НОВЫЕ КОНЪЮГАТЫ МОНТЕЛУКАСТА И ПЕПТИДОВ Российский патент 2025 года по МПК A61K47/64 C07K2/00 A61P17/00 A61P29/00 

Область техники

Данное изобретение относится к новым конъюгатам известного противовоспалительного соединения, ковалентно связанного со специфическими пептидными последовательностями, к применению таких новых конъюгатов в медицине и к фармацевтическим композициям, содержащим их. В частности, данное изобретение относится к применению указанных конъюгатов и композиций для лечения воспаления.

Уровень техники

Воспаление обычно описывают как локализованную реакцию ткани, например, на инвазию микроорганизмов, некоторые антигены, поврежденные клетки или физические и/или химические факторы. Воспалительная реакция в норме является защитным механизмом, служащим для разрушения, растворения или изоляции повреждающего агента и поврежденной ткани, а также для инициации заживления ткани.

Воспаление может быть обусловлено физической травмой, инфекцией, некоторыми хроническими заболеваниями (например, псориазом и аутоиммунными заболеваниями, такими как ревматоидный артрит) и/или химическими и/или физическими реакции на внешние раздражители (например, как часть аллергической реакции). Может быть затронута сложная серия событий, в которых воспалительные медиаторы усиливают кровоток и расширение локальных кровеносных сосудов, что приводит к покраснению и повышению температуры, экссудации физиологических жидкостей, часто обусловливающих локализованную отечность, лейкоцитарную миграцию в область воспаления и боль.

Многие патологические состояния/расстройства характеризуются и/или обусловлены патологическим воспалением, повреждающим ткань. Такие состояния обычно характеризуются активацией механизмов иммунной защиты, что обусловливает эффект, который является скорее вредным, чем полезным для хозяина, и обычно они связаны с различной степенью покраснения или гиперемии ткани, опуханием, гипертермией, болью, зудом, гибелью клеток, разрушением ткани, клеточной пролиферацией и/или потерей функции. Примеры включают воспалительные болезни кишечника, ревматоидный артрит, рассеянный склероз, псориаз, гломерулонефрит и отторжение трансплантата.

Как правило, сложные серии событий приводят к воспалительным изменениям, таким как усиленный кровоток вследствие расширения локальных кровеносных сосудов, что обусловливает покраснение и повышение температуры, экстравазацию лейкоцитов и плазмы, часто приводящую к локализованному опуханию, активации сенсорных нервов (приводящей к боли в некоторых тканях) и потере функции. Такие воспалительные изменения инициируются каскадом клеточных и биохимических событий, затрагивающих такие клетки, как нейтрофилы, моноциты, макрофаги и лимфоциты, вместе с воспалительными медиаторами, такими как вазоактивные амины, цитокины, факторы комплементов и активные формы кислорода.

Среди прочего, воспаление играет ключевую роль в процессе заживления ран. Таким образом, раны и ожоги можно классифицировать как патологические состояния, с которыми связано воспаление. В данной области техники распространено традиционное мнение, что противовоспалительные препараты не следует наносить непосредственно на открытые раны, поскольку это негативно влияет на протекание заживления раны.

Монтелукаст представляет собой перорально активное нестероидное иммуномодулирующее соединение, которое вводят перорально в желудочно-кишечный тракт для поддерживающего лечения и предотвращения симптомов сезонной аллергии (см., например, Hon et al, Drug Design, Development and Therapy, 8, 839 (2014)). Он действует посредством блокирования действия, главным образом, лейкотриена D4 (а также лейкотриенов C4 и E4) на цистеиновом лекотриеновом рецепторе CysLT1 в дыхательных путях.

В международных патентных заявках WO 02/34237 и WO 2003/020200 описаны активные агенты, ковалентно связанные с полипептидами, более конкретно, с гомо- и гетерополимерами природных и/или синтетических аминокислот.

Авторами данного изобретения ранее было неожиданно обнаружено, что монтелукаст демонстрирует противовоспалительный эффект при локальном введении, например, местно, например, при нанесении на кожу (см. неопубликованную международную патентную заявку PCT/CN2018/094441). Авторами изобретения установлено, что монтелукаст, ковалентно связанный с некоторыми аминокислотными последовательностями, является источником новых соединений, которые могут находить применение при различных патологических состояниях, включая местное лечение кожных патологических состояний, таких как воспаление и раны.

Сущность изобретения

В соответствии с первым аспектом изобретения предложено пептидсодержащее соединение, которое содержит пептидный компонент, представляющий собой аминокислотную последовательность из 2-45 аминокислот, и указанный пептидный компонент ковалентно связан с одним или более соединениями формулы I:

где:

R¹ выбран из группы, состоящей из -C(CH₃)₂OH, -COCH₃, -C(CH₃)=CH₂ и -C(CH₃)₂H; и

n равен 0, 1 или 2,

а также региоизомеры, стереоизомеры и фармацевтически или косметически приемлемые соли указанного пептидсодержащего соединения,

причем указанные пептидсодержащие соединения, региоизомеры, стереоизомеры и соли в совокупности описаны здесь и далее как «соединения по данному изобретению».

Соединения по данному изобретению содержат по меньшей мере одну первичную амидную связь, через которую одно или более соединений формулы I связано/связаны с пептидным компонентом. Амидная связь образуется посредством взаимодействия группы (групп) карбоновой кислоты в одном или более соединениях формулы I с одной или более свободными группами -NH₂ в пептидном компоненте. Амидная связь может быть образована на N-концевой группе -NH₂ и/или на одной или более других свободных группах -NH₂ в аминокислотах, присутствующих в пептидной последовательности.

Соответственно, предпочтительно, что по меньшей мере одна из аминокислот в пептидном компоненте соединения по данному изобретению содержит положительно заряженную группу (т.е. свободную группу -NH₂), которая не является N-концевой. Аминокислоты в пептидном компоненте соединений по данному изобретению могут быть природными (но не обязательно протеиногенными) аминокислотами и/или синтетическими аминокислотами. Предпочтительно, аминокислоты в пептидном компоненте являются природными аминокислотами.

Например, по меньшей мере одна из аминокислот, присутствующих не на N-конце пептидного компонента, может содержать аспарагин (Asn), более предпочтительно аргинин (Arg) и еще более предпочтительно лизин (Lys).

В данном отношении предпочтительно, что по меньшей мере около 5%, более предпочтительно по меньшей мере около 10%, например, по меньшей мере около 15%, включая значение по меньшей мере около 20% (по количеству и/или по массе) аминокислот, присутствующих в пептидном компоненте, содержат указанные аминокислоты (т.е. Asn, Arg и/или Lys).

Пептидный компонент соединений по данному изобретению может представлять собой гомополимер аминокислоты. Альтернативно, пептидный компонент соединений по данному изобретению может представлять собой гетерополимер двух или более различных аминокислот. Предпочтительно, пептидный компонент соединений по данному изобретению представляет собой гетерополимер двух или более различных природных аминокислот (например, по меньшей мере трех различных аминокислот, предпочтительно четырех различных аминокислот, наиболее предпочтительно по меньшей мере пяти различных аминокислот).

Пептидные компоненты, которые могут быть связаны с соединениями формулы I, включают пептиды, которые обладают известными противомикробными и/или противовоспалительными свойствами, или их фрагменты или незначительные модификации.

Фрагменты таких пептидов включают «части» полной аминокислотной последовательности, которые могут проявлять такие противомикробные и/или противовоспалительные свойства.

Также включены аминокислотные последовательности, которые являются (например, незначительными) модификациями таких полных аминокислотных последовательностей или их фрагментами, которые могут быть синтезированы химическими и/или биологическими способами (например, химической модификацией природных пептидов или прямым синтезом). Под «(например, второстепенными) модификациями полных аминокислотных последовательностей или их фрагментами» подразумеваются модификации в соответствующих последовательностях, которые не оказывают измеримого негативного влияния на требуемые свойства соответствующего полного пептида или его фрагмента.

Противомикробные пептиды, которые могут быть упомянуты в этом отношении, включают цекропин, такой как цекропин A:

H-Lys-Trp-Lys-Leu-Phe-Lys-Lys-Ile-Glu-Lys-Val-Gly-Gln-Asn-Ile-Arg-Asp-Gly-Ile-Ile-Lys-Ala-Gly-Pro-Ala-Val-Ala-Val-Val-Gly-Gln-Ala-Thr-Gln-Ile-Ala-Lys-NH₂ (SEQ ID №: 1); цекропин B:

H-Lys-Trp-Lys-Val-Phe-Lys-Lys-Ile-Glu-Lys-Met-Gly-Arg-Asn-Ile-Arg-Asn-Gly-Ile-Val-Lys-Ala-Gly-Pro-Ala-Ile-Ala-Val-Leu-Gly-Glu-Ala-Lys-Ala-Leu-NH₂ (SEQ ID №: 2) и/или

LL-37:

H-Leu-Leu-Gly-Asp-Phe-Phe-Arg-Lys-Ser-Lys-Glu-Lys-Ile-Gly-Lys-Glu-Phe-Lys-Arg-Ile-Val-Gln-Arg-Ile-Lys-Asp-Phe-Leu-Arg-Asn-Leu-Val-Pro-Arg-Thr-Glu-Ser-NH₂ (SEQ ID №: 3).

Противовоспалительные пептиды, которые могут быть упомянуты, включают аминокислотные последовательности, представляющие собой фрагменты адгезивного белка мидий (MAP), также известного как белок ноги Mytilus edulis (mefp), который представляет собой белок, секретируемые различными видами морских моллюсков, такими как Mytilus edulis, Mytilus coruscus и Perna viridis, включая одиннадцать идентифицированных отдельных подтипов адгезивного белка, полученных из мидий, включая коллагены пре-COL-P, пре-COL-D и пре-COL-NG; матричные белки ноги мидий PTMP (матричный белок проксимальной нити) и DTMP (матричный белок дистальной нити); и белки mfp, mfp-2 (иногда упоминаемый как «mefp-2», здесь и далее названия использованы взаимозаменяемо), mfp-3/mefp-3, mfp-4/mefp-4, mfp-5/mefp-5, mfp-6/mefp-6 и, наиболее предпочтительно, mfp-1/mefp-1 (см., например, Zhu et al, Advances in Marine Science, 32, 560 (2014) и Gao et al, Journal of Anhui Agr. Sci., 39, 19860 (2011)).

Значительная часть mefp-1 состоит из 70-90 тандемных повторов декапептида: Ala-Lys-Pro-Ser-Tyr-Hyp-Hyp-Thr-DOPA-Lys (SEQ ID №: 4; см. Waite, Int. J. Adhesion and Adhesives, 7, 9 (1987)). Указанная декапептидная последовательность может быть выделена в виде низкомолекулярного производного природных MAP или может быть синтезирована, например, как описано в публикации Yamamoto в J. Chem. Soc., Perkin Trans. 1, 613 (1987). См. также Dalsin et al, J. Am. Chem. Soc., 125, 4253 (2003).

В этом отношении пептидный компонент, который можно использовать в соединениях по данному изобретению, содержит от одного до четырех (предпочтительно три и более предпочтительно два) повторяющихся звеньев вышеупомянутой декапептидной последовательности или, наиболее предпочтительно, одну из вышеупомянутых декапептидных последовательностей, или модификации (описанные выше) любых указанных вариантов.

Дополнительно предложено пептидсодержащее соединение, определение которого приведено выше, в котором по меньшей мере около 5%, например, по меньшей мере около 10% (по количеству) аминокислот в пептидном компоненте содержат ароматические группы, например, тирозин и/или 3,4-дигидроксифенилаланин (DOPA). Альтернативно, ни одна из аминокислот в пептидной цепи не содержит ароматические группы, т.е. ни одна из аминокислот не представляет собой тирозин и/или DOPA.

Дополнительно предпочтительно, что пептидный компонент в соединении по данному изобретению содержит от 5 до 30 аминокислот, например, от 6 до 20 аминокислот, включая от 7 до 15 (например, до 12, например, 10) аминокислот в аминокислотной последовательности.

Соединения по данному изобретению, которые могут быть упомянуты в этом отношении, включают соединения, в которых пептидный компонент имеет аминокислотную последовательность:

X-Pro-Y-Z (SEQ ID №: 5),

где:

X представляет собой цепь из 1-2 аминокислотных остатков, каждый из которых независимо выбран из группы, состоящей Ala и Lys;

Y выбран из группы, состоящей из Ser и pSer;

Z представляет собой цепь, содержащую от 1 (например, 2, например, 3) до 7 аминокислотных остатков, каждый из которых независимо выбран из группы, состоящей из Tyr, pTyr, Hyp (т.е. 3Hyp или 4Hyp), Thr, pThr, DOPA и Lys; и

по меньшей мере один из остатков Ala и/или Lys связан с одним или более соединениями формулы I, как описано выше.

Конкретная аминокислотная последовательность, котора может быть упомянута, представляет собой Ala-Pro-Ser-Hyp-Hyp-Thr (SEQ ID №: 6).

Предпочтительные соединения по данному изобретению, которые могут быть упомянуты, включают соединения, в которых пептидный компонент имеет аминокислотную последовательность:

G¹-Lys-Pro-G²-T-Hyp-G³-Lys (SEQ ID №: 7),

где:

G¹ отсутствует или представляет собой Ala;

G² выбран из группы, состоящей из Ser и pSer;

T выбран из группы, состоящей из DOPA или, более предпочтительно, Tyr и pTyr;

Hyp выбран из группы, состоящей из 3Hyp и 4Hyp;

G³ представляет собой цепь из 1-4 (например, 1-3) аминокислотных остатков, каждый из которых независимо выбран из группы, состоящей из Tyr, pTyr, 3Hyp, 4Hyp, Thr, pThr и DOPA; и

по меньшей мере один из остатков Lys и/или, при его наличии, остаток Ala связан с одним или более соединениями формулы I, как описано выше.

Пептидные компоненты, которые могут быть упомянуты, включают компоненты с аминокислотной последовательностью:

Lys-Pro-G²-T-Hyp-G³-Lys (SEQ ID №: 8),

где G², T, Hyp и G³ являются такими, как определено выше, причем G² более предпочтительно представляет собой Ser, и G³ более предпочтительно представляет собой Tyr или, в частности, DOPA.

Однако дополнительно предпочтительно:

G¹ представляет собой Ala;

G² представляет собой Ser;

T представляет собой Tyr;

G³ представляет собой 1-4 (например, 1-3) аминокислотных остатка, каждый из которых независимо выбран из группы, состоящей из Tyr, 3Hyp, 4Hyp и Thr, так что цепь аминокислот представлена последовательностью -V¹-Thr-Tyr-V²-, где V¹ связан с Hyp, и V² связан с Lys, и V¹ и V² независимо либо отсутствуют, либо представляют собой одну или две группы Hyp.

В этом отношении может быть представлена последовательность -V¹-Thr-Tyr-V², в порядке увеличения предпочтения составных последовательностей:
-Hyp-Thr-Tyr-

-Hyp-Thr-Tyr-Hyp- или

-Thr-Tyr-Hyp-.

Таким образом, предпочтительные пептидные компоненты включают компоненты с аминокислотной последовательностью:

Ala-Lys-Pro-G²-T-Hyp-Hyp-Thr-G⁴-Lys (SEQ ID №: 9),

где G², T и Hyp являются такими, как описано выше, и G⁴ выбран из группы, состоящей из Tyr, pTyr, 3Hyp, 4Hyp, Thr, pThr и DOPA, причем G² более предпочтительно представляет собой Ser, T более предпочтительно представляет собой Tyr, и G⁴ более предпочтительно представляет собой Tyr или DOPA.

Предпочтительные пептидные компоненты дополнительно включают компоненты с аминокислотной последовательностью:

Ala-Lys-Pro-G²-T-Hyp-Thr-G⁴-Hyp-Lys (SEQ ID №: 10),

где G², T, Hyp и G⁴ являются такими, как определено выше, причем G⁴ более предпочтительно представляет собой DOPA или, в частности, Tyr.

Предпочтительные пептидные компоненты включают компоненты с аминокислотной последовательностью:

Ala-Lys-Pro-Ser-Tyr-Hyp-Hyp-Thr-DOPA-Lys (SEQ ID №: 4);

Ala-Lys-Pro-pSer-Tyr-Hyp-Hyp-Thr-DOPA-Lys (SEQ ID №: 11);

Ala-Lys-Pro-Ser-Tyr-Hyp-Hyp-Thr-Tyr-Lys (SEQ ID №: 12);

Ala-Lys-Pro-pSer-Tyr-Hyp-Hyp-Thr-Tyr-Lys (SEQ ID №: 13);

Lys-Pro-Ser-Tyr-Hyp-DOPA-Lys (SEQ ID №: 14); и

Lys-Pro-Ser-pTyr-Hyp-DOPA-Lys (SEQ ID №: 15).

В вышеуказанном перечне аминокислотных последовательностей наиболее предпочтительной является Ala-Lys-Pro-Ser-Tyr-Hyp-Hyp-Thr-Tyr-Lys (SEQ ID №: 12).

Дополнительные предпочтительные пептидные компоненты включают компоненты с аминокислотной последовательностью:

Ala-Lys-Pro-Ser-Tyr-Hyp-Hyp-pThr-DOPA-Lys (SEQ ID №: 16) и

Ala-Lys-Pro-Ser-Tyr-Hyp-Hyp-pThr-Tyr-Lys (SEQ ID №: 17).

Дополнительные предпочтительные пептидные компоненты включают компоненты с аминокислотной последовательностью:

Ala-Lys-Pro-Ser-Tyr-Hyp-Hyp-Thr-DOPA-Hyp-Lys (SEQ ID №: 18);

Ala-Lys-Pro-pSer-Tyr-Hyp-Hyp-Thr-DOPA-Hyp-Lys (SEQ ID №: 19);

Ala-Lys-Pro-Ser-Tyr-Hyp-Hyp-Thr-Tyr-Hyp-Lys (SEQ ID №: 20);

Ala-Lys-Pro-pSer-Tyr-Hyp-Hyp-Thr-Tyr-Hyp-Lys (SEQ ID №: 21);

Ala-Lys-Pro-Ser-Tyr-Hyp-Thr-DOPA-Hyp-Lys (SEQ ID №: 22),

Ala-Lys-Pro-pSer-Tyr-Hyp-Thr-DOPA-Hyp-Lys (SEQ ID №: 23);

Ala-Lys-Pro-Ser-Tyr-Hyp-Thr-Tyr-Hyp-Lys (SEQ ID №: 24);

Ala-Lys-Pro-pSer-Tyr-Hyp-Thr-Tyr-Hyp-Lys (SEQ ID №: 25);

Ala-Lys-Pro-Ser-Tyr-Hyp-Hyp-pThr-DOPA-Hyp-Lys (SEQ ID №: 26); и

Ala-Lys-Pro-Ser-Tyr-Hyp-Hyp-pThr-Tyr-Hyp-Lys (SEQ ID №: 27).

В вышеуказанном перечне аминокислотных последовательностей наиболее предпочтительной является Ala-Lys-Pro-Ser-Tyr-Hyp-Thr-Tyr-Hyp-Lys (SEQ ID №: 24).

Дополнительные предпочтительные пептидные компоненты включают компоненты с аминокислотной последовательностью:

Ala-Lys-Pro-Ser-Tyr-Hyp-Hyp-Thr-DOPA (SEQ ID №: 28);

Ala-Lys-Pro-pSer-Tyr-Hyp-Hyp-Thr-DOPA (SEQ ID №: 29);

Ala-Lys-Pro-Ser-Tyr-Hyp-Hyp-Thr-Tyr (SEQ ID №: 30);

Ala-Lys-Pro-pSer-Tyr-Hyp-Hyp-Thr-Tyr (SEQ ID №: 31);

Lys-Pro-Ser-Tyr-Hyp-DOPA (SEQ ID №: 32);

Lys-Pro-Ser-pTyr-Hyp-DOPA (SEQ ID №: 33);

Ala-Lys-Pro-Ser-Tyr-Hyp-Hyp-pThr-DOPA (SEQ ID №: 34);

Ala-Lys-Pro-Ser-Tyr-Hyp-Hyp-pThr-Tyr (SEQ ID №: 35);

Ala-Lys-Pro-Ser-Tyr-Hyp-Hyp-Thr-DOPA-Hyp (SEQ ID №: 36);

Ala-Lys-Pro-pSer-Tyr-Hyp-Hyp-Thr-DOPA-Hyp (SEQ ID №: 37);

Ala-Lys-Pro-Ser-Tyr-Hyp-Hyp-Thr-Tyr-Hyp (SEQ ID №: 38);

Ala-Lys-Pro-pSer-Tyr-Hyp-Hyp-Thr-Tyr-Hyp (SEQ ID №: 39);

Ala-Lys-Pro-Ser-Tyr-Hyp-Thr-DOPA-Hyp (SEQ ID №: 40),

Ala-Lys-Pro-pSer-Tyr-Hyp-Thr-DOPA-Hyp (SEQ ID №: 41);

Ala-Lys-Pro-Ser-Tyr-Hyp-Thr-Tyr-Hyp (SEQ ID №: 42);

Ala-Lys-Pro-pSer-Tyr-Hyp-Thr-Tyr-Hyp (SEQ ID №: 43);

Ala-Lys-Pro-Ser-Tyr-Hyp-Hyp-pThr-DOPA-Hyp (SEQ ID №: 44);

Ala-Lys-Pro-Ser-Tyr-Hyp-Hyp-pThr-Tyr-Hyp (SEQ ID №: 45);

Ala-Lys-Pro-Ser-Tyr-Hyp-Hyp (SEQ ID №: 46); и

Ala-Lys-Pro-Ser-Tyr-Hyp (SEQ ID №: 47).

Специалистам в данной области техники понятно, что метаболиты соединений по данному изобретению, которые могут образовываться после введения, входят в объем данного изобретения.

В частности, соединения по данному изобретению, содержащие пептидные компоненты с аминокислотными последовательностями SEQ ID №: 28 - SEQ ID №: 47, могут образовываться как метаболиты соответствующих соединений по данному изобретению, содержащих релевантные аминокислоты на C-конце, которые могут отщепляться от других соединений по данному изобретению после введения.

Например, соединения по данному изобретению, содержащие пептидные компоненты с аминокислотными последовательностями SEQ ID №: 30, SEQ ID №: 46 и SEQ ID №: 47, могут образовываться как метаболиты соединений по данному изобретению, содержащих пептидные компоненты с аминокислотной последовательностью SEQ ID №: 12. Аналогично, соединения по данному изобретению, содержащие пептидные компоненты с аминокислотными последовательностями SEQ ID №: 42 и SEQ ID №: 47, могут образовываться как метаболиты соединений по данному изобретению, содержащих пептидные компоненты с аминокислотной последовательностью SEQ ID №: 24.

Тем не менее, соединения по данному изобретению, содержащие пептидные компоненты с аминокислотными последовательностями SEQ ID №: 28 - SEQ ID №: 47, также являются полноправными соединениями по данному изобретению, и они могут быть получены, составлены в композицию и введены пациентам точно так же, как другие соединения по данному изобретению, которые описаны в настоящем документе и/или представлены в следующих примерах.

Во избежание разногласий, в данном контексте Pro означает пролин, Ala означает аланин, Ser означает серин, и pSer означает фосфосерин, Tyr означает тирозин, pTyr означает фосфотирозин, Hyp означает гидроксипролин (3Hyp означает 3-гидроксипролин, и 4Hyp означает 4-гидроксипролин), Thr означает треонин, pThr означает фосфотреонин (или фосфонотреонин), и Lys, Ala и DOPA являются такими, как описано выше. Фосфонированные производные аминокислот, содержащих свободную гидрокси-группу (например, Ser, Tyr и Thr), содержат группу -OP(=O)(OH)₂ вместо -OH.

Одно или более соединений формулы I могут быть связаны с вышеупомянутым пептидным компонентом через один или более фрагментов, например, Ala или Lys, в том числе через N-концевой фрагмент Ala или Lys и/или через C-концевой фрагмент Lys.

Три соединения формулы I, предпочтительно два соединения формулы I и более предпочтительно одно соединение формулы I может быть ковалентно связано с вышеупомянутым пептидным компонентом в соединении по данному изобретению.

Преимущественно, что пептидный компонент соединений по данному изобретению содержит по меньшей мере один аминокислотный остаток, который содержит по меньшей мере одну свободную группу -NH₂. Конкретные аминокислотные остатки, которые содержат по меньшей мере одну свободную группу -NH₂, включают Asn, Gln, предпочтительно Arg и наиболее предпочтительно Lys. Например, если пептидный компонент представляет собой последовательность G¹-Lys-Pro-G²-T-Hyp-G³-Lys (SEQ ID №: 7), то по меньшей мере один из остатков Lys имеет свободную группу -NH₂ (Т.е. по меньшей мере один из остатков Lys ковалентно не связан с группой соединения формулы I).

В примерах соединений по данному изобретению, в которых два или более (например, три, предпочтительно два) соединений формулы I ковалентно связаны с пептидным компонентом, предпочтительно, что указанный пептидный компонент содержит по меньшей мере один аминокислотный остаток, который содержит по меньшей мере одну свободную группу -NH₂. Например, пептидный компонент содержит по меньшей мере один остаток Lys, который ковалентно не связан с соединением формулы I.

Не ограничиваясь теорией, полагают, что присутствие свободных групп -NH₂ в пептидном компоненте (например, если один или более остатков Lys, которые могут присутствовать, ковалентно не связаны с соединением формулы I) является преимущественным для обеспечения растворимости (например, в воде) соединений по данному изобретению.

Соединения формулы I содержат двойную связь и, следовательно, могут существовать как E (entgegen) и Z (zusammen) геометрические изомеры относительно двойной связи. Все такие изомеры и их смеси входят в объем данного изобретения. Во избежание разночтений, в соединениях формулы I означает, что 7-хлорхинолиновое кольцо может быть расположено в цис-положении (как Z-геометрический изомер) или в транс-положении (как E-геометрический изомер) относительно двойной связи с центральным 1,3-дизамещенным фенильным кольцом. Предпочтительно, 7-хлорхинолиновое кольцо находится в транс-положении относительно двойной связи с центральным 1,3-дизамещенным фенильным кольцом, т.е. как E-геометрический изомер.

Конкретные соединения формулы I, которые могут быть упомянуты, включают соединения, в которых R¹ выбран из группы, состоящей из -C(CH₃)₂OH, -COCH₃ и -C(CH₃)=CH₂.

Предпочтительные соединения формулы I включают соединения, в которых R¹ представляет собой -C(CH₃)₂OH, и/или n равен 0 (например, монтелукаст).

Во избежание разночтений, монтелукаст имеет следующую химическую структуру:

Другие соединения формулы I включают соединения, в которых R¹ представляет собой -C(CH₃)=CH₂, и/или n равен 0 (например, монтелукаст-стирол).

Во избежание разночтений, монтелукаст-стирол имеет следующую химическую структуру:

Другие соединения формулы I, которые могут быть упомянуты, включают соединения, в которых R¹ представляет собой -C(CH₃)₂H, и/или n равен 0 (например, гидрированный монтелукаст-стирол).

Во избежание разночтений, гидрированный монтелукаст-стирол имеет следующую химическую структуру:

Соединения по данному изобретению, в том числе в форме солей или в иных формах, включают региоизомеры в аминокислотах пептидного компонента (например, фрагментах Hyp и Tyr), а также смеси таких региоизомеров. Например, в определение Tyr ходит не только тирозин (4-гидроксифенилаланин), но и 2- и 3-гидроксифенилаланин, а в определение Hy входят 4-гидроксипролин (4Hyp), 3-гидроксипролин (3Hyp) и 5-гидроксипролин (5Hyp). Более предпочтительно, остатки Hyp представляют собой 4-гидроксипролин.

Кроме того, помимо стандартного центрального атома углерода в аминокислотах пептидного компонента соединений по данному изобретению (которые обычно, но не исключительно, находятся в L-конфигурации), некоторые аминокислоты в последовательности содержат дополнительные хиральные атомы углерода. Все такие стереоизомеры и их смеси (включая рацемические смеси) включены в объем данного изобретения. Соответственно, в определение Hyp включены транс-4-гидрокси-L-пролин, цис-4-гидрокси-L-пролин, транс-3-гидрокси-L-пролин, цис-3-гидрокси-L-пролин, транс-5-гидрокси-L-пролин и цис-5-гидрокси-L-пролин, однако предпочтительно, Hyp, используемый в соединениях по данному изобретению, представляет собой 4-гидрокси-L-пролин. Аналогично, отдельные энантиомеры соединений формулы I, которые могут образовывать часть соединения по данному изобретению, включены в объем данного изобретения.

