нуклеотиде также можно назвать инвертированным абазическим концевым кэпом.

[00285] В качестве примера, модифицированы один или более из первых трех, четырех или пяти нуклеотидов на 5'-конце и один или более из последних трех, четырех или пяти нуклеотидов на 3'-конце. Модификация может представлять собой, например, 2'-O-Ме, 2'-F, инвертированный абазический нуклеотид, тиофосфатную связь или другую модификацию нуклеотида, которая, как известно, повышает стабильность и/или характеристики.

[00286] В другом примере первые четыре нуклеотида на 5'-конце и последние четыре нуклеотида на 3'-конце могут быть связаны тиофосфатными связями.

[00287] В другом примере первые три нуклеотида на 5'-конце и последние три нуклеотида на 3'-конце могут содержать 2'-O-метил (2'-O-Ме) модифицированный нуклеотид. В другом примере первые три нуклеотида на 5'-конце и последние три нуклеотида на 3'-конце могут содержать 2'-фтор (2'-F) модифицированный нуклеотид. В другом примере первые три нуклеотида на 5'-конце и последние три нуклеотида на 3'-конце содержат инвертированный абазический нуклеотид.

[00288] Гидовые РНК могут быть представлены в любой форме. Например, гРНК может быть представлена в форме РНК, либо в виде двух молекул (отдельные сrРНК и tracrPHК), либо в виде одной молекулы (sgPHК), и, необязательно, в форме комплекса с белком Cas. гРНК также может быть предоставлена в форме ДНК, кодирующей гРНК. ДНК, кодирующая гРНК, может кодировать одну молекулу РНК (sgPHК) или отдельные молекулы РНК (например, отдельные сrРНК и tracrPHК). В последнем случае ДНК, кодирующая гРНК, может быть представлена в виде одной молекулы ДНК или в виде отдельных молекул ДНК, кодирующих сrРНК и tracrPHК, соответственно.

[00289] Когда гРНК представлена в форме ДНК, гРНК может временно, условно или конститутивно экспрессироваться в клетке. ДНК, кодирующие гРНК, могут быть стабильно интегрированы в геном клетки и функционально связаны с активным в клетке промотором. В качестве альтернативы, ДНК, кодирующие гРНК, могут быть функционально связаны с промотором в конструкции экспрессии. Например, ДНК, кодирующая гРНК, может находиться в векторе, содержащем гетерологичную нуклеиновую кислоту, такую как нуклеиновая кислота, кодирующая белок Cas. В качестве альтернативы, она может находиться в векторе или плазмиде, отдельной от вектора, содержащего нуклеиновую кислоту, кодирующую белок Cas. Промоторы, которые могут быть использованы в таких конструкциях экспрессии, включают промоторы, активные, например, в одной или более из эукариотической клетки, клетки человека, клетка, отличной от клетки человека, клетки млекопитающего, клетки отличного от человека млекопитающего, клетки грызуна, клетки мыши, клетки крысы, плюрипотентной клетки, эмбриональной стволовой (ЭС) клетки, взрослой стволовой клетки, ограниченной стадией развития клетки-предшественника, индуцированной плюрипотентной стволовой (иПС) клетки или находящегося на одноклеточной стадии эмбриона. Такие промоторы могут представлять собой, например, условные промоторы, индуцибельные промоторы, конститутивные промоторы или тканеспецифические промоторы. Такие промоторы также могут представлять собой, например, двунаправленные промоторы. Конкретные примеры подходящих промоторов включают промотор РНК-полимеразы III, такой как промотор U6 человека, промотор U6 полимеразы III крысы или промотор U6 полимеразы III мыши. В другом примере для управления экспрессией гидовой РНК может быть использована малая тРНК Gln.

[00290] В качестве альтернативы, гРНК могут быть получены различными другими способами. Например, гРНК могут быть получены путем транскрипции in vitro с использованием, например, РНК-полимеразы Т7 (см., например, публикации WO 2014/089290 и WO 2014/065596, каждая из которых включена в настоящий документ посредством ссылки в полном объеме для всех целей). Гидовые РНК также могут представлять собой синтетически полученные молекулы, полученные с помощью химического синтеза. Например, гидовая РНК может быть химически синтезирована таким образом, чтобы она содержала 2'-О-метальные аналоги и 3'-тиофосфатные межнуклеотидные связи в первых трех 5'- и 3'-концевых остатках РНК.

[00291] Гидовые РНК (или нуклеиновые кислоты, кодирующие гидовые РНК) могут находиться в композициях; содержащих одну или более гидовых РНК (например, 1, 2, 3, 4 или более гидовых РНК) и носитель, повышающий стабильность гидовой РНК (например, носитель, пролонгирующий период при заданных условиях хранения (например, -20°С, 4°С или температуре окружающей среды), в течение которого продукты разложения остаются ниже порогового значения, например, ниже 0,5 мас. % от исходной нуклеиновой кислоты или белка; или повышающий стабильность in vivo). Неограничивающие примеры таких носителей включают микросферы полимолочной кислоты (PLA), микросферы сополимера D,L-молочной и гликолевой кислот (PLGA), липосомы, мицеллы, обратные мицеллы, липидные кохлеаты и липидные микротрубочки. Такие композиции могут дополнительно содержать белок Cas, такой как белок Cas9, или нуклеиновую кислоту, кодирующую белок Cas.

3. Последовательности-мишени гидовой РНК

[00292] ДНК-мишени для гидовых РНК включают последовательности нуклеиновых кислот, присутствующие в ДНК, с которыми будет связываться ДНК-нацеливающий сегмент гРНК, при условии, что обеспечены достаточные условия для связывания. Подходящие условия для связывания ДНК/РНК включают в себя физиологические условия, обычно имеющие место в клетке. Другие подходящие условия для связывания ДНК/РНК (например, условия в бесклеточной системе) известны в данной области техники (см., например, источник Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Ed. (Sambrook et al., Harbor Laboratory Press 2001), включенный в настоящий документ посредством ссылки в полном объеме для всех целей). Цепь ДНК-мишени, которая комплементарна гРНК и гибридизуется с ней, может быть названа «комплементарной цепью», а цепь ДНК-мишени, которая комплементарна «комплементарной цепи» (и, следовательно, не комплементарна белку Cas или гРНК), может быть названа «некомплементарной цепью» или «матричной цепью».

[00293] ДНК-мишень содержит как последовательность на комплементарной цепи, с которой гибридизуется гидовая РНК, так и соответствующую последовательность на некомплементарной цепи (например, смежную с мотивом, прилегающим к протоспейсеру (РАМ)). Если не указано иное, термин «последовательность-мишень гидовой РНК» в контексте настоящего документа относится конкретно к последовательности на некомплементарной цепи (т.е. обратному комплементу), соответствующей последовательности, с которой гибридизуется гидовая РНК на комплементарной цепи. То есть, последовательность-мишень гидовой РНК относится к последовательности на некомплементарной цепи; смежной с РАМ (например, против хода транскрипции или на 5'-конце относительно РАМ в случае Cas9). Последовательность-мишень гидовой РНК эквивалентна ДНК-нацеливающему сегменту гидовой РНК, но с тиминами вместо урацилов. В качестве примера, последовательность-мишень гидовой РНК применительно к ферменту SpCas9 может относиться к последовательности, расположенной против хода транскрипции от 5'-NGG-3' РАМ на некомплементарной цепи. Гидовая РНК разработана таким образом, чтобы быть комплементарной к комплементарной цепи ДНК-мишени, при этом гибридизация между ДНК-нацеливающим сегментом гидовой РНК и комплементарной цепью ДНК-мишени способствует образованию комплекса CRISPR. Полная комплементарность не обязательно требуется при условии, что комплементарность является достаточной, чтобы вызвать гибридизацию и способствовать образованию комплекса CRISPR. Если гидовая РНК упоминается в настоящем документе как нацеленная на последовательность-мишень гидовой РНК, это означает, что гидовая РНК гибридизируется с последовательностью комплементарной цепи ДНК-мишени, которая представляет собой обратный комплемент последовательности-мишени гидовой РНК на некомплементарной цепи.

[00294] ДНК-мишень или последовательность-мишень гидовой РНК может содержать любой полинуклеотид и может располагаться, например, в ядре или цитоплазме клетки или в органелле клетки, такой как митохондрия или хлоропласт. ДНК-мишень или последовательность-мишень гидовой РНК может представлять собой любую последовательность нуклеиновой кислоты, эндогенную или экзогенную для клетки. Последовательность-мишень гидовой РНК может представлять собой последовательность, кодирующую продукт гена (например, белок), или некодирующую последовательность (например, регуляторную последовательность), или может содержать и то, и другое.

[00295] Сайт-специфическое связывание и расщепление ДНК-мишени белком Cas может происходить в местах, определяемых как (i) комплементарностью спаривания оснований между гидовой РНК и комплементарной цепью ДНК-мишени, так и (ii) коротким мотивом, называемым мотивом, прилегающим к протоспейсеру (РАМ), в некомплементарной цепи ДНК-мишени. РАМ может фланкировать последовательность-мишень гидовой РНК. Необязательно, последовательность-мишень гидовой РНК может быть фланкирована на 3'-конце протоспейсером РАМ (например, в случае Cas9). В качестве альтернативы, последовательность-мишень гидовой РНК может быть фланкирована на 5'-конце протоспейсером РАМ (например, в случае Cpf1). Например, сайт расщепления белков Cas может располагаться на расстоянии от примерно 1 до примерно 10 или от примерно 2 до примерно 5 пар оснований (например, 3 пар оснований) против хода транскрипции или по ходу транскрипции от последовательности РАМ (например, в пределах последовательности-мишени гидовой РНК). В случае SpCas9 последовательность РАМ (т.е. на некомплементарной цепи) может представлять собой 5'-N₁GG-3', где N₁ представляет собой любой нуклеотид ДНК, и где РАМ примыкает с 3'-конца к последовательности-мишени гидовой РНК на некомплементарной цепи ДНК-мишени. Таким образом, последовательность, соответствующая РАМ на комплементарной цепи (т.е., обратный комплемент) будет представлять собой 5'-CCN₂-3', где N₂ представляет собой любой нуклеотид ДНК и примыкает с 5'-конца к последовательности, с которой ДНК-нацеливающий сегмент гидовой РНК гибридизуется на комплементарной цепи ДНК-мишени. В некоторых таких случаях N₁ и N₂ могут быть комплементарными, и пара оснований N₁-N₂ может представлять собой любую пару оснований (например, N₁=C и N₂=G; N₁=G и N₂=C; N₁=A и N₂=T; или N₁=T и N₂=A). В случае Cas9 из S. aureus РАМ может представлять собой NNGRRT или NNGRR, где N может представлять собой A, G, С или Т, и R может представлять собой G или А. В случае Cas9 из С.jejuni РАМ может представлять собой, например, NNNNACAC или NNNNRYAC, где N может представлять собой А, G, С или Т, и R может представлять собой G или А. В некоторых случаях (например, в случае FnCpf1) последовательность РАМ может располагаться против хода транскрипции от 5'-конца и иметь последовательность 5'-TTN-3'.

[00296] Примером последовательности-мишени гидовой РНК является последовательность ДНК из 20 нуклеотидов, непосредственно предшествующая мотиву NGG, которая распознается белком SpCas9. Например, двумя примерами последовательностей-мишеней гидовой РНК плюс РАМ являются GN₁₉NGG (SEQ ID NO: 40) или N₂₀NGG (SEQ ID NO: 41). См., например, публикацию WO 2014/165825, включенную в настоящий документ посредством ссылки в полном объеме для всех целей. Гуанин на 5'-конце может способствовать транскрипции РНК-полимеразой в клетках. Другие примеры последовательностей-мишеней гидовой РНК плюс РАМ могут включать два гуаниновых нуклеотида на 5'-конце (например, GGN₂₀NGG; SEQ ID NO: 42) для способствования эффективной транскрипции полимеразой Т7 in vitro. См., например, публикацию WO 2014/065596, включенную в настоящий документ посредством ссылки в полном объеме для всех целей. Другие последовательности-мишени гидовой РНК плюс РАМ могут иметь длину от 4 до 22 нуклеотидов из последовательностей SEQ ID NO: 40-42, включая 5' G или GG и 3' GG или NGG. Другие последовательности-мишени гидовой РНК плюс РАМ могут иметь длину от 14 до 20 нуклеотидов из последовательности SEQ ID NO: 40-42.

[00297] Гидовые РНК, нацеленные на ген RS1, могут быть нацелены, например, на первый интрон гена RS1 или последовательность, примыкающую к первому интрону гена RS1 (например, в первом экзоне или втором экзоне гена-RS1).

[00298] Образование комплекса CRISPR, гибридизованного с ДНК-мишенью, может приводить к расщеплению одной или обеих цепей этой ДНК-мишени внутри или вблизи области, соответствующей последовательности-мишени гидовой РНК (т.е. последовательности-мишени гидовой РНК на некомплементарной цепи ДНК-мишени и обратному комплементу на комплементарной цепи, с которой гибридизуется гидовая РНК). Например, сайт расщепления может располагаться в последовательности-мишени гидовой РНК (например, в определенном месте относительно последовательности РАМ). «Сайт расщепления» включает положение в ДНК-мишени, в котором белок Cas вызывает одноцепочечный разрыв или двухцепочечный разрыв. Сайт расщепления может находиться только на одной цепи (например, когда используется никаза) или на обеих цепях двухцепочечной ДНК. Сайты расщепления могут находиться в одном и том же положении на обеих цепях (образуя тупые концы; например, Cas9)) или могут находиться в разных сайтах на каждой цепи (образуя ступенчатые концы (т.е. выступы); например, Cpf1). Ступенчатые концы могут быть образованы, например, при использовании двух белков Cas, каждый из которых вызывает одноцепочечный разрыв в другом сайте расщепления на другой цепи, тем самым создавая двухцепочечный разрыв. Например, первая никаза может создавать одноцепочечный разрыв в первой цепи двухцепочечной ДНК (дцДНК), а вторая никаза может создавать одноцепочечный разрыв во второй цепи дцДНК, и, таким образом, создаются последовательности с выступами. В некоторых случаях последовательность-мишень гидовой РНК или сайт расщепления никазой в первой цепи отделены от последовательности-мишени гидовой РНК или от сайта расщепления никазой во второй цепи по меньшей мере 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 75, 100, 250, 500 или 1000 парами оснований.

[00299] Гидовая РНК, нацеленная на ген RS1, например, ген RS1 человека, может быть нацелена на любое желаемое местоположение в гене RS1. Гидовые РНК, нацеленные на ген RS1, могут быть нацелены, например, на первый интрон гена RS1 или последовательность, примыкающую к первому интрону ген RS1 (например, в первом экзоне или втором экзоне гена RS1). Например, последовательность-мишень гидовой РНК может содержать любую непрерывную последовательность в гене RS1. Термин «ген RS1» включает геномную область, охватывающую регуляторные промоторы и энхансерные последовательности RS1, а также кодирующую последовательность. Последовательность-мишень гидовой РНК может содержать кодирующую последовательность, некодирующую последовательность (например, регуляторный элемент, такой как промоторная или энхансерная область) или их комбинацию. В качестве примера, последовательность-мишень гидовой РНК может содержать непрерывную кодирующую последовательность в любом из кодирующих экзонов RS1. В качестве примера, последовательность-мишень гидовой РНК может находиться в экзоне 1 гена RS1. В качестве другого примера, последовательность-мишень гидовой РНК может находиться в экзоне 2 гена RS1. В качестве другого примера, последовательность-мишень гидовой РНК может находиться в экзоне 3 гена RS1. В качестве другого примера, последовательность-мишень гидовой РНК может находиться в экзоне 4 гена RS1. В качестве другого примера, последовательность-мишень гидовой РНК может находиться в экзоне 5 гена RS1. В качестве другого примера, последовательность-мишень гидовой РНК может находиться в экзоне 6 ген RS1. Последовательность-мишень гидовой РНК также может содержать непрерывную последовательность в любом из интронов RS1. В качестве примера, последовательность-мишень гидовой РНК может находиться в интроне 1 гена RS1. В качестве другого примера, последовательность-мишень гидовой РНК может находиться в интроне 2 гена RS1. В качестве другого примера, последовательность-мишень гидовой РНК может находиться в интроне 3 гена RS1. В качестве другого примера, последовательность-мишень гидовой РНК может находиться в интроне 4 гена. RS1. В качестве другого примера, последовательность-мишень гидовой РНК может находиться в интроне 5 гена RS1. В качестве другого примера, последовательность-мишень гидовой РНК может находиться в интроне 6 гена rs1.

[00300] Последовательность-мишень гидовой РНК также может быть выбрана для минимизации нецелевых модификаций или предотвращения нецелевых эффектов (например, путем исключения двух или менее несовпадений с нецелевыми геномными последовательностями).

[00301] В качестве примера, гидовая РНК, нацеленная на ген RS1, может быть нацелена на последовательность-мишень гидовой РНК, представленную в любой из SEQ ID NO: 54-3147. В качестве другого примера, гидовая РНК, нацеленная на ген RS1, может быть нацелена на по меньшей мере 17, по меньшей мере 18, по меньшей мере 19 или по меньшей мере 20 смежных нуклеотидов последовательности-мишени гидовой РНК, представленной в любой из SEQ ID NO: 54-3147. Примеры таких последовательностей-мишеней гидовой РНК приведены в таблицах 2 и 3.

[00302] В качестве примера, гидовая РНК, нацеленная на ген RS1 человека, может быть нацелена на последовательность-мишень гидовой РНК, представленную в любой из SEQ ID NO: 54-1895. В качестве другого примера, гидовая РНК, нацеленная на ген RS1 человека, может быть нацелена на по меньшей мере 17, по меньшей мере 18, по меньшей мере 19 или по меньшей мере 20 смежных нуклеотидов последовательности-мишени гидовой РНК, представленной в любой из SEQ ID NO: 54-1895.

[00303] В качестве примера, гидовая РНК, нацеленная на ген RS1 человека, может быть нацелена на последовательность-мишень гидовой РНК, представленную в любой из SEQ ID NO: 54-57, 60-92, 94-153 и 155-1257. В качестве другого примера, гидовая РНК, нацеленная на ген RS1 человека, может быть нацелена на по меньшей мере 17, по меньшей мере 18, по меньшей мере 19 или по меньшей мере 20 смежных нуклеотидов последовательности-мишени гидовой РНК, представленной в любой из SEQ ID NO: 54-57, 60-92, 94-153 и 155-1257.

[00304] В качестве примера, гидовая РНК, нацеленная на ген RS1 человека, может быть нацелена на последовательность-мишень гидовой РНК, представленную в любой из SEQ ID NO: 56, 57, 65, 581, 1203 и 1210. В качестве другого примера, гидовая РНК, нацеленная на ген RS1 человека, может быть нацелена на по меньшей мере 17, по меньшей мере 18, по меньшей мере 19 или по меньшей мере 20 смежных нуклеотидов последовательности-мишени гидовой РНК, представленной в любой из SEQ ID NO: 56, 57, 65, 581, 1203 и 1210.

[00305] В качестве примера, гидовая РНК, нацеленная на ген Rs1 мыши, может быть нацелена на последовательность-мишень гидовой РНК, представленную в любой из SEQ ID NO: 1896-3147 (например, SEQ ID NO: 2383 или 2887). В качестве другого примера, гидовая РНК, нацеленная на ген Rs1 мыши, может быть нацелена на по меньшей мере 17, по меньшей мере 18, по меньшей мере 19 или по меньшей мере 20 смежных нуклеотидов последовательности-мишени гидовой РНК, представленной в любой из SEQ ID NO: 1896-3147 (например, SEQ ID NO: 2383 или 2887).

[00306]

[00307]

В. Другие нуклеазные агенты и последовательности-мишени для нуклеазных агентов

[00308] В способах и композициях, описанных в настоящем документе, может быть использован любой нуклеазный агент, который вызывает ник или двухцепочечный разрыв в желаемой последовательности-мишени. Может быть использован встречающийся в природе или нативный нуклеазный агент, при условии, что нуклеазный агент вызывает ник или двухцепочечный разрыв в желаемой последовательности-мишени. В качестве альтернативы, может быть использован модифицированный или сконструированный нуклеазный агент. «Сконструированный нуклеазный агент» включает нуклеазу, которая сконструирована (модифицирована или получена) из ее нативной формы таким образом, чтобы она могла специфически распознавать желаемую последовательность-мишень и вызывать в ней ник или двухцепочечный разрыв. Таким образом, сконструированный нуклеазный агент может быть получен из нативного нуклеазного агента, встречаюегося в природе, или он может быть создан или синтезирован искусственно. Сконструированная нуклеаза может вызывать ник или двухцепочечный разрыв в последовательности-мишени, например, когда последовательность-мишень не является последовательностью, которая была бы распознана нативным (несконструированным или немодифицированным) нуклеазным агентом. Модификация нуклеазного агента может представлять собой изменение всего одной аминокислоты в белке расщепляющего агента или одного нуклеотида в нуклеиновой кислоте расщепляющего агента. Создание ника или двухцепочечного разрыва в последовательности-мишени или другой ДНК может называться в настоящем документе «разрезанием» или «расщеплением» последовательности-мишени или другой ДНК.

[00309] Также предложены активные варианты и фрагменты приведенных в качестве примеров последовательностей-мишеней. Такие активные варианты могут обладать по меньшей мере 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или большей идентичностью последовательности с рассматриваемой последовательностью-мишенью, при этом активные варианты сохраняют биологическую активность и, следовательно, способны распознаваться и расщепляться нуклеазным агентом сиквенс-специфичным образом. Анализы для измерения двухцепочечного разрыва последовательности-мишени нуклеазным агентом хорошо известны. См., например, источник Frendewey et al. (2010) Methods in Enzymology 476:295-307, включенный в настоящий документ посредством ссылки в полном объеме для всех целей.

[00310] Последовательность-мишень нуклеазного агента может быть расположена в любом месте в целевом локусе или рядом с ним. Последовательность-мишень может быть расположена в кодирующей области гена или в регуляторных областях, которые влияют на экспрессию гена. Последовательность-мишень нуклеазного агента может быть расположена в интроне, экзоне, промоторе, энхансере, регуляторной области или любой небелковой кодирующей области.

[00311] Одним из типов нуклеазных агентов является эффекторная нуклеаза, подобная активатору транскрипции (TALEN). Эффекторные нуклеазы TAL представляют собой класс сиквенс-специфичных нуклеаз, которые могут быть использованы для создания двухцепочечных разрывов в определенных последовательностях-мишенях в геноме прокариотического или эукариотического организма. Эффекторные нуклеазы TAL создают путем слияния природного или сконструированного эффектора, подобного активатору транскрипции (TAL), или его функциональной части, с каталитическим доменом эндонуклеазы, такой как, например, FokI. Уникальный модульный эффекторный ДНК-связывающий домен TAL позволяет разрабатывать белки, которые потенциально могут обладать специфичностью распознавания любой отдельно взятой ДНК. Таким образом, ДНК-связывающие домены эффекторных нуклеаз TAL могут быть сконструированы для распознавания специфических сайтов-мишеней ДНК и, таким образом, использованы для создания двухцепочечных разрывов в желаемых последовательностях-мишенях. См. источники WO 2010/079430; Morbitzer et al. (2010) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107(50):21617-21622; Scholze & Boch (2010) Virulence 1:428-432; Christian et al. Genetics (2010) 186:757-761; Li et al. (2010) Nucleic Acids Res. (2010) doi:10.1093/nar/gkq704; и Miller et al. (2011) Nat. Biotechnol. 29:143-148, каждый из которых включен в настоящий документ посредством ссылки в полном объеме для всех целей.

[00312] Примеры подходящих нуклеаз TAL и способы получения подходящих нуклеаз TAL раскрыты, например, в публикациях US 2011/0239315 A1, US 2011/0269234 A1, US 2011/0145940 A1, US 2003/0232410 A1, US 2005/0208489 A1, US 2005/0026157 A1, US 2005/0064474 A1, US 2006/0188987 A1 и US 2006/0063231 A1, каждая из которых включена в настоящий документ посредством ссылки в полном объеме для всех целей. В различных вариантах осуществления эффекторные нуклеазы TAL сконструированы таким образом, что они создают разрез в последовательности нуклеиновой кислоты-мишени или рядом с ней, например, в представляющем интерес локусе или представляющем интерес геномном локусе, причем последовательность нуклеиновой кислоты-мишени находится в последовательности, подлежащей модификации с использованием нацеливающего вектора, или рядом с ней. Нуклеазы TAL, подходящие для использования с различными способами и композициями, предложенными в настоящем документе, включают специально разработанные для связывания с последовательностями нуклеиновых кислот-мишеней, подлежащих модификации нацеливающими векторами, как описано в настоящем документе, или рядом с ними.

[00313] В некоторых TALEN каждый мономер TALEN содержит 33-35 повторов TAL, которые распознают одну пару оснований посредством двух гипервариабельных остатков. В некоторых TALEN нуклеазный агент представляет собой химерный белок, содержащий ДНК-связывающий домен на основе TAL-повторов, функционально связанный с независимой нуклеазой, такой как эндонуклеаза FokI. Например, нуклеазный агент может содержать первый ДНК-связывающий домен на основе TAL-повторов и второй ДНК-связывающий домен на основе TAL-повторов, при этом каждый из первого и второго ДНК-связывающего домена на основе TAL-повторов функционально связан с нуклеазой FokI, при этом первый и второй ДНК-связывающий домен на основе TAL-повторов распознает две смежные последовательности ДНК-мишени в каждой цепи последовательности ДНК-мишени, разделенные спейсерной последовательностью различной длины (12-20 п.н.), и при этом субъединицы нуклеазы FokI димеризуются с образованием активной нуклеазы, которая создает двухцепочечный разрыв в последовательности-мишени.

[00314] Нуклеазный агент, используемый в различных раскрытых в настоящем документе способах и композициях, может дополнительно содержать нуклеазу с «цинковыми пальцами» (ZFN). В некоторых ZFN каждый мономер ZFN содержит 3 или более ДНК-связывающих домена с «цинковыми пальцами», при этом каждый ДНК-связывающий домен с «цинковыми пальцами» связывается с субсайтом размером 3 п. о. В других ZFN, ZFN представляет собой химерный белок, содержащий ДНК-связывающий домен с «цинковыми пальцами», функционально связанный с независимой нуклеазой, такой как эндонуклеаза Fokl. Например, нуклеазный агент может содержать первый ZFN и второй ZFN, при этом каждый из первого ZFN и второго ZFN функционально связан с субъединицей нуклеазы FokI, при этом первый и второй ZFN распознают две смежные последовательности ДНК-мишени в каждой цепи последовательности ДНК-мишени, разделенные спейсером около 5-7 п. о., и при этом субъединицы нуклеазы FokI димеризуются с образованием активной нуклеазы, которая делает двухцепочечный разрыв. См., например, источники US 20060246567; US 20080182332; US 20020081614; US 20030021776; WO/2002/057308A2; US 20130123484; US 20100291048; WO/2011/017293А2; и Gaj et al. (2013) Trends Biotechnol, 31(7):397-405, каждый из которых включен в настоящий документ посредством ссылки в полном объеме для всех целей.

[00315] Также предложены активные варианты и фрагменты нуклеазных агентов (т.е. сконструированный нуклеазный агент). Такие активные варианты могут обладать по меньшей мере 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или большей идентичностью последовательности с нативным нуклеазным агентом, при этом активные варианты сохраняют способность разрезать желаемую последовательность-мишень и, следовательно, сохраняют активность индукции ников или двухцепочечных разрывов. Например, любой из описанных в данном документе нуклеазных агентов может быть модифицирован относительно нативной последовательности эндонуклеазы и разработан для распознавания последовательности-мишени, которая не распознавалась нативным нуклеазным агентом, и индукции ника или двухцепочечного разрыва в ней. Таким образом, некоторые сконструированные нуклеазы обладают специфичностью индукции ников или двухцепочечных разрывов в последовательности-мишени, которая отличается от соответствующей последовательности-мишени нативного нуклеазного агента. Анализы на активность индукции ников или двухцепочечных разрывов известны, и обычно в них измеряют общую активность и специфичность эндонуклеазы на ДНК-субстратах, содержащих последовательность-мишень.

[00316] Нуклеазный агент может быть введен в клетку или организм животного, отличного от человека, любым известным способом. Полипептид, кодирующий нуклеазный агент, может быть введен непосредственно в клетку или организм животного. В качестве альтернативы, в клетку или организм животного может быть введен полинуклеотид, кодирующий нуклеазный агент. При введении в клетку полинуклеотида, кодирующего нуклеазный агент, нуклеазный агент может временно, условно или конститутивно экспрессироваться внутри клетки. Таким образом, полинуклеотид, кодирующий нуклеазный агент, может содержаться в кассете экспрессии и быть функционально связан с условным промотором, индуцибельным промотором, конститутивным промотором или тканеспецифическим промотором. Примеры промоторов обсуждаются более подробно в других местах настоящего документа. В качестве альтернативы, нуклеазный агент может быть введен в клетку в виде мРНК, кодирующей нуклеазный агент.

[00317] Полинуклеотид, кодирующий нуклеазный агент, может быть стабильно интегрирован в геном клетки и функционально связан с активным в клетке промотором. В качестве альтернативы, полинуклеотид, кодирующий нуклеазный агент, может находиться в векторе экспрессии или в нацеливающем векторе.

[00318] Когда нуклеазный агент вводят в клетку путем внесения полинуклеотида, кодирующего нуклеазный агент, такой полинуклеотид, кодирующий нуклеазный агент, может быть модифицирован для замены кодонов, имеющих более высокую частоту использования в представляющей интерес клетке, по сравнению с встречающейся в природе полинуклеотидной последовательностью, кодирующей нуклеазный агент. Например, полинуклеотид, кодирующий нуклеазный агент, может быть модифицирован для замены кодонов, имеющих более высокую частоту использования в данной представляющей интерес эукариотической клетке, включая клетку человека, клетку, отличную от клетки человека, клетку млекопитающего, клетку грызуна, клетку мыши, клетку крысы или любую другую представляющую интерес клетку-хозяина, по сравнению с встречающейся в природе полинуклеотидной последовательностью.

[00319] Термин «последовательность-мишень для нуклеазного агента» включает последовательность ДНК, в которой нуклеазный агент вызывает ник или двухцепочечный разрыв. Последовательность-мишень для нуклеазного агента может быть эндогенной (или нативной) по отношению к клетке, или последовательность-мишень может быть экзогенной по отношению к клетке. Последовательность-мишень, экзогенная по отношению к клетке, в природе не встречается в геноме клетки. Последовательность-мишень также может быть экзогенной по отношению к представляющим интерес полинуклеотидам, которые требуется поместить в целевой локус. В некоторых случаях последовательность-мишень присутствует в виде только одной копии в геноме клетки-хозяина.

[00320] Длина последовательности-мишени может варьировать и включает, например, последовательности-мишени, которые составляют примерно 30-36 п.о. для пары нуклеаз с «цинковыми пальцами» (ZFN) (т.е. примерно 15-18 п.о. для каждой ZFN), примерно 36 п.о. для эффекторной нуклеазы, подобной активатору транскрипции (TALEN), или примерно 20 п.о. для гидовой РНК CRISPR/Cas9.

VI. Клетки или животные, или геномы, содержащие конструкции нуклеиновых кислот и/или нуклеазные агенты, или нуклеиновые кислоты, кодирующие нуклеазные агенты

[00321] Также предложены геномы, клетки и животные, полученные раскрытыми в настоящем документе способами. Аналогичным образом, также предложены геномы, клетки и животные, содержащие конструкции нуклеиновых кислот, содержащие кодирующую последовательность ретиношизина (т.е. кодирующую белок ретиношизин или его фрагмент или вариант) для интеграции в целевой геномный локус и экспрессии из него, векторы, липидные наночастицы или композиции, как описано в настоящем документе. Аналогичным образом, также предложены геномы, клетки и животные, содержащие описанные нуклеазные агенты или нуклеиновые кислоты, кодирующие нуклеазные агенты (например, нацеленные на эндогенный локус RS1), или векторы, липидные наночастицы или композиции, как описано в настоящем документе. Геномы, клетки или животные могут содержать нуклеиновокислотную конструкцию, геномно интегрированную в целевой геномный локус (например, в локус RS1), и могут экспрессировать белок ретиношизин или его фрагмент или вариант. Кодирующая последовательность ретиношизина может быть функционально связана с эндогенным промотором в целевом геномном локусе при интеграции в целевой геномный локус, или она может быть функционально связана с экзогенным промотором, присутствующим в нуклеиновокислотной конструкции. Если нуклеиновокислотная конструкция представляет собой двунаправленную нуклеиновокислотную конструкцию, раскрытую в настоящем документе, то геном, клетка или животное могут экспрессировать первый белок ретиношизин или его фрагмент или вариант, или могут экспрессировать второй белок ретиношизин или его фрагмент или вариант. В некоторых геномах, клетках или животных целевой геномный локус представляет собой локус RS1. Например, нуклеиновокислотная конструкция может быть геномно интегрирована в интрон 1 эндогенного локуса RS1. Эндогенный экзон 1 RS1 может затем претерпевать сплайсинг в кодирующую последовательность для белка ретиношизина или его фрагмента или варианта в нуклеиновокислотной конструкции. В конкретном примере модифицированный локус RS1, содержащий геномно интегрированную нуклеиновокислотную конструкцию, кодирует белок, содержащий, по существу состоящий из или состоящий из последовательности, по меньшей мере примерно на 90%, по меньшей мере примерно на 91%, по меньшей мере примерно на 92%, по меньшей мере примерно на 93%, по меньшей мере примерно на 94%, по меньшей мере примерно на 95%, по меньшей мере примерно на 96%, по меньшей мере примерно на 97%, по меньшей мере примерно на 98%, по меньшей мере примерно на 99% или на 100% идентичной SEQ ID NO: 2 или 4. В конкретном примере модифицированный локус RS1, содержащий геномно интегрированную нуклеиновокислотную конструкцию, содержит кодирующую RS1 последовательность, содержащую, по существу состоящуюй из или состоящуюй из последовательности, по меньшей мере примерно на 90%, по меньшей мере примерно на 91%, по меньшей мере примерно на 92%, по меньшей мере примерно на 93%, по меньшей мере примерно на 94%, по меньшей мере примерно на 95%, по меньшей мере примерно на 96%, по меньшей мере примерно на 97%, по меньшей мере примерно на 98%, по меньшей мере примерно на 99% или на 100% идентичной SEQ ID NO: 6, 11 или 12.

