ШТАММ, ОБЛАДАЮЩИЙ ПОВЫШЕННОЙ СПОСОБНОСТЬЮ К ПРОДУЦИРОВАНИЮ L-ГЛУТАМИНОВОЙ КИСЛОТЫ, А ТАКЖЕ СПОСОБ ЕГО КОНСТРУИРОВАНИЯ И ПРИМЕНЕНИЕ Российский патент 2025 года по МПК C12N15/77 C07K14/34 C12P13/14 

Область техники

Настоящее изобретение относится к области конструирования генов и микроорганизмов, и, в частности, относится к штамму, обладающему повышенной способностью к продуцированию L-глутаминовой кислоты, а также способу его конструирования и применения.

Уровень техники

L-глутаминовая кислота имеет химическое название: L-2-аминоглутаровая кислота; молекулярную формулу: C₅H₉O₄N; и молекулярную массу: 147,13. L-глутаминовая кислота представляет собой заменимую аминокислоту. Глутаминовая кислота, присутствующая в биологических организмах, принадлежит к L-типу глутаминовой кислоты и представляет собой предшественник моноглутамата натрия. После употребления с пищей моноглутамат натрия может также быть преобразован в глутаминовую кислоту в желудке, затем расщеплен и абсорбирован для участия в синтезе белка, а другие аминокислоты могут быть синтезированы путем трансаминирования, имеющего большое значение для питания. Помимо широкого диапазона вариантов применения в пищевых продуктах, он также применяется в медицине, косметике и сельскохозяйственном производстве. Из важнейших органов организма человека самым высоким содержанием глутамата характеризуется головной мозг, и при этом глутаминовая кислота является единственной аминокислотой, вовлеченной в метаболизм головного мозга человека, которая играет важную роль в поддержании функции нервной системы. Соответственно, у людей, страдающих неврастенией, повышенное потребление глутаминовой кислоты может улучшать функцию нервной системы. В косметической промышленности глутаминовая кислота может применяться для синтеза полиглутамата натрия. Ввиду высокой гигроскопичности она может применяться в качестве смягчающего вещества. Глутаминовая кислота может также быть скомбинирована с лауроилхлоридом для получения лауро ил глутамата натрия, который широко используется в косметической промышленности. Глутаминовая кислота служит в основном для получения бактерицидных агентов, таких как глутамат-кетон, для сельского хозяйства. В процессе внесения удобрений глутаминовую кислоту также можно использовать в качестве носителя удобрения, способствующего усвоению азота, фосфора и калия сельскохозяйственными культурами.

В 1956 году в истории получения моноглутамата натрия произошло важнейшее изменение: из природного источника была выделена продуцирующая глутаминовую кислоту бактерия, Corynebacterium glutamicum. В 1957 году началась эра получения моноглутамата натрия путем ферментации. Успешное получение глутаминовой кислоты путем ферментации представляет собой новаторскую разработку, имеющую огромное значение для всей индустрии ферментации, а также в значительной степени способствующую исследованиям и получению других ферментированных продуктов. Для промышленной ферментации основными факторами, определяющими продуктивность ферментации, являются производительность штамма, процесс ферментации, последующий процесс экстракции и т.п. Среди этих факторов уровень продуцирования кислоты штаммами представляет собой внутреннюю причину, ключ к определению успешности или неудовлетворительного результата ферментации. Выведение штаммов с выдающимися качествами по-прежнему является ключом к получению L-глутаминовой кислоты с высоким выходом. С учетом прогресса технологии высокопроизводительного скрининга в сочетании с традиционной технологией мутагенеза, целесообразен поиск мутантных штаммов с неизвестными признаками, продуцирующих L-глутаминовую кислоту с высоким выходом. У этих мутантных штаммов может быть изменена активность в определенной точке метаболического пути L-глутаминовой кислоты, или изменена перегруппировка и интеграция на протяжении всего пути, с повышением таким образом продуцирования кислоты.

Хотя уже был проведен скрининг некоторых штаммов, которые способны обеспечивать повышенное продуцирование L-глутаминовой кислоты, требуется найти больше мутантных штаммов для продуцирования L-глутаминовой кислоты с высоким выходом, чтобы удовлетворить растущий спрос.

Краткое описание изобретения

Для преодоления недостатков предшествующего уровня техники в настоящем изобретении предложены полинуклеотид и рекомбинантный штамм, содержащий указанный полинуклеотид, и применение указанного рекомбинантного штамма для улучшения способности бактерии к продуцированию L-глутаминовой кислоты. Для достижения вышеуказанных целей авторы настоящего изобретения в ходе исследования обнаружили, что ген BBD29_00405 (GenBank: ANU32350.1) в геноме Corynebacterium glutamicum АТСС13869 (GenBank: СР016335.1), обладающего способностью к продуцированию L-глутаминовой кислоты, может быть модифицирован или усовершенствован применительно к экспрессии с получением рекомбинантного штамма с повышенным продуцированием L-глутаминовой кислоты. По сравнению со штаммом дикого типа, который не был модифицирован, способность указанного рекомбинантного штамма к продуцированию L-глутаминовой кислоты выше.

Настоящее изобретение осуществляют с использованием следующих технических решений:

Согласно первому аспекту настоящего изобретения предложена бактерия для получения L-глутаминовой кислоты, характеризующаяся улучшенной экспрессией полинуклеотида, кодирующего последовательность аминокислот, представленную в последовательности SEQ ID NO: 3. В соответствии с настоящим изобретением указанная улучшенная экспрессия представляет собой усиленную экспрессию полинуклеотида или присутствие точечной мутации в полинуклеотиде, который кодирует последовательность аминокислот SEQ ID NO: 3, или присутствие точечной мутации в полинуклеотиде и усиленную экспрессию полинуклеотида, который кодирует последовательность аминокислот SEQ ID NO: 3.

Последовательность аминокислот, представленная в SEQ ID NO: 3, представляет собой белок, кодируемый геном BBD29_00405.

Указанная бактерия обладает повышенной способностью к продуцированию L-глутаминовой кислоты по сравнению с немодифицированным штаммом.

Согласно настоящему изобретению термин «бактерия, обладающая способностью к продуцированию L-глутаминовой кислоты» относится к бактерии, обладающей такой способностью к продуцированию и накоплению целевой L-глутаминовой кислоты в культуральной среде и/или в клетке бактерии, что L-глутаминовая кислота может быть собрана при культивировании указанной бактерии в культуральной среде. Бактерия, обладающая способностью к продуцированию L-глутаминовой кислоты, может представлять собой бактерию, способную к накоплению целевой L-глутаминовой кислоты в культуральной среде и/или в клетке указанной бактерии в большем количестве, чем у немодифицированного штамма.

Термин «немодифицированный штамм» относится к контрольному штамму, который не был модифицирован таким образом, чтобы включать некий специфический признак. Таким образом, примеры немодифицированного штамма включают штамм дикого типа и исходный штамм.

Согласно настоящему изобретению, термин «L-глутаминовая кислота» относится к L-глутаминовой кислоте в свободной форме, к ее соли или смеси, если не указано иное.

Указанный полинуклеотид может кодировать последовательность аминокислот, обладающую приблизительно 90% или более, приблизительно 92% или более, приблизительно 95% или более, приблизительно 97% или более, приблизительно 98% или более, или приблизительно 99% или более гомологией последовательности в отношении последовательности аминокислот SEQ ID NO: 3. В настоящем документе термин «гомология» относится к проценту идентичности двух полинуклеотидов или двух полипептидов как модулей. Гомология последовательностей может быть измерена между одним модулем и другим модулем с применением способа, известного в данной области техники. Например, такая гомология последовательностей может быть измерена с помощью алгоритма BLAST.

Экспрессия полинуклеотида может быть усилена: путем замены или мутирования регуляторной последовательности экспрессии, введения мутации в последовательность полинуклеотида; и путем увеличения числа копий полинуклеотида, инсертированных через хромосому или введенных с помощью вектора; или комбинации перечисленного, и т.п.

Регуляторная последовательность экспрессии полинуклеотида может быть модифицирована. Регуляторная последовательность экспрессии контролирует экспрессию полинуклеотида, который функционально с ней связан, и может содержать, например, промоторы, терминаторы, энхансеры, сайленсеры и т.п. Полинуклеотид может иметь измененный инициирующий кодон. Полинуклеотид может быть включен в специфический сайт хромосомы, с увеличением таким образом числа копий. Согласно настоящему документу специфический сайт может включать, например, сайт транспозона или межгенный сайт. Кроме того, полинуклеотид может быть включен в экспрессионный вектор, а указанный экспрессионный вектор введен в клетку-хозяина, с увеличением таким образом числа копий.

Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения полинуклеотид или имеющий точечную мутацию полинуклеотид включают в специфический сайт хромосомы микроорганизма, с увеличением таким образом числа копий.

Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения полинуклеотид с последовательностью промотора или имеющий точечную мутацию полинуклеотид с последовательностью промотора встраивают в специфический сайт хромосомы микроорганизма, со сверхэкспрессией таким образом последовательности нуклеиновой кислоты.

Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения полинуклеотид или имеющий точечную мутацию полинуклеотид встраивают в экспрессионный вектор, а указанный экспрессионный вектор вводят в клетку-хозяина, с увеличением таким образом числа копий.

Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения полинуклеотид с последовательностью промотора или имеющий точечную мутацию полинуклеотид с последовательностью промотора встраивают в экспрессионный вектор, а указанный экспрессионный вектор вводят в клетку-хозяина, со сверхэкспрессией таким образом последовательности аминокислот.

Согласно конкретному варианту реализации настоящего изобретения указанный полинуклеотид может содержать последовательность нуклеотидов SEQ ID NO: 1.

Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения полинуклеотид, кодирующий последовательность аминокислот SEQ ID NO: 3, имеет такую точечную мутацию, что метионин в положении 199 в последовательности аминокислот SEQ ID NO: 3, заменен на другую аминокислоту.

В соответствии с настоящим изобретением предпочтительно метионин в положении 199 заменен на изолейцин.

В соответствии с настоящим изобретением в последовательности SEQ ID NO: 4 представлена последовательность аминокислот после замены изолейцином метионина в положении 199 в последовательности аминокислот SEQ ID NO: 3.

Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения последовательность полинуклеотида, имеющая точечную мутацию, образована в результате мутации основания в положении 597 последовательности полинуклеотида SEQ ID NO: 1.

В соответствии с настоящим изобретением указанная мутация включает мутацию основания в положении 597 последовательности полинуклеотида SEQ ID NO: 1, с заменой гуанина (G) на аденин (А).

Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения последовательность полинуклеотида, имеющая точечную мутацию, содержит последовательность полинуклеотида SEQ ID NO: 2.

В настоящем документе термин «функционально связанный» относится к функциональной связи между регуляторной последовательностью и последовательностью полинуклеотида, за счет которой регуляторная последовательность контролирует транскрипцию и/или трансляцию указанной последовательности полинуклеотида. Регуляторная последовательность может представлять собой сильный промотор, который может повышать уровень экспрессии полинуклеотида. Регуляторная последовательность может представлять собой промотор, происходящий из микроорганизма, принадлежащего к роду Corynebacterium, или может представлять собой промотор, происходящий из других микроорганизмов. Например, указанный промотор может представлять собой промотор trc, промотор gap, промотор tac, промотор Т7, промотор lac, промотор trp, промотор araBAD или промотор cj7.

Согласно конкретному варианту реализации настоящего изобретения указанный промотор представляет собой промотор полинуклеотида, кодирующего последовательность аминокислот SEQ ID NO: 3 (BBD29_00405).

В настоящем документе термин «вектор» относится к полинуклеотидной конструкции, содержащей регуляторную последовательность гена и последовательность гена, и выполненной с возможностью экспрессии целевого гена в подходящей клетке-хозяине. Термин «вектор» может также относиться к такой полинуклеотидной конструкции, содержащей последовательность для гомологичной рекомбинации, что при введении этого вектора в клетку-хозяина может быть изменена регуляторная последовательность эндогенного гена в геноме клетки-хозяина, или целевой ген, который может экспрессироваться, может быть инсертирован в конкретный сайт генома хозяина. Таким образом, вектор для применения по настоящему изобретению может дополнительно содержать селективный маркер для определения введения вектора в клетку-хозяина или инсерции вектора в хромосому клетки-хозяина. Селективный маркер может включать маркер, обеспечивающий селектируемый фенотип, такой как лекарственная устойчивость, ауксотрофность, устойчивость к цитотоксическим агентам или экспрессия поверхностного белка. На среде, обработанной таким селективным агентом, может быть выбрана трансформированная клетка, поскольку только клетка, которая экспрессирует селективный маркер, может выживать или проявлять иные фенотипические черты. Вектор согласно описанию в настоящем документе хорошо известен специалистам в данной области техники и включает в том числе, но не ограничиваясь перечисленным: плазмиду, бактериофаг (такой как λ-бактериофаг или нитевидный бактериофаг М13, и т.п.), космиду или вирусный вектор.

Согласно некоторым конкретным вариантам реализации настоящего изобретения в качестве вектора используют плазмиду pK18mobsacB и плазмиду pXMJ19.

В настоящем документе термин «трансформация» относится к введению полинуклеотида в клетку-хозяина таким образом, чтобы указанный полинуклеотид мог быть репликативно-компетентным в качестве элемента, чужеродного для генома, или путем встраивания в геном клетки-хозяина. Способ трансформации вектором, применяемый согласно настоящему изобретению, может включать способ введения нуклеиновой кислоты в клетку. Кроме того, в соответствии с описанием близких методик, может быть использован подходящий для клетки-хозяина способ, задействующий электрические импульсы.

Согласно настоящему изобретению микроорганизм может представлять собой дрожжи, бактерию, водоросль или гриб.

В соответствии с настоящим изобретением бактерия может представлять собой микроорганизм, принадлежащий к роду Corynebacterium, такой как Corynebacterium acetoacidophilum, Corynebacterium acetoglutamicum, Corynebacterium callunae, Corynebacterium glutamicum, Brevibacterium flavum, Brevibacterium lactofermentum, Corynebacterium ammoniagenes, Corynebacterium pekinense, Brevibacterium saccharolyticum, Brevibacterium roseum и Brevibacterium thiogenitalis, и т.п.

Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения указанный микроорганизм, принадлежащий к роду Corynebacterium, представляет собой Corynebacterium glutamicum АТСС13869.

Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения указанный микроорганизм, принадлежащий к роду Corynebacterium, представляет собой Corynebacterium glutamicum YPGLU001, и был депонирован в Китайском главном центре коллекций микробиологических культур («China General Microbiological Culture Collection Center»), сокращенно «CGMCC», no адресу: No. 3, Yard 1, Beichen West Road, Chaoyang District, Beijing, Post Code: 100101, 23 ноября 2020 г., под номером доступа депонированного биологического образца: CGMCC №21220.

Согласно второму аспекту настоящего изобретения предложены последовательность полинуклеотида, последовательность аминокислот, кодируемая указанной последовательностью полинуклеотида, рекомбинантный вектор, содержащий указанную последовательность полинуклеотида, и рекомбинантный штамм, содержащий указанную последовательность полинуклеотида.

В соответствии с настоящим изобретением указанная последовательность полинуклеотида содержит полинуклеотид, кодирующий полипептид, содержащий последовательность аминокислот SEQ ID NO: 3, причем метионин в положении 199 в указанной последовательности заменен на другую аминокислоту.

В соответствии с настоящим изобретением предпочтительно метионин в положении 199 заменен на изолейцин.

В соответствии с настоящим изобретением в последовательности SEQ ID NO: 4 представлена последовательность аминокислот после замены изолейцином метионина в положении 199 в последовательности аминокислот SEQ ID NO: 3.

В соответствии с настоящим изобретением предпочтительно последовательность полинуклеотида, кодирующая полипептид, содержащий последовательность аминокислот SEQ ID NO: 3, содержит последовательность полинуклеотидов согласно последовательности SEQ ID NO: 1.

Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения указанная последовательность полинуклеотидов образована в результате мутации основания в положении 597 в последовательности полинуклеотида SEQ ID NO: 1.

В соответствии с настоящим изобретением указанная мутация относится к изменению основания/нуклеотида в сайте, и способ осуществления мутации может представлять собой по меньшей мере один способ, выбранный из мутагенеза, сайт-направленного ПЦР-мутагенеза и/или гомологичной рекомбинации, и т.п. Согласно настоящему изобретению предпочтительно используют сайт-направленный ПЦР-мутагенез и/или гомологичную рекомбинацию.

В соответствии с настоящим изобретением указанная мутация включает мутацию в положении 597 в последовательности полинуклеотида SEQ ID NO: 1, с заменой гуанина (G) на аденин (А).

Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения указанная последовательность полинуклеотида содержит последовательность полинуклеотида SEQ ID NO:2.

В соответствии с настоящим изобретением указанная последовательность аминокислот содержит последовательность аминокислот SEQ ID NO: 4.

В соответствии с настоящим изобретением указанный рекомбинантный вектор конструируют путем введения указанной последовательности полинуклеотидов в плазмиду.

Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения указанная плазмида представляет собой плазмиду pK18mobsacB.

Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения указанная плазмида представляет собой плазмиду pXMJ19.

В частности, указанные последовательность полинуклеотида и плазмида могут быть сконструированы в виде рекомбинантного вектора с помощью системы рекомбинации NEBuider.

В соответствии с настоящим изобретением указанный рекомбинантный штамм содержит указанную последовательность полинуклеотида.

Во варианте реализации настоящего изобретения исходный штамм для рекомбинантного штамма представляет собой Corynebacterium glutamicum YPGLU001 под номером доступа депонированного биологического образца: CGMCC №21220.

Во варианте реализации настоящего изобретения исходный штамм для рекомбинантного штамма представляет собой АТСС 13869.

Согласно третьему аспекту настоящего изобретения предложено применение указанных последовательности полинуклеотида, последовательности аминокислот, кодируемой указанной последовательностью полинуклеотида, рекомбинантного вектора, содержащего указанную последовательность полинуклеотида, и рекомбинантного штамма, содержащего указанную последовательность полинуклеотида, для получения L-глутаминовой кислоты.

Согласно четвертому аспекту настоящего изобретения также предложен способ конструирования рекомбинантного штамма, продуцирующего L-глутаминовую кислоту.

В соответствии с настоящим изобретением способ конструирования включает этап:

конструирования последовательности полинуклеотидов гена дикого типа BBD29_00405 согласно представленным в последовательности SEQ ID NO: 1 у штамма-хозяина с осуществлением мутации основания в положении 597 для получения рекомбинантного штамма, содержащего мутированный кодирующий ген BBD29_00405.

В соответствии со способом конструирования согласно настоящему изобретению конструирование включает по меньшей мере одно из мутагенеза, сайт-направленного ПЦР-мутагенеза и/или гомологичной рекомбинации, и т.п.

В соответствии со способом конструирования согласно настоящему изобретению указанная мутация относится к изменению основания в положении 597 в SEQ ID NO: 1, с заменой гуанина (G) на аденин (А); в частности, последовательность полинуклеотида, содержащая мутированный кодирующий ген BBD29_00405, представлена в последовательности SEQ ID NO: 2.

Кроме того, указанный способ конструирования включает следующие этапы:

(1) конструирование последовательности нуклеотидов гена BBD29_00405 дикого типа согласно последовательности SEQ ID NO: 1, с осуществлением мутации основания в положении 597 для получения последовательности полинуклеотида мутированного гена BBD29_00405;

(2) соединение мутированной последовательности полинуклеотида с плазмидой для конструирования рекомбинантного вектора;

(3) введение указанного рекомбинантного вектора в штамм-хозяин с получением рекомбинантного штамма, содержащего мутированный кодирующий ген BBD29_00405.

В соответствии со способом конструирования согласно настоящему изобретению указанный этап (1) включает конструирование гена BBD29_00405 с точечной мутацией: с геномной последовательностью немодифицированного штамма, синтез двух пар праймеров P1, Р2 и Р3, Р4 для амплификации фрагмента гена BBD29_00405, и введение точечной мутации в ген BBD29_00405 дикого типа, SEQ ID NO: 1, с применением сайт-направленного ПЦР-мутагенеза с получением последовательности нуклеотидов гена BBD29_00405 с точечной мутацией, SEQ ID NO: 2, обозначенного как BBD29_00405^G597A.

Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения геном немодифицированного штамма может происходить из штамма АТСС13869, геномную последовательность которого (GenBank: СР016335.1) можно найти на вебсайте NCBI.

Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения на этапе (1) используют следующие праймеры:

Р1: 5'CAGTGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGATGACTATTAATGTCTCCGA3' (SEQ ID NO: 5)

Р2: 5'AGACCGGCATCAAGTATGGTCTGGGCA3' (SEQ ID NO: 6)

Р3: 5'TGCCC AGACCAT ACTTGATGCCGGTCT3' (SEQ ID NO: 7)

P4: 5'CAGCTATGACCATGATTACGAATTCGAGCTCGGTACCCCTAGCCGGCGTAAGGATC CCGGAT3' (SEQ ID NO: 8)

Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения ПЦР-амплификацию осуществляют следующим образом: предварительная денатурация в течение 5 минут при 94°С, денатурация в течение 30 с при 94°С, ренатурация в течение 30 с при 52°С, удлинение в течение 40 с при 72°С (30 циклов); и избыточное удлинение в течение 10 мин при 72°С.

Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения ПЦР-амплификацию с перекрывающимися праймерами осуществляют следующим образом: предварительная денатурация в течение 5 минут при 94°С, денатурация в течение 30 с при 94°С, ренатурация в течение 30 с при 52°С, удлинение в течение 100 с при 72°С (30 циклов); и избыточное удлинение в течение 10 мин при 72°С.

В соответствии со способом конструирования согласно настоящему изобретению этап (2) включает конструирование рекомбинантной плазмиды, включающее сборку выделенного и очищенного BBD29_00405^G597A с плазмидой pK18mobsacB с помощью системы рекомбинации NEBuider с получением рекомбинантной плазмиды.

В соответствии со способом конструирования согласно настоящему изобретению этап (3) включает конструирование рекомбинантного штамма путем трансформации рекомбинантной плазмидой штамма-хозяина с получением рекомбинантного штамма.

Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения трансформацию на этапе (3) осуществляют способом электротрансформации.

Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения штамм-хозяин представляет собой АТСС 13869.

Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения штамм-хозяин представляет собой Corynebacterium glutamicum YPGLU001 под номером доступа депонированного биологического образца: CGMCC №21220.

Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения указанная рекомбинация достигается путем гомологичной рекомбинации.

Согласно пятому аспекту настоящего изобретения также предложен способ конструирования рекомбинантного штамма, продуцирующего L-глутаминовую кислоту.

В соответствии с настоящим изобретением указанный способ конструирования включает этап:

амплификации 5'- и 3'-фрагментов плеч гомологии BBD29_00405 и последовательности кодирующей области гена BBD29_00405 с областью его промотора, и введения гена BBD29_00405 или BBD29_00405^G597A в геном штамма-хозяина путем гомологичной рекомбинации, что позволяет указанному штамму сверхэкспрессировать ген BBD29_00405 или BBD29_00405^G597A.

Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения используют следующие праймеры для амплификации 5'-фрагментов плеч гомологии:

Р7: 5'CAGTGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGGACCCGCTTGCCAT ACGAAG3'

Р8: 5'CCTACCACGA CGAGCACTAC АТСТАСТСАТ CTGAAGAATC 3'

Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения используют следующие праймеры для амплификации 3'-фрагментов плеч гомологии:

P11: 5'GGGATCCTTA CGCCGGCTAG TTCGTGGGCA CTCTGGTTTG3'

Р12: 5'CAGCTATGACCATGATTACGAATTCGAGCTCGGTACCCCATAAGAAACA АССАСТТСС3'

Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения используют следующие праймеры для амплификации последовательности кодирующей области гена и области его промотора:

Р9: 5'GATTCTTCAG ATGAGTAGAT GTAGTGCTCG TCGTGGTAGG3' (SEQ ID NO:13)

Р10: 5'CAAACCAGAG TGCCCACGAA CTAGCCGGCG TAAGGATCCC3' (SEQ ID NO: 14)

Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения, опять же с вышеупомянутыми Р7/Р12 в качестве праймеров, осуществляют амплификацию с применением в качестве матриц смеси трех фрагментов, амплифицированного 5'-фрагмента плеча гомологии, 3'-фрагмента плеча гомологии и фрагмента последовательности кодирующей области гена и области его промотора, с получением единого фрагмента плеч гомологии.

Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения используемая ПЦР-система содержит: 10×буфер Ex Taq Buffer: 5 мкл, смесь dNTP (2,5 мМ каждый): 4 мкл, Mg²⁺ (25 мМ): 4 мкл, праймеры (10 пМ): каждого по 2 мкл; и Ex Taq (5 Ед/мкл): 0,25 мкл, в общем объеме 50 мкл; ПЦР-амплификацию осуществляют следующим образом: предварительная денатурация в течение 5 минут при 94°С, денатурация в течение 30 с при 94°С, ренатурация в течение 30 с при 52°С, удлинение в течение 180 с при 72°С (30 циклов); и избыточное удлинение в течение 10 мин при 72°С.

Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения используют систему рекомбинации NEBuider для сборки челночной плазмиды PK18mobsacB с единым фрагментом плеч гомологии, с получением интегративной плазмиды.

Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения штамм-хозяин трансфицируют указанной интегративной плазмидой для введения гена BBD2900405 или BBD29_00405^G597A в геном штамма-хозяина путем гомологичной рекомбинации.

Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения штамм-хозяин представляет собой Corynebacterium glutamicum YPGLU001 под номером доступа депонированного биологического образца: CGMCC №21220.

Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения штамм-хозяин представляет собой АТСС 13869.

Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения штамм-хозяин представляет собой штамм, несущий последовательность полинуклеотида SEQ ID NO: 2.

Согласно шестому аспекту настоящего изобретения также предложен способ конструирования рекомбинантного штамма, продуцирующего L-глутаминовую кислоту.

В соответствии с настоящим изобретением указанный способ конструирования включает следующие этапы:

амплификация последовательности кодирующей области гена BBD2900405 и области промотора, или последовательности кодирующей области гена BBD29_00405^G597A и области промотора, конструирование сверхэкспрессирующего плазмидного вектора и трансформация указанным вектором штамма-хозяина, что позволяет указанному штамму сверхэкспрессировать ген BBD29_00405 или BBD29_00405^G597A.

Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения используют следующие праймеры для амплификации последовательности кодирующей области гена и области его промотора:

Р17: 5'GCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGAGGATCCCC GTAG TGCTCG TCGTGGTAGG3' (SEQ ID NO: 21)

P18: 5'ATCAGGCTGAAAATCTTCTCTCATCCGCCAAAACCTAGCCGGCG TAAGGATCCCGGAT3' (SEQ ID NO: 22)

Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения ПЦР-система содержит: 10×буфер Ex Taq Buffer: 5 мкл, смесь dNTP (2,5 мМ каждый): 4 мкл, (25 мМ): 4 мкл, праймеры (10 пМ): каждого по 2 мкл; Ex Taq (5 Ед/мкл): 0,25 мкл, в общем объеме 50 мкл. ПЦР-амплификацию осуществляют следующим образом: предварительная денатурация в течение 5 минут при 94°С, денатурация в течение 30 с при 94°С, ренатурация в течение 30 с при 52°С, удлинение в течение 100 с при 72°С (30 циклов); и избыточное удлинение в течение 10 мин при 72°С.

Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения систему рекомбинации NEBuider применяют для сборки челночной плазмиды pXMJ19 с фрагментом BBD29_00405 или BBD29_00405^G597A с собственными промоторами, с получением сверхэкспрессирующей плазмиды.

Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения указанный штамм-хозяин представляет собой Corynebacterium glutamicum YPGLU001 под номером доступа депонированного биологического образца: CGMCC №21220.

Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения указанный штамм-хозяин представляет собой АТСС 13869.

Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения указанный штамм-хозяин представляет собой штамм, несущий последовательность полинуклеотида SEQ ID NO: 2.

Рекомбинантный штамм, предложенный согласно настоящему изобретению, может индивидуально применяться при ферментации для продуцирования L-глутаминовой кислоты, и может также применяться для продуцирования L-глутаминовой кислоты при гибридной ферментации с другими продуцирующими L-глутаминовую кислоту бактериями.

Согласно другому аспекту настоящего изобретения предложен способ получения L-глутаминовой кислоты, который включает культивирование бактерии; и получение L-глутаминовой кислоты из культуры.

Бактерия может быть культивирована в подходящей культуральной среде в условиях культивирования, известных в данной области техники. Культуральная среда может содержать: источник углерода, источник азота, следовые элементы и комбинацию перечисленного. При культивировании могут корректироваться значения рН культуры. Кроме того, может предотвращаться образование пузырьков при культивировании, например, с применением пеногасителя для предотвращения образования пузырьков. Кроме того, в культуру могут вводиться газы при культивировании. Указанные газы могут включать любые газы, способные поддерживать аэробные условия в культуре. При культивировании температура культуры может составлять от 20°С до 45°С. Продуцированная L-глутаминовая кислота может быть выделена из культуры, т.е. культуру обрабатывают серной кислотой или соляной кислотой и т.п., с последующим применением комбинации таких способов, как анионообменная хроматография, конденсация, кристаллизация и изоэлектрическое осаждение.

Согласно настоящему изобретению также предложен белок, обозначенный как белок BBD29_00405^M199I, отличающийся тем, что указанный белок может представлять собой любое из:

А1) белка, имеющего последовательность аминокислот SEQ ID NO: 4;

А2) белка, обладающего 80% или более идентичностью белку, указанному в подпункте А1), и имеющего ту же функцию, что и белок, указанный в А1), полученного путем осуществления в последовательности аминокислот SEQ ID NO: 4, замены, и/или делеции, и/или добавления остатков аминокислот;

A3) слитого белка, имеющего ту же функцию, полученного путем присоединения метки к N-концу и/или С-концу белка по А1) или А2).

Согласно настоящему изобретению также предложена молекула нуклеиновой кислоты, обозначенная как BBD29_00405^G597A, отличающаяся тем, что указанная молекула нуклеиновой кислоты BBD29_00405^G597A может представлять собой любое из:

В1) молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей белок BBD29_00405^M199I;

В2) молекулы ДНК, кодирующая последовательность которой представлена в последовательности SEQ ID NO: 2;

В3) молекулы ДНК, последовательность нуклеотидов которой представлена в последовательности SEQ ID NO: 2.

Молекула ДНК, представленная в SEQ ID NO: 2, представляет собой ген BBD29_00405^G597A согласно настоящему изобретению.

Молекула ДНК, представленная в SEQ ID NO: 2 (ген BBD29_00405^G597A), кодирует белок BBD29_00405^M199I, представленный в SEQ ID NO: 4.

Последовательность аминокислот белка BBD29_00405^M199I (SEQ ID NO: 4) получают в результате замены метионина (М) в положении 199 SEQ ID NO: 3 на изолейцин (I).

Согласно настоящему изобретению также предложен биоматериал, отличающийся тем, что указанный биоматериал может представлять собой любое из следующего:

С1) экспрессионная кассета, содержащая молекулу нуклеиновой кислоты BBD29_00405^G597A;

С2) рекомбинантный вектор, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты BBD29_00405^G597A, или рекомбинантный вектор, содержащий экспрессионную кассету по С1);

СЗ) рекомбинантный микроорганизм, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты BBD29_00405^G597A, или рекомбинантный микроорганизм, содержащий экспрессионную кассету по С1), или рекомбинантный микроорганизм, содержащий рекомбинантный вектор по С2).

Согласно настоящему изобретению также предложено любое из следующих применений по любому из D1)-D8):

F1) применение по любому из D1)-D8) для регуляции продуцирования L-глутаминовой кислоты микроорганизмом;

F2) применение по любому из D1)-D8) для конструирования генетически сконструированной (модифицированной) бактерии для продуцирования L-глутаминовой кислоты;

F3) применение по любому из D1)-D8) для получения L-глутаминовой кислоты;

где D1)-D8) представляет собой:

D1) белок BBD29_00405^M199I;

D2) молекулу нуклеиновой кислоты BBD29_00405^G597A;

D3) биоматериал;

D4) молекулу ДНК, последовательность нуклеотидов которой представлена SEQ ID NO: 1;

D5) молекулу ДНК, обладающую идентичностью 90% или более молекуле ДНК, которая представлена в SEQ ID NO: 1, и имеющую ту же функцию, что и указанная молекула ДНК, полученную путем осуществления в последовательности нуклеотидов SEQ ID NO: 1, модификации, и/или замены, и/или делеции, и/или добавления одного или нескольких нуклеотидов;

D6) экспрессионную кассету, содержащую молекулу ДНК по D4) или D5);

D7) рекомбинантный вектор, содержащий молекулу ДНК по D4) или D5), или рекомбинантный вектор, содержащий экспрессионную кассету по D6);

D8) рекомбинантный микроорганизм, содержащий молекулу ДНК по D4) или D5), или рекомбинантный микроорганизм, содержащий экспрессионную кассету по D6), или рекомбинантный микроорганизм, содержащий рекомбинантный вектор по D7).

Молекула ДНК, представленная в SEQ ID NO: 1, представляет собой ген BBD29_00405 согласно настоящему изобретению.

Молекула ДНК, представленная в SEQ ID NO: 1 (ген BBD29 00405), кодирует белок, представленный в SEQ ID NO: 3.

В настоящем документе «идентичность» относится к идентичности последовательностей аминокислот или последовательностей нуклеотидов. Международные сайты поиска гомологии в сети Интернет могут применяться для определения идентичности последовательностей аминокислот, например, страница BLAST на главной странице вебсайта NCBI. Например, в Advanced BLAST2.1 может быть использована программа blastp со значением параметра Expect value, установленным на 10, всеми фильтрами в режиме OFF, BLOSUM62 в качестве матрицы и значениями штрафа за введение пропуска, штрафа за удлинение пропуска на один остаток и коэффициента лямбда (Lambda ratio), установленными на 11, 1 и 0,85 (устанавливаемые по умолчанию значения), соответственно, и может быть выполнен поиск идентичности между парой последовательностей аминокислот для расчета, после чего можно получить значение идентичности (%).

Согласно настоящему документу идентичность 80% или более может представлять собой по меньшей мере 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичность.

Согласно настоящему документу идентичность 90% или более может представлять собой по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичность.

Регуляция продуцирования L-глутаминовой кислоты микроорганизмом согласно описанию в настоящем документе может представлять собой увеличение или уменьшение уровня накопления L-глутаминовой кислоты микроорганизмом (т.е. стимуляцию или ингибирование биосинтеза L-глутаминовой кислоты).

Согласно настоящему изобретению также предложен способ повышения продуцирования L-глутаминовой кислоты микроорганизмом, при этом указанный способ включает любое из:

Е1) увеличения уровня экспрессии или содержания молекулы нуклеиновой кислоты BBD29_00405^G597A у микроорганизма-мишени с получением микроорганизма, продуцирующего больше L-глутаминовой кислоты, чем микроорганизм-мишень;

Е2) увеличения уровня экспрессии или содержания молекулы ДНК по D4) или D5) у микроорганизма-мишени с получением микроорганизма, продуцирующего больше L-глутаминовой кислоты, чем микроорганизм-мишень;

Е3) осуществления мутации в молекуле ДНК, последовательность нуклеотидов которой представлена SEQ ID NO: 1, в микроорганизме-мишени с получением микроорганизма, продуцирующего больше L-глутаминовой кислоты, чем микроорганизм-мишень.

Согласно описанному выше способу указанная мутация может представлять собой точечную мутацию, т.е. мутацию одного нуклеотида.

Согласно описанному выше способу указанная точечная мутация может представлять собой мутацию остатка аланина в положении 199 в последовательности аминокислот, кодируемой молекулой ДНК SEQ ID NO: 1, на остаток другой аминокислоты.

Согласно описанному выше способу указанная точечная мутация может представлять собой мутацию аланина в положении 199 в последовательности аминокислот, кодируемой молекулой ДНК SEQ ID NO: 1, на треонин, с получением мутированного белка BBD29_00405^M199I, последовательность аминокислот которого представлена SEQ ID NO: 4.

Указанная мутация относится к изменению одного или нескольких оснований в гене в результате сайт-направленной мутации, что приводит к изменению аминокислотного состава соответствующего белка, с получением таким образом нового белка, или обеспечением новой функции исходного белка, то есть представляет собой сайт-направленную мутацию генов. Методики осуществления сайт-направленных мутаций генов, такие как опосредованный олигонуклеотидными праймерами сайт-направленный мутагенез, ПЦР-опосредованный сайт-направленный мутагенез или кассетный мутагенез, хорошо известны специалистам в данной области техники.

Точечная мутация согласно описанию в настоящем документе может представлять собой замену одного основания, инсерцию одного основания или делецию одного основания, и в особенности замену одного основания. Замена одного основания может представлять собой аллельную замену.

Указанная точечная мутация может заключаться в осуществлении модификации нуклеиновой кислоты с заменой гуанина (G) в положении 597 гена BBD29_00405 (SEQ ID NO: 1).

В частности, указанная точечная мутация может заключаться в осуществлении мутации гуанина (G) в положении 597 гена BBD29_00405 (SEQ ID NO: 1) на аденин (А) с получением молекулы ДНК SEQ ID NO: 2.

В настоящем документе рекомбинантный вектор может представлять собой, в частности, рекомбинантный вектор pK18-BBD29_00405^G597A, PK18mobsacB-BBD29_00405, PK18mobsacB-BBD29_00405^G597A, pXMJ19-BBD29_00405 или pXMJ19-BBD29_00405^G597A.

Рекомбинантный вектор pK18-BBD29_00405^G597A содержит молекулу ДНК, представленную положениями 1-1473 мутированного гена BBD29_00405^G597A, представленного в SEQ ID NO: 2, и, в частности, представляет собой рекомбинантный вектор, полученный путем инсерции фрагмента ДНК BBD29_00405^G597A-Up-Down, представленного в SEQ ID NO: 31, между сайтами распознавания Xba I в векторе pK18mobsacB, при сохранении в неизмененном виде других последовательностей вектора pK18mobsacB.

Рекомбинантный вектор PK18mobsacB-BBD29_00405 применяют для интеграции экзогенного гена BBD29_00405 в хромосому хозяина и для сверхэкспрессии гена дикого типа BBD29_00405 у бактерии-продуцента.

Рекомбинантный вектор PK18mobsacB-BBD29_00405^G597A применяют для интеграции экзогенного гена BBD29_00405^G597A в хромосому хозяина и для сверхэкспрессии мутантного гена BBD29_00405^G597A у бактерии-продуцента.

Рекомбинантный вектор pXMJ19-BBD29 00405 применяют для экспрессии экзогенного гена BBD29_00405 вне хромосомы посредством плазмиды, со сверхэкспрессией таким образом гена BBD29_00405 дикого типа у бактерии-продуцента.

Рекомбинантный вектор pXMJ19-BBD29_00405^G597A применяют для экспрессии экзогенного гена BBD29_00405^G597A вне хромосомы посредством плазмиды, со сверхэкспрессией таким образом мутантного гена BBD29_00405^G597A у бактерии-продуцента.

Все рекомбинантные векторы из pK18-BBD29_00405^G597A, PK18mobsacB-BBD29_00405, PK18mobsacB-BBD29_00405^G597A, pXMJ19-BBD29_00405 и pXMJ19-BBD29_00405^G597A входят в заявленный объем настоящего изобретения.

Согласно настоящему документу рекомбинантный микроорганизм может представлять собой, в частности, рекомбинантную бактерию YPG-025, YPG-026, YPG-027, YPG-028 или YPG-029.

Рекомбинантная бактерия YPG-025 представляет собой рекомбинантную бактерию, полученную путем трансформации рекомбинантный вектором pK18-BBD29_00405^G597A бактерии Corynebacterium glutamicum CGMCC №21220, и указанная рекомбинантная бактерия YPG-025 содержит мутированный ген BBD29_00405^G597A, представленный в SEQ ID NO: 2.

Рекомбинантная бактерия YPG-026 содержит двухкопийный ген BBD29_00405, представленный в SEQ ID NO: 1; рекомбинантная бактерия, содержащая двухкопийный ген BBD29_00405, способна значимо и устойчиво повышать уровень экспрессии гена BBD29_00405. Рекомбинантная бактерия YPG-026 представляет собой сконструированную бактерию, сверхэкспрессирующую ген BBD29_00405 дикого типа из генома.