Соединения по данному изобретению могут быть в форме солей. Соли, которые могут быть упомянуты, включают фармацевтически приемлемые и/или косметически приемлемые соли, такие как фармацевтически и/или косметически приемлемые соли присоединения кислот и соли присоединения оснований. Такие соли могут быть получены традиционными способами, например, посредством взаимодействия соединения по данному изобретению с одним или более эквивалентами соответствующей кислоты или основания, необязательно в растворителе или в среде, в которой нерастворима данная соль, с последующим удалением указанного растворителя или указанной среды с применением стандартных технологий (например, in vacuo, сублимационной сушкой или фильтрованием). Соли также могут быть получены посредством обмена противоиона активного ингредиента в форме соли на другой противоион, например, с использованием подходящей ионообменной смолы.

Предпочтительные соли включают, например, ацетаты, гидрохлориды, бисульфаты, малеаты, мезилаты, тозилаты, соли щелочноземельных металлов, таких как кальций и магний, или соли щелочных металлов, такие как соли натрия и калия. Наиболее предпочтительно, соединения по данному изобретению могут быть в форме ацетатных солей.

Соединения по данному изобретению могут быть получены стандартными технологиями. Например, соединение по данному изобретению может быть получено связыванием одного или более соединений формулы I с пептидным компонентом, например, как описано далее. Соединения по данному изобретению (и их пептидные компоненты) могут быть синтезированы из доступных исходных материалов с применением соответствующих реагентов и условий реакции. В этом отношении специалисты в данной области техники могут обратиться inter alia, к публикации “Comprehensive Organic Synthesis”, B. M. Trost and I. Fleming, Pergamon Press, 1991. Дополнительные источники, которые можно использовать, включают “Heterocyclic Chemistry”, J. A. Joule, K. Mills and G. F. Smith, 3^е издание, опубликовано компанией Chapman & Hall, “Comprehensive Heterocyclic Chemistry II”, A. R. Katritzky, C. W. Rees and E. F. V. Scriven, Pergamon Press, 1996, и “Science of Synthesis”, тома 9-17 (Hetarenes and Related Ring Systems), Georg Thieme Verlag, 2006. 

Пептидный компонент соединения по данному изобретению, при необходимости, может быть получен стандартными технологиями синтеза пептидов, с использованием стандартных технологий связывания аминокислот и стандартных связующих реагентов и растворителей, например, описанных далее.

Специалистам в данной области техники понятно, что заместители, описанные в данном документе, и их заместители могут быть модифицированы один или более раз, после или во время процессов, описанных выше для получения соединений по данному изобретению, с применением способов, известных специалистам в данной области техники. Примеры таких способов включают замещение, восстановление, окисление, дегидрирование, алкилирование, деалкилирование, ацилирование, гидролиз, эстерификацию, этерификацию, галогенирование и нитрование. Группы-предшественники могут быть заменены на различные группы или на группы, описанные в соединениях по данному изобретению, в любой момент на протяжении реакционной последовательности. Специалисты в данной области техники также могут обратиться к публикациям “Comprehensive Organic Functional Group Transformations”, A. R. Katritzky, O. Meth-Cohn and C. W. Rees, Pergamon Press, 1995, и/или “Comprehensive Organic Transformations”, R. C. Larock, Wiley-VCH, 1999.

Соединения по данному изобретению могут быть выделены из их реакционных смесей и при необходимости очищены с помощью традиционных технологий, известных специалистам в данной области техники. Таким образом, способы получения соединений по данному изобретению, описанные в настоящем документе, могут включать в качестве последней стадии выделение и необязательно очистку соединения по данному изобретению.

Специалистам в данной области техники понятно, что в способах, описанных выше и ниже, функциональные группы промежуточных соединений могут нуждаться в защите защитными группами. Защита и снятие защиты с функциональных групп можно осуществлять до или после реакции на вышеупомянутых схемах.

Защитные группы можно устанавливать и удалять в соответствии с технологиями, хорошо известными специалистам в данной области техники и описанными далее. Например, защищенные соединения/промежуточные соединения, описанные в данном документе, можно химически превращать в незащищенные соединения, используя стандартные технологии снятия защиты. Тип химического превращения обусловливает необходимость и тип защитных групп, а также последовательность осуществления синтеза. Использование защитных групп подробно описано в публикации “Protective Groups in Organic Synthesis”, 3е издание, T.W. Greene & P.G.M. Wutz, Wiley-Interscience (1999), содержание которой включено в данный документ посредством ссылки.

Соединения по данному изобретению имеют практическое применение благодаря их фармакологической активности. Так, соединения по данному изобретению пригодны в качестве лекарственного средства для медицины и ветеринарии. Таким образом, они показаны в качестве фармацевтических препаратов (и/или для ветеринарии), несмотря на то, что их можно использовать также в качестве косметического средства и/или компонента медицинского устройства.

Несмотря на то, что сами соединения по данному изобретению могут обладать фармакологической активностью, могут существовать или могут быть получены некоторые фармацевтически приемлемые (например, «защищенные») производные соединений по данному изобретению, которые могут не обладать такой активностью, но которые могут быть введены, а затем метаболизированы или химически трансформированы с образованием соединений по данному изобретению. Следовательно, такие соединения (которые могут обладать определенной фармакологической активностью, при условии, что такая активность существенно ниже, чем у активных соединений, до которых они метаболизируются/трансформируются) могут быть описаны как «пролекарства» соединений по данному изобретению.

В данном контексте упоминание пролекарств включает соединения, которые образуют соединение по данному изобретению в экспериментально обнаруживаемом количестве, в течение определенного времени после введения. Все пролекарства соединений по данному изобретению входят в объем настоящего изобретения.

Соединения по данному изобретению имеют практическую применимость при лечении воспаления.

«Лечение воспаления» включает лечение воспаления в любом органе организма (включая мягкие ткани, суставы, нервы, сосудистую систему, внутренние органы, особенно слизистые оболочки и, в частности, кожу), независимо от причины, а также включает все такие воспалительные расстройства или патологические состояния, и/или расстройства или патологические состояния, характеризующиеся воспалением (например, симптом).

Воспалительные состояния могут характеризоваться (и обычно характеризуются) активацией механизмов иммунной защиты, которая обусловливает эффект, который является скорее вредным, чем полезным для хозяина. Такие патологические состояния обычно связаны с различной степенью покраснения или гиперемии ткани, опуханием, отеком, гипертермией, болью (в том числе ноющей), экссудацией физиологических жидкостей, зудом (пруритом), клеточной гибелью и разрушением ткани, клеточной пролиферацией и/или потерей функции.

Воспалительные состояния, которые могут быть упомянуты, включают артериит, сахарный диабет, метаболический синдром, розовые угри, астму и аллергию, анкилозирующий спондилит, хроническую обструктивную болезнь легких, подагрический артрит, воспалительную болезнь кишечника (такую как болезнь Крона и язвенный колит), рассеянный склероз, остеоартрит, панкреатит, простатит, псориатический артрит, ревматоидный артрит, тендинит, бурсит, синдром Шегрена, системную красную волчанку, увеит, крапивницу, васкулит, мастоцитоз, сосудистые осложнения диабета, мигрень, атеросклероз и сопутствующие сердечнососудистые расстройства. Болезненное состояние, характеризующееся воспалением, которое может быть упомянуто, представляет собой хроническую обструктивную болезнь легких (ХОБЛ). Дополнительное болезненное состояние, характеризующееся воспалением, которое может быть упомянуто, представляет собой воспалительные болезни кишечника, включая болезнь Крона и, в частности, язвенный колит.

Воспалительные состояния, которые могут быть упомянуты более конкретно, включают воспаления кожи или слизистой оболочки (включая слизистые оболочки полости рта, носа, глаз, влагалища, шейки матки и/или аноректальную слизистую), такие как воспаления, вызванные инфекциями (такими как вирусные и/или бактериальные инфекции), или аллергические/атопические состояния (такие как ринит (например, аллергический ринит), фарингит, периодонтит, гингивит, ксерофтальмия, конъюнктивит (например, аллергический конъюнктивит), дерматит, крапивница (аллергическая сыпь) и пищевая аллергия); и другие воспалительные состояния, такие как герпес, медикаментозная сыпь, полиморфный фотодерматоз, солнечные ожоги, ранние проявления рака кожи (поражения кожи наподобие эритемы), патологическое выпадение волос (в том числе после трансплантации кожи), химическая сыпь, псориаз, мультиформная эритема, фолликулит, экзема и наружный отит. Болезненное состояние, которое может быть упомянуто, представляет собой полиморфный фотодерматоз.

Более конкретно, предложенные соединения можно использовать для лечения некоторых состояний, характеризующихся воспалением, и/или состояний, с которыми связано воспаление. Такие состояния могут включать раны (включая ссадины (царапины), порезы (включая операционные разрезы), разрывы, колотые раны, рваные раны, ушибы и рубцы) и ожоги (включая воспаление, обусловленное послеожоговой операцией, такой как пересадка кожи), а также другие состояния, такие как геморрой. Раны могут быть острыми или хроническими и/или могут возникать в результате одного или более воспалительных расстройств, описанных в данном документе.

Раны на коже или слизистой оболочке могут возникать в результате внутреннего или внешнего физического повреждения поверхности оболочки, или могут быть вызваны (т.е. могут быть симптомом) первопричинным физиологическим расстройством.

Физические (например, «открытые») раны могут быть нанесены острыми предметами (порезы, рассечения, проколы) или тупыми твердыми предметами/механическими силами (разрывы, ссадины, рваные раны), физическими ударами (ушибы), тепловым воздействием или химическими веществами (ожоги и нарывы), УФ светом (солнечные ожоги), холодом (обморожение или ознобление). Раны могут быть поверхностными (повреждение только эпидермиса и/или дермы) или глубокими (повреждение ниже эпидермиса и/или дермы). В тяжелых случаях могут быть повреждения подкожные и/или подслизистые ткани, такие как мышцы, кости, суставы и даже внутренние органы.

Соединения по данному изобретению можно использовать для облегчения боли (в том числе ноющей), связанной с воспалением и/или ранением. В частности, соединения по данному изобретению можно использовать для облегчения боли во время процедур и/или непроцедурной боли. Специалистам в данной области техники понятно, что термин «боль во время процедур» (т.е. операционная боль) относится к острой боли, которая связана с медицинскими исследованиями и лечением, проводимым с целью медицинского обслуживания. Термин «непроцедурная» относится к общей боли, которая связана с воспалением и/или ранением (например, к боли, связанной с язвой языка, ожогами и/или шрамами), и не является следствием определенного медицинского вмешательства.

Соединения по данному изобретению можно использовать для лечения не только воспаления, боли (в том числе ноющей) и/или прурита (зуда), связанного с самой раной и процессом заживления, но их можно использовать также для предотвращения экссудации физиологических жидкостей из ран, риска инфицирования, а также для предотвращения физиологических реакций, возникающих в результате воспаления и/или заживления ран, таких как рубцевание и меланиновая пигментация.

Рубцевание является следствием воспаления и/или заживления ран, и представляет собой общий термин для образования фиброзной ткани, которая является последствием такого воспаления/заживления.

Соединения по данному изобретению также могут быть пригодны для подавления возникновения меланиновой пигментации, которая может быть или не быть результатом воспаления и/или заживления раны. Соединения по данному изобретению также могут быть пригодны для подавления расстройств, связанных с меланиновой пигментацией, таких как хлоазма, лентиго, сыпь в форме бабочки и другие типы дисхромии кожи, раковые заболевания кожи с меланомой, а также хроматоз, вызванные воздействием солнца, или кожными заболеваниями типа угрей.

Раны также могут возникать вследствие (например, воспалительных) заболеваний или расстройств. Такие раны могут включать нарывы и/или язвы кожи и слизистой оболочки. Они являются распространенными состояниями, которые часто являются продолжительными и трудно поддающимися лечению. Кожные ткани часто могут быть поврежденными, оторванными, разжиженными, инфицированными и/или некротическими. Язвы могут вызывать вторичные последствия для здоровья, в частности, если происходит их инфицирование, то заживление происходит трудно и требует дорогостоящего лечения. Они также могут вызывать существенный психологический стресс и экономические затраты для пациента, что ухудшает самочувствие и качество жизни.

Альтернативно, воспалительные заболевания или патологические состояния кожи, при которых соединения по данному изобретению находят особое применение, включают псориаз, угри, экзему и дерматит, особенно аллергический/атопический дерматит, а также для лечения воспаления слизистой оболочки, характерного, например, для ринита, особенно аллергического ринита, геморроя, хронической обструктивной болезни легких и язвенного колита.

Псориаз представляет собой хроническое воспалительное заболевание кожи, склонное к рецидиву (некоторые пациенты никогда не выздоравливают на протяжении всей жизни). Клинические проявления псориаза включают, главным образом, покраснение и чешуйки. Он может проявляться по всему телу, но обычно наблюдается на голове и конечностях.

Угри представляют собой фолликулярное (относящееся к пилосебацейному комплексу) хроническое воспалительное заболевание кожи, возникновение которого тесно связано с такими главными факторами, как гиперстеатоз, закупоренные пилосебацейные протоки (включая закрытые и открытые комедоны), бактериальная инфекция и воспалительные реакции, которые обычно возникают в юности, и характеризуется мультиформными поражениями кожи лица. Таким образом, термин «угри» включает обычные угри и розовые угри (т.е. «винный нос»).

Экзема представляет собой воспалительную реакцию кожи с сильным зудом, вызванную различными внутренними и внешними факторами. Она имеет три фазы, острую, подострую и хроническую. В острой фазе существует тенденция к образованию экссудатов, а хроническая фаза включает инфильтрацию и гипертрофию. Кожные повреждения часто являются зудящими и легко рецидивирующими.

Дерматит представляет собой распространенное заболевание кожи, характеризующееся загрубелостью, покраснением, зудом, экземой и сухостью. Небольшие шишечки, незаживающие язвы и пигментированные пятна, вызванные дерматитом, при отсутствии быстрого лечения могут развиваться в базальноклеточную карциному, плоскоклеточную карциному и злокачественную меланому. Дерматит может быть вызван различными внутренними и внешними инфекциями или неинфекционными факторами, включая действие различных веществ (контактный дерматит) или аллергию (аллергический/атопический дерматит). Также включен себорейный дерматит (себорейная экзема) и все формы стероид-зависимого дерматита (включая фоточувствительный себореид, околоротовой дерматит, розацеаподобный дерматит, стероидные розовые угри, вызванную стероидами розацею, ятрозацею, розацеаподобный дерматит, розацеаподобный дерматит, вызванный местным применением кортикостероидов, и, более конкретно, кортикостероидный аддиктивный дерматит лица (FCAD) или зависимый от кортикостероидов дерматит лица (FCDD), характеризующийся приливами жара, эритемой, телангиэктазией, атрофией, папулами и/или пустулами в области лица после длительного лечения местными кортикостероидами (включая неконтролируемое использование, злоупотребление или неправильное использование); см., например, Xiao et al, J. Dermatol., 42, 697 (2015) и Lu et al, Clin. Exp. Dermatol., 35, 618 (2009)).

Ринит представляет собой раздражение и воспаление слизистой оболочки носа. Обычные симптомы ринита включают заложенность носа, насморк, чихание и стекание слизи из носоглотки. Наиболее распространенным видом ринита является аллергический ринит, вызванный аллергеном, таким как пыльца, пыль, плесень или чешуйки кожи некоторых животных. Неожиданно обнаружено, что пациенты с аллергическим ринитом, проходившие лечение соединениями по данному изобретению, испытывали облегчение зуда глаз, даже при назальном введении (т.е. в слизистую носа) соединения по данному изобретению.

Геморрой представляет собой узелки, обусловленные воспалением геморроидальных кровеносных сосудов, находящихся внутри или вокруг прямой кишки и ануса. Симптомы включают кровотечение (т.е. повреждение) после акта дефекации, выпадение геморроидальной шишки, отхождение слизи и зуд, болезненность, красноту и отечность в области заднего прохода. Геморрой предположительно является следствием повышения давления в брюшной полости, например, в результате запора или диареи.

Хроническая обструктивная болезнь легких (ХОБЛ) представляет собой название группы патологических состояний легких, которые вызывают затруднение дыхания, включая эмфизему (повреждение альвеол) и хронический бронхит (длительное воспаление дыхательных путей). ХОБЛ возникает при воспалении, повреждении и сужении легких. Повреждение легких обычно является необратимым и приводит к затруднению движения воздуха в легкие и из них. Симптомы ХОБЛ включают одышку, продуктивный кашель, частые инфекции грудной клетки и постоянные хрипы. Наиболее распространенной причиной заболевания является курение, хотя другие факторы риска включают высокий уровень загрязнения воздуха и профессиональное воздействие пыли, химических реагентов и дыма.

Соединения по данному изобретению могут оказывать положительный эффект на устранение эритемы, покраснения и отечности, отеков, нарывов и буллезного пемфигоида, вызванных различными патологическими состояниями, включая те, которые в общем и в частности упомянуты в данном документе, и могут подавлять экссудацию жидкости из подкожной ткани и снижать зуд и боль, вызванные воспалительными состояниями.

Другие воспалительные состояния, которые могут быть упомянуты, включают:

(a) Воспаление слизистых оболочек, такие как ротовой мукозит, афтозные язвы, отит среднего уха, ларингит, трахеит, эзофагит, гастрит, энтерит и энтероколит (включая бактериальную дизентерию, хроническую амебную дизентерию, шистостомоз, неспецифический язвенный колит и региональный энтерит), цервицит и эндоцервицит, эндометрит, воспаление, вызванное повреждением при вдыхании и т.п., а также воспаление слизистой оболочки, связанное с раком, и инфекции (например, вирусные инфекции, такие как обычная простуда или грипп), которые поражают слизистые поверхности, такие как в полости рта, в носоглотке, ушах, горле, трахее, желудочно-кишечном тракте, шейке матки и т.д.

(b) Ортопедическое воспаление, связанное, например, с переломом костей, гнойные инфекции костей и суставов, воспаление, вызванное ревматическими болезнями костей, а также гнойный остеомиелит (острый, хронический, локализованный, склеротический, посттравматический), гнойный артрит; костные опухоли (остеому, остеоидную остеому, хондрому), костные кисты, остеокластому, первичную остеосаркому (остеосаркому, хондросаркому, остеофибросаркому, саркому Юинга, неходжкинскую лимфому, миелому, хордому), метастатические опухоли костей, опухолеподобные повреждения костей (костные кисты, аневризматические костные кисты, эозинофильную гранулему, фиброзную дисплазию); и ревматический артрит.

(c) Воспаление нервов, такое как периферический полиневрит, фасциальный неврит, периферический неврит, подкожный неврит, локтевой неврит, межреберный неврит и т.д.

(d) Воспаление подкожных и подмышечных мягких тканей, такое как миозит, лигаментит, тендонит, панникулит, капсулит, лимфаденит, паховый лимфаденит, тонзиллит, синовит, фасциит, и воспаление мягких тканей, вызванное повреждениями, контузией или разрывом мышц, связок, соединительно-тканных оболочек, сухожилий, синовиальных мембран, жировой ткани, суставных капсул и лимфоидной ткани.

(e) Сосудистое воспаление, такое как аллергический лейкоцитокластический васкулит, аллергический кожный васкулит, нодозный полиартериит, тромботический васкулит, гранулематозный васкулит, лимфоцитарный васкулит, васкулит с патологиями состава крови и ревматический васкулит, а также сосудистое воспаление, связанное с раковыми заболеваниями сосудов, вызванными аллергическим лейкоцитокластическим васкулитом, нодозным полиартериитом, тромботическим васкулитом, гранулематозным васкулитом, лимфоцитарным васкулитом, васкулитом с патологиями состава крови и ревматическим васкулитом.

(f) воспаление внутренних органов, таких как сердце, желудок, кишечник, легкие, печень, селезенка, почки, поджелудочная железа, мочевой пузырь, яичники и предстательная железа, включая, но не ограничиваясь ими, перикардит, миокардит, эндокардит, пневмонию, гепатит, спленит, нефрит, панкреатит, цистит, оофорит, простатит и лечение язвы желудка.

(g) Воспаление глаз и окружающей зоны, такое как конъюнктивит, кератит (например, острый эпителиальный кератит, монетовидный кератит, интерстициальный кератит, дисковидный кератит, нейротрофный кератит, кератит с образованием слизистой бляшки, простой герпетический кератит, кератит с опоясывающим герпесом, бактериальный кератит, кератит, вызванный грибковой инфекцией, акантамебный кератит, онхоцеркозный кератит, точечный поверхностный кератит, язвенный кератит, кератит, развивающийся при несмыканнии глазной щели, фотокератит и острое покраснение глаз при ношении контактных линз), неврит зрительного нерва и т.д.

(h) Воспаление десен и полости рта, такое как периодонтит, гингивит, язвы десен и т.д.

(i) Воспаление, связанное с ревматизмом, такое как ревматический васкулит, ревматоидный артрит, ревматические болезни костей, анкилозирующий спондилит, бурсит, болезнь Крона, подагра, инфекционный артрит, ювенильный идиопатический артрит, остеоартрит, остеопороз, ревматическая полимиалгия, полимиозит, псориатический артрит, склеродермия, синдром Шегрена, спондилоартропатия, системна красная волчанка, тендинит и т.д.

Соединения по данному изобретению также можно использовать для лечения некоторых конкретных заболеваний дыхательной системы, таких как кистозный фиброз легких, обычная интерстициальная пневмония, аллергическая пневмония, асбестоз, эмфизема, легочно-сердечная недостаточность, эмболия легких и т.д. Конкретное болезненное состояние, которое может быть упомянуто, представляет собой идиопатический фиброз легких.

Идиопатический фиброз легких представляет собой диффузное и фатальное интерстициальное заболевание легких с патологическими признаками, включающими повреждение альвеолярного эпителия, массивную пролиферацию легочных фибробластов, избыточное отложение внеклеточного матрикса, приводящие, в конечном итоге, к необратимому повреждению легочной ткани. На поздних стадиях заболевания субъекты с идиопатическим фиброзом легких испытывают дыхательную недостаточность и погибают. Обнаружено, что соединения по данному изобретению могут находить применение для лечения идиопатического фиброза легких и/или облегчения симптомов, связанных с данным заболеванием.

Соединения по данному изобретению особенно пригодны для лечения следующих патологических состояний легких и/или фиброзных состояний (не зависимо от того, упомянуты ли они в иных местах данного документа или нет): фиброз легких, фиброз почек, фиброз печени, силикоз, острый бронхит, хронический бронхит, трахеобронхит, бронхиальная астма, астматический статус, бронхоэктаз, инфекции верхних дыхательных путей (включая обычную простуду и грипп), аллергическое воспаление дыхательных путей, бактериальная пневмония, вирусная пневмония, микоплазматическая пневмония, риккетсии, лучевая пневмония, пневмококковая (в том числе стафилококковая, стрептококковая и вызванная грамотрицательными бациллами) пневмония, кандидоз легких (включая аспергиллез, мукормикоз, гистоплазмоз, актиномикоз и нокардиоз), микоз легких, криптококкоз, абсцесс легких, анафилактическая пневмония (синдром Леффлера), экзогенно-аллергический альвеолит, легочная эозинофилия (эозинофилоз), обструктивная эмфизема легких, отек легких, туберкулез легких, алкалоз (ацидоз) дыхательных путей, острое повреждение легких, интерстициальная болезнь легких, эмпиема, фиброма легких и легочное сердце.

Конкретные расстройства и заболевания слизистых оболочек, для лечения которых пригодны соединения по данному изобретению, включают аноректальные заболевания, такие как диарея, геморрой, абсцесс, фистула, трещины, анальный зуд, анальный синусит, папилломы и выпадение прямой кишки; воспалительную болезнь кишечника, включая болезнь Крона и, в частности, язвенный колит; гинекологические заболевания, такие как цервицит, вагинит, тазовая боль и нарушения; и зубные болезни, такие как, например, парадонтит.

Соединения по данному изобретению могут дополнительно обладать антиокислительным действием посредством увеличения выработки SOD (супероксиддисмутазы) и снижения окисления липидов. Следовательно, соединения по данному изобретению можно рассматривать как обладающие свойствами антиоксиданта.

Соединения по данному изобретению также могут обладать жаропонижающими свойствами, обеспечивающими возможность лечения лихорадки и/или облегчения ее симптомов; например, посредством снижения температуры тела субъекта, что приводит к облегчению лихорадки. Таким образом, соединения по данному изобретению и композиции, содержащие их, можно рассматривать как жаропонижающие.

В соответствии с дополнительным аспектом данного изобретения, предложен способ лечения воспаления, воспалительного расстройства и/или расстройства/патологического состояния, характеризующегося воспалением (например, в качестве симптома), и указанный способ включает введение пациенту, нуждающемуся в таком лечении, соединения по данному изобретению.

Во избежание разночтений, в контексте данного изобретения термины «лечение», «терапия» и «терапевтический способ» включают терапевтическое или паллиативное лечение пациентов, нуждающихся в этом, а также профилактическое лечение и/или диагностику пациентов, предрасположенных к воспалению и/или воспалительным расстройствам.

Соединения по данному изобретению могут дополнительно обладать противовирусными свойствами, которые могут обеспечивать возможность лечения вирусной инфекции per se, то есть лечения вирусной инфекции или вирусного заболевания посредством нарушения репликации вируса в организме хозяина, в отличие от лечения любых симптомов любых вирусных инфекций или заболеваний, таких как боль и/или воспаление. Такие противовирусные свойства также могут обеспечивать возможность предотвращения возникновения такой инфекции или заболевания, защиты клеток в организме хозяина от (например, дополнительной) вирусной инфекции, предотвращения или остановки распространения вирусной инфекции или заболевания (в организме одного хозяина или от одного хозяина к другому хозяину) или предотвращения реактивации вируса после латентного периода в организме хозяина.

В соответствии с дополнительным аспектом данного изобретения, предложен способ лечения вирусной инфекции, включающий введение пациенту, нуждающемуся в таком лечении, соединения по данному изобретению или его соли.

Вирусные инфекции, которые могут быть упомянуты, включают инфекции, вызванные вирусами следующих семейств: аденовирусы (например, аденовирус), папилломавирусы (например, папилломавирус человека), полиомавирусы (например, вирус BK; вирус JC), герпесвирусы (например, вирус простого герпеса 1 типа; вирус простого герпеса 2 типа; вирус ветряной оспы; вирус Эпштейна-Барра; цитомегаловирус человека; вирус герпеса человека 8 типа), поксвирусы (например, оспы), гепаднавирусы (например, вирус гепатита B), парвовирусы (например, парвовирус B19), астровирусы (например, астровирус человека), калицивирусы (например, норовирус; вирус Норуолк), пикорнавирусы (например, вирус Коксаки, вирус гепатита A; полиовирус; риновирус), коронавирусы (например, вирус тяжелого острого респираторного синдрома), флавивирусы (например, вирус гепатита C; вирус желтой лихорадки; вирус Денге; вирус Западного Нила; вирус клещевого энцефалита), ретровирусы (например, вирус иммунодефицита человека; ВИЧ), тогавирусы (например, вирус коревой краснухи), аренавирусы (например, вирус Ласа), буньявирусы (например, хантавирус; вирус конго-крымской геморрагической лихорадки; вирус Хантаан), филовирусы (например, вирус Эбола; марбургский вирус; вирус Равн), ортомиксовирусы (например, вирусы гриппа, включая вирус гриппа A (например, вирусы H1N1 и H3N2), вирус гриппа B или вирус гриппа C), парамиксовирусы (например, вирус кори; вирус свинки; вирус парагриппа, респираторный синцитиальный вирус), рабдовирусы (например, вирус бешенства), гепатовирусы (например, вирус гепатита E), реовирусы (например, ротавирус; орбивирус; колтивирус; вирус Банна), а также вирусы, не отнесенные к семействам, такие как вирус гепатита D.

Вирусы, которые могут быть упомянуты более конкретно, включают вирус простого герпеса 1 типа и вирус простого герпеса 2 типа, папилломавирус человека, вирус гриппа и вирус парагриппа.

Соединения по данному изобретению могут дополнительно обладать антибактериальным и/или бактериостатическими свойствами, которые могут обеспечивать возможность лечения бактериальной инфекции per se, то есть лечения бактериальной инфекции или бактериального заболевания посредством нарушения бактериального роста или пролиферации в организме хозяина, в отличие от лечения любых симптомов любых бактериальных инфекций или заболеваний, таких как боль и/или воспаление. Таким образом, соединения по данному изобретению можно рассматривать как бактерициды и/или, предпочтительно, бактериостатические агенты.