[00322] В некоторых геномах, клетках или животных интеграция нуклеиновокислотной конструкции в эндогенный локус RS1 предотвращает транскрипцию эндогенного гена RS1 по ходу транскрипции от сайта интеграции. Например, интеграция нуклеиновокислотной конструкции в эндогенный локус RS1 может снизить или устранить экспрессию эндогенного белка ретиношизина и заменить ее экспрессией белка ретиношизина или его фрагмента или варианта, кодируемого нуклеиновокислотной конструкцией. В качестве примера, интеграция нуклеиновокислотной конструкции в эндогенный локус RS1 снижает экспрессию эндогенного белка ретиношизина. В другом примере интеграция нуклеиновокислотной конструкции в эндогенный локус RS1 устраняет экспрессию эндогенного белка ретиношизина. В конкретном примере эндогенный локус RS1 содержит мутированный ген RS1, содержащий мутацию, вызывающую Х-сцепленный ювенильный ретиношизис, и экспрессия геномно интегрированной нуклеиновокислотной конструкции снижает или устраняет экспрессию мутированного гена RS1.

[00323] Целевой геномный локус, в который стабильно интегрирована нуклеиновокислотная конструкция, может быть гетерозиготным по кодирующей последовательности ретиношизина из нуклеиновокислотной конструкции или гомозиготным по кодирующей последовательности ретиношизина из нуклеиновокислотной конструкции. Диплоидный организм имеет два аллеля в каждом генетическом локусе. Каждая пара аллелей отражает генотип конкретного генетического локуса. Генотипы описываются как гомозиготные, если в определенном локусе находятся два идентичных аллеля, и как гетерозиготные, если эти два аллеля различаются. Животное, содержащее геномно интегрированную нуклеиновокислотную конструкцию, как описано в настоящем документе, может содержать нуклеиновокислотную конструкцию в целевом геномном локусе в своей зародышевой линии.

[00324] Предложенные в настоящем документе геномы, клетки или животные могут быть, например, эукариотическими, включая, например, животное, млекопитающее, отличное от человека млекопитающее и человека. Термин «животное» включает млекопитающих, рыб и птиц. Млекопитающее может представлять собой, например, отличное от человека млекопитающее, человека, грызуна, крысу, мышь или хомяка. К другим отличным от человека млекопитающим относятся, например, отличные от человека приматы, нечеловекообразные обезьяны, человекообразные обезьяны, кошки, собаки, кролики, лошади, быки, олени, бизоны, домашний скот (например, виды крупного рогатого скота, такие как коровы, кастрированные бычки и т.д.; виды овечьих, такие как овцы, козы и т.д., и виды свинообразных, такие как свиньи и кабаны). К птицам относятся, например, куры, индюки, страусы, гуси, утки и т.д. Включены также домашние животные и сельскохозяйственные животные. Термин «отличный от человека» исключает людей.

[00325] Клетки могут быть выделенными клетками (например, in vitro) или могут находиться in vivo в организме животного. Клетки также могут находиться в недифференцированном или дифференцированном состоянии любого типа. Например, клетка может быть тотипотентной клеткой, плюрипотентной клеткой (например, плюрипотентной клеткой человека или плюрипотентной клеткой, отличной от клетки человека, такой как эмбриональная стволовая (ЭС) клетка мыши или ЭС клетка крысы) или неплюрипотентной клеткой. Тотипотентные клетки включают недифференцированные клетки, которые могут давать начало любому типу клеток, а плюрипотентные клетки включают недифференцированные клетки, которые обладают способностью развиваться в более чем один тип дифференцированных клеток.

[00326] Предложенные в настоящем документе клетки также могут быть зародышевыми клетками (например, сперматозоидами или ооцитами). Клетки могут быть митотически компетентными клетками или митотически неактивными клетками, мейотически компетентными клетками или мейотически неактивными клетками. Аналогичным образом, клетки также могут быть первичными соматическими клетками или клетками, которые не являются первичными соматическими клетками. Соматические клетки включают любые клетки, не являющиеся гаметами, зародышевыми клетками, гаметоцитами или недифференцированными стволовыми клетками. Например, клетки могут представлять собой клетки печени, клетки почек, гемопоэтические клетки, эндотелиальные клетки, эпителиальные клетки, фибробласты, мезенхимальные клетки, кератиноциты, клетки крови, меланоциты, моноциты, мононуклеарные клетки, моноцитарные предшественники, В-клетки, эритроид-мегакариоцитарные клетки, эозинофилы, макрофаги, Т-клетки, островковые бета-клетки, экзокринные клетки, предшественники поджелудочной железы, эндокринные предшественники, адипоциты, преадипоциты, нейроны, глиальные клетки, нервные стволовые клетки, нейроны, гепатобласты, гепатоциты, кардиомиоциты, скелетные миобласты, клетки гладких мышц, протоковые клетки, ацинарные клетки, альфа-клетки, бета-клетки, дельта-клетки, клетки РР (панкреатические полипептидные клетки), холангиоциты, белые или бурые адипоциты или клетки глаза (например, клетки трабекулярной сети, клетки пигментного эпителия сетчатки, эндотелиальные клетки микрососудов сетчатки, перициты сетчатки, эпителиальные клетки конъюнктивы, фибробласты конъюнктивы, клетки пигментного эпителия радужки, кератоциты, эпителиальные клетки хрусталика, клетки непигментированного эпителия цилиарного тела, фибробласты сосудистой оболочки глаза, фоторецепторные клетки, ганглиозные клетки, биполярные клетки, горизонтальные клетки или амакриновые клетки). Например, клетки могут представлять собой клетки глаза, такие как клетки сетчатки (например, фоторецепторы).

[00327] Предложенные в настоящем документе клетки могут быть нормальными, здоровыми клетками, или могут быть больными или несущими мутации клетками. Например, клетки могут содержать одну или более мутаций, связанных с XLRS или вызывающих его (например, кодирующие замену R141C в белке ретиношизине).

[00328] Предложенные в настоящем документе животные могут представлять собой людей или отличных от человека животных. Отличные от человека животные, имеющие нуклеиновую кислоту или кассету экспрессии, как описано в настоящем документе, могут быть получены способами, описанными в других местах настоящего документа. Термин «животное» включает млекопитающих, рыб и птиц. Млекопитающие включают, например, людей, отличных от человека приматов, нечеловекообразных обезьян, человекообразных обезьян, кошек, собак, лошадей, быков, оленей, бизонов, овец, кроликов, грызунов (например, мышей, крыс, хомяков и морских свинок), домашний скот (например, виды крупного рогатого скота, такие как коровы и кастрированные бычки; виды овечьих, такие как овцы и козы; и виды свинообразных, такие как свиньи и кабаны). К птицам относятся, например, куры, индюки, страусы, гуси и утки. Включены также домашние животные и сельскохозяйственные животные. Термин «отличное от человека животное» исключает людей. Конкретные примеры отличных от человека животных включают грызунов, таких как мыши и крысы.

[00329] Отличные от человека животные могут иметь любой генетический фон. Например, подходящие мыши могут происходить из линии 129, линии C57BL/6, смеси линии 129 и C57BL/6, линии BALB/c или линии Swiss Webster. Примеры линий 129 включают 129Р1, 129Р2, 129Р3, 129X1, 129S1 (e.g., 129S1/SV, 129Sl/Svlm), 129S2, 129S4, 129S5, 129S9/SvEvH, 129S6 (129/SvEvTac), 129S7, 129S8, 129T1 и 129T2. См., например, источник Festing et al. (1999) Mammalian Genome 10:836, включенный в настоящий документ посредством ссылки в полном объеме для всех целей. Примеры линий C57BL включают C57BL/A, C57BL/An, C57BL/GrFa, C57BL/Kal_wN, C57BL/6, C57BL/6J, C57BL/6ByJ, C57BL/6NJ, C57BL/10, C57BL/10ScSn, C57BL/10Cr и C57BL/Ola. Подходящие мыши также могут происходить из комбинации вышеупомянутой линии 129 и вышеупомянутой линии C57BL/6 (например, 50% 129 и 50% C57BL/6). Аналогичным образом, подходящие мыши могут происходить из комбинации вышеупомянутых линий 129 или из комбинации вышеупомянутых линий BL/6 (например, линия 129S6 (129/SvEvTac)).

[00330] Аналогичным образом, крысы могут происходить из любой линии крыс, включая, например, линию крыс ACI, линию крыс Dark Agouti (DA), линию крыс Wistar, линию крыс LEA, линию крыс Sprague Dawley (SD) или линию крыс Fischer, например, Fisher F344 или Fisher F6. Крысы также могут быть получены из линии, происходящей из комбинации двух или более линий, перечисленных выше. Например, подходящая крыса может происходить из линии DA или линии ACI. Линия крыс ACI характеризуется черным агути с белыми животом и лапами и гаплотипом RT1^av1. Такие линии доступны из различных источников, включая Harlan Laboratories.. Линия крыс Dark Agouti (DA) характеризуется наличием окраса агути и гаплотипом RT1^av1. Такие крысы доступны из различных источников, включая Charles River и Harlan Laboratories. В некоторых случаях подходящие крысы могут происходить из инбредной линии крыс. См., например, публикацию US 2014/0235933, включенную в настоящий документ посредством ссылки в полном объеме для всех целей.

VII. Способы модификации целевого геномного локуса, экспрессии ретиношизина в клетке или лечения XLRS

[00331] В настоящем документе также предложены способы модификации целевого геномного локуса или способы экспрессии ретиношизина в клетке с применением конструкций нуклеиновых кислот, содержащих кодирующую последовательность ретиношизина (т.е. кодирующую белок ретиношизин или его фрагмент или вариант) для интеграции в целевой геномный локус и экспрессии из него, как предложено в настоящем документе. В настоящем документе также предложены способы модификации целевого геномного локуса или способы экспрессии ретиношизина в клетке с применением нуклеазных агентов (или кодирующих нуклеиновых кислот), раскрытых в настоящем документе, в комбинации с конструкциями нуклеиновых кислот, содержащих кодирующую последовательность ретиношизина (т.е. кодирующую белок ретиношизин или его фрагмент или вариант) для интеграции в целевой геномный локус и экспрессии из него, как предложено в настоящем документе. В настоящем документе также предложены способы модификации целевого геномного локуса с применением нуклеазных агентов (или кодирующих нуклеиновых кислот), раскрытых в настоящем документе.

[00332] Способы могут представлять собой, например, способы модификации целевого геномного локуса (например, эндогенного локуса RS1). Некоторые такие способы включают введение нуклеазного агента или нуклеиновой кислоты, кодирующей нуклеазный агент, где нуклеазный агент нацелен на последовательность-мишень нуклеазы в целевом геномном локусе и расщепляет целевой геномный локус.

[00333] Способы могут представлять собой, например, способы интеграции кодирующей последовательности для белка ретиношизина или его фрагмента в целевой геномный локус и экспрессии белка ретиношизина или его фрагмента в клетке. Некоторые такие способы включают введение в клетку нуклеиновокислотной конструкции, вектора или липидной наночастицы, как описано в других местах настоящего документа. Затем кодирующая последовательность может быть интегрирована в целевой геномный локус, и белок ретиношизин или его фрагмент экспрессируется в клетке. Кодирующая последовательность ретиношизина может быть функционально связана с эндогенным промотором в целевом геномном локусе при интеграции в целевой геномный локус, или она может быть функционально связана с экзогенным промотором, присутствующим в нуклеиновокислотной конструкции. Некоторые такие способы включают введение в клетку нуклеиновокислотной конструкции, вектора или липидной наночастицы, как описано в других местах настоящего документа, и нуклеазного агента или нуклеиновой кислоты, кодирующей нуклеазный агент, где нуклеазный агент нацелен на последовательность-мишень нуклеазы в целевом геномном локусе. Нуклеазный агент может расщеплять целевой геномный локус, и кодирующая последовательность из нуклеиновокислотной конструкции может быть интегрирована в целевой геномный локус, так что белок ретиношизин или его фрагмент экспрессируются в клетке. Некоторые такие способы включают введение в клетку композиции, содержащей нуклеиновокислотную конструкцию, вектор или липидную наночастицу, раскрытые в настоящем документе, и нуклеазного агента или нуклеиновой кислоты, кодирующей нуклеазный агент, где нуклеазный агент нацелен на последовательность-мишень нуклеазы в целевом геномном локусе. Нуклеазный агент может расщеплять целевой геномный локус, и кодирующая последовательность из нуклеиновокислотной конструкции может быть интегрирована в целевой геномный локус, так что белок ретиношизин или его фрагмент экспрессируются в клетке. Нуклеазный агент или нуклеиновая кислота, кодирующая нуклеазный агент, могут быть введены, например, в векторе (например, вирусном векторе, таком как вектор AAV) или в липидной наночастице.

[00334] Клетки в вышеуказанных способах могут быть выделенными клетками (например, in vitro) или могут находиться in vivo в организме животного. Клетки также могут находиться в недифференцированном или дифференцированном состоянии любого типа. Например, клетка может быть тотипотентной клеткой, плюрипотентной клеткой (например, плюрипотентной клеткой человека или плюрипотентной клеткой, отличной от клетки человека, такой как эмбриональная стволовая (ЭС) клетка мыши или ЭС клетка крысы) или неплюрипотентной клеткой. Тотипотентные клетки включают недифференцированные клетки, которые могут давать начало любому типу клеток, а плюрипотентные клетки включают недифференцированные клетки, которые обладают способностью развиваться в более чем один тип дифференцированных клеток.

[00335] Предложенные в настоящем документе клетки также могут быть зародышевыми клетками (например, сперматозоидами или ооцитами). Клетки могут быть митотически компетентными клетками или митотически неактивными клетками, мейотически компетентными клетками или мейотически неактивными клетками. Аналогичным образом, клетки также могут быть первичными соматическими клетками или клетками, которые не являются первичными соматическими клетками. Соматические клетки включают любые клетки, не являющиеся гаметами, зародышевыми клетками, гаметоцитами или недифференцированными стволовыми клетками. Например, клетки могут представлять собой клетки печени, клетки почек, гемопоэтические клетки, эндотелиальные клетки, эпителиальные клетки, фибробласты, мезенхимальные клетки, кератиноциты, клетки крови, меланоциты, моноциты, мононуклеарные клетки, моноцитарные предшественники, В-клетки, эритроид-мегакариоцитарные клетки, эозинофилы, макрофаги, Т-клетки, островковые бета-клетки, экзокринные клетки, предшественники поджелудочной железы, эндокринные предшественники, адипоциты, преадипоциты, нейроны, глиальные клетки, нервные стволовые клетки, нейроны, гепатобласты, гепатоциты, кардиомиоциты, скелетные миобласты, клетки гладких мышц, протоковые клетки, ацинарные клетки, альфа-клетки, бета-клетки, дельта-клетки, клетки РР (панкреатические полипептидные клетки), холангиоциты, белые или бурые адипоциты или клетки глаза (например, клетки трабекулярной сети, клетки пигментного эпителия сетчатки, эндотелиальные клетки микрососудов сетчатки, перициты сетчатки, эпителиальные клетки конъюнктивы, фибробласты конъюнктивы, клетки пигментного эпителия радужки, кератоциты, эпителиальные клетки хрусталика, клетки непигментированного эпителия цилиарного тела, фибробласты сосудистой оболочки глаза, фоторецепторные клетки, ганглиозные клетки, биполярные клетки, горизонтальные клетки или амакриновые клетки). Например, клетки могут представлять собой клетки глаза, такие как клетки сетчатки (например, фоторецепторы).

[00336] Предложенные в настоящем документе клетки могут быть нормальными, здоровыми клетками, или могут быть больными или несущими мутации клетками. Например, клетки могут содержать одну или более мутаций, связанных с XLRS или вызывающих его (например, R141C).

[00337] Предложенные в настоящем документе клетки могут быть, например, эукариотическими, включая, например, животное, млекопитающее, отличное от человека млекопитающее и человека. В конкретном примере клетки представляют собой клетки человека. Термин «животное» включает млекопитающих, рыб и птиц. Млекопитающее может представлять собой, например, отличное от человека млекопитающее, человека, грызуна, крысу, мышь или хомяка. К другим отличным от человека млекопитающим относятся, например, отличные от человека приматы, нечеловекообразные обезьяны, человекообразные обезьяны, кошки, собаки, кролики, лошади, быки, олени, бизоны, домашний скот (например, виды крупного рогатого скота, такие как коровы, кастрированные бычки и т.д.; виды овечьих, такие как овцы, козы и т.д., и виды свинообразных, такие как свиньи и кабаны). К птицам относятся, например, куры, индюки, страусы, гуси, утки и т.д. Включены также домашние животные и сельскохозяйственные животные. Термин «отличный от человека» исключает людей.

[00338] Клетки могут находиться in vivo в организме животного. Животное может представлять собой человека или может представлять собой отличное от человека животное. Отличные от человека животные, имеющие нуклеиновую кислоту или кассету экспрессии, как описано в настоящем документе, могут быть получены способами, описанными в других местах настоящего документа. Термин «животное» включает млекопитающих, рыб и птиц. Млекопитающие включают, например, людей, отличных от человека приматов, нечеловекообразных обезьян, человекообразных обезьян, кошек, собак, лошадей, быков, оленей, бизонов, овец, кроликов, грызунов (например, мышей, крыс, хомяков и морских свинок), домашний скот (например, виды крупного рогатого скота, такие как коровы и кастрированные бычки; виды овечьих, такие как овцы и козы; и виды свинообразных, такие как свиньи и кабаны). К птицам относятся, например, куры, индюки, страусы, гуси и утки. Включены также домашние животные и сельскохозяйственные животные. Термин «отличное от человека животное» исключает людей. Конкретные примеры отличных от человека животных, включают грызунов, таких как мыши и крысы.

[00339] Отличные от человека животные могут иметь любой генетический фон. Например, подходящие мыши могут происходить из линии 129, линии C57BL/6, смеси линии 129 и C57BL/6, линии BALB/c или линии Swiss Webster. Примеры линий 129 включают 129Р1, 129Р2, 129Р3, 129X1, 129S1 (e.g., 129S1/SV, 129S1/Svlm), 129S2, 129S4, 129S5, 129S9/SvEvH, 129S6 (129/SvEvTac), 129S7, 129S8, 129T1 и 129T2. См., например, источник Festing et al. (1999) Mammalian Genome 10:836, включенный в настоящий документ посредством ссылки в полном объеме для всех целей. Примеры линий C57BL включают C57BL/A, C57BL/An, C57BL/GrFa, C57BL/Kal_wN, C57BL/6, C57BL/6J, C57BL/6ByJ, C57BL/6NJ, C57BL/10, C57BL/10ScSn, C57BL/10Cr и C57BL/Ola. Подходящие мыши также могут происходить из комбинации вышеупомянутой линии 129 и вышеупомянутой линии C57BL/6 (например, 50% 129 и 50% C57BL/6). Аналогичным образом, подходящие мыши могут происходить из комбинации вышеупомянутых линий 129 или из комбинации вышеупомянутых линий BL/6 (например, линия 129S6 (129/SvEvTac)).

[00340] Аналогичным образом, крысы могут происходить из любой линии крыс, включая, например, линию крыс ACI, линию крыс Dark Agouti (DA), линию крыс Wistar, линию крыс LEA, линию крыс Sprague Dawley (SD) или линию крыс Fischer, например, Fisher F344 или Fisher F6. Крысы также могут быть получены из линии, происходящей из комбинации двух или более линий, перечисленных выше. Например, подходящая крыса может происходить из линии DA или линии ACI. Линия крыс ACI характеризуется черным агути с белыми животом и лапами и гаплотипом RT1^av1. Такие линии доступны из различных источников, включая Harlan Laboratories.. Линия крыс Dark Agouti (DA) характеризуется наличием окраса агути и гаплотипом RT1^av1. Такие крысы доступны из различных источников, включая Charles River и Harlan Laboratories. В некоторых случаях подходящие крысы могут происходить из инбредной линии крыс. См., например, публикацию US 2014/0235933, включенную в настоящий документ посредством ссылки в полном объеме для всех целей.

[00341] Также предложены способы лечения субъекта с Х-сцепленным ювенильным ретиношизисом (XLRS). Такие способы могут включать введение нуклеиновокислотной конструкции, вектора или липидной наночастицы, как описано в других местах настоящего документа, субъекту с XLRS, где нуклеиновокислотная конструкция интегрируется в целевой геномный локус и экспрессируется из него в одной или более клетках сетчатки (например, фоторецепторах) у субъекта, и у субъекта достигается терапевтически эффективный уровень экспрессии ретиношизина. Субъект может иметь, например, эндогенный ген RSL, содержащий по меньшей мере одну мутацию, связанную с Х-сцепленным ювенильным ретиношизисом или вызывающую его (например, R141C). Кодирующая последовательность ретиношизина может быть функционально связана с эндогенным промотором в целевом геномном локусе при интеграции в целевой геномный локус, или она может быть функционально связана с экзогенным промотором, присутствующим в нуклеиновокислотной конструкции. Такие способы также могут также включать введение субъекту нуклеиновокислотной конструкции, вектора или липидной наночастицы, как описано в других местах настоящего документа, и нуклеазного агента или нуклеиновой кислоты, кодирующей нуклеазный агент, где нуклеазный агент нацелен на последовательность-мишень нуклеазы в целевом геномном локусе, нуклеиновокислотная конструкция интегрируется в целевой геномный локус и экспрессируется из него в одной или более клетках сетчатки (например, фоторецепторах) у субъекта, и у субъекта достигается терапевтически эффективный уровень экспрессии ретиношизина. Такие способы также могут также включать введение субъекту композиции, содержащей нуклеиновокислотную конструкцию, вектор или липидную наночастицу, как раскрыто в настоящем документе, и нуклеазного агента или нуклеиновой кислоты, кодирующей нуклеазный агент, где нуклеазный агент нацелен на последовательность-мишень нуклеазы в целевом геномном локусе, нуклеиновокислотная конструкция интегрируется в целевой геномный локус и экспрессируется из него в одной или более клетках сетчатки (например, фоторецепторах) у субъекта, и у субъекта достигается терапевтически эффективный уровень экспрессии ретиношизина.

[00342] XLRS представляет собой витреоретинальную дистрофию, характеризующуюся макулярной патологией и расщеплением поверхностного слоя сетчатки. Макулярные изменения имеют место практически во всех случаях. На глазном дне видны радиально ориентированные интраретинальные фовеомакулярные кисты в форме колеса со спицами, с отсутствием в большинстве случаев фовеального рефлекса. Кроме того, примерно в половине случаев наблюдается билатеральный периферический ретиношизис в инферотемпоральной части сетчатки. Помимо типичного внешнего вида глазного дна, могут наблюдаться косоглазие, нистагм, осевая дальнозоркость, нарушение цветового зрения и фовеальная эктопия. Наиболее серьезными осложнениями являются кровоизлияние в стекловидное тело, отслоение сетчатки и неоваскулярная глаукома. Фовеальный шизис по типу «колеса со спицами» является характерным наблюдением при осмотре глазного дна, присутствующим почти в 100% случаев. Шизис может возникать периферически у вплоть до 50% пациентов. Периферический шизис может привести к перфорациям и разрывам внутреннего листка с возможностью кровоизлияния из неподдерживаемых пересекающих сосудов. Дополнительные периферические изменения включают пигментацию, напоминающую РП, фиброз сетчатки и белые пятна.

[00343] Поскольку XLRS является рецессивным заболеванием, вызванным потерей функции ретиношизина, заместительная генная терапия рассматривается в качестве потенциального средства лечения этого заболевания. Кроме того, поскольку ретиношизин функционирует как внеклеточный белок, эффективное лечение не обязательно ограничивается трансфицированной клеткой, экспрессирующей замещающий ген, а может охватывать более широкую область из-за распространения секретируемого белка из места экспрессии.

[00344] В некоторых способах интеграция нуклеиновокислотной конструкции приводит к структурному восстановлению сетчатки (например, по меньшей мере частичному структурному восстановлению сетчатки). В некоторых способах интеграция нуклеиновокислотной конструкции приводит к восстановлению функции сетчатки (например, по меньшей мере частичному восстановлению функции сетчатки).

[00345] Субъект с XLRS в вышеуказанных способах может быть любым типом животного, как раскрыто выше. В конкретном примере субъект представляет собой человека.

[00346] В способах, нацеленных на клетку in vivo в организме животного, нуклеиновокислотная конструкция может быть вставлена в определенные типы клеток у животного. Способ и носитель для введения нуклеазного агента (или нуклеиновой кислоты, кодирующей нуклеазный агент) и нуклеиновокислотной конструкции животному могут влиять на то, какие типы клеток у животного являются будут выступать мишенями. Например, в некоторых способах нуклеиновокислотную конструкцию вставляют в целевой геномный локус (например, эндогенный локус RSL) в клетках сетчатки, таких как фоторецепторы. Способы и носители для введения нуклеазного агента (или нуклеиновой кислоты, кодирующей нуклеазный агент) и нуклеиновокислотной конструкции животному (включая способы и носители, нацеленные на клетки глаза или сетчатки (например, фоторецепторы), такие как доставка с помощью липидных наночастиц и AAV2-опосредованная доставка, AAV5-опосредованная доставка, AAV8-опосред о ванная доставка или AAV7m8-опосредованная доставка, и интравитреальная или субретинальная инъекция) более подробно раскрыты в других местах настоящего документа.

[00347] Может быть использован любой целевой геномный локус, способный экспрессировать ген, например, локус «безопасной гавани» (ген «безопасной гавани») или эндогенный локус RSL. Такие локусы более подробно описаны в других местах настоящего документа. В конкретном примере целевой геномный локус может представлять собой эндогенный локус RSL, такой как эндогенный локус RSL, содержащий одну или более мутаций, связанных с XLRS или вызывающих его (например, R141C). Например, нуклеиновокислотная конструкция может быть геномно интегрирована в интрон 1 эндогенного локуса. RSL. Эндогенный экзон 1 RSL может затем претерпевать сплайсинг в кодирующую последовательность для белка ретиношизина или его фрагмента или варианта в нуклеиновокислотной конструкции. В конкретном примере модифицированный локус RSL, содержащий геномно интегрированную нуклеиновокислотную конструкцию, кодирует белок, содержащий, по существу состоящий из или состоящий из последовательности, по меньшей мере примерно на 90%, по меньшей мере примерно на 91%, по меньшей мере примерно на 92%, по меньшей мере примерно на 93%, по меньшей мере примерно на 94%, по меньшей мере примерно на 95%, по меньшей мере примерно на 96%, по меньшей мере примерно на 97%, по меньшей мере примерно на 98%, по меньшей мере примерно на 99% или на 100% идентичной SEQ ID NO: 2 или 4. В конкретном примере модифицированный локус RSL, содержащий геномно интегрированную нуклеиновокислотную конструкцию, содержит кодирующую RSL последовательность, содержащую, по существу состоящую из или состоящую из последовательности, по меньшей мере примерно на 90%, по меньшей мере примерно на 91%, по меньшей мере примерно на 92%, по меньшей мере примерно на 93%, по меньшей мере примерно на 94%, по меньшей мере примерно на 95%, по меньшей мере примерно на 96%, по меньшей мере примерно на 97%, по меньшей мере примерно на 98%, по меньшей мере примерно на 99% или на 100% идентичной SEQ ID NO: 6, 11 или 12.

[00348] Интеграция нуклеиновокислотной конструкции в эндогенный локус RSL может в некоторых случаях предотвращать транскрипцию эндогенного гена RSL по ходу транскрипции от сайта интеграции. Интеграция нуклеиновокислотной конструкции в эндогенный локус RSL может снизить или устранить экспрессию эндогенного белка ретиношизина и заменить ее экспрессией белка ретиношизина или его фрагмента или варианта, кодируемого нуклеиновокислотной конструкцией. В качестве примера, интеграция нуклеиновокислотной конструкции в эндогенный локус RSL снижает экспрессию эндогенного белка ретиношизина. В другом примере интеграция нуклеиновокислотной конструкции в эндогенный локус RSL устраняет экспрессию эндогенного белка ретиношизина. В способах, нацеленных на клетки in vivo, таких как способы лечения субъекта с XLRS, интеграция нуклеиновокислотной конструкции в эндогенный локус RSL в одной или более клетках может снизить или устранить экспрессию эндогенного белка ретиношизина в этих клетках и заменить ее экспрессией белка ретиношизина или его фрагмента или варианта, кодируемого нуклеиновокислотной конструкцией. Таким образом, интеграция нуклеиновокислотной конструкции может одновременно обеспечивать нокаут эндогенного гена RSL (например, эндогенного гена RSL, содержащего одну или более мутаций, связанных с XLRS или вызывающих его, например, R141C), и обеспечивать нокин последовательности, кодирующей замещающий ретиношизин (например, последовательности, кодирующей замещающий ретиношизин, которая не содержит мутаций, связанных с XLRS или вызывающих его). Однако в других способах эндогенный ген RSL, содержащий одну или более мутаций, связанных с XLRS или вызывающих его, может сначала быть инактивирован (например, с использованием одного или более нуклеазных агентов, которые нацелены на эндогенный ген RSL и разрушают его), после чего нуклеиновокислотная конструкция, содержащая последовательность, кодирующую замещающий ретиношизин (например, последовательность, кодирующую замещающий ретиношизин, которая не содержит мутаций, связанных с XLRS или вызывающих его), может быть интегрирована в целевой геномный локус. В других способах можно сначала интегрировать нуклеиновокислотную конструкцию, а затем инактивировать эндогенный ген RSL.

[00349] Направленная вставка нуклеиновокислотной конструкции, содержащий кодирующую последовательность ретиношизина, в целевой геномный локус и, в частности, в эндогенный локус RSL, обеспечивает множество преимуществ. Такие способы приводят к стабильной модификации, обеспечивающей стабильную долгосрочную экспрессию последовательности, кодирующей ретиношизин. Применительно к локусу RSL такие способы позволяют использовать эндогенный промотор и регуляторные области RSL для достижения физиологически значимой экспрессии (уровень экспрессии, продолжительность экспрессии и место экспрессии). Например, кодирующая последовательность ретиношизина в нуклеиновокислотной конструкции может содержать ген без промотора, и вставленная нуклеиновокислотная конструкция может быть функционально связана с эндогенным промотором в целевом геномном локусе (например, локус RSL). Использование эндогенного промотора является преимуществом, поскольку он устраняет необходимость включения промотора в нуклеиновокислотную конструкцию, позволяя упаковывать более крупные трансгены, которые, как правило, не могут упаковываться эффективно (например, в AAV). В качестве альтернативы, кодирующая последовательность ретиношизина в нуклеиновокислотной конструкции может быть функционально связана с экзогенным промотором в нуклеиновокислотной конструкции. Примеры типов промоторов, которые могут быть использованы, раскрыты в других местах настоящего документа.

[00350] Необязательно, некоторые или все эндогенные гены (например, эндогенный ген RSL) в целевом геномном локусе могут экспрессироваться при вставке кодирующей последовательности ретиношизина из нуклеиновокислотной конструкции. В качестве альтернативы, в некоторых способах в целевом геномном локусе не экспрессируется ни один эндогенный ген. В качестве примера, модифицированный целевой геномный локус (например, модифицированный локус RSL) после интеграции нуклеиновокислотной конструкции может кодировать химерный белок, содержащий эндогенный сигнал секреции, или его фрагмент, и белок ретиношизин, кодируемый нуклеиновокислотной конструкцией. В другом примере мишенью может быть первый интрон локуса RSL. Сигнальный пептид секреции RSL кодируется экзоном 1 и частью экзона 2 гена RSL. При таком сценарии кассета без промотора, несущая акцептор сплайсинга и кодирующую последовательность ретиношизина, будет поддерживать экспрессию и секрецию белка ретиношизина. Сплайсинг между эндогенным экзоном 1 RSL и интегрированной кодирующей последовательностью ретиношизина создает химерную мРНК и белок, включающий эндогенную последовательность ретиношизина, кодируемую экзоном 1, функционально связанную с последовательностью белка ретиношизина, кодируемой интегрированной нуклеиновокислотной конструкцией.

[00351] Кодирующая последовательность ретиношизина в нуклеиновокислотной конструкции может быть вставлена в целевой геномный локус любыми способами, включая гомологичную рекомбинацию (HR) и негомологичное соединение концов (NHEJ), как описано в других местах настоящего документа.

[00352] В конкретном примере нуклеиновокислотная конструкция может быть вставлена посредством независимой от гомологии направленной интеграции (например, целевой независимой от гомологии направленной интеграции). Например, кодирующая последовательность ретиношизина в нуклеиновокислотной конструкции может быть фланкирована с каждой стороны сайтом-мишенью для нуклеазного агента (например, тем же сайтом-мишенью, что и в целевом геномном локусе, и для того же нуклеазного агента, который используется для расщепления сайта-мишени в целевом геномном локусе). Затем нуклеазный агент может расщеплять сайты-мишени, фланкирующие кодирующую последовательность ретиношизина. В конкретном примере нуклеиновокислотную конструкцию доставляют с помощью AAV-опосредованной доставки, и расщепление сайтов-мишеней, фланкирующих кодирующую последовательность ретиношизина, может удалить инвертированные концевые повторы (ITR) AAV. Удаление ITR может упростить оценку успешного нацеливания, потому что присутствие ITR может затруднять работу по секвенированию из-за повторяющихся последовательностей. В некоторых способах сайт-мишень в целевом геномном локусе (например, последовательность-мишень гРНК, включая фланкирующий мотив, прилегающий к протоспейсеру) больше не присутствует при вставке кодирующей последовательности ретиношизина в целевой геномный локус в правильной ориентации, но преобразуется при вставке кодирующей последовательности белка ретиношизина в целевой геномный локус в противоположной ориентации. Это может помочь обеспечить вставку кодирующей последовательности ретиношизина в правильной ориентации для экспрессии.