Рекомбинантная бактерия YPG-027 содержит мутированный ген BBD29_00405^G597A, представленный в SEQ ID NO: 2; рекомбинантная бактерия YPG-027 представляет собой сконструированную бактерию, сверхэкспрессирующую ген BBD29_00405^G597A мутантного типа из генома.

Рекомбинантная бактерия YPG-028 содержит двухкопийный ген BBD29_00405, представленный в SEQ ID NO: 1; рекомбинантная бактерия YPG-028 представляет собой сконструированную бактерию, сверхэкспрессирующую ген BBD29_00405 дикого типа с плазмиды, т.е. сверхэкспрессия происходит вне хромосомы с помощью плазмиды pXMJ19-BBD29_00405.

Рекомбинантная бактерия YPG-029 содержит мутированный ген BBD29_00405^G597A, представленный в SEQ ID NO: 2; рекомбинантная бактерия YPG-029 представляет собой сконструированную бактерию, сверхэкспрессирующую ген BBD29_00405^G597A мутантного типа с плазмиды, т.е. сверхэкспрессия происходит вне хромосомы с помощью плазмиды pXMJ19- BBD29_00405 ^G597A.

Все рекомбинантные бактерии YPG-025, YPG-025, YPG-027, YPG-027 и YPG-029 включены в заявленный объем настоящего изобретения.

Согласно настоящему изобретению также предложен способ конструирования рекомбинантного микроорганизма, при этом указанный способ включает по меньшей мере одно из:

F1) введения молекулы нуклеиновой кислоты BBD29_00405^G597A в микроорганизм-мишень с получением рекомбинантного микроорганизма;

F2) введения молекулы ДНК SEQ ID NO: 1, в микроорганизм-мишень с получением рекомбинантного микроорганизма;

F3) редактирования молекулы ДНК SEQ ID NO: 1, с помощью средства редактирования генов (такого как редактирование генов с изменением одного основания) для введения молекулы ДНК SEQ ID NO: 2, в микроорганизм-мишень.

Указанное введение может быть представлено трансформацией бактерии-хозяина вектором, несущим молекулу ДНК согласно настоящему изобретению, любыми известными способами трансформации, такими как способ химической трансформации или способ электротрансформации. Введенная молекула ДНК может быть однокопийной или многокопийной. Введение может быть представлено интеграцией экзогенного гена в хромосому хозяина, или экспрессией вне хромосомы с помощью плазмиды.

Согласно настоящему изобретению также предложен способ получения L-глутаминовой кислоты, при этом указанный способ включает продуцирование L-глутаминовой кислоты любым из рекомбинантных микроорганизмов согласно описанию в настоящем документе.

Описанный выше способ может представлять собой получение L-глутаминовой кислоты ферментативным способом, а рекомбинантный микроорганизм может относиться к роду Corynebacterium, и в частности, представлять собой Corynebacterium glutamicum и его варианты.

Ссылка на депонирование биологического образца

Corynebacterium glutamicum был депонирован в Китайском главном центре коллекций микробиологических культур (China General Microbiological Culture Collection Center, сокращенно «CGMCC», адрес: No. 3, Yard 1, Beichen West Road, Chaoyang District, Beijing, Post Code: 100101, 23 ноября 2020 г., под номером доступа депонированного биологического образца: CGMCC №21220, Название штамма: YPGLU001.

Наилучшие способы реализации изобретения

Технические решения согласно настоящему изобретению будут подробно описаны ниже на конкретных примерах. Следует понимать, что приведенные примеры служат исключительно для иллюстрации и объяснения настоящего изобретения, и не должны быть истолкованы как ограничивающие заявленный объем настоящего изобретения. Все методики, осуществляемые на основе описанного выше содержания настоящего изобретения, входят в заявленный объем защиты настоящего изобретения.

Если не указано иное, все исходные материалы и реагенты, используемые в приведенных ниже примерах, коммерчески доступны или могут быть получены с применением известных способов. Экспериментальные методы, не требующие специальных условий, описанные в следующих примерах, обычно сопряжены со стандартными условиями, такими как описанные в руководстве: Sambrook et al., Molecular Cloning: Laboratory Manual (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989), или рекомендованными изготовителями.

Если иное не указано или явным образом не следует из контекста, все технические и научные термины в настоящем описании имеют значения, соответствующие общеизвестным значениям для специалистов в области техники, к которой относится настоящее изобретение.

В приведенных ниже примерах состав основной среды, используемой для культивирования штамма, одинаков; в соответствующих случаях при необходимости добавляют сахарозу, канамицин или хлорамфеникол и т.п.на основе состава основной среды. Если требуется твердая среда, добавляют 2% агара при значении рН 7,0 и температуре 30°С для культивирования. Содержание растворенных веществ в основной среде представлено в таблице 1 ниже. Вещества, перечисленные в таблице 1, растворяют в воде с получением основной среды:

Corynebacterium glutamicum YPGLU001 CGMCC №21220 из примеров ниже был депонирован в Китайском главном центре коллекций микробиологических культур («China General Microbiological Culture Collection Center», сокращенно «CGMCC», адрес: No. 3, Yard 1, Beichen West Road, Chaoyang District, Beijing, Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences), 23 ноября 2020 г., под номером доступа CGMCC №21220. Corynebacterium glutamicum YPGLU001 также известен как Corynebacterium glutamicum CGMCC №21220.

Пример 1. Конструирование вектора для трансформации pK18-BBD29_00405^G597A, содержащего кодирующую область гена BBD29_00405 с точечной мутацией

В соответствии с последовательностью генома Corynebacterium glutamicum АТСС13869 (GenBank: СР016335.1), опубликованной в базе NCBI, разрабатывали и синтезировали два пары праймеров для амплификации последовательности кодирующей области гена BBD29_00405 (GenBank: AKF27993.1) для введения точечной мутации в штаммы АТСС13869 и Corynebacterium glutamicum YPGLU001 (Номер доступа депонированного биологического образца: CGMCC №21220), продуцирующего L-глутаминовую кислоту с высоким выходом, посредством аллельной замены. Последовательность аминокислот, соответствующая кодируемому белку, представлена SEQ ID NO: 3, с заменой гуанина (G) в положении 597 в последовательности нуклеотидов гена BBD29_00405 на аденин (A) (SEQ ID NO: 2: BBD29_00405^G597A), и, соответственно, с изменением метионина (М) в положении 199 в последовательности аминокислот, соответствующей кодируемому белку, на изолейцин (I) (SEQ ID NO: 4: BBD29_00405^M199I).

Последовательность нуклеотидов гена BBD29_00405 дикого типа представлена SEQ ID NO: 1 и последовательность аминокислот кодируемого ей белка BBD29_00405 представлена SEQ ID NO: 3;

Последовательность нуклеотидов мутированного гена BBD29_00405^G597A представлена SEQ ID NO: 2 и последовательность аминокислот кодируемого ей мутированного белка BBD29_00405^M199I представлена SEQ ID NO: 4.

Были разработаны следующие праймеры (синтезированы Invitrogen Corporation, Шанхай, мутированные основания подчеркнуты):

Р1: 5'CAGTGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGATGACTATTAATGTCTCCGA3' (SEQ ID NO: 5)

Р2: 5'AGACCGGCATCAAGTATGGTCTGGGCA3' (SEQ ID NO: 6)

Р3: 5'TGCCCAGACCATACTTGATGCCGGTCT3'(SEQ ID NO: 7)

P4: 5'CAGCTATGACCATGATTACGAATTCGAGCTCGGTACCCCTAGCCGGCGTAA GGATCCCGGAT3' (SEQ ID NO: 8)

Способ конструирования: используя Corynebacterium glutamicum ATCC13869 в качестве матрицы, осуществляют ПЦР-амплификацию с соответствующими праймерами P1, Р2 и Р3, Р4. ПЦР-система: 10×буфер Ex Taq Buffer: 5 мкл, смесь dNTP (2,5 мМ каждый): 4 мкл, Mg²⁺ (25 мМ): 4 мкл, праймеры (10 пМ): каждого по 2 мкл; Ex Taq (5 Ед/мкл) 0,25 мкл, матрица: 1 мкл, вода до конечного объема, в общем объеме 50 мкл.

Описанную выше ПЦР-амплификацию осуществляют путем предварительной денатурации в течение 5 минут при 94°С, денатурации в течение 30 с при 94°С, ренатурации в течение 30 с при 52°С, удлинения в течение 40 с при 72°С (30 циклов); и избыточного удлинения в течение 10 мин при 72°С, с получением двух фрагментов ДНК, содержащих кодирующую область гена BBD29_00405, размер каждого из которых составляет приблизительно 647 п.о. и 927 п.о., соответственно, (BBD29_00405^G597A-Up (SEQ ID NO: 29) и BBD29_00405^Q597A-Down (SEQ ID NO: 30).

После выделения BBD29_00405^G597A-Up и BBD29_00405^G597A-Down путем электрофореза на агарозном геле и их очищения два указанных фрагмента ДНК используют в качестве матрицы с праймерами Р1 и Р4 для ПЦР-амплификации с перекрывающимися праймерами, с получением фрагмента BBD29 00405^G597A-Up-Down длиной1547 п.о., имеющего последовательность нуклеотидов SEQ ID NO: 31.

ПЦР-система: 10×буфер Ex Taq Buffer: 5 мкл, смесь dNTP (2,5 мМ каждый): 4 мкл, Mg²⁺ (25 мМ): 4 мкл, праймеры (10 пМ): каждого по 2 мкл; Ex Taq (5 Ед/мкл) 0,25 мкл, матрица: 1 мкл, вода до конечного объема, в общем объеме 50 мкл.

Описанную выше ПЦР-амплификацию осуществляют путем предварительной денатурации в течение 5 минут при 94°С, денатурации в течение 30 с при 94°С, ренатурации в течение 30 с при 52°С, удлинения в течение 100 с при 72°С (30 циклов); и избыточного удлинения в течение 10 мин при 72°С.

Указанный фрагмент ДНК обеспечивает изменение гуанина (G) в положении 597 в кодирующей области гена BBD29_00405 подвергнутого мутагенезу штамма АТСС13869, Corynebacterium glutamicum YPGLU001 (Номер доступа депонированного биологического образца: CGMCC №21220), что в итоге приводит к изменению аминокислоты в положении 199 кодируемого белка с метионина (М) на изолейцин (I).

После расщепления плазмиды pK18mobsacB (приобретена у Addgene Corporation) с помощью Xba I, фрагмент BBD29_00405^G597A-Up-Down и линеаризованную плазмиду pK18mobsacB выделяют путем электрофореза на агарозном геле и очищают, после чего осуществляют сборку с применением системы рекомбинации NEBuider (NEB E5520S) с получением вектора pK18-BBD29_00405^G597A, плазмиды, содержащей маркер устойчивости к канамицину. Затем вектор pK18-BBD29_00405^G597A отправляют для секвенирования и идентификации в компанию, осуществляющую секвенирование, и вектор pK18-BBD29_00405^G597A, содержащий корректную точечную мутацию (G-А) отправляют на хранение.

Рекомбинантный вектор pK18-BBD29_00405^G597A представляет собой рекомбинантный вектор, полученный путем инсерции фрагмента ДНК BBD29_00405^G597A-Up-Down, представленного в SEQ ID NO: 31, между сайтами распознавания XbaI вектора pK18mobsacB, при сохранении других последовательностей вектора pK18mobsacB в неизмененном виде.

Пример 2. Конструирование сконструированного штамма, содержащего BBD29_00405^G597A с точечной мутацией

Способ конструирования: плазмидой pK18-BBD29_00405^G597A после аллельной замены электротрансформируют Corynebacterium glutamicum YPGLU001, продуцирующий L-глутаминовую кислоту с высоким выходом (Номер доступа депонированного биологического образца: CGMCC №21220; с помощью секвенирования подтверждают, что кодирующая область гена BBD29_00405 дикого типа на хромосоме у штамма сохранена); каждую из выросших моноколоний идентифицируют с применением праймера Р1 и универсального праймера M13R для определения положительного штамма с полосой, соответствующей приблизительно 1554 п.о. (SEQ ID NO: 32), после амплификации. Положительный штамм культивируют на культуральной среде, содержащей 15% сахарозы; выросшие моноколонии культивируют на культуральных средах с канамицином и без канамицина, соответственно. Штаммы, растущие на культуральной среде без канамицина и не растущие на культуральной среде с канамицином, подвергают дальнейшей идентификации с помощью ПЦР со следующими праймерами (синтезированы Invitrogen Corporation, Шанхай):

Р5: 5'AGAAGGCAACCTGCGCATGA3' (SEQ ID NO: 9)

Р6: 5'ATCGGGTTGGAAATCGCAGA3' (SEQ ID NO: 10);

Универсальный праймер M13R имеет следующую последовательность: M13R: 5'CAG GAA ACAGCT ATGACC3'.

Вышеописанный амплифицированный продукт ПЦР размером 261 п.о. (SEQ ID NO: 33) подвергают денатурации при высокой температуре и на ледяной бане, после чего проводят SSCP-электрофорез (с амплифицированным фрагментом плазмиды pK18-BBD29_00405^G597A в качестве положительного контроля, амплифицированным фрагментом АТСС13869 в качестве отрицательного контроля, и водой в качестве холостого контроля). Поскольку фрагменты отличаются структурой, их локализация при электрофорезе будет разной. Соответственно, штамм, характеризующийся успешной аллельной заменой, представляет собой такой штамм, локализация фрагмента которого при электрофорезе не совпадает с локализацией отрицательного контрольного фрагмента, и совпадает с локализацией положительного контрольного фрагмента.

Праймеры Р5 и Р6 также используют для ПЦР-амплификации целевого фрагмента штамма, характеризующегося успешной аллельной заменой, который соединяют с вектором PMD19-T для секвенирования. Для идентификации успешной или неудавшейся замены используют выравнивание последовательностей оснований; полученный путем успешной замены мутантный штамм Corynebacterium glutamicum YPGLU001, продуцирующий глутаминовую кислоту с высоким выходом (Номер доступа депонированного биологического образца: CGMCC №21220), обозначен как YPG-025.

Рекомбинантная бактерия YPG-025 представляет собой генетически сконструированную бактерию YPG-025, содержащую точечную мутацию (G-A), полученную путем введения точечной мутации G597A в кодирующую область гена BBD29_00405 (SEQ ID NO: 1) Corynebacterium glutamicum CGMCC №21220 посредством аллельной замены, обеспечивающей мутацию в положении 597 гена с заменой G на А при сохранении в неизмененном виде других последовательностей гена.

Corynebacterium glutamicum YPG-025 отличается от Corynebacterium glutamicum CGMCC21220 только заменой в геноме Corynebacterium glutamicum CGMCC21220 гена BBD29 00405, представленного в SEQ ID NO: 1, на ген BBD29_00405^G597A, представленный в SEQ ID NO: 2. SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 2 отличаются всего одним нуклеотидом в положении 597.

Подготовка ПААГ-электрофореза и условия для SSCP-электрофореза показаны в таблице 2 ниже:

Пример 3. Конструирование сконструированного штамма со сверхэкспрессируемым геном BBD29_00405 или BBD29_00405^G597A из генома

В соответствии с последовательностью генома Corynebacterium glutamicum АТСС13869 (GenBank: СР016335.1), опубликованной NCBI, разрабатывают и синтезируют три пары праймеров для амплификации 5'- и 3'-фрагментов плеч гомологии, а также последовательности кодирующей области гена BBD29_00405 и области промотора для введения гена BBD29_00405 или BBD29_00405^G597A в штамм Corynebacterium glutamicum YPGLU001 (Номер доступа депонированного биологического образца: CGMCC №21220) посредством гомологичной рекомбинации.

Разработаны следующие праймеры (синтезированы Invitrogen Corporation, Шанхай):

Р7: 5'CAGTGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGGACCCGCTTGCCAT ACGAAG3'

Р8: 5'CCTACCACGA CGAGCACTAC АТСТАСТСАТ CTGAAGAATC3'

Р9: 5'GATTCTTCAG ATGAGTAGAT GTAGTGCTCG TCGTGGTAGG3'

Р10: 5'CAAACCAGAG TGCCCACGAA CTAGCCGGCG TAAGGATCCC3'

P11: 5'GGGATCCTTA CGCCGGCTAG TTCGTGGGCA CTCTGGTTTG3'

Р12: 5'CAGCTATGACCATGATTACGAATTCGAGCTCGGTACCCCATAAGAAACAACCACT ТСС3'

Способ конструирования: используя Corynebacterium glutamicum АТСС13869 или YPI019 в качестве матрицы, осуществляют ПЦР-амплификацию с праймерами Р7/Р8, Р9/Р10 и Р11/Р22, соответственно, с получением 5'-фрагмента плеча гомологии длиной приблизительно 806 п.о., фрагмента гена BBD29_00405 (SEQ ID NO: 34) или BBD29_00405 ^G597A (SEQ ID NO: 36) длиной приблизительно 1777 п.о., и 3'-фрагмента плеча гомологии длиной приблизительно 788 п.о. (SEQ ID NO: 37). Кроме того, с применением Р7/Р12 в качестве праймеров осуществляют амплификацию со смесью трех описанных выше амплифицированных фрагментов в качестве матрицы с получением единого фрагмента плеч гомологии 5'-BBD29_00405-3' (SEQ ID NO: 38) или единого фрагмента плеч гомологии 5'-BBD29_00405^G597A-3' (SEQ ID NO: 39) длиной 3291 п.о. После завершения ПЦР-реакции осуществляют электрофорез амплифицированных продуктов для выделения требуемого фрагмента ДНК длиной приблизительно 3291 п.о. с применением набора с колонкой для выделения ДНК на геле (Column DNA Gel Recovery Kit), который лигируют, используя систему рекомбинации NEBuider, в челночную плазмиду PK18mobsacB, расщепленную Xba I, и выделяют с получением интегративной плазмиды (т.е. рекомбинантного вектора) PK18mobsacB-BBD29_00405 или PK18mobsacB-BBD29_00405^G597A, Указанная плазмида содержит маркер устойчивости к канамицину, благодаря чему путем скрининга с канамицином может быть получен рекомбинантный штамм, содержащий интегрированную в геном плазмиду.

pk18mobsacB-BBD29_00405 представляет собой рекомбинантный вектор, полученный путем инсерции единого фрагмента плеч гомологии 5'-BBD29_00405-3' (SEQ ID NO: 38) между сайтами расщепления Xba I челночной плазмиды pk18mobsacB.

pk18mobsacB-BBD29_00405 представляет собой рекомбинантный вектор, полученный путем инсерции единого фрагмента плеч гомологии 5'-BBD29_00405^G597A-3' (SEQ ID NO: 39) между сайтами расщепления Xba I челночной плазмиды pk18mobsacB.

ПЦР-система: 10×буфер Ex Taq Buffer: 5 мкл, смесь dNTP (2,5 мМ каждый): 4 мкл, Mg²⁺ (25 мМ): 4 мкл, праймеры (10 пМ): каждого по 2 мкл; Ex Taq (5 Ед/мкл) 0,25 мкл, матрица: 1 мкл, вода до конечного объема, в общем объеме 50 мкл.

Описанную выше ПЦР-амплификацию осуществляют путем предварительной денатурации в течение 5 минут при 94°С, денатурации в течение 30 с при 94°С, ренатурации в течение 30 с при 52°С, удлинения в течение 180 с при 72°С (30 циклов); и избыточного удлинения в течение 10 мин при 72°С.

Каждой из этих двух интегративных плазмид электротрансформируют Corynebacterium glutamicum YPGLU001 (Номер доступа депонированного биологического образца: CGMCC №21220), и осуществляют ПЦР-идентификацию выросших моноколоний с праймерами Р13/Р14 для обнаружения положительного штамма, содержащего фрагмент длиной приблизительно 1970 п.о. (SEQ ID NO: 40), полученный при ПЦР-амплификации, тогда как штамм, не содержащий каких-либо амплифицированных этим способом фрагментов, представляет собой исходный штамм. При скрининге с 15% сахарозы положительный штамм культивируют на культуральных средах с канамицином и без канамицина, соответственно, и штаммы, растущие на культуральной среде без канамицина и не растущие на культуральной среде с канамицином подвергают дальнейшей ПЦР с праймерами Р15/Р16 для идентификации. Бактерия с амплифицированным этим способом фрагментом длиной приблизительно 1758 п.о. (SEQ ID NO: 41) представляет собой штамм с геном BBD29 00405 или BBD29_00405^G597A, интегрированным в геном штамма Corynebacterium glutamicum YPGLU001 (Номер доступа депонированного биологического образца: CGMCC №21220), обозначен YPG-026 (без точечной мутации) и YPG-027 (с точечной мутацией).

