РЕКОМБИНАНТНЫЙ ШТАММ С МОДИФИЦИРОВАННЫМ ГЕНОМ BBD29_04920 ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ L-ГЛУТАМИНОВОЙ КИСЛОТЫ, А ТАКЖЕ СПОСОБ ЕГО КОНСТРУИРОВАНИЯ И ПРИМЕНЕНИЕ Российский патент 2025 года по МПК C12N15/77 C07K14/34 C12P13/14 

Область техники

Настоящее изобретение относится к области конструирования генов и микроорганизмов, и, в частности, относится к рекомбинантному штамму для продуцирования (получения) L-глутаминовой кислоты, а также способу его конструирования и применения.

Уровень техники

L-глутаминовая кислота представляет собой важную аминокислоту, которую используют в пищевых продуктах, в клинической медицине и в других областях.

Традиционно L-глутаминовую кислоту получают в основном путем ферментации с использованием продуцирующих L-глутаминовую кислоту бактерий, принадлежащих к роду Brevibacterium, Corynebacterium или Microtatobiotes, или их мутантов.

L-Глутаминовая кислота синтезируется путем биосинтеза из α-кетоглутаровой кислоты, промежуточного продукта цикла лимонной кислоты в клетках микроорганизмов. Существует два биосинтетических пути образования L-глутаминовой кислоты из а-кетоглутаровой кислоты через ассимиляцию ионов аммония. Один путь представлен синтезом L-глутаминовой кислоты путем катализа глутаматдегидрогеназой (GDH) в присутствии ионов аммония в высокой концентрации. Другой путь (путь GS/GOGAT) представлен синтезом L-глутаминовой кислоты глутаминсинтетазой и аминотрансферазой глутамина-оксоглутаровой кислоты. Глутаминсинтетаза (GS) катализирует конверсию L-глутаминовой кислоты и ионов аммония в глутамин; аминотрансфераза глутамина-оксоглутаровой кислоты, также известная как «глутаминсинтетаза» (GOGAT), катализирует синтез L-глутаминовой кислоты, в ходе которого две молекулы L-глутаминовой кислоты синтезируются из одной молекулы глутамина, которая была синтезирована GS из одной молекулы α-кетоглутаровой кислоты.

Улучшение получения L-аминокислот путем ферментации может относиться к методикам ферментации, таким как перемешивание и подача кислорода; или к составу питательной среды, например, к концентрации сахара во время ферментации; или к переработке ферментативного бульона в продукт в подходящей форме, например, путем высушивания и грануляции ферментативного бульона, или с помощью ионообменной хроматографии; или может относиться к собственным свойствам соответствующих продуцирующих микроорганизмов.

Способы улучшения свойств указанных продуцирующих микроорганизмов включают мутагенез, выбор и скрининг мутантов. Штамм, полученный указанным способом, устойчив к антиметаболитам или ауксотрофен по метаболитам, имеющим регуляторное значение, и продуцирует L-аминокислоты, и т.п.

Хотя существует значительное число способов, способных усиливать способность к продуцированию L-глутаминовой кислоты, сохраняется потребность в разработке способов продуцирования L-глутаминовой кислоты для удовлетворения растущего спроса.

Краткое описание изобретения

Задача настоящего изобретения заключается в разработке новой методики для усиления способности бактерии к продуцированию L-глутаминовой кислоты, с обеспечением таким образом способа эффективного продуцирования L-глутаминовой кислоты.

В ходе исследований для решения вышеуказанной задачи авторы настоящего изобретения обнаружили, что ген BBD29_04920 или гомологичный ген у бактерии может быть модифицирован или улучшен в отношении экспрессии указанного гена, чтобы обеспечить усиленную способность к продуцированию L-глутаминовой кислоты. Настоящее изобретение было выполнено с учетом этих находок.

Согласно настоящему изобретению предложена бактерия для продуцирования L-глутаминовой кислоты, характеризующаяся улучшенной экспрессией полинуклеотида, кодирующего последовательность аминокислот SEQ ID NO: 3, или гомологичную ей последовательность. Согласно настоящему изобретению также предложен способ получения L-глутаминовой кислоты с использованием микроорганизма.

Согласно первому аспекту настоящего изобретения предложена бактерия для продуцирования L-глутаминовой кислоты, обладающая улучшенной экспрессией полинуклеотида, кодирующего последовательность аминокислот SEQ ID NO: 3 или гомологичную ей последовательность. В соответствии с настоящим изобретением улучшенная экспрессия представляет собой усиленную экспрессию полинуклеотида, или присутствие точечной мутации в полинуклеотиде, который кодирует последовательность аминокислот SEQ ID NO: 3 или гомологичную ей последовательность, или присутствие точечной мутации в полинуклеотиде и усиленную экспрессию полинуклеотида, который кодирует последовательность аминокислот SEQ ID NO: 3 или гомологичную ей последовательность.

Последовательность аминокислот SEQ ID NO: 3, или гомологичная ей последовательность представляет собой белок, кодируемый геном BBD29_04920 или гомологичным ему геном.

Указанная бактерия обладает усиленной способностью к продуцированию L-глутаминовой кислоты по сравнению с немодифицированным штаммом.

Согласно настоящему изобретению термин «бактерия, обладающая способностью к продуцированию L-глутаминовой кислоты» относится к бактерии, обладающей такой способностью к продуцированию и накоплению целевой L-глутаминовой кислоты в культуральной среде и/или в клетке указанной бактерии, что L-глутаминовая кислота может быть собрана при культивировании бактерии в культуральной среде. Бактерия, обладающая способностью к продуцированию L-глутаминовой кислоты, может представлять собой бактерию, способную к накоплению целевой L-глутаминовой кислоты в культуральной среде и/или в клетке указанной бактерии в большем количестве, чем у немодифицированного штамма.

Термин «немодифицированный штамм» относится к контрольному штамму, который не был модифицирован таким образом, чтобы включать некий специфический признак. Таким образом, примеры немодифицированного штамма включают штамм дикого типа и исходный штамм.

Бактерия, обладающая способностью к продуцированию L-глутаминовой кислоты, может представлять собой бактерию, способную к накоплению целевой L-глутаминовой кислоты в культуральной среде в количестве, предпочтительно превышающем 0,5 г/л, и более предпочтительно - превышающем 1,0 г/л.

Согласно настоящему изобретению, термин «L-глутаминовая кислота» относится к L-глутаминовой кислоте в свободной форме, к ее соли или смеси, если не указано иное.

Указанный полинуклеотид может кодировать последовательность аминокислот, обладающую приблизительно 90% или более, приблизительно 92% или более, приблизительно 95% или более, приблизительно 97% или более, приблизительно 98% или более, или приблизительно 99% или более гомологией последовательности в отношении последовательности аминокислот SEQ ID NO: 3. В настоящем документе термин «гомология» относится к проценту идентичности двух полинуклеотидов или двух полипептидов как модулей. Гомология последовательностей может быть измерена между одним модулем и другим модулем с применением способа, известного в данной области техники. Например, такая гомология последовательностей может быть измерена с помощью алгоритма BLAST.

Экспрессия полинуклеотида может быть усилена: путем замены или мутирования регуляторной последовательности экспрессии, введения мутации в последовательность полинуклеотида, и путем увеличения числа копий полинуклеотида, инсертированных в хромосому или введенных с помощью вектора, или комбинации перечисленного, и т.п.

Регуляторная последовательность экспрессии полинуклеотида может быть модифицирована. Регуляторная последовательность экспрессии контролирует экспрессию полинуклеотида, который функционально с ней связан, и может содержать, например, промоторы, терминаторы, энхансеры, сайленсеры и т.п. Полинуклеотид может иметь измененный инициирующий кодон. Полинуклеотид может быть включен в определенный сайт хромосомы, с увеличением таким образом числа копий. Согласно настоящему документу определенный сайт может включать, например, сайт транспозона или межгенный сайт. Кроме того, полинуклеотид может быть включен в экспрессионный вектор, а указанный экспрессионный вектор введен в клетку-хозяина, с увеличением таким образом числа копий.

Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения полинуклеотид или имеющий точечную мутацию полинуклеотид включают в определенный сайт хромосомы микроорганизма с увеличением таким образом числа копий.

Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения полинуклеотид с последовательностью промотора, или имеющий точечную мутацию полинуклеотид с последовательностью промотора встраивают в определенный сайт хромосомы микроорганизма, со сверхэкспрессией таким образом последовательности нуклеиновой кислоты.

Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения полинуклеотид или имеющий точечную мутацию полинуклеотид включают в экспрессионный вектор, а указанный экспрессионный вектор вводят в клетку-хозяина, с увеличением таким образом числа копий.

Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения полинуклеотид с последовательностью промотора, или имеющий точечную мутацию полинуклеотид с последовательностью промотора включают в экспрессионный вектор, а указанный экспрессионный вектор вводят в клетку-хозяина, с обеспечением таким образом сверхэкспрессии последовательности аминокислот.

Согласно конкретному варианту реализации настоящего изобретения указанный полинуклеотид может содержать последовательность нуклеотидов SEQ ID NO: 1.

Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения полинуклеотид, кодирующий последовательность аминокислот SEQ ID NO: 3, имеет точечную мутацию, такую, что аспарагин в положении 520 в последовательности аминокислот SEQ ID NO: 3 заменен на другую аминокислоту.

В соответствии с настоящим изобретением предпочтительно аспарагин в положении 520 заменен на лизин.

В соответствии с настоящим изобретением последовательность, представленная в SEQ ID NO: 4, представляет собой последовательность аминокислот после замены аспарагина на лизин в положении 520 в последовательности аминокислот, представленной в SEQ ID NO: 3.

Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения последовательность полинуклеотида, имеющего точечную мутацию, образуется в результате мутации основания в положении 1560 последовательности полинуклеотида, представленной в SEQ ID NO: 1.

В соответствии с настоящим изобретением указанная мутация включает мутацию основания в положении 1560 последовательности полинуклеотида, представленной в SEQ ID NO: 1, с заменой цитозина (С) на аденин (А).

Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения последовательность полинуклеотида, имеющего точечную мутацию, содержит последовательность полинуклеотида, представленную в SEQ ID NO: 2.

В настоящем документе термин «функционально связанный» относится к функциональной связи между регуляторной последовательностью и последовательностью полинуклеотида, за счет которой регуляторная последовательность контролирует транскрипцию и/или трансляцию указанной последовательности полинуклеотида. Регуляторная последовательность может представлять собой сильный промотор, который может повышать уровень экспрессии полинуклеотида. Регуляторная последовательность может представлять собой промотор, происходящий из микроорганизма, принадлежащего к роду Corynebacterium, или может представлять собой промотор, происходящий из других микроорганизмов. Например, указанный промотор может представлять собой промотор trc, промотор gap, промотор tac, промотор Т7, промотор lac, промотор trp, промотор araBAD или промотор cj7.

Согласно конкретному варианту реализации настоящего изобретения указанный промотор представляет собой промотор полинуклеотида, кодирующего последовательность аминокислот SEQ ID NO: 3 (гена BBD29_04920).

В настоящем документе термин «вектор» относится к полинуклеотидной конструкции, содержащей регуляторную последовательность гена и последовательность гена, и выполненной с возможностью экспрессии целевого гена в подходящей клетке-хозяине. Термин "вектор" может также относиться к полинуклеотидной конструкции, содержащей последовательность для гомологичной рекомбинации, такой, что при введении этого вектора в клетку-хозяина может быть изменена регуляторная последовательность эндогенного гена в геноме клетки-хозяина, или целевой ген, который может экспрессироваться, может быть инсертирован в конкретный сайт генома хозяина. Таким образом, вектор для применения по настоящему изобретению может дополнительно содержать селективный маркер для определения введения вектора в клетку-хозяина или инсерции вектора в хромосому клетки-хозяина. Селективный маркер может включать маркер, обеспечивающий селектируемый фенотип, такой как лекарственная устойчивость, ауксотрофность, устойчивость к цитотоксическим агентам или экспрессия поверхностного белка. На среде, обработанной таким селективным агентом, может быть выбрана трансформированная клетка, поскольку только клетка, которая экспрессирует селективный маркер, может выживать или проявлять иные фенотипические черты. Вектор согласно описанию в настоящем документе хорошо известен специалистам в данной области техники и включает в том числе, но не ограничиваясь перечисленным: плазмиду, бактериофаг (такой как λ бактериофаг или нитевидный бактериофаг М13, и т.п.), космиду или вирусный вектор.

Согласно некоторым конкретным вариантам реализации настоящего изобретения в качестве вектора используют плазмиду pK18mobsacB и плазмиду pXMJ19.

В настоящем документе термин «трансформация» относится к введению полинуклеотида в клетку-хозяина таким образом, чтобы указанный полинуклеотид мог быть репликативно-компетентным в качестве элемента, чужеродного для генома, или за счет встраивания в геном клетки-хозяина. Способ трансформации вектором, применяемый согласно настоящему изобретению, может включать способ введения нуклеиновой кислоты в клетку. Кроме того, в соответствии с описанием близких методик, может быть использован подходящий для клетки-хозяина способ, задействующий электрические импульсы.

Согласно настоящему изобретению микроорганизм может представлять собой дрожжи, бактерию, водоросль или гриб.

В соответствии с настоящим изобретением указанная бактерия может представлять собой микроорганизм, принадлежащий к роду Corynebacterium, такой как Corynebacterium acetoacidophilum, Corynebacterium acetoglutamicum, Corynebacterium callunae, Corynebacterium glutamicum, Brevibacterium flavum, Brevibacterium lactofermentum, Corynebacterium ammoniagenes, Corynebacterium pekinense, Brevibacterium saccharolyticum, Brevibacterium roseum и Brevibacterium thiogenitalis и т.п.

Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения указанный микроорганизм, принадлежащий к роду Corynebacterium, представляет собой Corynebacterium glutamicum АТСС 13869.

Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения указанный микроорганизм, принадлежащий к роду Corynebacterium, представляет собой Corynebacterium glutamicum YPGLU001, который обеспечивает высокие уровни продуцирования глутаминовой кислоты, и депонирован как штамм с названием: Corynebacterium glutamicum; латинское название: Corynebacterium glutamicum; штамм №: YPGLU001 в Китайском главном центре коллекций микробиологических культур, сокращенно CGMCC, адрес: No. 3, Yard 1, Beichen West Road, Chaoyang District, Beijing, 23 ноября 2020 г., под номером доступа: CGMCC №21220.

В соответствии с настоящим изобретением указанная бактерия может также иметь дополнительные улучшения, связанные с повышением уровней продуцирования L-глутаминовой кислоты, такие как усиление или снижение активности, или экспрессии генов глутаматдегидрогеназы, глутаминсинтетазы, аминотрансферазы глутамина-оксоглутаровой кислоты и т.п., или замена генов чужеродными генами.

Согласно второму аспекту настоящего изобретения предложены последовательность полинуклеотида, последовательность аминокислот, кодируемая указанной последовательностью полинуклеотида, рекомбинантный вектор, содержащий указанную последовательность полинуклеотида, и рекомбинантный штамм, содержащий указанную последовательность полинуклеотида.

В соответствии с настоящим изобретением указанная последовательность полинуклеотида включает полинуклеотид, кодирующий полипептид, содержащий последовательность аминокислот SEQ ID NO: 3, где аспарагин в положении 520 в последовательности заменен на другую аминокислоту.

В соответствии с настоящим изобретением предпочтительно аспарагин в положении 520 заменен на лизин.

В соответствии с настоящим изобретением последовательность, представленная в SEQ ID NO: 4, представляет собой последовательность аминокислот после замены аспарагина на лизин в положении 520 в последовательности аминокислот, представленной в SEQ ID NO: 3.

В соответствии с настоящим изобретением предпочтительно указанный полинуклеотид, кодирующий полипептид, содержащий последовательность аминокислот SEQ ID NO: 3, содержит последовательность полинуклеотида согласно представленной в SEQ ID NO: 1.

Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения указанная последовательность полинуклеотида образуется в результате мутации основания в положении 1560 в последовательности полинуклеотида, представленной в SEQ ID NO: 1.

В соответствии с настоящим изобретением указанная мутация относится к изменению основания/нуклеотида в сайте, и способ осуществления мутации может представлять собой по меньшей мере один способ, выбранный из мутагенеза, сайт-направленного ПЦР-мутагенеза и/или гомологичной рекомбинации, и т.п. Согласно настоящему изобретению, предпочтительно используют сайт-направленный ПЦР-мутагенез и/или гомологичную рекомбинацию.

В соответствии с настоящим изобретением указанная мутация включает мутацию в основании в положении 1560 в последовательности полинуклеотида, представленной в SEQ ID NO: 1, с заменой цитозина (С) на аденин (А).

Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения указанная последовательность полинуклеотида содержит последовательность полинуклеотида SEQ ID NO: 2.

В соответствии с настоящим изобретением указанная последовательность аминокислот содержит последовательность аминокислот SEQ ID NO: 4.

В соответствии с настоящим изобретением указанный рекомбинантный вектор конструируют путем введения последовательности полинуклеотида в плазмиду.

Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения указанная плазмида представляет собой плазмиду pK18mobsacB.

Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения указанная плазмида представляет собой плазмиду pXMJ19.

В частности, указанные последовательность полинуклеотида и плазмида могут быть сконструированы в виде рекомбинантного вектора с помощью системы рекомбинации NEBuider.

В соответствии с настоящим изобретением указанный рекомбинантный штамм содержит указанную последовательность полинуклеотида.

Во варианте реализации настоящего изобретения исходный штамм для рекомбинантного штамма представляет собой Corynebacterium glutamicum CGMCC №21220.

Во варианте реализации настоящего изобретения исходный штамм для рекомбинантного штамма представляет собой АТСС 13869.

Согласно третьему аспекту настоящего изобретения также предложен способ конструирования рекомбинантного штамма, продуцирующего L-глутаминовую кислоту.

В соответствии с настоящим изобретением указанный способ конструирования включает следующий этап:

конструирование последовательности полинуклеотида гена BBD29_04920 дикого типа, представленной в SEQ ID NO: 1, у штамма-хозяина, чтобы вызвать мутацию основания в положении 1560, с получением рекомбинантного штамма, содержащего кодирующий мутированный BBD29_04920 ген.

В соответствии со способом конструирования согласно настоящему изобретению указанное конструирование включает по меньшей мере что-либо одно из мутагенеза, сайт-направленного ПЦР-мутагенеза и/или гомологичной рекомбинации и т.п.

В соответствии со способом конструирования согласно настоящему изобретению мутация относится к изменению основания в положении 1560 в SEQ ID NO: 1 с заменой цитозина (С) на аденин (А). В частности, последовательность полинуклеотида, содержащая кодирующий мутированный BBD29_04920 ген, представлена в SEQ ID NO: 2.

Кроме того, указанный способ конструирования включает следующие этапы:

(1) конструирование последовательности нуклеотидов гена BBD29_04920 дикого типа, представленной в SEQ ID NO: 1, чтобы вызвать мутацию основания в положении 1560, с получением последовательности полинуклеотида мутированного гена BBD29_04920;

(2) соединение мутированной последовательности полинуклеотида с плазмидой для конструирования рекомбинантного вектора;

(3) введение указанного рекомбинантного вектора в штамм-хозяин с получением рекомбинантного штамма, содержащего кодирующий мутированный BBD29_04920 ген.

В соответствии со способом конструирования согласно настоящему изобретению указанный этап (1) включает конструирование гена BBD29_04920 с точечной мутацией: в соответствии с геномной последовательностью немодифицированного штамма, синтез двух пар праймеров P1, Р2 и Р3, Р4 для амплификации фрагмента гена BBD29_04920, и введение точечной мутации в ген BBD29_04920 дикого типа, SEQ ID NO: 1, с применением сайт-направленного ПЦР-мутагенеза, с получением последовательности нуклеотидов гена BBD29_04920 с точечной мутацией, SEQ ID NO: 2, обозначенного как BBD29_04920^C1560A.

Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения геном немодифицированного штамма может происходить из штамма АТСС13869, последовательность генома которого можно найти на веб-сайте NCBI.

Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения на этапе (1) используют следующие праймеры:

Р1: 5' CAGTGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAG TGTTTCTGTC TTGACCTTGG (SEQ ID NO: 5)

Р2: 5' AGCCACGATG GTGACTTTTT GCAAGTTGTT_3' (SEQ ID NO: 6)

Р3: 5' AACAACTTGC AAAAAGTCAC CATCGTGGCT 3' (SEQ ID NO: 7)

Р4: 5' CAGCTATGACCATGATTACGAATTCGAGCTCGGTACCC ACAGATTGGG CAGGTGCC 3' (SEQ ID NO: 8)

Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения ПЦР-амплификацию осуществляют следующим образом: предварительная денатурация в течение 5 минут при 94°С, денатурация в течение 30 с при 94°С, ренатурация в течение 30 с при 52°С и удлинение в течение 40 с при 72°С в ходе 30 циклов, и избыточное удлинение в течение 10 мин при 72°С.

Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения ПЦР-амплификацию с перекрывающимися праймерами осуществляют следующим образом: предварительная денатурация в течение 5 минут при 94°С, денатурация в течение 30 с при 94°С, ренатурация в течение 30 с при 52°С и удлинение в течение 90 с при 72°С в ходе 30 циклов, и избыточное удлинение в течение 10 мин при 72°С.

В соответствии со способом конструирования согласно настоящему изобретению этап (2) включает конструирование рекомбинантной плазмиды, включающей сборку выделенного и очищенного BBD29_04920^C1560A с плазмидой pK18mobsacB с помощью системы рекомбинации NEBuider, с получением рекомбинантной плазмиды.

В соответствии со способом конструирования согласно настоящему изобретению указанный этап (3) включает конструирование рекомбинантного штамма путем трансформации рекомбинантной плазмидой штамма-хозяина с получением рекомбинантного штамма.

Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения трансформацию на этапе (3) осуществляют методом электротрансформации.

Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения штамм-хозяин представляет собой АТСС 13869.

Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения штамм-хозяин представляет собой Corynebacterium glutamicum CGMCC №21220.

Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения указанная рекомбинация достигается путем гомологичной рекомбинации.

Согласно четвертому аспекту настоящего изобретения также предложен способ конструирования рекомбинантного штамма, продуцирующего L-глутаминовую кислоту.

В соответствии с настоящим изобретением указанный способ конструирования включает следующие этапы:

амплификация 5'- и 3' -фрагментов плеч гомологии BBD29_04920 и последовательности кодирующей области гена BBD29_04920 с областью его промотора, и введение гена BBD29_04920 или BBD29_04920 С1560А в геном штамма-хозяина путем гомологичной рекомбинации, что позволит указанному штамму сверхэкспрессировать ген BBD29_04920 или BBD29_04920^C1560A.

Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения используют следующие праймеры для амплификации 5'-фрагментов плеч гомологии:

Р7: 5' CAGTGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAG GACCCGCTTG CCATACGAAG 3' (SEQ ID NO: 11)

Р8: 5' GCATCACAAT GACATAACGA АТСТАСТСАТ CTGAAGAATC 3' (SEQ ID NO: 12)

Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения используют следующие праймеры для амплификации 3'-фрагментов плеча гомологии:

P11: 5' GCGCGGGGAA GCGTCGATAG TTCGTGGGCA CTCTGGTTTG 3' (SEQ ID NO: 15)

P12: 5' CAGCTATGACCATGATTACGAATTCGAGCTCGGTACCC CATAAGAAAC AACCACTTCC 3' (SEQ ID NO: 16)

Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения используют следующие праймеры для амплификации последовательности кодирующей области гена и области его промотора:

Р9: 5' GATTCTTCAG ATGAGTAGAT TCGT TATGTCATTG TGATGC 3' (SEQ ID NO: 13)

Р10: 5' CAAACCAGAG TGCCCACGAA CTATCGACGC TTCCCCGCGC 3' (SEQ ID NO: 14)

Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения, опять же с вышеупомянутыми Р7/Р12 в качестве праймеров, осуществляют амплификацию с применением в качестве матриц смеси трех фрагментов, амплифицированного 5'- фрагмента плеча гомологии, 3'-фрагмента плеча гомологии и фрагмента последовательности кодирующей области гена и области его промотора, с получением интегрированного фрагмента плеча гомологии.

Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения используемая ПЦР-система содержит: 10×буфер Ex Taq Buffer: 5 мкл, смесь dNTP (2,5 мМ каждый): 4 мкл, Mg²⁺ (25 мМ): 4 мкл, праймеры (10 пМ): каждого по 2 мкл; и Ex Taq (5 Ед/мкл): 0,25 мкл, в общем объеме 50 мкл. ПЦР- амплификацию осуществляют следующим образом: предварительная денатурация в течение 5 минут при 94°С, денатурация в течение 30 с при 94°С, ренатурация в течение 30 с при 52°С, удлинение в течение 120 с при 72°С (30 циклов) и избыточное удлинение в течение 10 мин при 72°С.

Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения используют систему рекомбинации NEBuider для сборки челночной плазмиды PK18mobsacB с интегрированным фрагментом плеча гомологии, с получением интегративной плазмиды.

Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения штамма-хозяин трансфицируют указанной интегративной плазмидой для введения гена BBD29_04920 или BBD29_04920^C1560A в геном штамма-хозяина путем гомологичной рекомбинации.

Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения штамм-хозяин представляет собой Corynebacterium glutamicum CGMCC №21220.

Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения штамм-хозяин представляет собой АТСС 13869.

Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения указанный штамм-хозяин представляет собой штамм, несущий последовательность полинуклеотида, представленную в SEQ ID NO: 2.

Согласно пятому аспекту настоящего изобретения также предложен способ конструирования рекомбинантного штамма, продуцирующего L-глутаминовую кислоту.

В соответствии с настоящим изобретением указанный способ конструирования включает следующие этапы:

амплификация последовательности кодирующей области гена BBD29_04920 и области промотора, или последовательности кодирующей области гена BBD29_04920^C1560A и области промотора, конструирование сверхэкспрессирующего плазмидного вектора и трансформация указанным вектором штамма-хозяина, что позволяет указанному штамму сверхэкспрессировать ген BBD29_04920 или BBD29_04920^C1560A.

Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения используют следующие праймеры для амплификации последовательности кодирующей области гена и области его промотора:

Р17: 5' GCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGAGGATCCCCTCGTTATGTCATTGTGATGC 3' (SEQ ID NO: 21)

P18: 5' ATCAGGCTGAAAATCTTCTCTCATCCGCCAAAACCTATCGACGCTTCCCCGCGC 3' (SEQ ID NO: 22).

Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения указанная ПЦР-система содержит: 10×буфер Ex Taq Buffer: 5 мкл, смесь dNTP (2,5 мМ каждого): 4 мкл, Mg²⁺ (25 мМ): 4 мкл, праймеры (10 пМ): 2 мкл каждого из них, Ex Taq (5 Ед/мкл): 0,25 мкл, в общем объеме 50 мкл. ПЦР-амплификацию осуществляют следующим образом: предварительная денатурация в течение 5 минут при 94°С, денатурация в течение 30 с при 94°С, ренатурация в течение 30 с при 52°С, удлинение в течение 90 с при 72°С (30 циклов) и избыточное удлинение в течение 10 мин при 72°С.

Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения систему рекомбинации NEBuider применяют для сборки челночной плазмиды pXMJ19 с фрагментом BBD29_04920 или BBD29_04920^C1560A, имеющей собственные промоторы, с получением сверхэкспрессирующей плазмиды.

Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения штамм-хозяин представляет собой Corynebacterium glutamicum CGMCC №21220.

Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения штамм-хозяин представляет собой АТСС 13869.

Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения указанный штамм-хозяин представляет собой штамм, несущий последовательность полинуклеотида, представленную в SEQ ID NO: 2.

Рекомбинантный штамм, предложенный согласно настоящему изобретению, может индивидуально применяться при ферментации для продуцирования L-глутаминовой кислоты, и может также применяться для продуцирования L-глутаминовой кислоты при гибридной ферментации с другими продуцирующими L-глутаминовую кислоту бактериями.

Согласно другому аспекту настоящего изобретения предложен способ получения L-глутаминовой кислоты, который включает культивирование бактерии; и получение L-глутаминовой кислоты из культуры.

Бактерия может быть культивирована в подходящей культуральной среде в условиях культивирования, известных в данной области техники. Культуральная среда может содержать: источник углерода, источник азота, следовые элементы и комбинацию перечисленного. При культивировании могут корректироваться значения рН культуры. Кроме того, может предотвращаться образование пузырьков при культивировании, например, с применением пеногасителя для предотвращения образования пузырьков. Кроме того, в культуру могут вводиться газы при культивировании. Указанные газы могут включать любые газы, способные поддерживать аэробные условия в культуре. При культивировании температура культуры может составлять от 20°С до 45°С. Продуцированная L-глутаминовая кислота может быть выделена из культуры, т.е. культуру обрабатывают серной кислотой или соляной кислотой и т.п., с последующим применением комбинации таких способов, как анионообменная хроматография, конденсация, кристаллизация и изоэлектрическое осаждение.

Согласно настоящему изобретению также предложен белок, обозначенный как белок BBD29_04920^N520K, отличающийся тем, что указанный белок может представлять собой любое из:

А1) белка, имеющего последовательность аминокислот SEQ ID NO: 4;

А2) белка, обладающего 80% или более идентичностью белку, указанному в А1), и имеющего ту же функцию, что и белок, указанный в А1), полученного путем осуществления в последовательности аминокислот, представленной в SEQ ID NO: 4, замены, и/или делеции, и/или добавления остатков аминокислот;

A3) слитого белка, имеющего ту же функцию, полученного путем присоединения метки к N-концу и/или С-концу А1) или А2).

Согласно настоящему изобретению также предложена молекула нуклеиновой кислоты, обозначенная как BBD29_04920^C1560A, отличающаяся тем, что указанная молекула нуклеиновой кислоты BBD29_04920^C1560A может представлять собой любое из:

B1) молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей белок BBD29_04920^N520K;

B2) молекулы ДНК, кодирующая последовательность которой представлена в SEQ ID NO: 2;

B3) молекулы ДНК, последовательность нуклеотидов которой представлена в SEQ ID NO: 2.

Молекула ДНК, представленная в SEQ ID NO: 2, представляет собой ген BBD29-04920^Cl560A согласно настоящему изобретению.

Молекула ДНК, представленная в SEQ ID NO: 2 (ген BBD29_04920^C1560A), кодирует белок BBD29_04920^N520K, представленный в SEQ ID NO: 4.

Последовательность аминокислот белка BBD29_04920^N520K (SEQ ID NO: 4) получают путем замены аспарагина (N) в положении 520 в SEQ ID NO: 3 на лизин (K).

Согласно настоящему изобретению также предложен биоматериал, отличающийся тем, что указанный биоматериал может представлять собой любое из:

B1) экспрессионной кассеты, содержащей молекулу нуклеиновой кислоты BBD29_04920^C1560A;

B2) рекомбинантного вектора, содержащего молекулу нуклеиновой кислоты BBD29_04920^C1560A, или рекомбинантного вектора, содержащего экспрессионную кассету С1);

B3) рекомбинантного микроорганизма, содержащего молекулу нуклеиновой кислоты BBD29_04920^C1560A, или рекомбинантного микроорганизма, содержащего экспрессионную кассету С1), или рекомбинантного микроорганизма, содержащего рекомбинантный вектор С2).

Согласно настоящему изобретению также предложено любое из следующих применений по любому из D1)-D8):

F1) применение любого из D1)-D8) для регуляции продуцирования L-глутаминовой кислоты у микроорганизма;

F2) применение любого из D1)-D8) для конструирования генетически сконструированной бактерии для продуцирования L-глутаминовой кислоты;

F3) применение любого из D1)-D8) для продуцирования L-глутаминовой кислоты;

где D1)-D8) представляет собой:

D1) белок BBD29_04920^N520K;

D2) молекулу нуклеиновой кислоты BBD29_04920^C1560A;

D3) биоматериал;

D4) молекулу ДНК, последовательность нуклеотидов которой представляет собой SEQ ID NO: 1;

D5) молекулу ДНК, обладающую идентичностью 90% или более молекуле ДНК и имеющую ту же функцию, что и молекула ДНК, которая представлена в SEQ ID NO: 1, полученную путем осуществления в последовательности нуклеотидов, представленной в SEQ ID NO: 1, модификации, и/или замены, и/или делеции, и/или добавления одного или нескольких нуклеотидов;

D6) экспрессионную кассету, содержащую молекулу ДНК по D4) или D5);

D7) рекомбинантный вектор, содержащий молекулу ДНК по D4) или D5), или рекомбинантный вектор, содержащий экспрессионную кассету по D6);

D8) рекомбинантный микроорганизм, содержащий молекулу ДНК по D4) или D5), или рекомбинантный микроорганизм, содержащий экспрессионную кассету по D6), или рекомбинантный микроорганизм, содержащий рекомбинантный вектор по D7).

Молекула ДНК, представленная в SEQ ID NO: 1, представляет собой ген BBD29_04920 согласно настоящему изобретению.

Молекула ДНК, представленная в SEQ ID NO: 1 (ген BBD29_04920), кодирует белок, представленный в SEQ ID NO: 3.

В настоящем документе «идентичность» относится к идентичности последовательностей аминокислот или последовательностей нуклеотидов. Международные сайты поиска гомологии в сети Интернет могут применяться для определения идентичности последовательностей аминокислот или последовательностей нуклеотидов, например, страница BLAST на главной странице веб-сайта NCBI. Например, в Advanced BLAST2.1 может быть использована программа blastp со значением параметра Expect value, установленным на 10, всеми фильтрами в режиме OFF, BLOSUM62 в качестве матрицы и значениями штрафа за введение пропуска, штрафа за удлинение пропуска на один остаток и коэффициента лямбда (Lambda ratio), установленными на 11, 1 и 0,85 (устанавливаемые по умолчанию значения), соответственно, и выполнен поиск идентичности между парой аминокислотных последовательностей для расчета, после чего можно получить значение идентичности (%).

Согласно настоящему документу идентичность 80% или более может представлять собой идентичность, составляющую по меньшей мере 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%.

Согласно настоящему документу идентичность 90% или более может представлять собой идентичность, составляющую по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%.

Регуляция продуцирования L-глутаминовой кислоты у микроорганизма согласно описанию в настоящем документе может представлять собой повышение или понижение уровня накопления L-глутаминовой кислоты у микроорганизма (т.е. стимуляцию или ингибирование биосинтеза L-глутаминовой кислоты).

Согласно настоящему изобретению также предложен способ повышения продуцирования L-глутаминовой кислоты у микроорганизма, при этом указанный способ включает любое из:

Е1) повышения уровня экспрессии или содержания молекулы нуклеиновой кислоты BBD29_04920^C1560A в микроорганизме-мишени с получением микроорганизма, продуцирующего больше L-глутаминовой кислоты, чем микроорганизм-мишень;

Е2) повышения уровня экспрессии или содержания молекулы ДНК по D4) или D5) в микроорганизме-мишени с получением микроорганизма, продуцирующего больше L-глутаминовой кислоты, чем микроорганизм-мишень;

Е3) осуществления мутации в молекуле ДНК, последовательность нуклеотидов которой представляет собой SEQ ID NO: 1, в микроорганизме-мишени с получением микроорганизма, продуцирующего больше L-глутаминовой кислоты, чем микроорганизм-мишень.

Согласно описанному выше способу указанная мутация может представлять собой точечную мутацию, т.е. мутацию одного нуклеотида.

Согласно описанному выше способу указанная точечная мутация может представлять собой мутацию остатка аспарагина в положении 520 в последовательности аминокислот, кодируемой молекулой ДНК, представленной в SEQ ID NO: 1, на остаток другой аминокислоты.

Согласно описанному выше способу указанная точечная мутация может представлять собой мутацию аспарагина в положении 520 в последовательности аминокислот, кодируемой молекулой ДНК, представленной в SEQ ID NO: 1, на лизин, что обеспечивает мутированный белок BBD29_04920 N520K, последовательность аминокислот которого представляет собой SEQ ID NO: 4.

Указанная мутация относится к изменению одного или нескольких оснований в гене в результате сайт-направленной мутации, что приводит к изменению аминокислотного состава соответствующего белка, с получением таким образом нового белка, или обеспечением новой функции исходного белка, то есть представляет собой сайт-направленную мутацию генов. Методики осуществления сайт-направленных мутаций генов, таких как опосредованный олигонуклеотидными праймерами сайт-направленный мутагенез, ПЦР-опосредованный сайт-направленный мутагенез или кассетный мутагенез хорошо известны специалистам в данной области техники.

Точечная мутация согласно описанию в настоящем документе может представлять собой замену одного основания, инсерцию одного основания или делецию одного основания, и в особенности замену одного основания. Замена одного основания может представлять собой аллельную замену.

Указанная точечная мутация может заключаться в осуществлении модификации нуклеиновой кислоты с заменой цитозина (С) в положении 1560 гена BBD29_04920 (SEQ ID NO: 1).

В частности, указанная точечная мутация может заключаться в осуществлении мутации цитозина (G) в положении 1560 гена BBD29_04920 (SEQ ID NO: 1) на аденин (А) с получением молекулы ДНК, представленной в SEQ ID NO: 2.

В настоящем документе рекомбинантный вектор может представлять собой, в частности, рекомбинантный вектор pK18-BBD29_04920^Cl560A, PK18mobsacB-BBD29_04920, PK18mobsacB-BBD29_04920^C1560A, pXMJ19-BBD29_04920 или pXMJ19-BBD29_04920^Cl560A.

Рекомбинантный вектор pK18-BBD29_04920^Cl560A содержит молекулу ДНК, представленную положениями 846-1788 в мутированном гене BBD29_04920^C1560A, представленном в SEQ ID NO: 2.

Рекомбинантный вектор PK18mobsacB-BBD29_04920 применяют для интеграции экзогенного гена BBD29_04920 в хромосому хозяина для сверхэкспрессии гена BBD29_04920 дикого типа у бактерии-продуцента.

Рекомбинантный вектор pK18mobsacB-BBD29_04920^Cl560A применяют для интеграции экзогенного гена BBD29-04920^C1560A в хромосому хозяина для сверхэкспрессии мутантного типа BBD29_04920^C1560A у бактерии-продуцента.

Рекомбинантный вектор pXMJ19-BBD29_04920 применяют для экспрессии с помощью плазмиды экзогенного гена BBD29_04920 вне хромосомы для сверхэкспрессии гена BBD29_04920 дикого типа у бактерии-продуцента.

Рекомбинантный вектор pXMJ19-BBD29_04920^Cl560A применяют для экспрессии с помощью плазмиды экзогенного гена BBD29_04920^C1560A вне хромосомы для сверхэкспрессии мутантного типа гена BBD29_04920^Cl560Ay бактерии-продуцента.

Все рекомбинантные векторы из pK18-BBD29-04920^Cl560A, PK18mobsacB-BBD29_04920, PK18mobsacB-BBD29_04920^Cl560A, pXMJ19-BBD29_04920 и pXMJ19-BBD29_04920^Cl560A включены в заявленный объем настоящего изобретения.

В настоящем документе рекомбинантный микроорганизм может представлять собой, в частности, рекомбинантную бактерию YPG-001, YPG-002, YPG-003, YPG-004 или YPG-005.

Рекомбинантная бактерия YPG-001 представляет собой рекомбинантную бактерию, полученную путем трансформации рекомбинантного вектора pK18-BBD29_04920^Cl560A в Corynebacterium glutamicum CGMCC №21220, и указанная рекомбинантная бактерия YPG-001 содержит мутированный ген BBD29_04920^C1560A, представленный в SEQ ID NO: 2.