Такие антибактериальные свойства также могут обеспечивать возможность предотвращения возникновения такой инфекции или заболевания, защиты клеток в организме хозяина от (например, дополнительной) бактериальной инфекции, предотвращения или остановки распространения бактериальной инфекции или заболевания (в организме одного хозяина или от одного хозяина к другому хозяину) или предотвращения реактивации бактерий после латентного периода в организме хозяина.

В соответствии с дополнительным аспектом данного изобретения, предложен способ лечения бактериальной инфекции, включающий введение пациенту, нуждающемуся в таком лечении, соединения по данному изобретению или его соли.

Как описано в данном документе, соединения по данному изобретению могут дополнительно обладать противораковыми свойствами, которые могут обеспечивать возможность лечения рака per se, то есть лечения рака посредством взаимодействия с раком, в отличие от лечения любых симптомов рака, таких как боль и/или воспаление. Такие противораковые свойства также могут включать предотвращение возникновения указанного заболевания, например, посредством лечения воспаления и, следовательно, предотвращения такого возникновения.

В соответствии с другим аспектом данного изобретения, предложен способ лечения рака, включающий введение пациенту, нуждающемуся в таком лечении, соединения по данному изобретению или его соли.

Конкретные виды рака, которые могут быть упомянуты, включают рак полости рта, рак носоглотки, рак среднего уха, конъюнктивальный рак, рак горла, рак трахеи, рак пищевода, рак желудка, рак кишечника, рак шейки матки, рак эндометрия, рак кожи и т.п., вызванные мукозитом полости рта, ринитом, отитом среднего уха, конъюнктивитом, фарингитом, ларингитом, трахеитом, эзофагитом, гастритом, энтероколитом, цервицитом, эндометритом, эритемоподобными повреждениями кожи и т.п. Конкретный рак кожи, который может быть упомянут, представляет собой базальноклеточную карциному.

«Пациенты» включают рептилий, птиц и, предпочтительно, млекопитающих (в частности, человека).

В соответствии с данным изобретением, соединения по данному изобретению предпочтительно вводят локально или системно, например, перорально, внутривенно или внутриартериально (в том числе интраваскулярно или в других периваскулярных устройствах/лекарственных формах (например, стентах)), внутримышечно, в кожу, подкожно, трансмукозально (например, сублингвально или буккально), ректально, внутривагинально, трансдермально, назально, пульмонально (например, трахеально или бронхиально), предпочтительно местно, или любым другим парентеральным способом в форме фармацевтического препарата содержащего предложенное соединение(ия) в фармацевтически приемлемой лекарственной форме(ах).

Введение посредством ингаляции (например, назально) особенно пригодно, если патологическое состояние, подлежащее лечению, представляет собой ринит или воспаление, обусловленное вирусными инфекциями дыхательных путей (например, инфекциями верхних дыхательных путей, такими как обычная простуда и грипп).

Пульмональное введение особенно пригодно, если патологическое состояние, подлежащее лечению, представляет собой ХОБЛ или ИФЛ. Местные формы введения могут быть усовершенствованы посредством создания спрея, содержащего активные ингредиенты, например, с использованием порошкообразного аэрозоля или в виде водного спрея с применением соответствующей технологии или устройства для распыления, такого как небулайзер.

Аноректальное введение является особенно пригодным, если патологическое состояние, подлежащее лечению, представляет собой геморрой или язвенный колит, с использованием соответствующих средств доставки, таких как раствор или пена для впрыска, или суппозиторий.

Введение в нижний отдел желудочно-кишечного тракта также может быть достигнуто парентеральным и, в частности, пероральным способом доставки с использованием стандартных технологий нанесения покрытий для отсроченного или пролонгированного высвобождения, известных специалистам в данной области техники. В частности, для целевой доставки можно рассматривать отдельные части верхнего и нижнего отдела кишечника. Например, введение в толстую кишку также может быть достигнуто с использованием средств доставки лекарственных препаратов в толстую кишку, которые изначально вводят перорально или парентерально.

Предпочтительные способы доставки соединений по данному изобретению включают местное введение в очаг воспаления (например, в слизистую оболочку, в том числе в слизистую полости рта и/или носа, легкие, аноректальную область и/или толстую кишку) или, более предпочтительно, на кожу) в соответствующем (например, фармацевтически и локально приемлемом) носителе, подходящем для нанесения на кожу и/или соответствующую поверхность слизистой оболочки, и/или в доступной в продаже композиции, но также могут включать пероральный, внутривенный, внутрикожный или подкожный, назальный, внутримышечный, интраперитонеальный или пульмональный способ доставки.

Соединения по данному изобретению обычно вводят в форме одной или более, например, фармацевтических композиций в смеси с (например, фармацевтически приемлемым) адъювантом, разбавителем или носителем, который может быть выбран с учетом предполагаемого способа введения (например, местно в соответствующую слизистую оболочку (включая легкие) или, предпочтительно на кожу) и стандартной фармацевтической или иной (например, косметической) практики. Такие фармацевтически приемлемые носители могут быть химически инертными в отношении активных соединений и могут не проявлять неблагоприятные побочные эффекты или токсичность в условиях применения. Такие фармацевтически приемлемые носители также могут обеспечивать мгновенное или модифицированное высвобождение активного ингредиента.

Пригодные фармацевтические композиции могут быть доступны в продаже или в ином случае получены в соответствии с технологиями, описанными в литературных источниках, например, Remington, The Science and Practice of Pharmacy, 22^ое издание, Pharmaceutical Press (2012), и Martindale - The Complete Drug Reference, 38^ое издание, Pharmaceutical Press (2014), а также в документах, указанных в них, и соответствующее описание всех таких документов включено в данный документ посредством ссылки. В ином случае получение подходящих лекарственных форм, содержащих соединения по данному изобретению, может быть осуществлено специалистами в данной области техники стандартными технологиями, не входящими в данное изобретение.

Соединения по данному изобретению могут быть в форме водной лекарственной формы, такой как эмульсия, суспензия и/или раствор (например, (необязательно) забуференная водная лекарственная форма (например, раствор), такая как лекарственная форма (например, раствор), содержащая физиологический солевой раствор, лекарственная форма (например, раствор), содержащая фосфат, лекарственная форма (например, раствор), содержащая ацетат, или лекарственная форма (например, раствор), содержащая борат), или лиофилизированный порошок.

Активный ингредиент может дополнительно и/или альтернативно смешивать с соответствующими вспомогательными веществами с получением:

• гелеобразных лекарственных форм (для которых подходящие материалы для гелевой матрицы включают производные целлюлозы, карбомер и альгинаты, трагакантовую камедь, желатин, пектин, каррагенан, геллановую камедь, крахмал, ксантановую камедь, катионную гуаровую камедь, агар, нецеллюлозные полисахариды, сахариды, такие как глюкоза, глицерин, пропандиол, виниловые полимеры, акриловые смолы, поливиниловый спирт, карбоксивиниловый полимер и, в частности, гиалуроновую кислоту);

• лосьонов (для которых подходящие материалы матрицы включают производные целлюлозы, глицерин, нецеллюлозные полисахариды, полиэтиленгликоли различной молекулярной массы и пропандиол);

• паст или мазей (для которых подходящие материалы для матрицы пасты включают глицерин, вазелин, парафин, полиэтиленгликоли различной молекулярной массы и т.д.);

• кремов или пен (для которых подходящие вспомогательные вещества (например, вспенивающие агенты) включают гидроксипропилметилцеллюлозу, желатин, полиэтиленгликоли различной молекулярной массы, додецилсульфат натрия, натрий-полиоксиэтилен-эфирсульфонат жирных спиртов, порошок кукурузного глютена и акриламид);

• порошковых аэрозолей (для которые подходящие вспомогательные вещества включают маннит, глицин, декстрин, декстрозу, сахарозу, лактозу, сорбит и полисорбаты, например, сухое порошкообразное вещество для ингаляций); и/или

• жидких, например, водных (аэрозольных) спреев для перорального применения или для ингаляций (для которых подходящие вспомогательные вещества включают модификаторы вязкости, такие как гиалуроновая кислота, сахара, такие как глюкоза и лактоза, эмульгаторы, буферные агенты, спирты, воду, консерванты, подсластители, ароматизаторы и т.д.);

• растворов или суспензий для инъекций (которые могут быть водными, или в противном случае подходящие вспомогательные вещества для них включают растворители и сорастворители, солюбилизирующие агенты, смачивающие агенты, суспендирующие агенты, эмульгирующие агенты, загустители, хелатообразующие агенты, антиоксиданты, восстановители, противомикробные консерванты, буферы и/или модификаторы рН, объемообразующие агенты, защитные агенты и агенты для модификации тоничности).

В такие лекарственные формы при необходимости можно добавлять также увлажняющие агенты, такие как глицерин, полиэтиленгликоль, трегалоза, глицерин, петролатум, парафиновое масло, кремнийорганическое масло, гиалуроновая кислота и ее соли (например, натриевая и калиевая соли), триглицерид октановой/каприловой кислоты и т.п.; и/или антиоксиданты, такие как витамины и глутатион; и/или модификаторы рН, такие как кислоты, основания и рН-буферы. Кроме того, можно добавлять поверхностно-активные вещества/эмульгаторы, такие как гексадеканол (цетиловый спирт), жирные кислоты (например, стеариновую кислоту), додецилсульфат натрия (лаурилсульфат натрия), сложные эфиры сорбита (например, сорбитанстеарат, сорбитанолеат и т.д.), моноацилглицериды (такие как глицерилмоностеарат), полиэтоксилированные спирты, поливиниловые спирты, сложные эфиры полиолов, алкиловые простые эфиры полиоксиэтилена (например, полиоксиэтилен-сорбитанмоноолеат), производные полиоксиэтилен-касторового масла, этоксилированные сложные эфиры жирных кислот, полиоксиглицериды, лаурилдиметиламиноксид, соли желчных кислот (например, дезоксихолат натрия, холат натрия), фосфолипиды, N,N-диметилдодециламин-N-оксид, гексадецилтриметиламмония бромид, полоксамеры, лецитин, стеролы (например, холестерин), сложные эфиры сахаров, полисорбаты и т.п.; консерванты, такие как феноксиэтанол, этилгексилглицерин и т.п.; и загустители, такие как сополимер акрилоилдиметилтаурат/VP. В частности, можно добавлять стеариновую кислоту, глицерилмоностеарат, гексадеканол, сорбитанстеарат, цетиловый спирт, глицерид октановой/каприновой кислоты и т.д., в частности, в кремовые лекарственные формы.

Соединения по данному изобретению и (например, фармацевтические) лекарственные формы (например, водные растворы, гели, кремы, мази, лосьоны, пены, пасты и/или сухие порошки, описанные выше), содержащие их, можно дополнительно комбинировать с соответствующим материалом матрицы для получения перевязочного материала или терапевтического пластыря для нанесения на биологическую поверхность, такую как поверхность кожи или слизистой оболочки. Следовательно, такие лекарственные формы можно использовать для пропитывания материала матрицы, такого как марля, нетканый материал или шелковая бумага. Альтернативно, терапевтический пластырь может быть, например, пластырем, маской для лица, маской для глаз, маской для рук, маской для ног и т.д.

Для нанесения таких перевязочных материалов на раны можно использовать вазелин, но авторами данного изобретения обнаружено также, что мази на основе ПЭГ (например, ПЭГ 400) можно объединять с материалами матрицы для получения перевязочных материалов без необходимости использовать вазелин.

Соединения по данному изобретению можно вводить для ингаляций в форме суспензии, сухого порошка или раствора. Подходящие устройства для ингаляции включают дозирующие ингаляторы по давлением (pMDI), которые могут активироваться вручную или от вдоха, и которые можно использовать со стандартным спейсерным устройством или без него), порошковые ингаляторы (DPI), которые могут содержать одну дозу, несколько доз, и бустерные и жидкостные ингаляторы (SMI) или небулайзеры, в которых аэрозольное лекарственное средство в форме мельчайших капель доставляется с меньшей скоростью, чем при доставке спрея с использованием, например, pMDI.

В pMDI соединения по данному изобретению можно вводить в виде суспензии под давлением или микронизированных частиц, распределенных в газе-вытеснителе (например, гидрофторалканах, вместе со вспомогательными веществами, такими как маннит, лактоза, сорбит и т.д.), или в виде этанольных растворов для доставки одной или более дозированных доз от около 20 до около 100 мкл за каждое срабатывание. Срабатывание можно запускать вручную (например, надавливанием) или при вдыхании (срабатывание на вдохе), для чего необходима система, срабатывающая от какого-либо потока, на пружинном управлении.

В DPI соединения по данному изобретению можно вводить в форме микронизированных частиц (размером от примерно 1 до примерно 5 мкм), отдельно или в смеси с неактивным вспомогательным веществом, имеющим более крупный размер частиц (например, с маннитом), внутри капсулы, которая может быть предварительно вставлена или вставлена в устройство вручную. Ингаляция из DPI может обеспечивать разрушение агрегатов частиц лекарственного препарата и их распределение в дыхательных путях.

В SMI соединения по данному изобретению могут находиться в форме раствора в картридже, который вставляют в устройство. Пружина может обеспечивать высвобождение дозы в микропомпу, что приводит к высвобождению дозы при нажатии кнопки с высвобождением струйных потоков лекарственного раствора.

Для введения соединений по данному изобретению в форме мелкодисперсного аэрозоля или аэролизированного раствора также можно использовать различные небулайзеры. Небулайзеры могут включать струйный небулайзер, синхронизированный с дыханием (в котором воздушный поток с помощью компрессора движется через форсунку, обеспечивая аэролизацию лекарственного раствора); активируемые от вдоха небулайзеры (в которых после вдоха пациента воздушный поток с помощью компрессора движется через трубку, вызывая аэролизацию лекарственного раствора); ультразвуковые небулайзеры (в которых вибрируют пьезоэлектрические кристаллы, вызывая аэролизацию под действием нагревания, обусловливающего распыление); небулайзеры с вибрирующей сеткой (в которых пьезоэлектрические кристаллы обеспечивают вибрацию сетчатой пластинки, что приводит к аэролизации с образованием очень мелких капель без существенного изменения температуры раствора во время распыления).

В соответствии с дополнительным аспектом данного изобретения, предложен способ получения фармацевтической композиции/лекарственной формы, определение которой приведено выше, который включает приведение в контакт соединения по данному изобретению, определение которого приведено выше, с одним или более фармацевтически приемлемыми вспомогательными веществами, описанными выше.

Соединения по данному изобретению также можно комбинировать для лечения с одним или более факторами роста, выбранными из факторов роста тромбоцитарного типа (включая тромбоцитарные факторы роста, PDGF); факторы роста из остеосаркомы (ODGF), эпидермальные факторы роста (EGF), трансформирующие факторы роста (TGFα и TGFβ), факторы роста фибробластов (αFGF, βFGF), инсулиноподобные факторы роста (IGF-I, IGF-II), факторы роста нервов (NGF), факторы роста интерлейкинового типа (IL-1, IL-1, IL-3), эритропоэтин (EPO) и колониестимулирующий фактор (CSF).

В соответствии с дополнительным аспектом данного изобретения, предложена (например, фармацевтическая) композиция, содержащая соединение по данному изобретению и одно или более фармацевтически приемлемых вспомогательных веществ, таких как адъювант, разбавитель или носитель. Предпочтительные лекарственные формы пригодны для местного нанесения, например, на слизистую оболочку (включая слизистые оболочки полости рта и/или носа, легкие, аноректальную зону и/или толстую кишку) или, более предпочтительно, на кожу, и, следовательно, содержат приемлемый для местного нанесения адъювант, разбавитель или носитель.

Таким образом, дополнительно предложены фармацевтические композиции, содержащие соединения по данному изобретению, которые пригодны, адаптированы и/или упакованы и представлены для местного нанесения (например, на слизистую оболочку, включая слизистые оболочки полости рта и/или носа, легкие, аноректальную зону и/или толстую кишку или, предпочтительно, на кожу), а также применение такой композиции для лечения расстройства, включая воспаление, воспалительное расстройство и/или патологическое состояние, характеризующееся воспалением (например, симптом), путем непосредственного местного применения указанной композиции (например, нанесения на слизистую оболочку, включая слизистые оболочки полости рта и/или носа, легкие, аноректальную зону и/или толстую кишку или, предпочтительно, на кожу).

В отношении данного аспекта изобретения, во избежание разночтений, лекарственные формы для местного применения, содержащие соединения по данному изобретению, можно использовать при любых и всех патологических состояниях, описанных в данном документе, включая лечение воспаления, для лечения любых и всех воспалительных расстройств и/или для лечения любых и всех патологических состояний, характеризующихся воспалением, которые упомянуты, определены или описаны выше. Аналогично, лекарственные формы для местного применения, содержащие соединения по данному изобретению, которые могут быть упомянуты, включают любые и все формы, которые упомянуты, определены или описаны выше. Любые и все релевантные описания в данном контексте включены посредством ссылки в отношении данного аспекта изобретения.

Композиции для местного применения (например, на основе жидкостей или (например, водных) растворов), содержащие соединения по данному изобретению, могут быть особенно применимы для обработки ран, и они могут облегчать боль (в том числе ноющую) и, в частности, прурит/зуд, связанный с самой раной и процессом заживления раны. Такие композиции для местного применения, содержащие соединения по данному изобретению, могут быть особенно пригодны для предупреждения и/или уменьшения экссудации физиологических жидкостей из ран, в частности, на острой стадии воспаления, например, в течение первых 48 часов после получения ожога или раны. Это предотвращает риск инфицирования и других физиологических реакций. Указанные лекарственные формы для местного применения, содержащие соединения по данному изобретению, также могут быть особенно применимы для предотвращения и/или подавления рубцевания и меланиновой пигментации (vide supra), связанной или не связанной с ранами.

Введение активных ингредиентов может быть непрерывным или периодическим. Способ введения также может зависеть от времени и частоты введения, и, кроме того, в случае терапевтического лечения воспаления зависит от тяжести состояния.

В зависимости от расстройства и пациента, подлежащего лечению, а также от способа введения, соединения по данному изобретению можно вводить пациенту, нуждающемуся в этом, в разных терапевтически эффективных дозах.

Аналогично, количество активного ингредиента в лекарственной форме может зависеть от тяжести состояния и от пациента, подлежащего лечению, но может быть определено специалистом в данной области техники.

В любом случае практикующий медик или другой специалист может практическим образом определить фактическую дозу, которая лучше всего подходит для конкретного пациента, в зависимости от тяжести состояния и способа введения. Вышеупомянутые дозы являются иллюстративными для среднего случая; конечно, могут иметь место отдельные случаи, в которых уместны более высокие или низкие диапазоны доз, и они входят в объем данного изобретения.

Дозы можно вводить от одного до четырех (например, трижды) раз в сутки.

Подходящие концентрации соединений по данному изобретению в готовом водном растворе могут составлять от около 0,01 (например, от около 0,1) до около 15,0 мг/мл, во всех случаях в пересчете на свободную (не солевую) форму соединения.

Подходящие местные дозы соединений по данному изобретению составляют от около 0,05 до около 50 мкг/см² обрабатываемой области, например, от около 0,1 (например, от около 0,5) до около 20 мкг/см² обрабатываемой области, включая от около 1 до около 10 мкг/см² обрабатываемой области, например, около 5 мкг/см² обрабатываемой области, во всех случаях в пересчете на свободную (не солевую) форму соединения.

Подходящие дозы соединений по данному изобретению для назального введения (например, посредством ингаляции) составляют от около 0,01 мкг до около 2000 мг, например, от около 0,1 мкг до около 500 мг, или от около 1 мкг до около 100 мг. Конкретные дозы для назального введения, которые могут быть упомянуты, включают дозы от около 10 мкг до около 1 мг, в частности, дозу около 0,1 мг (т.е. около 100 мкг). Обнаружено, что назальное введение около 0,1 мг в сутки соединений по данному изобретению является особенно эффективным для лечения патологических состояний, связанных с воспалением носовых проходов и слизистой оболочки, таких как ринит (например, аллергический ринит).

Подходящие дозы соединений по данному изобретению для пульмонального введения (например, посредством ингаляции) составляют от около 0,01 мкг до около 2000 мг, например, от около 0,1 мкг до около 500 мг, или от около 1 мкг до около 100 мг. Конкретные дозы для пульмонального введения, которые могут быть упомянуты, включают дозы от около 10 мкг до около 10 мг, в частности, дозу от около 0,6 мг (т.е. 60 мкг) до 6 мг (например, для применения для лечения ХОБЛ или идиопатического фиброза легких).

Предпочтительно, значения рН композиций, содержащих соединения по данному изобретению, составляют от около 1,0 до около 9,0 (например, от около 3,0 до около 8,0).

В любом случае доза, введенная млекопитающему, в частности, человеку, в контексте данного изобретения должна быть достаточной для обеспечения терапевтического ответа у млекопитающего в течение целесообразного периода времени (как описано выше). Специалистам в данной области техники понятно, что выбор точно дозы и композиции, а также наиболее подходящей схемы доставки также зависит, среди прочего, от фармакологических свойств лекарственной формы, природы и тяжести патологического состояния, подлежащего лечению, и от физического состояния и ясности ума реципиента, а также от возраста, состояния, массы тела, пола и реакции пациента, подлежащего лечению, а также от стадии/тяжести заболевания, а также от генетических различий между пациентами.

В применении и способах, описанных в данном документе, соединения по данному изобретению также можно комбинировать с одним или более активными ингредиентами, пригодными для лечения воспаления и/или воспалительных расстройств (другими противовоспалительными агентами). Таким образом, указанные пациенты могут также (и/или уже) принимать терапию, основанную на введении одного или более указанных других активных ингредиентов, и авторы данного изобретения подразумевают под этим получение предписанной дозы одного или более активных ингредиентов, упомянутых в данном документе, до, одновременно и/или после лечения соединением по данному изобретению.

Такие противовоспалительные агенты, которые можно использовать в комбинации с соединениями по данному изобретению для лечения воспаления, включают терапевтические агенты, пригодные для лечения воспаления и/или заболеваний, характеризующихся воспалением в качестве одного из симптомов. В зависимости от патологического состояния, подлежащего лечению, такие противовоспалительные агенты могут включать НСПВП, антагонисты лейкотриенового рецептора (например, сам монтелукаст), кортикостероиды, анальгетики и некоторые ферменты, такие как трипсин, например, как описано далее. Соединения по данному изобретению также можно комбинировать с лейкотриеном B4 (LTB4).

В данном контексте соединения по данному изобретению для использования для лечения воспаления также можно комбинировать с одним или более адгезивными белками мидий (MAP), которые включают любые адгезивные белки, которые могут быть получены из биологических видов мидий, таких как Mytilus edulis (голубые мидии), включая белки полной длины, включая все подтипы, которые получены или могут быть получены из мидий, такие как коллагены пре-COL-P, пре-COL-D и пре-COL-NG, матричные белки ноги мидий PTMP и DTMP, и, более предпочтительно, mfps или mefps, такие как mefp-2, mefp-3, mefp-4, mefp-5, mefp-6 и особенно mefp-1, и включая смеси или комбинации любых указанных белков, таких как mefps. Природные MAP могут быть получены, например, смешанной адсорбционной хроматографией (см. Китайский патент № ZL200710179491.0), карбоксиметил-ионообменной хроматографией (см. Китайский патент № ZL200710179492.5) и/или высаливанием и диализом (Китайский патент № ZL200910087567.6). Коммерческие источники MAP включают USUN Bio Co. (Китай; доступный в продаже как MAP Medical Device®), BD Biosciences (США), Kollodis (Южная Корея) и Biopolymer (Швеция). Альтернативно, MAP могут быть получены известными способами рекомбинантных ДНК.

Производные (например, фармацевтически приемлемые производные) MAP можно также комбинировать с соединениями по данному изобретению, и они включают соединения, например, с молекулярной массой от около 500 Да до около 2000 Да (например, около 1500, например, около 1200, включая около 800 Да). Такие производные также могут включать другие соединения, которые содержат аминокислотные последовательности, которые являются такими же последовательностями или представляют собой (например, незначительные) варианты (как описано выше) последовательностей, которые идентифицированы в природных MAP и которые могут быть синтезированы химическими и/или биологическими способами (например, химическими модификациями природных MAP или прямым синтезом).

Например, как описано выше, выделенные декапептидные соединения последовательностей:

Ala-Lys-Pro-Ser-Tyr-Hyp-Hyp-Thr-DOPA-Lys (декапептид mefp-1, SEQ ID №: 4); и

Ala-Lys-Pro-Ser-Tyr-Hyp-Hyp-Thr-Tyr-Lys (SEQ ID №: 12)

представляют собой фармацевтически приемлемые низкомолекулярные производные MAP, которые можно комбинировать с соединением по данному изобретению.

Другие предпочтительные агенты, которые можно комбинировать с соединениями по данному изобретению, включают LTB4 (для лечения ран и ожогов), монтелукаст (для лечения воспалений вообще) и трипсин (для лечения воспаления слизистой оболочки, связанной, например, с вирусными инфекциями).

Соединения по данному изобретению также можно комбинировать с другими терапевтическими агентами, которые при введении, как известно, вызывают воспаление в качестве побочного эффекта.

Если соединения по данному изобретению можно «комбинировать» с другими терапевтическими агентами указанным образом, то активные ингредиенты можно вводить вместе в составе одной лекарственной формы или по отдельности (одновременно или последовательно) в разных лекарственных формах.

Такие комбинированные продукты предложены для введения соединений по данному изобретению вместе с другим терапевтическим агентом и, следовательно, могут быть представлены в виде отдельных лекарственных форм, причем по меньшей мере одна из таких лекарственных форм содержит соединение по данному изобретению, и по меньшей мере одна содержит другой терапевтический агент, либо могут быть представлены (т.е. составлены) в виде комбинированного препарата (т.е. представлены в виде единой лекарственной формы, содержащей соединение по данному изобретению и другой терапевтический агент).

Таким образом, дополнительно предложены:

(1) фармацевтическая лекарственная форма, содержащая соединение по данному изобретению; другой противовоспалительный агент или агент, который, как известно, вызывает воспаление в качестве побочного эффекта; и фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество (например, адъювант, разбавитель или носитель), и такая фармацевтическая лекарственная форма упомянута далее как «комбинированный препарат»; и

(2) набор, содержащий следующие компоненты:

(A) фармацевтическая лекарственная форма, содержащая соединение по данному изобретению в смеси с фармацевтически приемлемым адъювантом, разбавителем или носителем; и

(B) фармацевтическая лекарственная форма, содержащая другой противовоспалительный агент или агент, который, как известно, вызывает воспаление в качестве побочного эффекта, в смеси с фармацевтически приемлемым адъювантом, разбавителем или носителем,

причем каждый компонент (A) и (B) представлен в такой форме, которая подходит для введения в сочетании с другим компонентом.

В дополнительном аспекте данного изобретения предложен способ получения комбинированного препарата, описанного выше, включающий объединение соединения по данному изобретению, другого противовоспалительного агента или агента, который, как известно, вызывает воспаление в качестве побочного эффекта, и по меньшей мере одного (например, фармацевтически приемлемого) вспомогательного вещества.

В дополнительном аспекте данного изобретения предложен способ получения набора, описанного выше, включающий объединение компонентов (A) и (B). В данном контексте упоминание объединения означает обеспечение пригодности двух компонентов для введения в сочетании друг с другом.

Таким образом, в отношении способа получения набора компонентов, определение которого приведено выше, под «объединением» двух компонентов друг с другом понимают, что два компонента набора могут быть:

(i) представлены в виде отдельных лекарственных форм (т.е. независимо друг от друга), которые затем объединяют для применения в сочетании друг с другом в комбинированной терапии; или

(ii) упакованы и представлены вместе в виде отдельных компонентов «комбинированной упаковки» для применения в сочетании друг с другом в комбинированной терапии.

Таким образом, дополнительно предложен набор, содержащий:

(I) один из компонентов (A) и (B), описанных в данном документе; а также

(II) инструкции по применению указанного компонента в сочетании с другим из указанных двух компонентов.

Наборы, описанные в данном документе, могут содержать более одной лекарственной формы, содержащей соответствующее количество/дозу соединения по данному изобретению, и/или более одной лекарственной формы, содержащей соответствующее количество/дозу другого противовоспалительного агента, для обеспечения возможности повторного введения дозы. При наличии более чем одной лекарственной формы (содержащей любое активное соединение), такие лекарственные формы могут быть одинаковыми или могут быть различными с точки зрения дозы любого соединения, химического состава (составов) и/или физической формы (форм).