Р13: 5'GTCCAAGGTGACGGCCGCAC3'

Р14: 5'AGCTTCGCCGATGTTGCGCA3'

Р15: 5'AGGTTGCACCCGCCATCGCTGCA3'

Р16: 5'ATATTCGGCCCAGCAGCAGC3'

Рекомбинантная бактерия YPG-026 представляет собой рекомбинантную бактерию, содержащую двухкопийный ген BBD29_00405, представленный в SEQ ID NO: 1, полученную путем интеграции единого фрагмента плеч гомологии 5'-BBD29_00405-3' (SEQ ID NO: 38) в геном штамма Corynebacterium glutamicum YPGLU001. Рекомбинантная бактерия, содержащая двухкопийный ген BBD29_00405, может значимо и стабильно увеличивать уровень экспрессии гена BBD29_00405.

Рекомбинантная бактерия YPG027 представляет собой рекомбинантную бактерию, содержащую мутированный ген BBD29_00405^G597A, представленный в SEQ ID NO: 2, полученную путем интеграции единого фрагмента плеч гомологии 5'-BBD29_00405^G597A-3' (SEQ ID NO: 39) в геном штамма Corynebacterium glutamicum YPGLU001.

Пример 4. Конструирование сконструированного штамма, сверхэкспрессирующего ген BBD29_00405 или BBD29_00405^G597A с плазмиды

В соответствии с последовательностью генома Corynebacterium glutamicum АТСС13869 (GenBank: СР016335.1), опубликованной NCBI, разрабатывают и синтезируют пару праймеров для амплификации последовательности кодирующей области гена BBD29_00405 и области промотора. Разработаны следующие праймеры (синтезированы Invitrogen Corporation, Шанхай).

Р17: 5'GCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGAGGATCCCCGTAGTGCTCGTCGTGGTAGG3'

P18: 5'ATCAGGCTGAAAATCTTCTCTCATCCGCCAAAACCTAGCCGGCGTAAGGATCCCGGAT3'

Способ конструирования: используя ATCC13869 или YPG-025 в качестве матрицы, осуществляют ПЦР-амплификацию с праймерами Р17/Р18 для получения молекулы ДНК, содержащей BBD29_00405 (SEQ ID NO: 42), или молекулы ДНК, содержащей BBD29_00405^G597A (SEQ ID NO: 43), размером приблизительно 1807 п.о. Осуществляют электрофорез амплифицированных продуктов для выделения требуемого фрагмента ДНК размером 1807 п.о. с применением набора с колонкой для выделения ДНК на геле (Column DNA Gel Recovery Kit), который лигируют с применением системы рекомбинации NEBuider в челночную плазмиду pXMJ19 (BioVector NTCC BiovectorpXMJ19), расщепленную EcoR I, и выделяют с получением сверхэкспрессирующей плазмиды pXMJ19-BBD29_00405 или pXMJ19-BBD29_00405^G597A. Указанная плазмида содержит маркер устойчивости к хлорамфениколу, и трансформация штамма указанной плазмидой может быть достигнута путем скрининга с хлорамфениколом.

ПЦР-система: 10×буфер Ex Taq Buffer: 5 мкл, смесь dNTP (2,5 мМ каждый): 4 мкл, Mg²⁺ (25 мМ): 4 мкл, праймеры (10 пМ): каждого по 2 мкл; Ex Taq (5 Ед/мкл) 0,25 мкл, матрица: 1 мкл, вода до конечного объема, в общем объеме 50 мкл.

Описанную выше ПЦР-амплификацию осуществляют путем предварительной денатурации в течение 5 минут при 94°С, денатурации в течение 30 с при 94°С, ренатурации в течение 30 с при 52°С, удлинения в течение 100 с при 72°С (30 циклов); и избыточного удлинения в течение 10 мин при 72°С.

Рекомбинантный вектор pXMJ19-BBD29_00405 представляет собой рекомбинантный штамм, полученный путем инсерции молекулы ДНК, содержащей BBD29_00405 (SEQ ID NO: 42) между сайтами расщепления EcoR I челночной плазмиды pXMJ19.

Рекомбинантный вектор pXMJ19-BBD29_00405^G597A представляет собой рекомбинантный штамм, полученный путем инсерции молекулы ДНК, содержащей BBD29_00405^G597A (SEQ ID NO: 43) между сайтами расщепления EcoR I челночной плазмиды pXMJ19.

Каждой из плазмид электротрансфицируют Corynebacterium glutamicum YPGLU001 (Номер доступа депонированного биологического образца: CGMCC №21220), и осуществляют ПЦР-идентификацию выросших моноколоний с праймерами M13R (-48) и Р18 для обнаружения трансформированного штамма, содержащего фрагмент длиной приблизительно 1846 п.о. (SEQ ID NO: 44), полученный при ПЦР-амплификации, обозначенного как YPG-028 (без точечной мутации) и YPG-029 (с точечной мутацией).

M13R (-48) имеет следующую последовательность:

5'AGCGGATAAC AATTTCACAC AGGA3'

Рекомбинантная бактерия YPG-028 содержит двухкопийный ген BBD29_00405, представленный в SEQ ID NO: 1; рекомбинантная бактерия YPG-028 представляет собой сконструированную бактерию, сверхэкспрессирующую ген дикого типа BBD29_00405 с плазмиды, т.е. сверхэкспрессия происходит вне хромосомы с помощью плазмиды pXMJ19-BBD29_00405.

Рекомбинантная бактерия YPG-029 содержит мутированный ген BBD29_00405^G597A, представленный в SEQ ID NO: 2; рекомбинантная бактерия YPG-029 представляет собой сконструированную бактерию, сверхэкспрессирующую ген BBD29_00405^G597A мутантного типа с плазмиды, т.е. сверхэкспрессия происходит вне хромосомы с помощью плазмиды pXMJ19-BBD29_00405^G597A.

Пример 5. Конструирование сконструированного штамма с делетированным из генома геном BBD29_00405

В соответствии с последовательностью генома Corynebacterium glutamicum АТСС13869 (GenBank: СР016335.1), опубликованной в базе NCBI, синтезируют две пары праймеров для амплификации фрагментов на обоих концах кодирующей области гена BBD29_00405, как 5'- и 3'-фрагментов плеч гомологии. Разработаны следующие праймеры (синтезированы Invitrogen Corporation, Шанхай):

Р19: 5'CAGTGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGGTCTGGGGGTGAGCGCGGAT3'

Р20: AGGAAAATAACGCATCCATCTGCCCCTTTACAAATCCACCGCAAACACTGGGAT3'

Р21: TGGATTTGTAAAGGGGCAGATGGATGCGTTATTTTCCTTCACTTTTCGTATCCA3'

Р22: 5'CAGCTATGACCATGATTACGAATTCGAGCTCGGTACCCCTCTGGCGCATCGAACAGGTCGAAGGA3'

Используя Corynebacterium glutamicum АТСС13869 в качестве матрицы, осуществляют ПЦР-амплификацию с праймерами Р19/Р20 и Р21/Р22, соответственно, для получения 5' фрагмента плеча гомологии длиной 709 п.о. (SEQ ID NO: 45) и 3'-фрагмента плеча гомологии длиной 734 п.о. (SEQ ID NO: 46). Кроме того, праймеры Р19/Р22 используют для ПЦР с перекрывающимися праймерами с получением единого фрагмента плеч гомологии длиной 1405 п.о. (SEQ ID NO: 47). После завершения ПЦР-реакции осуществляют электрофорез амплифицированных продуктов для выделения требуемого фрагмента ДНК длиной 1405 п.о. с применением набора с колонкой для выделения ДНК на геле (Column DNA Gel Recovery Kit), который лигируют, с помощью системы рекомбинации NEBuider, в челночную плазмиду, плазмиду pk18mobsacB, расщепленную Xba I и выделенную с получением нокаутной плазмиды. Указанная плазмида содержит маркер устойчивости к канамицину.

Нокаутной плазмидой электротрансформируют Corynebacterium glutamicum YPGLU001 (Номер доступа депонированного биологического образца: CGMCC №21220), и осуществляют ПЦР-идентификацию выросших моноколоний, в каждом случае со следующими праймерами (синтезированы Invitrogen Corporation, Шанхай):

Р23: 5'GTCTGGGGGTGAGCGCGGAT3'

Р24: 5'CTCTGGCGCATCGAACAGGTCGAAGGA3'

Штамм с полосами, соответствующими приблизительно 1331 п.о. (SEQ ID NO: 49) и приблизительно 2804 п.о. (SEQ ID NO: 48), амплифицированными в ходе описанной выше ПЦР-амплификации, представляет собой положительный штамм, тогда как штамм с единственной полосой, соответствующей 2804 п.о., амплифицированной таким образом, представляет собой исходный штамм. После скрининга на культуральной среде с 15% сахарозы положительный штамм культивируют на культуральных средах с канамицином и без канамицина, соответственно, и штаммы, растущие на культуральной среде без канамицина и не растущие на культуральной среде с канамицином, подвергают дальнейшей ПЦР-идентификации с праймерами Р23/Р24. Штамм с амплифицированной из него полосой, соответствующей 1331 п.о., представляет собой генетически сконструированный штамм с нокаутом кодирующей области гена BBD29_00405, обозначенный как YPG-030.

Рекомбинантная бактерия YPG-030 представляет собой рекомбинантную бактерию с нокаутом гена BBD29_00405 в геноме Corynebacterium glutamicum CGMCC №21220.

Пример 6. Эксперименты с ферментацией для получения L-глутаминовой кислоты

Эксперименты с ферментацией осуществляют на штаммах YPG-025, YPG-026, YPG-027, YPG-028, YPG-029 и YPG-030, сконструированных согласно примерам 2-5, и исходном штамме Corynebacterium glutamicum YPGLU001 (Номер доступа депонированного биологического образца: CGMCC №21220) в ферментативном реакторе типа BLBIO-5GC-4-H (приобретен у Shanghai Bailun Biological Technology Co., Ltd.) с культуральной средой, представленной в таблице 3 и процессом управления ферментацией, представленным в таблице 4, и собирают продукты ферментации.

В начальный момент после завершения посева концентрация бактерий в системе составляет 15 г/л. Во время ферментации содержание сахара в системе (остаточный сахар) контролируют путем добавления водного раствора, содержащего 50-55% глюкозы.

Для каждого штамма эксперименты проводят в трех повторностях.. Результаты приведены в таблице 5.

Описанную выше культуральную среду для ферментации получают путем растворения веществ, перечисленных в таблице 3, в воде.

Результаты из таблицы 5 демонстрируют, что у сконструированной бактерии, продуцирующей L-глутаминовую кислоту, Corynebacterium glutamicum YPGLU001 (Номер доступа депонированного биологического образца: CGMCC №21220), точечная мутация в кодирующей области гена BBD29_00405, BBD29_00405^G597A, способствует повышению продуцирования L-глутаминовой кислоты; сверхэкспрессия BBD29_00405 или BBD29_00405^G597A способствует повышению продуцирования L-глутаминовой кислоты, тогда как нокаут гена BBD29 00405 неблагоприятен для накопления L-глутаминовой кислоты.

Иллюстративное описание вариантов реализации настоящего изобретения было приведено выше. Однако настоящее изобретение не ограничено вышеописанными вариантами реализации. Любая модификация, эквивалентная замена, любое усовершенствование и т.п., осуществленные в соответствии с сутью и принципами настоящего изобретения, включены в заявленный объем защиты настоящего изобретения.

Промышленное применение

Согласно настоящему изобретению было обнаружено, что через нокаут гена BBD29_00405, кодируемый этим геном продукт влияет на способность к продуцированию L-глутаминовой кислоты, и что рекомбинантный штамм, полученный путем введения точечной мутации в кодирующую последовательность, или путем увеличения числа копий или сверхэкспрессии гена, облегчает получение L-глутаминовой кислоты в более высокой концентрации по сравнению с немодифицированным штаммом. При действии ингибитора CTD-2256P15.2 или кодируемого им микропептида РАСМР, предложенного в настоящем изобретении, на опухолевые клетки или опухолевые ткани, рост опухолевых клеток может быть значимо ингибирован, апоптоз опухолевых клеток может усиливаться, объем опухоли может снижаться, и может быть достигнут выдающийся противоопухолевый эффект. Новая схема комбинирования противоопухолевых лекарственных средств, предложенная согласно настоящему изобретению, применение ингибитора CTD-2256P15.2 или кодируемого им микропептида РАСМР в комбинации с другими противоопухолевыми лекарственными средствами, может значимо усиливать киллинговый эффект противоопухолевых лекарственных средств в отношении опухолевых клеток и снижать устойчивость опухолевых клеток к химиотерапии, усиливая таким образом эффект клинического лечения в отношении опухолей. CTD-2256P15.2 экспрессируется на высоких уровнях в устойчивых к химиотерапии опухолевых тканей и линиях клеток, и его высокая экспрессия значимо отрицательно коррелирует с выживаемостью без прогрессирования и общей выживаемостью пациентов с опухолями. Уровень экспрессии гена CTD2256P15.2, обеспечиваемый согласно настоящему изобретению, может применяться в качестве молекулярного индекса для предсказания чувствительности к химиотерапии и прогноза у пациентов с опухолями, формируя новый стандарт эффективного руководства по клиническому химиотерапевтическому лечению пациентов с опухолями и оценки прогноза лечения.

В частности, согласно настоящему изобретению сначала конструируют генетически сконструированную бактерию YPG-025 с точечной мутацией (G-A) путем введения точечной мутации в кодирующую область гена BBD29_00405 (SEQ ID NO: 1) Corynebacterium glutamicum CGMCC №21220 посредством аллельной замены. Для дальнейшего изучения и подтверждения того, что сверхэкспрессия гена дикого типа BBD29_00405 или соответствующего мутантного гена BBD29_00405^G597A у бактерии-продуцента может увеличивать продуцирование L-глутаминовой кислоты, экзогенный ген интегрируют в хромосому хозяина, или экспрессируют вне хромосомы с помощью плазмиды, соответственно, конструируя таким образом сконструированные бактерии YPG-026, YPG-027, YPG-028 и YPG-029, сверхэкспрессирующие ген BBD29_00405 или ген BBD29_00405^G597A из генома и с плазмиды. Эксперименты предполагают, что ген BBD29_00405 и его варианты вовлечены в биосинтез L-глутаминовой кислоты. Путем сверхэкспрессии или нокаутирования гена BBD29_00405, или введения в него сайт-направленной мутации (такой как точечная мутация) можно регулировать уровень накопления L-глутаминовой кислоты микроорганизмом. Точечная мутация в кодирующей области гена BBD29_00405, или сверхэкспрессия гена BBD29_00405 или соответствующего мутантного гена BBD29_00405^G597A у бактерии-продуцента способствует увеличению продуцирования и показателя конверсии L-глутаминовой кислоты L-глутаминовой кислоты, тогда как нокаут или ослабление гена BBD29_00405 нежелательны для накопления L-глутаминовой кислоты. Ген BBD29_00405 и его вариант (такой как ген BBD29_00405^G597A) могут применяться для конструирования генетически сконструированного штамма для продуцирования L-глутаминовой кислоты, чтобы способствовать повышению продуцирования L-глутаминовой кислоты, и для получения высокопродуктивного и высококачественного штамма для промышленного производства, полезного для широкого диапазона вариантов применения и имеющего высокую экономическую ценность для промышленного производства L-глутаминовой кислоты.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110>NINGXIA EPPEN BIOTECH CO., LTD / НИНСЯ ЭППЕН БИОТЕХ КО., ЛТД