[00353] В способах, в которых нуклеиновокислотную конструкцию (или вектор, или LNP) и нуклеазный агент или нуклеиновую кислоту, кодирующую нуклеазный агент, вводят вместе с нуклеиновокислотной конструкцией, нуклеиновокислотная конструкция и нуклеазный агент или нуклеиновая кислота, кодирующая нуклеазный агент, могут быть введены одновременно. В качестве альтернативы, нуклеиновокислотная конструкция и нуклеазный агент или нуклеиновая кислота, кодирующая нуклеазный агент, могут быть введены последовательно в любом порядке. Например, нуклеиновокислотная конструкция может быть введена после нуклеазного агента или нуклеиновой кислоты, кодирующей нуклеазный агент, или нуклеазный агент или нуклеиновая кислота, кодирующая нуклеазный агент, могут быть введены после нуклеиновокислотной конструкции. Например, нуклеазный агент или нуклеиновая кислота, кодирующая нуклеазный агент, могут быть введены в пределах от примерно 1 часа до примерно 48 часов, от примерно 1 часа до примерно 24 часов, от примерно 1 часа до примерно 12 часов, от примерно 1 часа до примерно 6 часов, от примерно 1 часа до примерно 2 часов, от примерно 2 часов до примерно 48 часов, от примерно 2 часов до примерно 24 часов, от примерно 2 часов до примерно 12 часов, от примерно 2 часов до примерно 6 часов, от примерно 3 часов до примерно 48 часов, от примерно 6 часов до примерно 48 часов, от примерно 12 часов до примерно 48 часов или от примерно 24 часов до примерно 48 часов до или после введения нуклеиновокислотной конструкции.

[00354] Нуклеиновокислотная конструкция и нуклеазный агент или нуклеиновая кислота, кодирующая нуклеазный агент, могут быть введены в любом подходящем средстве доставки. В некоторых способах нуклеиновокислотная конструкция и нуклеазный агент или нуклеиновая кислота, кодирующая нуклеазный агент, могут быть введены в одном и том же средстве доставки (например, в одной и той же липидной наночастице или векторе). В некоторых способах, в которых нуклеазный агент содержит белок Cas или нуклеиновую кислоту, кодирующую белок Cas, и гидовую РНК или ДНК, кодирующую гидовую РНК, оба компонента могут быть введены в одном и том же средстве доставки или, в качестве альтернативы, они могут быть доставлены в отдельных средствах доставки. В других способах нуклеиновокислотная конструкция и нуклеазный агент или нуклеиновая кислота, кодирующая нуклеазный агент, могут быть введены в разных средствах доставки (например, введение нуклеазного агента или нуклеиновой кислоты, кодирующей нуклеазный агент, в первом векторе или в LNP, и введение нуклеиновокислотной конструкции во втором векторе, таком как вектор AAV).

[00355] Нуклеазный агент (или нуклеиновая кислота, кодирующая нуклеазный агент) и нуклеиновокислотная конструкция могут быть введены в любой форме (например, ДНК или РНК для гидовых РНК; ДНК, РНК или белок для белков Cas) любым способом доставки (например, AAV, LNP или HDD) и любым путем введения (например путем интравитреальной инъекции или субретинальной инъекции), как раскрыто в других местах настоящего документа. В качестве примера, нуклеиновокислотную конструкцию доставляют посредством доставки, опосредованной аденоассоциированным вирусом (AAV) (например, AAV2-опосредованной доставки, AAV5-опосредованной доставки, AAV8-опосредованной доставки или AAV7m8-опосредованной доставки). Аналогичным образом, нуклеазный агент (или нуклеиновая кислота, кодирующая нуклеазный агент) может быть доставлен посредством доставки, опосредованной липидными наночастицами (LNP), или AAV-опосредованной доставки. Например, нуклеазный агент может представлять собой CRISPR/Cas9, и мРНК Cas9 и гРНК, нацеленная на эндогенный локус RSL (например, интрон 1 RSL), могут быть доставлены посредством LNP-опосредованной доставки или AAV-опосредованной доставки, а нуклеиновокислотная конструкция (например, двунаправленная конструкция или конструкция независимой от гомологии направленной интеграции) может быть доставлена посредством AAV2-опосредованной доставки, AAV5-опосредованной доставки, AAV8-опосредованной доставки или AAV7m8-опосредованной доставки. В другом конкретном примере как нуклеиновую кислоту, кодирующую нуклеазный агент, так и нуклеиновокислотную конструкцию доставляют посредством AAV-опосредованной доставки (например, в одном AAV или посредством двух отдельных AAV). Например, первый AAV может нести кассету экспрессии Cas9, а второй AAV может нести кассету экспрессии гРНК и нуклеиновокислотную конструкцию. Аналогичным образом, первый AAV может нести кассету экспрессии Cas9, а второй AAV может нести две или более кассет экспрессии гРНК и нуклеиновокислотную конструкцию. В качестве альтернативы, первый AAV может нести кассету экспрессии Cas9 (например, кодирующую последовательность Cas9, функционально связанную с промотором) и кассету экспрессии гРНК (например, кодирующую последовательность гРНК, функционально связанную с промотором), и второй AAV может нести нуклеиновокислотную конструкцию. Аналогичным образом, первый AAV может нести кассету экспрессии Cas9 (например, кодирующую последовательность Cas9, функционально связанную с промотором) и две кассеты экспрессии гРНК (например, кодирующие последовательности гРНК, функционально связанные с промоторами), и второй AAV может нести нуклеиновокислотную конструкцию. Для управления экспрессией нРНК могут быть использованы разные промоторы, такие как промотор U6 или малая тРНК Gln. Аналогичным образом, для управления экспрессией Cas9 могут быть использованы разные промоторы. В некоторых способах используют небольшие промоторы, чтобы кодирующую последовательность Cas9 можно было поместить в конструкцию AAV. В некоторых способах для максимизации упаковочной способности AAV используют небольшие белки Cas9 (например, SaCas9 или CjCas9).

[00356] Способы, раскрытые в настоящем документе, включают введение в клетку животному, или обеспечение в них нуклеазных агентов (или нуклеиновых кислот, кодирующих нуклеазные агенты) и конструкций нуклеиновых кислот (т.е. экзогенных донорных нуклеиновых кислот), содержащих кодирующую последовательность ретиношизина (т.е. кодирующую белок ретиношизин или его фрагмент или вариант) для интеграции в целевой геномный локус и экспрессии из него. «Введение» включает представление клетке или животному нуклеиновой кислоты или белка таким образом, что нуклеиновая кислота или белок получают доступ внутрь клетки или внутрь клеток в организме животного. Введение может быть осуществлено любыми способами, и два или более компонентов (например, два компонента или все компоненты) могут быть введены в клетку или животному одновременно или последовательно в любой комбинации. Например, нуклеазный агент может быть введен в клетку или животному перед введением нуклеиновокислотной конструкции. Кроме того, два или более компонентов могут быть введены в клетку или животному одним и тем же способом доставки или разными способами доставки. Аналогичным образом, два или более компонентов могут быть введены животному одним и тем же путем введения или разными путями введения.

[00357] Гидовая РНК может быть введена в клетку в форме РНК (например, РНК, транскрибируемой in vitro) или в форме ДНК, кодирующей гидовую РНК. Аналогичным образом, белковые компоненты, такие как белки Cas9, ZFN или TALEN, могут быть введены в клетку в форме ДНК, РНК или белка. Например, и гидовая РНК, и белок Cas9 могут быть введены в форме РНК. При введении в форме ДНК, указанная ДНК, кодирующая гидовую РНК, может быть функционально связана с промотором, активным в клетке. Например, гидовая РНК может быть доставлена посредством AAV и экспрессирована in vivo под контролем промотора U6. Такие ДНК могут присутствовать в одной или более конструкциях экспрессии. Например, такие конструкции экспрессии могут быть компонентами одной молекулы нуклеиновой кислоты. В качестве альтернативы, они могут быть разделены в любой комбинации между двумя или более молекулами нуклеиновой кислоты (т.е. ДНК, кодирующие одну или более РНК CRISPR, и ДНК, кодирующие одну или более tracrPHK, могут быть компонентами отдельных молекул нуклеиновой кислоты).

[00358] Нуклеиновые кислоты, кодирующие гидовые РНК или нуклеазные агенты, могут быть функционально связаны с промотором в конструкции экспрессии. Конструкции экспрессии включают любые конструкции нуклеиновых кислот, способные управлять экспрессией гена или другой представляющей интерес последовательности нуклеиновой кислоты, и которые могут переносить такую представляющую интерес последовательность нуклеиновой кислоты в клетку-мишень. Подходящие промоторы, которые могут быть использованы в конструкции экспрессии, включают промоторы, активные, например, в одной или более из эукариотической клетки, клетки человека, клетка, отличной от клетки человека, клетки млекопитающего, клетки отличного от человека млекопитающего, клетки грызуна, клетки мыши, клетки крысы, клетки хомяка, клетки кролика, плюрипотентной клетки, эмбриональной стволовой (ЭС) клетки, взрослой стволовой клетки, ограниченной стадией развития клетки-предшественника, индуцированной плюрипотентной стволовой (иПС) клетки или находящегося на одноклеточной стадии эмбриона. Такие промоторы могут представлять собой, например, условные промоторы, индуцибельные промоторы, конститутивные промоторы или тканеспецифические промоторы. Необязательно, промотор может представлять собой двунаправленный промотор, управляющий экспрессией как гидовой РНК в одном направлении, так и другого компонента в другом направлении. Такие двунаправленные промоторы могут состоять из (1) полного обычного однонаправленного промотора Pol III, который содержит 3 внешних контрольных элемента: дистальный про моторный элемент (DSE), проксимальный промоторный элемент (PSE) и ТАТА-бокс; и (2) второго базового промотора Pol III, включающего PSE и ТАТА-бокс, слитого с 5'-концом DSE в обратной ориентации. Например, в промоторе H1 DSE прилегает к PSE и ТАТА-боксу, и промотор можно сделать двунаправленным путем создания гибридного промотора, в котором транскрипция в обратном направлении контролируется путем добавления PSE и ТАТА-бокса, происходящих из промотора U6. См., например, публикацию US 2016/0074535, включенную в настоящий документ посредством ссылки в полном объеме для всех целей. Применение двунаправленного промотора для одновременной экспрессии генов, кодирующих гидовую РНК и другой компонент, позволяет создавать компактные кассеты экспрессии для облегчения доставки.

[00359] Гидовые РНК или нуклеиновые кислоты, кодирующие гидовые РНК (или другие компоненты) могут быть представлены в композициях, содержащих носитель, повышающий стабильность гидовой РНК (например, носитель, пролонгирующий период при заданных условиях хранения (например, -20°С, 4°С или температуре окружающей среды), в течение которого продукты разложения остаются ниже порогового значения, например, ниже 0,5 мас. % от исходной нуклеиновой кислоты или белка; или повышающий стабильность in vivo). Неограничивающие примеры таких носителей включают микросферы полимолочной кислоты (PLA), микросферы сополимера D,L-молочной и гликолевой кислот (PLGA), липосомы, мицеллы, обратные мицеллы, липидные кохлеаты и липидные микротрубочки.

[00360] Предложенные в настоящем документе способы не зависят от конкретного способа введения нуклеиновой кислоты или белка в клетку, за исключением того, что эта нуклеиновая кислота или белок получают доступ внутрь по меньшей мере одной клетки. Способы введения нуклеиновых кислот и белков в различные типы клеток известны в данной области техники и включают, например, способы стабильной трансфекции, способы временной трансфекции и опосредованные вирусами способы.

[00361] Протоколы трансфекции, а также протоколы введения нуклеиновых кислот или белков в клетки могут быть различными. Неограничивающие способы трансфекции включают химические способы трансфекции с использованием липосом; наночастиц; фосфата кальция (Graham et al. (1973) Virology 52 (2): 456-67, Bacchetti et al. (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74 (4): 1590-4, и Kriegler, M (1991). Transfer and Expression: A Laboratory Manual. New York: W.H. Freeman and Company. pp. 96-97); дендримеров; или катионных полимеров, такие как ДЭАЭ-декстран или полиэтиленимин. Нехимические способы включают электропорацию, сонопорацию и оптическую трансфекцию. Трансфекция на основе частиц включает применение генной пушки или трансфекцию с помощью магнита (Bertram (2006) Current Pharmaceutical Biotechnology 7, 277-28). Для трансфекции также могут применяться вирусные способы.

[00362] Введение нуклеиновых кислот или белков в клетку также может быть опосредовано электропорацией, интрацитоплазматической инъекцией, вирусной инфекцией, аденовирусом, лентивирусом, ретровирусом, трансфекцией, липид-опосредованной трансфекцией или нуклеофекцией. Введение нуклеиновых кислот или белков в клетку также может быть опосредовано аденоассоциированным вирусом. Нуклеофекция представляет собой усовершенствованную технологию электропорации, которая позволяет доставлять субстраты нуклеиновых кислот не только в цитоплазму, но также через ядерную мембрану и в ядро. Кроме того, для применения нуклеофекции в описанных в настоящем документе способах обычно требуется гораздо меньше клеток, чем при обычной электропорации (например, всего примерно 2 миллиона по сравнению с 7 миллионами при обычной электропорации). В качестве примера, нуклеофекцию проводят с использованием системы LONZA® NUCLEOFECTOR™.

[00363] Введение нуклеиновых кислот или белков в клетку (например, находящийся на одноклеточной стадии эмбрион) также может быть осуществлено с помощью микроинъекции. В находящихся на одноклеточной стадии эмбрионах микроинъекция может быть осуществлена в материнский и/или отцовский пронуклеус или в цитоплазму. При осуществлении микроинъекции только в один пронуклеус отцовский пронуклеус более предпочтителен из-за его большего размера. Микроинъекцию мРНК предпочтительно осуществляют в цитоплазму (например, для доставки мРНК непосредственно в аппарат трансляции), тогда как микроинъекцию белка Cas или полинуклеотида, кодирующего белок Cas или кодирующего РНК, предпочтительно осуществляют в ядро/пронуклеус. В качестве альтернативы, микроинъекция может быть осуществлена с помощью инъекции как в ядро/пронуклеус, так и в цитоплазму: сначала игла может быть введена в ядро/пронуклеус и может быть введено первое количество, и при извлечении иглы из находящегося на одноклеточной стадии эмбриона может быть введено второе количество - в цитоплазму. При введении белка Cas в цитоплазму указанный белок Cas предпочтительно содержит сигнал ядерной локализации для обеспечения доставки в ядро/пронуклеус. Способы осуществления микроинъекций хорошо известны. См., например, источники Nagy et al. (Nagy A, Gertsenstein M, Vintersten K, Behringer R., 2003, Manipulating the Mouse Embryo. Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press); Meyer et al. (2010) Proc. Natl. Acad Sci. USA 107:15022-15026 и Meyer et al. (2012) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 109:9354-9359. Введение в находящиеся на одноклеточной стадии эмбрионы также может быть осуществлено с помощью электропорации.

[00364] В настоящем документе предложены различные способы и композиции, позволяющие ввести нуклеиновую кислоту или белок в клетку или животному. Такие способы введения нуклеиновой кислоты или белков в клетку или животному могут включать, например, векторную доставку, опосредованную частицами доставку, опосредованную экзосомами доставку, опосредованную липидными наночастицами (LNP) доставку, опосредованную проникающим в клетки пептидом доставку или опосредованную имплантируемым устройством доставку. В качестве конкретных примеров, нуклеиновая кислота или белок могут быть введены в клетку или животному в носителе, таком как микросфера из полимолочной кислоты) (PLA), микросфера из сополимера D,L-молочной и гликолевой кислот (PLGA), липосома, мицелла, обратная мицелла, липидный кохелат или липидная микротрубочка. Некоторые конкретные примеры доставки животному включают гидродинамическую доставку, вирус-опосредованную доставку (например, доставку, опосредованную аденоассоциированным вирусом (AAV) или аденовирусом, лентивирусом или ретровирусом) и опосредованную липидными наночастицами доставку. В одном конкретном примере как нуклеазный агент, так и нуклеиновокислотная конструкция могут быть доставлены с помощью LNP-опосредованной доставки. В другом конкретном примере как нуклеазный агент, так и нуклеиновокислотная конструкция могут быть доставлены с помощью AAV-опосредованной доставки. Например, нуклеазный агент и нуклеиновокислотная конструкция могут быть доставлены с помощью множества различных векторов AAV (например, двух разных векторов AAV). В конкретном примере, в котором нуклеазный агент представляет собой CRISPR/Cas (например, CRISPR/Cas9), первый вектор AAV может доставлять Cas (например, Cas9), а второй вектор AAV может доставлять гРНК и нуклеиновокислотную конструкцию. Например, могут быть использованы небольшие промоторы, чтобы кодирующую последовательность Cas9 можно было поместить в конструкцию AAV.

[00365] В другом конкретном примере нуклеазный агент может быть доставлен с помощью LNP-опосредованной доставки, а нуклеиновокислотная конструкция может быть доставлена с помощью AAV-опосредованной доставки. В другом конкретном примере нуклеазный агент может быть доставлен с помощью AAV-опосредованной доставки, а нуклеиновокислотная конструкция может быть доставлена с помощью LNP-опосредованной доставки.

[00366] Введение нуклеиновых кислот также может быть осуществлено с помощью вирус-опосредованной доставки, такой как AAV-опосредованная доставка или лентивирус-опосредованная доставка (например, вектор AAV или лентивирусный вектор). Другие иллюстративные вирусы/вирусные векторы включают ретровирусы, аденовирусы, вирусы осповакцины, поксвирусы и вирусы простого герпеса. Вирусы могут инфицировать делящиеся клетки, неделящиеся клетки или как делящиеся, так и неделящиеся клетки. Вирусы могут интегрироваться в геном хозяина или, в качестве альтернативы, не интегрироваться в геном хозяина. Такие вирусы также могут быть разработаны таким образом, чтобы они имели сниженный иммунитет. Вирусы могут быть репликационно-компетентными или могут быть репликационно-дефектными (например, дефектными в одном или нескольких генах, необходимых для дополнительных раундов репликации и/или упаковки вириона). Вирусы могут вызывать временную экспрессию, длительную экспрессию (например, по меньшей мере 1 неделю, 2 недели, 1 месяц, 2 месяца или 3 месяца) или постоянную экспрессию (например, Cas9 и/или гРНК). Иллюстративные вирусные титры (например, титры AAV) включают 10¹², 10¹³, 10¹⁴, 10¹⁵, и 10¹⁶ векторных геномов/мл. Иллюстративные вирусные титры (например, титры AAV) включают примерно 10¹², примерно 10¹³, примерно 10¹⁴, примерно 10¹⁵ и примерно 10¹⁶ векторных геномов (вг)/мл, или от примерно 10¹² до примерно 10¹⁶, от примерно 10¹² до примерно 10¹⁵, от примерно 10¹² до примерно 10¹⁴, от примерно 10¹² до примерно 10¹³, от примерно 10¹³ до примерно 10¹⁶, от примерно 10¹⁴ до примерно 10¹⁶, от примерно 10¹⁵ до примерно 10¹⁶ или от примерно 10¹³ до примерно 10¹⁵ вг/мл. Другие иллюстративные вирусные титры (например, титры AAV) включают примерно 10¹², примерно 10¹³, примерно 10¹⁴, примерно 10¹⁵ и примерно 10¹⁶ векторных геномов (вг)/кг массы тела, или от примерно 10¹² до примерно 10¹⁶, от примерно 10¹² до примерно 10¹⁵, от примерно 10¹² до примерно 10¹⁴, от примерно 10¹² до примерно 10¹³, от примерно 10¹³ до примерно 10¹⁶, от примерно 10¹⁴ до примерно 10¹⁶, от примерно 10¹⁵ до примерно 10¹⁶ или от примерно 10¹³ до примерно 10¹⁵ вг/кг массы тела.

[00367] Геном оцДНК AAV состоит из двух открытых рамок считывания, Rep и Сар, фланкированных двумя инвертированными концевыми повторами, которые обеспечивают синтез комплементарной цепи ДНК. При конструировании плазмиды для переноса AAV трансген помещают между двумя ITR, и Rep и Сар могут быть представлены в трансположении. Помимо Rep и Сар для AAV может потребоваться хелперная плазмида, содержащая гены аденовируса. Эти гены (Е4, Е2а и VA) опосредуют репликацию AAV. Например, плазмида для переноса, Rep/Cap и хелперная плазмида могут быть трансфицированы в клетки HEK293, содержащие ген аденовируса Е1+, для продуцирования инфекционных частиц AAV. В качестве альтернативы, Rep, Сар и хелперные гены аденовируса могут быть объединены в одной плазмиде. Аналогичные упаковывающие клетки и способы могут быть использованы для других вирусов, например, ретровирусов.

[00368] Идентифицировано несколько серотипов AAV. Эти серотипы различаются типами клеток, которые они инфицируют (т.е. их тропизмом), что позволяет осуществлять избирательную трансдукцию определенных типов клеток. Серотипы для фоторецепторных клеток включают AAV2, AAV5 и AAV8. Серотипы для пигментного эпителия сетчатки включают AAV1, AAV2, AAV4, AAV5 и AAV8. В конкретном примере вектор AAV, содержащий нуклеиновокислотную конструкцию, может представлять собой AAV2, AAV5 или AAV8.

[00369] Тропизм может быть дополнительно уточнен с помощью псевдотипирования, которое представляет собой смешение капсида и генома разных вирусных серотипов. Например, AAV2/5 означает вирус, содержащий геном серотипа 2, упакованный в капсид из серотипа 5. Применение псевдотипированных вирусов может улучшить эффективность трансдукции, а также изменить тропизм. Гибридные капсиды, полученные из разных серотипов, также могут быть использованы для изменения вирусного тропизма. Например, AAV-DJ содержит гибридный капсид из восьми серотипов и демонстрирует высокую инфицирующую способность в широком диапазоне типов клеток in vivo. AAV-DJ8 представляет собой еще один пример, который демонстрирует свойства AAV-DJ, но с улучшенным захватом в головном мозге. Серотипы AAV также могут быть модифицированы посредством мутаций. Примеры мутационных модификаций AAV2 включают Y444F, Y500F, Y730F и S662V. Примеры мутационных модификаций AAV3 включают Y705F, Y731F и T492V. Примеры мутационных модификаций AAV6 включают S663V и T492V. Другие псевдотипированные/модифицированные варианты AAV включают AAV2/1, AAV2/6, AAV2/7, AAV2/8, AAV2/9, AAV2.5, AAV8.2 и AAV/SASTG. В конкретном примере AAV представляет собой AAV7m8 - вариант AAV, который обеспечивает высокоэффективную доставку ко всем слоям сетчатки и к фоторецепторам. См., например, источник Dalkara et al. (2013) Sci. Transl. Med. 5:189ra76, включенной в настоящий документ посредством ссылки в полном объеме для всех целей.

[00370] Для ускорения экспрессии трансгена можно использовать самокомплементарные варианты AAV (scAAV). Поскольку AAV зависит от аппарата репликации ДНК клетки для синтеза комплементарной цепи генома в виде одноцепочечной ДНК AAV, экспрессия трансгена может быть отсрочена. Чтобы устранить эту задержку, можно использовать scAAV, содержащие комплементарные последовательности, которые способны спонтанно отжигаться при инфицировании, что устраняет потребность в синтезе ДНК клетки-хозяина. Однако, также можно использовать одноцепочечные векторы AAV (ssAAV).

[00371] Чтобы увеличить упаковочную способность, более длинные трансгены могут быть разделены между двумя плазмидами для переноса AAV, первая с 3'-донором сплайсинга, а вторая с 5'-акцептором сплайсинга. При совместном инфицировании клетки эти вирусы образуют конкатемеры, подвергаются совместному сплайсингу и обеспечивают возможность экспрессии полноразмерного трансгена. Хотя это обеспечивает более длительную экспрессию трансгена, такая экспрессия менее эффективна. В аналогичных способах увеличения способности используется гомологичная рекомбинация. Например, трансген может быть разделен между двумя плазмидами для переноса, но со значительным перекрытием последовательностей, так что совместная экспрессия вызывает гомологичную рекомбинацию и экспрессию полноразмерного трансгена.

[00372] В некоторых AAV груз может включать нуклеазный агент (т.е. нуклеиновую кислоту, кодирующую нуклеазный агент). В некоторых AAV груз может включать гидовую РНК или нуклеиновую кислоту, кодирующую гидовую РНК. В некоторых AAV груз может включать мРНК, кодирующую нуклеазу Cas, такую как Cas9, и гидовую РНК или нуклеиновую кислоту, кодирующую гидовую РНК. В некоторых AAV груз может включать нуклеиновокислотную конструкцию, как описано в других местах настоящего документа. В некоторых AAV груз может включать нуклеазный агент и нуклеиновокислотную конструкцию, как описано в других местах настоящего документа. В некоторых AAV груз может включать мРНК, кодирующую нуклеазу Cas, такую как Cas9, гидовую РНК или нуклеиновую кислоту, кодирующую гидовую РНК, и нуклеиновокислотную конструкцию, как описано в других местах настоящего документ.

[00373] Введение нуклеиновых кислот и белков также может осуществляться путем доставки, опосредованной липидными наночастицами (LNP). Например, LNP-опосредованная доставка может быть использована для доставки гидовой РНК в форме РНК. Доставка такими способами приводит к временному присутствию гидовой РНК, а биоразлагаемые липиды улучшают клиренс, улучшают переносимость и снижают иммуногенность. Липидные препараты могут защищать биологические молекулы от деградации, улучшая при этом их клеточный захват. Липидные наночастицы представляют собой частицы, содержащие множество липидных молекул, физически связанных друг с другом межмолекулярными силами. К ним относятся микросферы (включая однослойные и многослойные везикулы, например, липосомы), дисперсная фаза в эмульсии, мицеллы или внутренняя фаза в суспензии. Такие липидные наночастицы могут быть использованы для инкапсуляции одной или более нуклеиновых кислот или белков для доставки. Препараты, содержащие катионные липиды, пригодны для доставки полианионов, таких как нуклеиновые кислоты. Другие липиды, которые могут быть включены, представляют собой нейтральные липиды (т.е. незаряженные или цвиттерионные липиды), анионные липиды, вспомогательные липиды, которые усиливают трансфекцию, и липиды-невидимки, которые увеличивают продолжительность существования наночастиц in vivo. Примеры подходящих катионных липидов, нейтральных липидов, анионных липидов, вспомогательных липидов и липидов-невидимок можно найти в публикациях WO 2016/010840 А1 и WO 2017/173054 А1, каждая из которых включена в настоящий документ посредством ссылки в полном объеме для всех целей. Иллюстративная липидная наночастица может содержать катионный липид и один или более других компонентов. В качестве примера, другой компонент может включать вспомогательный липид, такой как холестерин. В еще одном примере другие компоненты могут включать вспомогательный липид, такой как холестерин, и нейтральный липид, такой как DSPC. В качестве еще одного примера, другие компоненты могут включать вспомогательный липид, такой как холестерин, необязательный нейтральный липид, такой как DSPC, и липид-невидимку, такой как S010, S024, S027, S031 или S033.

[00374] LNP может содержать одно или более, или все из следующего: (i) липид для инкапсуляции и для эндосомального высвобождения; (ii) нейтральный липид для стабилизации; (iii) вспомогательный липид для стабилизации; и (iv) липид-невидимка. См., например, источники Finn et al. (2018) Cell Rep. 22(9):2227-2235 и WO 2017/173054 A1, каждый из которых включен в настоящий документ посредством ссылки в полном объеме для всех целей. В некоторых LNP груз может включать нуклеазный агент. В некоторых LNP груз может включать гидовую РНК или нуклеиновую кислоту, кодирующую гидовую РНК. В некоторых LNP груз может включать мРНК, кодирующую нуклеазу Cas, такую как Cas9, и гидовую РНК или нуклеиновую кислоту, кодирующую гидовую РНК. В некоторых LNP груз может включать экзогенную донорную последовательность. В некоторых LNP груз может включать нуклеазный агент и экзогенную донорную последовательность. В некоторых LNP груз может включать мРНК, кодирующую нуклеазу Cas, такую как Cas9, гидовую РНК или нуклеиновую кислоту, кодирующую гидовую РНК, и экзогенную донорную последовательность.

[00375] Липид для инкапсуляции и эндосомального высвобождения может представлять собой катионный липид. Липид также может представлять собой биоразлагаемый липид, такой как биоразлагаемый ионизируемый липид. Одним из примеров подходящего липида является липид А или LP01, который представляет собой (9Z,12Z)-3-((4,4-бис(октилокси)бутаноил)окси)-2-((((3-(диэтиламино)пропокси)карбонил)окси)метил)пропилоктадека-9,12-диеноат, также называемый 3-((4,4-бис(октилокси)бутаноил)окси)-2-((((3-(диэтиламино)пропокси)карбонил)окси)метил)пропил(9Z,12Z)-октадека-9,12-диеноат. См., например, источники Finn et al. (2018) CellRep. 22(9):2227-2235 и WO 2017/173054 A1, каждый из которых включен в настоящий документ посредством ссылки в полном объеме для всех целей. Еще одним примером подходящего липида является липид В, который представляет собой ((5-((диметиламино)метил)-1,3-фенилен)бис(окси))бис(октан-8,1-диил)бис(деканоат), также называемый ((5-((диметиламино)метил)-1,3-фенилен)бис(окси))бис(октан-8,1-диил)бис(деканоатом). Еще одним примером подходящего липида является липид С, который представляет собой 2-(4-(((3-(диметиламино)пропокси)карбонил)окси)гексадеканоил)окси)пропан-1,3-диил(9Z,9'Z,12Z,12'Z)-бис(октадека-9,12-диеноат). Еще одним примером подходящего липида является липид D, который представляет собой 3-(((3-(диметиламино)пропокси)карбонил)окси)-13-(октаноилокси)тридецил-3-октилундеканоат. Другие подходящие липиды включают: гептатриаконта-6,9,28,31-тетраен-19-ил 4-(диметиламино)бутаноат (также известный как Dlin-MC3-DMA (МС3))).

[00376] Некоторые такие липиды, подходящие для применения в описанных в настоящем документе LNP, являются биоразлагаемыми in vivo. Например, LNP, содержащие такой липид, включают те, в которых по меньшей мере 75% липида выводится из плазмы в течение 8, 10, 12, 24 или 48 часов, или 3, 4, 5, 6, 7 или 10 дней. В качестве другого примера, по меньшей мере 50% LNP выводится из плазмы в течение 8, 10, 12, 24 или 48 часов, или 3, 4, 5, 6, 7 или 10 дней.

[00377] Такие липиды могут быть ионизируемыми в зависимости от рН среды, в которой они находятся. Например, в слабокислой среде липиды могут быть протонированы и, таким образом, нести положительный заряд. И наоборот, в слабощелочной среде, такой как, например, кровь, где рН составляет примерно 7,35, липиды не могут протонироваться и, таким образом, не имеют заряда. В некоторых вариантах осуществления липиды могут быть протонированы при рН по меньшей мере примерно 9, 9,5 или 10. Способность такого липида нести заряд связана с его собственной pKa. Например, липид может независимо иметь pKa в диапазоне от около 5,8 до около 6,2.

[00378] Нейтральные липиды стабилизируют и улучшают процессинг LNP. Примеры подходящих нейтральных липидов включают множество нейтральных, незаряженных или цвиттерионных липидов. Примеры нейтральных фосфолипидов, подходящих для применения в настоящем изобретении, включают, не ограничиваясь перечисленным, 5-гептадецилбензол-1,3-диол (резорцин), дипальмитоилфосфатидилхолин (DPPC), дистеароилфосфатидилхолин (DSPC), фосфохолин (DOPC), димиристоилфосфатидилхолин (DMPC), фосфатидилхолин (PLPC), 1,2-диарахидоноил-sn-глицеро-3-фосфохолин (DAPC), фосфатидилэтаноламин (РЕ), яичный фосфатидилхолин (ЕРС), дилаурилоилфосфатидилхолин (DLPC), димиристоилфосфатидилхолин (DMPC), 1-миристоил-2-пальмитоилфосфатилфосфатил-2-пальмитоилфосфатилхолин (МРРС), 1-пальмоитил-2-миристоилфосфатидилхолин (РМРС), 1-пальмитоил-2-стеароилфосфатидилхолин (PSPC), 1,2-диарахидоил-sn-глицеро-3-фосфохолин (DBPC), 1-стеароил-2-пальмитоилфосфатидилхолин (SPPC), 1,2-диэйкозеноил-sn глицеро-3-фосфохолин (DEPC), пальмитоилолеоилфосфатидилхолин (РОРС), лизофосфатидилхолин, диолеоилфосфатидилэтаноламин (DOPE), дилинолеоилфосфатидилхолин дистеароилфосфатидилэтаноламин (DSPE), димиристоилфосфатидилэтаноламин (DMPE), дипальмитоилфосфатидилэтаноламин (DPPE), пальмитоилолеилфосфатидилэтаноламин (POPE), лизофосфатидилэтаноламин и их комбинации. Например, нейтральный фосфолипид может быть выбран из группы, состоящей из дистеароилфосфатидилхолина (DSPC) и димиристоилфосфатидилэтаноламина (DMPE).

[00379] Вспомогательные липиды включают липиды, которые усиливают трансфекцию. Механизм, с помощью которого вспомогательный липид усиливает трансфекцию, может включать повышение стабильности частиц. В некоторых случаях вспомогательный липид может усиливать фузогенность мембран. Вспомогательные липиды включают стероиды, стерины и алкилрезорцины. Примеры подходящих вспомогательных липидов включают холестерин, 5-гептадецилрезорцин и холестерин гемисукцинат. В качестве примера, вспомогательный липид может представлять собой холестерин или холестерин гемисукцинат.