Рекомбинантная бактерия YPG-002 содержит двухкопийный ген BBD29_04920, представленный в SEQ ID NO: 1; рекомбинантная бактерия, содержащая двухкопийный ген BBD29_04920, способна значимо и устойчиво повышать уровень экспрессии гена BBD29_04920. Рекомбинантная бактерия YPG-002 представляет собой сконструированную бактерию, сверхэкспрессирующую ген BBD29 04920 дикого типа из генома.

Рекомбинантная бактерия YPG-003 содержит мутированный ген BBD29_04920^C1560A, представленный в SEQ ID NO: 2; рекомбинантная бактерия YPG-003 представляет собой сконструированную бактерию, сверхэкспрессирующую мутантный тип гена BBD29_04920^C1560A из генома.

Рекомбинантная бактерия YPG-004 содержит двухкопийный ген BBD29_04920, представленный в SEQ ID NO: 1; указанная рекомбинантная бактерия YPG-004 представляет собой сконструированную бактерию, сверхэкспрессирующую ген BBD29_04920 дикого типа на плазмиде, т.е. сверхэкспрессия происходит вне хромосомы с помощью плазмиды pXMJ19-BBD29_04920.

Рекомбинантная бактерия YPG-005 содержит мутированный ген BBD29_04920^C1560A, представленный в SEQ ID NO: 2; рекомбинантная бактерия YPG-005 представляет собой сконструированную бактерию, сверхэкспрессирующую мутантный тип гена BBD29_04920^C1560A на плазмиде, т.е. сверхэкспрессия происходит вне хромосомы с помощью плазмиды pXMJ19-BBD29_04920^C1560A.

Все рекомбинантные бактерии YPG-001, YPG-002, YPG-003, YPG-004 или YPG-005 включены в заявленный объем настоящего изобретения.

Согласно настоящему изобретению также предложен способ конструирования рекомбинантного микроорганизма, при этом указанный способ включает по меньшей мере одно из:

F1) введения молекулы нуклеиновой кислоты BBD29_04920^C1560A в микроорганизм-мишень с получением рекомбинантного микроорганизма;

F2) введения молекулы ДНК, представленной в SEQ ID NO: 1, в микроорганизм-мишень с получением рекомбинантного микроорганизма;

F3) редактирования молекулы ДНК, представленной в SEQ ID NO: 1, с использованием средства редактирования генов (такого как редактирование генов с изменением одного основания) для введения молекулы ДНК, представленной в SEQ ID NO: 2, в микроорганизм-мишень.

Указанное введение может быть представлено трансформацией бактерии-хозяина вектором, несущим молекулу ДНК согласно настоящему изобретению, любыми известными способами трансформации, такими как способ химической трансформации или способ электротрансформации. Введенная молекула ДНК может быть однокопийной или многокопийной. Введение может быть представлено интеграцией экзогенного гена в хромосому хозяина, или экспрессией вне хромосомы с помощью плазмиды.

Согласно настоящему изобретению также предложен способ получения L-глутаминовой кислоты, при этом указанный способ включает продуцирование L-глутаминовой кислоты любым из рекомбинантных микроорганизмов согласно описанию в настоящем документе.

Описанный выше способ может представлять собой получение L-глутаминовой кислоты ферментативным способом, а рекомбинантный микроорганизм может относиться к роду Corynebacterium, и в частности, представлять собой Corynebacterium glutamicum и его варианты.

Согласно настоящему изобретению:

SEQ ID NO: 1: последовательность кодирующей области BBD29_04920 дикого типа

SEQ ID NO: 3: последовательность аминокислот белка, кодируемого BBD29_04920 дикого типа

SEQ ID NO: 4: последовательность аминокислот белка, кодируемого BBD29 04920^N520K

Информация о депонировании: Название штамма: Corynebacterium glutamicum; Латинское название: Corynebacterium glutamicum; штамм №: YPGLU001; Депозитарное учреждение: Китайский главный центр коллекций микробиологических культур, сокращенно CGMCC; Адрес: No. 3, Yard 1, Beichen West Road, Chaoyang District, Beijing; Дата депонирования: 23 ноября 2020 г.; номер доступа в депозитарном центре: CGMCC №21220.

Наилучшие способы реализации изобретения

Техническое решение настоящего изобретения будет подробно описано ниже на конкретных примерах. Следует понимать, что следующие ниже примеры приведены только для иллюстрации и объяснения настоящего изобретения, и их не следует интерпретировать как ограничение объема правовой охраны настоящего изобретения. Все методики, реализованные на основе описанного выше содержания настоящего изобретения, входят в объем защиты настоящего изобретения. Если конкретным образом не указано иное, исходные материалы и реагенты, используемые в приведенных ниже примерах, могут быть коммерчески доступными или могут быть получены известными способами; все выполняемые операции известны в данной области техники или выполняются в соответствии с руководством пользователя по применению коммерчески доступных продуктов.

В приведенных ниже примерах состав основной среды, используемой для культивирования штамма, одинаковый, а сахарозу, канамицин или хлорамфеникол добавляют в состав основной среды по мере необходимости. Компоненты основной среды, которые дают основную среду при растворении в воде, приведены ниже:

Corynebacterium glutamicum YPGLU001 CGMCC №21220 в примерах ниже был депонирован в Китайском главном центре коллекций микробиологических культур (сокращенно CGMCC, адрес: No. 3, Yard 1, Beichen West Road, Chaoyang District, Beijing, Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences) 23 ноября 2020 г. под номером доступа CGMCC №21220. Corynebacterium glutamicum YPGLU001 также известен как Corynebacterium glutamicum CGMCC №21220.

Пример 1. Конструирование вектора для трансформации pK18-BBD29_04920^Cl560A, содержащего кодирующую область гена BBD29_04920 с точечной мутацией

В соответствии с последовательностью генома Corynebacterium glutamicum АТСС13869, опубликованной в NCBI, разрабатывали и синтезировали два пары праймеров для амплификации последовательности кодирующей области гена BBD29_04920 (SEQ ID NO: 1 BBD29_04920), и вводили точечную мутацию в штамм Corynebacterium glutamicum CGMCC №21220 путем аллельной замены (подтверждено соответствие кодирующей области гена BBD29_04920 на хромосоме штамма АТСС13869 при секвенировании). Последовательность аминокислот, соответствующая кодируемому белку, представлена в SEQ ID NO: 3, при замене цитозина (С) в положении 1560 последовательности нуклеотидов гена BBD29_04920 на аденин (A) (SEQ ID NO: 2: BBD29_04920^C1560A), соответственно, происходит замена аспарагина (N) в положении 520 в последовательности аминокислот, соответствующей кодируемому белку, на лизин (K) (SEQ ID NO: 4: BBD29_04920^N520K). Разработаны следующие праймеры (синтезированы Invitrogen Corporation, Шанхай):

P1: 5' CAGTGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAG TGTTTCTGTC TTGACCTTGG (SEQ ID NO: 5)

P2: 5' AGCCACGATG GTGACTTTTT GCAAGTTGTT_3' (SEQ ID NO: 6)

P3: 5' AACAACTTGC AAAAAGTCAC CATCGTGGCT 3' (SEQ ID NO: 7)

Р4: 5' CAGCTATGACCATGATTACGAATTCGAGCTCGGTACCC ACAGATTGGG CAGGTGCC 3' (SEQ ID NO: 8)

Способ конструирования: используя в качестве матрицы Corynebacterium glutamicum АТСС13869, осуществляют ПЦР-амплификацию с соответствующими праймерами P1, Р2 и Р3, Р4.

ПЦР-система: 10×буфер Ex Taq Buffer: 5 мкл, смесь dNTP (каждый 2,5 мМ): 4 мкл, Mg²⁺ (25 мМ): 4 мкл, праймеры (10 пМ): по 2 мкл каждого, Ex Taq (5 Ед/мкл): 0,25 мкл, матрица 1 мкл и вода в качестве баланса в общем объеме 50 мкл.

Вышеуказанную ПЦР-амплификацию осуществляют путем предварительной денатурации в течение 5 минут при 94°С, денатурации в течение 30 с при 94°С, ренатурации в течение 30 с при 52°С и удлинения в течение 40 с при 72°С в течение 30 циклов; и избыточного удлинения в течение 10 мин при 72°С с получением двух фрагментов ДНК, содержащих кодирующую область гена BBD29_04920 С1560А, каждый из которых имеет размер 766 п.о. и 778 п.о. (BBD29_04920 Up и BBD29_04920 Down).

Указанные два фрагмента ДНК выделяют посредством электрофореза на агарозном геле и очищают. Указанные два фрагмента ДНК затем используют в качестве матрицы с Р1 и Р4 в качестве праймеров для ПЦР-амплификации с перекрывающимися праймерами с получением фрагмента длиной 1514 п.о. (то есть BBD29_04920^C1560A-Up-Down, последовательность нуклеотидов которого представлена положениями 846-1788 SEQ ID NO: 2.

ПЦР-система: 10×буфер Ex Taq Buffer: 5 мкл, смесь dNTP (каждый 2,5 мМ): 4 мкл, Mg²⁺ (25 мМ): 4 мкл, праймеры (10 пМ): по 2 мкл каждого, Ex Taq (5 Ед/мкл): 0,25 мкл, матрица 1 мкл и вода в качестве баланса в общем объеме 50 мкл.

Вышеуказанную перекрывающуюся ПЦР-амплификацию осуществляют путем предварительной денатурации в течение 5 минут при 94°С, денатурации в течение 30 с при 94°С, ренатурации в течение 30 с при 52°С, удлинения в течение 90 с при 72°С в течение 30 циклов и избыточного удлинения в течение 10 мин при 72°С.

Фрагмент ДНК вызывает изменение цитозина (С) в положении 1560 кодирующей области гена BBD29 04920 у Corynebacterium glutamicum CGMCC №21220 на аденин (А) и, в конечном итоге, приводит к изменению аминокислоты в положении 520 кодируемого белка с аспарагина (N) на лизин (K).

После расщепления плазмиды pK18mobsacB (приобретена у Addgene Coporation) Xba I, BBD29_04920 C1560A и линеаризированную плазмиду pK18mobsacB выделяют посредством электрофореза на агарозном геле и очищают, с последующей сборкой с применением системы рекомбинации NEBuider (NEB E5520S), получая вектор pK18-BBD29_04920^Cl560A, плазмиду, содержащую маркер устойчивости к канамицину. При этом вектор pK18-BBD29_04920^Cl560A отправляют для секвенирования и идентификации в компанию, осуществляющую секвенирование, и вектор pK18-BBD29_04920^Cl560A, содержащий корректную точечную мутацию (С-А), отправляют на хранение.

pK18-BBD29_04920^Cl560A представляет собой рекомбинантный вектор, полученный путем инсерции фрагмента ДНК BBD29_04920^C1560A-Up-Down, представленного положениями 846-1488 SEQ ID NO: 2 в перечне последовательностей, в сайты распознавания XbaI в векторе pK18mobsacB, при сохранении в неизмененном виде других последовательностей вектора pK18mobsacB.

Пример 2. Конструирование сконструированного штамма, содержащего BBD29_04920^C1560A с точечной мутацией

Способ конструирования: Плазмиду pK18-BBD29_04920^Cl560A после аллельной замены электротрансформируют в Corynebacterium glutamicum CGMCC №21220. Каждую из культивируемых моноколоний идентифицируют с использованием праймера Р1 и универсального праймера M13R (5'CAG GAA АСА GCT ATG АСС 3') для определения положительного штамма с амплифицированной из него полосой около 1521 п.о. (представленной в SEQ ID NO: 29 для указанной последовательности). Положительный штамм культивируют на культуральной среде, содержащей 15% сахарозы, и выросшие моноколонии культивируют на культуральных средах с канамицином и без канамицина, соответственно. Штаммы, растущие на культуральной среде без канамицина и не растущие на культуральной среде с канамицином, дополнительно подвергают ПЦР-идентификации со следующими праймерами (синтезированы Invitrogen Corporation, Шанхай):

Р5: 5' CTATTGCTTT CTGGTGGTG 3' (SEQ ID NO: 9)

Р6: 5' TCGCCTTACG CTCCCTGCGT 3' (SEQ ID NO: 10)

Описанные выше амплифицированные продукты ПЦР (с последовательностью согласно SEQ ID NO: 30) подвергают денатурации при высокой температуре и в ледяной бане, после чего проводят SSCP-электрофорез (с амплифицированным фрагментом плазмиды pK18-BBD29_04920 C1560A в качестве положительного контроля, амплифицированным фрагментом АТСС13869 в качестве отрицательного контроля, и водой в качестве холостого контроля). Поскольку фрагменты отличаются структурой, их локализация при электрофорезе будет разной. Соответственно, штамм, характеризующийся успешной аллельной заменой, представляет собой такой штамм, локализация фрагмента которого при электрофорезе не совпадает с локализацией отрицательного контрольного фрагмента, и совпадает с локализацией положительного контрольного фрагмента. Праймеры Р5 и Р6 используют также для ПЦР-амплификации целевого фрагмента штамма, характеризующегося успешной аллельной заменой, который затем лигируют в вектор PMD19-T для секвенирования. Используя выравнивание последовательностей для мутированной последовательности оснований, подтверждают успешность аллельной замены у указанного штамма, который обозначен как YPG-001.

Рекомбинантная бактерия YPG-001 представляет собой генетически сконструированный штамм YPG-001 с точечной мутацией (С-А), полученной путем введения точечной мутации С1560А в кодирующую область гена BBD29_04920 (SEQ ID NO: 1) Corynebacterium glutamicum CGMCC №21220 в аллельной замене, чтобы вызвать мутацию в положении 1560 гена от С до А, сохраняя при этом другие последовательности гена без изменений.

По сравнению с Corynebacterium glutamicum CGMCC21220, Corynebacterium glutamicum YPG-001 отличается только заменой гена BBD29_04920, представленного в SEQ ID NO: 1, в геноме Corynebacterium glutamicum CGMCC21220, на ген BBD29_04920^C1560A, представленный в SEQ ID NO: 2. SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 2 отличаются только одним нуклеотидом, локализованным в положении 1560.

Пример 3. Конструирование сконструированного штамма со сверхэкспрессируемым геном BBD29_04920 или BBD29_04920^C1560AB геноме

В соответствии с последовательностью генома Corynebacterium glutamicum АТСС13869, опубликованной в базе NCBI, разрабатывали и синтезировали три пары праймеров для амплификации 5'- и 3' -фрагментов плеч гомологии, а также последовательность кодирующей области гена BBD29_04920 и область промотора для введения гена BBD29_04920 или BBD29_04920^C1560A в штамм Corynebacterium glutamicum CGMCC №21220 путем гомологичной рекомбинации.

Разработаны следующие праймеры (синтезированы Invitrogen Corporation, Шанхай):

Р7: 5' CAGTGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAG GACCCGCTTG CCATACGAAG 3' (SEQ ID NO: 11)

Р8: 5' GCATCACAAT GACATAACGA АТСТАСТСАТ CTGAAGAATC 3' (SEQ ID NO: 12)

Р9: 5' GATTCTTCAG ATGAGTAGAT TCGT TATGTCATTG TGATGC 3' (SEQ ID NO: 13)

Р10: 5' CAAACCAGAG TGCCCACGAA CTATCGACGC TTCCCCGCGC 3' (SEQ ID NO: 14)

P11: 5' GCGCGGGGAA GCGTCGATAG TTCGTGGGCA CTCTGGTTTG 3' (SEQ ID NO: 15)

P12: 5' CAGCTATGACCATGATTACGAATTCGAGCTCGGTACCC CATAAGAAAC AACCACTTCC 3' (SEQ ID NO: 16)

Способ конструирования: Используя Corynebacterium glutamicum ATCC13869 или YPG-001, соответственно, в качестве матрицы, осуществляют ПЦР-амплификацию с праймерами Р7/Р8, Р9/Р10 и Р11/Р22, соответственно, с получением 5'-фрагмента плеча гомологии длиной около 806 п.о. (как указано в SEQ ID NO: 31 для последовательности), фрагмента области, кодирующей ген BBD29_04920 или BBD29_04920^С1560А, и области промотора длиной около 1987 п.о. (как указано в SEQ ID NO: 32 или SEQ ID NO: 33 для последовательности), и 3'-фрагмента плеча гомологии длиной около 788 п.о. (как указано в SEQ ID NO: 34 для последовательности). Кроме того, с применением Р7/Р12 в качестве праймеров осуществляют амплификацию со смесью трех описанных выше амплифицированных фрагментов в качестве матрицы с получением единого фрагмента плеч гомологии против хода транскрипции-BBD29_04920 по ходу транскрипции (как указано в SEQ ID NO: 35 для последовательности); или единого фрагмента плеч гомологии против хода транскрипции-BBD29_04920 С1560А по ходу транскрипции (как указано в SEQ ID NO: 36 для последовательности). После завершения ПЦР-реакции осуществляют электрофорез амплифицированных продуктов для выделения требуемого фрагмента ДНК длиной приблизительно 3501 п.о. с применением набора с колонкой для выделения ДНК на геле (TIANGEN), который лигируют, используя систему рекомбинации NEBuider, в челночную плазмиду PK18mobsacB, расщепленную Xba I и выделенную с получением интегративной плазмиды PK18mobsacB-BBD29_04920 или PK18mobsacB- BBD29_04920^C1560A. Указанная плазмида содержит маркер устойчивости к канамицину, благодаря чему путем скрининга с канамицином может быть получен рекомбинантный штамм, содержащий интегрированную в геном плазмиду.

pK18mobsacB-BBD29_04920 представляет собой рекомбинантный вектор, полученный путем инсерции единого фрагмента плеч гомологии 5'-BBD29_04920-3' в сайты распознавания Xba I челночной плазмиды pk18mobsacB.

pK18mobsacB-BBD29_04920^Cl560A представляет собой рекомбинантный вектор, полученный путем инсерции единого фрагмента плеч гомологии 5'-BBD29_04920^Cl560A-3' в сайты распознавания Xba I челночной плазмиды pk18mobsacB.

ПЦР-система: 10×буфер Ех Taq Buffer: 5 мкл, смесь dNTP (каждый 2,5 мМ): 4 мкл, Mg²⁺ (25 мМ): 4 мкл, праймеры (10 пМ): по 2 мкл каждого, Ex Taq (5 Ед/мкл): 0,25 мкл, матрица 1 мкл и вода до общего объема 50 мкл.

ПЦР-амплификацию осуществляют путем предварительной денатурации в течение 5 минут при 94°С, денатурации в течение 30 с при 94°С, ренатурации в течение 30 с при 52°С, удлинения в течение 120 с при 72°С (30 циклов) и избыточного удлинения в течение 10 мин при 72°С.

Каждую из двух интегративных плазмид вводят в штамм Corynebacterium glutamicum CGMCC №21220 путем электротрансформации, и осуществляют ПЦР-идентификацию выросших моноколоний с праймерами Р13/Р14 для получения положительного штамма, содержащего фрагмент длиной около 1674 п. о. (как указано в SEQ ID NO: 37 для последовательности), полученного при ПЦР-амплификации, тогда как штамм, не содержащий каких-либо амплифицированных из него фрагментов, представляет собой исходный штамм. При скрининге с 15% сахарозы положительный штамм культивируют на культуральных средах с канамицином и без канамицина, соответственно, и штаммы, растущие на культуральной среде без канамицина и не растущие на культуральной среде с канамицином подвергают дальнейшей ПЦР с праймерами Р15/Р16 для идентификации. Штамм с полосой около 1943 п.о. (последовательность согласно SEQ ID NO: 38), амплифицированный этим способом, представляет собой штамм с геном BBD29_04920 или BBD29_04920^C1560A, интегрированным в геном Corynebacterium glutamicum CGMCC №21220, обозначенный как YPG-002 (без точечной мутации) и YPG-003 (с точечной мутацией).