<120>Strain Having Enhanced L-Glutamic Acid Production Capacity, and Method for

Constructing the Same and Use Thereof / Штамм, обладающий повышенной

способностью к продуцированию L-глутаминовой кислоты, а также способ его

конструирования и применение

<150>CN202011631311.X

<151>2020-12-30

<160> 49

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1473

<212> ДНК

<213>Corynebacterium glutamicum

<400> 1

atgactatta atgtctccga actacttgcc aaagtcccca cgggtctact gattggtgat 60

tcctgggtgg aagcatccga gggcggtact ttcgatgtgg aaaacccagc gacgggtgaa 120

acaatcgcaa cgctcgcgtc tgctacttcc gaggatgcac tggctgctct tgatgctgca 180

tgcgctgttc aggccgagtg ggctaggacg ccagcgcgcg agcgttctaa tattttacga 240

cgcggtttcg agctcgtcgc ggaacgtgca gaagagttcg ccaccctcat gaccttggaa 300

atgggcaaac ctttggctga agctcgcggc gaagtcacct acggcaacga attcctgcgc 360

tggttctctg aggaagcagt ccgcctctac ggccgctacg gtgctacccc agaaggcaac 420

ctgcgcatga tgaccacccg caaaccagtt ggcccctgcc tgttgatcac cccatggaac 480

ttcccactag caatggccac ccgtaaggtt gcacccgcca tcgctgcagg ttgtgtcatg 540

gtgctcaagc cagctcgcct gaccccgctg acctcccagt attttgccca gaccatgctt 600

gatgccggtc ttccagcagg tgtcctcaat gtggtctccg gtgcttccgc ctctgcgatt 660

tccaacccga ttatggaaga cgatcgcctt cgtaaagtct cattcaccgg ctccacccca 720

gttggccagc agctgctcaa aaaggctgcc gataaagttc tgcgcacctc catggaactc 780

ggcggcaacg cacctttcat tgtcttcgag gacgccgacc tagatctcgc gatcgaaggt 840

gccatgggcg caaaaatgcg caacatcggc gaagcttgca ccgcagccaa ccgtttccta 900

gtccacgaat ccgtcgccga tgaattcggc cgacgcttcg cagcccgcct cgaggaacaa 960

gtcctaggca acggcctcga cgaaggcgtc accgtaggcc cattggttga ggaaaaagca 1020

cgaaacagcg ttgcatcgct tgtcgacgcc gccgtctccg aaggtgccac cgtcctcacc 1080

ggtggcaagg ccggcacagg tgcaggctac ttctacgaac caacggtgct cacgggagtt 1140

tcaacagatg cagccatcct gaacgaagag atcttcggtc ccgtcgcacc gatcgtcacc 1200

ttctctgatg aagctgaagc tctgcgccta gccaattcca ccgaatacgg cctggcctcc 1260

tacgtgttca cccaagacac ctcacgcatc ttccgcgtct ccgacggcct cgagttcggc 1320

ctagtgggcg tcaactccgg tgtcatctct aacgccgctg caccttttgg tggcgtaaaa 1380

caatccggaa tgggccgcga aggtggtctc gaaggaattg aagagtacac ctccgtgcag 1440

tacatcggta tccgggatcc ttacgccggc tag 1473

<210> 2

<211> 1473

<212> ДНК

<213>Corynebacterium glutamicum

<400> 2

atgactatta atgtctccga actacttgcc aaagtcccca cgggtctact gattggtgat 60

tcctgggtgg aagcatccga gggcggtact ttcgatgtgg aaaacccagc gacgggtgaa 120

acaatcgcaa cgctcgcgtc tgctacttcc gaggatgcac tggctgctct tgatgctgca 180

tgcgctgttc aggccgagtg ggctaggacg ccagcgcgcg agcgttctaa tattttacga 240

cgcggtttcg agctcgtcgc ggaacgtgca gaagagttcg ccaccctcat gaccttggaa 300

atgggcaaac ctttggctga agctcgcggc gaagtcacct acggcaacga attcctgcgc 360

tggttctctg aggaagcagt ccgcctctac ggccgctacg gtgctacccc agaaggcaac 420

ctgcgcatga tgaccacccg caaaccagtt ggcccctgcc tgttgatcac cccatggaac 480

ttcccactag caatggccac ccgtaaggtt gcacccgcca tcgctgcagg ttgtgtcatg 540

gtgctcaagc cagctcgcct gaccccgctg acctcccagt attttgccca gaccatactt 600

gatgccggtc ttccagcagg tgtcctcaat gtggtctccg gtgcttccgc ctctgcgatt 660

tccaacccga ttatggaaga cgatcgcctt cgtaaagtct cattcaccgg ctccacccca 720

gttggccagc agctgctcaa aaaggctgcc gataaagttc tgcgcacctc catggaactc 780

ggcggcaacg cacctttcat tgtcttcgag gacgccgacc tagatctcgc gatcgaaggt 840

gccatgggcg caaaaatgcg caacatcggc gaagcttgca ccgcagccaa ccgtttccta 900

gtccacgaat ccgtcgccga tgaattcggc cgacgcttcg cagcccgcct cgaggaacaa 960

gtcctaggca acggcctcga cgaaggcgtc accgtaggcc cattggttga ggaaaaagca 1020

cgaaacagcg ttgcatcgct tgtcgacgcc gccgtctccg aaggtgccac cgtcctcacc 1080

ggtggcaagg ccggcacagg tgcaggctac ttctacgaac caacggtgct cacgggagtt 1140

tcaacagatg cagccatcct gaacgaagag atcttcggtc ccgtcgcacc gatcgtcacc 1200

ttctctgatg aagctgaagc tctgcgccta gccaattcca ccgaatacgg cctggcctcc 1260

tacgtgttca cccaagacac ctcacgcatc ttccgcgtct ccgacggcct cgagttcggc 1320

ctagtgggcg tcaactccgg tgtcatctct aacgccgctg caccttttgg tggcgtaaaa 1380

caatccggaa tgggccgcga aggtggtctc gaaggaattg aagagtacac ctccgtgcag 1440

tacatcggta tccgggatcc ttacgccggc tag 1473

<210> 3

<211> 490

<212> БЕЛОК

<213>Corynebacterium glutamicum

<400> 3

Met Thr Ile Asn Val Ser Glu Leu Leu Ala Lys Val Pro Thr Gly Leu

1 5 10 15

Leu Ile Gly Asp Ser Trp Val Glu Ala Ser Glu Gly Gly Thr Phe Asp

20 25 30

Val Glu Asn Pro Ala Thr Gly Glu Thr Ile Ala Thr Leu Ala Ser Ala

35 40 45

Thr Ser Glu Asp Ala Leu Ala Ala Leu Asp Ala Ala Cys Ala Val Gln

50 55 60

Ala Glu Trp Ala Arg Thr Pro Ala Arg Glu Arg Ser Asn Ile Leu Arg

65 70 75 80

Arg Gly Phe Glu Leu Val Ala Glu Arg Ala Glu Glu Phe Ala Thr Leu

85 90 95

Met Thr Leu Glu Met Gly Lys Pro Leu Ala Glu Ala Arg Gly Glu Val

100 105 110

Thr Tyr Gly Asn Glu Phe Leu Arg Trp Phe Ser Glu Glu Ala Val Arg

115 120 125

Leu Tyr Gly Arg Tyr Gly Ala Thr Pro Glu Gly Asn Leu Arg Met Met

130 135 140

Thr Thr Arg Lys Pro Val Gly Pro Cys Leu Leu Ile Thr Pro Trp Asn

145 150 155 160

Phe Pro Leu Ala Met Ala Thr Arg Lys Val Ala Pro Ala Ile Ala Ala

165 170 175

Gly Cys Val Met Val Leu Lys Pro Ala Arg Leu Thr Pro Leu Thr Ser

180 185 190

Gln Tyr Phe Ala Gln Thr Met Leu Asp Ala Gly Leu Pro Ala Gly Val

195 200 205

Leu Asn Val Val Ser Gly Ala Ser Ala Ser Ala Ile Ser Asn Pro Ile

210 215 220

Met Glu Asp Asp Arg Leu Arg Lys Val Ser Phe Thr Gly Ser Thr Pro

225 230 235 240

Val Gly Gln Gln Leu Leu Lys Lys Ala Ala Asp Lys Val Leu Arg Thr

245 250 255

Ser Met Glu Leu Gly Gly Asn Ala Pro Phe Ile Val Phe Glu Asp Ala

260 265 270

Asp Leu Asp Leu Ala Ile Glu Gly Ala Met Gly Ala Lys Met Arg Asn

275 280 285

Ile Gly Glu Ala Cys Thr Ala Ala Asn Arg Phe Leu Val His Glu Ser

290 295 300

Val Ala Asp Glu Phe Gly Arg Arg Phe Ala Ala Arg Leu Glu Glu Gln

305 310 315 320

Val Leu Gly Asn Gly Leu Asp Glu Gly Val Thr Val Gly Pro Leu Val

325 330 335

Glu Glu Lys Ala Arg Asn Ser Val Ala Ser Leu Val Asp Ala Ala Val

340 345 350

Ser Glu Gly Ala Thr Val Leu Thr Gly Gly Lys Ala Gly Thr Gly Ala

355 360 365

Gly Tyr Phe Tyr Glu Pro Thr Val Leu Thr Gly Val Ser Thr Asp Ala

370 375 380

Ala Ile Leu Asn Glu Glu Ile Phe Gly Pro Val Ala Pro Ile Val Thr

385 390 395 400

Phe Ser Asp Glu Ala Glu Ala Leu Arg Leu Ala Asn Ser Thr Glu Tyr

405 410 415

Gly Leu Ala Ser Tyr Val Phe Thr Gln Asp Thr Ser Arg Ile Phe Arg

420 425 430

Val Ser Asp Gly Leu Glu Phe Gly Leu Val Gly Val Asn Ser Gly Val

435 440 445

Ile Ser Asn Ala Ala Ala Pro Phe Gly Gly Val Lys Gln Ser Gly Met

450 455 460

Gly Arg Glu Gly Gly Leu Glu Gly Ile Glu Glu Tyr Thr Ser Val Gln

465 470 475 480

Tyr Ile Gly Ile Arg Asp Pro Tyr Ala Gly

485 490

<210> 4

<211> 490

<212> БЕЛОК

<213>Corynebacterium glutamicum

<400> 4

Met Thr Ile Asn Val Ser Glu Leu Leu Ala Lys Val Pro Thr Gly Leu

1 5 10 15

Leu Ile Gly Asp Ser Trp Val Glu Ala Ser Glu Gly Gly Thr Phe Asp

20 25 30

Val Glu Asn Pro Ala Thr Gly Glu Thr Ile Ala Thr Leu Ala Ser Ala

35 40 45

Thr Ser Glu Asp Ala Leu Ala Ala Leu Asp Ala Ala Cys Ala Val Gln

50 55 60

Ala Glu Trp Ala Arg Thr Pro Ala Arg Glu Arg Ser Asn Ile Leu Arg

65 70 75 80

Arg Gly Phe Glu Leu Val Ala Glu Arg Ala Glu Glu Phe Ala Thr Leu

85 90 95

Met Thr Leu Glu Met Gly Lys Pro Leu Ala Glu Ala Arg Gly Glu Val

100 105 110

Thr Tyr Gly Asn Glu Phe Leu Arg Trp Phe Ser Glu Glu Ala Val Arg

115 120 125

Leu Tyr Gly Arg Tyr Gly Ala Thr Pro Glu Gly Asn Leu Arg Met Met

130 135 140

Thr Thr Arg Lys Pro Val Gly Pro Cys Leu Leu Ile Thr Pro Trp Asn

145 150 155 160

Phe Pro Leu Ala Met Ala Thr Arg Lys Val Ala Pro Ala Ile Ala Ala

165 170 175

Gly Cys Val Met Val Leu Lys Pro Ala Arg Leu Thr Pro Leu Thr Ser

180 185 190

Gln Tyr Phe Ala Gln Thr Ile Leu Asp Ala Gly Leu Pro Ala Gly Val

195 200 205

Leu Asn Val Val Ser Gly Ala Ser Ala Ser Ala Ile Ser Asn Pro Ile

210 215 220

Met Glu Asp Asp Arg Leu Arg Lys Val Ser Phe Thr Gly Ser Thr Pro

225 230 235 240

Val Gly Gln Gln Leu Leu Lys Lys Ala Ala Asp Lys Val Leu Arg Thr

245 250 255

Ser Met Glu Leu Gly Gly Asn Ala Pro Phe Ile Val Phe Glu Asp Ala

260 265 270

Asp Leu Asp Leu Ala Ile Glu Gly Ala Met Gly Ala Lys Met Arg Asn

275 280 285

Ile Gly Glu Ala Cys Thr Ala Ala Asn Arg Phe Leu Val His Glu Ser

290 295 300

Val Ala Asp Glu Phe Gly Arg Arg Phe Ala Ala Arg Leu Glu Glu Gln

305 310 315 320

Val Leu Gly Asn Gly Leu Asp Glu Gly Val Thr Val Gly Pro Leu Val

325 330 335

Glu Glu Lys Ala Arg Asn Ser Val Ala Ser Leu Val Asp Ala Ala Val

340 345 350

Ser Glu Gly Ala Thr Val Leu Thr Gly Gly Lys Ala Gly Thr Gly Ala

355 360 365

Gly Tyr Phe Tyr Glu Pro Thr Val Leu Thr Gly Val Ser Thr Asp Ala

370 375 380

Ala Ile Leu Asn Glu Glu Ile Phe Gly Pro Val Ala Pro Ile Val Thr

385 390 395 400

Phe Ser Asp Glu Ala Glu Ala Leu Arg Leu Ala Asn Ser Thr Glu Tyr

405 410 415

Gly Leu Ala Ser Tyr Val Phe Thr Gln Asp Thr Ser Arg Ile Phe Arg

420 425 430

Val Ser Asp Gly Leu Glu Phe Gly Leu Val Gly Val Asn Ser Gly Val

435 440 445

Ile Ser Asn Ala Ala Ala Pro Phe Gly Gly Val Lys Gln Ser Gly Met

450 455 460

Gly Arg Glu Gly Gly Leu Glu Gly Ile Glu Glu Tyr Thr Ser Val Gln

465 470 475 480

Tyr Ile Gly Ile Arg Asp Pro Tyr Ala Gly

485 490

<210> 5

<211> 56

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<400> 5

cagtgccaag cttgcatgcc tgcaggtcga ctctagatga ctattaatgt ctccga 56

<210> 6

<211> 27

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<400> 6

agaccggcat caagtatggt ctgggca 27

<210> 7

<211> 27

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<400> 7

tgcccagacc atacttgatg ccggtct 27

<210> 8

<211> 62

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<400> 8

cagctatgac catgattacg aattcgagct cggtacccct agccggcgta aggatcccgg 60

at 62

<210> 9

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<400> 9

agaaggcaac ctgcgcatga 20

<210> 10

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<400> 10

atcgggttgg aaatcgcaga 20

<210> 11

<211> 56

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<400> 11

cagtgccaag cttgcatgcc tgcaggtcga ctctaggacc cgcttgccat acgaag 56

<210> 12

<211> 40

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<400> 12

cctaccacga cgagcactac atctactcat ctgaagaatc 40

<210> 13

<211> 40

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<400> 13

gattcttcag atgagtagat gtagtgctcg tcgtggtagg 40

<210> 14

<211> 40

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<400> 14

caaaccagag tgcccacgaa ctagccggcg taaggatccc 40

<210> 15

<211> 40

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<400> 15

gggatcctta cgccggctag ttcgtgggca ctctggtttg 40

<210> 16

<211> 58

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<400> 16

cagctatgac catgattacg aattcgagct cggtacccca taagaaacaa ccacttcc 58

<210> 17

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<400> 17

gtccaaggtg acggccgcac 20

<210> 18

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<400> 18

agcttcgccg atgttgcgca 20

<210> 19

<211> 23

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<400> 19

aggttgcacc cgccatcgct gca 23

<210> 20

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<400> 20

atattcggcc cagcagcagc 20

<210> 21

<211> 56

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<400> 21

gcttgcatgc ctgcaggtcg actctagagg atccccgtag tgctcgtcgt ggtagg 56

<210> 22

<211> 58

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<400> 22

atcaggctga aaatcttctc tcatccgcca aaacctagcc ggcgtaagga tcccggat 58

<210> 23

<211> 56

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<400> 23

cagtgccaag cttgcatgcc tgcaggtcga ctctaggtct gggggtgagc gcggat 56

<210> 24

<211> 54

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<400> 24

aggaaaataa cgcatccatc tgccccttta caaatccacc gcaaacactg ggat 54

<210> 25

<211> 54

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<400> 25

tggatttgta aaggggcaga tggatgcgtt attttccttc acttttcgta tcca 54

<210> 26

<211> 65

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<400> 26

cagctatgac catgattacg aattcgagct cggtacccct ctggcgcatc gaacaggtcg 60

aagga 65

<210> 27

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<400> 27

gtctgggggt gagcgcggat 20

<210> 28

<211> 27

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<400> 28

ctctggcgca tcgaacaggt cgaagga 27

<210> 29

<211> 647

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<400> 29

cagtgccaag cttgcatgcc tgcaggtcga ctctagatga ctattaatgt ctccgaacta 60

cttgccaaag tccccacggg tctactgatt ggtgattcct gggtggaagc atccgagggc 120

ggtactttcg atgtggaaaa cccagcgacg ggtgaaacaa tcgcaacgct cgcgtctgct 180

acttccgagg atgcactggc tgctcttgat gctgcatgcg ctgttcaggc cgagtgggct 240

aggacgccag cgcgcgagcg ttctaatatt ttacgacgcg gtttcgagct cgtcgcggaa 300

cgtgcagaag agttcgccac cctcatgacc ttggaaatgg gcaaaccttt ggctgaagct 360

cgcggcgaag tcacctacgg caacgaattc ctgcgctggt tctctgagga agcagtccgc 420

ctctacggcc gctacggtgc taccccagaa ggcaacctgc gcatgatgac cacccgcaaa 480

ccagttggcc cctgcctgtt gatcacccca tggaacttcc cactagcaat ggccacccgt 540

aaggttgcac ccgccatcgc tgcaggttgt gtcatggtgc tcaagccagc tcgcctgacc 600

ccgctgacct cccagtattt tgcccagacc atacttgatg ccggtct 647

<210> 30

<211> 927

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<400> 30

tgcccagacc atacttgatg ccggtcttcc agcaggtgtc ctcaatgtgg tctccggtgc 60

ttccgcctct gcgatttcca acccgattat ggaagacgat cgccttcgta aagtctcatt 120

caccggctcc accccagttg gccagcagct gctcaaaaag gctgccgata aagttctgcg 180

cacctccatg gaactcggcg gcaacgcacc tttcattgtc ttcgaggacg ccgacctaga 240

tctcgcgatc gaaggtgcca tgggcgcaaa aatgcgcaac atcggcgaag cttgcaccgc 300

agccaaccgt ttcctagtcc acgaatccgt cgccgatgaa ttcggccgac gcttcgcagc 360

ccgcctcgag gaacaagtcc taggcaacgg cctcgacgaa ggcgtcaccg taggcccatt 420

ggttgaggaa aaagcacgaa acagcgttgc atcgcttgtc gacgccgccg tctccgaagg 480

tgccaccgtc ctcaccggtg gcaaggccgg cacaggtgca ggctacttct acgaaccaac 540

ggtgctcacg ggagtttcaa cagatgcagc catcctgaac gaagagatct tcggtcccgt 600

cgcaccgatc gtcaccttct ctgatgaagc tgaagctctg cgcctagcca attccaccga 660

atacggcctg gcctcctacg tgttcaccca agacacctca cgcatcttcc gcgtctccga 720

cggcctcgag ttcggcctag tgggcgtcaa ctccggtgtc atctctaacg ccgctgcacc 780

ttttggtggc gtaaaacaat ccggaatggg ccgcgaaggt ggtctcgaag gaattgaaga 840

gtacacctcc gtgcagtaca tcggtatccg ggatccttac gccggctagg ggtaccgagc 900

tcgaattcgt aatcatggtc atagctg 927

<210> 31

<211> 1547

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<400> 31

cagtgccaag cttgcatgcc tgcaggtcga ctctagatga ctattaatgt ctccgaacta 60

cttgccaaag tccccacggg tctactgatt ggtgattcct gggtggaagc atccgagggc 120

ggtactttcg atgtggaaaa cccagcgacg ggtgaaacaa tcgcaacgct cgcgtctgct 180

acttccgagg atgcactggc tgctcttgat gctgcatgcg ctgttcaggc cgagtgggct 240

aggacgccag cgcgcgagcg ttctaatatt ttacgacgcg gtttcgagct cgtcgcggaa 300

cgtgcagaag agttcgccac cctcatgacc ttggaaatgg gcaaaccttt ggctgaagct 360

cgcggcgaag tcacctacgg caacgaattc ctgcgctggt tctctgagga agcagtccgc 420

ctctacggcc gctacggtgc taccccagaa ggcaacctgc gcatgatgac cacccgcaaa 480