[00380] Липиды-невидимки включают липиды, которые изменяют продолжительность существования наночастиц in vivo. Липиды-невидимки могут способствовать процессу приготовления препарата, например, уменьшая агрегацию частиц и контролируя размер частиц. Липиды-невидимки могут модулировать фармакокинетические свойства LNP. Подходящие липиды-невидимки включают липиды, имеющие гидрофильную головную группу, связанную с липидным фрагментом.

[00381] Гидрофильная головная группа липида-невидимки может содержать, например, полимерный фрагмент, выбранный из полимеров на основе PEG (иногда называемый поли(этиленоксидом)), поли(оксазолина), поли(винилового спирта), поли(глицерина), поли(N-винилпирролидона), полиаминокислот и поли-N-(2-гидроксипропил)метакриламида). Термин «PEG» означает любой полиэтиленгликоль или другой полимер на основе простого полиалкиленового эфира. В некоторых препаратах LNP PEG представляет собой PEG-2К, также называемый PEG 2000, который имеет среднюю молекулярную массу примерно 2000 Дальтон. См., например, публикацию WO 2017/173054 А1, включенную в настоящий документ посредством ссылки в полном объеме для всех целей.

[00382] Липидный фрагмент липида-невидимки может быть получен, например, из диацилглицерина или диацилгликамида, включая группы, содержащие диалкилглицериновую или диалкилгликамидную группу, имеющую длину алкильной цепи, независимо содержащую от примерно С4 до примерно С40 насыщенных или ненасыщенных атомов углерода, где цепь может содержать одну или более функциональных групп, таких как, например, амид или сложный эфир. Диалкилглицериновая или диалкилгликамидная группа может дополнительно содержать одну или более замещенных алкильных групп.

[00383] В качестве примера, липид-невидимка может быть выбран из PEG-дилауроилглицерина, PEG-димиристоилглицерина (PEG-DMG), PEG-дипальмитоилглицерина, PEG-дистеароилглицерина (PEG-DSPE), PEG-дилаурилгликамида, PEG-димиристилгликамида, PEG-дипальмитоилгликамида и PEG-дистеароилгликамида, PEG-холестерина (1-[8'-(холест-5-ен-3[бета]-окси)карбоксамидо-3',6'-диоксаоктанил]карбамоил-[омега]-метилполи(этиленгликоль), PEG-DMB (3,4-дитетрадекоксилбензил-[омега]-метилполи(этиленгликоль)эфир), 1,2-димиристоил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин-N-[метокси(полиэтиленгликоль)-2000] (PEG2k-DMG), 1,2-дистеароил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин-N-[метокси(полиэтиленгликоль)-2000] (PEG2k-DSPE), 1,2-дистеароил-sn-глицерин метоксиполиэтиленгликоля (PEG2k-DSG), поли(этиленгликоль)-2000-диметакрилата (PEG2k-DMA) и 1,2-дистеарилоксипропил-3-амин-N-[метокси(полиэтиленгликоль)-2000] (PEG2k-DSA). В одном конкретном примере липид-невидимка может представлять собой PEG2k-DMG.

[00384] LNP могут содержать различные соответствующие молярные соотношения входящих в состав препарата липидов. Мол. % липида CCD может составлять, например, от примерно 30 мол. % до примерно 60 мол. %, от примерно 35 мол. % до примерно 55 мол. %, от примерно 40 мол. % до примерно 50 мол. %, от примерно 42 мол. % до примерно 47 мол. %, или примерно 45%. Мол. % вспомогательного липида может составлять, например, от примерно 30 мол. % до примерно 60 мол. %, от примерно 35 мол. % до примерно 55 мол. %, от примерно 40 мол. % до примерно 50 мол. %, от примерно 41 мол. % до примерно 46 мол. %, или примерно 44 мол. %. Мол. % нейтрального липида может составлять, например, от примерно 1 мол. % до примерно 20 мол. %, от примерно 5 мол. % до примерно 15 мол. %, от примерно 7 мол. % до примерно 12 мол. %, или примерно 9 мол. %. Мол. % липида-невидимки может составлять, например, от около 1 мол. % до около 10 мол. %, от около 1 мол. % до около 5 мол. %, от около 1 мол. % до около 3 мол. %, около 2 мол. % или около 1 мол. %.

[00385] LNP могут иметь разные соотношения между положительно заряженными аминогруппами биоразлагаемого липида (N) и отрицательно заряженными фосфатными группами (Р) нуклеиновой кислоты, которую необходимо инкапсулировать. Это может быть математически представлено уравнением N/P. Например, соотношение N/P может составлять от примерно 0,5 до примерно 100, от примерно 1 до примерно 50, от примерно 1 до примерно 25, от примерно 1 до примерно 10, от примерно 1 до примерно 7, от примерно 3 до примерно 5, от примерно 4 до примерно 5, примерно 4, примерно 4,5 или примерно 5.

[00386] В некоторых LNP груз может содержать мРНК Cas и гРНК. мРНК Cas и гРНК могут присутствовать в разных соотношениях. Например, препарат LNP может включать соотношение мРНК Cas и нуклеиновой кислоты гРНК в диапазоне от примерно 25:1 до примерно 1:25, в диапазоне от примерно 10:1 до примерно 1:10, в диапазоне от примерно 5:1 до примерно 1:5, или примерно 1:1. В качестве альтернативы, препарат LNP может включать соотношение мРНК Cas и нуклеиновой кислоты гРНК от примерно 1:1 до примерно 1:5, или примерно 10:1. В качестве альтернативы, препарат LNP может включать соотношение мРНК Cas и нуклеиновой кислоты гРНК, равное примерно 1:10, 25:1, 10:1, 5:1,3:1, 1:1, 1:3, 1:5, 1:10 или 1:25. В качестве альтернативы, препарат LNP может включать соотношение мРНК Cas и нуклеиновой кислоты гРНК от примерно 1:1 до примерно 1:2. В конкретных примерах соотношение мРНК Cas и гРНК может составлять примерно 1:1 или примерно 1:2.

[00387] Иллюстратвная дозировка LNP включает примерно 0,1, примерно 0,25, примерно 0,3, примерно 0,5, примерно 1, примерно 2, примерно 3, примерно 4, примерно 5, примерно 6, примерно 8 или примерно 10 мг/кг массы тела (mpk), или от примерно 0,1 до примерно 10, от примерно 0,25 до примерно 10, от примерно 0,3 до примерно 10, от примерно 0,5 до примерно 10, от примерно 1 до примерно 10, от примерно 2 до примерно 10, от примерно 3 до примерно 10, от примерно 4 до примерно 10, от примерно 5 до примерно 10, от примерно 6 до примерно 10, от примерно 8 до примерно 10, от примерно 0,1 до примерно 8, от примерно 0,1 до примерно 6, от примерно 0,1 до примерно 5, от примерно 0,1 до примерно 4, от примерно 0,1 до примерно 3, от примерно 0,1 до примерно 2, от примерно 0,1 до примерно 1, от примерно 0,1 до примерно 0,5, от примерно 0,1 до примерно 0,3, от примерно 0,1 до примерно 0,25, от примерно 0,25 до примерно 8, от примерно 0,3 до примерно 6, от примерно 0,5 до примерно 5, от примерно 1 до примерно 5 или от примерно 2 до примерно 3 мг/кг массы тела относительно всей РНК (мРНК Cas9 и гРНК) содержимого груза. Такие LNP могут быть введены, например, внутривенно. В качестве примера, могут быть использованы дозы LNP от примерно 0,01 мг/кг до примерно 10 мг/кг, от примерно 0,1 до примерно 10 мг/кг или от примерно 0,01 до примерно 0,3 мг/кг. Например, могут быть использованы дозы LNP, равные примерно 0,01, примерно 0,03, примерно 0,1, примерно 0,3, примерно 1, примерно 3 или примерно 10 мг/кг. Дополнительные иллюстративные дозировки LNP включают примерно 0,1, примерно 0,25, примерно 0,3, примерно 0,5, примерно 1, примерно 2, примерно 3, примерно 4, примерно 5, примерно 6, примерно 8 или примерно 10 мг/кг (mpk) массы тела, или от примерно 0,1 до примерно 10, от примерно 0,25 до примерно 10, от примерно 0,3 до примерно 10, от примерно 0,5 до примерно 10, от примерно 1 до примерно 10, от примерно 2 до примерно 10, от примерно 3 до примерно 10, от примерно 4 до примерно 10, от примерно 5 до примерно 10, от примерно 6 до примерно 10, от примерно 8 до примерно 10, от примерно 0,1 до примерно 8, от примерно 0,1 до примерно 6, от примерно 0,1 до примерно 5, от примерно 0,1 до примерно 4, от примерно 0,1 до примерно 3, от примерно 0,1 до примерно 2, от примерно 0,1 до примерно 1, от примерно 0,1 до примерно 0,5, от примерно 0,1 до примерно 0,3, от примерно 0,1 до примерно 0,25, от примерно 0,25 до примерно 8, от примерно 0,3 до примерно 6, от примерно 0,5 до примерно 5, от примерно 1 до примерно 5 или от примерно 2 до примерно 3 мг/кг массы тела относительно всей РНК (мРНК Cas9 и гРНК) содержимого груза. Такие LNP могут быть введены, например, внутривенно. В качестве примера, могут быть использованы дозы LNP от примерно 0,01 мг/кг до примерно 10 мг/кг, от примерно 0,1 до примерно 10 мг/кг или от примерно 0,01 до примерно 0,3 мг/кг. Например, могут быть использованы дозы LNP, равные примерно 0,01, примерно 0,03, примерно 0,1, примерно 0,3, примерно 0,5, примерно 1, примерно 2, примерно 3 или примерно 10 мг/кг. В другом примере могут быть использованы дозы LNP от примерно 0,5 до примерно 10, от примерно 0,5 до примерно 5, от примерно 0,5 до примерно 3, от примерно 1 до примерно 10, от примерно 1 до примерно 5, от примерно 1 до примерно 3 или от примерно 1 до примерно 2 мг/кг.

[00388] Способ доставки может быть выбран для снижения иммуногенности. Например, разные компоненты могут доставляться разными способами (например, двухрежимная доставка). Эти разные способы могут придавать разные фармакодинамические или фармакокинетические свойства рассматриваемой доставляемой молекуле. Например, разные способы могут приводить к разному распределению в тканях, разному периоду полужизни или разному временному распределению. Некоторые способы доставки (например, доставка нуклеиново-кислотного вектора, который сохраняется в клетке путем автономной репликации или геномной интеграции) приводят к более устойчивой экспрессии и присутствию молекулы, тогда как другие способы доставки являются временными и менее устойчивыми (например, доставка РНК или белка). Доставка компонентов более временным образом, например, в виде РНК, может гарантировать, что комплекс Cas/нРНК присутствует и активен только в течение короткого периода времени, и может снизить иммуногенность. Такая временная доставка может также снизить вероятность нецелевых модификаций.

[00389] Введение in vivo может осуществляться любым подходящим путем, включая, например, интравитреальную инъекцию или субретинальную инъекцию. Значительно меньшие количества компонентов (по сравнению с системными подходами) могут оказывать эффект при локальном введении (например, субретинальном или интравитреальном) по сравнению с системным введением (например, внутривенным). Способы локального введения могут также снижать или устранять частоту потенциально токсичных побочных действий, которые могут возникать при системном введении терапевтически эффективных количеств компонента.

[00390] Композиции, содержащие нуклеазные агенты (например, мРНК Cas9 и гидовые РНК или нуклеиновые кислоты, кодирующие гидовые РНК) и/или конструкции нуклеиновых кислот, раскрытые в настоящем документе, могут быть составлены с использованием одного или более физиологически и фармацевтически приемлемых носителей, разбавителей, эксципиентов или вспомогательных веществ. Состав препарата может зависеть от выбранного пути введения. Термин «фармацевтически приемлемый» означает, что носитель, разбавитель, эксципиент или вспомогательное вещество совместимы с другими ингредиентами препарата и по существу не являются вредными для их реципиента.

[00391] Частота введения и количество доз могут зависеть, среди прочих факторов, от периода полужизни конструкций нуклеиновых кислот или нуклеазных агентов (или нуклеиновых кислот, кодирующих нуклеазные агенты) и пути введения. Введение нуклеиновых кислот или белков в клетку или животному может быть проведено один раз или несколько раз в течение определенного периода времени. Например, введение может быть проведено только один раз в течение определенного периода времени, по меньшей мере три раза в течение определенного периода времени, по меньшей мере четыре раза в течение определенного периода времени, по меньшей мере пять раз в течение определенного периода времени, по меньшей мере шесть раз в течение определенного периода времени, по меньшей мере семь раз в течение определенного периода времени, по меньшей мере восемь раз в течение определенного периода времени, по меньшей мере девять раз в течение определенного периода времени, по меньшей мере десять раз в течение определенного периода времени, по меньшей мере одиннадцать раз, по меньшей мере двенадцать раз в течение определенного периода времени, по меньшей мере тринадцать раз в течение определенного периода времени, по меньшей мере четырнадцать раз в течение определенного периода времени, по меньшей мере пятнадцать раз в течение определенного периода времени, по меньшей мере шестнадцать раз в течение определенного периода времени, по меньшей мере семнадцать раз в течение определенного периода времени, по меньшей мере восемнадцать раз в течение определенного периода времени, по меньшей мере девятнадцать раз в течение определенного периода времени или по меньшей мере двадцать раз в течение определенного периода времени.

[00392] Необязательно, такие способы могут дополнительно включать оценку экспрессии и/или активности вставленной кодирующей последовательности ретиношизина или кодируемого белка ретиношизина у животного или в клетке. Для идентификации клеток, имеющих целевую генетическую модификацию, могут быть использованы различные способы. Скрининг может включать количественный анализ для оценки модификации аллеля (МОА) исходной хромосомы. Например, количественный анализ может быть проведен с помощью количественной ПЦР, такой как ПЦР в реальном времени (кПЦР). В ПЦР в реальном времени может быть использован первый набор праймеров, который распознает целевой локус, и второй набор праймеров, который распознает нецелевой референсный локус. Набор праймеров может включать флуоресцентный зонд, распознающий амплифицированную последовательность. Другие примеры подходящих количественных анализов включают флуоресцентную гибридизацию in situ (FISH), сравнительную геномную гибридизацию, изотермическую амплификацию ДНК, количественную гибридизацию с иммобилизованным(и) зондом(ами), зонды INVADER®, зонды типа «молекулярный маяк» (Molecular Beacon) TaqMan® или технологию зондов ECLIPSE™ (см., например, публикацию US 2005/0144655, включенную в настоящий документ посредством ссылки в полном объеме для всех целей).

[00393] Для скрининга также может быть использовано секвенирование нового поколения (NGS). Секвенирование нового поколения также может называться «NGS», «массовое параллельное секвенирование» или «высокопроизводительное секвенирование». NGS может быть использовано в качестве инструмента скрининга в дополнение к анализам МОА для определения точной природы целевой генетической модификации и ее единообразия в разных типах клеток, типах тканей или типах органов.

[00394] Оценка модификации целевого геномного локуса у животного может быть осуществлена в любом типе клеток из любой ткани или органа. Например, оценка может быть осуществлена в нескольких типах клеток из одной и той же ткани или органа (например, глаза) или в клетках из нескольких локализаций в ткани или органе. Она может предоставить информацию о том, какие типы клеток в целевой ткани или органе выступают в качестве мишеней, или какие участки ткани или органа достигаются нуклеиновокислотной конструкцией. В качестве еще одного примера, оценка может быть осуществлена в нескольких типах тканей или в нескольких органах. В способах, в которых нацеливание осуществляют на конкретную ткань, орган или тип клеток, это может предоставить информацию о том, насколько эффективно осуществляется нацеливание на эту ткань или орган, и присутствуют ли нецелевые эффекты в других тканях или органах.

[00395] Способы измерения экспрессии ретиношизина могут включать, например, измерение экспрессии белка. Такие способы хорошо известны. Такие способы также могут включать оценку экспрессии мРНК, кодируемой кодирующей последовательностью ретиношизина. Это измерение может быть проведено в глазу или определенных типах клеток или областях в глазу (например, клеток сетчатки, таких как фоторецепторы).

[00396] Одним из примеров анализа, который может быть использован, является анализ гибридизации РНК in situ (ISH) BASESCOPE™, который представляет собой метод, позволяющий количественно оценить клеточно-специфические отредактированные транскрипты, включая изменения единичных нуклеотидов, в контексте интактной фиксированной ткани. ISH-анализ РНК BASESCOPE™ может дополнять NGS и кПЦР при определении характеристик редактирования генов. В то время как NGS/кПЦР могут предоставить количественные средние значения для последовательностей дикого типа и отредактированных последовательностей, они не предоставляют информации о неоднородности или процентном содержании отредактированных клеток в ткани. ISH-анализ BASESCOPE™ может обеспечить обзор всей ткани и количественную оценку транскриптов дикого типа по сравнению с отредактированными транскриптами с разрешением на уровне отдельных клеток, где можно количественно оценить фактическое количество клеток в целевой ткани, содержащих отредактированный транскрипт мРНК. Анализ BASESCOPE™ обеспечивает обнаружение единичных молекул РНК с использованием парных олигозондов («ZZ») для амплификации сигнала без неспецифического фона. Тем не менее, конструкция зонда BASESCOPE™ и система амплификации сигнала позволяют обнаруживать единичные молекулы РНК с помощью 1 зонда ZZ и способна дифференцированно обнаруживать единичные нуклеотидные изменения и мутации в интактной фиксированной ткани.

[00397] Анализы для измерения активности белка ретиношизина могут включать, например, методы оптической когерентной томографии (ОКТ) и электроретинографии (ЭРГ). Сканы ОКТ могут быть использованы для оценки полостей сетчатки и/или для измерения толщины фоторецепторных слоев сетчатки. Другие анализы включают оптокинетические тесты. Такие методы хорошо известны. Например, если модифицируемая клетка или животное представляет собой клетку с мутацией, которая связана с Х-сцепленным ювенильным ретиношизисом или вызывает его (например, мутация R141C), такие функциональные анализы могут быть использованы для оценки устранения патологического фенотипа. Оптическая когерентная томография (ОКТ) позволяет получать изображения поперечных срезов макулярной области с высоким разрешением. У людей с XLRS ОКТ выявляет кистозные полости преимущественно во внутреннем ядерном и наружном плексиформном слоях сетчатки. Такое функциональное тестирование может также включать снятие электроретинограммы (ЭРГ), которая представляет собой диагностические тесты, измеряющие электрическую активность, генерируемую нейронами и ненейронными клетками сетчатки в ответ на световой раздражитель. XLRS связан со сниженной амплитудой фототопических и скотопических b-волн на ЭРГ.

[00398] Все патентные документы, веб-сайты, другие публикации, учетные номера и т.п., цитируемые выше или ниже, включены посредством ссылки в полном объеме для всех целей в той же степени, как если бы каждый отдельный элемент был специально и отдельно указан как включенный посредством такой ссылки. Если в разное время разные версии последовательности связаны с определенным учетным номером, то подразумевается та версия, которая связана с учетным номером на действительную дату подачи данной заявки. Действительная дата подачи означает более раннюю дату из даты фактической подачи или даты подачи приоритетной заявки, содержащей ссылку на учетный номер, если это применимо. Аналогичным образом, если в разное время опубликованы разные версии публикации, веб-сайта и т.п., то подразумевается та версия, которая была опубликована последней на действительную дату подачи данной заявки, если не указано иное. Любые признак, стадия, элемент, вариант осуществления или аспект данного изобретения могут быть использованы в комбинации с любым другим, если специально не указано иное. Несмотря на то, что данное изобретение было описано довольно подробно с помощью иллюстраций и примеров для обеспечения ясности и понимания, очевидно, что в пределах объема прилагаемой формулы изобретения могут быть сделаны определенные изменения и модификации.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

[00399] Нуклеотидные и аминокислотные последовательности, перечисленные в прилагаемом перечне последовательностей, представлены с использованием стандартных буквенных сокращений для нуклеотидных оснований и трехбуквенного кода для аминокислот. Нуклеотидные последовательности соответствуют стандартному соглашению: они приведены, начиная с 5'-конца последовательности, в направлении к 3'-концу (т.е. слева направо в каждой строке). Приведена только одна цепь каждой нуклеотидной последовательности, но подразумевается, что комплементарная ей цепь включена посредством любой ссылки на приведенную цепь. Когда приведена нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность, подразумевается, что также приведены ее варианты с вырожденными кодонами, кодирующие ту же аминокислотную последовательность. Аминокислотные последовательности соответствуют стандартному соглашению: они приведены, начиная с аминоконца последовательности, в направлении к карбоксиконцу (т.е. слева направо в каждой строке).

ПРИМЕРЫ

Пример 1. Вставка кодирующей последовательности RSL в локус Rsl мыши в мышиной модели XLRS

[00401] Чтобы смоделировать потенциальные терапевтические стратегии CRISPR для терапии Х-сцепленного ювенильного ретиношизиса (XLRS) in vivo, авторы создали линию мышей с конститутивной экспрессией белка Cas9 во всех тканях (Rosa^Cas9/⁺; см., например, публикации US 2019/0032155 и WO 2019/028032, каждая из которых включена в настоящий документ посредством ссылки в полном объеме для всех целей), и скрестили ее с мышами, содержащими мутантную копию мышиного ретиношизина (Rsl) (Rsl^R141C/^Y) для создания мышей Rosa^Cas9/⁺; Rsl^R141C/^Y. У мышей с мутацией Rsl R141C, которая вызывает внутриклеточное удерживание ретиношизина, воспроизведены ключевые признаки патологического состояния человека, включая интраретинальный шизис, дистрофию сетчатки и уменьшенную b-волну на ЭРГ.

[00402] Ген Rsl представляет собой высококонсервативный внеклеточный белок, участвующий в клеточной организации сетчатки. Он собирается и секретируется фоторецепторами и биполярными клетками в виде гомоолигомерного белкового комплекса. В Rsl было выявлено более 200 мутаций, многие из которых приводят к раннему началу дегенерации желтого пятна из-за нефункционального белка или отсутствия секреции белка. Отсутствие экспрессии функционального Rsl вызывает расслоение слоев сетчатки, что приводит к ранней и прогрессирующей потере зрения, связанной с XLRS. На сегодняшний день нет публикаций, которые бы описывали доклинические или клинические исследования с использованием технологии Cas9 для лечения XLRS. В этом примере авторы описывают подход к использованию Cas9 в сочетании с аденоассоциированным вирусом (AAV) для восстановления несекретируемого варианта R141C Rsl у мышей. Конструкции предназначены для интеграции в эндогенный локус Rsl в сетчатке (например, фоторецепторы), где гибридный мышино-человеческий транскрипт RSL будет экспрессироваться через эндогенный промотор Rsl.

[00403] Субретинальная доставка AAV серотипа 7 т8 привела к успешной экспрессии трансгенов (данные не показаны). Хотя AAV могут сохраняться эктопически в течение года или более, усилия авторов направлены на разработку стратегии постоянного устранения мутантных фенотипов Rsl. С этой целью были разработаны три вирусных вектора, кодирующие экзоны 2-6 RSL человека дикого типа (без промотора), а также гидовая РНК, нацеленная на интрон 1 Rsl мыши. Последовательность гидовой РНК представлена в SEQ ID NO: 43, а последовательность-мишень гидовой РНК в интроне 1 Rsl мыши представлена в SEQ ID NO: 2383. Авторы ожидали, что при инъекции любого из этих вирусов мышам RosaCas9/+; RslR141C/Y экспрессия гидовой РНК приведет к разрезанию в локусе Rsl и интеграции вирусного генома, содержащего фрагмент кДНК RSL человека. Локус Rsl мыши показан на фиг. 1. Экзон 1 мыши должен претерпевать сплайсинг в кДНК экзонов 2-6 человека (фиг. 2), и экспрессия гибридного мышино-человеческого белка должна предотвращать транскрипцию мутантного Rsl мыши.

[00404] Вирусный вектор версии 1 (SEQ ID NO: 47) был создан путем двунаправленной вставки в одноцепочечный вектор AAV (ssAAV). Двести оснований интрона 1 RSl человека (содержащего сигналы сплайсинга экзона 2) помещали перед кДНК, кодирующей экзоны 2-6 транскрипта RSL человека, за которой следовал полиА гормона роста крупного рогатого скота (bGH) (T^h). Вторую кДНК человека генерировали с оптимизацией кодонов для мыши и интегрировали в вектор в противоположной ориентации. Эта последовательность была фланкирована 200 п.о., содержащими сигналы сплайсинга мыши и полиА SV40 (T^mh). Последовательности были разработаны так, чтобы они были достаточно различающимися, чтобы снизить вероятность самоотжига вирусных транскриптов. Кроме того, между транскриптами была добавлена единица экспрессии sgPHK (фиг. 3А). Преимущество этой стратегии заключается в том, что вирусный геном может быть вставлен в любой ориентации и при этом образовывать функциональную рамку считывания для восстановления аллелей.

[00405] Вирусный вектор версии 2 (SEQ ID NO: 46) был создан путем двунаправленной вставки в самокомплементарный вектор AAV (scAAV). Эта версия имела конфигурацию, аналогичную версии 1, с двумя отличиями. Во-первых, последовательность была включена в само комплементарный вектор AAV. Во-вторых, чтобы соответствовать максимальному размеру самокомплементарного генома в 2100 п.о., сигнальные области сплайсинга были уменьшены до 60 п.о. (фиг. 3А).

[00406] Вирусный вектор версии 3 (SEQ ID NO: 45) был разработан для независимой от гомологии направленной интеграции (HITI). В HITI используется необходимость наличия мотива, прилегающего к протоспейсеру (РАМ), для последовательности распознавания Cas9. Конструкция была разработана для экспрессии T^h и той же гидовой РНК, нацеленной на интрон 1 Rsl. Однако в то время, как версии 1 и 2 не содержат последовательностей-мишеней гидовой РНК, версия 3 фланкирована инвертированной последовательностью-мишенью гидовой РНК с каждой стороны (фиг. 3В). Как только вирусный геном станет двухцепочечным, он будет экспрессировать одну последовательность гидовой РНК, которая должна одновременно вызывать двухцепочечный разрыв в интроне 1 Rsl мыши, а также на обеих сторонах вирусного генома, эффективно отщепляя последовательности ITR. Освобожденный вирусный геном теперь может свободно вставляться в геном мыши в любой ориентации. Однако, если кДНК интегрируется в обратной ориентации, последовательности-мишени гидовой РНК должны быть восстановлены и доступны для дальнейшего расщепления Cas9. Если кДНК интегрируется в нужной ориентации, последовательности-мишени гидовой РНК будут разрушены, а последовательность заблокирована на месте.

[00407] В то время как последовательности Rsl версий 1 и 2 почти идентичны, вирусные остовы могут изменять время продукции двухцепочечного вируса и, таким образом, влиять на эффективность вставки генов. scAAV становится двухцепочечным быстрее, чем ssAAV, из-за различий в механизме синтеза второй цепи. Оба ITR в ssAAV могут выступать в качестве точек начала репликации и содержат одноцепочечные нуклеазные домены, которые разрезают вновь синтезированные цепи. Репликация может быть инициирована с любого ITR, поэтому будет генерироваться смесь + и - цепей. Как только полимераза достигает другого ITR, синтезированная цепь расщепляется и высвобождается. Первичный механизм синтеза комплементарной цепи заключается в использовании аппарата клетки-хозяина. Однако на низком уровне + и - цепи, синтезируемые вирусом, могут спонтанно отжигаться с образованием двухцепочечного вируса. В случае scAAV одна из двух последовательностей ITR мутирована для удаления нуклеазного домена. Репликационная вилка начинается с активного ITR и проходит через мутантный ITR, не расщепляясь, а синтез продолжается на противоположной цепи. При одноцепочечном синтезе, содержащем как +, так и - цепь, происходит самокомплементация с образованием двухцепочечного вируса.

[00408] Каждая из версий 1-3 была способна опосредовать вставку гена в локус Rsl мыши на фоновом генотипе мыши Cas9. В пробном исследовании небольшое количество вируса вводили в правый глаз каждой мыши, а левый глаз оставляли без введения в качестве контроля. Обе сетчатки собирали и разрезали пополам. Половину каждой сетчатки использовали для определения характеристик негомологичного соединения концов (NHEJ) в интроне 1 локуса. Rsl мыши. Другую половину использовали для создания кДНК для секвенирования ампликона NGS в мутантной области. Из-за эффективности и систематической ошибки ПЦР авторы смогли амплифицировать каждый вариант транскрипта, но не смогли количественно определить фактические профили экспрессии. Характеристика NHEJ дает ключ к управлению активностью РНК, а также активностью вставки. Обнаружение NHEJ подразумевает наличие аллеля без вставки гена, который, вероятно, будет экспрессировать мутантный транскрипт мыши. Обнаружение любого модифицированного транскрипта указывает на то, что произошла вставка гена.

[00409] Осуществляли инъекцию в правый глаз тринадцати мышам: версию 1 - трем мышам, и каждую из версий 2 и 3 - пяти мышам. Во всех глазах, подвергшихся инъекции, структура сетчатки улучшилась, что видно на изображениях оптической когерентной томографии (ОКТ). См. фиг. 4. Оценка полостей сетчатки, показанных на сканах ОКТ (каждый из которых содержит 61 изображение) из 3 разных мест в каждом глазу, проводилась на основе следующих заранее заданных критериев тремя независимыми интерпретаторами. 1 балл присваивали, если хотя бы на одном отдельном изображении имелось 1-4 полости. 2 балла присваивали, если хотя бы на одном отдельном изображении имелось ≥ 4 полостей, но полости не сливались. 3 балла присваивали, если хотя бы на одном отдельном изображении имелись слившиеся полости. 4 балла присваивали, если хотя бы на одном отдельном изображении имелись слившиеся полости, и сетчатка была растянута. Средние оценки для каждой группы лечения сравнивали с контрольной группой, содержащей объединенные необработанные глаза, с помощью непараметрического однофакторного дисперсионного анализа по критерию Краскела-Уоллиса и апостериорного анализа по критерию множественных сравнений Данна.

[00410] Ампликоны для направленного пересеквенирования нового поколения были разработаны для областей, изображенных на фиг. 3 (горизонтальные стрелки), поскольку эти области различаются в четырех ожидаемых вариантах последовательности ((1) мышь дикого типа, эталонная мышиная последовательность, не содержащая мутанта R141C; (2) мутантная мышь, эталонная мышиная последовательность, несущая мутант R141C; (3) гуманизированный транскрипт 1, эталонная человеческая последовательность; и (4) гуманизированный транскрипт 2, эталонная человеческая последовательность, кодон-оптимизированная для экспрессии у мыши). У исследуемых мышей собирали сетчатки и экстрагировали из тканей тотальную мРНК. мРНК использовали для создания кДНК, которая играла роль матрицы для амплификации с помощью секвенирования нового поколения (NGS). Мишень-специфичные олигонуклеотиды со встроенными штрих-кодами для идентификации последовательности использовали для амплификации всех четырех вариантов на ткань. Продукты ПЦР от каждой мыши нормировали и объединяли в одну пробирку для дальнейшей обработки. Окончательную библиотеку загружали в MiSeq и использовали программу 2×300 для секвенирования образцов. Затем использовали информационные коды для деконволюции образцов и создания эталона последовательности de novo. Число чтений, соответствующее каждому варианту, определяли количественно и получали процент путем деления числа чтений варианта на общее число чтений. Как и ожидалось, последовательности мыши WT были обнаружены только у самок мышей Rosa^Cas9/⁺; Rsl^R141C/+. Результаты NGS для четырех ожидаемых вариантов последовательностей показаны на фиг. 5. Систематическая ошибка и эффективность ПЦР не учтены. Отдельный ампликон использовали для амплификации последовательности-мишени гидовой РНК интрона 1 Rsl. Чтения, которые соответствовали эталонной мышиной последовательности или содержали негомологичное соединение концов, количественно оценивали, чтобы оценить, как часто гидовая РНК осуществляла разрез без вставки. См. фиг. 6А и 6В. Гистограммы, демонстрирующие некоторые данные из таблиц на фиг. 5, показаны на фиг. 7А-7С для версий 1-3, соответственно.

[00411] Все мыши продемонстрировали различные уровни всех транскриптов, с большим числом чтений T^h, чем T^mh, у всех мышей. Как и ожидалось, мыши с очень высокими уровнями NHEJ имели меньшее количество человеческих транскриптов. В то время как версии 1 и 2 имели схожие профили последовательностей, версия 3 характеризовалась более высоким присутствием остаточного мутантного мышиного транскрипта. Вероятно, это было связано с необходимостью определенной ориентации вставки. В то время как дизайн гидовой РНК должен помочь подтолкнуть вставку к желаемой вставке, вполне вероятно, что расщепление Cas9 повреждало последовательности распознавания за пределами возможности повторного нацеливания. Кроме того, большая вставка/делеция (индел) в вирусном геноме могла нарушить сигналы сплайсинга и предотвратить правильную экспрессию.

Пример 2. Вставка кодирующей последовательности RSL в локус RSL человека в клетках ретинобластомы человека

[00412] Затем авторы проверили вставку кодирующей последовательности RSL в локус RSL человека в клетках WERI-Rb1 ретинобластомы человека in vitro. Линия клеток WERI-Rb1 (АТСС^® НТВ 169ТМ) была получена из ретинобластомы человека. Клетки ретинобластомы являются предшественниками фоторецепторов и являются подходящей in vitro моделью фоторецепторных клеток, поскольку линии клеток фоторецепторов недоступны. Клетки были охарактеризованы собственными силами с помощью специфичных для сетчатки клеточных маркеров с помощью ICC и ОТ-ПЦР, которые показали только мРНК/белки, специфичные для колбочек, но не были обнаружены их палочковые аналоги, что позволяет предположить, что это новообразование относится к линии клеток колбочек. Кроме того, сообщалось, что RSL экспрессируется и высвобождается клетками WERI-Rb1. Авторы также обнаружили экспрессию RSL на уровне мРНК и уровне белка (данные не показаны). Готовили липидные наночастицы (LNP) с одной из шести гидовых РНК, нацеленных на интрон 1 RSL человека, и мРНК Cas9 (последовательность представлена в SEQ ID NO: 6245).