Р13: 5' GTCCAAGGTG ACGGCCGCAC 3' (SEQ ID NO: 17)

Р14: 5' СТТТТТСАСС AATGAGTGGC 3' (SEQ ID NO: 18)

P15: 5' CCGTAAACAG CTTCTAAGCT 3' (SEQ ID NO: 19)

P16: 5' ATATTCGGCC CAGCAGCAGC 3' (SEQ ID NO: 20)

Рекомбинантная бактерия YPG-002 представляет собой рекомбинантную бактерию, содержащую двухкопийный ген BBD29_04920, представленный в SEQ ID NO: 1, полученную путем интеграции единого фрагмента плеч гомологии 5'-BBD29_04920-3' в геном штамма Corynebacterium glutamicum YPGLU001, и указанная рекомбинантная бактерия, содержащая двухкопийный ген BBD29_04920, способна значимо и устойчиво повышать уровень экспрессии BBD29_04920.

Рекомбинантная бактерия YPG-003 представляет собой рекомбинантную бактерию, содержащую мутантный ген BBD29_04920 С1560А, представленный в SEQ ID NO: 2, полученный путем интеграции единого фрагмента плеч гомологии 5'-BBD29_04920^Cl560A-3' в геном штамма Corynebacterium glutamicum YPGLU001.

Пример 4. Конструирование сконструированного (модифицированного) штамма, сверхэкспрессирующего ген BBD29_04920 или BBD29_04920^C1560A с плазмиды

В соответствии с последовательностью генома Corynebacterium glutamicum АТСС13869, опубликованной в базе NCBI, разрабатывали и синтезировали пару праймеров для амплификации последовательности кодирующей области гена BBD29 04920 и области промотора. Разработаны следующие праймеры (синтезированы Invitrogen Corporation, Шанхай):

P17: 5' GCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGAGGATCCCCTCGTTATGTCATTGTGATGC 3' (SEQ ID NO: 21)

P18: 5' ATCAGGCTGAAAATCTTCTCTCATCCGCCAAAACCTATCGACGCTTCCCCGCGC 3' (SEQ ID NO: 22)

Способ конструирования: Используя YPG-002 или YPG-001, соответственно, в качестве матрицы, осуществляют ПЦР-амплификацию с праймерами Р17/Р18 с получением фрагмента ДНК в 2017 п.о., содержащего ген BBD29_04920 или BBD29_BBD29_04920^C1560A и его промотор (последовательность согласно SEQ ID NO: 39 или SEQ ID NO: 40). Осуществляют электрофорез амплифицированных продуктов для выделения требуемого фрагмента ДНК длиной 1947 п.о. с применением набора с колонкой для выделения ДНК на геле, который лигируют, используя систему рекомбинации NEBuider, в челночную плазмиду pXMJ19, расщепленную EcoR I и выделенную с получением сверхэкспрессирующей плазмиды pXMJ19-BBD29_04920 или pXMJ19-BBD29_04920^Cl560A. Эта плазмида содержит маркер устойчивости к хлорамфениколу, и трансформация штамма плазмидой может быть достигнута при скрининге с хлорамфениколом.

ПЦР-система: 10×буфер Ex Taq Buffer: 5 мкл, смесь dNTP (каждый 2,5 мМ): 4 мкл, Mg²⁺ (25 мМ): 4 мкл, праймеры (10 пМ): по 2 мкл каждого, Ex Taq (5 Ед/мкл): 0,25 мкл, матрица: 1 мкл и вода в качестве баланса в общем объеме 50 мкл.

ПЦР-амплификацию осуществляют путем предварительной денатурации в течение 5 минут при 94°С, денатурации в течение 30 с при 94°С, ренатурации в течение 30 с при 52°С, удлинения в течение 90 с при 72°С (30 циклов) и избыточного удлинения в течение 10 мин при 72°С.

Сверхэкспрессирующая плазмида pXMJ19-BBD29 04920 представляет собой рекомбинантный вектор, полученный путем инсерции фрагмента ДНК (представленного в SEQ ID NO: 39 для указанной последовательности), содержащего ген BBD29_04920 и его промотор, в сайты распознавания EcoR I челночной плазмиды pXMJ19.

Сверхэкспрессирующая плазмида pXMJ19-BBD29_04920^Cl560A представляет собой рекомбинантный вектор, полученный путем инсерции фрагмента ДНК (представленного в SEQ ID NO: 40 для указанной последовательности), содержащего ген BBD29_04920^C1560A и его промотор, в сайты распознавания EcoR I челночной плазмиды pXMJ19.

Каждую из этих двух плазмид вводят в штамм Corynebacterium glutamicum CGMCC №21220 путем электротрансформации, и осуществляют ПЦР-идентификацию выросших моноколоний с праймерами M13R (-48) (5'AGCGGATAAC AATTTCACAC AGGA 3') и Р18 для трансформированного штамма, содержащего фрагмент длиной около 2056 п.о. (последовательность без точечной мутации согласно SEQ ID NO: 41; последовательность с точечной мутацией согласно SEQ ID NO: 41, за исключением положения 1794, представляющего собой А), из ПЦР-амплификации, обозначенного как YPG-004 (без точечной мутации) и YPG-005 (с точечной мутацией).

Рекомбинантная бактерия YPG-004 содержит двухкопийный ген BBD29_04920 согласно SEQ ID NO: 1; рекомбинантная бактерия YPG-004 представляет собой сконструированную бактерию, сверхэкспрессирующую ген BBD29_04920 дикого типа на плазмиде, т.е. сверхэкспрессия происходит вне хромосомы с помощью плазмиды pXMJ19-BBD29_04920.

Рекомбинантная бактерия YPG-005 содержит мутированный ген BBD29_04920^C1560A согласно SEQ ID NO: 2; рекомбинантная бактерия YPG-005 представляет собой сконструированную бактерию, сверхэкспрессирующую мутантный ген BBD29_04920^C1560A на плазмиде, т.е. сверхэкспрессия происходит вне хромосомы с плазмиды pXMJ19-BBD29_04920^Cl560A.

Пример 5. Конструирование сконструированного штамма с делетированным в геноме геном BBD29_04920

В соответствии с последовательностью генома Corynebacterium glutamicum АТСС13869, опубликованной в базе NCBI, синтезируют две пары праймеров для амплификации фрагментов на обоих концах кодирующей области гена BBD29_04920, в виде 5'- и 3'-фрагментов плеч гомологии. Разработаны следующие праймеры (синтезированы Invitrogen Corporation, Шанхай):

Р19: 5' CAGTGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGTAAGGGGCAG TTGGTCTCG 3' (SEQ ID NO: 23)

Р20: 5' GTATCAGGGGTTAAAAATTGCTTAATTTTCC CTGGCAGAA 3' (SEQ ID NO: 24)

P21: 5' TTCTGCCAGGGAAAATTAAGCAATTTTTAACCCCTGATAC 3' (SEQ ID NO: 25)

P22: 5' CAGCTATGACCATGATTACGAATTCGAGCTCGGTACCCATATCGCGCG ACATTGCGCG 3' (SEQ ID NO: 26)

Способ конструирования: Используя Corynebacterium glutamicum ATCC13869 в качестве матрицы, проводят ПЦР-амплификацию с праймерами Р19/Р20 и Р21/Р22, соответственно, с получением 5'-фрагмента плеча гомологии длиной 733 п.о. (последовательность согласно SEQ ID NO: 42) и 3'-фрагмента плеча гомологии длиной 814 п.о. (последовательность согласно SEQ ID NO: 43). Кроме того, Р19/Р22 используют в качестве праймеров для ПЦР с перекрывающимися праймерами с получением единого фрагмента плеч гомологии длиной 1507 п. о. (последовательность согласно SEQ ID NO: 44). После завершения ПЦР-реакции проводят электрофорез амплифицированных продуктов для выделения требуемого фрагмента ДНК длиной 1507 п.о. с применением набора с колонкой для выделения ДНК на геле, который лигируют с помощью системы рекомбинации NEBuider в челночную плазмиду, плазмиду pk18mobsacB, расщепленную Xba I и выделенную с получением нокаутной плазмиды. Указанная плазмида содержит маркер устойчивости к канамицину.

Указанной нокаутной плазмидой электротрансформируют штамм Corynebacterium glutamicum CGMCC №21220 и осуществляют ПЦР-идентификацию выросших моноколоний, в каждом случае со следующими праймерами (синтезированы Invitrogen Corporation, Шанхай):

Р23: 5' TAAG GGGCAG TTGGTCTCG 3' (SEQ ID NO: 27)

Р24:5' ATATCGCGCG ACATTGCGCG 3' (SEQ ID NO: 28)

Штамм с полосами, соответствующими 1433 п. о. (последовательность согласно SEQ ID NO: 45) и 3380 п.о. (как указано в SEQ ID NO: 46 для последовательности), амплифицированными в ходе описанной выше ПЦР-амплификации, представляет собой положительный штамм, тогда как штамм с единственной амплифицированной при ПЦР полосой, соответствующей 3380 п. о., представляет собой исходный штамм. При скрининге на культуральной среде с 15% сахарозы положительный штамм культивируют на культуральных средах с канамицином и без канамицина, соответственно, и штаммы, растущие на культуральной среде без канамицина и не растущие на культуральной среде с канамицином, дополнительно подвергают ПЦР-идентификации с праймерами Р23/Р24. Штамм с полосой, соответствующей 1433 п.о., амплифицированной из него, представляет собой генетически сконструированный штамм с нокаутом кодирующей области гена BBD29_04920, обозначенный как YPG-006.

Рекомбинантная бактерия YPG-006 представляет собой штамм, полученный путем нокаута кодирующей области гена BBD29_04920 в геноме Corynebacterium glutamicum CGMCC №21220.

Пример 6. Эксперименты с ферментацией для получения L-глутаминовой кислоты

Эксперименты с ферментацией проводят на штаммах YPG-001, YPG-002, YPG-003, YPG-004, YPG-005 и YPG-006, сконструированных согласно приведенным примерам, и на исходном штамме Corynebacterium glutamicum CGMCC №21220, в ферментативном резервуаре типа BLBIO-5GC-4-H (приобретен у Shanghai Bailun Biological Technology Co., Ltd.); культуральная среда (которую получают растворением компонентов, представленных в таблице 1, в воде) описана в таблице 1; процесс управления представлен в таблице 2; продукты ферментации собирают.

В начальный момент, когда посев завершен, бактерия находится в системе в концентрации 15 г/л. Во время ферментации: содержание сахара в системе (остаточный сахар) контролируют путем добавления водного раствора, содержащего 50-55% глюкозы.

Для каждого штамма эксперименты проводят в трех повторностях. Результаты приведены в таблице 3.

Результаты из таблицы 3 демонстрируют, что сверхэкспрессия гена BBD29_04920, или точечная мутация в кодирующей области гена BBD29_04920, BBD29_04920^C1560A, и/или сверхэкспрессия у Corynebacterium glutamicum способствуют повышению продуцирования L-глутаминовой кислоты, тогда как ослабление экспрессии или нокаут гена неблагоприятны для накопления L-глутаминовой кислоты.

Варианты реализации настоящего изобретения проиллюстрированы выше. Однако настоящее изобретение не ограничено вышеупомянутыми вариантами реализации. Любые модификации, эквивалентные замены, усовершенствования и т.д., осуществленные в соответствии с сущностью и принципами настоящего изобретения, должны быть включены в заявленный объем настоящего изобретения.

Промышленное применение

Согласно настоящему изобретению было обнаружено, что через снижение экспрессии или нокаут гена BBD29_04920 кодируемый этим геном продукт влияет на способность к продуцированию L-глутаминовой кислоты, и что рекомбинантный штамм, полученный путем введения точечной мутации в кодирующую последовательность, или путем увеличения числа копий, или сверхэкспрессии указанного гена, способствует продуцированию глутаминовой кислоты в более высокой концентрации по сравнению с немодифицированным штаммом.

В частности, согласно настоящему изобретению сначала конструируют генетически сконструированную бактерию YPG-001 с точечной мутацией (С-А) путем введения точечной мутации в кодирующую область гена BBD29_04920 (SEQ ID NO: 1) Corynebacterium glutamicum CGMCC №21220 путем аллельной замены. Для дополнительного изучения и подтверждения того, что сверхэкспрессия гена BBD29_04920 дикого типа или содержащего его мутантного гена BBD29_04920^C1560A у бактерии-продуцента может повышать продуцирование L-глутаминовой кислоты, экзогенный ген интегрируют в хромосому хозяина или экспрессируют вне хромосомы с помощью плазмиды, соответственно, конструируя таким образом сконструированные бактерии YPG-002, YPG-003, YPG-004 и YPG-005, сверхэкспрессирующие ген BBD29_04920 или ген BBD29_04920^C1560A из генома и с плазмиды. Эксперименты предполагают, что ген BBD29_04920 и его варианты вовлечены в биосинтез L-глутаминовой кислоты. Используя сверхэкспрессию или нокаут гена BBD29_04920, или сайт-направленную мутацию (такую как точечная мутация) в указанном гене, можно регулировать уровень накопления L-глутаминовой кислоты у микроорганизма. Точечная мутация в кодирующей области гена BBD29_04920 или сверхэкспрессия гена BBD29_04920 или его мутантного гена BBD29_04920^С1560А у бактерии-продуцента способствует повышению продуцирования и увеличению показателя конверсии L-глутаминовой кислоты, тогда как нокаут или ослабление экспрессии гена BBD29_04920 неблагоприятны для накопления L-глутаминовой кислоты. Ген BBD29_04920 и его вариант (такой как ген BBD29_04920^C1560A) могут применяться для конструирования генетически сконструированного штамма для продуцирования L-глутаминовой кислоты, чтобы способствовать повышению продуцирования L-глутаминовой кислоты, и для получения высокопродуктивного и высококачественного штамма для промышленного производства, полезного для широкого диапазона вариантов применения и имеющего высокую экономическую ценность для промышленного производства L-глутаминовой кислоты.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> INNER MONGOLIA EPPEN BIOTECH CO., LTD. / ИННЕР МОНГОЛИА ЭППЕН БИОТЕК КО.,

ЛТД

<120> Recombinant Strain with Modified Gene BBD29_04920 for Producing

L-Glutamic Acid, and Method for Constructing the Same and Use Thereof /

РЕКОМБИНАНТНЫЙ ШТАММ С МОДИФИЦИРОВАННЫМ ГЕНОМ BBD29_04920 ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ

L-ГЛУТАМИНОВОЙ КИСЛОТЫ, А ТАКЖЕ СПОСОБ ЕГО КОНСТРУИРОВАНИЯ И ПРИМЕНЕНИЕ

<150> 202011631254 .5

<151> 2020-12-30

<160> 46

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1788

<212> ДНК

<213> Corynebacterium glutamicum

<400> 1

atgactacat ctgacccaaa ttcgaaaccg atagtggagg atgctcagcc agagcagatc 60

accgcaaccg aagaactggc gggtttgctt gagaatccaa ctaacctgga agggaaactg 120

gccgacgccg aagaggaaat tatcctcgaa ggcgaagacg cccaggcctc acttaactgg 180

tcagtcatcg ttccagccct agtcattgtc ctagcgacag tggtgtgggg tatcggattc 240

aaagatagct ttaccaactt tgctagttct gcgttgtcag cagtagttga caatctcggc 300

tgggccttca ttttgtttgg cacagtcttt gtatttttta tcgttgttat cgccgctagt 360

aaattcggca cgattcgctt aggccgcatt gatgaagcac cagagtttcg cacggtgtca 420

tggatttcca tgatgtttgc tgcaggtatg ggtattggtt tgatgttcta cggaaccaca 480

gaacctttaa ccttctaccg caatggtgta cctggatatg atgaacacaa tgttggcgtt 540

gctatgtcca cgacaatgtt ccactggacc ttgcatccat gggctatcta cgcaattgtg 600

ggcctagcca ttgcctattc gaccttccga gtgggccgta aacagcttct aagctctgca 660

ttcgtgccac tcattggtga aaaaggtgca gaaggatggt tgggcaagct catcgacatc 720

ctggcgatta tcgccacagt attcggcacc gcatgttccc ttggcctggg tgcgctgcag 780

atcggtgcag gactttccgc agccaacatc attgaaaatc cgagtgactg gactgtcatt 840

ggtattgttt ctgtcttgac cttggcattt atcttctctg ctatttctgg tgtgggcaag 900

ggaatccagt acctctccaa cgccaacatg gttctggcag ctctgctcgc gattttcgtg 960

ttcgttgtcg gaccaaccgt gtcgattttg aacctgctgc caggttctat tggcaactac 1020

ctgtccaact tcttccaaat ggcaggccgc actgccatga gtgccgacgg cacagcaggt 1080

gagtggctag gtagctggac catcttctac tgggcatggt ggatctcttg gtcaccattc 1140

gtaggaatgt tcttggcacg tatttcccgt ggccgctcca tccgtgagtt catcctgggc 1200

gtgttgctcg tcccagcagg tgtgtccacc gtatggttct ccatttttgg tggcactgcg 1260

attgtcttcg aacaaaatgg ggaatccatt tggggtgatg gtgcagcaga agagcagctc 1320

tttggattgc ttcatgcact tccaggtggg caaataatgg gcatcatcgc catgattttg 1380

ctgggtactt tcttcattac ctctgcagac tctgcttcca ccgtcatggg caccatgagt 1440

cagcacggcc agctggaagc caacaagtgg gtgacagctg cctggggtgt tgctaccgca 1500

gctattggac taacgctatt gctttctggt ggtgacaatg ccttgaacaa cttgcaaaac 1560

gtcaccatcg tggctgcaac accattcctg tttgtggtta ttggattgat gtttgcgtta 1620

gtcaaggact taagcaatga tgtgatctac ctcgagtacc gtgagcagca acgcttcaac 1680

gcgcgccttg cccgtgaacg tcgtgttcac aatgaacacc gcaagcgtga actggctgca 1740

aagcgacgca gggagcgtaa ggcgagtggc gcggggaagc gtcgatag 1846

<210> 2

<211> 1788

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<400> 2

atgactacat ctgacccaaa ttcgaaaccg atagtggagg atgctcagcc agagcagatc 60

accgcaaccg aagaactggc gggtttgctt gagaatccaa ctaacctgga agggaaactg 120

gccgacgccg aagaggaaat tatcctcgaa ggcgaagacg cccaggcctc acttaactgg 180

tcagtcatcg ttccagccct agtcattgtc ctagcgacag tggtgtgggg tatcggattc 240

aaagatagct ttaccaactt tgctagttct gcgttgtcag cagtagttga caatctcggc 300

tgggccttca ttttgtttgg cacagtcttt gtatttttta tcgttgttat cgccgctagt 360

aaattcggca cgattcgctt aggccgcatt gatgaagcac cagagtttcg cacggtgtca 420

tggatttcca tgatgtttgc tgcaggtatg ggtattggtt tgatgttcta cggaaccaca 480

gaacctttaa ccttctaccg caatggtgta cctggatatg atgaacacaa tgttggcgtt 540

gctatgtcca cgacaatgtt ccactggacc ttgcatccat gggctatcta cgcaattgtg 600

ggcctagcca ttgcctattc gaccttccga gtgggccgta aacagcttct aagctctgca 660

ttcgtgccac tcattggtga aaaaggtgca gaaggatggt tgggcaagct catcgacatc 720

ctggcgatta tcgccacagt attcggcacc gcatgttccc ttggcctggg tgcgctgcag 780

atcggtgcag gactttccgc agccaacatc attgaaaatc cgagtgactg gactgtcatt 840

ggtattgttt ctgtcttgac cttggcattt atcttctctg ctatttctgg tgtgggcaag 900

ggaatccagt acctctccaa cgccaacatg gttctggcag ctctgctcgc gattttcgtg 960

ttcgttgtcg gaccaaccgt gtcgattttg aacctgctgc caggttctat tggcaactac 1020

ctgtccaact tcttccaaat ggcaggccgc actgccatga gtgccgacgg cacagcaggt 1080

gagtggctag gtagctggac catcttctac tgggcatggt ggatctcttg gtcaccattc 1140

gtaggaatgt tcttggcacg tatttcccgt ggccgctcca tccgtgagtt catcctgggc 1200

gtgttgctcg tcccagcagg tgtgtccacc gtatggttct ccatttttgg tggcactgcg 1260

attgtcttcg aacaaaatgg ggaatccatt tggggtgatg gtgcagcaga agagcagctc 1320

tttggattgc ttcatgcact tccaggtggg caaataatgg gcatcatcgc catgattttg 1380

ctgggtactt tcttcattac ctctgcagac tctgcttcca ccgtcatggg caccatgagt 1440

cagcacggcc agctggaagc caacaagtgg gtgacagctg cctggggtgt tgctaccgca 1500

gctattggac taacgctatt gctttctggt ggtgacaatg ccttgaacaa cttgcaaaaa 1560

gtcaccatcg tggctgcaac accattcctg tttgtggtta ttggattgat gtttgcgtta 1620

gtcaaggact taagcaatga tgtgatctac ctcgagtacc gtgagcagca acgcttcaac 1680

gcgcgccttg cccgtgaacg tcgtgttcac aatgaacacc gcaagcgtga actggctgca 1740

aagcgacgca gggagcgtaa ggcgagtggc gcggggaagc gtcgatag 1846

<210> 3

<211> 595

<212> БЕЛОК

<213> Corynebacterium glutamicum

<400> 3

Met Thr Thr Ser Asp Pro Asn Ser Lys Pro Ile Val Glu Asp Ala Gln

1 5 10 15

Pro Glu Gln Ile Thr Ala Thr Glu Glu Leu Ala Gly Leu Leu Glu Asn

20 25 30

Pro Thr Asn Leu Glu Gly Lys Leu Ala Asp Ala Glu Glu Glu Ile Ile

35 40 45

Leu Glu Gly Glu Asp Ala Gln Ala Ser Leu Asn Trp Ser Val Ile Val

50 55 60

Pro Ala Leu Val Ile Val Leu Ala Thr Val Val Trp Gly Ile Gly Phe

65 70 75 80

Lys Asp Ser Phe Thr Asn Phe Ala Ser Ser Ala Leu Ser Ala Val Val

85 90 95

Asp Asn Leu Gly Trp Ala Phe Ile Leu Phe Gly Thr Val Phe Val Phe

100 105 110

Phe Ile Val Val Ile Ala Ala Ser Lys Phe Gly Thr Ile Arg Leu Gly

115 120 125

Arg Ile Asp Glu Ala Pro Glu Phe Arg Thr Val Ser Trp Ile Ser Met

130 135 140

Met Phe Ala Ala Gly Met Gly Ile Gly Leu Met Phe Tyr Gly Thr Thr

145 150 155 160

Glu Pro Leu Thr Phe Tyr Arg Asn Gly Val Pro Gly Tyr Asp Glu His

165 170 175

Asn Val Gly Val Ala Met Ser Thr Thr Met Phe His Trp Thr Leu His

180 185 190

Pro Trp Ala Ile Tyr Ala Ile Val Gly Leu Ala Ile Ala Tyr Ser Thr

195 200 205

Phe Arg Val Gly Arg Lys Gln Leu Leu Ser Ser Ala Phe Val Pro Leu

210 215 220

Ile Gly Glu Lys Gly Ala Glu Gly Trp Leu Gly Lys Leu Ile Asp Ile

225 230 235 240

Leu Ala Ile Ile Ala Thr Val Phe Gly Thr Ala Cys Ser Leu Gly Leu

245 250 255

Gly Ala Leu Gln Ile Gly Ala Gly Leu Ser Ala Ala Asn Ile Ile Glu

260 265 270

Asn Pro Ser Asp Trp Thr Val Ile Gly Ile Val Ser Val Leu Thr Leu

275 280 285

Ala Phe Ile Phe Ser Ala Ile Ser Gly Val Gly Lys Gly Ile Gln Tyr

290 295 300

Leu Ser Asn Ala Asn Met Val Leu Ala Ala Leu Leu Ala Ile Phe Val

305 310 315 320

Phe Val Val Gly Pro Thr Val Ser Ile Leu Asn Leu Leu Pro Gly Ser

325 330 335

Ile Gly Asn Tyr Leu Ser Asn Phe Phe Gln Met Ala Gly Arg Thr Ala

340 345 350

Met Ser Ala Asp Gly Thr Ala Gly Glu Trp Leu Gly Ser Trp Thr Ile

355 360 365

Phe Tyr Trp Ala Trp Trp Ile Ser Trp Ser Pro Phe Val Gly Met Phe

370 375 380

Leu Ala Arg Ile Ser Arg Gly Arg Ser Ile Arg Glu Phe Ile Leu Gly

385 390 395 400

Val Leu Leu Val Pro Ala Gly Val Ser Thr Val Trp Phe Ser Ile Phe

405 410 415

Gly Gly Thr Ala Ile Val Phe Glu Gln Asn Gly Glu Ser Ile Trp Gly

420 425 430

Asp Gly Ala Ala Glu Glu Gln Leu Phe Gly Leu Leu His Ala Leu Pro

435 440 445

Gly Gly Gln Ile Met Gly Ile Ile Ala Met Ile Leu Leu Gly Thr Phe

450 455 460

Phe Ile Thr Ser Ala Asp Ser Ala Ser Thr Val Met Gly Thr Met Ser

465 470 475 480

Gln His Gly Gln Leu Glu Ala Asn Lys Trp Val Thr Ala Ala Trp Gly

485 490 495

Val Ala Thr Ala Ala Ile Gly Leu Thr Leu Leu Leu Ser Gly Gly Asp

500 505 510

Asn Ala Leu Asn Asn Leu Gln Asn Val Thr Ile Val Ala Ala Thr Pro

515 520 525

Phe Leu Phe Val Val Ile Gly Leu Met Phe Ala Leu Val Lys Asp Leu

530 535 540

Ser Asn Asp Val Ile Tyr Leu Glu Tyr Arg Glu Gln Gln Arg Phe Asn

545 550 555 560

Ala Arg Leu Ala Arg Glu Arg Arg Val His Asn Glu His Arg Lys Arg

565 570 575

Glu Leu Ala Ala Lys Arg Arg Arg Glu Arg Lys Ala Ser Gly Ala Gly

580 585 590

Lys Arg Arg

595

<210> 4

<211> 595

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<400> 4

Met Thr Thr Ser Asp Pro Asn Ser Lys Pro Ile Val Glu Asp Ala Gln

1 5 10 15

Pro Glu Gln Ile Thr Ala Thr Glu Glu Leu Ala Gly Leu Leu Glu Asn

20 25 30

Pro Thr Asn Leu Glu Gly Lys Leu Ala Asp Ala Glu Glu Glu Ile Ile

35 40 45

Leu Glu Gly Glu Asp Ala Gln Ala Ser Leu Asn Trp Ser Val Ile Val

50 55 60

Pro Ala Leu Val Ile Val Leu Ala Thr Val Val Trp Gly Ile Gly Phe

65 70 75 80

Lys Asp Ser Phe Thr Asn Phe Ala Ser Ser Ala Leu Ser Ala Val Val

85 90 95

Asp Asn Leu Gly Trp Ala Phe Ile Leu Phe Gly Thr Val Phe Val Phe

100 105 110

Phe Ile Val Val Ile Ala Ala Ser Lys Phe Gly Thr Ile Arg Leu Gly

115 120 125

Arg Ile Asp Glu Ala Pro Glu Phe Arg Thr Val Ser Trp Ile Ser Met

130 135 140

Met Phe Ala Ala Gly Met Gly Ile Gly Leu Met Phe Tyr Gly Thr Thr

145 150 155 160

Glu Pro Leu Thr Phe Tyr Arg Asn Gly Val Pro Gly Tyr Asp Glu His

165 170 175

Asn Val Gly Val Ala Met Ser Thr Thr Met Phe His Trp Thr Leu His

180 185 190

Pro Trp Ala Ile Tyr Ala Ile Val Gly Leu Ala Ile Ala Tyr Ser Thr

195 200 205

Phe Arg Val Gly Arg Lys Gln Leu Leu Ser Ser Ala Phe Val Pro Leu

210 215 220

Ile Gly Glu Lys Gly Ala Glu Gly Trp Leu Gly Lys Leu Ile Asp Ile

225 230 235 240

Leu Ala Ile Ile Ala Thr Val Phe Gly Thr Ala Cys Ser Leu Gly Leu

245 250 255

Gly Ala Leu Gln Ile Gly Ala Gly Leu Ser Ala Ala Asn Ile Ile Glu

260 265 270

Asn Pro Ser Asp Trp Thr Val Ile Gly Ile Val Ser Val Leu Thr Leu

275 280 285

Ala Phe Ile Phe Ser Ala Ile Ser Gly Val Gly Lys Gly Ile Gln Tyr

290 295 300

Leu Ser Asn Ala Asn Met Val Leu Ala Ala Leu Leu Ala Ile Phe Val

305 310 315 320

Phe Val Val Gly Pro Thr Val Ser Ile Leu Asn Leu Leu Pro Gly Ser

325 330 335

Ile Gly Asn Tyr Leu Ser Asn Phe Phe Gln Met Ala Gly Arg Thr Ala

340 345 350

Met Ser Ala Asp Gly Thr Ala Gly Glu Trp Leu Gly Ser Trp Thr Ile

355 360 365

Phe Tyr Trp Ala Trp Trp Ile Ser Trp Ser Pro Phe Val Gly Met Phe

370 375 380

Leu Ala Arg Ile Ser Arg Gly Arg Ser Ile Arg Glu Phe Ile Leu Gly

385 390 395 400

Val Leu Leu Val Pro Ala Gly Val Ser Thr Val Trp Phe Ser Ile Phe

405 410 415

Gly Gly Thr Ala Ile Val Phe Glu Gln Asn Gly Glu Ser Ile Trp Gly

420 425 430

Asp Gly Ala Ala Glu Glu Gln Leu Phe Gly Leu Leu His Ala Leu Pro

435 440 445

Gly Gly Gln Ile Met Gly Ile Ile Ala Met Ile Leu Leu Gly Thr Phe

450 455 460

Phe Ile Thr Ser Ala Asp Ser Ala Ser Thr Val Met Gly Thr Met Ser

465 470 475 480

Gln His Gly Gln Leu Glu Ala Asn Lys Trp Val Thr Ala Ala Trp Gly

485 490 495

Val Ala Thr Ala Ala Ile Gly Leu Thr Leu Leu Leu Ser Gly Gly Asp

500 505 510

Asn Ala Leu Asn Asn Leu Gln Lys Val Thr Ile Val Ala Ala Thr Pro

515 520 525

Phe Leu Phe Val Val Ile Gly Leu Met Phe Ala Leu Val Lys Asp Leu

530 535 540

Ser Asn Asp Val Ile Tyr Leu Glu Tyr Arg Glu Gln Gln Arg Phe Asn

545 550 555 560

Ala Arg Leu Ala Arg Glu Arg Arg Val His Asn Glu His Arg Lys Arg

565 570 575

Glu Leu Ala Ala Lys Arg Arg Arg Glu Arg Lys Ala Ser Gly Ala Gly

580 585 590

Lys Arg Arg

595

<210> 5

<211> 56

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<400> 5

cagtgccaag cttgcatgcc tgcaggtcga ctctagtgtt tctgtcttga ccttgg 56

<210> 6

<211> 30

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<400> 6

agccacgatg gtgacttttt gcaagttgtt 30

<210> 7

<211> 30

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<400> 7

aacaacttgc aaaaagtcac catcgtggct 30

<210> 8

<211> 56

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<400> 8

cagctatgac catgattacg aattcgagct cggtacccac agattgggca ggtgcc 56

<210> 9

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<400> 9

ctattgcttt ctggtggtg 19

<210> 10

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<400> 10

tcgccttacg ctccctgcgt 20

<210> 11

<211> 56

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<400> 11

cagtgccaag cttgcatgcc tgcaggtcga ctctaggacc cgcttgccat acgaag 56

<210> 12

<211> 40

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<400> 12

gcatcacaat gacataacga atctactcat ctgaagaatc 40

<210> 13

<211> 40

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<400> 13

gattcttcag atgagtagat tcgttatgtc attgtgatgc 40

<210> 14

<211> 40

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<400> 14

caaaccagag tgcccacgaa ctatcgacgc ttccccgcgc 40

<210> 15

<211> 40

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<400> 15

gcgcggggaa gcgtcgatag ttcgtgggca ctctggtttg 40

<210> 16

<211> 58

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<400> 16

cagctatgac catgattacg aattcgagct cggtacccca taagaaacaa ccacttcc 58

<210> 17

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<400> 17

gtccaaggtg acggccgcac 20

<210> 18

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<400> 18

ctttttcacc aatgagtggc 20

<210> 19

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<400> 19

ccgtaaacag cttctaagct 20

<210> 20

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<400> 20

atattcggcc cagcagcagc 20

<210> 21

<211> 56

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<400> 21

gcttgcatgc ctgcaggtcg actctagagg atcccctcgt tatgtcattg tgatgc 56

<210> 22

<211> 54

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<400> 22

atcaggctga aaatcttctc tcatccgcca aaacctatcg acgcttcccc gcgc 54

<210> 23

<211> 55

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<400> 23

cagtgccaag cttgcatgcc tgcaggtcga ctctagtaag gggcagttgg tctcg 55

<210> 24

<211> 40

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<400> 24

gtatcagggg ttaaaaattg cttaattttc cctggcagaa 40

<210> 25

<211> 40

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<400> 25

ttctgccagg gaaaattaag caatttttaa cccctgatac 40

<210> 26

<211> 58

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<400> 26

cagctatgac catgattacg aattcgagct cggtacccat atcgcgcgac attgcgcg 58

<210> 27

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<400> 27

taaggggcag ttggtctcg 19

<210> 28

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<400> 28

atatcgcgcg acattgcgcg 20

<210> 29

<211> 1521

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<400> 29

cagtgccaag cttgcatgcc tgcaggtcga ctctagtgtt tctgtcttga ccttggcatt 60

tatcttctct gctatttctg gtgtgggcaa gggaatccag tacctctcca acgccaacat 120

ggttctggca gctctgctcg cgattttcgt gttcgttgtc ggaccaaccg tgtcgatttt 180

gaacctgctg ccaggttcta ttggcaacta cctgtccaac ttcttccaaa tggcaggccg 240

cactgccatg agtgccgacg gcacagcagg tgagtggcta ggtagctgga ccatcttcta 300

ctgggcatgg tggatctctt ggtcaccatt cgtaggaatg ttcttggcac gtatttcccg 360

tggccgctcc atccgtgagt tcatcctggg cgtgttgctc gtcccagcag gtgtgtccac 420

cgtatggttc tccatttttg gtggcactgc gattgtcttc gaacaaaatg gggaatccat 480

ttggggtgat ggtgcagcag aagagcagct ctttggattg cttcatgcac ttccaggtgg 540

gcaaataatg ggcatcatcg ccatgatttt gctgggtact ttcttcatta cctctgcaga 600

ctctgcttcc accgtcatgg gcaccatgag tcagcacggc cagctggaag ccaacaagtg 660

ggtgacagct gcctggggtg ttgctaccgc agctattgga ctaacgctat tgctttctgg 720

tggtgacaat gccttgaaca acttgcaaaa agtcaccatc gtggctgcaa caccattcct 780

gtttgtggtt attggattga tgtttgcgtt agtcaaggac ttaagcaatg atgtgatcta 840

cctcgagtac cgtgagcagc aacgcttcaa cgcgcgcctt gcccgtgaac gtcgtgttca 900

caatgaacac cgcaagcgtg aactggctgc aaagcgacgc agggagcgta aggcgagtgg 960

cgcggggaag cgtcgatagg caatttttaa cccctgatac ccctttccgg ccgggcataa 1020

attaaggtgg tacgcatgac gaagaacgtg ctcgtatctg ttgcctggcc gtatgccaac 1080

ggaccccgtc acattggaca tgtggcgggg tttggtgtcc cctccgatgt gttcgcaagg 1140

ttccagcgaa tgtctggcaa caacgtgctc atggtgtccg gcaccgatga gcacggcacg 1200

ccacttctgg ttcaagcaga caaagaaggc gtcaccgttc aagacctcgc ggataagtac 1260

aaccgccaga tcgtcgaaga cctcaccggc ctgggcctgt cctatgacct tttcacccgc 1320

accaccacct ccaaccacta cgcagtagtg caggaactgt tccgtggtct gtacgacaac 1380

ggttacatga tcaaggaaac caccctcggt gcgatttccc catccactgg ccgtaccctg 1440

ccagaccgct acattgaagg cacctgccca atctgtgggt accgagctcg aattcgtaat 1500

catggtcata gctgtttcct g 1571

<210> 30

<211> 250

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<400> 30

ctattgcttt ctggtggtga caatgccttg aacaacttgc aaaacgtcac catcgtggct 60

gcaacaccat tcctgtttgt ggttattgga ttgatgtttg cgttagtcaa ggacttaagc 120

aatgatgtga tctacctcga gtaccgtgag cagcaacgct tcaacgcgcg ccttgcccgt 180

gaacgtcgtg ttcacaatga acaccgcaag cgtgaactgg ctgcaaagcg acgcagggag 240

cgtaaggcga 258

<210> 31

<211> 806

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<400> 31

cagtgccaag cttgcatgcc tgcaggtcga ctctaggacc cgcttgccat acgaagtcct 60

ggagaagatc tccacccgca tcaccaacga agttccagac gtaaaccgcg tggttttgga 120

cgtaacctcc aagccaccag gaaccatcga atgggagtag gccttaaatg agccttcgtt 180

aagcggcaat caccttatcg gtgattgccg ctttcccatt tctccgggtt ttctggaact 240

ttttgggcgt atgctgggaa tgatcttatt attttgattt cagaaagcag gagagaccag 300

atgagcgaaa tccttgaaac ctactgggca ccccacttcg gaaacaccga tgaagccgca 360

gcactcgttt catacttggc acaagcttcc ggtgatccta ttgaggttca caccctgttc 420

ggggatttag gtttagacgg actctctgga aactacaccg acactgagat cgacggctac 480

ggcgacgcat tcctgctggt tgcagcacta gcagtgttga tggctgaaaa caaagcatcc 540

ggcggcgtga atctgggtga agttggggga gctgataaat cgatccggct gcatgttgaa 600

tccaaggaaa acacccagat caacaccgca ttgaagtact ttgcgctttc cccagaagac 660

cacgcagcgg cagatcgctt cgatgaggat gacctgtctg agcttgccaa cttgagtgaa 720

gagctgcgcg gacagctgga ctaattgctg cccgtttaag gagtccgatt cttcagatga 780

gtagattcgt tatgtcattg tgatgc 832

<210> 32

<211> 1987

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<400> 32

gattcttcag atgagtagat tcgttatgtc attgtgatgc tcccgtgaac ataaacggga 60

cctactggct ttacttaagt aacagctatg taaaagacca ggtcaggttc gggtcggttt 120

aggtacgaaa cccatttttc ggtttgcttt ccaggtttcc ccaagtaaag gtgagtttta 180

tgactacatc tgacccaaat tcgaaaccga tagtggagga tgctcagcca gagcagatca 240

ccgcaaccga agaactggcg ggtttgcttg agaatccaac taacctggaa gggaaactgg 300

ccgacgccga agaggaaatt atcctcgaag gcgaagacgc ccaggcctca cttaactggt 360

cagtcatcgt tccagcccta gtcattgtcc tagcgacagt ggtgtggggt atcggattca 420

aagatagctt taccaacttt gctagttctg cgttgtcagc agtagttgac aatctcggct 480

gggccttcat tttgtttggc acagtctttg tattttttat cgttgttatc gccgctagta 540

aattcggcac gattcgctta ggccgcattg atgaagcacc agagtttcgc acggtgtcat 600

ggatttccat gatgtttgct gcaggtatgg gtattggttt gatgttctac ggaaccacag 660

aacctttaac cttctaccgc aatggtgtac ctggatatga tgaacacaat gttggcgttg 720

ctatgtccac gacaatgttc cactggacct tgcatccatg ggctatctac gcaattgtgg 780

gcctagccat tgcctattcg accttccgag tgggccgtaa acagcttcta agctctgcat 840

tcgtgccact cattggtgaa aaaggtgcag aaggatggtt gggcaagctc atcgacatcc 900

tggcgattat cgccacagta ttcggcaccg catgttccct tggcctgggt gcgctgcaga 960

tcggtgcagg actttccgca gccaacatca ttgaaaatcc gagtgactgg actgtcattg 1020

gtattgtttc tgtcttgacc ttggcattta tcttctctgc tatttctggt gtgggcaagg 1080

gaatccagta cctctccaac gccaacatgg ttctggcagc tctgctcgcg attttcgtgt 1140

tcgttgtcgg accaaccgtg tcgattttga acctgctgcc aggttctatt ggcaactacc 1200

tgtccaactt cttccaaatg gcaggccgca ctgccatgag tgccgacggc acagcaggtg 1260

agtggctagg tagctggacc atcttctact gggcatggtg gatctcttgg tcaccattcg 1320

taggaatgtt cttggcacgt atttcccgtg gccgctccat ccgtgagttc atcctgggcg 1380

tgttgctcgt cccagcaggt gtgtccaccg tatggttctc catttttggt ggcactgcga 1440

ttgtcttcga acaaaatggg gaatccattt ggggtgatgg tgcagcagaa gagcagctct 1500

ttggattgct tcatgcactt ccaggtgggc aaataatggg catcatcgcc atgattttgc 1560

tgggtacttt cttcattacc tctgcagact ctgcttccac cgtcatgggc accatgagtc 1620

agcacggcca gctggaagcc aacaagtggg tgacagctgc ctggggtgtt gctaccgcag 1680

ctattggact aacgctattg ctttctggtg gtgacaatgc cttgaacaac ttgcaaaacg 1740

tcaccatcgt ggctgcaaca ccattcctgt ttgtggttat tggattgatg tttgcgttag 1800

tcaaggactt aagcaatgat gtgatctacc tcgagtaccg tgagcagcaa cgcttcaacg 1860

cgcgccttgc ccgtgaacgt cgtgttcaca atgaacaccg caagcgtgaa ctggctgcaa 1920

agcgacgcag ggagcgtaag gcgagtggcg cggggaagcg tcgatagttc gtgggcactc 1980

tggtttg 2053

<210> 33

<211> 1987

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<400> 33

gattcttcag atgagtagat tcgttatgtc attgtgatgc tcccgtgaac ataaacggga 60

cctactggct ttacttaagt aacagctatg taaaagacca ggtcaggttc gggtcggttt 120

aggtacgaaa cccatttttc ggtttgcttt ccaggtttcc ccaagtaaag gtgagtttta 180

tgactacatc tgacccaaat tcgaaaccga tagtggagga tgctcagcca gagcagatca 240

ccgcaaccga agaactggcg ggtttgcttg agaatccaac taacctggaa gggaaactgg 300

ccgacgccga agaggaaatt atcctcgaag gcgaagacgc ccaggcctca cttaactggt 360

cagtcatcgt tccagcccta gtcattgtcc tagcgacagt ggtgtggggt atcggattca 420

aagatagctt taccaacttt gctagttctg cgttgtcagc agtagttgac aatctcggct 480

gggccttcat tttgtttggc acagtctttg tattttttat cgttgttatc gccgctagta 540

aattcggcac gattcgctta ggccgcattg atgaagcacc agagtttcgc acggtgtcat 600

ggatttccat gatgtttgct gcaggtatgg gtattggttt gatgttctac ggaaccacag 660

aacctttaac cttctaccgc aatggtgtac ctggatatga tgaacacaat gttggcgttg 720

ctatgtccac gacaatgttc cactggacct tgcatccatg ggctatctac gcaattgtgg 780

gcctagccat tgcctattcg accttccgag tgggccgtaa acagcttcta agctctgcat 840

tcgtgccact cattggtgaa aaaggtgcag aaggatggtt gggcaagctc atcgacatcc 900

tggcgattat cgccacagta ttcggcaccg catgttccct tggcctgggt gcgctgcaga 960

tcggtgcagg actttccgca gccaacatca ttgaaaatcc gagtgactgg actgtcattg 1020

gtattgtttc tgtcttgacc ttggcattta tcttctctgc tatttctggt gtgggcaagg 1080

gaatccagta cctctccaac gccaacatgg ttctggcagc tctgctcgcg attttcgtgt 1140

tcgttgtcgg accaaccgtg tcgattttga acctgctgcc aggttctatt ggcaactacc 1200

tgtccaactt cttccaaatg gcaggccgca ctgccatgag tgccgacggc acagcaggtg 1260

agtggctagg tagctggacc atcttctact gggcatggtg gatctcttgg tcaccattcg 1320

taggaatgtt cttggcacgt atttcccgtg gccgctccat ccgtgagttc atcctgggcg 1380

tgttgctcgt cccagcaggt gtgtccaccg tatggttctc catttttggt ggcactgcga 1440

ttgtcttcga acaaaatggg gaatccattt ggggtgatgg tgcagcagaa gagcagctct 1500

ttggattgct tcatgcactt ccaggtgggc aaataatggg catcatcgcc atgattttgc 1560

tgggtacttt cttcattacc tctgcagact ctgcttccac cgtcatgggc accatgagtc 1620

agcacggcca gctggaagcc aacaagtggg tgacagctgc ctggggtgtt gctaccgcag 1680

ctattggact aacgctattg ctttctggtg gtgacaatgc cttgaacaac ttgcaaaaag 1740

tcaccatcgt ggctgcaaca ccattcctgt ttgtggttat tggattgatg tttgcgttag 1800

tcaaggactt aagcaatgat gtgatctacc tcgagtaccg tgagcagcaa cgcttcaacg 1860

cgcgccttgc ccgtgaacgt cgtgttcaca atgaacaccg caagcgtgaa ctggctgcaa 1920

agcgacgcag ggagcgtaag gcgagtggcg cggggaagcg tcgatagttc gtgggcactc 1980

tggtttg 2053

<210> 34

<211> 788

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<400> 34

gcgcggggaa gcgtcgatag ttcgtgggca ctctggtttg gttaccagga tgggttagtc 60

attctgatca gcgaattcca cgttcacatc gccaattcca gagttcacaa ccagattcag 120

cattggacct tctagatcag cattgtgggc ggtgagatct ccaacatcac agcgcgctgt 180

gcccacaccg gcggtacaac ttaggctcac gggcacatca tcgggcaggg tgaccatgac 240

ttcgccgatc cctgaggtga tttggatgtt ttgttcctga tccaattggg tgaggtggct 300

gaaatcgagg ttcatttcac ccacgccaga ggtgtagctg ctgaggagtt catcgttggt 360

ggggatgaga ttgacatcgc cgattccagg gtcgtcttca aagtagatgg gatcgatatt 420

tgaaataaac aggcctgcga gggcgctcat gacaactccg gtaccaacta caccgccgac 480

aatccatggc cacacatggc gctttttctg aggcttttgt ggagggactt gtacatccca 540

ggtgttgtat tggttttggg caagtggatc ccaatgaggc gcttcggggg tttgttgcgc 600

gaagggtgca tagtagccct caacgggggt gatagtgctt agatctggtt ggggttgtgg 660

gtagagatct tcgtttttca tggtggcatc ctcagaaaca gtgaattcag tggtgagtag 720

tccgcggggt ggaagtggtt gtttcttatg gggtaccgag ctcgaattcg taatcatggt 780

catagctg 814

<210> 35

<211> 3501

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<400> 35

cagtgccaag cttgcatgcc tgcaggtcga ctctaggacc cgcttgccat acgaagtcct 60

ggagaagatc tccacccgca tcaccaacga agttccagac gtaaaccgcg tggttttgga 120

cgtaacctcc aagccaccag gaaccatcga atgggagtag gccttaaatg agccttcgtt 180

aagcggcaat caccttatcg gtgattgccg ctttcccatt tctccgggtt ttctggaact 240

ttttgggcgt atgctgggaa tgatcttatt attttgattt cagaaagcag gagagaccag 300

atgagcgaaa tccttgaaac ctactgggca ccccacttcg gaaacaccga tgaagccgca 360

gcactcgttt catacttggc acaagcttcc ggtgatccta ttgaggttca caccctgttc 420

ggggatttag gtttagacgg actctctgga aactacaccg acactgagat cgacggctac 480

ggcgacgcat tcctgctggt tgcagcacta gcagtgttga tggctgaaaa caaagcatcc 540

ggcggcgtga atctgggtga agttggggga gctgataaat cgatccggct gcatgttgaa 600

tccaaggaaa acacccagat caacaccgca ttgaagtact ttgcgctttc cccagaagac 660

cacgcagcgg cagatcgctt cgatgaggat gacctgtctg agcttgccaa cttgagtgaa 720

gagctgcgcg gacagctgga ctaattgctg cccgtttaag gagtccgatt cttcagatga 780

gtagattcgt tatgtcattg tgatgctccc gtgaacataa acgggaccta ctggctttac 840

ttaagtaaca gctatgtaaa agaccaggtc aggttcgggt cggtttaggt acgaaaccca 900

tttttcggtt tgctttccag gtttccccaa gtaaaggtga gttttatgac tacatctgac 960

ccaaattcga aaccgatagt ggaggatgct cagccagagc agatcaccgc aaccgaagaa 1020

ctggcgggtt tgcttgagaa tccaactaac ctggaaggga aactggccga cgccgaagag 1080

gaaattatcc tcgaaggcga agacgcccag gcctcactta actggtcagt catcgttcca 1140

gccctagtca ttgtcctagc gacagtggtg tggggtatcg gattcaaaga tagctttacc 1200

aactttgcta gttctgcgtt gtcagcagta gttgacaatc tcggctgggc cttcattttg 1260

tttggcacag tctttgtatt ttttatcgtt gttatcgccg ctagtaaatt cggcacgatt 1320

cgcttaggcc gcattgatga agcaccagag tttcgcacgg tgtcatggat ttccatgatg 1380

tttgctgcag gtatgggtat tggtttgatg ttctacggaa ccacagaacc tttaaccttc 1440

taccgcaatg gtgtacctgg atatgatgaa cacaatgttg gcgttgctat gtccacgaca 1500

atgttccact ggaccttgca tccatgggct atctacgcaa ttgtgggcct agccattgcc 1560

tattcgacct tccgagtggg ccgtaaacag cttctaagct ctgcattcgt gccactcatt 1620

ggtgaaaaag gtgcagaagg atggttgggc aagctcatcg acatcctggc gattatcgcc 1680

acagtattcg gcaccgcatg ttcccttggc ctgggtgcgc tgcagatcgg tgcaggactt 1740

tccgcagcca acatcattga aaatccgagt gactggactg tcattggtat tgtttctgtc 1800

ttgaccttgg catttatctt ctctgctatt tctggtgtgg gcaagggaat ccagtacctc 1860

tccaacgcca acatggttct ggcagctctg ctcgcgattt tcgtgttcgt tgtcggacca 1920

accgtgtcga ttttgaacct gctgccaggt tctattggca actacctgtc caacttcttc 1980

caaatggcag gccgcactgc catgagtgcc gacggcacag caggtgagtg gctaggtagc 2040

tggaccatct tctactgggc atggtggatc tcttggtcac cattcgtagg aatgttcttg 2100

gcacgtattt cccgtggccg ctccatccgt gagttcatcc tgggcgtgtt gctcgtccca 2160

gcaggtgtgt ccaccgtatg gttctccatt tttggtggca ctgcgattgt cttcgaacaa 2220

aatggggaat ccatttgggg tgatggtgca gcagaagagc agctctttgg attgcttcat 2280

gcacttccag gtgggcaaat aatgggcatc atcgccatga ttttgctggg tactttcttc 2340

attacctctg cagactctgc ttccaccgtc atgggcacca tgagtcagca cggccagctg 2400

gaagccaaca agtgggtgac agctgcctgg ggtgttgcta ccgcagctat tggactaacg 2460

ctattgcttt ctggtggtga caatgccttg aacaacttgc aaaacgtcac catcgtggct 2520

gcaacaccat tcctgtttgt ggttattgga ttgatgtttg cgttagtcaa ggacttaagc 2580

aatgatgtga tctacctcga gtaccgtgag cagcaacgct tcaacgcgcg ccttgcccgt 2640

gaacgtcgtg ttcacaatga acaccgcaag cgtgaactgg ctgcaaagcg acgcagggag 2700

cgtaaggcga gtggcgcggg gaagcgtcga tagttcgtgg gcactctggt ttggttacca 2760

ggatgggtta gtcattctga tcagcgaatt ccacgttcac atcgccaatt ccagagttca 2820

caaccagatt cagcattgga ccttctagat cagcattgtg ggcggtgaga tctccaacat 2880

cacagcgcgc tgtgcccaca ccggcggtac aacttaggct cacgggcaca tcatcgggca 2940

gggtgaccat gacttcgccg atccctgagg tgatttggat gttttgttcc tgatccaatt 3000

gggtgaggtg gctgaaatcg aggttcattt cacccacgcc agaggtgtag ctgctgagga 3060

gttcatcgtt ggtggggatg agattgacat cgccgattcc agggtcgtct tcaaagtaga 3120

tgggatcgat atttgaaata aacaggcctg cgagggcgct catgacaact ccggtaccaa 3180

ctacaccgcc gacaatccat ggccacacat ggcgcttttt ctgaggcttt tgtggaggga 3240

cttgtacatc ccaggtgttg tattggtttt gggcaagtgg atcccaatga ggcgcttcgg 3300

gggtttgttg cgcgaagggt gcatagtagc cctcaacggg ggtgatagtg cttagatctg 3360

gttggggttg tgggtagaga tcttcgtttt tcatggtggc atcctcagaa acagtgaatt 3420

cagtggtgag tagtccgcgg ggtggaagtg gttgtttctt atggggtacc gagctcgaat 3480

tcgtaatcat ggtcatagct g 3617

<210> 36

<211> 3501

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<400> 36

cagtgccaag cttgcatgcc tgcaggtcga ctctaggacc cgcttgccat acgaagtcct 60

ggagaagatc tccacccgca tcaccaacga agttccagac gtaaaccgcg tggttttgga 120

cgtaacctcc aagccaccag gaaccatcga atgggagtag gccttaaatg agccttcgtt 180

aagcggcaat caccttatcg gtgattgccg ctttcccatt tctccgggtt ttctggaact 240

ttttgggcgt atgctgggaa tgatcttatt attttgattt cagaaagcag gagagaccag 300

atgagcgaaa tccttgaaac ctactgggca ccccacttcg gaaacaccga tgaagccgca 360

gcactcgttt catacttggc acaagcttcc ggtgatccta ttgaggttca caccctgttc 420

ggggatttag gtttagacgg actctctgga aactacaccg acactgagat cgacggctac 480

ggcgacgcat tcctgctggt tgcagcacta gcagtgttga tggctgaaaa caaagcatcc 540

ggcggcgtga atctgggtga agttggggga gctgataaat cgatccggct gcatgttgaa 600

tccaaggaaa acacccagat caacaccgca ttgaagtact ttgcgctttc cccagaagac 660

cacgcagcgg cagatcgctt cgatgaggat gacctgtctg agcttgccaa cttgagtgaa 720

gagctgcgcg gacagctgga ctaattgctg cccgtttaag gagtccgatt cttcagatga 780

gtagattcgt tatgtcattg tgatgctccc gtgaacataa acgggaccta ctggctttac 840

ttaagtaaca gctatgtaaa agaccaggtc aggttcgggt cggtttaggt acgaaaccca 900

tttttcggtt tgctttccag gtttccccaa gtaaaggtga gttttatgac tacatctgac 960

ccaaattcga aaccgatagt ggaggatgct cagccagagc agatcaccgc aaccgaagaa 1020

ctggcgggtt tgcttgagaa tccaactaac ctggaaggga aactggccga cgccgaagag 1080

gaaattatcc tcgaaggcga agacgcccag gcctcactta actggtcagt catcgttcca 1140

gccctagtca ttgtcctagc gacagtggtg tggggtatcg gattcaaaga tagctttacc 1200

aactttgcta gttctgcgtt gtcagcagta gttgacaatc tcggctgggc cttcattttg 1260

tttggcacag tctttgtatt ttttatcgtt gttatcgccg ctagtaaatt cggcacgatt 1320

cgcttaggcc gcattgatga agcaccagag tttcgcacgg tgtcatggat ttccatgatg 1380

tttgctgcag gtatgggtat tggtttgatg ttctacggaa ccacagaacc tttaaccttc 1440

taccgcaatg gtgtacctgg atatgatgaa cacaatgttg gcgttgctat gtccacgaca 1500

atgttccact ggaccttgca tccatgggct atctacgcaa ttgtgggcct agccattgcc 1560

tattcgacct tccgagtggg ccgtaaacag cttctaagct ctgcattcgt gccactcatt 1620

ggtgaaaaag gtgcagaagg atggttgggc aagctcatcg acatcctggc gattatcgcc 1680

acagtattcg gcaccgcatg ttcccttggc ctgggtgcgc tgcagatcgg tgcaggactt 1740

tccgcagcca acatcattga aaatccgagt gactggactg tcattggtat tgtttctgtc 1800

ttgaccttgg catttatctt ctctgctatt tctggtgtgg gcaagggaat ccagtacctc 1860

tccaacgcca acatggttct ggcagctctg ctcgcgattt tcgtgttcgt tgtcggacca 1920

accgtgtcga ttttgaacct gctgccaggt tctattggca actacctgtc caacttcttc 1980

caaatggcag gccgcactgc catgagtgcc gacggcacag caggtgagtg gctaggtagc 2040

tggaccatct tctactgggc atggtggatc tcttggtcac cattcgtagg aatgttcttg 2100

gcacgtattt cccgtggccg ctccatccgt gagttcatcc tgggcgtgtt gctcgtccca 2160

gcaggtgtgt ccaccgtatg gttctccatt tttggtggca ctgcgattgt cttcgaacaa 2220

aatggggaat ccatttgggg tgatggtgca gcagaagagc agctctttgg attgcttcat 2280

gcacttccag gtgggcaaat aatgggcatc atcgccatga ttttgctggg tactttcttc 2340

attacctctg cagactctgc ttccaccgtc atgggcacca tgagtcagca cggccagctg 2400

gaagccaaca agtgggtgac agctgcctgg ggtgttgcta ccgcagctat tggactaacg 2460

ctattgcttt ctggtggtga caatgccttg aacaacttgc aaaaagtcac catcgtggct 2520

gcaacaccat tcctgtttgt ggttattgga ttgatgtttg cgttagtcaa ggacttaagc 2580

aatgatgtga tctacctcga gtaccgtgag cagcaacgct tcaacgcgcg ccttgcccgt 2640

gaacgtcgtg ttcacaatga acaccgcaag cgtgaactgg ctgcaaagcg acgcagggag 2700

cgtaaggcga gtggcgcggg gaagcgtcga tagttcgtgg gcactctggt ttggttacca 2760

ggatgggtta gtcattctga tcagcgaatt ccacgttcac atcgccaatt ccagagttca 2820

caaccagatt cagcattgga ccttctagat cagcattgtg ggcggtgaga tctccaacat 2880

cacagcgcgc tgtgcccaca ccggcggtac aacttaggct cacgggcaca tcatcgggca 2940

gggtgaccat gacttcgccg atccctgagg tgatttggat gttttgttcc tgatccaatt 3000

gggtgaggtg gctgaaatcg aggttcattt cacccacgcc agaggtgtag ctgctgagga 3060

gttcatcgtt ggtggggatg agattgacat cgccgattcc agggtcgtct tcaaagtaga 3120

tgggatcgat atttgaaata aacaggcctg cgagggcgct catgacaact ccggtaccaa 3180

ctacaccgcc gacaatccat ggccacacat ggcgcttttt ctgaggcttt tgtggaggga 3240

cttgtacatc ccaggtgttg tattggtttt gggcaagtgg atcccaatga ggcgcttcgg 3300

gggtttgttg cgcgaagggt gcatagtagc cctcaacggg ggtgatagtg cttagatctg 3360

gttggggttg tgggtagaga tcttcgtttt tcatggtggc atcctcagaa acagtgaatt 3420

cagtggtgag tagtccgcgg ggtggaagtg gttgtttctt atggggtacc gagctcgaat 3480

tcgtaatcat ggtcatagct g 3617

<210> 37

<211> 1674

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<400> 37

gtccaaggtg acggccgcac ctacggacac ccaatcgtgc tgcgcccagt atcttccgaa 60

gacgcaatga ccgccgactg gacccgcttg ccatacgaag tcctggagaa gatctccacc 120

cgcatcacca acgaagttcc agacgtaaac cgcgtggttt tggacgtaac ctccaagcca 180

ccaggaacca tcgaatggga gtaggcctta aatgagcctt cgttaagcgg caatcacctt 240

atcggtgatt gccgctttcc catttctccg ggttttctgg aactttttgg gcgtatgctg 300

ggaatgatct tattattttg atttcagaaa gcaggagaga ccagatgagc gaaatccttg 360

aaacctactg ggcaccccac ttcggaaaca ccgatgaagc cgcagcactc gtttcatact 420

tggcacaagc ttccggtgat cctattgagg ttcacaccct gttcggggat ttaggtttag 480

acggactctc tggaaactac accgacactg agatcgacgg ctacggcgac gcattcctgc 540

tggttgcagc actagcagtg ttgatggctg aaaacaaagc atccggcggc gtgaatctgg 600

gtgaagttgg gggagctgat aaatcgatcc ggctgcatgt tgaatccaag gaaaacaccc 660

agatcaacac cgcattgaag tactttgcgc tttccccaga agaccacgca gcggcagatc 720

gcttcgatga ggatgacctg tctgagcttg ccaacttgag tgaagagctg cgcggacagc 780

tggactaatt gctgcccgtt taaggagtcc gattcttcag atgagtagat tcgttatgtc 840

attgtgatgc tcccgtgaac ataaacggga cctactggct ttacttaagt aacagctatg 900

taaaagacca ggtcaggttc gggtcggttt aggtacgaaa cccatttttc ggtttgcttt 960

ccaggtttcc ccaagtaaag gtgagtttta tgactacatc tgacccaaat tcgaaaccga 1020

tagtggagga tgctcagcca gagcagatca ccgcaaccga agaactggcg ggtttgcttg 1080

agaatccaac taacctggaa gggaaactgg ccgacgccga agaggaaatt atcctcgaag 1140

gcgaagacgc ccaggcctca cttaactggt cagtcatcgt tccagcccta gtcattgtcc 1200

tagcgacagt ggtgtggggt atcggattca aagatagctt taccaacttt gctagttctg 1260

cgttgtcagc agtagttgac aatctcggct gggccttcat tttgtttggc acagtctttg 1320

tattttttat cgttgttatc gccgctagta aattcggcac gattcgctta ggccgcattg 1380

atgaagcacc agagtttcgc acggtgtcat ggatttccat gatgtttgct gcaggtatgg 1440

gtattggttt gatgttctac ggaaccacag aacctttaac cttctaccgc aatggtgtac 1500

ctggatatga tgaacacaat gttggcgttg ctatgtccac gacaatgttc cactggacct 1560

tgcatccatg ggctatctac gcaattgtgg gcctagccat tgcctattcg accttccgag 1620

tgggccgtaa acagcttcta agctctgcat tcgtgccact cattggtgaa aaag 1728

<210> 38

<211> 1943

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<400> 38

ccgtaaacag cttctaagct ctgcattcgt gccactcatt ggtgaaaaag gtgcagaagg 60

atggttgggc aagctcatcg acatcctggc gattatcgcc acagtattcg gcaccgcatg 120

ttcccttggc ctgggtgcgc tgcagatcgg tgcaggactt tccgcagcca acatcattga 180

aaatccgagt gactggactg tcattggtat tgtttctgtc ttgaccttgg catttatctt 240

ctctgctatt tctggtgtgg gcaagggaat ccagtacctc tccaacgcca acatggttct 300

ggcagctctg ctcgcgattt tcgtgttcgt tgtcggacca accgtgtcga ttttgaacct 360

gctgccaggt tctattggca actacctgtc caacttcttc caaatggcag gccgcactgc 420

catgagtgcc gacggcacag caggtgagtg gctaggtagc tggaccatct tctactgggc 480

atggtggatc tcttggtcac cattcgtagg aatgttcttg gcacgtattt cccgtggccg 540

ctccatccgt gagttcatcc tgggcgtgtt gctcgtccca gcaggtgtgt ccaccgtatg 600

gttctccatt tttggtggca ctgcgattgt cttcgaacaa aatggggaat ccatttgggg 660

tgatggtgca gcagaagagc agctctttgg attgcttcat gcacttccag gtgggcaaat 720

aatgggcatc atcgccatga ttttgctggg tactttcttc attacctctg cagactctgc 780

ttccaccgtc atgggcacca tgagtcagca cggccagctg gaagccaaca agtgggtgac 840

agctgcctgg ggtgttgcta ccgcagctat tggactaacg ctattgcttt ctggtggtga 900

caatgccttg aacaacttgc aaaacgtcac catcgtggct gcaacaccat tcctgtttgt 960

ggttattgga ttgatgtttg cgttagtcaa ggacttaagc aatgatgtga tctacctcga 1020

gtaccgtgag cagcaacgct tcaacgcgcg ccttgcccgt gaacgtcgtg ttcacaatga 1080

acaccgcaag cgtgaactgg ctgcaaagcg acgcagggag cgtaaggcga gtggcgcggg 1140

gaagcgtcga tagttcgtgg gcactctggt ttggttacca ggatgggtta gtcattctga 1200

tcagcgaatt ccacgttcac atcgccaatt ccagagttca caaccagatt cagcattgga 1260

ccttctagat cagcattgtg ggcggtgaga tctccaacat cacagcgcgc tgtgcccaca 1320

ccggcggtac aacttaggct cacgggcaca tcatcgggca gggtgaccat gacttcgccg 1380

atccctgagg tgatttggat gttttgttcc tgatccaatt gggtgaggtg gctgaaatcg 1440

aggttcattt cacccacgcc agaggtgtag ctgctgagga gttcatcgtt ggtggggatg 1500

agattgacat cgccgattcc agggtcgtct tcaaagtaga tgggatcgat atttgaaata 1560

aacaggcctg cgagggcgct catgacaact ccggtaccaa ctacaccgcc gacaatccat 1620

ggccacacat ggcgcttttt ctgaggcttt tgtggaggga cttgtacatc ccaggtgttg 1680

tattggtttt gggcaagtgg atcccaatga ggcgcttcgg gggtttgttg cgcgaagggt 1740

gcatagtagc cctcaacggg ggtgatagtg cttagatctg gttggggttg tgggtagaga 1800

tcttcgtttt tcatggtggc atcctcagaa acagtgaatt cagtggtgag tagtccgcgg 1860

ggtggaagtg gttgtttctt atgcaacgcc caccacatgg ctaaaaggca aaggtaagta 1920

atggctgctg ctgggccgaa tat 2007

<210> 39

<211> 2017

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<400> 39

gcttgcatgc ctgcaggtcg actctagagg atcccctcgt tatgtcattg tgatgctccc 60

gtgaacataa acgggaccta ctggctttac ttaagtaaca gctatgtaaa agaccaggtc 120

aggttcgggt cggtttaggt acgaaaccca tttttcggtt tgctttccag gtttccccaa 180

gtaaaggtga gttttatgac tacatctgac ccaaattcga aaccgatagt ggaggatgct 240

cagccagagc agatcaccgc aaccgaagaa ctggcgggtt tgcttgagaa tccaactaac 300

ctggaaggga aactggccga cgccgaagag gaaattatcc tcgaaggcga agacgcccag 360

gcctcactta actggtcagt catcgttcca gccctagtca ttgtcctagc gacagtggtg 420

tggggtatcg gattcaaaga tagctttacc aactttgcta gttctgcgtt gtcagcagta 480

gttgacaatc tcggctgggc cttcattttg tttggcacag tctttgtatt ttttatcgtt 540

gttatcgccg ctagtaaatt cggcacgatt cgcttaggcc gcattgatga agcaccagag 600

tttcgcacgg tgtcatggat ttccatgatg tttgctgcag gtatgggtat tggtttgatg 660

ttctacggaa ccacagaacc tttaaccttc taccgcaatg gtgtacctgg atatgatgaa 720

cacaatgttg gcgttgctat gtccacgaca atgttccact ggaccttgca tccatgggct 780

atctacgcaa ttgtgggcct agccattgcc tattcgacct tccgagtggg ccgtaaacag 840

cttctaagct ctgcattcgt gccactcatt ggtgaaaaag gtgcagaagg atggttgggc 900

aagctcatcg acatcctggc gattatcgcc acagtattcg gcaccgcatg ttcccttggc 960

ctgggtgcgc tgcagatcgg tgcaggactt tccgcagcca acatcattga aaatccgagt 1020

gactggactg tcattggtat tgtttctgtc ttgaccttgg catttatctt ctctgctatt 1080

tctggtgtgg gcaagggaat ccagtacctc tccaacgcca acatggttct ggcagctctg 1140

ctcgcgattt tcgtgttcgt tgtcggacca accgtgtcga ttttgaacct gctgccaggt 1200

tctattggca actacctgtc caacttcttc caaatggcag gccgcactgc catgagtgcc 1260

gacggcacag caggtgagtg gctaggtagc tggaccatct tctactgggc atggtggatc 1320

tcttggtcac cattcgtagg aatgttcttg gcacgtattt cccgtggccg ctccatccgt 1380

gagttcatcc tgggcgtgtt gctcgtccca gcaggtgtgt ccaccgtatg gttctccatt 1440

tttggtggca ctgcgattgt cttcgaacaa aatggggaat ccatttgggg tgatggtgca 1500

gcagaagagc agctctttgg attgcttcat gcacttccag gtgggcaaat aatgggcatc 1560

atcgccatga ttttgctggg tactttcttc attacctctg cagactctgc ttccaccgtc 1620

atgggcacca tgagtcagca cggccagctg gaagccaaca agtgggtgac agctgcctgg 1680

ggtgttgcta ccgcagctat tggactaacg ctattgcttt ctggtggtga caatgccttg 1740

aacaacttgc aaaacgtcac catcgtggct gcaacaccat tcctgtttgt ggttattgga 1800

ttgatgtttg cgttagtcaa ggacttaagc aatgatgtga tctacctcga gtaccgtgag 1860

cagcaacgct tcaacgcgcg ccttgcccgt gaacgtcgtg ttcacaatga acaccgcaag 1920

cgtgaactgg ctgcaaagcg acgcagggag cgtaaggcga gtggcgcggg gaagcgtcga 1980

taggttttgg cggatgagag aagattttca gcctgat 2083

<210> 40

<211> 2017

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<400> 40

gcttgcatgc ctgcaggtcg actctagagg atcccctcgt tatgtcattg tgatgctccc 60

gtgaacataa acgggaccta ctggctttac ttaagtaaca gctatgtaaa agaccaggtc 120

aggttcgggt cggtttaggt acgaaaccca tttttcggtt tgctttccag gtttccccaa 180

gtaaaggtga gttttatgac tacatctgac ccaaattcga aaccgatagt ggaggatgct 240

cagccagagc agatcaccgc aaccgaagaa ctggcgggtt tgcttgagaa tccaactaac 300

ctggaaggga aactggccga cgccgaagag gaaattatcc tcgaaggcga agacgcccag 360

gcctcactta actggtcagt catcgttcca gccctagtca ttgtcctagc gacagtggtg 420

tggggtatcg gattcaaaga tagctttacc aactttgcta gttctgcgtt gtcagcagta 480

gttgacaatc tcggctgggc cttcattttg tttggcacag tctttgtatt ttttatcgtt 540

gttatcgccg ctagtaaatt cggcacgatt cgcttaggcc gcattgatga agcaccagag 600

tttcgcacgg tgtcatggat ttccatgatg tttgctgcag gtatgggtat tggtttgatg 660

ttctacggaa ccacagaacc tttaaccttc taccgcaatg gtgtacctgg atatgatgaa 720

cacaatgttg gcgttgctat gtccacgaca atgttccact ggaccttgca tccatgggct 780

atctacgcaa ttgtgggcct agccattgcc tattcgacct tccgagtggg ccgtaaacag 840

cttctaagct ctgcattcgt gccactcatt ggtgaaaaag gtgcagaagg atggttgggc 900

aagctcatcg acatcctggc gattatcgcc acagtattcg gcaccgcatg ttcccttggc 960

ctgggtgcgc tgcagatcgg tgcaggactt tccgcagcca acatcattga aaatccgagt 1020

gactggactg tcattggtat tgtttctgtc ttgaccttgg catttatctt ctctgctatt 1080

tctggtgtgg gcaagggaat ccagtacctc tccaacgcca acatggttct ggcagctctg 1140

ctcgcgattt tcgtgttcgt tgtcggacca accgtgtcga ttttgaacct gctgccaggt 1200

tctattggca actacctgtc caacttcttc caaatggcag gccgcactgc catgagtgcc 1260

gacggcacag caggtgagtg gctaggtagc tggaccatct tctactgggc atggtggatc 1320

tcttggtcac cattcgtagg aatgttcttg gcacgtattt cccgtggccg ctccatccgt 1380

gagttcatcc tgggcgtgtt gctcgtccca gcaggtgtgt ccaccgtatg gttctccatt 1440

tttggtggca ctgcgattgt cttcgaacaa aatggggaat ccatttgggg tgatggtgca 1500

gcagaagagc agctctttgg attgcttcat gcacttccag gtgggcaaat aatgggcatc 1560

atcgccatga ttttgctggg tactttcttc attacctctg cagactctgc ttccaccgtc 1620

atgggcacca tgagtcagca cggccagctg gaagccaaca agtgggtgac agctgcctgg 1680

ggtgttgcta ccgcagctat tggactaacg ctattgcttt ctggtggtga caatgccttg 1740

aacaacttgc aaaaagtcac catcgtggct gcaacaccat tcctgtttgt ggttattgga 1800

ttgatgtttg cgttagtcaa ggacttaagc aatgatgtga tctacctcga gtaccgtgag 1860

cagcaacgct tcaacgcgcg ccttgcccgt gaacgtcgtg ttcacaatga acaccgcaag 1920

cgtgaactgg ctgcaaagcg acgcagggag cgtaaggcga gtggcgcggg gaagcgtcga 1980

taggttttgg cggatgagag aagattttca gcctgat 2083

<210> 41

<211> 2056

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<400> 41

agcggataac aatttcacac aggaaacaga attaattaag cttgcatgcc tgcaggtcga 60

ctctagagga tcccctcgtt atgtcattgt gatgctcccg tgaacataaa cgggacctac 120

tggctttact taagtaacag ctatgtaaaa gaccaggtca ggttcgggtc ggtttaggta 180

cgaaacccat ttttcggttt gctttccagg tttccccaag taaaggtgag ttttatgact 240

acatctgacc caaattcgaa accgatagtg gaggatgctc agccagagca gatcaccgca 300

accgaagaac tggcgggttt gcttgagaat ccaactaacc tggaagggaa actggccgac 360

gccgaagagg aaattatcct cgaaggcgaa gacgcccagg cctcacttaa ctggtcagtc 420

atcgttccag ccctagtcat tgtcctagcg acagtggtgt ggggtatcgg attcaaagat 480

agctttacca actttgctag ttctgcgttg tcagcagtag ttgacaatct cggctgggcc 540

ttcattttgt ttggcacagt ctttgtattt tttatcgttg ttatcgccgc tagtaaattc 600

ggcacgattc gcttaggccg cattgatgaa gcaccagagt ttcgcacggt gtcatggatt 660

tccatgatgt ttgctgcagg tatgggtatt ggtttgatgt tctacggaac cacagaacct 720

ttaaccttct accgcaatgg tgtacctgga tatgatgaac acaatgttgg cgttgctatg 780

tccacgacaa tgttccactg gaccttgcat ccatgggcta tctacgcaat tgtgggccta 840

gccattgcct attcgacctt ccgagtgggc cgtaaacagc ttctaagctc tgcattcgtg 900

ccactcattg gtgaaaaagg tgcagaagga tggttgggca agctcatcga catcctggcg 960

attatcgcca cagtattcgg caccgcatgt tcccttggcc tgggtgcgct gcagatcggt 1020

gcaggacttt ccgcagccaa catcattgaa aatccgagtg actggactgt cattggtatt 1080

gtttctgtct tgaccttggc atttatcttc tctgctattt ctggtgtggg caagggaatc 1140

cagtacctct ccaacgccaa catggttctg gcagctctgc tcgcgatttt cgtgttcgtt 1200

gtcggaccaa ccgtgtcgat tttgaacctg ctgccaggtt ctattggcaa ctacctgtcc 1260

aacttcttcc aaatggcagg ccgcactgcc atgagtgccg acggcacagc aggtgagtgg 1320

ctaggtagct ggaccatctt ctactgggca tggtggatct cttggtcacc attcgtagga 1380

atgttcttgg cacgtatttc ccgtggccgc tccatccgtg agttcatcct gggcgtgttg 1440

ctcgtcccag caggtgtgtc caccgtatgg ttctccattt ttggtggcac tgcgattgtc 1500

ttcgaacaaa atggggaatc catttggggt gatggtgcag cagaagagca gctctttgga 1560

ttgcttcatg cacttccagg tgggcaaata atgggcatca tcgccatgat tttgctgggt 1620

actttcttca ttacctctgc agactctgct tccaccgtca tgggcaccat gagtcagcac 1680

ggccagctgg aagccaacaa gtgggtgaca gctgcctggg gtgttgctac cgcagctatt 1740

ggactaacgc tattgctttc tggtggtgac aatgccttga acaacttgca aaacgtcacc 1800

atcgtggctg caacaccatt cctgtttgtg gttattggat tgatgtttgc gttagtcaag 1860

gacttaagca atgatgtgat ctacctcgag taccgtgagc agcaacgctt caacgcgcgc 1920

cttgcccgtg aacgtcgtgt tcacaatgaa caccgcaagc gtgaactggc tgcaaagcga 1980

cgcagggagc gtaaggcgag tggcgcgggg aagcgtcgat aggttttggc ggatgagaga 2040

agattttcag cctgat 2124

<210> 42

<211> 733

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<400> 42

cagtgccaag cttgcatgcc tgcaggtcga ctctagtaag gggcagttgg tctcgaactt 60

tgaccataat gaacaggcgc gcgtcggcaa gcttattgaa gccgcacgca cgggcacggt 120

gctggtggtc agcgatgccg gcatgcctgt ggtttctgat ccgggttttg cgcttatcga 180

cgccgcccac gaggcgaaca ttccggtcac ctgcttcccc gggccgtcag ctgtgccaac 240

tgcgttggca ttgtcgggcc ttcacgtggg ccgcttcgcc ttcgacggtt tcgcgccgcg 300

caaacaaggt gcgcgcacca cgtggttgga gtcgttgaaa accgaaaagc gcgcggtatg 360

tttcttcgaa tctcctcacc gcatcgcaga aaccctggct cacgcagccg aagttttagg 420

tgaacgacgc gcagcagtgt gccgtgaact gtccaaaacc tacgaacagg taaagcgtgg 480

aaccttgcca gagttggcag aatgggcaca agatggggtg cgtggcgaga tcaccgttgt 540

catcgaaggc gcgggcgata tcgcggtcga tgtcgattcg cttatcgacg ccgcccagca 600

gcgcgtcgat tccggcgagc ggttgaaagc ggtgtgcgca gacctcgcga aaatccatgg 660

cgtgagcaaa aatgaactct acgatgcggt tatttctgcc agggaaaatt aagcaatttt 720

taacccctga tac 757

<210> 43

<211> 814

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<400> 43

ttctgccagg gaaaattaag caatttttaa cccctgatac ccctttccgg ccgggcataa 60

attaaggtgg tacgcatgac gaagaacgtg ctcgtatctg ttgcctggcc gtatgccaac 120

ggaccccgtc acattggaca tgtggcgggg tttggtgtcc cctccgatgt gttcgcaagg 180

ttccagcgaa tgtctggcaa caacgtgctc atggtgtccg gcaccgatga gcacggcacg 240

ccacttctgg ttcaagcaga caaagaaggc gtcaccgttc aagacctcgc ggataagtac 300

aaccgccaga tcgtcgaaga cctcaccggc ctgggcctgt cctatgacct tttcacccgc 360

accaccacct ccaaccacta cgcagtagtg caggaactgt tccgtggtct gtacgacaac 420

ggttacatga tcaaggaaac caccctcggt gcgatttccc catccactgg ccgtaccctg 480

ccagaccgct acattgaagg cacctgccca atctgtggca ccgacggcgc tcgtggcgac 540

cagtgcgaca actgcggaaa ccagctcgat ccagcggacc tgatcaaccc ggtgtccaag 600

atcaacggcg aaaccccaga gttcgttgag accgaacact tcctgctcga cctgccagca 660

ctagctgaag cactaaccga gtggctgaag ggacgcgaag actggcgtcc aaacgtgttg 720

aagttctcgc tcaacctgct ggacgatatc cgcccacgcg caatgtcgcg cgatatgggt 780

accgagctcg aattcgtaat catggtcata gctg 840

<210> 44

<211> 1507

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<400> 44

cagtgccaag cttgcatgcc tgcaggtcga ctctagtaag gggcagttgg tctcgaactt 60

tgaccataat gaacaggcgc gcgtcggcaa gcttattgaa gccgcacgca cgggcacggt 120

gctggtggtc agcgatgccg gcatgcctgt ggtttctgat ccgggttttg cgcttatcga 180

cgccgcccac gaggcgaaca ttccggtcac ctgcttcccc gggccgtcag ctgtgccaac 240

tgcgttggca ttgtcgggcc ttcacgtggg ccgcttcgcc ttcgacggtt tcgcgccgcg 300

caaacaaggt gcgcgcacca cgtggttgga gtcgttgaaa accgaaaagc gcgcggtatg 360

tttcttcgaa tctcctcacc gcatcgcaga aaccctggct cacgcagccg aagttttagg 420

tgaacgacgc gcagcagtgt gccgtgaact gtccaaaacc tacgaacagg taaagcgtgg 480

aaccttgcca gagttggcag aatgggcaca agatggggtg cgtggcgaga tcaccgttgt 540

catcgaaggc gcgggcgata tcgcggtcga tgtcgattcg cttatcgacg ccgcccagca 600

gcgcgtcgat tccggcgagc ggttgaaagc ggtgtgcgca gacctcgcga aaatccatgg 660

cgtgagcaaa aatgaactct acgatgcggt tatttctgcc agggaaaatt aagcaatttt 720

taacccctga tacccctttc cggccgggca taaattaagg tggtacgcat gacgaagaac 780

gtgctcgtat ctgttgcctg gccgtatgcc aacggacccc gtcacattgg acatgtggcg 840

gggtttggtg tcccctccga tgtgttcgca aggttccagc gaatgtctgg caacaacgtg 900

ctcatggtgt ccggcaccga tgagcacggc acgccacttc tggttcaagc agacaaagaa 960

ggcgtcaccg ttcaagacct cgcggataag tacaaccgcc agatcgtcga agacctcacc 1020

ggcctgggcc tgtcctatga ccttttcacc cgcaccacca cctccaacca ctacgcagta 1080

gtgcaggaac tgttccgtgg tctgtacgac aacggttaca tgatcaagga aaccaccctc 1140

ggtgcgattt ccccatccac tggccgtacc ctgccagacc gctacattga aggcacctgc 1200

ccaatctgtg gcaccgacgg cgctcgtggc gaccagtgcg acaactgcgg aaaccagctc 1260

gatccagcgg acctgatcaa cccggtgtcc aagatcaacg gcgaaacccc agagttcgtt 1320

gagaccgaac acttcctgct cgacctgcca gcactagctg aagcactaac cgagtggctg 1380

aagggacgcg aagactggcg tccaaacgtg ttgaagttct cgctcaacct gctggacgat 1440

atccgcccac gcgcaatgtc gcgcgatatg ggtaccgagc tcgaattcgt aatcatggtc 1500

atagctg 1557

<210> 45

<211> 1433

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<400> 45

taaggggcag ttggtctcga actttgacca taatgaacag gcgcgcgtcg gcaagcttat 60

tgaagccgca cgcacgggca cggtgctggt ggtcagcgat gccggcatgc ctgtggtttc 120

tgatccgggt tttgcgctta tcgacgccgc ccacgaggcg aacattccgg tcacctgctt 180

ccccgggccg tcagctgtgc caactgcgtt ggcattgtcg ggccttcacg tgggccgctt 240

cgccttcgac ggtttcgcgc cgcgcaaaca aggtgcgcgc accacgtggt tggagtcgtt 300

gaaaaccgaa aagcgcgcgg tatgtttctt cgaatctcct caccgcatcg cagaaaccct 360

ggctcacgca gccgaagttt taggtgaacg acgcgcagca gtgtgccgtg aactgtccaa 420

aacctacgaa caggtaaagc gtggaacctt gccagagttg gcagaatggg cacaagatgg 480

ggtgcgtggc gagatcaccg ttgtcatcga aggcgcgggc gatatcgcgg tcgatgtcga 540

ttcgcttatc gacgccgccc agcagcgcgt cgattccggc gagcggttga aagcggtgtg 600

cgcagacctc gcgaaaatcc atggcgtgag caaaaatgaa ctctacgatg cggttatttc 660

tgccagggaa aattaagcaa tttttaaccc ctgatacccc tttccggccg ggcataaatt 720

aaggtggtac gcatgacgaa gaacgtgctc gtatctgttg cctggccgta tgccaacgga 780

ccccgtcaca ttggacatgt ggcggggttt ggtgtcccct ccgatgtgtt cgcaaggttc 840

cagcgaatgt ctggcaacaa cgtgctcatg gtgtccggca ccgatgagca cggcacgcca 900

cttctggttc aagcagacaa agaaggcgtc accgttcaag acctcgcgga taagtacaac 960

cgccagatcg tcgaagacct caccggcctg ggcctgtcct atgacctttt cacccgcacc 1020

accacctcca accactacgc agtagtgcag gaactgttcc gtggtctgta cgacaacggt 1080

tacatgatca aggaaaccac cctcggtgcg atttccccat ccactggccg taccctgcca 1140

gaccgctaca ttgaaggcac ctgcccaatc tgtggcaccg acggcgctcg tggcgaccag 1200

tgcgacaact gcggaaacca gctcgatcca gcggacctga tcaacccggt gtccaagatc 1260

aacggcgaaa ccccagagtt cgttgagacc gaacacttcc tgctcgacct gccagcacta 1320

gctgaagcac taaccgagtg gctgaaggga cgcgaagact ggcgtccaaa cgtgttgaag 1380

ttctcgctca acctgctgga cgatatccgc ccacgcgcaa tgtcgcgcga tat 1479

<210> 46

<211> 3380

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<400> 46

taaggggcag ttggtctcga actttgacca taatgaacag gcgcgcgtcg gcaagcttat 60

tgaagccgca cgcacgggca cggtgctggt ggtcagcgat gccggcatgc ctgtggtttc 120

tgatccgggt tttgcgctta tcgacgccgc ccacgaggcg aacattccgg tcacctgctt 180

ccccgggccg tcagctgtgc caactgcgtt ggcattgtcg ggccttcacg tgggccgctt 240

cgccttcgac ggtttcgcgc cgcgcaaaca aggtgcgcgc accacgtggt tggagtcgtt 300

gaaaaccgaa aagcgcgcgg tatgtttctt cgaatctcct caccgcatcg cagaaaccct 360

ggctcacgca gccgaagttt taggtgaacg acgcgcagca gtgtgccgtg aactgtccaa 420

aacctacgaa caggtaaagc gtggaacctt gccagagttg gcagaatggg cacaagatgg 480

ggtgcgtggc gagatcaccg ttgtcatcga aggcgcgggc gatatcgcgg tcgatgtcga 540

ttcgcttatc gacgccgccc agcagcgcgt cgattccggc gagcggttga aagcggtgtg 600

cgcagacctc gcgaaaatcc atggcgtgag caaaaatgaa ctctacgatg cggttatttc 660

tgccagggaa aattaatcgt tatgtcattg tgatgctccc gtgaacataa acgggaccta 720

ctggctttac ttaagtaaca gctatgtaaa agaccaggtc aggttcgggt cggtttaggt 780

acgaaaccca tttttcggtt tgctttccag gtttccccaa gtaaaggtga gttttatgac 840

tacatctgac ccaaattcga aaccgatagt ggaggatgct cagccagagc agatcaccgc 900

aaccgaagaa ctggcgggtt tgcttgagaa tccaactaac ctggaaggga aactggccga 960

cgccgaagag gaaattatcc tcgaaggcga agacgcccag gcctcactta actggtcagt 1020

catcgttcca gccctagtca ttgtcctagc gacagtggtg tggggtatcg gattcaaaga 1080

tagctttacc aactttgcta gttctgcgtt gtcagcagta gttgacaatc tcggctgggc 1140

cttcattttg tttggcacag tctttgtatt ttttatcgtt gttatcgccg ctagtaaatt 1200

cggcacgatt cgcttaggcc gcattgatga agcaccagag tttcgcacgg tgtcatggat 1260

ttccatgatg tttgctgcag gtatgggtat tggtttgatg ttctacggaa ccacagaacc 1320

tttaaccttc taccgcaatg gtgtacctgg atatgatgaa cacaatgttg gcgttgctat 1380

gtccacgaca atgttccact ggaccttgca tccatgggct atctacgcaa ttgtgggcct 1440

agccattgcc tattcgacct tccgagtggg ccgtaaacag cttctaagct ctgcattcgt 1500

gccactcatt ggtgaaaaag gtgcagaagg atggttgggc aagctcatcg acatcctggc 1560

gattatcgcc acagtattcg gcaccgcatg ttcccttggc ctgggtgcgc tgcagatcgg 1620

tgcaggactt tccgcagcca acatcattga aaatccgagt gactggactg tcattggtat 1680

tgtttctgtc ttgaccttgg catttatctt ctctgctatt tctggtgtgg gcaagggaat 1740

ccagtacctc tccaacgcca acatggttct ggcagctctg ctcgcgattt tcgtgttcgt 1800

tgtcggacca accgtgtcga ttttgaacct gctgccaggt tctattggca actacctgtc 1860

caacttcttc caaatggcag gccgcactgc catgagtgcc gacggcacag caggtgagtg 1920

gctaggtagc tggaccatct tctactgggc atggtggatc tcttggtcac cattcgtagg 1980

aatgttcttg gcacgtattt cccgtggccg ctccatccgt gagttcatcc tgggcgtgtt 2040

gctcgtccca gcaggtgtgt ccaccgtatg gttctccatt tttggtggca ctgcgattgt 2100

cttcgaacaa aatggggaat ccatttgggg tgatggtgca gcagaagagc agctctttgg 2160

attgcttcat gcacttccag gtgggcaaat aatgggcatc atcgccatga ttttgctggg 2220

tactttcttc attacctctg cagactctgc ttccaccgtc atgggcacca tgagtcagca 2280

cggccagctg gaagccaaca agtgggtgac agctgcctgg ggtgttgcta ccgcagctat 2340

tggactaacg ctattgcttt ctggtggtga caatgccttg aacaacttgc aaaacgtcac 2400

catcgtggct gcaacaccat tcctgtttgt ggttattgga ttgatgtttg cgttagtcaa 2460

ggacttaagc aatgatgtga tctacctcga gtaccgtgag cagcaacgct tcaacgcgcg 2520

ccttgcccgt gaacgtcgtg ttcacaatga acaccgcaag cgtgaactgg ctgcaaagcg 2580

acgcagggag cgtaaggcga gtggcgcggg gaagcgtcga taggcaattt ttaacccctg 2640

ataccccttt ccggccgggc ataaattaag gtggtacgca tgacgaagaa cgtgctcgta 2700

tctgttgcct ggccgtatgc caacggaccc cgtcacattg gacatgtggc ggggtttggt 2760

gtcccctccg atgtgttcgc aaggttccag cgaatgtctg gcaacaacgt gctcatggtg 2820

tccggcaccg atgagcacgg cacgccactt ctggttcaag cagacaaaga aggcgtcacc 2880

gttcaagacc tcgcggataa gtacaaccgc cagatcgtcg aagacctcac cggcctgggc 2940

ctgtcctatg accttttcac ccgcaccacc acctccaacc actacgcagt agtgcaggaa 3000

ctgttccgtg gtctgtacga caacggttac atgatcaagg aaaccaccct cggtgcgatt 3060

tccccatcca ctggccgtac cctgccagac cgctacattg aaggcacctg cccaatctgt 3120

ggcaccgacg gcgctcgtgg cgaccagtgc gacaactgcg gaaaccagct cgatccagcg 3180

gacctgatca acccggtgtc caagatcaac ggcgaaaccc cagagttcgt tgagaccgaa 3240

cacttcctgc tcgacctgcc agcactagct gaagcactaa ccgagtggct gaagggacgc 3300

gaagactggc gtccaaacgt gttgaagttc tcgctcaacc tgctggacga tatccgccca 3360

cgcgcaatgt cgcgcgatat 3492

<---

Изобретение относится к биотехнологии. Предложены бактерия рода Corynebacterium для продуцирования L-глутаминовой кислоты, способ получения L-глутаминовой кислоты с использованием указанной бактерии, белок и молекула нуклеиновой кислоты для продуцирования L-глутаминовой кислоты. Также предложены рекомбинантный микроорганизм для продуцирования L-глутаминовой кислоты, содержащий указанную молекулу нуклеиновой кислоты, способ его конструирования и способ получения L-глутаминовой кислоты с его использованием. Также предложены применение указанной молекулы нуклеиновой кислоты для конструирования генетически модифицированной бактерии для продуцирования L-глутаминовой кислоты, способ повышения продукции L-глутаминовой кислоты в бактерии рода Corynebacterium с использованием указанной молекулы нуклеиновой кислоты. Изобретение обеспечивает получение высокой продукции L-глутаминовой кислоты. 9 н. и 7 з.п. ф-лы, 3 табл., 6 пр.

1. Бактерия рода Corynebacterium для продуцирования L-глутаминовой кислоты, причем указанная бактерия обладает улучшенной экспрессией полинуклеотида, кодирующего последовательность аминокислот SEQ ID NO: 3 по сравнению с немодифицированной бактерией;

при этом указанная улучшенная экспрессия представляет собой усиленную экспрессию полинуклеотида, кодирующего последовательность аминокислот SEQ ID NO: 3, или присутствие точечной мутации в полинуклеотиде, кодирующем последовательность аминокислот SEQ ID NO: 3, или присутствие точечной мутации в полинуклеотиде и усиленную экспрессию полинуклеотида, который кодирует последовательность аминокислот SEQ ID NO: 3; где указанная точечная мутация в полинуклеотиде, кодирующем последовательность аминокислот SEQ ID NO: 3, представляет собой замену аспарагина в положении 520 в последовательности аминокислот SEQ ID NO: 3 на лизин.

2. Бактерия рода Corynebacterium по п. 1, где полинуклеотид, кодирующий последовательность аминокислот SEQ ID NO: 3, содержит последовательность нуклеотидов SEQ ID NO: 1.

3. Бактерия рода Corynebacterium по п. 1, где последовательность полинуклеотида содержит точечную мутацию основания в положении 1560 последовательности полинуклеотида, представленной в SEQ ID NO: 1, с заменой цитозина (C) на аденин (A).

4. Бактерия рода Corynebacterium по п. 1, где указанная последовательность полинуклеотида, имеющая точечную мутацию, содержит последовательность полинуклеотида SEQ ID NO: 2.

5. Бактерия рода Corynebacterium по п. 1, где указанная бактерия представляет собой Corynebacterium glutamicum CGMCC № 21220 или ATCC13869.

6. Способ получения L-глутаминовой кислоты, который включает: культивирование бактерии по п. 1 и выделение L-глутаминовой кислоты из указанной культуры.

7. Белок, характеризующийся тем, что он имеет последовательность аминокислот SEQ ID NO: 4, где указанный белок используется для продуцирования L-глутаминовой кислоты.

8. Молекула нуклеиновой кислоты, характеризующаяся тем, что указанная молекула нуклеиновой кислоты представляет собой любое из:

B1) молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей белок по п. 4;

B2) молекулы ДНК, кодирующая последовательность которой представлена в SEQ ID NO: 2;

B3) молекулы ДНК, последовательность нуклеотидов которой представлена в SEQ ID NO: 2;

B4) последовательности полинуклеотида, содержащей полинуклеотид, кодирующий последовательность аминокислот, представленную в SEQ ID NO: 3, где аспарагин в положении 520 заменен на лизин,

причем указанная молекула нуклеиновой кислоты используется для продуцирования L-глутаминовой кислоты.

9. Молекула нуклеиновой кислоты по п. 8, причем последовательность полинуклеотида содержит полинуклеотид, кодирующий последовательность аминокислот, представленную в SEQ ID NO: 4.

10. Молекула нуклеиновой кислоты по п. 8, где последовательность полинуклеотида образована в результате мутации основания в положении 1560 последовательности полинуклеотида, представленной в SEQ ID NO: 1, с заменой цитозина (C) на аденин (A).

11. Молекула нуклеиновой кислоты по п. 8, где последовательность полинуклеотида содержит последовательность полинуклеотида, представленную в SEQ ID NO: 2.

12. Рекомбинантный микроорганизм для продуцирования L-глутаминовой кислоты, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты по п. 8, или рекомбинантный вектор, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты по п. 8.

13. Применение молекулы нуклеиновой кислоты по п. 8 для конструирования генетически модифицированной бактерии для продуцирования L-глутаминовой кислоты.

14. Способ повышения продуцирования L-глутаминовой кислоты в бактерии рода Corynebacterium, характеризующийся тем, что указанный способ включает

введение молекулы нуклеиновой кислоты по любому из пп. 8-11 или рекомбинантного вектора, содержащего молекулу нуклеиновой кислоты по любому из пп. 8-11, в микроорганизм-мишень с получением рекомбинантного микроорганизма и культивирование указанного рекомбинантного микроорганизма с получением повышенной продукции L-глутаминовой кислоты по сравнению с микроорганизмом-мишенью без мутации.

15. Способ конструирования рекомбинантного микроорганизма по п. 12, характеризующийся тем, что указанный способ включает по меньшей мере одно из:

F1) введения молекулы нуклеиновой кислоты по п. 11 в микроорганизм-мишень с получением рекомбинантного микроорганизма;

F2) редактирования молекулы ДНК, представленной в SEQ ID NO: 1, с использованием средства редактирования генов, таким образом, чтобы микроорганизм-мишень содержал молекулу ДНК, представленную в SEQ ID NO: 2.

16. Способ получения L-глутаминовой кислоты, характеризующийся тем, что указанный способ включает продуцирование L-глутаминовой кислоты путем культивирования рекомбинантного микроорганизма по п. 12 и выделение L-глутаминовой кислоты из культуры.