ccagttggcc cctgcctgtt gatcacccca tggaacttcc cactagcaat ggccacccgt 540

aaggttgcac ccgccatcgc tgcaggttgt gtcatggtgc tcaagccagc tcgcctgacc 600

ccgctgacct cccagtattt tgcccagacc atacttgatg ccggtcttcc agcaggtgtc 660

ctcaatgtgg tctccggtgc ttccgcctct gcgatttcca acccgattat ggaagacgat 720

cgccttcgta aagtctcatt caccggctcc accccagttg gccagcagct gctcaaaaag 780

gctgccgata aagttctgcg cacctccatg gaactcggcg gcaacgcacc tttcattgtc 840

ttcgaggacg ccgacctaga tctcgcgatc gaaggtgcca tgggcgcaaa aatgcgcaac 900

atcggcgaag cttgcaccgc agccaaccgt ttcctagtcc acgaatccgt cgccgatgaa 960

ttcggccgac gcttcgcagc ccgcctcgag gaacaagtcc taggcaacgg cctcgacgaa 1020

ggcgtcaccg taggcccatt ggttgaggaa aaagcacgaa acagcgttgc atcgcttgtc 1080

gacgccgccg tctccgaagg tgccaccgtc ctcaccggtg gcaaggccgg cacaggtgca 1140

ggctacttct acgaaccaac ggtgctcacg ggagtttcaa cagatgcagc catcctgaac 1200

gaagagatct tcggtcccgt cgcaccgatc gtcaccttct ctgatgaagc tgaagctctg 1260

cgcctagcca attccaccga atacggcctg gcctcctacg tgttcaccca agacacctca 1320

cgcatcttcc gcgtctccga cggcctcgag ttcggcctag tgggcgtcaa ctccggtgtc 1380

atctctaacg ccgctgcacc ttttggtggc gtaaaacaat ccggaatggg ccgcgaaggt 1440

ggtctcgaag gaattgaaga gtacacctcc gtgcagtaca tcggtatccg ggatccttac 1500

gccggctagg ggtaccgagc tcgaattcgt aatcatggtc atagctg 1547

<210> 32

<211> 1554

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<400> 32

cagtgccaag cttgcatgcc tgcaggtcga ctctagatga ctattaatgt ctccgaacta 60

cttgccaaag tccccacggg tctactgatt ggtgattcct gggtggaagc atccgagggc 120

ggtactttcg atgtggaaaa cccagcgacg ggtgaaacaa tcgcaacgct cgcgtctgct 180

acttccgagg atgcactggc tgctcttgat gctgcatgcg ctgttcaggc cgagtgggct 240

aggacgccag cgcgcgagcg ttctaatatt ttacgacgcg gtttcgagct cgtcgcggaa 300

cgtgcagaag agttcgccac cctcatgacc ttggaaatgg gcaaaccttt ggctgaagct 360

cgcggcgaag tcacctacgg caacgaattc ctgcgctggt tctctgagga agcagtccgc 420

ctctacggcc gctacggtgc taccccagaa ggcaacctgc gcatgatgac cacccgcaaa 480

ccagttggcc cctgcctgtt gatcacccca tggaacttcc cactagcaat ggccacccgt 540

aaggttgcac ccgccatcgc tgcaggttgt gtcatggtgc tcaagccagc tcgcctgacc 600

ccgctgacct cccagtattt tgcccagacc atacttgatg ccggtcttcc agcaggtgtc 660

ctcaatgtgg tctccggtgc ttccgcctct gcgatttcca acccgattat ggaagacgat 720

cgccttcgta aagtctcatt caccggctcc accccagttg gccagcagct gctcaaaaag 780

gctgccgata aagttctgcg cacctccatg gaactcggcg gcaacgcacc tttcattgtc 840

ttcgaggacg ccgacctaga tctcgcgatc gaaggtgcca tgggcgcaaa aatgcgcaac 900

atcggcgaag cttgcaccgc agccaaccgt ttcctagtcc acgaatccgt cgccgatgaa 960

ttcggccgac gcttcgcagc ccgcctcgag gaacaagtcc taggcaacgg cctcgacgaa 1020

ggcgtcaccg taggcccatt ggttgaggaa aaagcacgaa acagcgttgc atcgcttgtc 1080

gacgccgccg tctccgaagg tgccaccgtc ctcaccggtg gcaaggccgg cacaggtgca 1140

ggctacttct acgaaccaac ggtgctcacg ggagtttcaa cagatgcagc catcctgaac 1200

gaagagatct tcggtcccgt cgcaccgatc gtcaccttct ctgatgaagc tgaagctctg 1260

cgcctagcca attccaccga atacggcctg gcctcctacg tgttcaccca agacacctca 1320

cgcatcttcc gcgtctccga cggcctcgag ttcggcctag tgggcgtcaa ctccggtgtc 1380

atctctaacg ccgctgcacc ttttggtggc gtaaaacaat ccggaatggg ccgcgaaggt 1440

ggtctcgaag gaattgaaga gtacacctcc gtgcagtaca tcggtatccg ggatccttac 1500

gccggctagg ggtaccgagc tcgaattcgt aatcatggtc atagctgttt cctg 1554

<210> 33

<211> 261

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<400> 33

agaaggcaac ctgcgcatga tgaccacccg caaaccagtt ggcccctgcc tgttgatcac 60

cccatggaac ttcccactag caatggccac ccgtaaggtt gcacccgcca tcgctgcagg 120

ttgtgtcatg gtgctcaagc cagctcgcct gaccccgctg acctcccagt attttgccca 180

gaccatgctt gatgccggtc ttccagcagg tgtcctcaat gtggtctccg gtgcttccgc 240

ctctgcgatt tccaacccga t 261

<210> 34

<211> 806

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<400> 34

cagtgccaag cttgcatgcc tgcaggtcga ctctaggacc cgcttgccat acgaagtcct 60

ggagaagatc tccacccgca tcaccaacga agttccagac gtaaaccgcg tggttttgga 120

cgtaacctcc aagccaccag gaaccatcga atgggagtag gccttaaatg agccttcgtt 180

aagcggcaat caccttatcg gtgattgccg ctttcccatt tctccgggtt ttctggaact 240

ttttgggcgt atgctgggaa tgatcttatt attttgattt cagaaagcag gagagaccag 300

atgagcgaaa tccttgaaac ctactgggca ccccacttcg gaaacaccga tgaagccgca 360

gcactcgttt catacttggc acaagcttcc ggtgatccta ttgaggttca caccctgttc 420

ggggatttag gtttagacgg actctctgga aactacaccg acactgagat cgacggctac 480

ggcgacgcat tcctgctggt tgcagcacta gcagtgttga tggctgaaaa caaagcatcc 540

ggcggcgtga atctgggtga agttggggga gctgataaat cgatccggct gcatgttgaa 600

tccaaggaaa acacccagat caacaccgca ttgaagtact ttgcgctttc cccagaagac 660

cacgcagcgg cagatcgctt cgatgaggat gacctgtctg agcttgccaa cttgagtgaa 720

gagctgcgcg gacagctgga ctaattgctg cccgtttaag gagtccgatt cttcagatga 780

gtagatgtag tgctcgtcgt ggtagg 806

<210> 35

<211> 1777

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<400> 35

gattcttcag atgagtagat gtagtgctcg tcgtggtagg tgcgcagcag agattcaggc 60

gcacgaccag aaagcacgtg gctgagcttc cagccggacg ttgtggccgg agtaaaaatc 120

catccaaact ttccgcgatg ctggtaaacc tgtggatgtc aatgcctttg atttgaacta 180

agcacaggac tacctcgacg ccggcgccaa ctttgtccga gtcggtgccg atgtccagca 240

actcaacgct gctggatacg aaaagtgaag gaaaataacg catcatgact attaatgtct 300

ccgaactact tgccaaagtc cccacgggtc tactgattgg tgattcctgg gtggaagcat 360

ccgagggcgg tactttcgat gtggaaaacc cagcgacggg tgaaacaatc gcaacgctcg 420

cgtctgctac ttccgaggat gcactggctg ctcttgatgc tgcatgcgct gttcaggccg 480

agtgggctag gacgccagcg cgcgagcgtt ctaatatttt acgacgcggt ttcgagctcg 540

tcgcggaacg tgcagaagag ttcgccaccc tcatgacctt ggaaatgggc aaacctttgg 600

ctgaagctcg cggcgaagtc acctacggca acgaattcct gcgctggttc tctgaggaag 660

cagtccgcct ctacggccgc tacggtgcta ccccagaagg caacctgcgc atgatgacca 720

cccgcaaacc agttggcccc tgcctgttga tcaccccatg gaacttccca ctagcaatgg 780

ccacccgtaa ggttgcaccc gccatcgctg caggttgtgt catggtgctc aagccagctc 840

gcctgacccc gctgacctcc cagtattttg cccagaccat gcttgatgcc ggtcttccag 900

caggtgtcct caatgtggtc tccggtgctt ccgcctctgc gatttccaac ccgattatgg 960

aagacgatcg ccttcgtaaa gtctcattca ccggctccac cccagttggc cagcagctgc 1020

tcaaaaaggc tgccgataaa gttctgcgca cctccatgga actcggcggc aacgcacctt 1080

tcattgtctt cgaggacgcc gacctagatc tcgcgatcga aggtgccatg ggcgcaaaaa 1140

tgcgcaacat cggcgaagct tgcaccgcag ccaaccgttt cctagtccac gaatccgtcg 1200

ccgatgaatt cggccgacgc ttcgcagccc gcctcgagga acaagtccta ggcaacggcc 1260

tcgacgaagg cgtcaccgta ggcccattgg ttgaggaaaa agcacgaaac agcgttgcat 1320

cgcttgtcga cgccgccgtc tccgaaggtg ccaccgtcct caccggtggc aaggccggca 1380

caggtgcagg ctacttctac gaaccaacgg tgctcacggg agtttcaaca gatgcagcca 1440

tcctgaacga agagatcttc ggtcccgtcg caccgatcgt caccttctct gatgaagctg 1500

aagctctgcg cctagccaat tccaccgaat acggcctggc ctcctacgtg ttcacccaag 1560

acacctcacg catcttccgc gtctccgacg gcctcgagtt cggcctagtg ggcgtcaact 1620

ccggtgtcat ctctaacgcc gctgcacctt ttggtggcgt aaaacaatcc ggaatgggcc 1680

gcgaaggtgg tctcgaagga attgaagagt acacctccgt gcagtacatc ggtatccggg 1740

atccttacgc cggctagttc gtgggcactc tggtttg 1777

<210> 36

<211> 1777

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<400> 36

gattcttcag atgagtagat gtagtgctcg tcgtggtagg tgcgcagcag agattcaggc 60

gcacgaccag aaagcacgtg gctgagcttc cagccggacg ttgtggccgg agtaaaaatc 120

catccaaact ttccgcgatg ctggtaaacc tgtggatgtc aatgcctttg atttgaacta 180

agcacaggac tacctcgacg ccggcgccaa ctttgtccga gtcggtgccg atgtccagca 240

actcaacgct gctggatacg aaaagtgaag gaaaataacg catcatgact attaatgtct 300

ccgaactact tgccaaagtc cccacgggtc tactgattgg tgattcctgg gtggaagcat 360

ccgagggcgg tactttcgat gtggaaaacc cagcgacggg tgaaacaatc gcaacgctcg 420

cgtctgctac ttccgaggat gcactggctg ctcttgatgc tgcatgcgct gttcaggccg 480

agtgggctag gacgccagcg cgcgagcgtt ctaatatttt acgacgcggt ttcgagctcg 540

tcgcggaacg tgcagaagag ttcgccaccc tcatgacctt ggaaatgggc aaacctttgg 600

ctgaagctcg cggcgaagtc acctacggca acgaattcct gcgctggttc tctgaggaag 660

cagtccgcct ctacggccgc tacggtgcta ccccagaagg caacctgcgc atgatgacca 720

cccgcaaacc agttggcccc tgcctgttga tcaccccatg gaacttccca ctagcaatgg 780

ccacccgtaa ggttgcaccc gccatcgctg caggttgtgt catggtgctc aagccagctc 840

gcctgacccc gctgacctcc cagtattttg cccagaccat acttgatgcc ggtcttccag 900

caggtgtcct caatgtggtc tccggtgctt ccgcctctgc gatttccaac ccgattatgg 960

aagacgatcg ccttcgtaaa gtctcattca ccggctccac cccagttggc cagcagctgc 1020

tcaaaaaggc tgccgataaa gttctgcgca cctccatgga actcggcggc aacgcacctt 1080

tcattgtctt cgaggacgcc gacctagatc tcgcgatcga aggtgccatg ggcgcaaaaa 1140

tgcgcaacat cggcgaagct tgcaccgcag ccaaccgttt cctagtccac gaatccgtcg 1200

ccgatgaatt cggccgacgc ttcgcagccc gcctcgagga acaagtccta ggcaacggcc 1260

tcgacgaagg cgtcaccgta ggcccattgg ttgaggaaaa agcacgaaac agcgttgcat 1320

cgcttgtcga cgccgccgtc tccgaaggtg ccaccgtcct caccggtggc aaggccggca 1380

caggtgcagg ctacttctac gaaccaacgg tgctcacggg agtttcaaca gatgcagcca 1440

tcctgaacga agagatcttc ggtcccgtcg caccgatcgt caccttctct gatgaagctg 1500

aagctctgcg cctagccaat tccaccgaat acggcctggc ctcctacgtg ttcacccaag 1560

acacctcacg catcttccgc gtctccgacg gcctcgagtt cggcctagtg ggcgtcaact 1620

ccggtgtcat ctctaacgcc gctgcacctt ttggtggcgt aaaacaatcc ggaatgggcc 1680

gcgaaggtgg tctcgaagga attgaagagt acacctccgt gcagtacatc ggtatccggg 1740

atccttacgc cggctagttc gtgggcactc tggtttg 1777

<210> 37

<211> 788

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<400> 37

gggatcctta cgccggctag ttcgtgggca ctctggtttg gttaccagga tgggttagtc 60

attctgatca gcgaattcca cgttcacatc gccaattcca gagttcacaa ccagattcag 120

cattggacct tctagatcag cattgtgggc ggtgagatct ccaacatcac agcgcgctgt 180

gcccacaccg gcggtacaac ttaggctcac gggcacatca tcgggcaggg tgaccatgac 240

ttcgccgatc cctgaggtga tttggatgtt ttgttcctga tccaattggg tgaggtggct 300

gaaatcgagg ttcatttcac ccacgccaga ggtgtagctg ctgaggagtt catcgttggt 360

ggggatgaga ttgacatcgc cgattccagg gtcgtcttca aagtagatgg gatcgatatt 420

tgaaataaac aggcctgcga gggcgctcat gacaactccg gtaccaacta caccgccgac 480

aatccatggc cacacatggc gctttttctg aggcttttgt ggagggactt gtacatccca 540

ggtgttgtat tggttttggg caagtggatc ccaatgaggc gcttcggggg tttgttgcgc 600

gaagggtgca tagtagccct caacgggggt gatagtgctt agatctggtt ggggttgtgg 660

gtagagatct tcgtttttca tggtggcatc ctcagaaaca gtgaattcag tggtgagtag 720

tccgcggggt ggaagtggtt gtttcttatg gggtaccgag ctcgaattcg taatcatggt 780

catagctg 788

<210> 38

<211> 3291

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<400> 38

cagtgccaag cttgcatgcc tgcaggtcga ctctaggacc cgcttgccat acgaagtcct 60

ggagaagatc tccacccgca tcaccaacga agttccagac gtaaaccgcg tggttttgga 120

cgtaacctcc aagccaccag gaaccatcga atgggagtag gccttaaatg agccttcgtt 180

aagcggcaat caccttatcg gtgattgccg ctttcccatt tctccgggtt ttctggaact 240

ttttgggcgt atgctgggaa tgatcttatt attttgattt cagaaagcag gagagaccag 300

atgagcgaaa tccttgaaac ctactgggca ccccacttcg gaaacaccga tgaagccgca 360

gcactcgttt catacttggc acaagcttcc ggtgatccta ttgaggttca caccctgttc 420

ggggatttag gtttagacgg actctctgga aactacaccg acactgagat cgacggctac 480

ggcgacgcat tcctgctggt tgcagcacta gcagtgttga tggctgaaaa caaagcatcc 540

ggcggcgtga atctgggtga agttggggga gctgataaat cgatccggct gcatgttgaa 600

tccaaggaaa acacccagat caacaccgca ttgaagtact ttgcgctttc cccagaagac 660

cacgcagcgg cagatcgctt cgatgaggat gacctgtctg agcttgccaa cttgagtgaa 720

gagctgcgcg gacagctgga ctaattgctg cccgtttaag gagtccgatt cttcagatga 780

gtagatgtag tgctcgtcgt ggtaggtgcg cagcagagat tcaggcgcac gaccagaaag 840

cacgtggctg agcttccagc cggacgttgt ggccggagta aaaatccatc caaactttcc 900

gcgatgctgg taaacctgtg gatgtcaatg cctttgattt gaactaagca caggactacc 960

tcgacgccgg cgccaacttt gtccgagtcg gtgccgatgt ccagcaactc aacgctgctg 1020

gatacgaaaa gtgaaggaaa ataacgcatc atgactatta atgtctccga actacttgcc 1080

aaagtcccca cgggtctact gattggtgat tcctgggtgg aagcatccga gggcggtact 1140

ttcgatgtgg aaaacccagc gacgggtgaa acaatcgcaa cgctcgcgtc tgctacttcc 1200

gaggatgcac tggctgctct tgatgctgca tgcgctgttc aggccgagtg ggctaggacg 1260

ccagcgcgcg agcgttctaa tattttacga cgcggtttcg agctcgtcgc ggaacgtgca 1320

gaagagttcg ccaccctcat gaccttggaa atgggcaaac ctttggctga agctcgcggc 1380

gaagtcacct acggcaacga attcctgcgc tggttctctg aggaagcagt ccgcctctac 1440

ggccgctacg gtgctacccc agaaggcaac ctgcgcatga tgaccacccg caaaccagtt 1500

ggcccctgcc tgttgatcac cccatggaac ttcccactag caatggccac ccgtaaggtt 1560

gcacccgcca tcgctgcagg ttgtgtcatg gtgctcaagc cagctcgcct gaccccgctg 1620

acctcccagt attttgccca gaccatgctt gatgccggtc ttccagcagg tgtcctcaat 1680

gtggtctccg gtgcttccgc ctctgcgatt tccaacccga ttatggaaga cgatcgcctt 1740

cgtaaagtct cattcaccgg ctccacccca gttggccagc agctgctcaa aaaggctgcc 1800

gataaagttc tgcgcacctc catggaactc ggcggcaacg cacctttcat tgtcttcgag 1860

gacgccgacc tagatctcgc gatcgaaggt gccatgggcg caaaaatgcg caacatcggc 1920

gaagcttgca ccgcagccaa ccgtttccta gtccacgaat ccgtcgccga tgaattcggc 1980

cgacgcttcg cagcccgcct cgaggaacaa gtcctaggca acggcctcga cgaaggcgtc 2040

accgtaggcc cattggttga ggaaaaagca cgaaacagcg ttgcatcgct tgtcgacgcc 2100

gccgtctccg aaggtgccac cgtcctcacc ggtggcaagg ccggcacagg tgcaggctac 2160

ttctacgaac caacggtgct cacgggagtt tcaacagatg cagccatcct gaacgaagag 2220

atcttcggtc ccgtcgcacc gatcgtcacc ttctctgatg aagctgaagc tctgcgccta 2280

gccaattcca ccgaatacgg cctggcctcc tacgtgttca cccaagacac ctcacgcatc 2340

ttccgcgtct ccgacggcct cgagttcggc ctagtgggcg tcaactccgg tgtcatctct 2400

aacgccgctg caccttttgg tggcgtaaaa caatccggaa tgggccgcga aggtggtctc 2460

gaaggaattg aagagtacac ctccgtgcag tacatcggta tccgggatcc ttacgccggc 2520

tagttcgtgg gcactctggt ttggttacca ggatgggtta gtcattctga tcagcgaatt 2580

ccacgttcac atcgccaatt ccagagttca caaccagatt cagcattgga ccttctagat 2640

cagcattgtg ggcggtgaga tctccaacat cacagcgcgc tgtgcccaca ccggcggtac 2700

aacttaggct cacgggcaca tcatcgggca gggtgaccat gacttcgccg atccctgagg 2760

tgatttggat gttttgttcc tgatccaatt gggtgaggtg gctgaaatcg aggttcattt 2820

cacccacgcc agaggtgtag ctgctgagga gttcatcgtt ggtggggatg agattgacat 2880

cgccgattcc agggtcgtct tcaaagtaga tgggatcgat atttgaaata aacaggcctg 2940

cgagggcgct catgacaact ccggtaccaa ctacaccgcc gacaatccat ggccacacat 3000

ggcgcttttt ctgaggcttt tgtggaggga cttgtacatc ccaggtgttg tattggtttt 3060

gggcaagtgg atcccaatga ggcgcttcgg gggtttgttg cgcgaagggt gcatagtagc 3120

cctcaacggg ggtgatagtg cttagatctg gttggggttg tgggtagaga tcttcgtttt 3180

tcatggtggc atcctcagaa acagtgaatt cagtggtgag tagtccgcgg ggtggaagtg 3240

gttgtttctt atggggtacc gagctcgaat tcgtaatcat ggtcatagct g 3291

<210> 39

<211> 3291

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<400> 39

cagtgccaag cttgcatgcc tgcaggtcga ctctaggacc cgcttgccat acgaagtcct 60

ggagaagatc tccacccgca tcaccaacga agttccagac gtaaaccgcg tggttttgga 120

cgtaacctcc aagccaccag gaaccatcga atgggagtag gccttaaatg agccttcgtt 180

aagcggcaat caccttatcg gtgattgccg ctttcccatt tctccgggtt ttctggaact 240

ttttgggcgt atgctgggaa tgatcttatt attttgattt cagaaagcag gagagaccag 300

atgagcgaaa tccttgaaac ctactgggca ccccacttcg gaaacaccga tgaagccgca 360

gcactcgttt catacttggc acaagcttcc ggtgatccta ttgaggttca caccctgttc 420