[00414] В первом эксперименте клетки ретинобластомы человека в суспензии трансдуцировали примерно 5е5 MOI донора AAV (варианты вирусного вектора 1 и 2 из примера 1), и через 2 часа после инфицирования вводили LNP с CRISPR/Cas9. Все LNP дозировали по 500 нг на лунку (48-луночный планшет), за исключением «высоких» образцов, в которые дозировали 1000 нг LNP. Затем проводили полный анализ экспрессии генов с помощью ОТ-кПЦР. ОТ-кПЦР выполняли путем сбора полной РНК из образцов и обработки их ДНКазой для деградации всей ДНК, содержащейся в образцах. Затем образцы РНК подвергали обратной транскрипции для создания кДНК для всех мРНК, содержащихся в образце. Затем для количественного определения уникальных последовательностей RSL, экспрессируемых в клетках, использовали мишень-специфические анализы TaqMan. РНК собирали через 72 часа после инфицирования. Контроль отсутствия обратной транскрипции завершали путем сбора тотальной РНК и обработки ДНКазой, как указано выше. Для контроля полимеразу обратной транскрипции заменяли водой, чтобы не образовывалась кДНК. Образцы с обратной транскрипцией и контрольные образцы без обратной транскрипции анализировали с геном «домашнего хозяйства» (DROSHA). Результаты для версии 1 вирусного вектора (двунаправленная вставка в одноцепочечный вектор AAV (ssAAV)) показаны на фиг. 8А. Результаты для вирусного вектора версии 1 (двунаправленная вставка в самокомплементарный вектор AAV (scAAV)) показаны на фиг. 8В. Эти результаты представлены в виде разности Ct, чтобы нормировать различия в количестве и качестве РНК. Чем ниже число, тем выше экспрессия целевой последовательности. Эти результаты указывают на устойчивую экспрессию введенных последовательностей. Анализы TaqMan и вирусные последовательности были оптимизированы для уменьшения перекрестного обнаружения эндогенной экспрессии RSL человека. Во втором эксперименте клетки ретинобластомы человека в суспензии трансдуцировали примерно 5е5 MOI донора AAV (варианты вирусного вектора 1 и 2 из примера 1), и за 2 часа до инфицирования вводили LNP с CRISPR/Cas9. Все LNP дозировали по 500 нг на лунку (48-луночный планшет), за исключением «высоких» образцов, в которые дозировали 1000 нг LNP. Затем проводили полный анализ экспрессии генов с помощью ОТ-кПЦР. Результаты для версии 1 вирусного вектора (двунаправленная вставка в одноцепочечный вектор AAV (ssAAV)) показаны на фиг. 9А. Результаты для вирусного вектора версии 1 (двунаправленная вставка в самокомплементарный вектор AAV (scAAV)) показаны на фиг. 9В. Эти результаты представлены в виде разности Ct, чтобы нормировать различия в количестве и качестве РНК. Чем ниже число, тем выше экспрессия целевой последовательности. Эти результаты указывают на устойчивую экспрессию введенных последовательностей. Анализы TaqMan и вирусные последовательности были оптимизированы для уменьшения перекрестного обнаружения эндогенной экспрессии RSL человека.

Пример 3. Вставка кодирующей последовательности RSL в локус Rsl мыши в мышиной модели XLRS посредством гомологичной рекомбинации

[00415] Чтобы смоделировать потенциальные терапевтические стратегии CRISPR для терапии Х-сцепленного ювенильного ретиношизиса (XLRS) in vivo, авторы использовали линию мышей, описанную в примере 1, с конститутивной экспрессией белка Cas9 во всех тканях, скрещенную с мышами, содержащими мутантную копию мышиного ретиношизина (Rsl) (мыши Rosa^Cas9/⁺;Rsl^R141C/^Y). CRISPR/Cas9 использовали в сочетании с аденоассоциированным вирусом (AAV) для восстановления несекретируемого варианта R141C Rsl у мышей. Конструкции предназначены для интеграции в эндогенный локус Rsl в сетчатке (например, фоторецепторы) посредством гомологичной рекомбинации, где гибридный мышино-человеческий транскрипт RSL будет экспрессироваться через эндогенный промотор Rsl. Мыши находились в возрасте Р14, когда сетчатка все еще претерпевает митоз, клеточную дифференцировку и созревание. Инъекцию проводили во время митоза сетчатки, а оценку проводили после завершения митоза, через 2 месяца после инъекции.

[00416] Были сконструированы три вирусных вектора, кодирующие экзоны 2-6 RSL человека дикого типа (без промотора), а также гидовую РНК, нацеленную на интрон 1 Rsl мыши (последовательность-мишень гидовой РНК представлена в SEQ ID NO: 2887), где все эти элементы были фланкированы плечами гомологии. См. фиг. 10. Эти элементы фланкированы инвертированной последовательностью-мишенью гидовой РНК с каждой стороны. Как только вирусный геном станет двухцепочечным, он будет экспрессировать одну последовательность гидовой РНК, которая одновременно вызывает двухцепочечный разрыв в интроне 1 Rsl мыши, а также на обеих сторонах вирусного генома, эффективно отщепляя последовательности ITR. Каждое плечо гомологии в первом вирусном векторе составляет примерно 1800 п.о., каждое плечо гомологии во втором вирусном векторе составляет примерно 900 п.о., и каждое плечо гомологии в третьем вирусном векторе составляет примерно 450 п.о. Последовательности для трех векторов представлены в SEQ ID NO: 6247-6249 соответственно. При инъекции любого из этих вирусов в глаз мышей RosaCas9/+; RslR141C/Y экспрессия гидовой РНК приводит к разрезанию в локусе Rsl и гомологичной рекомбинации с вирусным геномом, содержащим фрагмент кДНК RSL человека. Локус Rsl мыши показан на фиг. 1. Экзон 1 мыши сплайсируется в кДНК экзонов 2-6 человека (фиг. 2), и экспрессия гибридного мышино-человеческого белка предотвращает транскрипцию мутантного Rsl мыши.

[00417] Сетчатки собирали и разрезали пополам. Половину каждой сетчатки использовали для определения характеристик негомологичного соединения концов (NHEJ) в интроне 1 локуса Rsl мыши. Другую половину использовали для создания кДНК для секвенирования ампликона NGS в мутантной области. Характеристика NHEJ дает информация об управлению активностью РНК, а также активностью вставки. Обнаружение NHEJ подразумевает наличие аллеля без вставки гена, который, вероятно, будет экспрессировать мутантный транскрипт мыши. Обнаружение вставленного транскрипта указывает на то, что произошла вставка гена.

[00418] Организацию сетчатки оценивали с помощью визуализации методом оптической когерентной томографии (ОКТ). Оценку полостей сетчатки на сканах ОКТ проводили на основе следующих заранее заданных критериев тремя независимыми интерпретаторами. 1 балл присваивали, если хотя бы на одном отдельном изображении имелось 1-4 полости. 2 балла присваивали, если хотя бы на одном отдельном изображении имелось ≥ 4 полостей, но полости не сливались. 3 балла присваивали, если хотя бы на одном отдельном изображении имелись слившиеся полости. 4 балла присваивали, если хотя бы на одном отдельном изображении имелись слившиеся полости, и сетчатка была растянута. Средние оценки для каждой группы лечения сравнивали с контрольной группой, содержащей объединенные необработанные глаза, с помощью непараметрического однофакторного дисперсионного анализа по критерию Краскела-Уоллиса и апостериорного анализа по критерию множественных сравнений Данна.

[00419] У исследуемых мышей собирали сетчатки и экстрагировали из тканей тотальную мРНК. мРНК использовали для создания кДНК, которая играла роль матрицы для амплификации с помощью секвенирования нового поколения (NGS). Мишень-специфичные олигонуклеотиды со встроенными штрих-кодами для идентификации последовательности использовали для амплификации всех четырех вариантов на ткань. Продукты ПЦР от каждой мыши нормировали и объединяли в одну пробирку для дальнейшей обработки. Окончательную библиотеку загружали в MiSeq и использовали программу 2×300 для секвенирования образцов. Затем использовали информационные коды для деконволюции образцов и создания эталона последовательности de novo. Число чтений, соответствующее каждому варианту, определяли количественно и получали процент путем деления числа чтений варианта на общее число чтений.

Пример 4. Вставка кодирующей последовательности RSL в локус RSL человека в клетках ретинобластомы человека посредством гомологичной рекомбинации

[00420] Затем авторы проверили вставку кодирующей последовательности RSL в локус RSL человека посредством гомологичной рекомбинации в клетках ретинобластомы человека in vitro. Готовили липидные наночастицы (LNP) с гидовыми РНК, нацеленными на интрон 1 RSL человека, и мРНК Cas9. В первом эксперименте клетки ретинобластомы человека в суспензии трансдуцировали примерно 5е5 MOI донора AAV (вирусные векторы из примера 3, но с плечами гомологии RSL человека), и через 2 часа после инфицирования вводили LNP с CRISPR/Cas9. Все LNP дозировали по 500 нг на лунку или 1000 нг на лунку. Затем проводили полный анализ экспрессии генов с помощью ОТ-кПЦР. Во втором эксперименте клетки ретинобластомы человека в суспензии трансдуцировали примерно 5е5 MOI донора AAV (вирусные векторы из примера 3, но с плечами гомологии RSL человека), и за 2 часа до инфицирования вводили LNP с CRISPR/Cas9. Все LNP дозировали по 500 нг на лунку или 1000 нг на лунку. Затем проводили полный анализ экспрессии генов с помощью ОТ-кПЦР.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> Regeneron Pharmaceuticals, Inc.

<120> СТРАТЕГИИ CRISPR И AAV ДЛЯ ТЕРАПИИ X-СЦЕПЛЕННОГО ЮВЕНИЛЬНОГО

РЕТИНОШИЗИСА

<130> 057766/694232

<150> US 62/932,608

<151> 2019-11-08

<160> 6249

<170> PatentIn версии 3.5

<210> 1

<211> 224

<212> Белок

<213> Mus musculus

<400> 1

Met Pro His Lys Ile Glu Gly Phe Phe Leu Leu Leu Leu Phe Gly Tyr

1 5 10 15

Glu Ala Thr Leu Gly Leu Ser Ser Thr Glu Asp Glu Gly Glu Asp Pro

20 25 30

Trp Tyr Gln Lys Ala Cys Lys Cys Asp Cys Gln Val Gly Ala Asn Ala

35 40 45

Leu Trp Ser Ala Gly Ala Thr Ser Leu Asp Cys Ile Pro Glu Cys Pro

50 55 60

Tyr His Lys Pro Leu Gly Phe Glu Ser Gly Glu Val Thr Pro Asp Gln

65 70 75 80

Ile Thr Cys Ser Asn Pro Glu Gln Tyr Val Gly Trp Tyr Ser Ser Trp

85 90 95

Thr Ala Asn Lys Ala Arg Leu Asn Ser Gln Gly Phe Gly Cys Ala Trp

100 105 110

Leu Ser Lys Tyr Gln Asp Ser Ser Gln Trp Leu Gln Ile Asp Leu Lys

115 120 125

Glu Ile Lys Val Ile Ser Gly Ile Leu Thr Gln Gly Arg Cys Asp Ile

130 135 140

Asp Glu Trp Val Thr Lys Tyr Ser Val Gln Tyr Arg Thr Asp Glu Arg

145 150 155 160

Leu Asn Trp Ile Tyr Tyr Lys Asp Gln Thr Gly Asn Asn Arg Val Phe

165 170 175

Tyr Gly Asn Ser Asp Arg Ser Ser Thr Val Gln Asn Leu Leu Arg Pro

180 185 190

Pro Ile Ile Ser Arg Phe Ile Arg Leu Ile Pro Leu Gly Trp His Val

195 200 205

Arg Ile Ala Ile Arg Met Glu Leu Leu Glu Cys Ala Ser Lys Cys Ala

210 215 220

<210> 2

<211> 224

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<400> 2

Met Ser Arg Lys Ile Glu Gly Phe Leu Leu Leu Leu Leu Phe Gly Tyr

1 5 10 15

Glu Ala Thr Leu Gly Leu Ser Ser Thr Glu Asp Glu Gly Glu Asp Pro

20 25 30

Trp Tyr Gln Lys Ala Cys Lys Cys Asp Cys Gln Gly Gly Pro Asn Ala

35 40 45

Leu Trp Ser Ala Gly Ala Thr Ser Leu Asp Cys Ile Pro Glu Cys Pro

50 55 60

Tyr His Lys Pro Leu Gly Phe Glu Ser Gly Glu Val Thr Pro Asp Gln

65 70 75 80

Ile Thr Cys Ser Asn Pro Glu Gln Tyr Val Gly Trp Tyr Ser Ser Trp

85 90 95

Thr Ala Asn Lys Ala Arg Leu Asn Ser Gln Gly Phe Gly Cys Ala Trp

100 105 110

Leu Ser Lys Phe Gln Asp Ser Ser Gln Trp Leu Gln Ile Asp Leu Lys

115 120 125

Glu Ile Lys Val Ile Ser Gly Ile Leu Thr Gln Gly Arg Cys Asp Ile

130 135 140

Asp Glu Trp Met Thr Lys Tyr Ser Val Gln Tyr Arg Thr Asp Glu Arg

145 150 155 160

Leu Asn Trp Ile Tyr Tyr Lys Asp Gln Thr Gly Asn Asn Arg Val Phe

165 170 175

Tyr Gly Asn Ser Asp Arg Thr Ser Thr Val Gln Asn Leu Leu Arg Pro

180 185 190

Pro Ile Ile Ser Arg Phe Ile Arg Leu Ile Pro Leu Gly Trp His Val

195 200 205

Arg Ile Ala Ile Arg Met Glu Leu Leu Glu Cys Val Ser Lys Cys Ala

210 215 220

<210> 3

<211> 224

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<400> 3

Met Ser Arg Lys Ile Glu Gly Phe Leu Leu Leu Leu Leu Phe Gly Tyr

1 5 10 15

Glu Ala Thr Leu Gly Leu Ser Ser Thr Glu Asp Glu Gly Glu Asp Pro

20 25 30

Trp Tyr Gln Lys Ala Cys Lys Cys Asp Cys Gln Gly Gly Pro Asn Ala

35 40 45

Leu Trp Ser Ala Gly Ala Thr Ser Leu Asp Cys Ile Pro Glu Cys Pro

50 55 60

Tyr His Lys Pro Leu Gly Phe Glu Ser Gly Glu Val Thr Pro Asp Gln

65 70 75 80

Ile Thr Cys Ser Asn Pro Glu Gln Tyr Val Gly Trp Tyr Ser Ser Trp

85 90 95

Thr Ala Asn Lys Ala Arg Leu Asn Ser Gln Gly Phe Gly Cys Ala Trp

100 105 110

Leu Ser Lys Phe Gln Asp Ser Ser Gln Trp Leu Gln Ile Asp Leu Lys

115 120 125

Glu Ile Lys Val Ile Ser Gly Ile Leu Thr Gln Gly Cys Cys Asp Ile

130 135 140

Asp Glu Trp Met Thr Lys Tyr Ser Val Gln Tyr Arg Thr Asp Glu Arg

145 150 155 160

Leu Asn Trp Ile Tyr Tyr Lys Asp Gln Thr Gly Asn Asn Arg Val Phe

165 170 175

Tyr Gly Asn Ser Asp Arg Thr Ser Thr Val Gln Asn Leu Leu Arg Pro

180 185 190

Pro Ile Ile Ser Arg Phe Ile Arg Leu Ile Pro Leu Gly Trp His Val

195 200 205

Arg Ile Ala Ile Arg Met Glu Leu Leu Glu Cys Val Ser Lys Cys Ala

210 215 220

<210> 4

<211> 224

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 4

Met Pro His Lys Ile Glu Gly Phe Phe Leu Leu Leu Leu Phe Gly Tyr

1 5 10 15

Glu Ala Thr Leu Gly Leu Ser Ser Thr Glu Asp Glu Gly Glu Asp Pro

20 25 30

Trp Tyr Gln Lys Ala Cys Lys Cys Asp Cys Gln Gly Gly Pro Asn Ala

35 40 45

Leu Trp Ser Ala Gly Ala Thr Ser Leu Asp Cys Ile Pro Glu Cys Pro

50 55 60

Tyr His Lys Pro Leu Gly Phe Glu Ser Gly Glu Val Thr Pro Asp Gln

65 70 75 80

Ile Thr Cys Ser Asn Pro Glu Gln Tyr Val Gly Trp Tyr Ser Ser Trp

85 90 95

Thr Ala Asn Lys Ala Arg Leu Asn Ser Gln Gly Phe Gly Cys Ala Trp

100 105 110

Leu Ser Lys Phe Gln Asp Ser Ser Gln Trp Leu Gln Ile Asp Leu Lys

115 120 125

Glu Ile Lys Val Ile Ser Gly Ile Leu Thr Gln Gly Arg Cys Asp Ile

130 135 140

Asp Glu Trp Met Thr Lys Tyr Ser Val Gln Tyr Arg Thr Asp Glu Arg

145 150 155 160

Leu Asn Trp Ile Tyr Tyr Lys Asp Gln Thr Gly Asn Asn Arg Val Phe

165 170 175

Tyr Gly Asn Ser Asp Arg Thr Ser Thr Val Gln Asn Leu Leu Arg Pro

180 185 190

Pro Ile Ile Ser Arg Phe Ile Arg Leu Ile Pro Leu Gly Trp His Val

195 200 205

Arg Ile Ala Ile Arg Met Glu Leu Leu Glu Cys Val Ser Lys Cys Ala

210 215 220

<210> 5

<211> 206

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<400> 5

Thr Leu Gly Leu Ser Ser Thr Glu Asp Glu Gly Glu Asp Pro Trp Tyr

1 5 10 15

Gln Lys Ala Cys Lys Cys Asp Cys Gln Gly Gly Pro Asn Ala Leu Trp

20 25 30

Ser Ala Gly Ala Thr Ser Leu Asp Cys Ile Pro Glu Cys Pro Tyr His

35 40 45

Lys Pro Leu Gly Phe Glu Ser Gly Glu Val Thr Pro Asp Gln Ile Thr

50 55 60

Cys Ser Asn Pro Glu Gln Tyr Val Gly Trp Tyr Ser Ser Trp Thr Ala

65 70 75 80

Asn Lys Ala Arg Leu Asn Ser Gln Gly Phe Gly Cys Ala Trp Leu Ser

85 90 95

Lys Phe Gln Asp Ser Ser Gln Trp Leu Gln Ile Asp Leu Lys Glu Ile

100 105 110

Lys Val Ile Ser Gly Ile Leu Thr Gln Gly Arg Cys Asp Ile Asp Glu

115 120 125

Trp Met Thr Lys Tyr Ser Val Gln Tyr Arg Thr Asp Glu Arg Leu Asn

130 135 140

Trp Ile Tyr Tyr Lys Asp Gln Thr Gly Asn Asn Arg Val Phe Tyr Gly

145 150 155 160

Asn Ser Asp Arg Thr Ser Thr Val Gln Asn Leu Leu Arg Pro Pro Ile

165 170 175

Ile Ser Arg Phe Ile Arg Leu Ile Pro Leu Gly Trp His Val Arg Ile

180 185 190

Ala Ile Arg Met Glu Leu Leu Glu Cys Val Ser Lys Cys Ala

195 200 205

<210> 6

<211> 675

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 6

atgtcacgca agatagaagg ctttttgtta ttacttctct ttggctatga agccacattg 60

ggattatcgt ctaccgagga tgaaggcgag gacccctggt accaaaaagc atgcaagtgc 120

gattgccaag gaggacccaa tgctctgtgg tctgcaggtg ccacctcctt ggactgtata 180

ccagaatgcc catatcacaa gcctctgggt ttcgagtcag gggaggtcac accggaccag 240

atcacctgct ctaacccgga gcagtatgtg ggctggtatt cttcgtggac tgcaaacaag 300

gcccggctca acagtcaagg ctttgggtgt gcctggctct ccaagttcca ggacagtagc 360

cagtggttac agatagatct gaaggagatc aaagtgattt cagggatcct cacccagggg 420

cgctgtgaca tcgatgagtg gatgaccaag tacagcgtgc agtacaggac cgatgagcgc 480

ctgaactgga tttactacaa ggaccagact ggaaacaacc gggtcttcta tggcaactcg 540

gaccgcacct ccacggttca gaacctgctg cggcccccca tcatctcccg cttcatccgc 600

ctcatcccgc tgggctggca cgtccgcatt gccatccgga tggagctgct ggagtgcgtc 660

agcaagtgtg cctga 675

<210> 7

<211> 52

<212> ДНК

<213> Mus musculus

<400> 7

atgccacaca agattgaagg cttcttcttg ttacttctct ttggctatga ag 52

<210> 8

<211> 623

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 8

ccacattggg attatcgtct accgaggatg aaggcgagga cccctggtac caaaaagcat 60

gcaagtgcga ttgccaagga ggacccaatg ctctgtggtc tgcaggtgcc acctccttgg 120

actgtatacc agaatgccca tatcacaagc ctctgggttt cgagtcaggg gaggtcacac 180

cggaccagat cacctgctct aacccggagc agtatgtggg ctggtattct tcgtggactg 240

caaacaaggc ccggctcaac agtcaaggct ttgggtgtgc ctggctctcc aagttccagg 300

acagtagcca gtggttacag atagatctga aggagatcaa agtgatttca gggatcctca 360

cccaggggcg ctgtgacatc gatgagtgga tgaccaagta cagcgtgcag tacaggaccg 420

atgagcgcct gaactggatt tactacaagg accagactgg aaacaaccgg gtcttctatg 480

gcaactcgga ccgcacctcc acggttcaga acctgctgcg gccccccatc atctcccgct 540

tcatccgcct catcccgctg ggctggcacg tccgcattgc catccggatg gagctgctgg 600

agtgcgtcag caagtgtgcc tga 623

<210> 9

<211> 623

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 9

ccacactggg cctgagcagc acagaagatg aaggcgagga cccctggtat cagaaagcct 60

gcaagtgcga ctgtcaaggc ggccctaatg ctctttggag cgctggcgct acaagcctgg 120

actgcatccc tgagtgcccc taccataagc ctctgggctt cgagagcggc gaagtgaccc 180

ctgaccagat cacctgtagc aaccccgagc agtacgtcgg ctggtactct agctggacag 240

ccaacaaggc cagactgaac agccaaggct tcggctgtgc ctggctgagc aagttccagg 300

actctagcca gtggctgcag atcgacctga aagagatcaa agtcatcagc ggcatcctga 360

cacagggcag atgcgacatc gacgagtgga tgaccaagta cagcgtgcag tacagaaccg 420

acgagagact gaactggatc tactacaagg accagaccgg caacaacaga gtgttctacg 480

gcaacagcga cagaaccagc accgtgcaga atctgctgag gcctcctatc atctccagat 540

tcatcagact gatccctctc ggctggcacg tgcggatcgc catcagaatg gaactgctgg 600

aatgcgtgtc caagtgcgcc tga 623

<210> 10

<211> 623

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 10

tcaggcgcac ttggacacgc attccagcag ttccattctg atggcgatcc gcacgtgcca 60

gccgagaggg atcagtctga tgaatctgga gatgatagga ggcctcagca gattctgcac 120

ggtgctggtt ctgtcgctgt tgccgtagaa cactctgttg ttgccggtct ggtccttgta 180

gtagatccag ttcagtctct cgtcggttct gtactgcacg ctgtacttgg tcatccactc 240

gtcgatgtcg catctgccct gtgtcaggat gccgctgatg actttgatct ctttcaggtc 300

gatctgcagc cactggctag agtcctggaa cttgctcagc caggcacagc cgaagccttg 360

gctgttcagt ctggccttgt tggctgtcca gctagagtac cagccgacgt actgctcggg 420

gttgctacag gtgatctggt caggggtcac ttcgccgctc tcgaagccca gaggcttatg 480

gtaggggcac tcagggatgc agtccaggct tgtagcgcca gcgctccaaa gagcattagg 540

gccgccttga cagtcgcact tgcaggcttt ctgataccag gggtcctcgc cttcatcttc 600

tgtgctgctc aggcccagtg tgg 623

<210> 11

<211> 675

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<220>

<221> прочий признак

<222> (1)..(52)

<223> Мышиная последовательность

<220>

<221> прочий признак

<222> (53)..(675)

<223> Человеческая последовательность

<400> 11

atgccacaca agattgaagg cttcttcttg ttacttctct ttggctatga agccacattg 60

ggattatcgt ctaccgagga tgaaggcgag gacccctggt accaaaaagc atgcaagtgc 120

gattgccaag gaggacccaa tgctctgtgg tctgcaggtg ccacctcctt ggactgtata 180

ccagaatgcc catatcacaa gcctctgggt ttcgagtcag gggaggtcac accggaccag 240

atcacctgct ctaacccgga gcagtatgtg ggctggtatt cttcgtggac tgcaaacaag 300

gcccggctca acagtcaagg ctttgggtgt gcctggctct ccaagttcca ggacagtagc 360

cagtggttac agatagatct gaaggagatc aaagtgattt cagggatcct cacccagggg 420

cgctgtgaca tcgatgagtg gatgaccaag tacagcgtgc agtacaggac cgatgagcgc 480

ctgaactgga tttactacaa ggaccagact ggaaacaacc gggtcttcta tggcaactcg 540

gaccgcacct ccacggttca gaacctgctg cggcccccca tcatctcccg cttcatccgc 600

ctcatcccgc tgggctggca cgtccgcatt gccatccgga tggagctgct ggagtgcgtc 660

agcaagtgtg cctga 675

<210> 12

<211> 675

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<220>

<221> прочий признак

<222> (1)..(52)

<223> Мышиная последовательность

<220>

<221> прочий признак

<222> (53)..(675)

<223> Человеческая последовательность

<400> 12

atgccacaca agattgaagg cttcttcttg ttacttctct ttggctatga agccacactg 60

ggcctgagca gcacagaaga tgaaggcgag gacccctggt atcagaaagc ctgcaagtgc 120

gactgtcaag gcggccctaa tgctctttgg agcgctggcg ctacaagcct ggactgcatc 180

cctgagtgcc cctaccataa gcctctgggc ttcgagagcg gcgaagtgac ccctgaccag 240

atcacctgta gcaaccccga gcagtacgtc ggctggtact ctagctggac agccaacaag 300

gccagactga acagccaagg cttcggctgt gcctggctga gcaagttcca ggactctagc 360

cagtggctgc agatcgacct gaaagagatc aaagtcatca gcggcatcct gacacagggc 420

agatgcgaca tcgacgagtg gatgaccaag tacagcgtgc agtacagaac cgacgagaga 480

ctgaactgga tctactacaa ggaccagacc ggcaacaaca gagtgttcta cggcaacagc 540

gacagaacca gcaccgtgca gaatctgctg aggcctccta tcatctccag attcatcaga 600

ctgatccctc tcggctggca cgtgcggatc gccatcagaa tggaactgct ggaatgcgtg 660

tccaagtgcg cctga 675

<210> 13

<211> 1073

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<220>

<221> прочий признак

<222> (1)..(224)

<223> Интрон с акцептором сплайсинга

<220>

<221> прочий признак

<222> (225)..(847)

<223> Последовательность RS1 человека

<220>

<221> прочий признак

<222> (848)..(1073)

<223> ПолиА bGH

<400> 13

ctataatgat gatcttgttc tttctgttta attttactgt ccctagcttc ttagcatctg 60

cggatgtttt tcctggcaga tatttactca ccatgacttc ttccagaagg ggtgttggta 120

gctttcatgt gactatttct atttcacttt tccatgtaac gagtgatgct gttggatttc 180

tctttcatta attagatttt ttctgtctca tccttttgct ttagccacat tgggattatc 240

gtctaccgag gatgaaggcg aggacccctg gtaccaaaaa gcatgcaagt gcgattgcca 300

aggaggaccc aatgctctgt ggtctgcagg tgccacctcc ttggactgta taccagaatg 360

cccatatcac aagcctctgg gtttcgagtc aggggaggtc acaccggacc agatcacctg 420

ctctaacccg gagcagtatg tgggctggta ttcttcgtgg actgcaaaca aggcccggct 480

caacagtcaa ggctttgggt gtgcctggct ctccaagttc caggacagta gccagtggtt 540

acagatagat ctgaaggaga tcaaagtgat ttcagggatc ctcacccagg ggcgctgtga 600

catcgatgag tggatgacca agtacagcgt gcagtacagg accgatgagc gcctgaactg 660

gatttactac aaggaccaga ctggaaacaa ccgggtcttc tatggcaact cggaccgcac 720

ctccacggtt cagaacctgc tgcggccccc catcatctcc cgcttcatcc gcctcatccc 780

gctgggctgg cacgtccgca ttgccatccg gatggagctg ctggagtgcg tcagcaagtg 840

tgcctgactg tgccttctag ttgccagcca tctgttgttt gcccctcccc cgtgccttcc 900

ttgaccctgg aaggtgccac tcccactgtc ctttcctaat aaaatgagga aattgcatcg 960

cattgtctga gtaggtgtca ttctattctg gggggtgggg tggggcagga cagcaagggg 1020

gaggattggg aagacaatag caggcatgct ggggatgcgg tgggctctat ggc 1073

<210> 14

<211> 1028

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<220>

<221> прочий признак

<222> (1)..(183)

<223> Интрон с акцептором сплайсинга

<220>

<221> прочий признак

<222> (184)..(806)

<223> RS1 человека, кодон-оптимизированный для мыши

<220>

<221> прочий признак

<222> (807)..(1028)