В отношении наборов, описанных в данном документе, «введение в сочетании» включает последовательное, раздельное и/или одновременное введение соответствующих лекарственных форм, содержащих соединение по данному изобретению и другой противовоспалительный агент, в течение курса лечения рассматриваемого состояния.

Так, в отношении комбинированного продукта по данному изобретению, термин «введение в сочетании» включает введение (необязательно многократное) двух компонентов комбинированного продукта (соединения по данному изобретению и другого противовоспалительного агента) вместе или достаточно близко по времени для обеспечения благоприятного эффекта для пациента, который в течение курса лечения рассматриваемого состояния выше, чем при введении (необязательно многократном) любой лекарственной формы, содержащей соединение по данному изобретению, или лекарственной формы, содержащей другой агент, по отдельности, в отсутствие другого компонента, в течение такого же курса лечения. Определение того, обеспечивает ли комбинация усиленное благотворное действие в отношении и в течение курса лечения конкретного состояния, зависит от состояния, подлежащего лечению или предупреждению, но может быть стандартным образом осуществлено специалистом в данной области техники.

Кроме того, в контексте набора по данному изобретению термин «в сочетании с» включает возможность введения (необязательно многократного) одной или другой из двух лекарственных форм до, после и/или в то же время, что и введение другого компонента. При использовании в данном контексте термины «введенные одновременно» и «введенные в то же время, что и» включают введение отдельных доз рассматриваемого соединения по данному изобретению и другого противовоспалительного агента в пределах 48 часов (например, 24 часов) относительно друг друга.

При использовании в данном контексте термин «около», например, в контексте количества, такого как концентрации и/или дозы активных ингредиентов, молекулярные массы или рН, предусмотрено, что такие переменные являются приблизительными и, следовательно, могут варьироваться на ± 10%, например, ± 5% и предпочтительно ± 2% (например, ± 1%) относительно значений, указанных в данном документе. В данном отношении термин «около 10%» означает, например, ±10% относительно числа 10, т.е. от 9% до 11%.

Преимуществом соединений по данному изобретению является возможность их использования при различных патологических состояниях, характеризующихся воспалением, независимо от того, является ли указанное состояние органическим воспалительным заболеванием per se, или оно связано с воспалением, или характеризуется воспалением (например, рана, ожог или вирусная инфекция).

Преимуществом применения и способов, описанных в данном документе, также может быть то, что для лечения патологических состояний, упомянутых выше, они могут быть более удобными для врача и/или пациента, могут быть более эффективными, могут быть менее токсичными, могут иметь более широкий спектр активности, могут быть более сильнодействующими, могут обеспечивать меньшее количество побочных эффектов или могут иметь другие ценные фармакологические свойства по сравнению с аналогичными соединениями или способами (лечения), известными из уровня техники, предназначенными для применения для лечения воспаления, воспалительных расстройств или расстройств, характеризующихся воспалением в качестве симптома (включая раны), или для иного применения.

Данное изобретение проиллюстрировано следующими примерами, в которых для разных соединений, включая соединения по данному изобретению, на Фиг. 1 представлена степень отечности в мышиной модели отечности уха; на Фиг. 2 показано содержание Hyp (и, следовательно, степень восстановления), и на Фиг. 3 показано содержание фактора роста сосудистого эндотелия и трансформирующего фактора роста бета-1 в тканях раны в мышиной модели острой раны; на Фиг. 4 показана степень незаживленности раны, на Фиг. 5 показана регенерация кожи, и на Фиг. 6 представлены оценки пролиферации фибробластов в мышиной модели диабетической раны; на Фиг. 7 показано отношение площади оставшейся раны к исходной площади раны; на Фиг. 8 - 11 представлены результаты гистопатологического анализа с точки зрения различных маркеров заживления раны (регенерации кожи, пролиферации фибробластов, воспаления и окрашивания по Массону, соответственно), и на Фиг. 12 показаны степени отека в различных группах в следующей модели диабетической раны; на Фиг. 13 и 17 показано влияние соединений по данному изобретению на отек, вызванный острым воспалением, в следующих мышиных моделях отечности; на Фиг. 14 показана степень незаживленности раны в дополнительной мышиной модели острой раны; на Фиг. 15 показано сравнение между соединениями по данному изобретению и известными противовоспалительными стероидами в мышиной модели отечности уха; и на Фиг. 16 показано содержание IL-1в в легочных тканях для различных соединений по данному изобретению в мышиной модели повреждения легких.

Примеры

Пример 1

Синтез монтелукаст-стирол-Ala-Lys-Pro-Ser-Tyr-Hyp-Hyp-Thr-Tyr-Lys (т.е. монтелукаст-стирола, ковалентно связанного с аминокислотой SEQ ID №: 12 на N-конце)

Для синтеза 3 ммоль пептида с SEQ ID №: 12 использовали следующий способ.

Смолу Fmoc-Lys-Boc-Wang (9,15 г, GLS180322-41301, GL Biochem, Шанхай, Китай) загружали в стеклянную реакционную колонку.

В колонку добавляли метиленхлорид (ДХМ, 200 мл; Shandong Jinling Chemical Industry Co Ltd, Шаньдун, Китай) и оставляли для пропитки смолы примерно на полчаса. Затем удаляли ДХМ вакуумной фильтрацией.

Смолу 3 раза промывали N,N-диметилформамидом (ДМФА, 200 мл; Shandong Shitaifeng Fertilizer Industry Co Ltd, Шаньдун, Китай).

В качестве раствора для снятия защиты добавляли 20% раствор пиперидина в ДМФА (200 мл; Shandong Shitaifeng Fertilizer Industry Co Ltd, Шаньдун, Китай) и проводили реакцию в течение 20 минут. Затем удаляли раствор вакуумной фильтрацией и шесть раз промывали колонку ДМФА.

В смолу добавляли Fmoc-Tyr(tBu)-OH (4,14 г; GLS170916-36901, GL Biochem, Шанхай, Китай) и тетрафторборат 2-(1H-бензотриазол-1-ил)-1,1,3,3-тетраметиламиния (TBTU, 2,89 г; GLS170805-00705, GL Biochem, Шанхай, Китай). В реакционную колонку добавляли ДМФА (150 мл), затем N,N-диизопропилэтиламин (DIPEA, 2,33 г; Suzhou Highfine Biotech Co. Ltd, Цзянсу, Китай). Через 30 минут обнаруживали изменение цвета смолы, что свидетельствует об окончании реакции. Удаляли растворитель вакуумной фильтрацией.

Описанные выше стадии связывания повторяли для связывания остальных аминокислот в таких же количествах (в моль): Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-4-Hyp(tBu)-OH, Fmoc-4-Hyp(tBu)-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH и Fmoc-Ala-OH.

Наконец, к смоле добавляли монтелукаст (5,47 г; MedChemExpress, MCE China, Шанхай, Китай). Через 15 минут жидкость сливали и промывали колонку ДМФА, ДХМ и метанолом, каждый растворитель по три раза, соответственно.

Добавляли 91,5 мл (т.е. 10 мл на грамм смолы) лизата, который состоял из 95% трифторуксусной кислоты (ТФК), 2,5% воды и 2,5% триизопропилсилана (Tis), чтобы покрыть им пептидсодержащее соединение, связанное со смолой. Во время расщепления проводили также снятие защиты с боковых цепей. После расщепления удаляли твердую подложку фильтрованием и концентрировали фильтрат при пониженном давлении. Расщепленный пептид осаждали диэтиловым эфиром и лиофилизировали с получением 600 мг неочищенного соединения, указанного в заголовке.

1 мг неочищенного продукта растворяли в 1 мл смеси ацетонитрила и воды (1:3) и обнаруживали его с помощью ВЭЖХ помпы P3000A и полупрепаративного устройства LC3000 (модель препаративной колонки: GS-120-10-C18-AP 30 мм; Beijing Chuangxintongheng Science & Technology Co., Ltd., Пекин, Китай). Рассчитывали соответствующий градиент для элюирования и обнаруживали целевой пик при 11,035 по ЖХМС (модель аналитической колонки: GS-120-5-C18-BIO, 4,6*250 мм; обнаружение: УФ при 220 нм; растворитель A: 0,1% ТФК в MeCN, растворитель A: 0,1% ТФК в воде; скорость потока 1,0 мл/мин.; объем: 10 мкл).

Неочищенное соединение обессоливали с помощью анионообменной смолы, анализировали и сушили заморозкой. После очистки получали приблизительно 50 мг очищенного пептида, который повторно проверяли для подтверждения.

МС: m/z 866,90 [M+2H]²⁺.

На основании характеристических данных, доступных и представленных в данном документе, можно сделать вывод, что соединение, полученное в данном примере, является соединением, которое идентифицировано выше в качестве указанного в заголовке соединения. В остальном соединение, полученное в примере 1, представляет собой соединение по данному изобретению, для которого в соединении формулы I n равен 0, и указанное соединение формулы I ковалентно связано с аминокислотой SEQ ID №: 12 на N-конце. В любом случае, соединение из примера 1 упомянуто далее как «Соединение A».

Пример 2

Синтез Ala-Lys-Pro-Ser-Tyr-Hyp-Hyp-Thr-DOPA-Lys-(монтелукаст-стирола) (т.е. монтелукаст-стирола, ковалентно связанного с аминокислотой SEQ ID №: 4 на C-конце Lys)

Использовали такой же способ, как описан выше в примере 1, исходя из Fmoc-Lys(Dde)-OH (CAS №: 150629-67-7), на смоле Wang.

Добавляли 25% раствор пиперидина в ДМФА (200 мл; Shandong Shitaifeng Fertilizer Industry Co Ltd, Шаньдун, Китай) для удаления защитной группы Fmoc.

Добавляли вторую защищенную аминокислоту Fmoc-DOPA(ацетонид)-OH вместе с TBTU и DIPEA до завершения реакции.

Описанные выше стадии связывания повторяли для связывания остальных аминокислот в таких же количествах (в моль): Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-4-Hyp(tBu)-OH, Fmoc-4-Hyp(tBu)-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH и Fmoc-Ala-OH.

Пептидил-смолу помещали в колбу и обрабатывали 2% раствором моногидрата гидразина в ДМФА (25 мл/г). Колбу закрывали пробкой и оставляли смесь стоять при комнатной температуре в течение 3 минут. Затем смолу промывали ДМФА. К смоле добавляли монтелукаст (5,47 г; MedChemExpress, MCE China, Шанхай, Китай) вместе с TBTU и DIPEA и проводили реакцию полученной смеси в течение 1 часа.

Защищенную пептидил-смолу обрабатывали 91,5 мл лизата (смесь 95% ТФК, 2,5% воды и 2,5% Tis) в течение 1 часа. После расщепления удаляли твердую подложку фильтрованием и концентрировали фильтрат при пониженном давлении. Расщепленный пептид осаждали диэтиловым эфиром и лиофилизировали с получением около 600 мг неочищенного соединения, указанного в заголовке.

После очистки получали 50 мг чистого продукта.

МС: m/z 875,75 [M+2H]²⁺.

На основании характеристических данных, доступных и представленных в данном документе, можно сделать вывод, что соединение, полученное в данном примере, является соединением, которое идентифицировано выше в качестве указанного в заголовке соединения. В остальном соединение, полученное в примере 2, представляет собой соединение по данному изобретению, для которого в соединении формулы I n равен 0, и указанное соединение формулы I ковалентно связано с аминокислотой SEQ ID №: 4 на C-конце Lys. В любом случае, соединение из примера 2 упомянуто далее как «Соединение B».

Пример 3

Синтез монтелукаст-стирол-Ala-Lys-Pro-pSer-Tyr-Hyp-Hyp-Thr-Tyr-Lys (т.е. монтелукаст-стирола, ковалентно связанного с аминокислотой SEQ ID №: 13 на N-конце)

Использовали такой же способ, как описан ниже в примере 4, исходя из Fmoc-Lys(Dde)-OH (CAS №: 150629-67-7), на смоле Wang.

Добавляли 25% раствор пиперидина в ДМФА (200 мл; Shandong Shitaifeng Fertilizer Industry Co Ltd, Шаньдун, Китай) для удаления защитной группы Fmoc.

Добавляли вторую защищенную аминокислоту Fmoc-Tyr(tBu)-OH (GLS170916-36901, GL Biochem, Шанхай, Китай) вместе с ByBOP и DIPEA до завершения реакции.

Описанные выше стадии связывания повторяли для связывания остальных аминокислот в таких же количествах (в моль): Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-4-Hyp(tBu)-OH, Fmoc-4-Hyp(tBu)-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH, Fmoc-pSer(tBu)-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH и Fmoc-Ala-OH.

Пептидил-смолу помещали в колбу и обрабатывали 2% раствором моногидрата гидразина в ДМФА (25 мл/г). Колбу закрывали пробкой и оставляли смесь стоять при комнатной температуре в течение 3 минут. Затем смолу промывали ДМФА. К смоле добавляли монтелукаст (1,8 г; MedChemExpress, MCE China, Шанхай, Китай) вместе с TBTU и DIPEA и проводили реакцию полученной смеси в течение 1 часа.

Добавляли лизат (10 мл на грамм смолы), который состоял из 95% трифторуксусной кислоты (ТФК), 2,5% воды и 2,5% триизопропилсилана (Tis), чтобы покрыть им пептидсодержащее соединение, связанное со смолой. Во время расщепления проводили также снятие защиты с боковых цепей. После расщепления удаляли твердую подложку фильтрованием и концентрировали фильтрат при пониженном давлении. Расщепленный пептид осаждали диэтиловым эфиром и лиофилизировали с получением 1,4 г неочищенного пептида.

1 мг неочищенного продукта растворяли в 1 мл смеси ацетонитрила и воды (1:3) и обнаруживали его с помощью ВЭЖХ помпы P3000A и полупрепаративного устройства LC3000 (модель препаративной колонки: GS-120-10-C18-AP 30 мм; Beijing Chuangxintongheng Science & Technology Co., Ltd., Пекин, Китай). Рассчитывали соответствующий градиент для элюирования и обнаруживали целевой пик с помощью ЖХМС (модель аналитической колонки: GS-120-5-C18-BIO, 4,6*250 мм).

Неочищенное соединение обессоливали с помощью анионообменной смолы, анализировали и сушили заморозкой, и повторно испытывали для подтверждения.

После очистки получали 98 мг чистого продукта (показатель выхода приблизительно 7% из неочищенного продукта).

МС: m/z 907,3 [M+2H]²⁺.

На основании характеристических данных, доступных и представленных в данном документе, можно сделать вывод, что соединение, полученное в данном примере, является соединением, которое идентифицировано выше в качестве указанного в заголовке соединения. В остальном соединение, полученное в примере 3, представляет собой соединение по данному изобретению, для которого в соединении формулы I n равен 0, и указанное соединение формулы I ковалентно связано с аминокислотой SEQ ID №: 13 на N-конце. В любом случае, соединение из примера 3 упомянуто далее как «Соединение C».

Пример 4

Синтез Ala-Lys-(монтелукаст-стирол)-Pro-Ser-Tyr-Hyp-Hyp-Thr-Tyr-Lys-(монтелукаст-стирола) (т.е. двух молекул монтелукаст-стирола, ковалентно связанных через остатки Lys с аминокислотой SEQ ID №: 12)

Для синтеза 1 ммоль пептида с SEQ ID №: 12 использовали следующий способ.

Fmoc-Lys(Dde)-OH (CAS №: 150629-67-7) на смоле Wang (3 г, GL Biochem, Шанхай, Китай) загружали в стеклянную реакционную колонку.

В колонку добавляли метиленхлорид (ДХМ, 60 мл; Shandong Jinling Chemical Industry Co Ltd, Шаньдун, Китай) и оставляли для пропитки смолы примерно на полчаса. Затем удаляли ДХМ вакуумной фильтрацией.

Смолу 3 раза промывали N,N-диметилформамидом (ДМФА, 60 мл; Shandong Shitaifeng Fertilizer Industry Co Ltd, Шаньдун, Китай).

В качестве раствора для снятия защиты добавляли 20% раствор пиперидина в ДМФА (30 мл; Shandong Shitaifeng Fertilizer Industry Co Ltd, Шаньдун, Китай) и проводили реакцию в течение 20 минут. Затем удаляли раствор вакуумной фильтрацией и шесть раз промывали колонку ДМФА.

К смоле добавляли Fmoc-Tyr(tBu)-OH (1,4 г; GLS170916-36901, GL Biochem, Шанхай, Китай) и гексафторфосфат (бензотриазол-1-илокси)трипирролидинофосфония (ByBOP, 1,56 г; Suzhou Highfine Biotech Co. Ltd, Цзянсу, Китай), затем DIPEA (1 мл; Suzhou Highfine Biotech Co. Ltd, Цзянсу, Китай). Через 30 минут обнаруживали изменение цвета смолы, что свидетельствует об окончании реакции. Удаляли растворитель вакуумной фильтрацией.

Описанные выше стадии связывания повторяли для связывания остальных аминокислот в таких же количествах (в моль): Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-4-Hyp(tBu)-OH, Fmoc-4-Hyp(tBu)-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Lys(Dde)-OH и Boc-Ala-OH.

Пептидил-смолу помещали в колбу и обрабатывали 2% раствором моногидрата гидразина в ДМФА (25 мл/г). Колбу закрывали пробкой и оставляли смесь стоять при комнатной температуре в течение 3 минут. Затем смолу промывали ДМФА. К смоле добавляли монтелукаст (3,6 г; MedChemExpress, MCE China, Шанхай, Китай) вместе с TBTU и DIPEA и проводили реакцию полученной смеси в течение 1 часа.

Добавляли лизат (30 мл; 10 мл на грамм смолы), который состоял из 95% трифторуксусной кислоты (ТФК), 2,5% воды и 2,5% триизопропилсилана (Tis), чтобы покрыть им пептидсодержащее соединение, связанное со смолой. Во время расщепления проводили также снятие защиты с боковых цепей. После расщепления удаляли твердую подложку фильтрованием и концентрировали фильтрат при пониженном давлении. Расщепленный пептид осаждали диэтиловым эфиром и лиофилизировали с получением 1,6 г неочищенного пептида.

1 мг неочищенного продукта растворяли в 1 мл смеси ацетонитрила и воды (1:3) и обнаруживали его с помощью ВЭЖХ помпы P3000A и полупрепаративного устройства LC3000 (модель препаративной колонки: GS-120-10-C18-AP 30 мм; Beijing Chuangxintongheng Science & Technology Co., Ltd., Пекин, Китай). Рассчитывали соответствующий градиент для элюирования и обнаруживали целевой пик с помощью ЖХМС (модель аналитической колонки: GS-120-5-C18-BIO, 4,6*250 мм).

Неочищенное соединение обессоливали с помощью анионообменной смолы, анализировали и сушили заморозкой, и повторно испытывали для подтверждения. Из 1,6 г неочищенного пептида получали 20 мг очищенного пептида (чистота 90%-95%).

МС: m/z 762,2 [M+3H]³⁺.

На основании характеристических данных, доступных и представленных в данном документе, можно сделать вывод, что соединение, полученное в данном примере, является соединением, которое идентифицировано выше в качестве указанного в заголовке соединения. В остальном соединение, полученное в примере 4, представляет собой соединение по данному изобретению, для которого в соединении формулы I n равен 0, и указанное соединение формулы I ковалентно связано с аминокислотой SEQ ID №: 12 через остатки Lys. В любом случае, соединение из примера 4 упомянуто далее как «Соединение D».

Пример 5

Мышиная модель I отечности уха

35 здоровых самцов мышей BALB/c возрастом 6-8 недель со средней массой тела 18-25 г, приобретенных у компании Changzhou Cvens Experimental Animal Co. Ltd., содержали и наблюдали в течение около 1 недели до эксперимента. Температура в помещении составляла 25-27 °С при влажности 74%, с чередованием периодов освещения и темноты по 12 часов и со свободным доступом к корму и воде. Мышей случайным образом разделяли на 7 групп, как показано ниже в таблице 1, по 5 мышей в каждой группе.

В качестве аутологического контроля использовали левое ухо каждой мыши. Правое ухо каждой мыши обрабатывали различными препаратами, как показано ниже в таблице 1. На правое ухо каждой мыши, внутри и снаружи, наносили 20 мкл ксилола (Shanghai Aladdin Bio-Chem Technology Co., Ltd., Шанхай, Китай). Примерно за 4 минуты ухо начинало опухать. Затем на правое ухо в каждой группе наносили 0,08 г каждого экспериментального препарата или носителей. Мышей помещали обратно в клетки.

Получали крем на основе монтелукаста натрия (Mon), состоящий из следующих компонентов: монтелукаст натрия (200 мг; Arromax Pharmatech Co., Ltd, Сучжоу, Китай), стеариновая кислота (2 г), моностеарат глицерина (2 г), гексадеканол (2 г), глицерин (5 г) и гидроксид натрия (0,25 г) (все компоненты производства Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd, Шанхай, Китай); сополимер акрилоилдиметилтаурата аммония/VP (0,13 г; Clariant Chemical (Guangzhou) Co., Ltd., Гуанчжоу, Китай); феноксиэтанол (0,3 г) и этилгексилглицерин (0,1 г) (оба производства компании Shanghai Rayson Chemicals Co., Ltd., Шанхай, Китай); и очищенная вода (88,42 г).

Смешивали стеариновую кислоту, моностеарат глицерина и гексадеканол и нагревали до 85 °С при перемешивании до полного расплавления смеси. Смешивали сополимер акрилоилдиметилтаурата аммония/VP, очищенную воду и гидроксид натрия при перемешивании при 85 °С с получением однородной коллоидной суспензии. Затем объединяли монтелукаст натрия, глицерин, феноксиэтанол и этилгексилглицерин при перемешивании до полного растворения монтелукаста.

Смесь сополимера/воды добавляли к смеси, содержащей стеариновую кислоту, которую эмульгировали при быстром перемешивании в течение пяти минут с помощью оборудования для получения эмульсий. Полученную эмульсию охлаждали до 55 °С, при перемешивании добавляли смесь, содержащую монтелукаст. Полученную смесь оставляли остывать до комнатной температуры с получением готового продукта.

Крем дексаметазона (DEX) получали таким же способом, за исключением того, что вместо монтелукаста использовали 0,4 мг дексаметазона (Shanghai Aladdin Bio-Chem Technology Co., LTD, Шанхай, Китай).

Получали гель, содержащий соединение A («гель A»), который состоял из следующих компонентов: 0,5 г порошка соединения A (приобретенного у компании GL Biochem, Шанхай, Китай; полученного так, как описано выше в примере 1), метилцеллюлоза (2,2 г; Shandong Guangda Technology Development Co., Ltd., Шаньдун, Китай), глицерин (11 г) и пропандиол (11 г) (оба производства Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd.), и очищенная вода (75,3 г).

Метилцеллюлозу и воду смешивали друг с другом и перемешивали до получения однородной коллоидной суспензии. Затем к смеси метилцеллюлозы/воды добавляли порошок соединения A, глицерин и пропандиол и быстро перемешивали полученную смесь в течение 5 минут с получением готового продукта.

Гель на основе Ala-Lys-Pro-Ser-Tyr-Hyp-Hyp-Thr-Tyr-Lys (соединение 1 (SEQ ID №: 12); 1,5 г; приобретенного в форме порошка у компании GL Biochem, Шанхай, Китай, и полученного по существу таким же способом, как описано выше в примере 1, без связывания монтелукаста на конце) получали таким же способом, как описано выше для соединения A («гель 1»).

Носитель 1 в приведенной ниже таблице 1 представляет собой кремовую основу без активных ингредиентов. Носитель 2 в приведенной ниже таблице 1 представляет собой гелевую основу без активных ингредиентов. Оба получали таким же способом, как описано выше, без добавления активного ингредиента.

Таблица 1

Группа Концентрация лекарственного соединения Нанесение лекарственного соединения на правое ухо Общее количество лекарственных соединений (мкг/мышь) Модель / Ксилол / Носитель 1 / ксилол + крем
без АФИ / Носитель 2 / ксилол + гель без АФИ / DEX 10 мкг/мкл ксилол + крем Dex 400 Mon 5 мг/г ксилол + крем Mon 500 Гель 1 1,5 мг/г ксилол + гель соединения 1 120 Гель A 0,5 мг/г ксилол + гель соединения A 40

Мышей усыпляли смещением шейных позвонков через 40 минут. Отсекали левое и правое ухо. Для получения кусочка уха из одинаковых участков обоих ушей использовали кожный мешочек (Electron Microscopy Sciences, Хатфилд, штат Пенсильвания, США) диаметром 8 мм. Записывали массу и рассчитывали степень опухания следующим образом:

Степень отечности = (масса правого уха - масса левого уха) / масса левого уха × 100%

и полученные результаты представлены ниже в таблице 2 и на Фиг. 1.

Таблица 2

Модель Носитель 1 Носитель 2 Крем Dex Крем Mon Соединение 1 Соединение А 97,4 95% 97% 45% 38% 61,5% 55% 0,03 0,2 0,35 0,19 0,25 0,17 0,06

Представленные выше результаты демонстрируют, что оба экспериментальных соединения уменьшают ксилол-индуцированную отечность.

Пример 6

Модель I острой раны

6-8-Недельных самцов мышей C57BL/6 приобретали у компании Changzhou Cvens Experimental Animal Co. Ltd. Перед выполнением любых экспериментов мышей содержали в стандартизированных условиях (при постоянной температуре или 22 ± 2 °C, с чередованием периодов освещения и темноты по 12 часов) и кормили стандартным кормом для мышей с водой, в течение около одной недели.

Общую анестезию проводили с помощью интраперитонеального введения 3% хлоральгидрата (Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.; 1 мл/10 г массы тела). Шерсть на спинке сбривали детской бритвой и проводили депиляцию кремом. Эту часть кожи вытирали и дважды стерилизовали 75% спиртом.

Использовали перфоратор для биопсии кожи EMS (Electron Microscopy Sciences, P.O. Box 550, 1560 Industry Road, Хатфилд, штат Пенсильвания, 19440) диаметром 18 мм для получения круглой раны на средней линии спины. Удаляли кожу по всей толщине и по глубине достигали оболочки мышц. Раны оставляли открытыми без швов.

Местно наносили различные лекарственные соединения в количестве 50 мкл на рану, один раз в сутки с 0 дня по 7 день. Модельной группе вводили такое же количество физиологического солевого раствора. В данном эксперименте использовали 7 групп, содержащих 56 мышей, как показано ниже в таблице 3.

Рекомбинантный человеческий эпидермальный фактор роста (rhEGF, Shanghai Haohai Biological Technology Co. Ltd, Шанхай) приобретали и готовили по инструкциям производителя. Лиофилизированный порошок rhEGF (100000 МЕ/флакон) растворяли в 20 мл физиологического солевого раствора с получением раствора с концентрацией 5000 МЕ/мл. Рабочая доза rhEGF для данного эксперимента составляла 1285 МЕ на рану.

Соединение B приобретали в форме порошка у компании GL Biochem и получали так, как описано выше в примере 2. Ala-Lys-Pro-Ser-Tyr-Hyp-Hyp-Thr-DOPA-Lys (соединение 2; SEQ ID №: 4) приобретали в форме порошка у компании GL Biochem, и получали по существу так, как описано выше в примере 2, но без связывания монтелукаста на конце. Порошки хранили при -20 °С и растворяли в солевом растворе в концентрациях, указанных ниже в таблице 3 (L и H означают низкие и высокие дозы, соответственно).

Таблица 3

Группа Значение Количество Доза на рану в сутки Контроль Мыши C57 без ран / / Модель Мыши C57 с ранами/физиологический солевой раствор 8 Физиологический солевой раствор rhEGF Мыши C57 с ранами/EGF 8 1285 МЕ 2 H Мыши C57 с ранами/высокая доза соединения 2 8 77,15 мкг 2 L Мыши C57 с ранами/низкая доза соединения 2 8 3,09 мкг B H Мыши C57 с ранами/высокая доза соединения B 8 112,53 мкг B L Мыши C57 с ранами/низкая доза соединения B 8 4,50 мкг

Гидроксипролин (Hyp) представляет собой непротеиногенную аминокислоту, встречающуюся в коллагене, содержащем приблизительно 12-14% Hyp по массе. Таким образом, содержание Hyp в гидролизатах тканей является прямой мерой количества присутствующего коллагена, и содержание Hyp, присутствующего в раневой ткани, напрямую указывает на степень заживления. Содержание Hyp в каждой группе на 4 день и на 7 день после начала лечения представлено на Фиг. 2.