ggggatttag gtttagacgg actctctgga aactacaccg acactgagat cgacggctac 480

ggcgacgcat tcctgctggt tgcagcacta gcagtgttga tggctgaaaa caaagcatcc 540

ggcggcgtga atctgggtga agttggggga gctgataaat cgatccggct gcatgttgaa 600

tccaaggaaa acacccagat caacaccgca ttgaagtact ttgcgctttc cccagaagac 660

cacgcagcgg cagatcgctt cgatgaggat gacctgtctg agcttgccaa cttgagtgaa 720

gagctgcgcg gacagctgga ctaattgctg cccgtttaag gagtccgatt cttcagatga 780

gtagatgtag tgctcgtcgt ggtaggtgcg cagcagagat tcaggcgcac gaccagaaag 840

cacgtggctg agcttccagc cggacgttgt ggccggagta aaaatccatc caaactttcc 900

gcgatgctgg taaacctgtg gatgtcaatg cctttgattt gaactaagca caggactacc 960

tcgacgccgg cgccaacttt gtccgagtcg gtgccgatgt ccagcaactc aacgctgctg 1020

gatacgaaaa gtgaaggaaa ataacgcatc atgactatta atgtctccga actacttgcc 1080

aaagtcccca cgggtctact gattggtgat tcctgggtgg aagcatccga gggcggtact 1140

ttcgatgtgg aaaacccagc gacgggtgaa acaatcgcaa cgctcgcgtc tgctacttcc 1200

gaggatgcac tggctgctct tgatgctgca tgcgctgttc aggccgagtg ggctaggacg 1260

ccagcgcgcg agcgttctaa tattttacga cgcggtttcg agctcgtcgc ggaacgtgca 1320

gaagagttcg ccaccctcat gaccttggaa atgggcaaac ctttggctga agctcgcggc 1380

gaagtcacct acggcaacga attcctgcgc tggttctctg aggaagcagt ccgcctctac 1440

ggccgctacg gtgctacccc agaaggcaac ctgcgcatga tgaccacccg caaaccagtt 1500

ggcccctgcc tgttgatcac cccatggaac ttcccactag caatggccac ccgtaaggtt 1560

gcacccgcca tcgctgcagg ttgtgtcatg gtgctcaagc cagctcgcct gaccccgctg 1620

acctcccagt attttgccca gaccatactt gatgccggtc ttccagcagg tgtcctcaat 1680

gtggtctccg gtgcttccgc ctctgcgatt tccaacccga ttatggaaga cgatcgcctt 1740

cgtaaagtct cattcaccgg ctccacccca gttggccagc agctgctcaa aaaggctgcc 1800

gataaagttc tgcgcacctc catggaactc ggcggcaacg cacctttcat tgtcttcgag 1860

gacgccgacc tagatctcgc gatcgaaggt gccatgggcg caaaaatgcg caacatcggc 1920

gaagcttgca ccgcagccaa ccgtttccta gtccacgaat ccgtcgccga tgaattcggc 1980

cgacgcttcg cagcccgcct cgaggaacaa gtcctaggca acggcctcga cgaaggcgtc 2040

accgtaggcc cattggttga ggaaaaagca cgaaacagcg ttgcatcgct tgtcgacgcc 2100

gccgtctccg aaggtgccac cgtcctcacc ggtggcaagg ccggcacagg tgcaggctac 2160

ttctacgaac caacggtgct cacgggagtt tcaacagatg cagccatcct gaacgaagag 2220

atcttcggtc ccgtcgcacc gatcgtcacc ttctctgatg aagctgaagc tctgcgccta 2280

gccaattcca ccgaatacgg cctggcctcc tacgtgttca cccaagacac ctcacgcatc 2340

ttccgcgtct ccgacggcct cgagttcggc ctagtgggcg tcaactccgg tgtcatctct 2400

aacgccgctg caccttttgg tggcgtaaaa caatccggaa tgggccgcga aggtggtctc 2460

gaaggaattg aagagtacac ctccgtgcag tacatcggta tccgggatcc ttacgccggc 2520

tagttcgtgg gcactctggt ttggttacca ggatgggtta gtcattctga tcagcgaatt 2580

ccacgttcac atcgccaatt ccagagttca caaccagatt cagcattgga ccttctagat 2640

cagcattgtg ggcggtgaga tctccaacat cacagcgcgc tgtgcccaca ccggcggtac 2700

aacttaggct cacgggcaca tcatcgggca gggtgaccat gacttcgccg atccctgagg 2760

tgatttggat gttttgttcc tgatccaatt gggtgaggtg gctgaaatcg aggttcattt 2820

cacccacgcc agaggtgtag ctgctgagga gttcatcgtt ggtggggatg agattgacat 2880

cgccgattcc agggtcgtct tcaaagtaga tgggatcgat atttgaaata aacaggcctg 2940

cgagggcgct catgacaact ccggtaccaa ctacaccgcc gacaatccat ggccacacat 3000

ggcgcttttt ctgaggcttt tgtggaggga cttgtacatc ccaggtgttg tattggtttt 3060

gggcaagtgg atcccaatga ggcgcttcgg gggtttgttg cgcgaagggt gcatagtagc 3120

cctcaacggg ggtgatagtg cttagatctg gttggggttg tgggtagaga tcttcgtttt 3180

tcatggtggc atcctcagaa acagtgaatt cagtggtgag tagtccgcgg ggtggaagtg 3240

gttgtttctt atggggtacc gagctcgaat tcgtaatcat ggtcatagct g 3291

<210> 40

<211> 1970

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<400> 40

gtccaaggtg acggccgcac ctacggacac ccaatcgtgc tgcgcccagt atcttccgaa 60

gacgcaatga ccgccgactg gacccgcttg ccatacgaag tcctggagaa gatctccacc 120

cgcatcacca acgaagttcc agacgtaaac cgcgtggttt tggacgtaac ctccaagcca 180

ccaggaacca tcgaatggga gtaggcctta aatgagcctt cgttaagcgg caatcacctt 240

atcggtgatt gccgctttcc catttctccg ggttttctgg aactttttgg gcgtatgctg 300

ggaatgatct tattattttg atttcagaaa gcaggagaga ccagatgagc gaaatccttg 360

aaacctactg ggcaccccac ttcggaaaca ccgatgaagc cgcagcactc gtttcatact 420

tggcacaagc ttccggtgat cctattgagg ttcacaccct gttcggggat ttaggtttag 480

acggactctc tggaaactac accgacactg agatcgacgg ctacggcgac gcattcctgc 540

tggttgcagc actagcagtg ttgatggctg aaaacaaagc atccggcggc gtgaatctgg 600

gtgaagttgg gggagctgat aaatcgatcc ggctgcatgt tgaatccaag gaaaacaccc 660

agatcaacac cgcattgaag tactttgcgc tttccccaga agaccacgca gcggcagatc 720

gcttcgatga ggatgacctg tctgagcttg ccaacttgag tgaagagctg cgcggacagc 780

tggactaatt gctgcccgtt taaggagtcc gattcttcag atgagtagat gtagtgctcg 840

tcgtggtagg tgcgcagcag agattcaggc gcacgaccag aaagcacgtg gctgagcttc 900

cagccggacg ttgtggccgg agtaaaaatc catccaaact ttccgcgatg ctggtaaacc 960

tgtggatgtc aatgcctttg atttgaacta agcacaggac tacctcgacg ccggcgccaa 1020

ctttgtccga gtcggtgccg atgtccagca actcaacgct gctggatacg aaaagtgaag 1080

gaaaataacg catcatgact attaatgtct ccgaactact tgccaaagtc cccacgggtc 1140

tactgattgg tgattcctgg gtggaagcat ccgagggcgg tactttcgat gtggaaaacc 1200

cagcgacggg tgaaacaatc gcaacgctcg cgtctgctac ttccgaggat gcactggctg 1260

ctcttgatgc tgcatgcgct gttcaggccg agtgggctag gacgccagcg cgcgagcgtt 1320

ctaatatttt acgacgcggt ttcgagctcg tcgcggaacg tgcagaagag ttcgccaccc 1380

tcatgacctt ggaaatgggc aaacctttgg ctgaagctcg cggcgaagtc acctacggca 1440

acgaattcct gcgctggttc tctgaggaag cagtccgcct ctacggccgc tacggtgcta 1500

ccccagaagg caacctgcgc atgatgacca cccgcaaacc agttggcccc tgcctgttga 1560

tcaccccatg gaacttccca ctagcaatgg ccacccgtaa ggttgcaccc gccatcgctg 1620

caggttgtgt catggtgctc aagccagctc gcctgacccc gctgacctcc cagtattttg 1680

cccagaccat gcttgatgcc ggtcttccag caggtgtcct caatgtggtc tccggtgctt 1740

ccgcctctgc gatttccaac ccgattatgg aagacgatcg ccttcgtaaa gtctcattca 1800

ccggctccac cccagttggc cagcagctgc tcaaaaaggc tgccgataaa gttctgcgca 1860

cctccatgga actcggcggc aacgcacctt tcattgtctt cgaggacgcc gacctagatc 1920

tcgcgatcga aggtgccatg ggcgcaaaaa tgcgcaacat cggcgaagct 1970

<210> 41

<211> 1758

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<400> 41

aggttgcacc cgccatcgct gcaggttgtg tcatggtgct caagccagct cgcctgaccc 60

cgctgacctc ccagtatttt gcccagacca tgcttgatgc cggtcttcca gcaggtgtcc 120

tcaatgtggt ctccggtgct tccgcctctg cgatttccaa cccgattatg gaagacgatc 180

gccttcgtaa agtctcattc accggctcca ccccagttgg ccagcagctg ctcaaaaagg 240

ctgccgataa agttctgcgc acctccatgg aactcggcgg caacgcacct ttcattgtct 300

tcgaggacgc cgacctagat ctcgcgatcg aaggtgccat gggcgcaaaa atgcgcaaca 360

tcggcgaagc ttgcaccgca gccaaccgtt tcctagtcca cgaatccgtc gccgatgaat 420

tcggccgacg cttcgcagcc cgcctcgagg aacaagtcct aggcaacggc ctcgacgaag 480

gcgtcaccgt aggcccattg gttgaggaaa aagcacgaaa cagcgttgca tcgcttgtcg 540

acgccgccgt ctccgaaggt gccaccgtcc tcaccggtgg caaggccggc acaggtgcag 600

gctacttcta cgaaccaacg gtgctcacgg gagtttcaac agatgcagcc atcctgaacg 660

aagagatctt cggtcccgtc gcaccgatcg tcaccttctc tgatgaagct gaagctctgc 720

gcctagccaa ttccaccgaa tacggcctgg cctcctacgt gttcacccaa gacacctcac 780

gcatcttccg cgtctccgac ggcctcgagt tcggcctagt gggcgtcaac tccggtgtca 840

tctctaacgc cgctgcacct tttggtggcg taaaacaatc cggaatgggc cgcgaaggtg 900

gtctcgaagg aattgaagag tacacctccg tgcagtacat cggtatccgg gatccttacg 960

ccggctagtt cgtgggcact ctggtttggt taccaggatg ggttagtcat tctgatcagc 1020

gaattccacg ttcacatcgc caattccaga gttcacaacc agattcagca ttggaccttc 1080

tagatcagca ttgtgggcgg tgagatctcc aacatcacag cgcgctgtgc ccacaccggc 1140

ggtacaactt aggctcacgg gcacatcatc gggcagggtg accatgactt cgccgatccc 1200

tgaggtgatt tggatgtttt gttcctgatc caattgggtg aggtggctga aatcgaggtt 1260

catttcaccc acgccagagg tgtagctgct gaggagttca tcgttggtgg ggatgagatt 1320

gacatcgccg attccagggt cgtcttcaaa gtagatggga tcgatatttg aaataaacag 1380

gcctgcgagg gcgctcatga caactccggt accaactaca ccgccgacaa tccatggcca 1440

cacatggcgc tttttctgag gcttttgtgg agggacttgt acatcccagg tgttgtattg 1500

gttttgggca agtggatccc aatgaggcgc ttcgggggtt tgttgcgcga agggtgcata 1560

gtagccctca acgggggtga tagtgcttag atctggttgg ggttgtgggt agagatcttc 1620

gtttttcatg gtggcatcct cagaaacagt gaattcagtg gtgagtagtc cgcggggtgg 1680

aagtggttgt ttcttatgca acgcccacca catggctaaa aggcaaaggt aagtaatggc 1740

tgctgctggg ccgaatat 1758

<210> 42

<211> 1807

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<400> 42

gcttgcatgc ctgcaggtcg actctagagg atccccgtag tgctcgtcgt ggtaggtgcg 60

cagcagagat tcaggcgcac gaccagaaag cacgtggctg agcttccagc cggacgttgt 120

ggccggagta aaaatccatc caaactttcc gcgatgctgg taaacctgtg gatgtcaatg 180

cctttgattt gaactaagca caggactacc tcgacgccgg cgccaacttt gtccgagtcg 240

gtgccgatgt ccagcaactc aacgctgctg gatacgaaaa gtgaaggaaa ataacgcatc 300

atgactatta atgtctccga actacttgcc aaagtcccca cgggtctact gattggtgat 360

tcctgggtgg aagcatccga gggcggtact ttcgatgtgg aaaacccagc gacgggtgaa 420

acaatcgcaa cgctcgcgtc tgctacttcc gaggatgcac tggctgctct tgatgctgca 480

tgcgctgttc aggccgagtg ggctaggacg ccagcgcgcg agcgttctaa tattttacga 540

cgcggtttcg agctcgtcgc ggaacgtgca gaagagttcg ccaccctcat gaccttggaa 600

atgggcaaac ctttggctga agctcgcggc gaagtcacct acggcaacga attcctgcgc 660

tggttctctg aggaagcagt ccgcctctac ggccgctacg gtgctacccc agaaggcaac 720

ctgcgcatga tgaccacccg caaaccagtt ggcccctgcc tgttgatcac cccatggaac 780

ttcccactag caatggccac ccgtaaggtt gcacccgcca tcgctgcagg ttgtgtcatg 840

gtgctcaagc cagctcgcct gaccccgctg acctcccagt attttgccca gaccatgctt 900

gatgccggtc ttccagcagg tgtcctcaat gtggtctccg gtgcttccgc ctctgcgatt 960

tccaacccga ttatggaaga cgatcgcctt cgtaaagtct cattcaccgg ctccacccca 1020

gttggccagc agctgctcaa aaaggctgcc gataaagttc tgcgcacctc catggaactc 1080

ggcggcaacg cacctttcat tgtcttcgag gacgccgacc tagatctcgc gatcgaaggt 1140

gccatgggcg caaaaatgcg caacatcggc gaagcttgca ccgcagccaa ccgtttccta 1200

gtccacgaat ccgtcgccga tgaattcggc cgacgcttcg cagcccgcct cgaggaacaa 1260

gtcctaggca acggcctcga cgaaggcgtc accgtaggcc cattggttga ggaaaaagca 1320

cgaaacagcg ttgcatcgct tgtcgacgcc gccgtctccg aaggtgccac cgtcctcacc 1380

ggtggcaagg ccggcacagg tgcaggctac ttctacgaac caacggtgct cacgggagtt 1440

tcaacagatg cagccatcct gaacgaagag atcttcggtc ccgtcgcacc gatcgtcacc 1500

ttctctgatg aagctgaagc tctgcgccta gccaattcca ccgaatacgg cctggcctcc 1560

tacgtgttca cccaagacac ctcacgcatc ttccgcgtct ccgacggcct cgagttcggc 1620

ctagtgggcg tcaactccgg tgtcatctct aacgccgctg caccttttgg tggcgtaaaa 1680

caatccggaa tgggccgcga aggtggtctc gaaggaattg aagagtacac ctccgtgcag 1740

tacatcggta tccgggatcc ttacgccggc taggttttgg cggatgagag aagattttca 1800

gcctgat 1807

<210> 43

<211> 1807

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<400> 43

gcttgcatgc ctgcaggtcg actctagagg atccccgtag tgctcgtcgt ggtaggtgcg 60

cagcagagat tcaggcgcac gaccagaaag cacgtggctg agcttccagc cggacgttgt 120

ggccggagta aaaatccatc caaactttcc gcgatgctgg taaacctgtg gatgtcaatg 180

cctttgattt gaactaagca caggactacc tcgacgccgg cgccaacttt gtccgagtcg 240

gtgccgatgt ccagcaactc aacgctgctg gatacgaaaa gtgaaggaaa ataacgcatc 300

atgactatta atgtctccga actacttgcc aaagtcccca cgggtctact gattggtgat 360

tcctgggtgg aagcatccga gggcggtact ttcgatgtgg aaaacccagc gacgggtgaa 420

acaatcgcaa cgctcgcgtc tgctacttcc gaggatgcac tggctgctct tgatgctgca 480

tgcgctgttc aggccgagtg ggctaggacg ccagcgcgcg agcgttctaa tattttacga 540

cgcggtttcg agctcgtcgc ggaacgtgca gaagagttcg ccaccctcat gaccttggaa 600

atgggcaaac ctttggctga agctcgcggc gaagtcacct acggcaacga attcctgcgc 660

tggttctctg aggaagcagt ccgcctctac ggccgctacg gtgctacccc agaaggcaac 720

ctgcgcatga tgaccacccg caaaccagtt ggcccctgcc tgttgatcac cccatggaac 780

ttcccactag caatggccac ccgtaaggtt gcacccgcca tcgctgcagg ttgtgtcatg 840

gtgctcaagc cagctcgcct gaccccgctg acctcccagt attttgccca gaccatactt 900

gatgccggtc ttccagcagg tgtcctcaat gtggtctccg gtgcttccgc ctctgcgatt 960

tccaacccga ttatggaaga cgatcgcctt cgtaaagtct cattcaccgg ctccacccca 1020

gttggccagc agctgctcaa aaaggctgcc gataaagttc tgcgcacctc catggaactc 1080

ggcggcaacg cacctttcat tgtcttcgag gacgccgacc tagatctcgc gatcgaaggt 1140

gccatgggcg caaaaatgcg caacatcggc gaagcttgca ccgcagccaa ccgtttccta 1200

gtccacgaat ccgtcgccga tgaattcggc cgacgcttcg cagcccgcct cgaggaacaa 1260

gtcctaggca acggcctcga cgaaggcgtc accgtaggcc cattggttga ggaaaaagca 1320

cgaaacagcg ttgcatcgct tgtcgacgcc gccgtctccg aaggtgccac cgtcctcacc 1380

ggtggcaagg ccggcacagg tgcaggctac ttctacgaac caacggtgct cacgggagtt 1440

tcaacagatg cagccatcct gaacgaagag atcttcggtc ccgtcgcacc gatcgtcacc 1500

ttctctgatg aagctgaagc tctgcgccta gccaattcca ccgaatacgg cctggcctcc 1560

tacgtgttca cccaagacac ctcacgcatc ttccgcgtct ccgacggcct cgagttcggc 1620

ctagtgggcg tcaactccgg tgtcatctct aacgccgctg caccttttgg tggcgtaaaa 1680

caatccggaa tgggccgcga aggtggtctc gaaggaattg aagagtacac ctccgtgcag 1740

tacatcggta tccgggatcc ttacgccggc taggttttgg cggatgagag aagattttca 1800

gcctgat 1807

<210> 44

<211> 1846

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<400> 44

agcggataac aatttcacac aggaaacaga attaattaag cttgcatgcc tgcaggtcga 60

ctctagagga tccccgtagt gctcgtcgtg gtaggtgcgc agcagagatt caggcgcacg 120

accagaaagc acgtggctga gcttccagcc ggacgttgtg gccggagtaa aaatccatcc 180

aaactttccg cgatgctggt aaacctgtgg atgtcaatgc ctttgatttg aactaagcac 240

aggactacct cgacgccggc gccaactttg tccgagtcgg tgccgatgtc cagcaactca 300

acgctgctgg atacgaaaag tgaaggaaaa taacgcatca tgactattaa tgtctccgaa 360

ctacttgcca aagtccccac gggtctactg attggtgatt cctgggtgga agcatccgag 420

ggcggtactt tcgatgtgga aaacccagcg acgggtgaaa caatcgcaac gctcgcgtct 480

gctacttccg aggatgcact ggctgctctt gatgctgcat gcgctgttca ggccgagtgg 540

gctaggacgc cagcgcgcga gcgttctaat attttacgac gcggtttcga gctcgtcgcg 600

gaacgtgcag aagagttcgc caccctcatg accttggaaa tgggcaaacc tttggctgaa 660

gctcgcggcg aagtcaccta cggcaacgaa ttcctgcgct ggttctctga ggaagcagtc 720

cgcctctacg gccgctacgg tgctacccca gaaggcaacc tgcgcatgat gaccacccgc 780

aaaccagttg gcccctgcct gttgatcacc ccatggaact tcccactagc aatggccacc 840

cgtaaggttg cacccgccat cgctgcaggt tgtgtcatgg tgctcaagcc agctcgcctg 900

accccgctga cctcccagta ttttgcccag accatacttg atgccggtct tccagcaggt 960

gtcctcaatg tggtctccgg tgcttccgcc tctgcgattt ccaacccgat tatggaagac 1020

gatcgccttc gtaaagtctc attcaccggc tccaccccag ttggccagca gctgctcaaa 1080

aaggctgccg ataaagttct gcgcacctcc atggaactcg gcggcaacgc acctttcatt 1140

gtcttcgagg acgccgacct agatctcgcg atcgaaggtg ccatgggcgc aaaaatgcgc 1200

aacatcggcg aagcttgcac cgcagccaac cgtttcctag tccacgaatc cgtcgccgat 1260

gaattcggcc gacgcttcgc agcccgcctc gaggaacaag tcctaggcaa cggcctcgac 1320

gaaggcgtca ccgtaggccc attggttgag gaaaaagcac gaaacagcgt tgcatcgctt 1380

gtcgacgccg ccgtctccga aggtgccacc gtcctcaccg gtggcaaggc cggcacaggt 1440

gcaggctact tctacgaacc aacggtgctc acgggagttt caacagatgc agccatcctg 1500

aacgaagaga tcttcggtcc cgtcgcaccg atcgtcacct tctctgatga agctgaagct 1560

ctgcgcctag ccaattccac cgaatacggc ctggcctcct acgtgttcac ccaagacacc 1620

tcacgcatct tccgcgtctc cgacggcctc gagttcggcc tagtgggcgt caactccggt 1680

gtcatctcta acgccgctgc accttttggt ggcgtaaaac aatccggaat gggccgcgaa 1740