<223> ПолиА SV40

<400> 14

gctgtactgc accctgcttt gctatattaa tatattttcc ataattctat aagaaaaaac 60

aacagtcatt gccatccttt tcctccctcc agaatgagct ccttaatctc tatggcattg 120

ttttcatttt gccttctttc ctttcttaat ttcatttttt ccctctcttg ttcttttgct 180

cagccacact gggcctgagc agcacagaag atgaaggcga ggacccctgg tatcagaaag 240

cctgcaagtg cgactgtcaa ggcggcccta atgctctttg gagcgctggc gctacaagcc 300

tggactgcat ccctgagtgc ccctaccata agcctctggg cttcgagagc ggcgaagtga 360

cccctgacca gatcacctgt agcaaccccg agcagtacgt cggctggtac tctagctgga 420

cagccaacaa ggccagactg aacagccaag gcttcggctg tgcctggctg agcaagttcc 480

aggactctag ccagtggctg cagatcgacc tgaaagagat caaagtcatc agcggcatcc 540

tgacacaggg cagatgcgac atcgacgagt ggatgaccaa gtacagcgtg cagtacagaa 600

ccgacgagag actgaactgg atctactaca aggaccagac cggcaacaac agagtgttct 660

acggcaacag cgacagaacc agcaccgtgc agaatctgct gaggcctcct atcatctcca 720

gattcatcag actgatccct ctcggctggc acgtgcggat cgccatcaga atggaactgc 780

tggaatgcgt gtccaagtgc gcctgacaga catgataaga tacattgatg agtttggaca 840

aaccacaact agaatgcagt gaaaaaaatg ctttatttgt gaaatttgtg atgctattgc 900

tttatttgta accattataa gctgcaataa acaagttaac aacaacaatt gcattcattt 960

tatgtttcag gttcaggggg aggtgtggga ggttttttaa agcaagtaaa acctctacaa 1020

atgtggta 1028

<210> 15

<211> 224

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 15

ctataatgat gatcttgttc tttctgttta attttactgt ccctagcttc ttagcatctg 60

cggatgtttt tcctggcaga tatttactca ccatgacttc ttccagaagg ggtgttggta 120

gctttcatgt gactatttct atttcacttt tccatgtaac gagtgatgct gttggatttc 180

tctttcatta attagatttt ttctgtctca tccttttgct ttag 224

<210> 16

<211> 60

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 16

gatgctgttg gatttctctt tcattaatta gattttttct gtctcatcct tttgctttag 60

<210> 17

<211> 183

<212> ДНК

<213> Mus musculus

<400> 17

gctgtactgc accctgcttt gctatattaa tatattttcc ataattctat aagaaaaaac 60

aacagtcatt gccatccttt tcctccctcc agaatgagct ccttaatctc tatggcattg 120

ttttcatttt gccttctttc ctttcttaat ttcatttttt ccctctcttg ttcttttgct 180

cag 183

<210> 18

<211> 63

<212> ДНК

<213> Mus musculus

<400> 18

ttttcatttt gccttctttc ctttcttaat ttcatttttt ccctctcttg ttcttttgct 60

cag 63

<210> 19

<211> 183

<212> ДНК

<213> Mus musculus

<400> 19

ctgagcaaaa gaacaagaga gggaaaaaat gaaattaaga aaggaaagaa ggcaaaatga 60

aaacaatgcc atagagatta aggagctcat tctggaggga ggaaaaggat ggcaatgact 120

gttgtttttt cttatagaat tatggaaaat atattaatat agcaaagcag ggtgcagtac 180

agc 183

<210> 20

<211> 63

<212> ДНК

<213> Mus musculus

<400> 20

ctgagcaaaa gaacaagaga gggaaaaaat gaaattaaga aaggaaagaa ggcaaaatga 60

aaa 63

<210> 21

<211> 96

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 21

gttgaccagc tcggcggtga cctgcacgtc tagggcgcag tagtccaggg tttccttgat 60

gatgtcatac ttatcctgtc cctttttttt ccacag 96

<210> 22

<211> 226

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 22

ctgtgccttc tagttgccag ccatctgttg tttgcccctc ccccgtgcct tccttgaccc 60

tggaaggtgc cactcccact gtcctttcct aataaaatga ggaaattgca tcgcattgtc 120

tgagtaggtg tcattctatt ctggggggtg gggtggggca ggacagcaag ggggaggatt 180

gggaagacaa tagcaggcat gctggggatg cggtgggctc tatggc 226

<210> 23

<211> 222

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 23

cagacatgat aagatacatt gatgagtttg gacaaaccac aactagaatg cagtgaaaaa 60

aatgctttat ttgtgaaatt tgtgatgcta ttgctttatt tgtaaccatt ataagctgca 120

ataaacaagt taacaacaac aattgcattc attttatgtt tcaggttcag ggggaggtgt 180

gggaggtttt ttaaagcaag taaaacctct acaaatgtgg ta 222

<210> 24

<211> 222

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 24

taccacattt gtagaggttt tacttgcttt aaaaaacctc ccacacctcc ccctgaacct 60

gaaacataaa atgaatgcaa ttgttgttgt taacttgttt attgcagctt ataatggtta 120

caaataaagc aatagcatca caaatttcac aaataaagca tttttttcac tgcattctag 180

ttgtggtttg tccaaactca tcaatgtatc ttatcatgtc tg 222

<210> 25

<211> 2094

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 25

tgcctgcctc agctcggcgc ctgccagggg gtgactggca cagagcgggc cgtaggggac 60

cccctcacac accaccgaga tggacagggc tatatttcgc aaagcaattg taactgcagt 120

gctgggtaga taattttttt ttttttaaga tatagctttc tgatttcaat gaaataaaaa 180

tgaacttatt ccccactcag ggccagagaa agtcagaaca aagaaaatgt ccccgaaacg 240

aattttctta caaaagccta agtagcaggg gtaattttct gctcattttt tgtctcagtg 300

atactgtgaa aggtgcagtc tcaggggaac acaaagcagc cctgataatt tgaaaattca 360

tttgctttac cacattcaag acagaaacat acagtttcct aaagcctggc tttgaatgca 420

gaagggagca gctcctccta gttaagtttc cactaaatca tcgccaaaga ggacttcaga 480

gccctgggga ggcagctgag ggtctcaagg gtgactgggt ggcagggatg agtgcggtgg 540

gtgagaatcc cggtgccctg agaggctata cgtgacaaat gaccaaaagc ccaaggtagg 600

ggagtttcct ctgctcacag ttcttacctt caaggcggat ctgggcttcc accctcatga 660

acacagggat tggggaggga ccagagcgcc caatacacac agctccatta tgcaatccat 720

tccagcaaat tccccgtgtc tgtggtcacc atttaggtga tcatacagga caggctgcac 780

atctcagtat atgtagggac cccaaatgac cacaacacag tacaattgcc ctttacctag 840

ggctaccatt tcctagcaaa ccaaacatag ttcgagaaca gctggcccag gagctaccac 900

tggctactca gaggaggctc attagctggc tacatgcttc gcaggaagtg ggaaggactc 960

acatcataaa aaggaccatg tagctttttc cctgaaagct tctcaccctc caccctctgc 1020

cttgcaatac gcaaactgcg cctgctcctg aaaagctctc tgggaaggaa tgggcctggc 1080

tttccgttcc tggaggcggc gccttagatt gggaggcctc attggccact tagagcgcag 1140

cctgagtttc caggcccctt cctgggagag gctgttaaca cgggggaggg gcaggagagg 1200

gatatggaga gcaggtggtg gaatcagagg acgaggctgc tctaaagact gttctggccc 1260

cagacacagg gtagtctttg ctagcagctc atttccgagt tacttttcat tttcaaatgc 1320

caaggcaagt gactagactc gcgctaatac agtgctggac aacacattca ccttttctgt 1380

gaacaggcag ccttctaaaa gccccaaaca tccttcttga tgctttgggg gctcaattat 1440

tttatatcca acccagcatc tttctagtcc ctatgctgta tgcttgaact tcggaaaatg 1500

cttttccccg cccaatcttc tctcaaatat aaacacatca cacagggtgt tgggggtggg 1560

gggggggggt ggggggactt atccctggcc ttaggacaca ggacaaatct attttggata 1620

gaaatgcctg aacagagacc cttatttgga aaggtgaatt aactttggtc acgacatgga 1680

ctgtcagaca aaatggcagt atcctaagag ttaaggcaca tcaaacacag gagtcgagag 1740

agtgcagttc agggaaaaag gagaggagga aacagtgagg cagggagaaa ggctttccaa 1800

ataagagttc atgttggaaa cttttgtcac ggctttattg agattaagtt cacatacaat 1860

ttgtatccat ttaaagtata caatttgatg acttttggta tattcagagt tgtgcaacca 1920

ttatcactag atcaatttta gaaagtttat caccccaaag agaaatcctg cacccatcag 1980

ccaacactcc ccaacccatc ggccacccca agccctctgc aaccacgaat cgactgtctc 2040

tgtagattgg ccttctggac gttctacata aatgaaatca tatagtatgt ggta 2094

<210> 26

<211> 4176

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 26

atggacaagc ccaagaaaaa gcggaaagtg aagtacagca tcggcctgga catcggcacc 60

aactctgtgg gctgggccgt gatcaccgac gagtacaagg tgcccagcaa gaaattcaag 120

gtgctgggca acaccgacag gcacagcatc aagaagaacc tgatcggcgc cctgctgttc 180

gacagcggcg aaacagccga ggccaccaga ctgaagagaa ccgccagaag aagatacacc 240

aggcggaaga acaggatctg ctatctgcaa gagatcttca gcaacgagat ggccaaggtg 300

gacgacagct tcttccacag actggaagag tccttcctgg tggaagagga caagaagcac 360

gagagacacc ccatcttcgg caacatcgtg gacgaggtgg cctaccacga gaagtacccc 420

accatctacc acctgagaaa gaaactggtg gacagcaccg acaaggccga cctgagactg 480

atctacctgg ccctggccca catgatcaag ttcagaggcc acttcctgat cgagggcgac 540

ctgaaccccg acaacagcga cgtggacaag ctgttcatcc agctggtgca gacctacaac 600

cagctgttcg aggaaaaccc catcaacgcc agcggcgtgg acgccaaggc tatcctgtct 660

gccagactga gcaagagcag aaggctggaa aatctgatcg cccagctgcc cggcgagaag 720

aagaacggcc tgttcggcaa cctgattgcc ctgagcctgg gcctgacccc caacttcaag 780

agcaacttcg acctggccga ggatgccaaa ctgcagctga gcaaggacac ctacgacgac 840

gacctggaca acctgctggc ccagatcggc gaccagtacg ccgacctgtt cctggccgcc 900

aagaacctgt ctgacgccat cctgctgagc gacatcctga gagtgaacac cgagatcacc 960

aaggcccccc tgagcgcctc tatgatcaag agatacgacg agcaccacca ggacctgacc 1020

ctgctgaaag ctctcgtgcg gcagcagctg cctgagaagt acaaagaaat cttcttcgac 1080

cagagcaaga acggctacgc cggctacatc gatggcggcg ctagccagga agagttctac 1140

aagttcatca agcccatcct ggaaaagatg gacggcaccg aggaactgct cgtgaagctg 1200

aacagagagg acctgctgag aaagcagaga accttcgaca acggcagcat cccccaccag 1260

atccacctgg gagagctgca cgctatcctg agaaggcagg aagattttta cccattcctg 1320

aaggacaacc gggaaaagat cgagaagatc ctgaccttca ggatccccta ctacgtgggc 1380

cccctggcca gaggcaacag cagattcgcc tggatgacca gaaagagcga ggaaaccatc 1440

accccctgga acttcgagga agtggtggac aagggcgcca gcgcccagag cttcatcgag 1500

agaatgacaa acttcgataa gaacctgccc aacgagaagg tgctgcccaa gcacagcctg 1560

ctgtacgagt acttcaccgt gtacaacgag ctgaccaaag tgaaatacgt gaccgaggga 1620

atgagaaagc ccgccttcct gagcggcgag cagaaaaagg ccatcgtgga cctgctgttc 1680

aagaccaaca gaaaagtgac cgtgaagcag ctgaaagagg actacttcaa gaaaatcgag 1740

tgcttcgact ccgtggaaat ctccggcgtg gaagatagat tcaacgcctc cctgggcaca 1800

taccacgatc tgctgaaaat tatcaaggac aaggacttcc tggataacga agagaacgag 1860

gacattctgg aagatatcgt gctgaccctg acactgtttg aggaccgcga gatgatcgag 1920

gaaaggctga aaacctacgc tcacctgttc gacgacaaag tgatgaagca gctgaagaga 1980

aggcggtaca ccggctgggg caggctgagc agaaagctga tcaacggcat cagagacaag 2040

cagagcggca agacaatcct ggatttcctg aagtccgacg gcttcgccaa ccggaacttc 2100

atgcagctga tccacgacga cagcctgaca ttcaaagagg acatccagaa agcccaggtg 2160

tccggccagg gcgactctct gcacgagcat atcgctaacc tggccggcag ccccgctatc 2220

aagaagggca tcctgcagac agtgaaggtg gtggacgagc tcgtgaaagt gatgggcaga 2280

cacaagcccg agaacatcgt gatcgagatg gctagagaga accagaccac ccagaaggga 2340

cagaagaact cccgcgagag gatgaagaga atcgaagagg gcatcaaaga gctgggcagc 2400

cagatcctga aagaacaccc cgtggaaaac acccagctgc agaacgagaa gctgtacctg 2460

tactacctgc agaatggccg ggatatgtac gtggaccagg aactggacat caacagactg 2520

tccgactacg atgtggacca tatcgtgcct cagagctttc tgaaggacga ctccatcgat 2580

aacaaagtgc tgactcggag cgacaagaac agaggcaaga gcgacaacgt gccctccgaa 2640

gaggtcgtga agaagatgaa gaactactgg cgacagctgc tgaacgccaa gctgattacc 2700

cagaggaagt tcgataacct gaccaaggcc gagagaggcg gcctgagcga gctggataag 2760

gccggcttca tcaagaggca gctggtggaa accagacaga tcacaaagca cgtggcacag 2820

atcctggact cccggatgaa cactaagtac gacgaaaacg ataagctgat ccgggaagtg 2880

aaagtgatca ccctgaagtc caagctggtg tccgatttcc ggaaggattt ccagttttac 2940

aaagtgcgcg agatcaacaa ctaccaccac gcccacgacg cctacctgaa cgccgtcgtg 3000

ggaaccgccc tgatcaaaaa gtaccctaag ctggaaagcg agttcgtgta cggcgactac 3060

aaggtgtacg acgtgcggaa gatgatcgcc aagagcgagc aggaaatcgg caaggctacc 3120

gccaagtact tcttctacag caacatcatg aactttttca agaccgaaat caccctggcc 3180

aacggcgaga tcagaaagcg ccctctgatc gagacaaacg gcgaaaccgg ggagatcgtg 3240

tgggataagg gcagagactt cgccacagtg cgaaaggtgc tgagcatgcc ccaagtgaat 3300

atcgtgaaaa agaccgaggt gcagacaggc ggcttcagca aagagtctat cctgcccaag 3360

aggaacagcg acaagctgat cgccagaaag aaggactggg accccaagaa gtacggcggc 3420

ttcgacagcc ctaccgtggc ctactctgtg ctggtggtgg ctaaggtgga aaagggcaag 3480

tccaagaaac tgaagagtgt gaaagagctg ctggggatca ccatcatgga aagaagcagc 3540

tttgagaaga accctatcga ctttctggaa gccaagggct acaaagaagt gaaaaaggac 3600

ctgatcatca agctgcctaa gtactccctg ttcgagctgg aaaacggcag aaagagaatg 3660

ctggcctctg ccggcgaact gcagaaggga aacgagctgg ccctgcctag caaatatgtg 3720

aacttcctgt acctggcctc ccactatgag aagctgaagg gcagccctga ggacaacgaa 3780

cagaaacagc tgtttgtgga acagcataag cactacctgg acgagatcat cgagcagatc 3840

agcgagttct ccaagagagt gatcctggcc gacgccaatc tggacaaggt gctgtctgcc 3900

tacaacaagc acagggacaa gcctatcaga gagcaggccg agaatatcat ccacctgttc 3960

accctgacaa acctgggcgc tcctgccgcc ttcaagtact ttgacaccac catcgaccgg 4020

aagaggtaca ccagcaccaa agaggtgctg gacgccaccc tgatccacca gagcatcacc 4080

ggcctgtacg agacaagaat cgacctgtct cagctgggag gcgacaagag acctgccgcc 4140

actaagaagg ccggacaggc caaaaagaag aagtga 4176

<210> 27

<211> 1391

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 27

Met Asp Lys Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Lys Tyr Ser Ile Gly Leu

1 5 10 15

Asp Ile Gly Thr Asn Ser Val Gly Trp Ala Val Ile Thr Asp Glu Tyr

20 25 30

Lys Val Pro Ser Lys Lys Phe Lys Val Leu Gly Asn Thr Asp Arg His

35 40 45

Ser Ile Lys Lys Asn Leu Ile Gly Ala Leu Leu Phe Asp Ser Gly Glu

50 55 60

Thr Ala Glu Ala Thr Arg Leu Lys Arg Thr Ala Arg Arg Arg Tyr Thr

65 70 75 80

Arg Arg Lys Asn Arg Ile Cys Tyr Leu Gln Glu Ile Phe Ser Asn Glu

85 90 95

Met Ala Lys Val Asp Asp Ser Phe Phe His Arg Leu Glu Glu Ser Phe

100 105 110

Leu Val Glu Glu Asp Lys Lys His Glu Arg His Pro Ile Phe Gly Asn

115 120 125

Ile Val Asp Glu Val Ala Tyr His Glu Lys Tyr Pro Thr Ile Tyr His

130 135 140

Leu Arg Lys Lys Leu Val Asp Ser Thr Asp Lys Ala Asp Leu Arg Leu

145 150 155 160

Ile Tyr Leu Ala Leu Ala His Met Ile Lys Phe Arg Gly His Phe Leu

165 170 175

Ile Glu Gly Asp Leu Asn Pro Asp Asn Ser Asp Val Asp Lys Leu Phe

180 185 190

Ile Gln Leu Val Gln Thr Tyr Asn Gln Leu Phe Glu Glu Asn Pro Ile

195 200 205

Asn Ala Ser Gly Val Asp Ala Lys Ala Ile Leu Ser Ala Arg Leu Ser

210 215 220

Lys Ser Arg Arg Leu Glu Asn Leu Ile Ala Gln Leu Pro Gly Glu Lys

225 230 235 240

Lys Asn Gly Leu Phe Gly Asn Leu Ile Ala Leu Ser Leu Gly Leu Thr

245 250 255

Pro Asn Phe Lys Ser Asn Phe Asp Leu Ala Glu Asp Ala Lys Leu Gln

260 265 270

Leu Ser Lys Asp Thr Tyr Asp Asp Asp Leu Asp Asn Leu Leu Ala Gln

275 280 285

Ile Gly Asp Gln Tyr Ala Asp Leu Phe Leu Ala Ala Lys Asn Leu Ser

290 295 300

Asp Ala Ile Leu Leu Ser Asp Ile Leu Arg Val Asn Thr Glu Ile Thr

305 310 315 320

Lys Ala Pro Leu Ser Ala Ser Met Ile Lys Arg Tyr Asp Glu His His

325 330 335

Gln Asp Leu Thr Leu Leu Lys Ala Leu Val Arg Gln Gln Leu Pro Glu

340 345 350

Lys Tyr Lys Glu Ile Phe Phe Asp Gln Ser Lys Asn Gly Tyr Ala Gly

355 360 365

Tyr Ile Asp Gly Gly Ala Ser Gln Glu Glu Phe Tyr Lys Phe Ile Lys

370 375 380

Pro Ile Leu Glu Lys Met Asp Gly Thr Glu Glu Leu Leu Val Lys Leu

385 390 395 400

Asn Arg Glu Asp Leu Leu Arg Lys Gln Arg Thr Phe Asp Asn Gly Ser

405 410 415

Ile Pro His Gln Ile His Leu Gly Glu Leu His Ala Ile Leu Arg Arg

420 425 430

Gln Glu Asp Phe Tyr Pro Phe Leu Lys Asp Asn Arg Glu Lys Ile Glu

435 440 445

Lys Ile Leu Thr Phe Arg Ile Pro Tyr Tyr Val Gly Pro Leu Ala Arg

450 455 460

Gly Asn Ser Arg Phe Ala Trp Met Thr Arg Lys Ser Glu Glu Thr Ile

465 470 475 480

Thr Pro Trp Asn Phe Glu Glu Val Val Asp Lys Gly Ala Ser Ala Gln

485 490 495

Ser Phe Ile Glu Arg Met Thr Asn Phe Asp Lys Asn Leu Pro Asn Glu

500 505 510

Lys Val Leu Pro Lys His Ser Leu Leu Tyr Glu Tyr Phe Thr Val Tyr

515 520 525

Asn Glu Leu Thr Lys Val Lys Tyr Val Thr Glu Gly Met Arg Lys Pro

530 535 540

Ala Phe Leu Ser Gly Glu Gln Lys Lys Ala Ile Val Asp Leu Leu Phe

545 550 555 560

Lys Thr Asn Arg Lys Val Thr Val Lys Gln Leu Lys Glu Asp Tyr Phe

565 570 575

Lys Lys Ile Glu Cys Phe Asp Ser Val Glu Ile Ser Gly Val Glu Asp

580 585 590

Arg Phe Asn Ala Ser Leu Gly Thr Tyr His Asp Leu Leu Lys Ile Ile

595 600 605

Lys Asp Lys Asp Phe Leu Asp Asn Glu Glu Asn Glu Asp Ile Leu Glu

610 615 620

Asp Ile Val Leu Thr Leu Thr Leu Phe Glu Asp Arg Glu Met Ile Glu

625 630 635 640

Glu Arg Leu Lys Thr Tyr Ala His Leu Phe Asp Asp Lys Val Met Lys

645 650 655

Gln Leu Lys Arg Arg Arg Tyr Thr Gly Trp Gly Arg Leu Ser Arg Lys

660 665 670

Leu Ile Asn Gly Ile Arg Asp Lys Gln Ser Gly Lys Thr Ile Leu Asp

675 680 685

Phe Leu Lys Ser Asp Gly Phe Ala Asn Arg Asn Phe Met Gln Leu Ile

690 695 700

His Asp Asp Ser Leu Thr Phe Lys Glu Asp Ile Gln Lys Ala Gln Val

705 710 715 720

Ser Gly Gln Gly Asp Ser Leu His Glu His Ile Ala Asn Leu Ala Gly

725 730 735

Ser Pro Ala Ile Lys Lys Gly Ile Leu Gln Thr Val Lys Val Val Asp

740 745 750

Glu Leu Val Lys Val Met Gly Arg His Lys Pro Glu Asn Ile Val Ile

755 760 765

Glu Met Ala Arg Glu Asn Gln Thr Thr Gln Lys Gly Gln Lys Asn Ser

770 775 780

Arg Glu Arg Met Lys Arg Ile Glu Glu Gly Ile Lys Glu Leu Gly Ser

785 790 795 800

Gln Ile Leu Lys Glu His Pro Val Glu Asn Thr Gln Leu Gln Asn Glu

805 810 815

Lys Leu Tyr Leu Tyr Tyr Leu Gln Asn Gly Arg Asp Met Tyr Val Asp

820 825 830

Gln Glu Leu Asp Ile Asn Arg Leu Ser Asp Tyr Asp Val Asp His Ile

835 840 845

Val Pro Gln Ser Phe Leu Lys Asp Asp Ser Ile Asp Asn Lys Val Leu

850 855 860

Thr Arg Ser Asp Lys Asn Arg Gly Lys Ser Asp Asn Val Pro Ser Glu

865 870 875 880

Glu Val Val Lys Lys Met Lys Asn Tyr Trp Arg Gln Leu Leu Asn Ala

885 890 895

Lys Leu Ile Thr Gln Arg Lys Phe Asp Asn Leu Thr Lys Ala Glu Arg

900 905 910

Gly Gly Leu Ser Glu Leu Asp Lys Ala Gly Phe Ile Lys Arg Gln Leu

915 920 925

Val Glu Thr Arg Gln Ile Thr Lys His Val Ala Gln Ile Leu Asp Ser

930 935 940

Arg Met Asn Thr Lys Tyr Asp Glu Asn Asp Lys Leu Ile Arg Glu Val

945 950 955 960

Lys Val Ile Thr Leu Lys Ser Lys Leu Val Ser Asp Phe Arg Lys Asp

965 970 975

Phe Gln Phe Tyr Lys Val Arg Glu Ile Asn Asn Tyr His His Ala His

980 985 990

Asp Ala Tyr Leu Asn Ala Val Val Gly Thr Ala Leu Ile Lys Lys Tyr

995 1000 1005

Pro Lys Leu Glu Ser Glu Phe Val Tyr Gly Asp Tyr Lys Val Tyr

1010 1015 1020

Asp Val Arg Lys Met Ile Ala Lys Ser Glu Gln Glu Ile Gly Lys

1025 1030 1035

Ala Thr Ala Lys Tyr Phe Phe Tyr Ser Asn Ile Met Asn Phe Phe

1040 1045 1050

Lys Thr Glu Ile Thr Leu Ala Asn Gly Glu Ile Arg Lys Arg Pro

1055 1060 1065

Leu Ile Glu Thr Asn Gly Glu Thr Gly Glu Ile Val Trp Asp Lys

1070 1075 1080

Gly Arg Asp Phe Ala Thr Val Arg Lys Val Leu Ser Met Pro Gln

1085 1090 1095

Val Asn Ile Val Lys Lys Thr Glu Val Gln Thr Gly Gly Phe Ser

1100 1105 1110

Lys Glu Ser Ile Leu Pro Lys Arg Asn Ser Asp Lys Leu Ile Ala

1115 1120 1125

Arg Lys Lys Asp Trp Asp Pro Lys Lys Tyr Gly Gly Phe Asp Ser

1130 1135 1140

Pro Thr Val Ala Tyr Ser Val Leu Val Val Ala Lys Val Glu Lys

1145 1150 1155

Gly Lys Ser Lys Lys Leu Lys Ser Val Lys Glu Leu Leu Gly Ile

1160 1165 1170

Thr Ile Met Glu Arg Ser Ser Phe Glu Lys Asn Pro Ile Asp Phe

1175 1180 1185

Leu Glu Ala Lys Gly Tyr Lys Glu Val Lys Lys Asp Leu Ile Ile

1190 1195 1200

Lys Leu Pro Lys Tyr Ser Leu Phe Glu Leu Glu Asn Gly Arg Lys

1205 1210 1215

Arg Met Leu Ala Ser Ala Gly Glu Leu Gln Lys Gly Asn Glu Leu

1220 1225 1230

Ala Leu Pro Ser Lys Tyr Val Asn Phe Leu Tyr Leu Ala Ser His

1235 1240 1245

Tyr Glu Lys Leu Lys Gly Ser Pro Glu Asp Asn Glu Gln Lys Gln

1250 1255 1260

Leu Phe Val Glu Gln His Lys His Tyr Leu Asp Glu Ile Ile Glu

1265 1270 1275

Gln Ile Ser Glu Phe Ser Lys Arg Val Ile Leu Ala Asp Ala Asn

1280 1285 1290

Leu Asp Lys Val Leu Ser Ala Tyr Asn Lys His Arg Asp Lys Pro

1295 1300 1305

Ile Arg Glu Gln Ala Glu Asn Ile Ile His Leu Phe Thr Leu Thr

1310 1315 1320

Asn Leu Gly Ala Pro Ala Ala Phe Lys Tyr Phe Asp Thr Thr Ile

1325 1330 1335

Asp Arg Lys Arg Tyr Thr Ser Thr Lys Glu Val Leu Asp Ala Thr

1340 1345 1350

Leu Ile His Gln Ser Ile Thr Gly Leu Tyr Glu Thr Arg Ile Asp

1355 1360 1365

Leu Ser Gln Leu Gly Gly Asp Lys Arg Pro Ala Ala Thr Lys Lys

1370 1375 1380

Ala Gly Gln Ala Lys Lys Lys Lys

1385 1390

<210> 28

<211> 4218

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 28

atggccccaa agaagaagcg gaaggtcggt atccacggag tcccagcagc cgacaagaag 60

tacagcatcg gcctggacat cggcaccaac tctgtgggct gggccgtgat caccgacgag 120

tacaaggtgc ccagcaagaa attcaaggtg ctgggcaaca ccgaccggca cagcatcaag 180

aagaacctga tcggagccct gctgttcgac agcggcgaaa cagccgaggc cacccggctg 240

aagagaaccg ccagaagaag atacaccaga cggaagaacc ggatctgcta tctgcaagag 300

atcttcagca acgagatggc caaggtggac gacagcttct tccacagact ggaagagtcc 360

ttcctggtgg aagaggacaa gaagcacgag agacacccca tcttcggcaa catcgtggac 420

gaggtggcct accacgagaa gtaccccacc atctaccacc tgagaaagaa actggtggac 480

agcaccgaca aggccgacct gagactgatc tacctggccc tggcccacat gatcaagttc 540

agaggccact tcctgatcga gggcgacctg aaccccgaca acagcgacgt ggacaagctg 600

ttcatccagc tggtgcagac ctacaaccag ctgttcgagg aaaaccccat caacgccagc 660

ggcgtggacg ccaaggctat cctgtctgcc agactgagca agagcagaag gctggaaaat 720

ctgatcgccc agctgcccgg cgagaagaag aacggcctgt tcggcaacct gattgccctg 780

agcctgggcc tgacccccaa cttcaagagc aacttcgacc tggccgagga tgccaaactg 840

cagctgagca aggacaccta cgacgacgac ctggacaacc tgctggccca gatcggcgac 900

cagtacgccg acctgttcct ggccgccaag aacctgtctg acgccatcct gctgagcgac 960

atcctgagag tgaacaccga gatcaccaag gcccccctga gcgcctctat gatcaagaga 1020

tacgacgagc accaccagga cctgaccctg ctgaaagctc tcgtgcggca gcagctgcct 1080

gagaagtaca aagaaatctt cttcgaccag agcaagaacg gctacgccgg ctacatcgat 1140

ggcggcgcta gccaggaaga gttctacaag ttcatcaagc ccatcctgga aaagatggac 1200

ggcaccgagg aactgctcgt gaagctgaac agagaggacc tgctgagaaa gcagagaacc 1260

ttcgacaacg gcagcatccc ccaccagatc cacctgggag agctgcacgc tatcctgaga 1320

aggcaggaag atttttaccc attcctgaag gacaaccggg aaaagatcga gaagatcctg 1380

accttcagga tcccctacta cgtgggcccc ctggccagag gcaacagcag attcgcctgg 1440

atgaccagaa agagcgagga aaccatcacc ccctggaact tcgaggaagt ggtggacaag 1500

ggcgccagcg cccagagctt catcgagaga atgacaaact tcgataagaa cctgcccaac 1560

gagaaggtgc tgcccaagca cagcctgctg tacgagtact tcaccgtgta caacgagctg 1620

accaaagtga aatacgtgac cgagggaatg agaaagcccg ccttcctgag cggcgagcag 1680

aaaaaggcca tcgtggacct gctgttcaag accaacagaa aagtgaccgt gaagcagctg 1740

aaagaggact acttcaagaa aatcgagtgc ttcgactccg tggaaatctc cggcgtggaa 1800

gatagattca acgcctccct gggcacatac cacgatctgc tgaaaattat caaggacaag 1860

gacttcctgg ataacgaaga gaacgaggac attctggaag atatcgtgct gaccctgaca 1920

ctgtttgagg accgcgagat gatcgaggaa aggctgaaaa cctacgctca cctgttcgac 1980

gacaaagtga tgaagcagct gaagagaagg cggtacaccg gctggggcag gctgagcaga 2040

aagctgatca acggcatcag agacaagcag agcggcaaga caatcctgga tttcctgaag 2100

tccgacggct tcgccaaccg gaacttcatg cagctgatcc acgacgacag cctgacattc 2160

aaagaggaca tccagaaagc ccaggtgtcc ggccagggcg actctctgca cgagcatatc 2220

gctaacctgg ccggcagccc cgctatcaag aagggcatcc tgcagacagt gaaggtggtg 2280

gacgagctcg tgaaagtgat gggcagacac aagcccgaga acatcgtgat cgagatggct 2340

agagagaacc agaccaccca gaagggacag aagaactccc gcgagaggat gaagagaatc 2400

gaagagggca tcaaagagct gggcagccag atcctgaaag aacaccccgt ggaaaacacc 2460

cagctgcaga acgagaagct gtacctgtac tacctgcaga atggccggga tatgtacgtg 2520

gaccaggaac tggacatcaa cagactgtcc gactacgatg tggaccatat cgtgcctcag 2580

agctttctga aggacgactc catcgataac aaagtgctga ctcggagcga caagaacaga 2640

ggcaagagcg acaacgtgcc ctccgaagag gtcgtgaaga agatgaagaa ctactggcga 2700

cagctgctga acgccaagct gattacccag aggaagttcg ataacctgac caaggccgag 2760

agaggcggcc tgagcgagct ggataaggcc ggcttcatca agaggcagct ggtggaaacc 2820

agacagatca caaagcacgt ggcacagatc ctggactccc ggatgaacac taagtacgac 2880

gaaaacgata agctgatccg ggaagtgaaa gtgatcaccc tgaagtccaa gctggtgtcc 2940

gatttccgga aggatttcca gttttacaaa gtgcgcgaga tcaacaacta ccaccacgcc 3000

cacgacgcct acctgaacgc cgtcgtggga accgccctga tcaaaaagta ccctaagctg 3060

gaaagcgagt tcgtgtacgg cgactacaag gtgtacgacg tgcggaagat gatcgccaag 3120

agcgagcagg aaatcggcaa ggctaccgcc aagtacttct tctacagcaa catcatgaac 3180

tttttcaaga ccgaaatcac cctggccaac ggcgagatca gaaagcgccc tctgatcgag 3240

acaaacggcg aaaccgggga gatcgtgtgg gataagggca gagacttcgc cacagtgcga 3300

aaggtgctga gcatgcccca agtgaatatc gtgaaaaaga ccgaggtgca gacaggcggc 3360

ttcagcaaag agtctatcct gcccaagagg aacagcgaca agctgatcgc cagaaagaag 3420

gactgggacc ccaagaagta cggcggcttc gacagcccta ccgtggccta ctctgtgctg 3480

gtggtggcta aggtggaaaa gggcaagtcc aagaaactga agagtgtgaa agagctgctg 3540

gggatcacca tcatggaaag aagcagcttt gagaagaacc ctatcgactt tctggaagcc 3600

aagggctaca aagaagtgaa aaaggacctg atcatcaagc tgcctaagta ctccctgttc 3660

gagctggaaa acggcagaaa gagaatgctg gcctctgccg gcgaactgca gaagggaaac 3720

gagctggccc tgcctagcaa atatgtgaac ttcctgtacc tggcctccca ctatgagaag 3780

ctgaagggca gccctgagga caacgaacag aaacagctgt ttgtggaaca gcataagcac 3840

tacctggacg agatcatcga gcagatcagc gagttctcca agagagtgat cctggccgac 3900

gccaatctgg acaaggtgct gtctgcctac aacaagcaca gggacaagcc tatcagagag 3960

caggccgaga atatcatcca cctgttcacc ctgacaaacc tgggcgctcc tgccgccttc 4020

aagtactttg acaccaccat cgaccggaag aggtacacca gcaccaaaga ggtgctggac 4080

gccaccctga tccaccagag catcaccggc ctgtacgaga caagaatcga cctgtctcag 4140

ctgggaggcg acaagagacc tgccgccact aagaaggccg gacaggccaa aaagaagaag 4200

tgagcggccg cttaatta 4218

<210> 29

<211> 16

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 29

guuuuagagc uaugcu 16

<210> 30

<211> 67

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 30

agcauagcaa guuaaaauaa ggcuaguccg uuaucaacuu gaaaaagugg caccgagucg 60

gugcuuu 67

<210> 31

<211> 72

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 31

aaacagcaua gcaaguuaaa auaaggcuag uccguuauca acuugaaaaa guggcaccga 60

gucggugcuu uu 72

<210> 32

<211> 82

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 32

guuggaacca uucaaaacag cauagcaagu uaaaauaagg cuaguccguu aucaacuuga 60

aaaaguggca ccgagucggu gc 82

<210> 33

<211> 77

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 33

guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc cguuaucaac uugaaaaagu 60

ggcaccgagu cggugcu 77

<210> 34

<211> 82

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 34

guuggaacca uucaaaacag cauagcaagu uaaaauaagg cuaguccguu aucaacuuga 60

aaaaguggca ccgagucggu gc 82

<210> 35

<211> 76

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 35

guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc cguuaucaac uugaaaaagu 60

ggcaccgagu cggugc 76

<210> 36

<211> 86

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 36

guuuaagagc uaugcuggaa acagcauagc aaguuuaaau aaggcuaguc cguuaucaac 60

uugaaaaagu ggcaccgagu cggugc 86

<210> 37

<211> 83

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 37

guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc cguuaucaac uugaaaaagu 60

ggcaccgagu cggugcuuuu uuu 83

<210> 38

<211> 80

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 38

guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc cguuaucaac uugaaaaagu 60

ggcaccgagu cggugcuuuu 80

<210> 39

<211> 92

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 39

guuuaagagc uaugcuggaa acagcauagc aaguuuaaau aaggcuaguc cguuaucaac 60

uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uu 92

<210> 40

<211> 23

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<220>

<221> прочий признак

<222> (2)..(21)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<400> 40

gnnnnnnnnn nnnnnnnnnn ngg 23

<210> 41

<211> 23

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<220>

<221> прочий признак

<222> (1)..(21)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<400> 41

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn ngg 23

<210> 42

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<220>

<221> прочий признак

<222> (3)..(23)

<223> n представляет собой a, c, g или t

<400> 42

ggnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnngg 25

<210> 43

<211> 103

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 43

gagcacggaa cgaccugagu guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60

cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uuu 103

<210> 44

<211> 100

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<220>

<221> прочий признак

<222> (1)..(20)

<223> n представляет собой a, c, g или u

<400> 44

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60

cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100

<210> 45

<211> 3519

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<220>

<221> прочий признак

<222> (1)..(141)