Результаты демонстрируют, что экспериментальные соединения повышают содержание Hyp во всех экспериментальных группах. Более низкая доза соединения 2 и соединения B демонстрирует эффект на ранней стадии (на 4 день (D4)). Более высокие дозы обоих экспериментальных соединений также демонстрируют эффект ускорения выработки Hyp на 7 день (D7).

Фактор роста сосудистого эндотелия (VEGF) и трансформирующий фактор роста бета-1 (TGF-β1) играют значительные роли в процессе заживления ран. VEGF и TGF-β1 часто совместно экспрессируются в тканях, в которых происходит ангиогенез. Также определяли содержание указанных двух факторов в раневых тканях и отображали на Фиг. 3.

Результаты демонстрируют, что указанные два пептида могут стимулировать выработку VEGF и TGF-β1.

Пример 7

Модель I диабетической раны

Аналогичный эксперимент с по существу таким же протоколом, как описан выше в примере 6, проводили на 8-12-недельных самцах мышей db/db (C57BL/KsJ-db/db) с массой тела 35-45 г/мышь (Changzhou Cvens Experimental Animal Co. Ltd.).

Для образования ран использовали перфоратор для биопсии кожи EMS диаметром 18 мм.

Местно наносили различные лекарственные соединения в количестве 50 мкл на рану, один раз в сутки с 0 дня по 12 день. Модельной группе вводили такое же количество физиологического солевого раствора. В данном эксперименте использовали 7 групп, содержащих 52 мыши, как показано ниже в таблице 4.

Таблица 4

Группа Значение Доза/сутки Концентрация Контроль Мыши без ран / / Модель мыши с ранами, обработанными физиологическим солевым раствором Физиологический солевой раствор / rhEGF мыши с ранами, обработанными rhEGF 1285 МЕ 25,7 МЕ/мкл 1 L мыши с ранами, обработанными соединением 1 (низкая доза) 3,05 мкг 0,061 мкг/мкл A M мыши с ранами, обработанными соединением A (средняя доза) 22,3 мкг 0,446 мкг/мкл Mon L мыши с ранами, обработанными монтелукастом (низкая доза) 40 мкг 0,8 мкг/мкл 1 + Mon мыши с ранами, обработанными половиной дозы соединения 1 и половиной дозы монтелукаста 1,525 мкг + 20 мкг 25 мкг/мкл + 25 мкг/мкл

Каждую рану фотографировали через день после 0 дня. Фотографии сканировали в компьютер и рассчитывали площадь ран с помощью программного обеспечения для анализа изображений ImageJ (National Institute of Health, США).

Площадь незаживленной раны выражали в процентах от исходной площади раны:

A_t/A₀ × 100%,

где A₀ и A_t относятся к исходной площади в 0 день и к площади раны в день измерения (время t), соответственно.

Степень незаживленности ран показана на Фиг. 4. Полученный результат указывает на то, что соединение A оказывает наилучший эффект на усиление заживления раны и является более эффективным, чем комбинация соединения 1 с монтелукастом.

Анализировали гистологические образцы и определяли оценки регенерации кожи, пролиферации фибробластов, оценки регенерации коллагена (оценка Масона) и оценки воспаления.

Срезы, окрашенные по HE и Массону, рассматривали под оптическим микроскопом и оценивали (1, 2 или 3 балла) в соответствии со следующими критериями. Оценка регенерации кожи составляла 1 балл, если площадь, покрытая новой кожей, составляла не более одной трети площади раны; оценка составляла 2 балла, если новая кожа покрывала площадь более одной трети, но менее двух третей площади раны; и оценка составляла 3 балла, если площадь, покрытая новой кожей, составляла по меньшей мере две трети площади раны.

Оценки регенерации кожи представлены на Фиг. 5.

Пролиферацию фибробластов оценивали по следующим критериям, и результаты представлены на Фиг. 6.

Оценка пролиферации фибробластов Гиперплазия коллагеновых волокон Оценка Миофибробластная пролиферация 1 Пролиферация фиброзной ткани 2 Коллаген, появившийся между фиброзными тканями 3

Результаты патологического анализа демонстрируют, что соединение A и соединение 1 могут ускорять регенерацию кожи и пролиферацию фибробластов. Конъюгат соединения A был немного эффективнее, особенно в отношении оценки пролиферации фибробластов.

Пример 8

Модель II диабетической раны

Аналогичный эксперимент с по существу таким же протоколом, как описан выше в примере 7, проводили на 8-12-недельных самцах мышей db/db (C57BL/KsJ-db/db) с массой тела 35-45 г/мышь (Changzhou Cvens Experimental Animal Co. Ltd.).

Получали различные концентрации соединения A и соединения 1 («A» и «1», соответственно, как указано ниже в таблице 5) по существу таким же образом, как описано выше в примерах 6 и 7. Средние и низкие дозы монтелукаста натрия («Mon» в следующей таблице 5; MedChemExpress, MCE China, Шанхай, Китай) растворяли в сверхчистой воде с получением растворов с концентрациями, указанными ниже в таблице 5 (L, M и H означают низкие, средние и высокие дозы, соответственно). С учетом низкой растворимости монтелукаста в воде, экспериментальный образец высокой дозы монтелукаста получали посредством растворения монтелукаста в 100% этаноле, а затем добавления сверхчистой воды с получением раствора с концентрацией 20 мкг/мкл в 20% этанола.

Различные лекарственные соединения вводили местно в количестве 50 мкл на рану, один раз в сутки с 0 дня до 12 дня, как показано ниже в таблице 5. В контрольной группе не наносили раны.

Таблица 5

Группа Значение Доза/сутки (мкг) Концентрация лекарственного соединения (мкг/мкл) Контроль без ран / / Модель Физиологический солевой раствор Физиологический солевой раствор / 1 H Соединение 1, 5х более высокая доза 76,25 1,525 1 М Соединение 1, средняя доза 15,25 0,305 1 L Соединение 1, 5х более низкая доза 3,05 0,061 A H Соединение A, 5х более высокая доза 111,51 2,2302 A M Соединение A, средняя доза 22,3 0,446 A L Соединение A, 5х более низкая доза 4,46 0,0892 Mon H Mon, 5x более высокая доза 1000 20 (20% этанол) Mon M Mon, средняя доза 200 4 Mon L Mon, 5x более низкая доза 40 0,8

Модельной группе вводили такое же количество физиологического солевого раствора. В каждой группе было 8 мышей. В контрольной группе было 4 мыши. Кусочки кожи, взятые во время формирования раны, использовали в качестве образцов для контрольной группы на 7 день.

Влияние лекарственных соединений на заживление раны в первые 12 дней представлено ниже в таблице 6 и на Фиг. 7, где показана доля оставшейся площади раны относительно исходной раны в различных группах (± СО в случае таблицы 6).

Таблица 6

Модель Mon H Mon M Mon L A H A M A L 1 H 1 M 1 L Среднее D1 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 D2 0,982 0,938 0,956 0,919 0,884 0,971 1,058 1,051 0,991 0,860 D4 0,958 0,845 0,891 0,802 0,829 0,952 0,864 0,821 0,895 0,753 D6 0,867 0,707 0,734 0,623 0,692 0,690 0,773 0,718 0,786 0,593 D8 0,614 0,508 0,543 0,449 0,508 0,479 0,527 0,486 0,552 0,467 D10 0,547 0,401 0,432 0,409 0,447 0,386 0,471 0,478 0,490 0,433 D12 0,429 0,277 0,359 0,292 0,361 0,238 0,368 0,368 0,344 0,306

Полученные данные демонстрируют, что низкая доза соединения 1 ускоряет заживление раны на более ранних стадиях после формирования раны, и что средняя доза соединения A является более эффективной на более поздних стадиях.

Гистологические образцы анализировали так, как описано выше в примере 7, за исключением того, что критерии оценки отложения коллагена для образца, окрашенного по Массону, были следующими. Сравнение проводили с нормальной тканью. Отсутствие синего окрашивания оценивали в 0 баллов; синие волокна с неравномерным распределением оценивали в 1 балл; при образовании большего количества синих волокон ставили оценку 2 балла; и рассеянный синий цвет оценивали в 3 балла.

Результаты гистопатологического анализа представлены на Фиг. 8 - 11 и демонстрируют, что во всех экспериментальных группах было ускорено заживление раны, особенно при средней дозе соединения A, которое демонстрировало существенный ускоряющий эффект на отложение коллагена.

Оценивали также степень отечности в различных группах с помощью гистопатологического анализа, и результаты представлены на Фиг. 12. Полученные данные демонстрируют, что средняя доза соединения A обеспечивает наилучший результат.

Пример 9

Мышиная модель II отечности уха

Проводили такой же эксперимент с по существу таким же протоколом, как описано выше в примере 5, на 35 здоровых самцах мышей BALB/c. Мышей случайным образом разделяли на 7 групп, как показано ниже в таблице 7, по 5 мышей в каждой группе.

Соединения A, B, C и D приобретали у компании GL Biochem Ltd.

Как показано ниже в таблице 7, получали гидрогели соединений A, B, C и D, состоящие из указанных количеств активных ингредиентов, а также метилцеллюлозы (2,5%), пропандиола (11%), глицерина (11%), уксусной кислоты (регулятор рН; от 0 до 0,5 г). Все вспомогательные вещества приобретали у компании Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd. Гели получали с использованием воды для инъекций.

В качестве положительного контроля использовали крем ацетата дексаметазона (5 мг DEX в 10 г крема, Fuyuan Pharmaceutical Co. Ltd., Аньхой, Китай).

На правое ухо в каждой группе наносили 40 мкл различных экспериментальных препаратов.

Таблица 7

Группа Концентрация лекарственного соединения Нанесение лекарственного соединения на правое ухо Общее количество лекарственных соединений (мкг/мышь) Модель / Ксилол / Крем Dex 10 мкг/мкл ксилол + крем дексаметазона 400 Гель A 0,5 мг/г ксилол + гель соединения A 20 Гель B 0,39 мг/г ксилол + гель соединения B 16 Гель C 0,52 мг/г ксилол + гель соединения C 20,8 Гель D 0,66 мг/г ксилол + гель соединения D 26,4

Результаты представлены на Фиг. 13. Все конъюгаты были весьма эффективны для устранения отечности, вызванной острым воспалением.

Пример 10

Модель II острой раны

Проводили такой же эксперимент с по существу таким же протоколом, как описано выше в примере 6, на 6-8-недельных самцах мышей C57BL/6.

Для образования двух круглых ран на средней линии спины использовали перфоратор для биопсии кожи EMS диаметром 12 мм. Два круга были расположены по касательной друг к другу, и кожу между кругами вырезали вдоль верхней и нижней касательной. Для выравнивания раны использовали ножницы. Рана имела овальную форму.

Местно наносили различные лекарственные соединения в количестве 50 мкл на рану, один раз в сутки с 0 дня по 7 день. Модельной группе вводили такое же количество физиологического солевого раствора. В данном эксперименте использовали 10 групп, содержащих 80 мышей, как показано ниже в таблице 8.

Таблица 8

Группа Значение Количество Доза (на рану в сутки) Контроль Мыши C57 без ран / / Модель Мыши C57 с ранами/физиологический солевой раствор 8 Физиологический солевой раствор rhEGF Мыши C57 с ранами/EGF 8 1285 МЕ A Мыши C57 с ранами/соединение A 8 25 мкг B Мыши C57 с ранами/соединение B 8 19,64 мкг C Мыши C57 с ранами/соединение C 8 26,15 мкг D Мыши C57 с ранами/соединение D 8 32,93 мкг 1 Мыши C57 с ранами/соединение 1 8 17 мкг Mon Мыши C57 с ранами/монтелукаст 8 8,5 мкг 1 + Mon Мыши C57 с ранами/соединение 1 и монтелукаст 8 17 мкг + 8,5 мкг

Каждую рану фотографировали через день после 0 дня и определяли площадь незажившей раны, как описано выше в примере 6.

Степень незаживленности ран представлена на Фиг. 14. Полученные результаты демонстрируют, что все четыре конъюгата (A, B, C и D) имеют сопоставимый эффект в отношении ускорения заживления ран, по сравнению с другими группами.

Пример 11

Кремовая композиция

Смешивали сорбитанстеарат (0,6 г), полисорбат-80 (1 г), гексадеканол (2 г), глицерид октановой кислоты/декановой кислоты (5 г), жидкий парафин (4 г), глицерид моностеарата (2 г) и вазелин (5 г) (все компоненты производства Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd.) при перемешивании и нагревании до 85 °С до полного расплавления смеси.

Смешивали метилцеллюлозу (0,5 г), глицерин (4 г), трегалозу (0,5 г), полиэтиленгликоль 200 (4 г), феноксиэтанол (0,3 г) и этилгексилглицерин (0,1 г) (все компоненты производства Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd.) вместе с очищенной водой (69,45 г) при перемешивании и нагревании до 85 °С с получением однородной коллоидной суспензии.

Две смеси, полученные выше, смешивали вместе с кремнийорганическим маслом (0,5 г) при быстром перемешивании в течение 5 минут на приборе для получения эмульсий. Полученную эмульсию охлаждали до 55 °С.

Соединение A (50 мг; см. выше пример 1) растворяли в очищенной воде (1 г) и затем объединяли с эмульсионной смесью при перемешивании до однородности. Полученную смесь оставляли остывать до комнатной температуры с получением готового продукта.

Пример 12

Композиция спрея I

Гидроксипропилметилцеллюлозу (ГПМЦ; 0,1 г), гидроксиэтилцеллюлозу (0,1 г), глюкозу (5 г), феноксиспирт (0,5 г) (все компоненты производства Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.) и очищенную воду (93,25 г) перемешивали при нагревании до 85 °С с получением однородной коллоидной суспензии. Затем смесь охлаждали до комнатной температуры.

Соединение A (50 мг; см. выше пример 1) растворяли в 1 г очищенной воды. Полученный раствор добавляли к коллоидной смеси. После перемешивания до однородности получали готовый продукт.

Пример 13

Композиция спрея II

Второй спрей получали по существу таким же способом, как описано выше в примере 12, добавляя такой же водный раствор соединения A к коллоидной смеси, полученной с использованием немного большего количества ГПМЦ и гидроксиэтилцеллюлозы (по 0,2 г каждого) и с использованием остальных компонентов в таких же количествах, а также 94,05 г очищенной воды.

Пример 14

Гелевая композиция I

Указанную композицию получали по существу таким же способом, как описано выше в примерах 12 и 13, добавляя такой же водный раствор соединения A к коллоидной смеси, полученной с использованием по 1 г каждого из ГПМЦ и гидроксиэтилцеллюлозы и с использованием остальных компонентов в таких же количествах, а также 91,45 г очищенной воды.

Пример 15

Гелевая композиция II

Второй гель получали по существу таким же способом, как описано выше в примерах 12 - 14, добавляя такой же водный раствор соединения A к коллоидной смеси, полученной с использованием 0,5 г ГПМЦ и 1,5 г гидроксиэтилцеллюлозы и с использованием остальных компонентов в таких же количествах, а также 91,45 г очищенной воды.

Пример 16

Гелевая композиция III

Третью гелевую композицию получали по существу таким же способом, как описано выше в примерах 12 - 15. Сначала смешивали метилцеллюлозу (2,2 г) и пропандиол (11 г) (оба производства Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.), и глицерин (11 г) с 74,75 г очищенной воды. После добавления такого же водного раствора соединения A к полученной коллоидной смеси получали готовый продукт.

Пример 17

Клинический пример I. Пациент с аллергическим ринитом

Пациентка 45 лет с аллергическим ринитом периодически страдала от насморка и заложенности носа.

Композицию спрея I (см. выше пример 12), упакованную во флакон для назального спрея, вводили по отдельности в каждую ноздрю 2-3 раза в сутки на протяжении 5 дней.

Пациентку инструктировали не использовать привычный препарат (пероральный монтелукаст натрия и будесонид), начиная с первой дозы композиции спрея.

После второго введения наблюдали заметное облегчение насморка и заложенности носа. Пациентка почувствовала отсутствие необходимости перорального приема монтелукаста натрия в течение курса введения нового препарата. Было обнаружено, что будесонид потерял свою эффективность за несколько месяцев использования.

Пример 18

Клинический пример II. Облегчение симптомов у пациента с ожогами

Пациент испытывал сильный зуд в средней части плеча во время восстановления после тяжелого ожога второй степени с оценкой по VAS от 4 до 5.

Композицию спрея I (см. выше пример 12) наносили на рану, и наблюдали облегчение зуда за одну минуту.

Пример 19

Клинический пример III. Облегчение симптомов у пациента с ранами

Пациента оперировали, и он испытывал сильную боль после хирургических разрезов.

Композицию спрея I (см. выше пример 12) наносили на порез, и наблюдали облегчение боли за одну минуту.

Пример 20

Клинический пример IV. Пациенты с аллергическим ринитом

38 Субъектов, включенных в данное исследование, страдали от сезонного и/или хронического аллергического ринита. Большинство субъектов страдали от данного заболевания несколько лет и пытались лечиться различными препаратами, включая стероиды. Субъектов инструктировали не принимать привычный препарат, начиная с первой дозы композиции спрея.

Композицию спрея I (см. выше пример 12), упакованную во флакон для назального спрея, вводили по отдельности в каждую ноздрю 2 раза в сутки на протяжении 7 дней.

4 Субъекта не завершили исследование. Отзывы, полученные от остальных 34 субъектов, представлены ниже в таблице 9.

Частота возникновения симптомов равна количеству субъектов с определенным симптомом, деленному на общее количество субъектов. Показатель эффективности равен количеству субъектов, испытывающих облегчение симптома, деленному на общее количество субъектов с данным симптомом.

Таблица 9

Симптомы Частота встречаемости симптомов (%) Показатель эффективности (%) Время начала эффекта Продолжительность эффекта Заложенность носа 88,23 (30/34) 66,57(20/30) В течение 10 минут 2-5 часов Насморк 100 (34/34) 67,65 (23/34) В течение 30 минут 2-4 часа Зуд в носу 82,35 (28/34) 60,71(17/28) В течение 1 минуты Полдня Чихание 94,12 (32/34) 62,5 (20/30) В течение 1 минуты Полдня Зуд в глазах 73,53 (25/34) 68 (17/25) В течение 10 минут 2-4 часа

Пациенты отмечали простоту введения композиции спрея и отсутствие раздражения. Наблюдали быстрое облегчение заложенности носа, а также постоянного чихания и зуда в глазах. 16 субъектов проходили осмотр врача после использования спрея в течение 7 дней. 50% Пациентов демонстрировали снижение отечности в носовых проходах, 68,75% демонстрировали уменьшение носовых выделений и 43% - уменьшение отека слизистой оболочки. Побочных эффектов не обнаружено.

Пример 21

Клинический пример V. Облегчение боли в горле при ингаляции спрея

80-Летний мужчина европеоидной расы испытывал ощущения, связанные с началом обычной простуды. Симптомы включали зуд и боль в горле, а также заложенность носа. 5 мл композиции спрея (см. выше пример 12) загружали в портативный небулайзер (Feellife Medical INC, Шеньчжэнь, Китай). Вакуумное сопло небулайзера помещали в рот и включали устройство. Процедура длилась около 10 минут. Ингаляцию осуществляли только один раз. На следующее утро все симптомы простуды прошли.

Пример 22

Клинический пример VI. Облегчение операционной боли у пациента с ожогом

Пациента с масштабными глубокими ожогами второй степени, покрывающими всю спину, госпитализировали в ожоговое отделение больницы Beijing Jishuitan. Он проходил лечение тяжелых ожогов и страдал, по его словам, от невыносимой операционной боли каждый раз при перевязке, с оценкой по шкале VAS от 7 до 9.

Композицию спрея I (см. выше пример 12), упакованную во флакон для спрея, наносили разбрызгиванием непосредственно на поверхность ожоговой раны. Через 5 минут перевязочный материал снимали и меняли на новый. После использования спрея операционная боль уменьшилась примерно на две трети, по оценкам врачей.

Пример 23

Клинический пример VII. Облегчение операционной боли у пациента после лазерной операции

В данном исследовании принимали участие два субъекта. Субъектам была проведена операция по удалению кожной пигментации методом фракционной лазерной обработки.

Композицию спрея I (см. выше пример 12), упакованную во флакон для спрея, наносили разбрызгиванием на поверхность операционной области. Через 10 минут начинали лазерную операцию. После использования спрея операционная боль уменьшилась примерно на одну треть, по оценкам врачей.

Обычно субъекты, проходящие такую лазерную операцию, испытывают также ожоговую боль в течение приблизительно 30 минут после лечения. Однако в данном исследовании субъекты впоследствии не чувствовали никакой ожоговой боли.

Пример 24

Клинический пример VIII. Облегчение жара и кашля

У 5-летнего мальчика с простудой наблюдали сильный кашель. За ночь его температура достигла 38 °С, и он жаловался на боль в горле.

Композицию спрея I (см. выше пример 12), упакованную во флакон для спрея, наносили в форме перорального спрея 4 раза в сутки. Симптомы жара и боли в горле исчезли на следующий день. Кашель прошел через 3 дня.

Пример 25

Клинический пример IX. Облегчение контактного дерматита

53-Летняя пациентка страдала от контактного дерматита на шее. Сыпь и зуд возникали при ношении металлического ожерелья.

Композицию спрея I (см. выше пример 12), упакованную во флакон для спрея, наносили разбрызгиванием на пораженную область. Ощущение зуда облегчалось за 5 минут. После 2 доз (одна вечером и одна на следующее утро) все симптомы прекращались.

Пример 26

Клинический пример X. Облегчение простуды

Пациентами были 42-летняя женщина и ее 10-летний сын. Оба были простужены и страдали от боли в горле и насморка.

Композицию спрея I (см. выше пример 12), упакованную во флакон для спрея, вводили в форме перорального спрея. После 2 доз (одна вечером и одна на следующее утро) все симптомы прекращались.

Пример 27

Клинический пример XI. Аллергическое расстройство кожи

27-Летняя женщина с чувствительной кожей страдала от аллергического расстройства кожи лица, похожего на угри, со слабым зудом. Также на ее лице были пятна с покраснением и отечностью.

Композицию спрея I (см. выше пример 12), упакованную во флакон для спрея, наносили непосредственно на пораженные участки лица, по 2 разбрызгивания за один раз, 3 раза в сутки. Ощущение зуда облегчалось за 30 минут. Пораженные участки полностью исчезли через две недели.

Пример 28

Животная модель I. Идиопатический фиброз легких (ИФЛ)

Экспериментальные животные и формирование групп: 72 взрослых самцов крыс Спрага-Доули, после 7 дней адаптивного вскармливания, делили на 6 групп: группа с имитацией операции (без инфекции и без лечения), модельная группа ИФЛ (без лечения), экспериментальная группа с высокой дозой препарата, экспериментальная группа со средней дозой препарата, экспериментальная группа с низкой дозой препарата и группа положительного контроля.

Доза соединения A (пример 1) составляла 0,5 мг/мл, 0,1 мг/мл и 0,02 мг/мл в качестве высокой, средней и низкой дозы, соответственно. В качестве препарата положительного контроля использовали пероральное введение пирфенидона (Etuary®, Beijing Continent Pharmaceutical Co., Ltd., Пекин, Китай) в форме однократного болюса с дозой 30 мг/кг.

Создание модели и введение: Модель фиброза легких создавали интратрахеальной инстилляцией блеомицина. Крыс анестезировали и помещали на операционный стол в положении на спине для обеспечения доступа к трахее. Солевой раствор блеомицина (5 мг/кг) вводили в трахею через щель между хрящевыми кольцами трахеи. В группе с имитацией операции вводили равный объем физиологического солевого раствора. Вскоре после введения крыс поднимали в вертикальное положение и переворачивали для равномерного распределения лекарства. После восстановления крыс, приблизительно через 5 дней, им вводили различные лекарственные препараты в соответствии с планом модели на протяжении 28 дней подряд. План эксперимента представлен ниже в таблице 10.

Таблица 10

Группа Лечение Доза Имитация операции Солевой раствор 50 мкл Модельная группа ИФЛ Солевой раствор 50 мкл Положительный контроль Пирфенидон 250 мг/кг Соединение A, высокая доза Соединение А 975 мкг/крыса Соединение A, средняя доза Соединение А 195 мкг/крыса Соединение A, низкая доза Соединение А 39 мкг/крыса

Изучали следующие показатели наблюдений.

1) Ежедневное общее наблюдение активности крыс, восприимчивости к внешним раздражителям, блеск шерсти, цвет шерсти, состояние рта, губ, носа, массы тела, питания, дыхания и смертности.

2) Определение коэффициента легочного органа крыс и отношения сухой массы к влажной массе легких (т.е. отношение массы легочного органа животных к массе тела животных, т.е. отношение массы внутренних органов к массе тела).

3) Во время формирования фиброза легких измеряли экспрессию фактора роста (TGF-β), фактора-α некроза опухоли (TNF-α) и других цитокинов, участвующих в возникновении фиброза. Использовали стандартные методы иммуноферментного твердофазного анализа для определения содержания TGF-β, TNF-α, IL-1β, малондиальдегида (MDA) и активности супероксиддисмутазы (SOD) в легочной ткани.

4) Определение содержания коллагена и метаболита фибрина (гидроксипролина) в легких как специфических показателей для оценки степени фиброза легких.

5) Определение гистопатологических изменений в легочной ткани, которые являются важнейшими и объективными показателями для оценки фиброза легких.

Полученные результаты демонстрируют, что соединение A ингибирует сверхвыработку TGF-β и воспалительных цитокинов. Результаты также демонстрируют, что экспериментальное лекарственное соединение обладает антиокислительным действием благодаря увеличению выработки SOD и снижению окисления липидов.

Пример 29

Животная модель II. Противокашлевый эксперимент: Метод с использованием мышей, у которых кашель вызван аммиаком.

60 Мышей случайным образом разделяли на 5 групп по массе их тела: группа отрицательного контроля с КМЦ-Na, группа положительного контроля с гидробромидом декстрометорфана и группы с высокой, средней и низкой дозами (соединения A, пример 1). В каждой группе было 12 мышей, 6 самцов и 6 самок.

Экспериментальные препараты вводили посредством ингаляции спрея (0,15 мл/мин.) в течение 1 минуты, один раз в сутки в течение 5 дней. Препарат положительного контроля вводили один раз в сутки посредством внутрижелудочного введения дозы 10 мг/кг в течение 5 дней.

Мышей помещали в перевернутый стакан через 1, 2 и 4 часа после последнего введения препарата (соединения A или препарата положительного контроля). 1 мл жидкого аммиака (25,0-28,0%) устанавливали поверх бани с кипящей водой и направляли пары в стакан. Мышей стимулировали аммиачным паром в течение определенного периода времени, 63,1, 50,1, 39,8, 31,6, 25,1, 20,0, 15,9 или 12,6 секунд. Разность логарифмом двух ближайших интервалов раздражителя устанавливали на 0,1, и она составляла 1,8, 1,7, 1,6, 1,5, 1,4, 1,3, 1,2 и 1,1. Затем мышей быстро перемещали под стеклянный колпак. Количество актов кашля за 1 минуту определяли с помощью стетоскопа. Кашель, возникающий три или более раз в минуту, описывали как «кашель», а кашель, возникающий менее трех раз в минуту, описывали как «отсутствие кашля».

Время аммиачной стимуляции для следующей мыши определяли в соответствии с принципом метода последовательных приближений, т.е. если первая мышь «кашляла», то следующую мышь стимулировали в течение более короткого периода времени. И наоборот, если первая мышь была «без кашля», то следующую мышь стимулировали в течение более продолжительного периода времени.

Определяли EDT₅₀ как время аммиачной стимуляции, в течение которого у половины мышей развивался «кашель», и рассчитывали по уравнению:

EDT₅₀ = lg^-1c/n

(c равен сумме r и x, r представляет собой количество животных в группе при каждом времени раздражения, x представляет собой логарифм времени раздражения, и n представляет собой количество животных в каждой группе). Результаты представлены ниже в таблице 11.

Таблица 11

1 час после введения 2 часа после введения 4 часа после введения группа доза EDT₅₀/с R1/% EDT₅₀/с R1/% EDT₅₀/с R1/% контроль 20,7 21,5 22,4 положительный 10 мг/кг 50,1 241,7 44,7 207,3 41,4 184,8 Соединение A, высокая доза 39 мкг/мышь 28,2 135,9 29,3 135,9 26,1 116,6 Соединение A, средняя доза 195 мкг/мышь 34,1 164,7 39,8 184,8 39,8 177,8 Соединение A, низкая доза 975 мкг/мышь 43,0 207,3 46,4 215,4 43,0 192,0

Где R1 = (EDT₅₀ в экспериментальной группе/EDT₅₀ в контрольной группе)×100%, R > 130% указывает на противокашлевый эффект. R > 150% указывает на сильный противокашлевый эффект.

Полученные результаты демонстрируют, что соединение A оказывает благотворный эффект на облегчение кашля.

Пример 30

Животная модель III. Эксперимент отхаркивания. Метод с применением экскреции фенолового красного у мышей.

50 Мышей случайным образом разделяли на 5 групп по массе тела: группа с физиологическим солевым раствором, группа отрицательного контроля, группа положительного контроля с хлоридом аммония и группы с высокой, средней и низкой дозой экспериментального лекарственного соединения (либо соединения A, описанного выше, либо соединения E, описанного ниже). В каждой группе было 10 мышей, 5 самцов и 5 самок.

Соединение A вводили ингаляцией спрея (0,15 мл/мин.) в течение 1 минуты, один раз в сутки в течение 5 дней, а препарат положительного контроля вводили посредством внутрижелудочного введения в течение 5 дней.

Через полчаса после последнего введения соединения A в брюшную полость вводили инъекцию 5% раствора фенолового красного. Еще через полчаса мышей усыпляли. Удаляли кожу на шее и отделяли трахею от щитовидного хряща до места раздвоения, пропитывали 5% раствором бикарбоната натрия при постоянном встряхивании. Раствор бикарбоната натрия использовали для определения содержания фенолового красного.

Поглощение при 558 нм определяли спектрофотометрически (спектрофотометр 721G, Shanghai Jingke, Шанхай, Китай). Значение оптической плотности использовали для расчета содержания фенолового красного в трахее относительно стандартной кривой фенолового красного. Результаты в каждой группе и в группе отрицательного контроля проверяли по t-критерию значимости. Результаты эксперимента отхаркивания представлены ниже в таблице 12.

Таблица 12

Группа Лечение Доза Концентрация фенолового красного (мкг/мл) Отрицательный контроль Физиологический солевой раствор 6,970 ±0,339 Положительный контроль NH₄Cl 0,15 г/кг 10,335 ±0,337^** Высокая доза Соединение А 39 мкг/мышь 9,001 ±0,637 Средняя доза Соединение А 195 мкг/мышь 10,480 ±0,550^*** Низкая доза Соединение А 975 мкг/мышь 10,489 ±0,610^***

Сравнение с отрицательным контролем: *P<0,05,**P<0,01,***P<0,001

Полученные результаты демонстрируют, что соединение A снижает выработку слизи и, следовательно, уменьшает количество мокроты.

Пример 31

Влияние соединения A на активность в отношении вируса простого герпеса человека типа II (HSV-II)

Получали бессывороточную среду 1640, используя порошок RPMI1640 (доза 1000 мл; Thermo Fisher Scientific, Китай), L-глутамин (0,29 г; Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd, Шанхай, Китай), бикарбонат натрия (2,2 г; Sinopharm Chemical Reagent Co.), HEPES (2,39 г; Thermo Fisher Scientific, Китай) и деионизированную воду (1000 мл).

Реагенты смешивали до растворения и стерилизовали раствор фильтрацией. Смесь составляли в качестве полной среды, содержащей 10% сыворотки, посредством добавления перед использованием 10% сыворотки новорожденных телят, или смесь составляли в качестве поддерживающего раствора посредством добавления 2% сыворотки новорожденных телят.

20 мг соединения A (пример 1) растворяли в 1 мл 0,9% водного раствора хлорида натрия с получением исходного раствора с концентрацией 20 мкг/мкл. 0,05 мл исходного раствора добавляли к 1,95 мл полной (10%) среды с получением раствора лекарственного соединения с концентрацией 500 мкг/мл. Вместо полной среды использовали поддерживающий раствор (2%) в противовирусных испытаниях № 3 и 4, ниже.

Рабочие растворы с концентрациями 250, 125, 62,5, 31,25, 15,625, 7,8125, 3,9063, 1,9531 и 0,9766 мкг/мл получали двукратным разбавлением.

20,34 мг лаурилсульфоната натрия (SDS; производства компании AMRESCO LLC, Солон, штат Огайо, США, и упакованный компанией Biosharp Company, Хэфей, Китай; чистота: 99%) растворяли в 10,17 мл полной среды для выращивания культур с получением исходного раствора с концентрацией 2000 мкг/мл. Также получали аналогичный исходный раствор, используя поддерживающий раствор для противовирусных тестов. Затем получали рабочие растворы с концентрациями, указанными выше, посредством двукратного разбавления.

2,25 мг ацикловира (ACV; Zhiyuan Pharmaceutical Co., Ltd, Уси, Китай, чистота: 99,3%) растворяли в 2,25 мл полной среды для выращивания культур с получением исходного раствора с концентрацией 1000 г/мл. Также получали аналогичный исходный раствор, используя поддерживающий раствор для противовирусных тестов. 0,8 мл каждого исходного раствора двукратно разбавляли с получением рабочих растворов с концентрациями 500, 250 и 125 мкг/мл. 0,2 мл каждого исходного раствора добавляли к 1,95 мл полной среды для выращивания культур с получением концентрации 100 мкг/мл, которую затем разбавляли с получением растворов с концентрациями 50, 25 и 12,5 мкг/мл.

1. Испытание токсичности в отношении вируса HSV-2

0,5 мл суспензии вируса простого герпеса человека II типа (HSV-2; штамм SAV; Shanghai Institute of Cell Biology) инокулировали в монослойную культуру клеток Vero (Shanghai Institute of Cell Biology) и удаляли вирусную суспензию спустя 1 час адсорбции.

Добавляли поддерживающий раствор и выращивали при 37 °С в 5% CO₂, пока более 95% клеток не показали под микроскопом (инвертированный фазово-контрастный микроскоп ECLIPSE TS100 с системой визуализации) очевидные патологические изменения. Клетки собирали, несколько раз замораживали и оттаивали (3 цикла) и затем центрифугировали при 3000 об./мин. в течение 10 минут на медицинской низкоскоростной центрифуге модели 400C (Beijing Baiyang Centrifuge Co., Ltd.). Надосадочную жидкость собирали в качестве вирусного раствора.

Суспензию клеток Vero с плотностью 2 Ч 10⁵ (количество клеток) инокулировали в 96-луночный культуральный планшет (Costar, Corning Inc., Онеонта, штат Нью-Йорк, США) при 0,1 мл/лунка и выращивали при 37 °С в 5% CO₂ в инкубаторе с CO₂ Thermo Scientific в течение 18 часов до образования видимого под микроскопом монослоя. Вирус, собранный выше, инокулировали в монослой клеток Vero с 10-кратным разбавлением в поддерживающем растворе в каждую лунку при 0,1 мл/лунка. Поддерживающий раствор пополняли и продолжали выращивание при 37 °С в 5% CO₂. После выращивания в течение 24 часов наблюдали патологические изменения в клетках под микроскопом. Каждое разбавление повторяли в 3 лунках. В качестве контроля для этого эксперимента использовали нормальные клетки. Тест вирусной вирулентности повторяли 3 раза.

Для каждой лунки наблюдали три поля зрения. Определяли средний процент патологических клеток (P) в поле зрения.

Медианную инфекционную дозу (TCID₅₀, доза вируса, инфекционная для 50% тканевой культуры) вируса рассчитывали обычным методом Рида и Менча, то есть TCID₅₀, которая представляет собой логарифм разбавления, демонстрирующего следующую смертность выше 50% - (разность логарифмов × логарифм кратности разбавления). В целом, использовали следующую формулу для расчета «разности логарифмов» (разность логарифмов известна также как «пропорциональный промежуток» или «интерполированное значение»): Разность логарифмов = [(смертность при следующем разбавлении свыше 50%)-50%]/[(смертность при следующем разбавлении свыше 50%)-(смертность при следующем разбавлении ниже 50%)].

2. Цитотоксичность соединения A и контрольных препаратов

Клетки Vero инокулировали на 96-луночный планшет и выращивали в монослоях. 0,2 мл раствора соединения A (пример 1) или контрольных препаратов (20,34 мг лаурилсульфоната натрия или 2,25 мг ацикловира, как описано выше) добавляли в каждую лунку, содержащую различные концентрации скорректированной полной среды (как описано выше). Так повторяли в 3 лунках для каждой концентрации.

В качестве отрицательного контроля использовали растворитель и культуры нормальных клеток. Клетки выращивали при 37 °С в 5% CO₂, и наблюдали рост и морфологические изменения клеток под микроскопом в течение 2 дней. Для каждой лунки под микроскопом выбирали три поля зрения, подсчитывали процент патологических клеток и рассчитывали средние значения. В качестве точки времени оценки для данного испытания использовали 24 часа, и рассчитывали медианную токсичную концентрацию (TC₅₀) и максимальную нетоксичную концентрацию (TC₀). Эксперимент повторяли 3 раза.

Клетки инокулировали так, как описано выше. В качестве отрицательных контрольных образцов использовали растворитель и культуры нормальных клеток. Через 24 часа после добавления соединения A или контрольного препарата вводили 5 мг/мл бромида 3-(4,5-диметил-2-тиазолил)-2,5-дифенил-2H-тетразолия (MTT, Sigma-Aldrich (China), Шанхай, Китай) в PBS (разведенном из 10 x исходного раствора, Sigma-Aldrich (China)) (20 мкл/лунка) и продолжали выращивание в течение 4 часов. Затем отбрасывали надосадочный раствор в каждой лунке и добавляли 150 мкл диметилсульфоксида (ДМСО; Sigma-Aldrich (China)), затем 10 минут встряхивали в темноте при комнатной температуре.

Значение оптического поглощения (ОП₅₅₀) при 550 нм измеряли на измерительном приборе с иммуносорбеном с иммобилизованными ферментами (Multiskan Spectrum; Thermo Scientific, Шанхай, Китай).

3. Влияние экспериментального препарата и SDS на цитопатический эффект вирусов после непосредственного воздействия на HSV-2

Вирус HSV-2, хранившийся при -80 °С (в ультранизкотемпературной морозильной камере Haier DW-86L486), с установленным значением TCID₅₀ разбавляли до 200 TCID₅₀ с определенным титром (сначала каждый раз определяли значение TCID₅₀ для обеспечения возможности определения 200 TCID₅₀). Растворы с 200 TCID₅₀ смешивали с равным объемом соединения A или жидкого SDS, при котором титр вируса составлял 100 TCID₅₀. Смешанный раствор инкубировали на водяной бане (электротермическая водяная баня с постоянной температурой DK-8B; Shanghai Jinghong Biotech Co., Ltd.) при 37 °C в течение 1 часа и затем инокулировали в 96-луночный культуральный планшет, содержащий монослой клеток Vero. В каждую лунку добавляли 0,1 мл смешанного раствора.

Надосадочный раствор, содержащий вирус и лекарственное соединение, отбрасывали через 1 час адсорбции. Затем дважды промывали монослой клеток Vero поддерживающим раствором. Наконец, в каждую лунку добавляли 0,2 мл поддерживающего раствора. Полученную смесь непрерывно культивировали при 37 °С в 5% CO₂ до достижения под микроскопом цитопатической степени культуры без лекарственного соединения 95%. В качестве точки времени оценки для данного испытания использовали 24 часа.

Помимо экспериментальных групп, параллельно испытывали три контрольные группы: растворитель, контроль без лекарственного соединения (вирусный контроль) и контроль с нормальными клетками. Каждая группа состояла из 3 лунок, и эксперимент повторяли 4 раза.

Вирусную культуру разбавляли до 0,1, 1, 10, 100 и 1000 TCID₅₀ и инокулировали в монослой клеточных культур. Каждое разбавление проводили в трех повторениях. Для каждой лунки определяли цитопатическую степень. Цитопатический эффект не должен наблюдаться при 0,1 TCID₅₀, и цитопатический эффект должен наблюдаться при 100 TCID₅₀; в противном случае тесты нейтрализации не проводили.

Показатели оценки были такими же, как для испытания токсичности вируса. Для каждой лунки под микроскопом наблюдали три поля зрения. Определяли средний процент патологических клеток (P) в поле зрения и рассчитывали медианную инфекционную дозу (TCID₅₀) вируса в соответствии с методом Рида и Менча (как описано выше).

Токсичность лекарственного соединения для клеток Vero определяли методом клеточной морфологии, а противовирусные тесты проводили при нетоксичных концентрациях. После инкубации с различными концентрациями экспериментального препарата и SDS в течение 1 часа, в монослой культуры клеток Vero инокулировали 100 TCID₅₀ HSV-2 (штамм SAV).

Полученные результаты демонстрируют, что цитопатический эффект для клеток, вызванный вирусной инфекцией, в различной степени подавлен, что позволяет предположить, что соединение A оказывает ингибирующее действие на HSV-2.

4. Влияние экспериментального препарата и ACV на HSV-2 (прямой метод)

Вирус разбавляли до 100 TCID₅₀ и инокулировали в монослой культуры клеток Vero при 0,1 мл в каждую лунку. Надосадочный раствор отбрасывали через 1 час адсорбции и 2 раза промывали культуру поддерживающим раствором. Затем добавляли растворы с различными концентрациями соединения A или контрольного препарата (ацикловира) при 0,2 мл/лунка. Культуры непрерывно выращивали при 37 °С в 5% CO₂. Каждую концентрацию повторяли трижды.

Помимо экспериментальных групп, параллельно испытывали три контрольные группы: растворитель, контроль без лекарственного соединения (вирусный контроль) и контроль с нормальными клетками.

Во время периода выращивания под микроскопом наблюдали патологические изменения и прекращали испытания, если цитопатическая степень в контрольном образце с вирусом достигала >95%. В качестве точки времени оценки для данного испытания использовали 24 часа, и эксперименты повторяли 3 раза.

Критерии оценки были такими же, как в испытании токсичности вируса, т.е. выбирали три поля зрения для микроскопического изучения каждой лунки, определяли средний процент патологических клеток (P) в поле зрения, используя среднее значение для трех полей зрения.

Уравнение линейной регрессии рассчитывали в соответствии с процентом цитопатического эффекта для каждой группы с каждой концентрацией реагента в зависимости от концентрации препарата. Рассчитывали значения IC₅₀ и также рассчитывали критерий значимости коэффициента корреляции.

Полученные результаты демонстрируют, что соединение A имеет противовирусное действие.

Пример 32

Синтез монтелукаст-Ala-Lys-Pro-Ser-Tyr-Hyp-Hyp-Thr-Tyr-Lys (т.е. монтелукаста, ковалентно связанного с аминокислотой SEQ ID №: 12 на N-конце)

Повторяли способ, описанный в примере 1. Обнаруживали пик второго продукта при 5,813 минут по ЖХМС (модель аналитической колонки: GS-120-5-C18-BIO, 4,6*250 мм; обнаружение: УФ при 220 нм; растворитель A: 0,1% ТФК в MeCN, растворитель A: 0,1% ТФК в воде; скорость потока 1,0 мл/мин.; объем: 10 мкл) и указанного соединения.

МС: m/z 875,90 [M+2H]²⁺.

На основании характеристических данных, доступных и представленных в данном документе, можно сделать вывод, что соединение, выделенное в данном примере, является соединением, которое идентифицировано выше в качестве указанного в заголовке соединения. Соединение из примера 32 упомянуто далее как «соединение E».

Отношение выхода соединения E к соединению A составило 1:9.

Пример 33

Синтез гидрированного монтелукаст-стирол-Ala-Lys-Pro-Ser-Tyr-Hyp-Hyp-Thr-Tyr-Lys (т.е. гидрированного монтелукаст-стирола, ковалентно связанного с аминокислотой SEQ ID №: 12 на N-конце)

Синтез вышеуказанного соединения был точно таким же, как способ получения соединения A, описанный в примере 1, за исключением того, что в качестве реагента вместо монтелукаста использовали монтелукаст-стирол.

МС: m/z 867,91 [M+2H]²⁺.

На основании характеристических данных, доступных и представленных в данном документе, можно сделать вывод, что соединение, полученное в данном примере, является соединением, которое идентифицировано выше в качестве указанного в заголовке соединения. В остальном соединение, полученное в примере 33, представляет собой соединение по данному изобретению, для которого в соединении формулы I n равен 0, и указанное соединение формулы I ковалентно связано с аминокислотой SEQ ID №: 12 на N-конце. В любом случае, соединение из примера 33 упомянуто далее как «Соединение F».

Пример 34

Клинический пример XII. Облегчение жара

У 11-летнего мальчика наблюдали симптомы жара с температурой 39 °С в 21:00. Субъект также периодически кашлял и страдал от насморка.

В каждую ноздрю вводили аэрозольную композицию соединения E (2 мг; см. выше пример 32) в физиологическом солевом растворе (5 мл) в форме спрея, полученного распылением (устройство: ручной небулайзер, Lifetrons Beaute NS-400), в 22:00 в течение 5 минут.

В 22:15 субъект заснул. Около полуночи субъект начал потеть, и его температура немного упала. Таким же способом в 00:30 вводили вторую дозу соединения E (1 мг) в физиологическом солевом растворе (2,5 мл).

В 03:30 температура субъекта снизилась до 37,0 °С. К 08:00 субъект имел нормальную температуру. Таким образом, в течение времени от 22-15 на предыдущий день до 08:00 на следующий день кашель, в целом, наблюдали только в течение полуминуты. Во время сна в ту ночь не было видимой заложенности носа. Наутро, несмотря на возобновление насморка, наблюдали существенное улучшение по сравнению с 11 часами ранее.

Субъекту вводили третью дозу соединения E (1 мг) в физиологическом солевом растворе (2,5 мл), которую вводили таким же образом, в 08:30 того же утра. Через два часа наблюдали прекращение выделений из носа. После этого и до 15:00 того же дня у субъекта не было жара, кашля или насморка.

В 15:30 второго дня субъекту вводили четвертую дозу соединения E (1 мг) в физиологическом солевом растворе (10 мл) посредством распыления (прибор: Yuyue, небулайзер со сжатым воздухом, 403 M). В 20:45 температура субъекта составила 37,1 °С. В 21:00 субъекту вводили пятую дозу соединения E (1 мг) в физиологическом солевом растворе (10 мл) посредством распыления. В 22:15 температура субъекта составила 36,8 °С.

Пример 35

Сравнение соединений A и E в модели отечности уха у мышей (III)

Проводили такой же эксперимент с по существу таким же протоколом, как описано выше в примере 5, на 30 здоровых самцах мышей BALB/c. Мышей случайным образом разделяли на 6 групп, как показано ниже в таблице 13, по 5 мышей в каждой группе.

Таблица 13

Группа Концентрация лекарственного соединения Нанесение лекарственного соединения на правое ухо Общее количество лекарственного соединения Модель / Ксилол / Крем дексаметазона 5 мг/г ксилол + крем дексаметазона 0,8 г Назальный спрей будесонида 0,64 мг/кл ксилол + назальный спрей будесонида 40 мкл Назальный спрей пропионата флутиказона 50 мкг/100 мл ксилол + назальный спрей пропионата флутиказона 40 мкл Соединение А 0,5 мг/мл ксилол + соединение A 40 мкл Соединение E 0,5 мг/мл ксилол + соединение E 40 мкл

Соединения A и E приобретали у компании GL Biochem Ltd, и они были синтезированы так, как описано в примерах 1 и 32, соответственно. Водные растворы соединений A и E получали растворением 0,5 мг порошка в 1 мл физиологического солевого раствора (0,9% мас./об. раствор NaCl). На правое ухо в каждой группе наносили 40 мкл полученного раствора.

Крем ацетата дексаметазона (5 мг DEX в 10 г крема, Fuyuan Pharmaceutical Co. Ltd., Анхой, Китай), назальный спрей будесонида (32 мкг/нажатие ×120 доз, 0,64 мг/мл, AstraZeneca AB, SE-151 85, Седертелье, Швеция) и назальный спрей пропионата флутиказона (50 мкг/нажатие, 0,05% мас./мас., Glaxo Wellcome, S.A., Avenida de Extremadura n°3-09400, Аранда-де-Дуэро, Бургос, Испания) использовали в качестве положительного контроля. Крем помещали в шприц объемом 1 мл для измерения дозы по калибровке массы и объема. Открывали флаконы со спреем и с помощью пипетки набирали 40 мкл жидкости, и наносили на правое ухо в каждой группе.

Результаты представлены на Фиг. 15.

Все конъюгаты оказывали прекрасный эффект в отношении устранения отека, вызванного острым воспалением. Противовоспалительный эффект соединений A и E был одинаковым.

Пример 36

Синтез монтелукаст-Ala-Lys-Pro-Ser-Tyr-Hyp-Thr-Tyr-Hyp-Lys (т.е. монтелукаста, ковалентно связанного с аминокислотой SEQ ID №: 22 на N-конце) и монтелукаст-стирол-Ala-Lys-Pro-Ser-Tyr-Hyp-Thr-Tyr-Hyp-Lys (т.е. монтелукаст-стирола, ковалентно связанного с аминокислотой SEQ ID №: 22 на N-конце)

Использовали по существу такой же способ, как описан выше в примере 1, но изменяли порядок стадий связывания в соответствии с представленной выше аминокислотной последовательностью для синтеза модифицированного пептида с SEQ ID №: 22.

После этого связывали монтелукаст на N-конце Ala. Два указанных в заголовке соединения разделяли и очищали с помощью ЖХМС, таким же образом, как описано выше в примере 32. Полученные соединения упомянуты далее как соединение G (содержащее монтелукаст) и соединение H (содержащее монтелукаст-стирол), соответственно.

Отношение выходов соединений G:H составило 1:7.

МС (соединения G): m/z 876,6[M+2H]2⁺

МС (соединения H): m/z 867,6 [M+2H]2⁺

Пример 37

In vitro испытание антагониста CysLTR1 на спектрофотометре для чтения планшетов для визуализации флуоресценции (FLIPR)

Антагонистический эффект in vitro соединений A и E (см. выше примеры 1 и 32, соответственно) на клеточной линии CYSLTR1 измеряли с помощью набора для анализа кальция Fluo-4 Direct™ [кат. № F10471, Thermo Fisher Scientific]. В качестве сравнения испытывали также монтелукаст натрия и монтелукаст-стирол, и пранлукаст использовали в качестве положительного контроля. Для каждого соединения испытывали 10 различных концентраций в двух повторениях.

Использовали клеточную линию CYSLTR1/HEK293. Клетки подготавливали и добавляли 20 мкл клеточной суспензии в 384-луночные планшеты (20 тыс./лунка; планшет для белков с покрытием из поли-D-лизина, Greiner № 781946). Планшет помещали в инкубатор при 37 °С с 5% CO₂ на ночь.

Пробенецид в аналитическом буфере для FLIRP получали из соответствующего исходного пакета (кат. № F10471): Исходный 250 мМ раствор водорастворимого пробенецида получали добавлением 1 мл буфера для анализа кальция Fluo-4 Direct™ в пробирки на 77 мг, содержащие пробенецид (компонент B для кат. № F10471). 10 мл буфера для анализа кальция Fluo-4 Direct™ и 200 мкл исходного раствора пробенецида с концентрацией 250 мМ добавляли в один флакон с кальциевым реагентом Fluo-4 Direct™ (компонент A). Полученного нагрузочного 2 x раствора кальциевого реагента Fluo-4 Direct™ было достаточно для двух микропланшетов. Раствор встряхивали на вортексе, оставляли отстаиваться на 5 минут (в защищенном от света месте) для обеспечения полного растворения реагента. Каждый день готовили свежий реагент.

Все соединения растворяли и серийно разбавляли в буфере для анализа кальция Fluo-4 Direct™ (без пробенецида). Планшет с клетками вынимали из инкубатора и осторожно декантировали среду. 20 мкл соединений переносили в клеточный планшет и добавляли 20 мкл 2 x нагрузочного буфера Fluo-4 Direct™ без промывания. Конечные концентрации каждого соединения составляли 100, 30, 10, 3, 1, 0,3, 0,1 и 0,03 мкМ. Планшет инкубировали в течение 50 минут при 37 °C в инкубаторе с 5% CO₂ и в течение 10 минут при комнатной температуре. Флуоресценцию измеряли, используя настройки прибора, подходящие для возбуждения при 494 нм и испускания при 516 нм.

Данные анализировали с помощью программы Prism (программное обеспечение GraphPad, США) и для каждого соединения рассчитывали IC50. Результаты представлены ниже в таблице 14.

Таблица 14

ID соединения IC50 (нМ) Максимальная доза (нМ) Соединение А 474,7 100000 Монтелукаст-стирол 158,5 100000 Соединение E 90,55 100000 Монтелукаст натрия 13,74 100000 Пранлукаст 0,2178 1000

Полученные результаты демонстрируют, что монтелукаст имеет в 11 раз более высокую аффинность к CysLTR1, чем монтелукаст-стирол. Следовательно, соединение E имеет в 5 раз более высокую аффинность, чем соединение A, и аффинность испытываемых соединений к CysLTR1 в значительной степени зависит от структуры соединения формулы I.

Пример 38

In vitro испытание антагониста CysLTR1 на спектрофотометре для чтения планшетов для визуализации флуоресценции (FLIPR)

Повторяли аналитический способ, описанный выше в примере 37, для соединения G (см. выше пример 36), используя для сравнения соединение E (см. выше пример 32). Результаты представлены в Таблице 15.

Таблица 15

ID соединения IC50 (нМ) Максимальная доза (нМ) Соединение G 99,55 50000 Соединение E 140,5 50000 Монтелукаст натрия 7,300 50000 Пранлукаст 0,2496 4000

Полученные результаты демонстрируют, что соединения G и H имеют одинаковую степень аффинности к CysLTR1, что указывает на то, что изменение аминокислотной последовательности пептида слабо влияет на аффинность конъюгата.

Пример 38

Поражение легких у мышей, вызванное липополисахаридом

36 Самцов мышей BALB/c с массой тела от 20 до 22 г содержали в виварии при 22-26 °С и относительной влажности 55-75% при 12/12-часовом цикле освещения/темноты с неограниченным доступом к корму и воде.

Мышей случайным образом делили на 6 групп, как указано ниже в таблице 16.

Таблица 16

Группа Доза Введение Контроль / / Модель Солевой раствор Ингаляция Соединение А 2 мг/кг Ингаляция Соединение G (высокая доза) 10 мг/кг Ингаляция Соединение G (средняя доза) 2 мг/кг Ингаляция Соединение G (низкая доза) 0,4 мг/кг Ингаляция

Соединение A получали аналогично способу, описанному выше в примере 1, и соединение G получали аналогично способу, описанному выше в примере 36.

Мышей анестезировали интраперитонеальной инъекцией 3% хлоральгидрата (0,1 мл/10 г). Язык вытягивали с помощью щипцов. Липополисахарид (LPS, 1 мг/мл, 50 мкл) наносили с помощью пипетки на заднюю стенку глотки. Освобождали язык и сразу зажимали нос на 30 секунд. Затем мышей освобождали от удерживания и помещали обратно в клетки, ожидая, пока они проснутся. Мышам в контрольной группе вводили такой же объем солевого раствора.

Экспериментальные соединения вводили распылением/ингаляцией в течение 30 минут после стимуляции с LPS. Через 24 часа мышей усыпляли.

Быстро вскрывали грудную полость и полностью извлекали легкие. Точно взвешивали массу кусочка легочной ткани и добавляли солевой раствор в соотношении 9 мл солевого раствора на 1 г легочной ткани. Затем ткань гомогенизировали и центрифугировали в течение 10 минут при 3000 об./мин. Гомогенат использовали для определения TGF-β1 с помощью набора для твердофазного иммуноферментного анализа (Beijing 4A Biotech Co., Ltd, Китай) и результаты представлены на Фиг. 16.

Полученные результаты демонстрируют, что оба соединения по данному изобретению снижают содержание воспалительных цитокинов в легочной ткани. Концентрация IL-1в в легочной ткани в группе с соединением A была такой же, как в группе с низкой дозой соединения G. Соединение G также демонстрируют дозозависимую эффективность в отношении уменьшения содержания воспалительных цитокинов.

Таким образом, несмотря на то, что оба соединения по данному изобретению демонстрируют эффективность для лечения LPS-индуцированного острого поражения легких у мышей, эффективность соединения G была примерно в 5 раз выше, чем эффективность соединения A.

Пример 39

Модель идиопатического фиброза легких (ИФЛ) у крыс

60 Взрослых крыс SD (30 самцов, 30 самок) приобретали у компании Zhejiang Experimental Animal Center, Китай. Животных содержали при 21-26 °С и относительной влажности 40-70% со свободным доступом к корму и воде.

Через 7 дней адаптивного вскармливания крыс случайным образом делили на 6 групп, как показано ниже в таблице 17.

Таблица 17

Группа Лекарственное соединение Доза Способ введения Имитация / / Ингаляция Модель Физиологический солевой раствор 0,15 мл Ингаляция Пирфенидон Пирфенидон 240 мг/кг Желудочный зонд Соединение А Соединение А 2 мг/кг Ингаляция Соединение E Соединение E 2 мг/кг Ингаляция Соединение H Соединение H 2 мг/кг Ингаляция

Крыс анестезировали и помещали на операционный стол в положении на спине для обеспечения доступа к трахее. В трахею вводили блеомицин (5 мг/кг, гидрохлорид блеомицина для инъекций, Haizheng Pfizer Pharmaceutical Co., Ltd.) и солевой раствор через щель между хрящевыми кольцами трахеи.

В группе с имитацией операции вместо блеомицина вводили равный объем физиологического солевого раствора. Вскоре после введения крыс поднимали в вертикальное положение и переворачивали для равномерного распределения блеомицина.

После восстановления крыс, приблизительно через 7 дней, им вводили различные лекарственные препараты в соответствии с планом модели. 6,5 мг экспериментальных соединений по данному изобретению в порошкообразной форме тщательно растворяли в 5 мл солевого раствора с получением раствора с концентрацией 1,3 мг/мл. 0,15 мл полученного раствора распыляли и вводили каждой крысе посредством ингаляции. Ингаляцию осуществляли один раз в сутки.

Для группы с пирфенидоном вскрывали 12 капсул пирфенидона (Beijing Contini Pharmaceutical Co., Ltd., Пекин, Китай; 100 мг) и суспендировали все содержимое в 25 мл 0,5% раствора КМЦ-Na с получением суспензии с концентрацией 48 мг/мл. Доза пирфенидона составляла 1,0 мл/200 г для крыс, т.е. 240 мг/кг, и ее вводили с помощью желудочного зонда.

Через 28 дней введения крыс анестезировали интраперитонеальной инъекцией хлоральгидрата и затем усыпляли. Быстро вскрывали грудную полость и полностью извлекали легочную ткань. Измеряли влажную массу легких и рассчитывали легочный коэффициент (влажная масса легких/масса крысы х 1000), как показано ниже в таблице 18.

Таблица 18

Группа Легочный коэффициент (%) Имитация 6,272 ± 0,496 Модель 13,484 ± 1,395 Соединение А 8,771 ± 0,897 Соединение E 9,462 ± 1,123 Соединение H 9,825 ± 0,647 Пирфенидон 10,218 ± 0,984

Полученные результаты демонстрируют, что соединения A, E и H уменьшают отек легких, вызванный введением блеомицина.

Правый бронх зашивали, а левое легкое перфузировали раствором формалина in vitro. Левое легкое вырезали и фиксировали в растворе формалина для патологического исследования. Оставшуюся ткань хранили в морозильной камере при -80 °С для дальнейшего использования.

Фиксированную легочную ткань заливали в парафин и затем окрашивали 4 мкм срезы гепатоксилин-эозином (HE) и модифицированным трихромом Массона. Фиброзное поражение легкого морфологически оценивали по полуколичественным параметрам. Все морфологические изменения оценивали в соответствии с тяжестью повреждений. Выставляли оценки от 1 до 4 для легкой, слабой, умеренной и тяжелой степени, соответственно. Отсутствие поражений оценивали в 0 баллов. Оценка для срезов, окрашенных HE, представляет собой сумму степеней фиброза и воспаления. Оценка для срезов, окрашенных по Массону, представляет собой степень отложения коллагена в интерстициальной ткани легких. Результаты представлены ниже в таблице 19.

Таблица 19

Группа Оценка по HE Оценка по Массону Среднее СО Среднее СО Имитация 1,78 1,20 0,22 0,44 Модель 5,50 0,84 2,67 0,52 Пирфенидон 5,50 0,52 2,50 0,5 Соединение А 4,00 0,45 2,25 0,4 Соединение E 4,29 0,29 1,86 0,37 Соединение H 4,00 0,14 1,88 0,13

Полученные результаты демонстрируют, что по сравнению с группой с имитацией операции, фиброз легких и бронхиальная пневмония в модельной группе были более тяжелыми. По сравнению с модельной группой, патологические изменения в группе, получавшей лекарственное соединение, были аналогичными, а степень патологических изменений была ниже. Порядок патологических изменений был следующим: модель, пирфенидон > соединение E > соединение A > соединение H> имитация. Полученные результаты указывают на то, что соединения A, E и H предотвращают вызванный блеомицином фиброз легких у мышей, и их эффективность выше, чем эффективность пирфенидона.

Пример 40

Синтез монтелукаст-Ala-Lys-Pro-Ser-Tyr-Hyp-Hyp-Thr-Tyr-Hyp-Lys

(т.е. монтелукаст-стирола, ковалентно связанного с аминокислотой SEQ ID №: 20 на N-конце)

Использовали по существу такой же способ, как описан выше в примере 1, но изменяли порядок стадий связывания в соответствии с представленной выше аминокислотной последовательностью для синтеза модифицированного пептида с SEQ ID №: 20.

После этого связывали монтелукаст на N-конце Ala. Указанное соединение очищали с помощью ЖХМС, таким же образом, как описано выше в примере 32. Указанное соединение упомянуто далее как соединение J.

МС: m/z 924,15 [M+2H]2+

Пример 41

Мышиная модель IV отечности уха

Использовали по существу такой же протокол, как описан выше в примере 5, для 15 здоровых самцов мышей BALB/c с применением соединения J (см. выше пример 40) в качестве экспериментального соединения. Мышей случайным образом разделяли на 3 группы, как показано ниже в таблице 20, по 5 мышей в каждой группе.

Получали гидрогель соединения J, содержащий 0,5 мг/г активного ингредиента и метилцеллюлозу (2,5%), пропандиол (11%), глицерин (11%), уксусную кислоту (регулятор рН; от 0 до 0,5 г). Все вспомогательные вещества приобретали у компании Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd. Гель получали с использованием воды для инъекций.

В качестве положительного контроля использовали крем ацетата дексаметазона (крем DEX; 5 мг дексаметазона в 10 г крема; Fuyuan Pharmaceutical Co. Ltd., Аньхой, Китай). На правое ухо в каждой группе наносили 40 мкл различных экспериментальных препаратов.

Таблица 20

Группа Концентрация лекарственного соединения Нанесение лекарственного соединения на правое ухо Общее количество лекарственных соединений (мкг/мышь) Модель / Ксилол / Крем Dex 10 мкг/мкл ксилол + крем дексаметазона 400 Соединение J 0,5 мг/г ксилол + гель соединения J 20

Результаты представлены на Фиг. 17. Соединение J было весьма эффективным для устранения отечности, вызванной острым воспалением.

Пример 42

Клинический пример. Аллергический конъюнктивит

У 52-летней пациентки диагностировали аллергический конъюнктивит, и она жаловалась на опухшие веки, зуд и водянистые выделения из носа.

Во флакон с распылителем упаковывали 0,5 мг/мл соединения G в солевом растворе. Спрей вводили в каждый глаз 2-3 раза в сутки на протяжении 7 дней.

После первого введения пациентка почувствовала облегчение зуда в глазах. На второй день лечения уменьшилась отечность век. За неделю наблюдали полное прекращение всех симптомов.

Пример 43

Клинический пример. Язвенный колит

Госпитализированный пациент с язвенным колитом страдал от тяжелых симптомов, включая сильную боль в животе и спазмы, частую диарею (более 20 раз в сутки), и не был восприимчивым к безрецептурным препаратам. Пациент страдал от ректального кровотечения, выхода небольшого количества крови со стулом и неотложных позывов к дефекации, а также от лихорадки.

Получали гидрогель соединения G, состоящий из 0,5 мг/г активного ингредиента, метилцеллюлозы (2,5%), пропандиола (11%), глицерина (11%), уксусной кислоты (регулятор рН; от 0 до 0,5 г). Все вспомогательные вещества приобретали у компании Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd. Гель получали с использованием воды для инъекций.

Пациенту анально вводили 2 г описанного выше геля один раз в сутки. На второй день после введения диарея сократилась до 5-6 раз в сутки с меньшим кровотечением.

Пациент продолжал использовать гель с целью определения долгосрочной эффективности.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> Jiangyin USUN Pharmaceutical Co., Ltd.

<120> Новые конъюгаты монтелукаста и пептидов

<130> USUCZ/P70239PC

<140> PCT/CN2019/105832

<141> 2019-09-14

<150> PCT/CN2018/119072

<151> 2018-12-04

<150> PCT/CN2018/105703

<151> 2018-09-14

<160> 48

<170> BiSSAP 1.3.6

<210> 1

<211> 37

<212> PRT

<213> Hyalophora cecropia

<220>

<221> MOD_RES

<222> 1

<223> Остаток лизина с N-концевым водородом

<220>

<223> Цекропин A

<220>

<221> MOD_RES

<222> 37

<223> Остаток лизина с C-концевым карбоксамидом

<400> 1

Xaa Trp Lys Leu Phe Lys Lys Ile Glu Lys Val Gly Gln Asn Ile Arg

1 5 10 15

Asp Gly Ile Ile Lys Ala Gly Pro Ala Val Ala Val Val Gly Gln Ala

20 25 30

Thr Gln Ile Ala Xaa

35

<210> 2

<211> 35

<212> PRT

<213> Hyalophora cecropia

<220>

<221> MOD_RES

<222> 1

<223> Остаток лизина с N-концевым водородом

<220>

<223> Цекропин B

<220>

<221> MOD_RES

<222> 35

<223> Остаток лизина с C-концевым карбоксамидом

<400> 2

Xaa Trp Lys Val Phe Lys Lys Ile Glu Lys Met Gly Arg Asn Ile Arg

1 5 10 15

Asn Gly Ile Val Lys Ala Gly Pro Ala Ile Ala Val Leu Gly Glu Ala

20 25 30

Lys Ala Xaa

35

<210> 3

<211> 37

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<221> MOD_RES

<222> 1

<223> Остаток лизина с N-концевым водородом

<220>

<223> LL-37

<220>

<221> MOD_RES

<222> 37

<223> Остаток лизина с C-концевым карбоксамидом

<400> 3

Xaa Leu Gly Asp Phe Phe Arg Lys Ser Lys Glu Lys Ile Gly Lys Glu

1 5 10 15

Phe Lys Arg Ile Val Gln Arg Ile Lys Asp Phe Leu Arg Asn Leu Val

20 25 30

Pro Arg Thr Glu Xaa

35

<210> 4

<211> 10

<212> PRT

<213> Синтетическая

<220>

<221> САЙТ

<222> 6,7

<223> Где Xaa представляет собой 3- или 4-гидроксипролин

<220>

<221> САЙТ

<222> 9

<223> Где Xaa представляет собой 3,4-дигидроксифенилаланин

<400> 4

Ala Lys Pro Ser Tyr Xaa Xaa Thr Xaa Lys

1 5 10

<210> 5

<211> 4

<212> PRT

<213> Синтетическая

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> 1

<223> Где Xaa представляет собой цепь из 1-2 аминокислотных остатков,

каждый из которых независимо выбран из группы, состоящей из Ala и Lys

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> 3

<223> Где Xaa представляет собой серин или фосфосерин

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> 4

<223> Где Xaa представляет собой цепь из 1-7 аминокислотных остатков,

каждый из которых независимо выбран из группы, состоящей из тирозина,

фосфотирозина, 3-гидроксипролина, 4-гидроксипролина, треонина,

фосфотреонина, 3,4-дигидроксифенилаланина и лизина

<400> 5

Xaa Pro Xaa Xaa

1

<210> 6

<211> 6

<212> PRT

<213> Синтетическая

<220>

<221> САЙТ

<222> 4,5

<223> Где Xaa представляет собой 3- или 4-гидроксипролин

<400> 6

Ala Pro Ser Xaa Xaa Thr

1 5

<210> 7

<211> 8

<212> PRT

<213> Синтетическая

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> 1

<223> Где Xaa отсутствует или представляет собой аланин

<220>

<221> САЙТ

<222> 4

<223> Где Xaa представляет собой серин или фосфосерин

<220>

<221> САЙТ

<222> 5

<223> Где Xaa выбран из группы, состоящей из

3,4-дигидроксифенилаланина, тирозина и фосфотирозина

<220>

<221> САЙТ

<222> 6

<223> Где Xaa представляет собой 3- или 4-гидроксипролин

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> 7

<223> Где Xaa представляет собой цепь из 1-4 аминокислотных остатков,

каждый из которых независимо выбран из группы, состоящей из тирозина,

фосфотирозина, 3-гидроксипролина, 4-гидроксипролина, треонина,

фосфотреонина и 3,4-дигидроксифенилаланина

<400> 7

Xaa Lys Pro Xaa Xaa Xaa Xaa Lys

1 5

<210> 8

<211> 7

<212> PRT

<213> Синтетическая

<220>

<221> САЙТ

<222> 3

<223> Где Xaa представляет собой серин или фосфосерин

<220>

<221> САЙТ

<222> 4

<223> Где Xaa выбран из группы, состоящей из

3,4-дигидроксифенилаланина, тирозина и фосфотирозина

<220>

<221> САЙТ

<222> 5

<223> Где Xaa представляет собой 3- или 4-гидроксипролин

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> 6

<223> Где Xaa представляет собой цепь из 1-4 аминокислотных остатков,

каждый из которых независимо выбран из группы, состоящей из тирозина,

фосфотирозина, 3-гидроксипролина, 4-гидроксипролина, треонина,

фосфотреонина и 3,4-дигидроксифенилаланина

<400> 8

Lys Pro Xaa Xaa Xaa Xaa Lys

1 5

<210> 9

<211> 10

<212> PRT

<213> Синтетическая

<220>

<221> САЙТ

<222> 4

<223> Где Xaa представляет собой серин или фосфосерин

<220>

<221> САЙТ

<222> 5

<223> Где Xaa выбран из группы, состоящей из

3,4-дигидроксифенилаланина, тирозина и фосфотирозина

<220>

<221> САЙТ

<222> 6,7

<223> Где Xaa представляет собой 3- или 4-гидроксипролин

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> 9

<223> Где Xaa представляет собой тирозин, фосфотирозин, 3-гидроксипролин,

4-гидроксипролин, треонин, фосфотреонин или

3,4-дигидроксифенилаланин

<400> 9

Ala Lys Pro Xaa Xaa Xaa Xaa Thr Xaa Lys

1 5 10

<210> 10

<211> 10

<212> PRT

<213> Синтетическая

<220>

<221> САЙТ

<222> 4

<223> Где Xaa представляет собой серин или фосфосерин

<220>

<221> САЙТ

<222> 5

<223> Где Xaa выбран из группы, состоящей из

3,4-дигидроксифенилаланина, тирозина и фосфотирозина

<220>

<221> САЙТ

<222> 6

<223> Где Xaa представляет собой 3- или 4-гидроксипролин

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> 8

<223> Где Xaa представляет собой тирозин, фосфотирозин, 3-гидроксипролин,

4-гидроксипролин, треонин, фосфотреонин или

3,4-дигидроксифенилаланин

<220>

<221> САЙТ

<222> 9

<223> Где Xaa представляет собой 3- или 4-гидроксипролин

<400> 10

Ala Lys Pro Xaa Xaa Xaa Thr Xaa Xaa Lys

1 5 10

<210> 11

<211> 10

<212> PRT

<213> Синтетическая

<220>

<221> САЙТ

<222> 4

<223> Где Xaa представляет собой фосфосерин

<220>

<221> САЙТ

<222> 6,7

<223> Где Xaa представляет собой 3- или 4-гидроксипролин

<220>

<221> САЙТ

<222> 9

<223> Где Xaa представляет собой 3,4-дигидроксифенилаланин

<400> 11

Ala Lys Pro Xaa Tyr Xaa Xaa Thr Xaa Lys

1 5 10

<210> 12

<211> 10

<212> PRT

<213> Синтетическая

<220>

<221> САЙТ

<222> 6,7

<223> Где Xaa представляет собой 3- или 4-гидроксипролин

<400> 12

Ala Lys Pro Ser Tyr Xaa Xaa Thr Tyr Lys

1 5 10

<210> 13

<211> 10

<212> PRT

<213> Синтетическая

<220>

<221> САЙТ

<222> 4

<223> Где Xaa представляет собой фосфосерин

<220>

<221> САЙТ

<222> 6,7

<223> Где Xaa представляет собой 3- или 4-гидроксипролин

<400> 13

Ala Lys Pro Xaa Tyr Xaa Xaa Thr Tyr Lys

1 5 10

<210> 14

<211> 7

<212> PRT

<213> Синтетическая

<220>

<221> САЙТ

<222> 5

<223> Где Xaa представляет собой 3- или 4-гидроксипролин

<220>

<221> САЙТ

<222> 6

<223> Где Xaa представляет собой 3,4-дигидроксифенилаланин

<400> 14

Lys Pro Ser Tyr Xaa Xaa Lys

1 5

<210> 15

<211> 7

<212> PRT

<213> Синтетическая

<220>

<221> САЙТ

<222> 4

<223> Где Xaa представляет собой фосфотирозин

<220>

<221> САЙТ

<222> 5

<223> Где Xaa представляет собой 3- или 4-гидроксипролин

<220>

<221> САЙТ

<222> 6

<223> Где Xaa представляет собой 3,4-дигидроксифенилаланин

<400> 15

Lys Pro Ser Xaa Xaa Xaa Lys

1 5

<210> 16

<211> 10

<212> PRT

<213> Синтетическая

<220>

<221> САЙТ

<222> 6,7

<223> Где Xaa представляет собой 3- или 4-гидроксипролин

<220>

<221> САЙТ

<222> 8

<223> Где Xaa представляет собой фосфотреонин

<220>

<221> САЙТ

<222> 9

<223> Где Xaa представляет собой 3,4-дигидроксифенилаланин

<400> 16

Ala Lys Pro Ser Tyr Xaa Xaa Xaa Xaa Lys

1 5 10

<210> 17

<211> 10

<212> PRT

<213> Синтетическая

<220>

<221> САЙТ

<222> 6,7

<223> Где Xaa представляет собой 3- или 4-гидроксипролин

<220>

<221> САЙТ

<222> 8

<223> Где Xaa представляет собой фосфотреонин

<400> 17

Ala Lys Pro Ser Tyr Xaa Xaa Xaa Tyr Lys

1 5 10

<210> 18

<211> 11

<212> PRT

<213> Синтетическая

<220>

<221> САЙТ

<222> 6,7,10

<223> Где Xaa представляет собой 3- или 4-гидроксипролин

<220>

<221> САЙТ

<222> 9

<223> Где Xaa представляет собой 3,4-дигидроксифенилаланин

<400> 18

Ala Lys Pro Ser Tyr Xaa Xaa Thr Xaa Xaa Lys

1 5 10

<210> 19

<211> 11

<212> PRT

<213> Синтетическая

<220>

<221> САЙТ

<222> 4

<223> Где Xaa представляет собой фосфосерин

<220>

<221> САЙТ

<222> 6,7,10

<223> Где Xaa представляет собой 3- или 4-гидроксипролин

<220>

<221> САЙТ

<222> 9

<223> Где Xaa представляет собой 3,4-дигидроксифенилаланин

<400> 19

Ala Lys Pro Xaa Tyr Xaa Xaa Thr Xaa Xaa Lys

1 5 10

<210> 20

<211> 11

<212> PRT

<213> Синтетическая

<220>

<221> САЙТ

<222> 6,7,10

<223> Где Xaa представляет собой 3- или 4-гидроксипролин

<400> 20

Ala Lys Pro Ser Tyr Xaa Xaa Thr Tyr Xaa Lys

1 5 10

<210> 21

<211> 11

<212> PRT

<213> Синтетическая

<220>

<221> САЙТ

<222> 4

<223> Где Xaa представляет собой фосфосерин

<220>

<221> САЙТ

<222> 6,7,10

<223> Где Xaa представляет собой 3- или 4-гидроксипролин

<400> 21

Ala Lys Pro Xaa Tyr Xaa Xaa Thr Tyr Xaa Lys

1 5 10

<210> 22

<211> 10

<212> PRT

<213> Синтетическая

<220>

<221> САЙТ

<222> 6,9

<223> Где Xaa представляет собой 3- или 4-гидроксипролин

<220>

<221> САЙТ

<222> 8

<223> Где Xaa представляет собой 3,4-дигидроксифенилаланин

<400> 22

Ala Lys Pro Ser Tyr Xaa Thr Xaa Xaa Lys

1 5 10

<210> 23

<211> 9

<212> PRT

<213> Синтетическая

<220>

<221> САЙТ

<222> 4

<223> Где Xaa представляет собой фосфосерин

<220>

<221> САЙТ

<222> 6,9

<223> Где Xaa представляет собой 3- или 4-гидроксипролин

<220>

<221> САЙТ

<222> 8

<223> Где Xaa представляет собой 3,4-дигидроксифенилаланин

<400> 23

Ala Lys Pro Xaa Tyr Xaa Thr Xaa Lys

1 5

<210> 24

<211> 10

<212> PRT

<213> Синтетическая

<220>

<221> САЙТ

<222> 6,9

<223> Где Xaa представляет собой 3- или 4-гидроксипролин

<400> 24

Ala Lys Pro Ser Tyr Xaa Thr Tyr Xaa Lys

1 5 10

<210> 25

<211> 10

<212> PRT

<213> Синтетическая

<220>

<221> САЙТ

<222> 4

<223> Где Xaa представляет собой фосфосерин

<220>

<221> САЙТ

<222> 6,9

<223> Где Xaa представляет собой 3- или 4-гидроксипролин

<400> 25

Ala Lys Pro Xaa Tyr Xaa Thr Tyr Xaa Lys

1 5 10

<210> 26

<211> 11

<212> PRT

<213> Синтетическая

<220>

<221> САЙТ

<222> 6,7,10

<223> Где Xaa представляет собой 3- или 4-гидроксипролин

<220>

<221> САЙТ

<222> 8

<223> Где Xaa представляет собой фосфотреонин

<220>

<221> САЙТ

<222> 9

<223> Где Xaa представляет собой 3,4-дигидроксифенилаланин

<400> 26

Ala Lys Pro Ser Tyr Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Lys

1 5 10

<210> 27

<211> 11

<212> PRT

<213> Синтетическая

<220>

<221> САЙТ

<222> 6,7,10

<223> Где Xaa представляет собой 3- или 4-гидроксипролин

<220>

<221> САЙТ

<222> 8

<223> Где Xaa представляет собой фосфотреонин

<400> 27

Ala Lys Pro Ser Tyr Xaa Xaa Xaa Tyr Xaa Lys

1 5 10

<210> 28

<211> 9

<212> PRT

<213> Синтетическая

<220>

<221> САЙТ

<222> 6,7

<223> Где Xaa представляет собой 3- или 4-гидроксипролин

<220>

<221> САЙТ

<222> 9

<223> Где Xaa представляет собой 3,4-дигидроксифенилаланин

<400> 28

Ala Lys Pro Ser Tyr Xaa Xaa Thr Xaa

1 5

<210> 29

<211> 9

<212> PRT

<213> Синтетическая

<220>

<221> САЙТ

<222> 4

<223> Где Xaa представляет собой фосфосерин

<220>

<221> САЙТ

<222> 6,7

<223> Где Xaa представляет собой 3- или 4-гидроксипролин

<220>

<221> САЙТ

<222> 9

<223> Где Xaa представляет собой 3,4-дигидроксифенилаланин

<400> 29

Ala Lys Pro Xaa Tyr Xaa Xaa Thr Xaa

1 5

<210> 30

<211> 9

<212> PRT

<213> Синтетическая

<220>

<221> САЙТ

<222> 6,7

<223> Где Xaa представляет собой 3- или 4-гидроксипролин

<400> 30

Ala Lys Pro Ser Tyr Xaa Xaa Thr Tyr

1 5

<210> 31

<211> 9

<212> PRT

<213> Синтетическая

<220>

<221> САЙТ

<222> 4

<223> Где Xaa представляет собой фосфосерин

<220>

<221> САЙТ

<222> 6,7

<223> Где Xaa представляет собой 3- или 4-гидроксипролин

<400> 31

Ala Lys Pro Xaa Tyr Xaa Xaa Thr Tyr

1 5

<210> 32

<211> 6

<212> PRT

<213> Синтетическая

<220>

<221> САЙТ

<222> 5

<223> Где Xaa представляет собой 3- или 4-гидроксипролин

<220>

<221> САЙТ

<222> 6

<223> Где Xaa представляет собой 3,4-дигидроксифенилаланин

<400> 32

Lys Pro Ser Tyr Xaa Xaa

1 5

<210> 33

<211> 6

<212> PRT

<213> Синтетическая

<220>

<221> САЙТ

<222> 4

<223> Где Xaa представляет собой фосфотирозин

<220>

<221> САЙТ

<222> 5

<223> Где Xaa представляет собой 3- или 4-гидроксипролин

<220>

<221> САЙТ

<222> 6

<223> Где Xaa представляет собой 3,4-дигидроксифенилаланин

<400> 33

Lys Pro Ser Xaa Xaa Xaa

1 5

<210> 34

<211> 9

<212> PRT

<213> Синтетическая

<220>

<221> САЙТ

<222> 6,7

<223> Где Xaa представляет собой 3- или 4-гидроксипролин

<220>

<221> САЙТ

<222> 8

<223> Где Xaa представляет собой фосфотреонин

<220>

<221> САЙТ

<222> 9

<223> Где Xaa представляет собой 3,4-дигидроксифенилаланин

<400> 34

Ala Lys Pro Ser Tyr Xaa Xaa Xaa Xaa

1 5

<210> 35

<211> 9

<212> PRT

<213> Синтетическая

<220>

<221> САЙТ

<222> 6,7

<223> Где Xaa представляет собой 3- или 4-гидроксипролин

<220>

<221> САЙТ

<222> 8

<223> Где Xaa представляет собой фосфотреонин

<400> 35

Ala Lys Pro Ser Tyr Xaa Xaa Xaa Tyr

1 5

<210> 36

<211> 10

<212> PRT

<213> Синтетическая

<220>

<221> САЙТ

<222> 6,7,10

<223> Где Xaa представляет собой 3- или 4-гидроксипролин

<220>

<221> САЙТ

<222> 9

<223> Где Xaa представляет собой 3,4-дигидроксифенилаланин

<400> 36

Ala Lys Pro Ser Tyr Xaa Xaa Thr Xaa Xaa

1 5 10

<210> 37

<211> 10

<212> PRT

<213> Синтетическая

<220>

<221> САЙТ

<222> 4

<223> Где Xaa представляет собой фосфосерин

<220>

<221> САЙТ

<222> 6,7,10

<223> Где Xaa представляет собой 3- или 4-гидроксипролин

<220>

<221> САЙТ

<222> 9

<223> Где Xaa представляет собой 3,4-дигидроксифенилаланин

<400> 37

Ala Lys Pro Xaa Tyr Xaa Xaa Thr Xaa Xaa

1 5 10

<210> 38

<211> 10

<212> PRT

<213> Синтетическая

<220>

<221> САЙТ

<222> 6,7,10

<223> Где Xaa представляет собой 3- или 4-гидроксипролин

<400> 38

Ala Lys Pro Ser Tyr Xaa Xaa Thr Tyr Xaa

1 5 10

<210> 39

<211> 10

<212> PRT

<213> Синтетическая

<220>

<221> САЙТ

<222> 4

<223> Где Xaa представляет собой фосфосерин

<220>

<221> САЙТ

<222> 6,7,10

<223> Где Xaa представляет собой 3- или 4-гидроксипролин

<400> 39

Ala Lys Pro Xaa Tyr Xaa Xaa Thr Tyr Xaa

1 5 10

<210> 40

<211> 9

<212> PRT

<213> Синтетическая

<220>

<221> САЙТ

<222> 6,9

<223> Где Xaa представляет собой 3- или 4-гидроксипролин

<220>

<221> САЙТ

<222> 8

<223> Где Xaa представляет собой 3,4-дигидроксифенилаланин

<400> 40

Ala Lys Pro Ser Tyr Xaa Thr Xaa Xaa

1 5

<210> 41

<211> 9

<212> PRT

<213> Синтетическая

<220>

<221> САЙТ

<222> 4

<223> Где Xaa представляет собой фосфосерин

<220>

<221> САЙТ

<222> 6,9

<223> Где Xaa представляет собой 3- или 4-гидроксипролин

<220>

<221> САЙТ

<222> 8

<223> Где Xaa представляет собой 3,4-дигидроксифенилаланин

<400> 41

Ala Lys Pro Xaa Tyr Xaa Thr Xaa Xaa

1 5

<210> 42

<211> 9

<212> PRT

<213> Синтетическая

<220>

<221> САЙТ

<222> 6,9

<223> Где Xaa представляет собой 3- или 4-гидроксипролин

<400> 42

Ala Lys Pro Ser Tyr Xaa Thr Tyr Xaa

1 5

<210> 43

<211> 9

<212> PRT

<213> Синтетическая

<220>

<221> САЙТ

<222> 4

<223> Где Xaa представляет собой фосфосерин

<220>

<221> САЙТ

<222> 6,9

<223> Где Xaa представляет собой 3- или 4-гидроксипролин

<400> 43

Ala Lys Pro Xaa Tyr Xaa Thr Tyr Xaa

1 5

<210> 44

<211> 10

<212> PRT

<213> Синтетическая

<220>

<221> САЙТ

<222> 6,7,10

<223> Где Xaa представляет собой 3- или 4-гидроксипролин

<220>

<221> САЙТ

<222> 8

<223> Где Xaa представляет собой фосфотреонин

<220>

<221> САЙТ

<222> 9

<223> Где Xaa представляет собой 3,4-дигидроксифенилаланин

<400> 44

Ala Lys Pro Ser Tyr Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa

1 5 10

<210> 45

<211> 10

<212> PRT

<213> Синтетическая

<220>

<221> САЙТ

<222> 6,7,10

<223> Где Xaa представляет собой 3- или 4-гидроксипролин

<220>

<221> САЙТ

<222> 8

<223> Где Xaa представляет собой фосфотреонин

<400> 45

Ala Lys Pro Ser Tyr Xaa Xaa Xaa Tyr Xaa

1 5 10

<210> 46

<211> 7

<212> PRT

<213> Синтетическая

<220>

<221> САЙТ

<222> 6,7

<223> Где Xaa представляет собой 3- или 4-гидроксипролин

<400> 46

Ala Lys Pro Ser Tyr Xaa Xaa

1 5

<210> 47

<211> 6

<212> PRT

<213> Синтетическая

<220>

<221> САЙТ

<222> 6

<223> Где Xaa представляет собой 3- или 4-гидроксипролин

<400> 47

Ala Lys Pro Ser Tyr Xaa

1 5

<210> 48

<211> 4

<212> PRT

<213> Синтетическая

<220>

<221> САЙТ

<222> 1,4

<223> Где Xaa представляет собой 3- или 4-гидроксипролин

<400> 48

Xaa Thr Tyr Xaa

1

<---

Группа изобретений относится к области биотехнологии и может быть применима в медицине. Изобретение раскрывает конъюгат, который содержит пептидный компонент, представляющий собой аминокислотную последовательность из 2-45 аминокислот, ковалентно связанный с одним или более соединениями формулы I

Причем соединение формулы I предпочтительно представляет собой монтелукаст, монтелукаст-стирол или гидрированный монтелукаст-стирол. Конъюгат согласно настоящему изобретению, в том числе в составе фармацевтической композиции, может быть использован в медицине для лечения различных заболеваний, сопровождающихся воспалением, включая раны, геморрой, ожоги, псориаз, угри, атопический дерматит, аллергический ринит, аллергический конъюнктивит, хроническую обструктивную болезнь легких, воспалительную болезнь кишечника и др. Также предложенный конъюгат может быть применим для лечения идиопатического фиброза легких. 12 н. и 73 з.п. ф-лы, 17 ил., 20 табл., 43 пр.

1. Пептидсодержащее соединение для лечения воспаления, воспалительного заболевания и/или расстройства, характеризующегося воспалением, содержащее пептидный компонент, который содержит или состоит из аминокислотной последовательности

X-Pro-Y-Z (SEQ ID No: 5),

где X представляет собой цепь из 1-2 аминокислотных остатков, каждый из которых независимо выбран из группы, состоящей из Ala и Lys;

Y выбран из группы, состоящей из Ser и pSer;

Z представляет собой цепь из 1-7 аминокислотных остатков, каждый из которых независимо выбран из группы, состоящей из Tyr, pTyr, 3Hyp или 4Hyp, Thr, pThr, DOPA и Lys,

где по крайней мере один из остатков Ala и/или Lys в указанном пептидном компоненте ковалентно связан с одним или более соединением формулы I

где R¹ выбран из группы, состоящей из -C(CH₃)₂OH, -COCH₃, -C(CH₃)=CH₂ и -C(CH₃)₂H; и n равен 0, 1 или 2;

его региоизомер, стереоизомер и фармацевтически приемлемая соль.

2. Пептидсодержащее соединение по п. 1, отличающееся тем, что пептидный компонент связан с по меньшей мере одним соединением формулы I через первичную амидную связь, образованную на N-конце указанного пептидного компонента.

3. Пептидсодержащее соединение по п. 1 или 2, отличающееся тем, что пептидный компонент связан с по меньшей мере одним соединением формулы I через первичную амидную связь, образованную по меньшей мере одной свободной группой -NH₂ в одной или более аминокислотах в указанной последовательности, которые не являются N-концевой аминокислотой.

4. Пептидсодержащее соединение по любому из пп. 1-3, отличающееся тем, что по меньшей мере одна из аминокислот в пептидном компоненте представляет собой лизин.

5. Пептидсодержащее соединение по п. 4, отличающееся тем, что по меньшей мере около 5% аминокислот представляют собой лизин.

6. Пептидсодержащее соединение по п. 5, отличающееся тем, что по меньшей мере около 20% аминокислот представляют собой лизин.

7. Пептидсодержащее соединение по любому из пп. 1-6, отличающееся тем, что пептидный компонент представляет собой противомикробный и/или противовоспалительный пептид или его фрагмент и/или вариант такого пептида.

8. Пептидсодержащее соединение по любому из пп. 1-7, отличающееся тем, что по меньшей мере около 5% аминокислот пептидного компонента содержат ароматическую группу.

9. Пептидсодержащее соединение по п. 8, отличающееся тем, что по меньшей мере около 10% аминокислот содержат ароматическую группу.

10. Пептидсодержащее соединение по п. 8 или 9, отличающееся тем, что аминокислоты, которые содержат ароматическую группу, выбраны из группы, состоящей из тирозина и 3,4-дигидроксифенилаланина.

11. Пептидсодержащее соединение по любому из пп. 1-10, отличающееся тем, что пептидный компонент содержит или состоит из аминокислотной последовательности

G₁-Lys-Pro-G₂-T-Hyp-G₃-Lys (SEQ ID No: 7),

где G₁ отсутствует или представляет собой Ala;

G₂ выбран из группы, состоящей из Ser и pSer;

T выбран из группы, состоящей из DOPA, Tyr и pTyr;

Hyp выбран из группы, состоящей из 3Hyp и 4Hyp;

G₃ представляет собой цепь из 1-3 или 1-4 аминокислотных остатков, каждый из которых независимо выбран из группы, состоящей из Tyr, pTyr, 3Hyp, 4Hyp, Thr, pThr и DOPA; и

по меньшей мере один из остатков Lys и/или, когда он присутствует, остаток Ala связан с по меньшей мере одним соединением формулы I, как оно определено в п. 1.

12. Пептидсодержащее соединение по п. 11, отличающееся тем, что пептидный компонент содержит или состоит из аминокислотной последовательности

Lys-Pro-G₂-T-Hyp-G₃-Lys (SEQ ID No: 8),

где G₂, T, Hyp и G₃ имеют значения как определено в п. 11.

13. Пептидсодержащее соединение по п. 11, отличающееся тем, что G₁ представляет собой Ala.

14. Пептидсодержащее соединение по любому из пп. 11 или 13, отличающееся тем, что пептидный компонент содержит или состоит из аминокислотной последовательности

Ala-Lys-Pro-G₂-T-Hyp-Hyp-Thr-G₄-Lys (SEQ ID No: 9),

где G₂, T и Hyp являются такими, как определено в п. 11, и G₄ выбран из группы, состоящей из Tyr, pTyr, 3Hyp, 4Hyp, Thr, pThr и DOPA.

15. Пептидсодержащее соединение по любому из пп. 11-14, отличающееся тем, что G₂ представляет собой Ser.

16. Пептидсодержащее соединение по любому из пп. 11-15, отличающееся тем, что T представляет собой Tyr.

17. Пептидсодержащее соединение по любому из пп. 11-16, отличающееся тем, что G₃ или G₄ в соответствующем случае представляет собой Tyr или DOPA.

18. Пептидсодержащее соединение по п. 17, отличающееся тем, что пептидный компонент содержит или состоит из аминокислотной последовательности:

Ala-Lys-Pro-Ser-Tyr-Hyp-Hyp-Thr-DOPA-Lys (SEQ ID No: 4);

Ala-Lys-Pro-pSer-Tyr-Hyp-Hyp-Thr-DOPA-Lys (SEQ ID No: 11);

Ala-Lys-Pro-Ser-Tyr-Hyp-Hyp-Thr-Tyr-Lys (SEQ ID No: 12);

Ala-Lys-Pro-pSer-Tyr-Hyp-Hyp-Thr-Tyr-Lys (SEQ ID No: 13);

Lys-Pro-Ser-Tyr-Hyp-DOPA-Lys (SEQ ID No: 14); и

Lys-Pro-Ser-pTyr-Hyp-DOPA-Lys (SEQ ID No: 15).

19. Пептидсодержащее соединение по п. 18, отличающееся тем, что пептидный компонент содержит или состоит из аминокислотной последовательности

Ala-Lys-Pro-Ser-Tyr-Hyp-Hyp-Thr-Tyr-Lys (SEQ ID No: 12).

20. Пептидсодержащее соединение по любому из пп. 11-16, отличающееся тем, что G₃ или G₄ в соответствующем случае представляет собой -V¹-Thr-Tyr-V²-, причем V¹ связан с Hyp, и V² связан с Lys, и V¹ и V² независимо либо отсутствуют, либо представляют собой одну или две группы Hyp.

21. Пептидсодержащее соединение по п. 20, отличающееся тем, что -V¹-Thr-Tyr-V²-представляет собой -Hyp-Thr-Tyr-, -Hyp-Thr-Tyr-Hyp- или -Thr-Tyr-Hyp-.

22. Пептидсодержащее соединение по п. 20, отличающееся тем, что пептидный компонент содержит или состоит из аминокислотной последовательности:

Ala-Lys-Pro-Ser-Tyr-Hyp-Hyp-Thr-DOPA-Hyp-Lys (SEQ ID No: 18);

Ala-Lys-Pro-pSer-Tyr-Hyp-Hyp-Thr-DOPA-Hyp-Lys (SEQ ID No: 19);

Ala-Lys-Pro-Ser-Tyr-Hyp-Hyp-Thr-Tyr-Hyp-Lys (SEQ ID No: 20);

Ala-Lys-Pro-pSer-Tyr-Hyp-Hyp-Thr-Tyr-Hyp-Lys (SEQ ID No: 21);

Ala-Lys-Pro-Ser-Tyr-Hyp-Thr-DOPA-Hyp-Lys (SEQ ID No: 22);

Ala-Lys-Pro-pSer-Tyr-Hyp-Thr-DOPA-Hyp-Lys (SEQ ID No: 23);

Ala-Lys-Pro-Ser-Tyr-Hyp-Thr-Tyr-Hyp-Lys (SEQ ID No: 24); и

Ala-Lys-Pro-pSer-Tyr-Hyp-Thr-Tyr-Hyp-Lys (SEQ ID No: 25).

23. Пептидсодержащее соединение по п. 22, отличающееся тем, что пептидный компонент содержит или состоит из аминокислотной последовательности

Ala-Lys-Pro-Ser-Tyr-Hyp-Thr-Tyr-Hyp-Lys (SEQ ID No: 24).

24. Пептидсодержащее соединение по любому из пп. 1-23, отличающееся тем, что одно или более соединений формулы I связаны с пептидным компонентом через N-концевой фрагмент Ala или Lys и/или через C-концевой фрагмент Lys.

25. Пептидсодержащее соединение по любому из пп. 1-24, отличающееся тем, что с пептидным компонентом связаны одно или два соединения формулы I.

26. Пептидсодержащее соединение по п. 25, отличающееся тем, что с пептидным компонентом связано одно соединение формулы I.

27. Пептидсодержащее соединение по любому из пп. 1-26, отличающееся тем, что в одном или более соединениях формулы I R¹ выбран из группы, состоящей из -C(CH₃)₂OH, -C(CH₃)=CH₂ и -C(CH₃)₂H; и/или n равен 0.

28. Пептидсодержащее соединение по любому из пп. 1-27, отличающееся тем, что одно или более соединений формулы I представляют собой монтелукаст, монтелукаст-стирол или гидрированный монтелукаст-стирол.

29. Пептидсодержащее соединение по любому из пп. 1-28, отличающееся тем, что пептидный компонент пептидсодержащего соединения содержит или состоит из аминокислотной последовательности

Ala-Lys-Pro-Ser-Tyr-Hyp-Thr-Tyr-Hyp-Lys (SEQ ID No: 24),

соединение формулы I представляет собой монтелукаст, и

при этом монтелукаст ковалентно связан с N-концевым остатком Ala.

30. Фармацевтическая композиция, содержащая соединение по любому из пп. 1-29, для местного введения, отличающаяся тем, что фармацевтически приемлемый адъювант, разбавитель или носитель представляет собой адъювант, разбавитель или носитель для местного применения.

31. Фармацевтическая композиция по п. 30, представленная в форме геля, спрея, крема, мази или сухого порошка.

32. Фармацевтическая композиция по п. 30 или 31, дополнительно содержащая иной противовоспалительный агент.

33. Комбинированный продукт для лечения воспаления, воспалительного заболевания и/или расстройства, характеризующегося воспалением, где комбинированный продукт содержит следующие компоненты:

(A) одну или более фармацевтическую композицию по любому из пп. 30 или 31; и

(B) одну или более фармацевтическую композицию, содержащую иной противовоспалительный агент в смеси с фармацевтически приемлемым адъювантом, разбавителем или носителем,

причем каждый компонент (A) и (B) представлен в такой форме, которая подходит для введения в сочетании с другим компонентом,

отличающийся тем, что фармацевтические композиции в (А) и (В) могут быть одинаковыми или могут различаться по дозе любого соединения, химическому составу соответствующих композиций и/или физическим формам,

причем соответствующие дозы компонентов (А) и (В) вводятся либо вместе, либо достаточно близко по времени, чтобы обеспечить положительный эффект для пациента, который выше, чем при введении компонента (А) или (В) в отдельности в течение такого же курса лечения.

34. Применение соединения по любому из пп. 1-29 или его фармацевтически приемлемой соли, композиции по любому из пп. 30-32 или комбинированного продукта по п. 33 для производства лекарственного средства для лечения воспаления, воспалительного расстройства и/или расстройства, характеризующегося воспалением.

35. Способ лечения воспаления, воспалительного расстройства и/или расстройства, характеризующегося воспалением, включающий введение пациенту, нуждающемуся в таком лечении, соединения по любому из пп. 1-29 или его фармацевтически приемлемой соли, композиции по любому из пп. 30-32 или комбинированного продукта по п. 33.

36. Применение по п. 34 или способ по п. 35, отличающиеся тем, что воспаление является симптомом основного физиологического нарушения.

37. Применение по п. 34 или способ по п. 35, отличающиеся тем, что воспалительное расстройство включает воспаление одного или более из мягких тканей, суставов, нервов, сосудистой системы, одного или более внутренних органов, одной или более поверхностей слизистой оболочки или кожи.

38. Применение или способ по п. 37, отличающиеся тем, что воспалительное расстройство представляет собой воспаление слизистой оболочки полости рта, носа, глаз, влагалища, шейки матки и/или аноректальной кишки.

39. Применение или способ по п. 38, отличающиеся тем, что указанное расстройство представляет собой воспаление одной или более поверхностей слизистых оболочек и выбрано из ротового мукозита, афтозных язв, отита среднего уха, ларингита, трахеита, эзофагита, гастрита, энтерита и энтероколита, предпочтительно бактериальной дизентерии, хронической амебной дизентерии, шистостомоза, неспецифического язвенного колита и регионального энтерита; цервицита и эндоцервицита, эндометрита, воспаления, вызванного повреждением при вдыхании, воспаления слизистой оболочки, связанного с раком, и воспаления слизистой оболочки, связанного с инфекцией.

40. Применение п. 34 или способ по п. 35, отличающиеся тем, что воспалительное расстройство представляет собой воспаление сердца, желудка, кишечника, легких, печени, селезенки, почек, поджелудочной железы, мочевого пузыря, яичников или предстательной железы и выбрано из перикардита, миокардита, эндокардита, пневмонии, гепатита, спленита, нефрита, панкреатита, цистита, оофорита, простатита или язвы желудка.

41. Применение по п. 34 или способ по п. 35, отличающиеся тем, что расстройство выбрано из псориаза, угрей, экземы, дерматита, патологического выпадения волос, себорейного дерматита, ринита, геморроя, хронической обструктивной болезни легких и воспалительной болезни кишечника.

42. Применение или способ по п. 41, отличающиеся тем, что расстройство представляет собой обструктивную болезнь легких, эмфизему или хронический бронхит.

43. Применение или способ по п. 41, отличающиеся тем, что воспалительная болезнь кишечника представляет собой язвенный колит.

44. Применение или способ по п. 41, отличающиеся тем, что расстройство представляет собой астму, аллергический ринит или аллергический/атопический дерматит.

45. Применение по п. 34 или способ по п. 35, отличающиеся тем, что расстройство включает воспаление глаз и области вокруг глаз.

46. Применение или способ по п. 45, отличающиеся тем, что расстройство представляет собой конъюнктивит, кератит или неврит зрительного нерва.

47. Применение или способ по п. 46, отличающиеся тем, что расстройство выбрано из аллергического конъюнктивита, острого эпителиального кератита, монетовидного кератита, интерстициального кератита, дисковидного кератита, нейротрофного кератита, кератита с образованием слизистой бляшки, простого герпетического кератита, кератита с опоясывающим герпесом, бактериального кератита, кератита, вызванного грибковой инфекцией, акантомебного кератита, онхоцеркозного кератита, точечного поверхностного кератита, язвенного кератита, кератита, развивающегося при несмыкании глазной щели, фотокератита и острого покраснения глаз при ношении контактных линз.

48. Применение по п. 34 или способ по п. 35, отличающиеся тем, что расстройство, характеризующееся воспалением, представляет собой или приводит к ране.

49. Применение или способ по п. 38, отличающиеся тем, что воспаление слизистой оболочки полости рта, носа, глаз, влагалища, шейки матки и/или аноректальной области возникает в результате ранения поверхности этой слизистой оболочки.

50. Применение или способ по любому из предшествующих пунктов, отличающиеся тем, что рана является хронической.

51. Применение или способ по любому из предшествующих пунктов, отличающиеся тем, что рана представляет собой ссадину, царапину, порез, резаную рану, прокол кожи, разрыв, ушиб, рубец или нарыв.

52. Применение или способ по любому из пп. 48-51, отличающиеся тем, что рана представляет собой открытую рану, острую рану, хроническую рану, синяк, химический ожог, лекарственную сыпь, полиморфную световую сыпь, химиотерапевтическую сыпь, солнечные ожоги, обморожения.

53. Применение или способ по любому из пп. 48-52, отличающиеся тем, что рана возникает в результате ранения кожи, которое включает поверхностное повреждение эпидермиса и/или дермы; и/или возникает в результате ранения кожи по всей толщине, которое включает повреждения ниже эпидермиса и/или дермы.

54. Применение или способ по любому из пп. 48-53, отличающиеся тем, что ранение возникает в результате внутреннего или внешнего физического повреждения поверхности мембраны.

55. Применение или способ по любому из пп. 48-54, отличающиеся тем, что физическое повреждение включает хирургическое вмешательство после ожога или пересадки кожи.

56. Применение или способ по любому из пп. 48-55, отличающиеся тем, что хроническая рана представляет собой язву кожи или слизистой оболочки.

57. Применение или способ по п. 56, отличающиеся тем, что язва представляет собой трудноизлечимую язву кожи.

58. Применение или способ по п. 48, отличающиеся тем, что расстройство, приводящее к ране, представляет собой геморрой или язвенный колит, или болезнь Крона.

59. Применение или способ по любому из пп. 48-58, отличающиеся тем, что лечение направлено на устранение боли, включая ноющую, процедурную боль и/или непроцедурную боль, связанную с воспалением и/или ранением, прурита (зуда), связанного с самой раной и процессом заживления, выделением жидкостей организма из ран, риском инфицирования и/или предотвращением физиологических реакций, возникающих в результате воспаления и/или процессов заживления ран, выбранных из группы рубцевания и меланиновой пигментации.

60. Применение или способ по п. 59, отличающиеся тем, что основным физиологическим расстройством является аллергическое или атопическое состояние.

61. Применение или способ по п. 59 или 60, отличающиеся тем, что основное физиологическое нарушение выбрано из группы: фарингит, пародонтит, гингивит, ксерофтальмия, крапивница, пищевая аллергия, раннее проявление рака кожи и эритемаподобное поражение кожи, патологическое выпадение волос, патологическое выпадение волос после пересадки кожи, мультиформная эритема, фолликулит и наружный отит.

62. Применение или способ по п. 59 или 60, отличающиеся тем, что основное физиологическое нарушение выбрано из группы муковисцидоза легких, обычной интерстициальной пневмонии, аллергической пневмонии, асбестоза, эмфиземы, легочно-сердечной недостаточности и легочной эмболии.

63. Применение или способ по п. 59 или 60, отличающиеся тем, что основное физиологическое нарушение связано с меланиновой пигментацией.

64. Применение или способ по п. 63, отличающиеся тем, что физиологическое нарушение, связанное с меланиновой пигментацией, включает хлоазму, веснушки, меланоз, скуловую сыпь, хроматоз, рак кожи с меланомой или хроматоз, вызванный воздействием солнечных лучей, или кожное заболевание.

65. Применение или способ по п. 59 или 60, отличающиеся тем, что основное физиологическое нарушение характеризуется окислением.

66. Применение или способ по п. 65, отличающиеся тем, что пептидсодержащее соединение увеличивает выработку супероксиддисмутазы и/или снижает окисление липидов.

67. Применение соединения по любому из пп. 1-29 или его фармацевтически приемлемой соли или фармацевтической композиции по любому из пп. 30-32 для производства лекарственного средства для лечения патологического состояния и/или фиброзного состояния легких.

68. Способ лечения патологического состояния и/или фиброзного состояния легких, включающий введение пациенту, нуждающемуся в таком лечении, соединения по любому из пп. 1-29 или его фармацевтически приемлемой соли или фармацевтической композиции по любому из пп. 30-32.

69. Применение по п. 67 или способ по п. 68, отличающиеся тем, что указанное патологическое состояние выбрано из фиброза легких, фиброза почек, фиброза печени, силикоза, острого бронхита, хронического бронхита, трахеобронхита, бронхиальной астмы, астматического статуса, бронхоэктаза, инфекции верхних дыхательных путей, предпочтительно обычной простуды и гриппа, аллергического воспаления дыхательных путей, бактериальной пневмонии, вирусной пневмонии, микоплазматической пневмонии, риккетсии, лучевой пневмонии, пневмококковой, предпочтительно стафилококковой, стрептококковой и вызванной грамотрицательными бациллами пневмонии, кандидоза легких, предпочтительно аспергиллеза, мукормикоза, гистоплазмоза, актиномикоза и нокардиоза, микоза легких, криптококкоза, абсцесса легких, анафилактической пневмонии (синдрома Леффлера), экзогенно-аллергического альвеолита, легочной эозинофилии (эозинофилоза), обструктивной эмфиземы легких, отека легких, туберкулеза легких, алкалоза иацидоза дыхательных путей, острого повреждения легких, интерстициальной болезни легких, эмпиемы, фибромы легких и легочного сердца.

70. Применение по п. 67 или способ по п. 68, отличающиеся тем, что указанное патологическое состояние выбрано из идиопатического фиброза легких или острого поражения легких.

71. Применение соединения по любому из пп. 1-29 или его фармацевтически приемлемой соли, фармацевтической композиции по любому из пп. 30-32 или комбинированного продукта по п. 33 для производства лекарственного средства для лечения вирусной инфекции.

72. Способ лечения вирусной инфекции, включающий введение пациенту, нуждающемуся в таком лечении, соединения по любому из пп. 1-29 или его фармацевтически приемлемой соли, фармацевтической композиции по любому из пп. 30-32 или комбинированного продукта по п. 33, отличающийся тем, что вирусная инфекция вызвана одним или более вирусами, выбранными из аденовируса, папилломавируса человека, вируса BK, вируса JC, вируса простого герпеса 1 типа, вируса простого герпеса 2 типа, вируса ветряной оспы, вируса Эпштейна-Барр, цитомегаловируса человека, вируса простого герпеса человека 8 типа, натуральной оспы, вируса гепатита B, парвовируса B19, астровируса человека, норовируса, вируса Норуолка, коксакивируса, вируса гепатита A, полиовируса, риновируса, коронавируса, вируса гепатита C, вируса желтой лихорадки, вируса денге, вируса Западного Нила, вируса клещевого энцефилита, вируса иммунодефицита человека, вируса краснухи, вируса Ласса, хантавируса, вируса конго-крымской геморрагической лихорадки, вируса Хантаан, вируса Эбола, маргбургского вируса, вируса Равн, вируса гриппа, вируса кори, вируса паротита, вируса парагриппа, респираторно-синцитиального вируса, вируса бешенства, вируса гепатита E, ротавируса, орбивируса, колтивируса, вируса Банна и вируса гепатита D.

73. Применение по п. 71 или способ по п. 72, отличающиеся тем, что вирус выбран из аденовируса, папилломавируса человека, вируса простого герпеса 1 типа, вируса простого герпеса 2 типа, риновируса, коронавируса, вируса гриппа A, предпочтительно вирусов H1N1 и H3N2, вируса гриппа B или вируса гриппа C, вируса парагриппа и респираторно-синцитиального вируса.

74. Применение или способ по п. 73, отличающиеся тем, что вирус выбран из вируса, вызывающего инфекцию дыхательных путей.

75. Применение по п. 71 или способ по п. 72, отличающиеся тем, что вирус представляет собой вирус иммунодефицита человека.

76. Применение или способ по любому из предшествующих пунктов, отличающиеся тем, что указанное(ые) соединение(я) или его (их) соль вводят местно в форме композиции для местного применения.

77. Применение или способ по п. 76, отличающиеся тем, что соответствующее состояние лечат непосредственным местным нанесением на кожу.

78. Применение или способ по п. 76, отличающиеся тем, что соответствующее состояние лечат непосредственным местным нанесением на поверхность слизистой оболочки.

79. Применение или способ по любому из предшествующих пунктов, отличающиеся тем, что указанное(ые) соединение(я) вводят пероральным, внутривенным, внутриартериальным, внутрисосудистым, периваскулярным, внутримышечным, кожным, подкожным, трансмукозальным, сублингвальным, буккальным, ректальным, внутривагинальным, трансдермальным, назальным, пульмональным, трахеальным, бронхиальным, интраперитонеальным, аноректальным или другим способом парентеральной доставки.

80. Применение или способ по п. 79, отличающиеся тем, что введение осуществляют пульмонально в форме спрея, содержащего порошкообразный аэрозоль или водный аэрозоль, посредством распыления.

81. Применение или способ по п. 80, отличающиеся тем, что спрей представляет собой жидкий спрей, содержащий водный спрей, предпочтительно аэрозоль, и вспомогательные вещества, которые могут содержать один или более модификаторов вязкости, сахара, эмульгатора, буферного агента, спирта и консерванта.

82. Применение или способ по п. 80 или 81, отличающиеся тем, что введение осуществляют из устройства для ингаляции, выбранного из аэрозольного дозирующего ингалятора, ингалятора сухого порошка, жидкостного ингалятора или небулайзера.

83. Способ получения пептидсодержащего соединения по любому из пп. 1-29, включающий приведение во взаимодействие соединения формулы I, как оно определено в любом из пп. 1, 28 или 29, с пептидным компонентом, как он определен в любом из пп. 1-23 или 29.

84. Способ получения фармацевтической композиции по любому из пп. 30-32, включающий приведение в контакт пептидсодержащего соединения, как оно определено в любом из пп. 1-29, с одним или более фармацевтически приемлемыми адъювантами, разбавителями или носителями.

85. Способ получения комбинированного продукта по п. 33, включающий объединение компонента (A) указанного комбинированного продукта с компонентом (B) указанного комбинированного продукта.