ggtggtctcg aaggaattga agagtacacc tccgtgcagt acatcggtat ccgggatcct 1800

tacgccggct aggttttggc ggatgagaga agattttcag cctgat 1846

<210> 45

<211> 709

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<400> 45

cagtgccaag cttgcatgcc tgcaggtcga ctctaggtct gggggtgagc gcggatctga 60

ggcggtgacg tattaccagt attcctgggg tcgggcgcgt cgtagtttac gaggaatgga 120

ggagcagatt gcaaaagctg agcgtgcggt agccggcctc gttccggtca agcgttatcg 180

gtatgttgat cttaaagctg cacaaaagca ggtcaaccat gcattagcag ataagtatcg 240

ggcgttggct ggggtgaaag gatacgagac ctcacgcagt gatcttgctg ctggtgaggt 300

tattggggca tatcgtcagt tgtttaaaat tgagaaggcg tttcggatgg cgaagtcgga 360

tttgaaggct tgtccgattt ttcatcggaa gaaggattcg attgatgcgc atttaacgat 420

tgtgatggta tcgatggctg tggggcatgt gttggaacag cggtcggggt tgtcgttgaa 480

gcggttggtg cggatattga agagataccg cactttcact gtggaggtgg ctggccacag 540

ggttttcgct caggctccgg ttcctgatga tgttgcgtta attgttgatc ggttacctaa 600

accgtcagac taaaatggcc taagtcaggc aaaacacaaa aaatccacca caaacatccc 660

agtgtttgcg gtggatttgt aaaggggcag atggatgcgt tattttcct 709

<210> 46

<211> 734

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<400> 46

tggatttgta aaggggcaga tggatgcgtt attttccttc acttttcgta tccagcagcg 60

ttgagttgct ggacatcggc accgactcgg acaaagttgg cgccggcgtc gaggtagtcc 120

tgtgcttagt tcaaatcaaa ggcattgaca tccacaggtt taccagcatc gcggaaagtt 180

tggatggatt tttactccgg ccacaacgtc cggctggaag ctcagccacg tgctttctgg 240

tcgtgcgcct gaatctctgc tgcgcaccta ccacgacgag cactacccag ctgcggcaaa 300

cctcattgct ttcgataagg gatggtccac cctcatggtc cctcagctgg aagatccaga 360

ggctgtggag aggtactacg ttgctgcgga ggaattcacc gccggattcc tcaccgaaaa 420

ccaggacaat ctgatcactg cgggcacgga gcaccaggcg ctcgcgagcg gcttcccggt 480

ggggcgtcgc ttcaagtccg atattgcttt acgacgctgc gatgcggtga ccacccacat 540

cggccacgaa cactccgccg atggtcgatg gaagaaagcg aagactcacc actcaaccgc 600

ttcaccccag aagacggcga ccgcaacgca gtcttcgata tcaaggccat ctaccagcag 660

cattaccact ccttcgacct gttcgatgcg ccagaggggt accgagctcg aattcgtaat 720

catggtcata gctg 734

<210> 47

<211> 1405

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<400> 47

cagtgccaag cttgcatgcc tgcaggtcga ctctaggtct gggggtgagc gcggatctga 60

ggcggtgacg tattaccagt attcctgggg tcgggcgcgt cgtagtttac gaggaatgga 120

ggagcagatt gcaaaagctg agcgtgcggt agccggcctc gttccggtca agcgttatcg 180

gtatgttgat cttaaagctg cacaaaagca ggtcaaccat gcattagcag ataagtatcg 240

ggcgttggct ggggtgaaag gatacgagac ctcacgcagt gatcttgctg ctggtgaggt 300

tattggggca tatcgtcagt tgtttaaaat tgagaaggcg tttcggatgg cgaagtcgga 360

tttgaaggct tgtccgattt ttcatcggaa gaaggattcg attgatgcgc atttaacgat 420

tgtgatggta tcgatggctg tggggcatgt gttggaacag cggtcggggt tgtcgttgaa 480

gcggttggtg cggatattga agagataccg cactttcact gtggaggtgg ctggccacag 540

ggttttcgct caggctccgg ttcctgatga tgttgcgtta attgttgatc ggttacctaa 600

accgtcagac taaaatggcc taagtcaggc aaaacacaaa aaatccacca caaacatccc 660

agtgtttgcg gtggatttgt aaaggggcag atggatgcgt tattttcctt cacttttcgt 720

atccagcagc gttgagttgc tggacatcgg caccgactcg gacaaagttg gcgccggcgt 780

cgaggtagtc ctgtgcttag ttcaaatcaa aggcattgac atccacaggt ttaccagcat 840

cgcggaaagt ttggatggat ttttactccg gccacaacgt ccggctggaa gctcagccac 900

gtgctttctg gtcgtgcgcc tgaatctctg ctgcgcacct accacgacga gcactaccca 960

gctgcggcaa acctcattgc tttcgataag ggatggtcca ccctcatggt ccctcagctg 1020

gaagatccag aggctgtgga gaggtactac gttgctgcgg aggaattcac cgccggattc 1080

ctcaccgaaa accaggacaa tctgatcact gcgggcacgg agcaccaggc gctcgcgagc 1140

ggcttcccgg tggggcgtcg cttcaagtcc gatattgctt tacgacgctg cgatgcggtg 1200

accacccaca tcggccacga acactccgcc gatggtcgat ggaagaaagc gaagactcac 1260

cactcaaccg cttcacccca gaagacggcg accgcaacgc agtcttcgat atcaaggcca 1320

tctaccagca gcattaccac tccttcgacc tgttcgatgc gccagagggg taccgagctc 1380

gaattcgtaa tcatggtcat agctg 1405

<210> 48

<211> 2804

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<400> 48

gtctgggggt gagcgcggat ctgaggcggt gacgtattac cagtattcct ggggtcgggc 60

gcgtcgtagt ttacgaggaa tggaggagca gattgcaaaa gctgagcgtg cggtagccgg 120

cctcgttccg gtcaagcgtt atcggtatgt tgatcttaaa gctgcacaaa agcaggtcaa 180

ccatgcatta gcagataagt atcgggcgtt ggctggggtg aaaggatacg agacctcacg 240

cagtgatctt gctgctggtg aggttattgg ggcatatcgt cagttgttta aaattgagaa 300

ggcgtttcgg atggcgaagt cggatttgaa ggcttgtccg atttttcatc ggaagaagga 360

ttcgattgat gcgcatttaa cgattgtgat ggtatcgatg gctgtggggc atgtgttgga 420

acagcggtcg gggttgtcgt tgaagcggtt ggtgcggata ttgaagagat accgcacttt 480

cactgtggag gtggctggcc acagggtttt cgctcaggct ccggttcctg atgatgttgc 540

gttaattgtt gatcggttac ctaaaccgtc agactaaaat ggcctaagtc aggcaaaaca 600

caaaaaatcc accacaaaca tcccagtgtt tgcggtggat ttgtaaaggg gcagatgcta 660

gccggcgtaa ggatcccgga taccgatgta ctgcacggag gtgtactctt caattccttc 720

gagaccacct tcgcggccca ttccggattg ttttacgcca ccaaaaggtg cagcggcgtt 780

agagatgaca ccggagttga cgcccactag gccgaactcg aggccgtcgg agacgcggaa 840

gatgcgtgag gtgtcttggg tgaacacgta ggaggccagg ccgtattcgg tggaattggc 900

taggcgcaga gcttcagctt catcagagaa ggtgacgatc ggtgcgacgg gaccgaagat 960

ctcttcgttc aggatggctg catctgttga aactcccgtg agcaccgttg gttcgtagaa 1020

gtagcctgca cctgtgccgg ccttgccacc ggtgaggacg gtggcacctt cggagacggc 1080

ggcgtcgaca agcgatgcaa cgctgtttcg tgctttttcc tcaaccaatg ggcctacggt 1140

gacgccttcg tcgaggccgt tgcctaggac ttgttcctcg aggcgggctg cgaagcgtcg 1200

gccgaattca tcggcgacgg attcgtggac taggaaacgg ttggctgcgg tgcaagcttc 1260

gccgatgttg cgcatttttg cgcccatggc accttcgatc gcgagatcta ggtcggcgtc 1320

ctcgaagaca atgaaaggtg cgttgccgcc gagttccatg gaggtgcgca gaactttatc 1380

ggcagccttt ttgagcagct gctggccaac tggggtggag ccggtgaatg agactttacg 1440

aaggcgatcg tcttccataa tcgggttgga aatcgcagag gcggaagcac cggagaccac 1500

attgaggaca cctgctggaa gaccggcatc aagcatggtc tgggcaaaat actgggaggt 1560

cagcggggtc aggcgagctg gcttgagcac catgacacaa cctgcagcga tggcgggtgc 1620

aaccttacgg gtggccattg ctagtgggaa gttccatggg gtgatcaaca ggcaggggcc 1680

aactggtttg cgggtggtca tcatgcgcag gttgccttct ggggtagcac cgtagcggcc 1740

gtagaggcgg actgcttcct cagagaacca gcgcaggaat tcgttgccgt aggtgacttc 1800

gccgcgagct tcagccaaag gtttgcccat ttccaaggtc atgagggtgg cgaactcttc 1860

tgcacgttcc gcgacgagct cgaaaccgcg tcgtaaaata ttagaacgct cgcgcgctgg 1920

cgtcctagcc cactcggcct gaacagcgca tgcagcatca agagcagcca gtgcatcctc 1980

ggaagtagca gacgcgagcg ttgcgattgt ttcacccgtc gctgggtttt ccacatcgaa 2040

agtaccgccc tcggatgctt ccacccagga atcaccaatc agtagacccg tggggacttt 2100

ggcaagtagt tcggagacat taatagtcat gatgcgttat tttccttcac ttttcgtatc 2160

cagcagcgtt gagttgctgg acatcggcac cgactcggac aaagttggcg ccggcgtcga 2220

ggtagtcctg tgcttagttc aaatcaaagg cattgacatc cacaggttta ccagcatcgc 2280

ggaaagtttg gatggatttt tactccggcc acaacgtccg gctggaagct cagccacgtg 2340

ctttctggtc gtgcgcctga atctctgctg cgcacctacc acgacgagca ctacccagct 2400

gcggcaaacc tcattgcttt cgataaggga tggtccaccc tcatggtccc tcagctggaa 2460

gatccagagg ctgtggagag gtactacgtt gctgcggagg aattcaccgc cggattcctc 2520

accgaaaacc aggacaatct gatcactgcg ggcacggagc accaggcgct cgcgagcggc 2580

ttcccggtgg ggcgtcgctt caagtccgat attgctttac gacgctgcga tgcggtgacc 2640

acccacatcg gccacgaaca ctccgccgat ggtcgatgga agaaagcgaa gactcaccac 2700

tcaaccgctt caccccagaa gacggcgacc gcaacgcagt cttcgatatc aaggccatct 2760

accagcagca ttaccactcc ttcgacctgt tcgatgcgcc agac 2804

<210> 49

<211> 1331

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<400> 49

gtctgggggt gagcgcggat ctgaggcggt gacgtattac cagtattcct ggggtcgggc 60

gcgtcgtagt ttacgaggaa tggaggagca gattgcaaaa gctgagcgtg cggtagccgg 120

cctcgttccg gtcaagcgtt atcggtatgt tgatcttaaa gctgcacaaa agcaggtcaa 180

ccatgcatta gcagataagt atcgggcgtt ggctggggtg aaaggatacg agacctcacg 240

cagtgatctt gctgctggtg aggttattgg ggcatatcgt cagttgttta aaattgagaa 300

ggcgtttcgg atggcgaagt cggatttgaa ggcttgtccg atttttcatc ggaagaagga 360

ttcgattgat gcgcatttaa cgattgtgat ggtatcgatg gctgtggggc atgtgttgga 420

acagcggtcg gggttgtcgt tgaagcggtt ggtgcggata ttgaagagat accgcacttt 480

cactgtggag gtggctggcc acagggtttt cgctcaggct ccggttcctg atgatgttgc 540

gttaattgtt gatcggttac ctaaaccgtc agactaaaat ggcctaagtc aggcaaaaca 600

caaaaaatcc accacaaaca tcccagtgtt tgcggtggat ttgtaaaggg gcagatggat 660

gcgttatttt ccttcacttt tcgtatccag cagcgttgag ttgctggaca tcggcaccga 720

ctcggacaaa gttggcgccg gcgtcgaggt agtcctgtgc ttagttcaaa tcaaaggcat 780

tgacatccac aggtttacca gcatcgcgga aagtttggat ggatttttac tccggccaca 840

acgtccggct ggaagctcag ccacgtgctt tctggtcgtg cgcctgaatc tctgctgcgc 900

acctaccacg acgagcacta cccagctgcg gcaaacctca ttgctttcga taagggatgg 960

tccaccctca tggtccctca gctggaagat ccagaggctg tggagaggta ctacgttgct 1020

gcggaggaat tcaccgccgg attcctcacc gaaaaccagg acaatctgat cactgcgggc 1080

acggagcacc aggcgctcgc gagcggcttc ccggtggggc gtcgcttcaa gtccgatatt 1140

gctttacgac gctgcgatgc ggtgaccacc cacatcggcc acgaacactc cgccgatggt 1200

cgatggaaga aagcgaagac tcaccactca accgcttcac cccagaagac ggcgaccgca 1260

acgcagtctt cgatatcaag gccatctacc agcagcatta ccactccttc gacctgttcg 1320

atgcgccaga g 1331

<---

Изобретение относится к биотехнологии. Предложены бактерия рода Corynebacterium для продуцирования L-глутаминовой кислоты, способ получения L-глутаминовой кислоты с использованием указанной бактерии, белок и молекула нуклеиновой кислоты для продуцирования L-глутаминовой кислоты. Также предложены рекомбинантный микроорганизм для продуцирования L-глутаминовой кислоты, содержащий указанную молекулу нуклеиновой кислоты, способ его конструирования и способ получения L-глутаминовой кислоты с его использованием. Также предложены применение указанной молекулы нуклеиновой кислоты для конструирования генетически модифицированной бактерии для продуцирования L-глутаминовой кислоты, способ повышения продукции L-глутаминовой кислоты в бактерии рода Corynebacterium с использованием указанной молекулы нуклеиновой кислоты. Изобретение обеспечивает получение высокой продукции L-глутаминовой кислоты. 9 н. и 7 з.п. ф-лы, 5 табл., 6 пр.

1. Бактерия рода Corynebacterium для продуцирования L-глутаминовой кислоты, причем указанная бактерия обладает улучшенной экспрессией полинуклеотида, кодирующего последовательность аминокислот SEQ ID NO: 3, по сравнению с немодифицированной бактерией рода Corynebacterium дикого типа;

при этом улучшенная экспрессия представляет собой усиленную экспрессию полинуклеотида, кодирующего последовательность аминокислот SEQ ID NO: 3, или присутствие точечной мутации в полинуклеотиде, кодирующем последовательность аминокислот SEQ ID NO: 3, или присутствие точечной мутации в полинуклеотиде и усиленную экспрессию полинуклеотида, который кодирует последовательность аминокислот SEQ ID NO: 3, при этом

указанная точечная мутация в полинуклеотиде, кодирующем последовательность аминокислот SEQ ID NO: 3, представляет собой замену метионина в положении 199 в последовательности аминокислот SEQ ID NO: 3 на изолейцин.

2. Бактерия рода Corynebacterium по п. 1, где полинуклеотид, кодирующий последовательность аминокислот SEQ ID NO: 3, содержит последовательность нуклеотидов SEQ ID NO: 1.

3. Бактерия рода Corynebacterium по п. 1, где последовательность полинуклеотида включает точечную мутацию основания в положении 597 последовательности полинуклеотида SEQ ID NO: 1 с заменой гуанина (G) на аденин (A).

4. Бактерия рода Corynebacterium по п. 1, где указанная последовательность полинуклеотида, имеющая точечную мутацию, содержит последовательность полинуклеотида SEQ ID NO: 2.

5. Бактерия рода Corynebacterium по п. 1, характеризующаяся тем, что указанная бактерия представляет собой Corynebacterium glutamicum YPGLU001, номер доступа депонированного биологического образца: CGMCC №21220, или Corynebacterium glutamicum ATCC 13869.

6. Способ получения L-глутаминовой кислоты, который включает культивирование бактерии по п. 1 и выделение L-глутаминовой кислоты из культуры.

7. Белок, характеризующийся тем, что он имеет последовательность аминокислот, представленную в SEQ ID NO: 4; где указанный белок используется для продуцирования L-глутаминовой кислоты.

8. Молекула нуклеиновой кислоты для продуцирования L-глутаминовой кислоты, характеризующаяся тем, что указанная молекула нуклеиновой кислоты представляет собой любое из:

B1) молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей белок по п. 4;

B2) молекулы ДНК, кодирующей последовательность, которая представлена в последовательности SEQ ID NO: 2;

B3) молекулы ДНК, последовательность нуклеотидов которой представлена в последовательности SEQ ID NO: 2; или

В4) полинуклеотида, содержащего полинуклеотид, кодирующий последовательность аминокислот SEQ ID NO: 3, где метионин в положении 199 заменен на изолейцин.

9. Молекула нуклеиновой кислоты по п. 8, характеризующаяся тем, что указанный полинуклеотид содержит полинуклеотид, кодирующий последовательность аминокислот SEQ ID NO: 4.

10. Молекула нуклеиновой кислоты по п. 8, характеризующаяся тем, что указанный полинуклеотид образован в результате мутации основания в положении 597 последовательности полинуклеотида SEQ ID NO: 1; предпочтительно указанная мутация представляет собой мутацию основания в положении 597 последовательности полинуклеотида SEQ ID NO: 1 с заменой гуанина (G) на аденин (A).

11. Молекула нуклеиновой кислоты по п. 8, характеризующаяся тем, что указанный полинуклеотид содержит последовательность полинуклеотида SEQ ID NO: 2.

12. Рекомбинантный микроорганизм для продуцирования L-глутаминовой кислоты, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты по п. 8, или рекомбинантный вектор, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты по п. 11.

13. Применение молекулы нуклеиновой кислоты по п. 8 для конструирования генетически модифицированной бактерии для продуцирования L-глутаминовой кислоты.

14. Способ повышения продукции L-глутаминовой кислоты в бактерии рода Corynebacterium, характеризующийся тем, что он включает

встраивание молекулы нуклеиновой кислоты по п. 8 или рекомбинантного вектора, содержащего молекулу нуклеиновой кислоты по п. 11, в микроорганизм-мишень с получением рекомбинантного микроорганизма и культивирование указанного рекомбинантного микроорганизма с обеспечением повышенной продукции L-глутаминовой кислоты, чем в микроорганизме-мишени.

15. Способ конструирования рекомбинантного микроорганизма по п. 12, характеризующийся тем, что указанный способ включает по меньшей мере одно из:

F1) введения молекулы нуклеиновой кислоты по п. 8 в микроорганизм-мишень с получением рекомбинантного микроорганизма;

F2) редактирования молекулы ДНК, представленной в SEQ ID NO: 1, с помощью средства редактирования генов для введения молекулы ДНК, представленной в SEQ ID NO: 2, в микроорганизм-мишень.

16. Способ получения L-глутаминовой кислоты, характеризующийся тем, что указанный способ включает продуцирование L-глутаминовой кислоты путем культивирования рекомбинантного микроорганизма по п. 12.