<223> ITR

<220>

<221> прочий признак

<222> (156)..(178)

<223> Последовательность-мишень гидовой РНК плюс PAM

<220>

<221> прочий признак

<222> (179)..(274)

<223> Акцептор сплайсинга

<220>

<221> прочий признак

<222> (275)..(897)

<223> RS1 человека

<220>

<221> прочий признак

<222> (898)..(2991)

<223> Область ПолиА RS1 человека

<220>

<221> прочий признак

<222> (2992)..(3240)

<223> U6

<220>

<221> прочий признак

<222> (3241)..(3260)

<223> Гидовая последовательность

<220>

<221> прочий признак

<222> (3261)..(3343)

<223> Каркас гидовой РНК

<220>

<221> прочий признак

<222> (3344)..(3366)

<223> Последовательность-мишень гидовой РНК плюс PAM

<220>

<221> прочий признак

<222> (3379)..(3519)

<223> ITR

<400> 45

cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc 60

gggcgacctt tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggcca 120

actccatcac taggggttcc tgcgctagct gtacacctac tcaggtcgtt ccgtgctcgt 180

tgaccagctc ggcggtgacc tgcacgtcta gggcgcagta gtccagggtt tccttgatga 240

tgtcatactt atcctgtccc ttttttttcc acagccacat tgggattatc gtctaccgag 300

gatgaaggcg aggacccctg gtaccaaaaa gcatgcaagt gcgattgcca aggaggaccc 360

aatgctctgt ggtctgcagg tgccacctcc ttggactgta taccagaatg cccatatcac 420

aagcctctgg gtttcgagtc aggggaggtc acaccggacc agatcacctg ctctaacccg 480

gagcagtatg tgggctggta ttcttcgtgg actgcaaaca aggcccggct caacagtcaa 540

ggctttgggt gtgcctggct ctccaagttc caggacagta gccagtggtt acagatagat 600

ctgaaggaga tcaaagtgat ttcagggatc ctcacccagg ggcgctgtga catcgatgag 660

tggatgacca agtacagcgt gcagtacagg accgatgagc gcctgaactg gatttactac 720

aaggaccaga ctggaaacaa ccgggtcttc tatggcaact cggaccgcac ctccacggtt 780

cagaacctgc tgcggccccc catcatctcc cgcttcatcc gcctcatccc gctgggctgg 840

cacgtccgca ttgccatccg gatggagctg ctggagtgcg tcagcaagtg tgcctgatgc 900

ctgcctcagc tcggcgcctg ccagggggtg actggcacag agcgggccgt aggggacccc 960

ctcacacacc accgagatgg acagggctat atttcgcaaa gcaattgtaa ctgcagtgct 1020

gggtagataa tttttttttt tttaagatat agctttctga tttcaatgaa ataaaaatga 1080

acttattccc cactcagggc cagagaaagt cagaacaaag aaaatgtccc cgaaacgaat 1140

tttcttacaa aagcctaagt agcaggggta attttctgct cattttttgt ctcagtgata 1200

ctgtgaaagg tgcagtctca ggggaacaca aagcagccct gataatttga aaattcattt 1260

gctttaccac attcaagaca gaaacataca gtttcctaaa gcctggcttt gaatgcagaa 1320

gggagcagct cctcctagtt aagtttccac taaatcatcg ccaaagagga cttcagagcc 1380

ctggggaggc agctgagggt ctcaagggtg actgggtggc agggatgagt gcggtgggtg 1440

agaatcccgg tgccctgaga ggctatacgt gacaaatgac caaaagccca aggtagggga 1500

gtttcctctg ctcacagttc ttaccttcaa ggcggatctg ggcttccacc ctcatgaaca 1560

cagggattgg ggagggacca gagcgcccaa tacacacagc tccattatgc aatccattcc 1620

agcaaattcc ccgtgtctgt ggtcaccatt taggtgatca tacaggacag gctgcacatc 1680

tcagtatatg tagggacccc aaatgaccac aacacagtac aattgccctt tacctagggc 1740

taccatttcc tagcaaacca aacatagttc gagaacagct ggcccaggag ctaccactgg 1800

ctactcagag gaggctcatt agctggctac atgcttcgca ggaagtggga aggactcaca 1860

tcataaaaag gaccatgtag ctttttccct gaaagcttct caccctccac cctctgcctt 1920

gcaatacgca aactgcgcct gctcctgaaa agctctctgg gaaggaatgg gcctggcttt 1980

ccgttcctgg aggcggcgcc ttagattggg aggcctcatt ggccacttag agcgcagcct 2040

gagtttccag gccccttcct gggagaggct gttaacacgg gggaggggca ggagagggat 2100

atggagagca ggtggtggaa tcagaggacg aggctgctct aaagactgtt ctggccccag 2160

acacagggta gtctttgcta gcagctcatt tccgagttac ttttcatttt caaatgccaa 2220

ggcaagtgac tagactcgcg ctaatacagt gctggacaac acattcacct tttctgtgaa 2280

caggcagcct tctaaaagcc ccaaacatcc ttcttgatgc tttgggggct caattatttt 2340

atatccaacc cagcatcttt ctagtcccta tgctgtatgc ttgaacttcg gaaaatgctt 2400

ttccccgccc aatcttctct caaatataaa cacatcacac agggtgttgg gggtgggggg 2460

ggggggtggg gggacttatc cctggcctta ggacacagga caaatctatt ttggatagaa 2520

atgcctgaac agagaccctt atttggaaag gtgaattaac tttggtcacg acatggactg 2580

tcagacaaaa tggcagtatc ctaagagtta aggcacatca aacacaggag tcgagagagt 2640

gcagttcagg gaaaaaggag aggaggaaac agtgaggcag ggagaaaggc tttccaaata 2700

agagttcatg ttggaaactt ttgtcacggc tttattgaga ttaagttcac atacaatttg 2760

tatccattta aagtatacaa tttgatgact tttggtatat tcagagttgt gcaaccatta 2820

tcactagatc aattttagaa agtttatcac cccaaagaga aatcctgcac ccatcagcca 2880

acactcccca acccatcggc caccccaagc cctctgcaac cacgaatcga ctgtctctgt 2940

agattggcct tctggacgtt ctacataaat gaaatcatat agtatgtggt agagggccta 3000

tttcccatga ttccttcata tttgcatata cgatacaagg ctgttagaga gataattgga 3060

attaatttga ctgtaaacac aaagatatta gtacaaaata cgtgacgtag aaagtaataa 3120

tttcttgggt agtttgcagt tttaaaatta tgttttaaaa tggactatca tatgcttacc 3180

gtaacttgaa agtatttcga tttcttggct ttatatatct tgtggaaagg acgaaacacc 3240

gagcacggaa cgacctgagt gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggctagtc 3300

cgttatcaac ttgaaaaagt ggcaccgagt cggtgctttt tttcctactc aggtcgttcc 3360

gtgctctcta gaggccgcag gaacccctag tgatggagtt ggccactccc tctctgcgcg 3420

ctcgctcgct cactgaggcc gggcgaccaa aggtcgcccg acgcccgggc tttgcccggg 3480

cggcctcagt gagcgagcga gcgcgcagct gcctgcagg 3519

<210> 46

<211> 2455

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<220>

<221> прочий признак

<222> (1)..(161)

<223> ITR

<220>

<221> прочий признак

<222> (168)..(227)

<223> Акцептор сплайсинга

<220>

<221> прочий признак

<222> (228)..(850)

<223> RS1 человека

<220>

<221> прочий признак

<222> (851)..(1076)

<223> ПолиА bGH

<220>

<221> прочий признак

<222> (1077)..(1325)

<223> U6

<220>

<221> прочий признак

<222> (1326)..(1345)

<223> Гидовая последовательность

<220>

<221> прочий признак

<222> (1346)..(1428)

<223> Каркас гидовой РНК

<220>

<221> прочий признак

<222> (1429)..(1650)

<223> Обратный комплемент полиА SV40

<220>

<221> прочий признак

<222> (1651)..(2273)

<223> Обратный комплемент кодон-оптимизированного hRS1

<220>

<221> прочий признак

<222> (2274)..(2336)

<223> Обратный комплемент акцептора сплайсинга

<220>

<221> прочий признак

<222> (2344)..(2455)

<223> ITR

<400> 46

ggccactccc tctctgcgcg ctcgctcgct cactgaggcc gggcgaccaa aggtcgcccg 60

acgcccgggc tttgcccggg cggcctcagt gagcgagcga gcgcgcagag agggagtggc 120

caactccatc actaggggtt cctggagggg tggagtcgtg acctagggat gctgttggat 180

ttctctttca ttaattagat tttttctgtc tcatcctttt gctttagcca cattgggatt 240

atcgtctacc gaggatgaag gcgaggaccc ctggtaccaa aaagcatgca agtgcgattg 300

ccaaggagga cccaatgctc tgtggtctgc aggtgccacc tccttggact gtataccaga 360

atgcccatat cacaagcctc tgggtttcga gtcaggggag gtcacaccgg accagatcac 420

ctgctctaac ccggagcagt atgtgggctg gtattcttcg tggactgcaa acaaggcccg 480

gctcaacagt caaggctttg ggtgtgcctg gctctccaag ttccaggaca gtagccagtg 540

gttacagata gatctgaagg agatcaaagt gatttcaggg atcctcaccc aggggcgctg 600

tgacatcgat gagtggatga ccaagtacag cgtgcagtac aggaccgatg agcgcctgaa 660

ctggatttac tacaaggacc agactggaaa caaccgggtc ttctatggca actcggaccg 720

cacctccacg gttcagaacc tgctgcggcc ccccatcatc tcccgcttca tccgcctcat 780

cccgctgggc tggcacgtcc gcattgccat ccggatggag ctgctggagt gcgtcagcaa 840

gtgtgcctga ctgtgccttc tagttgccag ccatctgttg tttgcccctc ccccgtgcct 900

tccttgaccc tggaaggtgc cactcccact gtcctttcct aataaaatga ggaaattgca 960

tcgcattgtc tgagtaggtg tcattctatt ctggggggtg gggtggggca ggacagcaag 1020

ggggaggatt gggaagacaa tagcaggcat gctggggatg cggtgggctc tatggcgagg 1080

gcctatttcc catgattcct tcatatttgc atatacgata caaggctgtt agagagataa 1140

ttggaattaa tttgactgta aacacaaaga tattagtaca aaatacgtga cgtagaaagt 1200

aataatttct tgggtagttt gcagttttaa aattatgttt taaaatggac tatcatatgc 1260

ttaccgtaac ttgaaagtat ttcgatttct tggctttata tatcttgtgg aaaggacgaa 1320

acaccgagca cggaacgacc tgagtgtttt agagctagaa atagcaagtt aaaataaggc 1380

tagtccgtta tcaacttgaa aaagtggcac cgagtcggtg ctttttttta ccacatttgt 1440

agaggtttta cttgctttaa aaaacctccc acacctcccc ctgaacctga aacataaaat 1500

gaatgcaatt gttgttgtta acttgtttat tgcagcttat aatggttaca aataaagcaa 1560

tagcatcaca aatttcacaa ataaagcatt tttttcactg cattctagtt gtggtttgtc 1620

caaactcatc aatgtatctt atcatgtctg tcaggcgcac ttggacacgc attccagcag 1680

ttccattctg atggcgatcc gcacgtgcca gccgagaggg atcagtctga tgaatctgga 1740

gatgatagga ggcctcagca gattctgcac ggtgctggtt ctgtcgctgt tgccgtagaa 1800

cactctgttg ttgccggtct ggtccttgta gtagatccag ttcagtctct cgtcggttct 1860

gtactgcacg ctgtacttgg tcatccactc gtcgatgtcg catctgccct gtgtcaggat 1920

gccgctgatg actttgatct ctttcaggtc gatctgcagc cactggctag agtcctggaa 1980

cttgctcagc caggcacagc cgaagccttg gctgttcagt ctggccttgt tggctgtcca 2040

gctagagtac cagccgacgt actgctcggg gttgctacag gtgatctggt caggggtcac 2100

ttcgccgctc tcgaagccca gaggcttatg gtaggggcac tcagggatgc agtccaggct 2160

tgtagcgcca gcgctccaaa gagcattagg gccgccttga cagtcgcact tgcaggcttt 2220

ctgataccag gggtcctcgc cttcatcttc tgtgctgctc aggcccagtg tggctgagca 2280

aaagaacaag agagggaaaa aatgaaatta agaaaggaaa gaaggcaaaa tgaaaagcta 2340

gtccactccc tctctgcgcg ctcgctcgct cactgaggcc gggcgaccaa aggtcgcccg 2400

acgcccgggc tttgcccggg cggcctcagt gagcgagcga gcgcgcagag aggga 2455

<210> 47

<211> 2763

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<220>

<221> прочий признак

<222> (1)..(141)

<223> ITR

<220>

<221> прочий признак

<222> (156)..(379)

<223> Акцептор сплайсинга

<220>

<221> прочий признак

<222> (380)..(1002)

<223> RS1 человека

<220>

<221> прочий признак

<222> (1003)..(1228)

<223> ПолиА bGH

<220>

<221> прочий признак

<222> (1229)..(1477)

<223> U6

<220>

<221> прочий признак

<222> (1478)..(1497)

<223> Гидовая последовательность

<220>

<221> прочий признак

<222> (1498)..(1574)

<223> Каркас гидовой РНК

<220>

<221> прочий признак

<222> (1575)..(1802)

<223> Обратный комплемент полиА SV40

<220>

<221> прочий признак

<222> (1803)..(2425)

<223> Обратный комплемент кодон-оптимизированного RS1 человека

<220>

<221> прочий признак

<222> (2426)..(2608)

<223> Акцептор сплайсинга

<220>

<221> прочий признак

<222> (2609)..(2763)

<223> ITR

<400> 47

cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc 60

gggcgacctt tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggcca 120

actccatcac taggggttcc tgcgctagct gtacactata atgatgatct tgttctttct 180

gtttaatttt actgtcccta gcttcttagc atctgcggat gtttttcctg gcagatattt 240

actcaccatg acttcttcca gaaggggtgt tggtagcttt catgtgacta tttctatttc 300

acttttccat gtaacgagtg atgctgttgg atttctcttt cattaattag attttttctg 360

tctcatcctt ttgctttagc cacattggga ttatcgtcta ccgaggatga aggcgaggac 420

ccctggtacc aaaaagcatg caagtgcgat tgccaaggag gacccaatgc tctgtggtct 480

gcaggtgcca cctccttgga ctgtatacca gaatgcccat atcacaagcc tctgggtttc 540

gagtcagggg aggtcacacc ggaccagatc acctgctcta acccggagca gtatgtgggc 600

tggtattctt cgtggactgc aaacaaggcc cggctcaaca gtcaaggctt tgggtgtgcc 660

tggctctcca agttccagga cagtagccag tggttacaga tagatctgaa ggagatcaaa 720

gtgatttcag ggatcctcac ccaggggcgc tgtgacatcg atgagtggat gaccaagtac 780

agcgtgcagt acaggaccga tgagcgcctg aactggattt actacaagga ccagactgga 840

aacaaccggg tcttctatgg caactcggac cgcacctcca cggttcagaa cctgctgcgg 900

ccccccatca tctcccgctt catccgcctc atcccgctgg gctggcacgt ccgcattgcc 960

atccggatgg agctgctgga gtgcgtcagc aagtgtgcct gactgtgcct tctagttgcc 1020

agccatctgt tgtttgcccc tcccccgtgc cttccttgac cctggaaggt gccactccca 1080

ctgtcctttc ctaataaaat gaggaaattg catcgcattg tctgagtagg tgtcattcta 1140

ttctgggggg tggggtgggg caggacagca agggggagga ttgggaagac aatagcaggc 1200

atgctgggga tgcggtgggc tctatggcga gggcctattt cccatgattc cttcatattt 1260

gcatatacga tacaaggctg ttagagagat aattggaatt aatttgactg taaacacaaa 1320

gatattagta caaaatacgt gacgtagaaa gtaataattt cttgggtagt ttgcagtttt 1380

aaaattatgt tttaaaatgg actatcatat gcttaccgta acttgaaagt atttcgattt 1440

cttggcttta tatatcttgt ggaaaggacg aaacaccgag cacggaacga cctgagtgtt 1500

ttagagctag aaatagcaag ttaaaataag gctagtccgt tatcaacttg aaaaagtggc 1560

accgagtcgg tgcttttttt taccacattt gtagaggttt tacttgcttt aaaaaacctc 1620

ccacacctcc ccctgaacct gaaacataaa atgaatgcaa ttgttgttgt taacttgttt 1680

attgcagctt ataatggtta caaataaagc aatagcatca caaatttcac aaataaagca 1740

tttttttcac tgcattctag ttgtggtttg tccaaactca tcaatgtatc ttatcatgtc 1800

tgtcaggcgc acttggacac gcattccagc agttccattc tgatggcgat ccgcacgtgc 1860

cagccgagag ggatcagtct gatgaatctg gagatgatag gaggcctcag cagattctgc 1920

acggtgctgg ttctgtcgct gttgccgtag aacactctgt tgttgccggt ctggtccttg 1980

tagtagatcc agttcagtct ctcgtcggtt ctgtactgca cgctgtactt ggtcatccac 2040

tcgtcgatgt cgcatctgcc ctgtgtcagg atgccgctga tgactttgat ctctttcagg 2100

tcgatctgca gccactggct agagtcctgg aacttgctca gccaggcaca gccgaagcct 2160

tggctgttca gtctggcctt gttggctgtc cagctagagt accagccgac gtactgctcg 2220

gggttgctac aggtgatctg gtcaggggtc acttcgccgc tctcgaagcc cagaggctta 2280

tggtaggggc actcagggat gcagtccagg cttgtagcgc cagcgctcca aagagcatta 2340

gggccgcctt gacagtcgca cttgcaggct ttctgatacc aggggtcctc gccttcatct 2400

tctgtgctgc tcaggcccag tgtggctgag caaaagaaca agagagggaa aaaatgaaat 2460

taagaaagga aagaaggcaa aatgaaaaca atgccataga gattaaggag ctcattctgg 2520

agggaggaaa aggatggcaa tgactgttgt tttttcttat agaattatgg aaaatatatt 2580

aatatagcaa agcagggtgc agtacagccc tctagaggcc gcaggaaccc ctagtgatgg 2640

agttggccac tccctctctg cgcgctcgct cgctcactga ggccgggcga ccaaaggtcg 2700

cccgacgccc gggctttgcc cgggcggcct cagtgagcga gcgagcgcgc agctgcctgc 2760

agg 2763

<210> 48

<211> 224

<212> Белок

<213> Mus musculus

<400> 48

Met Pro His Lys Ile Glu Gly Phe Phe Leu Leu Leu Leu Phe Gly Tyr

1 5 10 15

Glu Ala Thr Leu Gly Leu Ser Ser Thr Glu Asp Glu Gly Glu Asp Pro

20 25 30

Trp Tyr Gln Lys Ala Cys Lys Cys Asp Cys Gln Val Gly Ala Asn Ala

35 40 45

Leu Trp Ser Ala Gly Ala Thr Ser Leu Asp Cys Ile Pro Glu Cys Pro

50 55 60

Tyr His Lys Pro Leu Gly Phe Glu Ser Gly Glu Val Thr Pro Asp Gln

65 70 75 80

Ile Thr Cys Ser Asn Pro Glu Gln Tyr Val Gly Trp Tyr Ser Ser Trp

85 90 95

Thr Ala Asn Lys Ala Arg Leu Asn Ser Gln Gly Phe Gly Cys Ala Trp

100 105 110

Leu Ser Lys Tyr Gln Asp Ser Ser Gln Trp Leu Gln Ile Asp Leu Lys

115 120 125

Glu Ile Lys Val Ile Ser Gly Ile Leu Thr Gln Gly Cys Cys Asp Ile

130 135 140

Asp Glu Trp Val Thr Lys Tyr Ser Val Gln Tyr Arg Thr Asp Glu Arg

145 150 155 160

Leu Asn Trp Ile Tyr Tyr Lys Asp Gln Thr Gly Asn Asn Arg Val Phe

165 170 175

Tyr Gly Asn Ser Asp Arg Ser Ser Thr Val Gln Asn Leu Leu Arg Pro

180 185 190

Pro Ile Ile Ser Arg Phe Ile Arg Leu Ile Pro Leu Gly Trp His Val

195 200 205

Arg Ile Ala Ile Arg Met Glu Leu Leu Glu Cys Ala Ser Lys Cys Ala

210 215 220

<210> 49

<211> 7

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 49

Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val

1 5

<210> 50

<211> 7

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 50

Pro Lys Lys Lys Arg Arg Val

1 5

<210> 51

<211> 16

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 51

Lys Arg Pro Ala Ala Thr Lys Lys Ala Gly Gln Ala Lys Lys Lys Lys

1 5 10 15

<210> 52

<211> 22

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 52

guuuuagagc uaugcuguuu ug 22

<210> 53

<211> 68

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 53

guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc cguuaucaac uuggcaccga 60

gucggugc 68

<210> 54

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 54

gggccttatg catctccatc 20

<210> 55

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 55

taatcagcat attatccaga 20

<210> 56

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 56

cccttttgta cgttttttaa 20

<210> 57

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 57

ctgtatcttc ttagccagta 20

<210> 58

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 58

gttaacgcgt catttacatt 20

<210> 59

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 59

tacaataaat tagccggatg 20

<210> 60

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 60

aaacttttag gagtcaaagt 20

<210> 61

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 61

aaaactttta ggagtcaaag 20

<210> 62

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 62

aatgttaaca gtgttggctt 20

<210> 63

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 63

gtggtggctg caggtgaggg 20

<210> 64

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 64

tactaaaatg ttaacagtgt 20

<210> 65

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 65

aaaaaaggac ttgacatgca 20

<210> 66

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 66

gtcccagctt ctcttgaggg 20

<210> 67

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 67

gttaacagtg ttggctttgg 20

<210> 68

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 68

gttggtggtc actgacagtg 20

<210> 69

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 69

gaaactagtg gctaccgtac 20

<210> 70

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 70

aaaaaacgta caaaaggggc 20

<210> 71

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 71

agccccaggc catcaaccgg 20

<210> 72

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 72

ggcagccaga cagatgcttc 20

<210> 73

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 73

ctggagaaca aaagcatttt 20

<210> 74

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 74

atcttagatt tatgcaatgt 20

<210> 75

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 75

acaagtagaa tcagaattct 20

<210> 76

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 76

aatatcggct cactgcaacc 20

<210> 77

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 77

ccctcaagag aagctgggac 20

<210> 78

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 78

tcttaggaga tgacgaggtt 20

<210> 79

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 79

aataataaag aactagagaa 20

<210> 80

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 80

aaaaacgtac aaaaggggcc 20

<210> 81

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 81

ggctgagcag gcggagaagt 20

<210> 82

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 82

agagaaagga gaacagtctg 20

<210> 83

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 83

cttctttctc tttcacgaga 20

<210> 84

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 84

aatcttagat ttatgcaatg 20

<210> 85

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 85

ctgagcaggc ggagaagtag 20

<210> 86

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 86

acctagtgtt gacaaggctg 20

<210> 87

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 87

tcccagcttc tcttgagggt 20

<210> 88

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 88

aataattctg ttgggacgac 20

<210> 89

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 89

cctataaaga ggacgtttcc 20

<210> 90

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 90

ccttctttct ctttcacgag 20

<210> 91

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 91

cccatcgaag tactcaccat 20

<210> 92

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 92

gtgtcatatg ttgctggtgg 20

<210> 93

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 93

aatgtaaatg acgcgttaac 20

<210> 94

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 94

gcctttgagc caagtggatt 20

<210> 95

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 95

gtcagactct gtgctggctg 20

<210> 96

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 96

ccgtcaatag cattccggtt 20

<210> 97

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 97

ccattaaaaa acgtacaaaa 20

<210> 98

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 98

gggatttggg gaggatgggg 20

<210> 99

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 99

actgtgtcat atgttgctgg 20

<210> 100

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 100

tacaatgttg tggaccgggc 20

<210> 101

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 101

gatagagtag caaacaaaac 20

<210> 102

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 102

gctctcaaag gagactgaga 20

<210> 103

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 103

ggaagagcaa ggagctcctg 20

<210> 104

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 104

tgtgtcatat gttgctggtg 20

<210> 105

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 105

ctgagaaggt gtacctagag 20

<210> 106

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 106

gtccgggagc cagttcctgc 20

<210> 107

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 107

ttaggagatg acgaggttgg 20

<210> 108

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 108

ggaggaagca gagctctcaa 20

<210> 109

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 109

agtcatcagc ctgggaaaca 20

<210> 110

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 110

tccgggagcc agttcctgca 20

<210> 111

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 111

gagcaaggag ctcctgaggc 20

<210> 112

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 112

tctggtacaa tgttgtggac 20

<210> 113

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 113

cctgggagtg tctgacaacc 20

<210> 114

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 114

ccagttcctg cagggcctcg 20

<210> 115

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 115

tagggaatgg gctgagcagg 20

<210> 116

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 116

agctttctgt ccctgtgaga 20

<210> 117

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 117

tcgtctccct gccttctcac 20

<210> 118

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 118

cgaagtactc accatgggca 20

<210> 119

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 119

aggccactgg accatgccca 20

<210> 120

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 120

ggcagggaga cgagtctaat 20

<210> 121

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 121

gggcttagat ttatgcaata 20

<210> 122

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 122

ttcagcgaag acaagggatt 20

<210> 123

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 123

catggcccac gaggccctgc 20

<210> 124

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 124

cagttcctgc agggcctcgt 20

<210> 125

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 125

cattaaaaaa cgtacaaaag 20

<210> 126

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 126

aggcagggag acgagtctaa 20

<210> 127

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 127

ctaacatctg gatgaacctg 20

<210> 128

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 128

ccagtggcct gtcttctcct 20

<210> 129

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 129

tattacaaat actgccgcta 20

<210> 130

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 130

gcagggagac gagtctaatg 20

<210> 131

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 131

caatctgctt gagaaacagg 20

<210> 132

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 132

ggcttagatt tatgcaatat 20

<210> 133

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 133

acactcccag ggctcactct 20

<210> 134

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 134

tatgggctca ttctgcccct 20

<210> 135

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 135

cgaagacaag ggatttgggg 20

<210> 136

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 136

agcacagagt ctgacattga 20

<210> 137

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 137

gtcttaggag atgacgaggt 20

<210> 138

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 138

gctgagcagg cggagaagta 20

<210> 139

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 139

ttccaatctg cttgagaaac 20

<210> 140

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 140

gagatcataa tacatctcag 20

<210> 141

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 141

gcccatcgaa gtactcacca 20

<210> 142

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 142

caggcggaga agtaggggtg 20

<210> 143

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 143

ttgaaaccca gtcaccaatg 20

<210> 144

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 144

acataatcca actgagagtc 20

<210> 145

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 145

gtgagtgtac tgagtctccg 20

<210> 146

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 146

caatggagtc acacagcatg 20

<210> 147

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 147

ggggtggggg gacgcatttg 20

<210> 148

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 148

aactgagagt caggaaacct 20

<210> 149

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 149

tgctcacttc cataaggata 20

<210> 150

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 150

atttggggag gatggggagg 20

<210> 151

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 151

cgggctggcc acggcaagtg 20

<210> 152

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 152

ctcaatgtca gactctgtgc 20

<210> 153

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 153

tgcagactat taattgcaag 20

<210> 154

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 154

acaggcgtga gccacgggcc 20

<210> 155

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 155

catcaattgt gccaggcccg 20

<210> 156

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 156

cagcacagag tctgacattg 20

<210> 157

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 157

gttgcagact attaattgca 20

<210> 158

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 158

gcaagtgtgg caacagggtc 20

<210> 159

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 159

tagggtcttg gagttttgat 20

<210> 160

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 160

aaagcctcac atggcccacg 20

<210> 161

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 161

cctcgaggtg agcgtgtgct 20

<210> 162

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 162

gcaggcggag aagtaggggt 20

<210> 163

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 163

catttttgtg gacagttgtg 20

<210> 164

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 164

ttgcagacta ttaattgcaa 20

<210> 165

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 165

ctggttgtca gacactccca 20

<210> 166

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 166

cagcgaagac aagggatttg 20

<210> 167

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 167

tcagcgaaga caagggattt 20

<210> 168

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 168

tggatttgaa aataagaagt 20

<210> 169

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 169

aggtttaaaa atattgggtg 20

<210> 170

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 170

ttggcccagg gtggtggcag 20

<210> 171

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 171

acagaaaaag ctgtcaccaa 20

<210> 172

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 172

acaagggatt tggggaggat 20

<210> 173

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 173

ggcagcccca ggccatcaac 20

<210> 174

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 174

caggttccca gctgtacaat 20

<210> 175

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 175

aggcggagaa gtaggggtgg 20

<210> 176

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 176

agtgtggtgg ctgcaggtga 20

<210> 177

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 177

agcacattgg gcagacacaa 20

<210> 178

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 178

ccacgaggcc ctgcaggaac 20

<210> 179

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 179

cgtctccctg ccttctcaca 20

<210> 180

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 180

agatactaat cccatgtatg 20

<210> 181

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 181

ttaggctttg ccctcataca 20

<210> 182

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 182

ctactcgggg gaggctgaag 20

<210> 183

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 183

acctcactgc ctcagcagcg 20

<210> 184

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 184

ttgaggaccc aggagaagac 20

<210> 185

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 185

cttaggagat gacgaggttg 20

<210> 186

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 186

ggcggagaag taggggtggg 20

<210> 187

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 187

ctggtacaat gttgtggacc 20

<210> 188

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 188

ggcaaagcat tctgggcaga 20

<210> 189

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 189

gaaaattacg gtgactgctg 20

<210> 190

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 190

ggaccaacct agtgttgaca 20

<210> 191

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 191

gcttttgttc tccagtttgt 20

<210> 192

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 192

tgatttaatc accaacaaac 20

<210> 193

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 193

atttagcaat gtttactggg 20

<210> 194

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 194

ggcattgaat ccaatatgtg 20

<210> 195

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 195

gtgttaccat cagagattgc 20

<210> 196

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 196

gtaggccatt cagtgcttac 20

<210> 197

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 197

tttgaaaata agaagttggc 20

<210> 198

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 198

cacctcgttc cgccggttga 20

<210> 199

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 199

acacgctcac ctcgagggct 20

<210> 200

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 200

gatatccagt aagcactgaa 20

<210> 201

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 201

tggatttagc aatgtttact 20

<210> 202

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 202

taaagaggac gtttcctggc 20

<210> 203

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 203

ttaatctgtc ttttgtcgta 20

<210> 204

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 204

ataggaaatg ccttactgtg 20

<210> 205

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 205

cttactggat atctgaacct 20

<210> 206

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 206

agtaaacatt gctaaatcca 20

<210> 207

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 207

gggttcttgc cttggggtat 20

<210> 208

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 208

gtgaggcttt gtggaacttg 20

<210> 209

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 209

acatcttact actaccacat 20

<210> 210

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 210

ccaccaacac cccttgcctt 20

<210> 211

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 211

tttttgggag accaaaggca 20

<210> 212

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 212

tttcatcctc cacgctgctg 20

<210> 213

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 213

tcagagccac atgaaactag 20

<210> 214

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 214

tccattaaaa aacgtacaaa 20

<210> 215

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 215

aaaaaaagga cttgacatgc 20

<210> 216

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 216

gctcctgagg ctggagctag 20

<210> 217

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 217

agaaggtgta cctagagtgg 20

<210> 218

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 218

ggtgccagca gatttgggtc 20

<210> 219

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 219

gatactaatc ccatgtatga 20

<210> 220

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 220

gaaatccgag agtgagccct 20

<210> 221

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 221

aaaacccctg caatctctga 20

<210> 222

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 222

taataatatt tatattattc 20

<210> 223

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 223

agaaaagaaa tgcaagaaat 20

<210> 224

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 224

tgaactgtgt catatgttgc 20

<210> 225

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 225

cagaaagctt tctgtatctc 20

<210> 226

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 226

agaagctggg actggctgtg 20

<210> 227

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 227

cttctcttga gggtggggat 20

<210> 228

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 228

gcccagaatg ctttgcccac 20

<210> 229

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 229

agcaggcgga gaagtagggg 20

<210> 230

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 230

tctcctctag ctccagcctc 20

<210> 231

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 231

ggttaaatga aagggaaagc 20

<210> 232

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 232

ctaaagcgcg cctttcctca 20

<210> 233

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 233

agaagatgct ggcttggccc 20

<210> 234

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 234

caggagctcc ttgctcttcc 20

<210> 235

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 235

ctgtgtcata tgttgctggt 20

<210> 236

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 236

tagcacattg ggcagacaca 20

<210> 237

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 237

gaagcatatc acttctgcta 20

<210> 238

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 238

gttgtggacc gggctggcca 20

<210> 239

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 239

tccagtggcc tgtcttctcc 20

<210> 240

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 240

aatttcctgc tgtgacaaca 20

<210> 241

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 241

caagggattt ggggaggatg 20

<210> 242

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 242

aggaagtagg gaacagggac 20

<210> 243

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 243

acctccatct ctataaaaat 20

<210> 244

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 244

ttacttctct ttggctatga 20

<210> 245

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 245

tcccactggc ccacgttgca 20

<210> 246

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 246

cagccatgtt gcttctcctt 20

<210> 247

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 247

tatttttctc cctgtttaga 20

<210> 248

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 248

gggcaaagca ttctgggcag 20

<210> 249

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 249

gaaggaggcg agacacctgt 20

<210> 250

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 250

atttcctgct gtgacaacaa 20

<210> 251

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 251

aagaaaagaa atgcaagaaa 20

<210> 252

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 252

gcttctcttg agggtgggga 20

<210> 253

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 253

attaatctgt cttttgtcgt 20

<210> 254

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 254

acaggaggaa cgcacgcagc 20

<210> 255

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 255

cctggttgtc agacactccc 20

<210> 256

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 256

aggtcaacat caattgtgcc 20

<210> 257

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 257

gacaagggat ttggggagga 20

<210> 258

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 258

ggcttagatc taaatactcc 20

<210> 259

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 259

gagcacacag cctcacagta 20

<210> 260

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 260

gttaccatca gagattgcag 20

<210> 261

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 261

ttggatttag caatgtttac 20

<210> 262

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 262

cttggagttt tgataggcac 20

<210> 263

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 263

atttaataaa agagaaacct 20

<210> 264

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 264

tttaataaaa gagaaacctt 20

<210> 265

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 265

attaaaaagc agggagaagg 20

<210> 266

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 266

gagttccaga agcatctgtc 20

<210> 267

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 267

gaagatgctg gcttggccca 20

<210> 268

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 268

gctagaggag agagagtctt 20

<210> 269

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 269

cgaaggaggc gagacacctg 20

<210> 270

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 270

gacaaacagc ctttgtcttc 20

<210> 271

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 271

tattggattc aatgccaata 20

<210> 272

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 272

tccccaccct caagagaagc 20

<210> 273

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 273

tcacagcaga gtggcccttt 20

<210> 274

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 274

gattgagagg gaattggaac 20

<210> 275

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 275

ttttgggaga ccaaaggcaa 20

<210> 276

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 276

cccagcttct cttgagggtg 20

<210> 277

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 277

gactgcactc acctcggaac 20

<210> 278

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 278

ggcaacaggg tccggttccg 20

<210> 279

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 279

tgacgaggtt gggggtgtcc 20

<210> 280

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 280

taggctttgc cctcatacat 20

<210> 281

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 281

tgaagcatat cacttctgct 20

<210> 282

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 282

aatcagaatt cttggtttca 20

<210> 283

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 283

gatgttctaa aaatccttat 20

<210> 284

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 284

agacaaatgc tttctgcggg 20

<210> 285

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 285

tgttaccatc agagattgca 20

<210> 286

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 286

cccgccaaag cgttttgcgc 20

<210> 287

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 287

cagttgtgtg gaaatatgat 20

<210> 288

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 288

acgatgtcca caaagaagac 20

<210> 289

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 289

ttaggcgaca ggcatattca 20

<210> 290

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 290

gctggtttaa agcactgatg 20

<210> 291

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 291

ccaggaaacg tcctctttat 20

<210> 292

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 292

tcagcccatt ccctataaag 20

<210> 293

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 293

agaaagcttt ctgtatctca 20

<210> 294

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 294

acttattaaa taagtatgga 20

<210> 295

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 295

attggattgc acccaggaat 20

<210> 296

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 296

tgctttcaga gccaattcct 20

<210> 297

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 297

ttctgcccct tggtccaaaa 20

<210> 298

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 298

caaatggtga gctgagggac 20

<210> 299

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 299

cctttagctt ccaccactct 20

<210> 300

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 300

aggtcaacct agtttaaata 20

<210> 301

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 301

ttggttgcct gtcttctttg 20

<210> 302

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 302

agaaatccga gagtgagccc 20

<210> 303

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 303

actgcaacct tccgcccgcc 20

<210> 304

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 304

atcgattgaa cccaggcggg 20

<210> 305

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 305

taggcgacag gcatattcat 20

<210> 306

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 306

ggcgtgttcc aggaagagca 20

<210> 307

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 307

caagcacacg ctcacctcga 20

<210> 308

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 308

tttattatta tatgcatcat 20

<210> 309

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 309

atctcagggt tcttgccttg 20

<210> 310

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 310

cttatttaat aagttttaca 20

<210> 311

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 311

ggcaaccaat ttctaacatc 20

<210> 312

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 312

agaagcagtg gagggtaaat 20

<210> 313

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 313

atcacagaag ccatctaaac 20

<210> 314

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 314

gctggcttgg cccagggtgg 20

<210> 315

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 315

tttagcaatg tttactgggt 20

<210> 316

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 316

ctgtttgttc agattcgtgt 20

<210> 317

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 317

actgagaaaa ctgcagaagc 20

<210> 318

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 318

taaattaatt aaaattggcc 20

<210> 319

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 319

tctccaggtg ccctgcaacg 20

<210> 320

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 320

ttcccactgg cccacgttgc 20

<210> 321

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 321

tcgcttagca tatgtggttg 20

<210> 322

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 322

gatgcttctg gaactcaagg 20

<210> 323

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 323

cagcatgtgc caagccctcg 20

<210> 324

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 324

tcacaacaac ttcggcctcc 20

<210> 325

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 325

atcatcgcag aaggttgcat 20

<210> 326

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 326

ggcctttaac agcacttgaa 20

<210> 327

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 327

cgaggcgggc aaaccacttg 20

<210> 328

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 328

tctgaagggc cctgtcagtt 20

<210> 329

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 329

agaaatatct cagcctctaa 20

<210> 330

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 330

gatgctggct tggcccaggg 20

<210> 331

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 331

ccacggcaag tgtggcaaca 20

<210> 332

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 332

ccaagcacac gctcacctcg 20

<210> 333

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 333

catcttcaca ccgcaatgtt 20

<210> 334

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 334

ttgtgtggaa atatgattgg 20

<210> 335

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 335

ctgcttagat tttcttgctg 20

<210> 336

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 336

ctccaggtgc cctgcaacgt 20

<210> 337

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 337

gatgcatccc attgtacagc 20

<210> 338

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 338

gaaggtttca gcgaagacaa 20

<210> 339

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 339

gtagtgccca caggatctgc 20

<210> 340

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 340

tcaggttccc agctgtacaa 20

<210> 341

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 341

tccaaaattg gattgcaccc 20

<210> 342

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 342

ctccctctgg tacaatgttg 20

<210> 343

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 343

cacctgtggg caaagcattc 20

<210> 344

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 344

aggaccatcc agggcaaatt 20

<210> 345

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 345

agtaacaaaa gtcatcagcc 20

<210> 346

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 346

ctgcaacctt ccgcccgcct 20

<210> 347

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 347

acagatgctt ctggaactca 20

<210> 348

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 348

gggcgggcgg aaggggaaga 20

<210> 349

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 349

ccctgttgcc acacttgccg 20

<210> 350

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 350

cgtttcctgg ccggacgcag 20

<210> 351

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 351

cagccttgtc aacactaggt 20

<210> 352

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 352

ggaccatcca gggcaaattg 20

<210> 353

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 353

gtaacaaaag tcatcagcct 20

<210> 354

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 354

atgcatccca ttgtacagct 20

<210> 355

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 355

tctcgctgtg ttgctcaggg 20

<210> 356

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 356

actggggaag tagtgcccac 20

<210> 357

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 357

gctgaagcag atacaccaca 20

<210> 358

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 358

actgacagca cccaacattg 20

<210> 359

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 359

ccatcttcac accgcaatgt 20

<210> 360

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 360

tacagtggac acaaaaaaag 20

<210> 361

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 361

gagtctcgct gtgttgctca 20

<210> 362

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 362

attactgacc acagtttcaa 20

<210> 363

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 363

atgtgctaga tgatccatag 20

<210> 364

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 364

tatccagatg gagatgcata 20

<210> 365

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 365

tctgaggtac catatcctta 20

<210> 366

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 366

caggaaacgt cctctttata 20

<210> 367

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 367

aattgccttc acttaggcgt 20

<210> 368

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 368

agagggagcc tttgaaactg 20

<210> 369

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 369

gcgtgtgctt ggcgtgttcc 20

<210> 370

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 370

ttgaaaataa gaagttggct 20

<210> 371

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 371

atctgcgggc agattacgcg 20

<210> 372

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 372

gtaagcactg aatggcctac 20

<210> 373

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 373

caggaccatc cagggcaaat 20

<210> 374

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 374

attctgcccc ttggtccaaa 20

<210> 375

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 375

atgcataagg cccatagaca 20

<210> 376

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 376

atgcatcttt cccatgtcta 20

<210> 377

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 377

tcctgggtgc aatccaattt 20

<210> 378

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 378

gcctttcctc atgggttgca 20

<210> 379

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 379

agagctgcca tttgcggggc 20

<210> 380

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 380

acaccccaat ttgccctgga 20

<210> 381

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 381

tttcgctgtg tctgtctacc 20

<210> 382

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 382

ttacaaaaat gatccgggcg 20

<210> 383

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 383

ctgctttcag agccaattcc 20

<210> 384

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 384

ccccaccctc aagagaagct 20

<210> 385

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 385

ggttgcccag gggctggggg 20

<210> 386

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 386

gtccacaaca ttgtaccaga 20

<210> 387

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 387

acctgtgggc aaagcattct 20

<210> 388

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 388

ttccaagtag ctcggatcac 20

<210> 389

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 389

cagtgtggtg gctgcaggtg 20

<210> 390

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 390

attttcccac attatgtata 20

<210> 391

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 391

gggatgagct cttaaaagaa 20

<210> 392

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 392

tagaatttaa tattccaaac 20

<210> 393

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 393

gaggtttcct gactctcagt 20

<210> 394

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 394

aatctaagca gactctttca 20

<210> 395

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 395

tttgggagac caaaggcaag 20

<210> 396

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 396

aatgtacctt gcaacccatg 20

<210> 397

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 397

agtgaaatat ttcgattatg 20

<210> 398

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 398

cagatgcttc tggaactcaa 20

<210> 399

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 399

agtagtgccc acaggatctg 20

<210> 400

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 400

ctcctgggcc cttgttccac 20

<210> 401

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 401

taataagttt tacatggcac 20

<210> 402

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 402

tctgctcaga atttctcctc 20

<210> 403

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 403

aggagggggc aaggagtaaa 20

<210> 404

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 404

tagagctgcc atttgcgggg 20

<210> 405

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 405

acagtttcaa aggctccctc 20

<210> 406

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 406

cggtagccac tagtttcatg 20

<210> 407

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 407

ccttacaccc caatttgccc 20

<210> 408

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 408

aagaaataca ataaattagc 20

<210> 409

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 409

ctaaacctga gtgtaaaaaa 20

<210> 410

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 410

ccagtcccag cttctcttga 20

<210> 411

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 411

agaaacggaa gtctgaggct 20

<210> 412

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 412

cccaggagaa gacaggccac 20

<210> 413

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 413

aagtcgatcc gtggttgccc 20

<210> 414

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 414

aagaaacgga agtctgaggc 20

<210> 415

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 415

gccacggcaa gtgtggcaac 20

<210> 416

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 416

atgacgaggt tgggggtgtc 20

<210> 417

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 417

aaagcctaat cacctcccaa 20

<210> 418

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 418

ggtctcccaa aaagaggatc 20

<210> 419

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 419

taggtttgat ggcctgcttc 20

<210> 420

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 420

cttggcgcta tactaggact 20

<210> 421

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 421

ggaaacgcta ccatcaaata 20

<210> 422

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 422

cctactgtgt gccctaccct 20

<210> 423

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 423

catccctctg gcccagggta 20

<210> 424

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 424

tggagcatcc ctctggccca 20

<210> 425

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 425

tgtagatgct ctgcttttga 20

<210> 426

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 426

gtagtcccag ctaccatggg 20

<210> 427

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 427

gcttggcgct atactaggac 20

<210> 428

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 428

aaaaaaacaa gtctgggaaa 20

<210> 429

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 429

tgccccctcc ctcctgaagc 20

<210> 430

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 430

ctaaaattac aaaaatgatc 20

<210> 431

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 431

tctctctgct cacttccata 20

<210> 432

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 432

tcctcttttt gggagaccaa 20

<210> 433

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 433

tcacagaagc catctaaaca 20

<210> 434

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 434

aatgtttact gggtgggtgg 20

<210> 435

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 435

gcgcacatgt ctcttagcct 20

<210> 436

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 436

tgctggttta aagcactgat 20

<210> 437

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 437

gcctttggtc tcccaaaaag 20

<210> 438

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 438

cagtgccaga tcctcttttt 20

<210> 439

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 439

cgggcagatt acgcgtggca 20

<210> 440

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 440

gagagtctta ggagatgacg 20

<210> 441

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 441

aaggggcaag ctagtgatac 20

<210> 442

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 442

gtggagtttg gccaggctgt 20

<210> 443

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 443

cccactcttc tccgacagcc 20

<210> 444

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 444

atatggcacc tggacacaca 20

<210> 445

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 445

gcatttgtct gtagacagcc 20

<210> 446

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 446

gttgcccagg ggctggggga 20

<210> 447

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 447

agatgcttct ggaactcaag 20

<210> 448

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 448

gctggattct gactacactg 20

<210> 449

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 449

aaaaaaaaag tcattgttct 20

<210> 450

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 450

aggcctgggg gtggagcccg 20

<210> 451

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 451

attaatgtag caaagtggac 20

<210> 452

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 452

gccctgcaac gtgggccagt 20

<210> 453

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 453

ttctcttaca ccgcacatat 20

<210> 454

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 454

aaaaataggt ttaaaaatat 20

<210> 455

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 455

cacaacaact tcggcctcct 20

<210> 456

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 456

gcaaggtttt attgagtgga 20

<210> 457

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 457

tatctcaggg ttcttgcctt 20

<210> 458

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 458

atgtctggga aggccgggtg 20

<210> 459

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 459

tgcatctttc ccatgtctat 20

<210> 460

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 460

tgtgaaagtg ttactatttt 20

<210> 461

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 461

aagaaagaga atagatagta 20

<210> 462

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 462

ctagcctatg agctttatga 20

<210> 463

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 463

tccacgctgc tgaggcagtg 20

<210> 464

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 464

tttctatggc cagcttcagg 20

<210> 465

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 465

gggaaggaac gctctatggt 20

<210> 466

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 466

gggcagatta cgcgtggcag 20

<210> 467

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 467

cttgccatca taaagctcat 20

<210> 468

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 468

gagttttgat aggcacagga 20

<210> 469

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 469

gcaagaaatg ggtccaaaat 20

<210> 470

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 470

ggatgggaca gagcatctcc 20

<210> 471

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 471

gttccgccgg ttgatggcct 20

<210> 472

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 472

tttttacact caggtttagt 20

<210> 473

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 473

tgccctgcaa cgtgggccag 20

<210> 474

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 474

tgggccagtg ggaaggtttg 20

<210> 475

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 475

gacaaatgct ttctgcggga 20

<210> 476

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 476

cagattacgc gtggcagggg 20

<210> 477

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 477

gccctgcagg aactggctcc 20

<210> 478

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 478

tctttagcag gtagagtacc 20

<210> 479

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 479

cacctaccaa gcccgactcc 20

<210> 480

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 480

ctcctggagt cgggcttggt 20

<210> 481

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 481

gatgcttttc tcctggagtc 20

<210> 482

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 482

actgaccttc ctaggtttga 20

<210> 483

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 483

gcaggccatc aaacctagga 20

<210> 484

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 484

ctcatccctg actatctgct 20

<210> 485

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 485

gtgggccagt gggaaggttt 20

<210> 486

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 486

agaatcgatt gaacccaggc 20

<210> 487

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 487

acgtcctctt tatagggaat 20

<210> 488

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 488

ctatttggca atttatacaa 20

<210> 489

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 489

caaaaatcag ctgggctttg 20

<210> 490

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 490

ggctgtgagg cagtttctga 20

<210> 491

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 491

cgtacaaaag gggccgggcg 20

<210> 492

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 492

cttcttattt tcaaatccaa 20

<210> 493

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 493

cgttccgccg gttgatggcc 20

<210> 494

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 494

actactacca cattggtgac 20

<210> 495

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 495

cacaaggggc ttgaggaccc 20

<210> 496

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 496

ttatagggaa tgggctgagc 20

<210> 497

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 497

ctttagcagg tagagtacct 20

<210> 498

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 498

cctagacact gccgtgggtt 20

<210> 499

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 499

gctgtggggc tccaaaccca 20

<210> 500

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 500

catagcgggt gagtaaccag 20

<210> 501

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 501

ctcttagcct aggaagattc 20

<210> 502

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 502

taaagaaatt gccttcactt 20

<210> 503

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 503

ttcatccaac gcctaagtga 20

<210> 504

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 504

tggctggatt ctgactacac 20

<210> 505

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 505

ctactaccac attggtgact 20

<210> 506

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 506

tacttcgatg ggctatgcag 20

<210> 507

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 507

tgtccaggtg ccatatttga 20

<210> 508

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 508

tgcataaggc ccatagacat 20

<210> 509

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 509

gcccaggggc tgggggaggg 20

<210> 510

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 510

accttgcaac ccatgaggaa 20

<210> 511

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 511

attacgcgtg gcaggggtgg 20

<210> 512

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 512

tgtgtgtgtt gggtgggagt 20

<210> 513

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 513

atcataatac atctcagagg 20

<210> 514

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 514

ctaccatcct atggccacca 20

<210> 515

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 515

aacctctttg gaaaactatt 20

<210> 516

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 516

ccccttgtga gcagagagtg 20

<210> 517

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 517

catgaacctt gagataagtg 20

<210> 518

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 518

cagaaaaact tcacactgct 20

<210> 519

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 519

ggcccatttc aggagagaaa 20

<210> 520

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 520

ttaaagcact gatggggtgc 20

<210> 521

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 521

gcatattctg gaaaactttt 20

<210> 522

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 522

ctggagcatc cctctggccc 20

<210> 523

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 523

ctcccccctc ccccagcccc 20

<210> 524

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 524

tcccccctcc cccagcccct 20

<210> 525

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 525

tccgtggttg cccaggggct 20

<210> 526

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 526

atccgtggtt gcccaggggc 20

<210> 527

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 527

cgacaaaaga cagattaatg 20

<210> 528

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 528

aagattagac tgaccttcct 20

<210> 529

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 529

cttgctgagg aaagaggagg 20

<210> 530

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 530

gcagagagag aaggaacgac 20

<210> 531

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 531

ctctgctcac aaggggcttg 20

<210> 532

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 532

gacaaaagac agattaatga 20

<210> 533

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 533

aagtatgcaa tgaatgtcaa 20

<210> 534

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 534

ccccagcccc tgggcaacca 20

<210> 535

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 535

gtgttactat tttaggcgac 20

<210> 536

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 536

aaagcagagc atctacatcg 20

<210> 537

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 537

gggtcttact cttgtcgccc 20

<210> 538

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 538

taaaacttat taaataagta 20

<210> 539

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 539

atctgtgggc aagaaaaagg 20

<210> 540

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 540

gagtacctgg gagagagggt 20

<210> 541

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 541

cctcactctc tgctcacaag 20

<210> 542

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 542

agctgggaac ctgaagacaa 20

<210> 543

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 543

gcgggcagat tacgcgtggc 20

<210> 544

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 544

aacacaagga agtagggaac 20

<210> 545

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 545

ctcaccagac ccaaatctgc 20

<210> 546

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 546

gaagggagat gcttttctcc 20

<210> 547

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 547

aaatggagtt ttggtggtgt 20

<210> 548

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 548

tgaagcaggc catcaaacct 20

<210> 549

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 549

aggtttgatg gcctgcttca 20

<210> 550

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 550

cacctcttct tccctgaagc 20

<210> 551

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 551

acagtgccag atcctctttt 20

<210> 552

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 552

ctgttcatca agagatgcaa 20

<210> 553

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 553

ggctggggga ggggggagac 20

<210> 554

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 554

ataatctgtg ggcaagaaaa 20

<210> 555

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 555

ttattattat atgcatcata 20

<210> 556

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 556

taaacctatt tttatagaga 20

<210> 557

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 557

atctgctggc accttgatcg 20

<210> 558

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 558

ttgtttctat ggccagcttc 20

<210> 559

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 559

gaggtgagtg cagtcatccg 20

<210> 560

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 560

aaaagcagag catctacatc 20

<210> 561

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 561

caagctagtg atactggagg 20

<210> 562

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 562

aggatagagc tgccatttgc 20

<210> 563

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 563

agattacgcg tggcaggggt 20

<210> 564

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 564

aggtgagtgc agtcatccga 20

<210> 565

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 565

cctagagtgg tggaagctaa 20

<210> 566

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 566

cgatagacgc cggcagcccc 20

<210> 567

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 567

ccccgctgct caaacctctg 20

<210> 568

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 568

acttttcctc acttatctca 20

<210> 569

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 569

aatcagctgg gctttgtggc 20

<210> 570

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 570

gccagtccca gcttctcttg 20

<210> 571

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 571

aggggggaga cagggagaat 20

<210> 572

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 572

gtgtgtgtgt tgggtgggag 20

<210> 573

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 573

gggaggatca tgagagttgg 20

<210> 574

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 574

aagtgtcctt caaggggtca 20

<210> 575

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 575

taccatccta tggccaccag 20

<210> 576

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 576

cctaccatcc tatggccacc 20

<210> 577

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 577

ccagctacca tgggaggctg 20

<210> 578

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 578

ctgattcttc cgatacccca 20

<210> 579

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 579

cgtggttgcc caggggctgg 20

<210> 580

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 580

gaggatagag ctgccatttg 20

<210> 581

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 581

agtctgaggc tggggcaact 20

<210> 582

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 582

agatgctttt ctcctggagt 20

<210> 583

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 583

cccatggtga gtacttcgat 20

<210> 584

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 584

caacaattaa tgagaaagta 20

<210> 585

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 585

caatttgccc tggatggtcc 20

<210> 586

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 586

cgtaacatac ccagtaccac 20

<210> 587

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 587

tcttgctgag gaaagaggag 20

<210> 588

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 588

ggtccacaac attgtaccag 20

<210> 589

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 589

tcataataca tctcagaggt 20

<210> 590

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 590

agggatgagc tcttaaaaga 20

<210> 591

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 591

cccagggtag ggcacacagt 20

<210> 592

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 592

tacagacaaa tgctttctgc 20

<210> 593

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 593

taaagcgcgc ctttcctcat 20

<210> 594

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 594

agtggccctt ttggaccaag 20

<210> 595

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 595

cctcactgag aaggtgatgt 20

<210> 596

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 596

ggagaaaaca caaggaagta 20

<210> 597

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 597

aagctagtga tactggaggg 20

<210> 598

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 598

cgttgagagg agtgcgccgg 20

<210> 599

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 599

tctgggaaat ggagttttgg 20

<210> 600

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 600

ttgcccaggg gctgggggag 20

<210> 601

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 601

ggggcgaatg tttacagctg 20

<210> 602

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 602

tcaaaatgtc tgggaaggcc 20

<210> 603

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 603

tggcccattt caggagagaa 20

<210> 604

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 604

ttctcagtat ttggaaagac 20

<210> 605

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 605

gggtggggag gtcacagaac 20

<210> 606

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 606

ttctggacag ttcatttcaa 20

<210> 607

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 607

agaaagaagg aaattgcttc 20

<210> 608

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 608

gcaaggtggt ctaacctctt 20

<210> 609

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 609

ttccgccggt tgatggcctg 20

<210> 610

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 610

gcccatggtg agtacttcga 20

<210> 611

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 611

ggggcaaaca ttgtgtatga 20

<210> 612

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 612

taagtatatt tacagatttg 20

<210> 613

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 613

ccgtggttgc ccaggggctg 20

<210> 614

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 614

aatctgcccg cagatcctgt 20

<210> 615

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 615

acacaaggaa gtagggaaca 20

<210> 616

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 616

gccaggctgt cggagaagag 20

<210> 617

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 617

ttaatgtagc aaagtggaca 20

<210> 618

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 618

tgcaacgtgg gccagtggga 20

<210> 619

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 619

agctccccaa accttcccac 20

<210> 620

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 620

agagtggccc ttttggacca 20

<210> 621

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 621

actacattaa tgtagcaaag 20

<210> 622

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 622

tgactagtcc catgtggtat 20

<210> 623

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 623

gatgctatta ataattctgt 20

<210> 624

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 624

ctgcctcggg ctccaccccc 20

<210> 625

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 625

ggttgatggc ctggggctgc 20

<210> 626

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 626

tagtaagatg tggggccttt 20

<210> 627

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 627

caactcctga atagcacatt 20

<210> 628

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 628

cgttaatcca tatttaaact 20

<210> 629

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 629

gctgggggag gggggagaca 20

<210> 630

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 630

agaaggtttc agcgaagaca 20

<210> 631

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 631

gaaacggaag tctgaggctg 20

<210> 632

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 632

tctacgggaa gatatcctgt 20

<210> 633

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 633

gaaaaaaaaa aaaacaagtc 20

<210> 634

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 634

agaaaaactt cacactgcta 20

<210> 635

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 635

ttcttgctga ggaaagagga 20

<210> 636

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 636

caggaattgg ctctgaaagc 20

<210> 637

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 637

caaaagcaga gcatctacat 20

<210> 638

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 638

cccgctgctc aaacctctgg 20

<210> 639

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 639

cacacttgcc gtggccagcc 20

<210> 640

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 640

acctattttt atagagatgg 20

<210> 641

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 641

aggagggagg gggcaggagc 20

<210> 642

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 642

gtcgatccgt ggttgcccag 20

<210> 643

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 643

caagtggctg gacgtgcaga 20

<210> 644

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 644

ggatttctct tctttgtgat 20

<210> 645

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 645

gcaattaggg tctagttggc 20

<210> 646

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 646

ggggggagac agggagaatg 20

<210> 647

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 647

agagggtggg gcctcaaagc 20

<210> 648

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 648

ccatcccact gcctgctttg 20

<210> 649

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 649

aagcaggcag tgggatggag 20

<210> 650

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 650

ccccagaggt ttgagcagcg 20

<210> 651

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 651

cagggcatgc aagggaggtg 20

<210> 652

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 652

ttttgttcgt tatagaattt 20

<210> 653

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 653

aaatatgatt ggaggatcaa 20

<210> 654

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 654

ctgctggttt aaagcactga 20

<210> 655

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 655

gattttcttg ctgaggaaag 20

<210> 656

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 656

catttgtctg tagacagcct 20

<210> 657

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 657

atccgaggga gagaagatgc 20

<210> 658

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 658

ccaacattgc ggtgtgaaga 20

<210> 659

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 659

gtagtaagat gtggggcctt 20

<210> 660

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 660

tcaactcctg aatagcacat 20

<210> 661

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 661

agaaaataaa ttaaaaagca 20

<210> 662

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 662

ccaaaggcaa ggggtgttgg 20

<210> 663

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 663

ttgatgttga cctaactgac 20

<210> 664

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 664

ccttccgccc gccccgcaaa 20

<210> 665

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 665

gctgccattt gcggggcggg 20

<210> 666

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 666

ggatagagct gccatttgcg 20

<210> 667

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 667

agcgaggaac atcacacact 20

<210> 668

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 668

aatatgattg gaggatcaaa 20

<210> 669

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 669

attgaaccca ggcgggcgga 20

<210> 670

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 670

aagtctgagg ctggggcaac 20

<210> 671

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 671

gattacgcgt ggcaggggtg 20

<210> 672

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 672

taatctgccc gcagatcctg 20

<210> 673

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 673

atagatagta tggaaaatta 20

<210> 674

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 674

tggagaggag agaaagcccc 20

<210> 675

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 675

agaggagaga aagcccctgg 20

<210> 676

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 676

gggctatgca ggggctgcag 20

<210> 677

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 677

ccagggcaaa ttggggtgta 20

<210> 678

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 678

cgtgggccag tgggaaggtt 20

<210> 679

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 679

ttggtgatta aatcattgtg 20

<210> 680

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 680

tgtctcttgc tagctcaaag 20

<210> 681

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 681

gggcaagcta gtgatactgg 20

<210> 682

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 682

cttcaattag gaaaaaataa 20

<210> 683

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 683

tagaaaataa attaaaaagc 20

<210> 684

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 684

acctactgtg tgccctaccc 20

<210> 685

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 685

gagtggccct tttggaccaa 20

<210> 686

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 686

ataataaagt gtccttcaag 20

<210> 687

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 687

ctccaccgtc aatagcattc 20

<210> 688

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 688

atgttgctgg tgggggtgca 20

<210> 689

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 689

gtacttcgat gggctatgca 20

<210> 690

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 690

ccccagccat gcacaaagat 20

<210> 691

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 691

agtacctggg agagagggtg 20

<210> 692

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 692

gttttgatag gcacaggatg 20

<210> 693

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 693

tctgtaacac acgcctgctg 20

<210> 694

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 694

aatagcaaag tggttaaagg 20

<210> 695

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 695

tatcatcaga aaagaaagaa 20

<210> 696

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 696

gaatttaaat taattaaaat 20

<210> 697

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 697

catatattag cagaaactga 20

<210> 698

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 698

ggtggggagg tcacagaaca 20

<210> 699

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 699

acaaatgctt tctgcgggag 20

<210> 700

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 700

agggcctcgt gggccatgtg 20

<210> 701

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 701

cctgcgcaaa acgctttggc 20

<210> 702

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 702

ccgctccccc accccacgac 20

<210> 703

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 703

taagtaccat atacataatg 20

<210> 704

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 704

gtgtgttggg tgggagtggg 20

<210> 705

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 705

aagaaaaagg tggactgaaa 20

<210> 706

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 706

cgttttttaa tggatccatg 20

<210> 707

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 707

aatttgccct ggatggtcct 20

<210> 708

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 708

ggctggattc tgactacact 20

<210> 709

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 709

ctctcctgcg caaaacgctt 20

<210> 710

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 710

atctcggctc acaacaactt 20

<210> 711

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 711

ttttgatagg cacaggatgg 20

<210> 712

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 712

aaagtggaca gggcagggag 20

<210> 713

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 713

aagaggtgaa aggaattcga 20

<210> 714

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 714

agaccaaagg caaggggtgt 20

<210> 715

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 715

aaggttgcat tggacactgc 20

<210> 716

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 716

accacactgc tgtctctcct 20

<210> 717

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 717

aattaatatc gttgataaat 20

<210> 718

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 718

atgctattaa taattctgtt 20

<210> 719

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 719

agggcaccat ccagcctgtc 20

<210> 720

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 720

tcataggcta gtgtgtgtgt 20

<210> 721

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 721

gaagatggaa ggtcagtgtt 20

<210> 722

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 722

ctgggggtgg agcccgaggc 20

<210> 723

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 723

ttctgtccct gtgagaaggc 20

<210> 724

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 724

gtatgtcact gaagagagtc 20

<210> 725

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 725

agtcgatccg tggttgccca 20

<210> 726

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 726

cggcggaacg aggtggagtt 20

<210> 727

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 727

ttgtttagaa attattttat 20

<210> 728

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 728

gaggagaaat tctgagcaga 20

<210> 729

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 729

aaacattgtg tatgacggcg 20

<210> 730

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 730

tggagaaaac acaaggaagt 20

<210> 731

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 731

tgaagatgga aggtcagtgt 20

<210> 732

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 732

tttaaaaata ttgggtgtgg 20

<210> 733

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 733

tagaaggctc ctcacagaac 20

<210> 734

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 734

ggtgtaaccc aggaccatcc 20

<210> 735

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 735

tttcttgctg aggaaagagg 20

<210> 736

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 736

tctcttcttt gtgattggca 20

<210> 737

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 737

aatcgtctga ttgctggaga 20

<210> 738

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 738

cattgcggtg tgaagatgga 20

<210> 739

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 739

tgtcgtgggg tgggggagcg 20

<210> 740

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 740

gcaagctagt gatactggag 20

<210> 741

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 741

agttttgata ggcacaggat 20

<210> 742

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 742

tcaccatggg catggtccag 20

<210> 743

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 743

gggtacttga gaattgagag 20

<210> 744

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 744

tttcactatt tttcctttag 20

<210> 745

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 745

ggaacaggga ctggtccttt 20

<210> 746

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 746

tgtgttgggt gggagtgggt 20

<210> 747

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 747

acaagcggct agatgtcgag 20

<210> 748

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 748

gtgagtaacc agtggaacaa 20

<210> 749

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 749

ttcatccaga tgttagaaat 20

<210> 750

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 750

cgtctgattg ctggagaggg 20

<210> 751

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 751

gaggggggag acagggagaa 20

<210> 752

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 752

tcctgcgcaa aacgctttgg 20

<210> 753

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 753

agtttaccaa tctttgtgca 20

<210> 754

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 754

gcatccctct ggcccagggt 20

<210> 755

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 755

gtgttgggtg ggagtgggtg 20

<210> 756

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 756

gaggccccac cctctctccc 20

<210> 757

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 757

tctatcgtgc gctcttccgc 20

<210> 758

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 758

tcattaattg ttgcaactta 20

<210> 759

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 759

ccaatccaag agactaaact 20

<210> 760

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 760

gaacagggac tggtcctttt 20

<210> 761

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 761

gagacaagtc tctctttagc 20

<210> 762

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 762

ggtgagtaac cagtggaaca 20

<210> 763

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 763

tgaccctttc tctcctgaaa 20

<210> 764

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 764

tgagaaagta tggcatattc 20

<210> 765

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 765

atttgtctgt agacagcctg 20

<210> 766

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 766

aagggggagc ccagacaggc 20

<210> 767

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 767

ctgaggctgg ggcaactggg 20

<210> 768

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 768

gacggaggca agagacagtc 20

<210> 769

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 769

aagggctgtt tttgtttcta 20

<210> 770

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 770

gaacaacagt tgtctttgtg 20

<210> 771

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 771

aatccaacag aaaacaggat 20

<210> 772

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 772

ctgactcaat tataagacat 20

<210> 773

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 773

ccatgggaag gaacgctcta 20

<210> 774

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 774

cgcaggagag tggcggcatc 20

<210> 775

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 775

ggcaagctag tgatactgga 20

<210> 776

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 776

tttagtttgc cgtctgtagg 20

<210> 777

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 777

atggagtttt ggtggtgtag 20

<210> 778

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 778

tgtagcaaag tggacagggc 20

<210> 779

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 779

aaataatgat tatctttttt 20

<210> 780

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 780

gaccctttct ctcctgaaat 20

<210> 781

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 781

gtgaaagaaa cggaagtctg 20

<210> 782

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 782

gggtgggggt gtgaaagaaa 20

<210> 783

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая

<400> 783

gcatcatagg ggtgtggaaa 20

<210> 784

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность