Способ прогнозирования риска развития сахарного диабета 2 типа у мужчин на основе генотипирования полиморфизма rs3219484 (C>T) гена MUTYH Российский патент 2025 года по МПК G01N33/58 C12Q1/6806 C12Q1/6827 C12Q1/686 C12Q1/6876 C12Q1/6883 

Изобретение относится к области медицинской диагностики, может быть использовано для прогнозирования риска развития сахарного диабета 2 типа у мужчин.

СД относится к категории заболеваний с неуклонными темпами роста распространенности и представляет собой угрозу за счет ранней инвалидизации и высокой смертности от сосудистых катастроф. В Российской Федерации, так же как и в других странах мира, продолжается рост распространенности СД - с 2000 г. численность пациентов увеличилась более чем в 2 раза [Дедов И.И., Шестакова М.В., Викулова О.К., Железнякова А.В., Исаков М.А., Сазонова Д.В., Мокрышева Н.Г. Сахарный диабет в Российской Федерации: динамика эпидемиологических показателей по данным Федерального регистра сахарного диабета за период 2010-2022 гг. // Сахарный диабет. - 2023. - Т. 26. - №2. - С. 104-123. doi: https://doi.org/10.14341/DM13035]. Более 92% больных имеют сахарный диабет 2 типа (СД2). Характерной чертой естественного течения СД2 является прогрессирующее во времени снижение на 25-50% числа функционирующих бета-клеток поджелудочной железы, связанное с их апоптозом [Reed J, Bain S, Kanamarlapudi V. A Review of Current Trends with Type 2 Diabetes Epidemiology, Aetiology, Pathogenesis, Treatments and Future Perspectives. Diabetes Metab Syndr Obes. 2021 Aug 10;14:3567-3602. doi: 10.2147/DMSO.S319895]. Недавние исследования показали причастность нарушений репарации окислительных повреждений ДНК к дисфункции и гибели β-клеток клеток поджелудочной железы при сахарном диабете 2 типа. Восстановление окисленных азотистых оснований ДНК в первую очередь осуществляется посредством эксцизионной репарации оснований, начинающейся с распознавания сайта повреждения с помощью ДНК-гликозилаз. Одним из таких ферментов является MutY-ДНК-гликозилаза, кодируемая геном MUTYH. Согласно данным полного транскриптомного анализа GTex Portal [https://gtexportal.org/home/snp/rs3219484], полиморфный вариант rs3219484 (C>T) гена MUTYH ассоциирован со снижением экспрессии (Р=9,8×10^-6) гена UQCRH, белковый продукт которого является компонентом убихинол-цитохром с-редуктазы (комплекса III) дыхательной цепи клеток поджелудочной железы и потому может рассматриваться как потенциальный генетический маркер предрасположенности к сахарному диабету 2 типа.

Известен способ прогнозирования риска развития сахарного диабета 2 типа по патенту на изобретение RU 2611900 C1 (публикация: 01.03.2017), включающий следующие этапы: определяют у пациента клинико-анамнестические и лабораторные данные, представляющие собой индекс массы тела (ИМТ), окружность талии (ОТ), наличие артериальной гипертензии (АГ), наличие сахарного диабета у близких родственников и лабораторных данных: выявление триглицеридов (ТГ) >1,7 ммоль/л, холестерина высокой плотности (ХС ЛВП) >1,0 ммоль/л, показаний САД > 40 и/или ДАД >90 мм рт. ст., уровня сахара в крови >5.6 ммоль/л; оценивают с использованием бальной шкалы: ИМТ <25 кг/м² - 0 баллов, 25-30 кг/м² - 1 балл, >30 кг/м² - 2 балла; ОТ у мужчин <94 см - 0 баллов, 94-102 см - 2 балла, >102 см - 3 балла; ОТ у женщин <80 см - 0 баллов, 80-88 см - 2 балла, >88 см - 3 балла; наличие АГ: нет - 0 баллов, да - 1 балл; выявление ТГ >1,7 ммоль/л: да - 1 балл, нет - 0 баллов; выявление ХС ЛВП >1,0 ммоль/л: да - 0 баллов, нет - 1 балл; показания САД >140 и/или ДАД >90 мм.рт.ст.: нет - 0 баллов, да - 1 балл; уровень сахара в крови >5.6 ммоль/л: нет - 0 баллов, да - 3 балла, полученные баллы суммируют и при сумме баллов <8 баллов судят о низком риске, а при сумме баллов >8 баллов судят о высоком риске развития СД 2 типа у пациента в течение ближайших 10 лет.

Недостаток метода заключается в том, что он не учитывает индивидуальную генетическую предрасположенность к заболеванию и имеет ограничение прогноза риска развития сахарного диабета 2 типа во времени.

Известен способ прогнозирования риска развития сахарного диабета 2 типа у больных гипертонической болезнью (патент на изобретение RU 2521202 C1, дата публикации 12.04.2013), предназначенный для прогнозирования риска развития сахарного диабета 2 типа у уроженцев Центрального Черноземья, больных гипертонической болезнью. Осуществляют выделение ДНК и проводят анализ полиморфного варианта гена лимфотоксина α (+250G/A Ltα). В случае выявления аллеля +250G Ltα прогнозируют повышенный риск формирования сахарного диабета на фоне гипертонической болезни, при обнаружении генотипа +250АА Ltα прогнозируют низкий риск развития сахарного диабета второго типа у уроженцев Центрального Черноземья, больных гипертонической болезнью. Предлагаемое изобретение обеспечивает возможность осуществления профилактических мероприятий сахарного диабета у больных гипертонической болезнью из группы риска.

Недостаток метода заключается в том, что он может быть использован только для уроженцев Центрального Черноземья, больных гипертонической болезнью и непригоден для прогнозирования риска развития сахарного диабета 2 типа у жителей других регионов России, не болеющих гипертонической болезнью.

Наиболее близок по результату исследования способ прогнозирования риска развития сахарного диабета 2 типа у жителей Центральной России на основе генотипирования полиморфизма rs11073891 гена ANPEP (патент на изобретение RU 2803636 C1, дата публикации 18.09.2023), включающий забор образца периферической венозной крови и экстракцию ДНК с последующим анализом полиморфного варианта гена аминопептидазы ANPEP rs11073891 (А>С). Прогнозируют повышенный риск развития сахарного диабета 2 типа в случае выявления генотипа rs11073891-А/А, а при обнаружении генотипов rs11073891-А/С или rs11073891-С/С – низкий риск развития сахарного диабета 2 типа.

Однако данный способ не учитывает пол пациентов.

Технический результат заключается в получении критериев оценки риска развития сахарного диабета 2 типа у мужчин по данным о генетическом полиморфизме rs3219484 (С>T) гена MUTYH.

Технический результат достигается тем, что после экстракции ДНК проводят анализ полиморфного варианта rs3219484 (С>T) гена MUTYH и прогнозируют повышенный риск развития сахарного диабета 2 типа в случае выявления генотипов rs3219484-C/T или rs3219484-T/T, а при обнаружении генотипа rs3219484-C/C – низкий риск развития сахарного диабета 2 типа у мужчин.

Способ осуществляют следующим образом:

1. Выделение ДНК из периферической венозной крови. На первом этапе к 0,5 мл крови добавляли 0,5 мл PBS и центрифугировали 10 мин при 12 тыс. об/мин. Надосадочную жидкость сливали, добавляли 1 мл PBS и вновь центрифугировали при тех же условиях. Надосадочную жидкость сливали, добавляли 200 мкл ТЕ-буфера, пипетировали до растворения осадка и затем последовательно добавляли 10 мкл 1% раствора додецилсульфата натрия SDS и 5 мкл протеиназы К. Пробирки инкубировали в термостате при t=37°C 12 ч. В ходе второго этапа проводили четыре последовательных центрифугирования с фенолом и хлороформом согласно протоколу методики (10 мин, 8 тыс. об/мин), после чего ДНК осаждали ледяным раствором 95% этилового спирта и центрифугировали 10 мин при 14,3 тыс. об/мин. По испарении спирта ДНК растворяли в 100 мкл деионизированной дистиллированной воды. Получаемый раствор ДНК в воде имел чистоту в диапазоне А260/280=1,5-2,0 и среднюю концентрацию около 180-200 нг/мкл. Экстрагированные из крови образцы ДНК хранились в морозильниках Thermo Fisher Scientific (США) при -20°С.

2. Подготовка образцов ДНК к генотипированию. Качество выделенной ДНК оценивали по степени чистоты и концентрации раствора на спектрофотометре NanoDrop (Thermo Fisher Scientific, США). Все анализируемые образцы ДНК были разведены деионизированной водой до концентрации 10 нг/мкл при А260/280=1,5-2,0.

3. Анализ полиморфизма rs3219484 (C>T) гена MUTYH - генотипирование методом полимеразно-цепной реакции в режиме реального времени. Использовали следующие последовательности праймеров: прямой праймер rs3219484 5'-GCTTGGCCTGACTGTTGTTC-3' (SEQ ID NO 1), обратный праймер rs3219484 5'-TGGCCTCATTGTGACTGACT-3' (SEQ ID NO 2), rs3219484-C-аллель-специфичный флуоресцентно-меченый зонд 5′-(FAM)TGTGACCACTTCCCAC(RTQ1)-3′ (SEQ ID NO 3), rs3219484-T-аллель-специфичный флуоресцентно-меченый зонд 5′-(ROX)TGTGACCACTTCCCAT(BHQ)-3′ (SEQ ID NO 4). Праймеры и зонды были синтезированы компанией «Синтол» (г. Москва). Реакцию амплификации проводили в 13,25 мкл смеси ПЦР, содержащей 9,4 мкл ddH2O, 1,3 мкл раствора MgCl2 (массовая концентрация 2,5%), 1,3 мкл ПЦР-буфера, 0,2 мкл смеси дНТФ (концентрация 2 ммоль/л), 0,05 мкл раствора прямого и обратного праймера (концентрация 100 пкмоль/мкл), 0,025 мкл раствора каждого TaqMan-зонда (концентрация 100 пкмоль/мкл) и 0,11 мкл Taq ДНК-полимеразы (концентрация 5 Ед/мкл), 1 мкл образца ДНК (минимальная концентрация 10 нг/мкл). ПЦР проводили с помощью прибора CFX96 Real-Time System (Bio-Rad) при следующем режиме: 2 минуты при 50°С, 10 мин при 95°С, затем 38 циклов амплификации, включающей 15 секунд при 95°С и 30 секунд при t=54°С. Детекция флуоресценции проводилась на стадии элонгации по каналам FAM и ROX. Анализ результатов генотипирования проводили с помощью программного обеспечения для амплификатора CFX96 Real-Time System (Bio-Rad) версии Bio-Rad CFX Manager 2.1. Статистические расчеты проводили с помощью программы SNPStats (Solé, X., Guinó, E., Valls, J., Iniesta, R., & Moreno, V. (2006). SNPStats: a web tool for the analysis of association studies. Bioinformatics, 22(15), 1928-1929) и PLINK (Slifer SH. PLINK: Key Functions for Data Analysis. Curr Protoc Hum Genet. 2018 Apr; 97(1):e59. doi: 10.1002/cphg.59).

4. Прогнозирование повышенного риска развития сахарного диабета 2 типа у мужчин в случае выявления генотипов rs3219484-C/T или rs3219484-T/T и пониженного риска развития этого заболевания при выявлении генотипа rs3219484-C/C.

Возможность использования предложенного способа для определения риска развития сахарного диабета 2 типа у мужчин подтверждает анализ результатов наблюдений 1173 мужчин, у 574 из которых установлен сахарный диабет 2 типа. В исследование включались лица славянской национальности Центральной России. Диагноз СД2 был установлен врачами-эндокринологами ОБУЗ ГК БСМП на основе клинического и лабораторно-инструментального обследования. Установлено, что носительство генотипов rs3219484-C/Т и rs rs3219484-Т/Т (OR=1,60, 95% CI 1,15-2,23, P=0,0053) ассоциировалось с повышенным риском развития сахарного диабета 2 типа (таблица 1).

Таблица 1

Ассоциация полиморфного варианта rs3219484 (C>T) гена MUTYH с риском развития сахарного диабета 2 типа у мужчин

Ген SNP ID Генотип, аллель n (%) Р_perm OR (95% CI)² Контроль (n=599) Пациенты с СД2 (n=574) MUTYH rs3219484 (C>T) C/C 515 (86%) 463 (80.7%) 0,0053 1,00 C/T 80 (13.4%) 104 (18.1%) 1.60 (1.15-2.23) T/T 4 (0.7%) 7 (1.2%) Т 7,3% 10,3% 0,015 1,44 (1,08-1,92) ¹Уровень значимости ассоциации;
²Отношения шансов и 95% доверительный интервал. Жирным выделены статистически значимые значения Р и OR (95% CI), доминантная модель.

В качестве примеров конкретного применения разработанного способа приведено генетическое обследование мужчин славянского происхождения, уроженцев Центральной России и не являющихся родственниками между собой: проведено генетическое обследование по локусу rs3219484 (C>T) гена MUTYH.

Донор-доброволец Ж.С., мужчина 57 лет обратился в ОБУЗ «Курская областная клиническая станция переливания крови» комитета здравоохранения Курской области 28.12.2018 г. для сдачи крови. Пациенту было предложено принять участие в научном исследовании для выявления генетической предрасположенности к сахарному диабету 2 типа. У мужчины была взята венозная кровь, при генотипировании полиморфного локуса rs3219484 (C>T) гена MUTYH был выявлен генотип rs3219484-C/C гена MUTYH, что позволило отнести мужчину в группу лиц с низким риском развития сахарного диабета 2 типа. Анализ крови подтвердил факт отсутствия нарушений углеводного обмена: концентрация глюкозы крови натощак 4,4 ммоль/л, гликированный гемоглобин 5,1%, что соответствует норме. Дальнейшее наблюдение не выявило диагноз сахарного диабета 2 типа.

Пациенту П.А., мужчина 50 лет, при прохождении профилактического осмотра на базе поликлиники ОБУЗ «Курской городской клинической больницы скорой медицинской помощи» 23.09.2015 г. было предложено пройти тестирование на предмет предрасположенности к сахарному диабету 2 типа. У мужчины была взята венозная кровь, при генотипировании полиморфного варианта rs3219484 (C>T) гена MUTYH был выявлен генотип rs3219484-C/Т гена MUTYH, что позволило отнести пациента в группу лиц с высоким риском развития сахарного диабета 2 типа. Тем не менее, профилактические мероприятия по увеличению физической активности и формированию приверженности к здоровому питанию мужчиной не проводились. С жалобами на сухость во рту, жажду до 5 литров в сутки, полиурию, снижение остроты зрения и снижение массы тела на 10 кг за месяц 20.02.2017 г. пациент П.А. был доставлен бригадой скорой медицинской помощи в эндокринологическое отделение ОБУЗ КГКБ СМП г. Курска, где получал стационарное лечение по 06.03.2017 г. При поступлении концентрация глюкозы крови составила 20,8 ммоль/л, гликированный гемоглобин 10,5%. Клинический диагноз: сахарный диабет, 2 тип, впервые выявленный, фаза декомпенсации от 20.02.2017 г., фаза компенсации от 06.03.2017 г. Индивидуальный целевой уровень HbA1c<7,0%. Целевой уровень гликемии плазмы натощак <7,0 ммоль/л, через 2 ч после еды <9,0 ммоль/л.

Пациент Ш.П., мужчина 62 года, проходил медосмотр в поликлинике ОБУЗ «Курской городской клинической больницы скорой медицинской помощи» 09.10.2015 г. Мужчине было предложено пройти тестирование на предмет предрасположенности к сахарному диабету 2 типа. У мужчины была взята венозная кровь, при генотипировании полиморфного варианта rs3219484 (C>T) гена MUTYH был выявлен генотип rs3219484-Т/Т гена MUTYH, что позволило отнести пациента в группу лиц с высоким риском развития сахарного диабета 2 типа. Тем не менее, профилактические мероприятия по увеличению физической активности и формированию приверженности к здоровому питанию с целью нормализации массы тела мужчиной не проводились. С жалобами на сухость во рту, жажду до 6 литров в сутки и полиурию 28.08.2016 г. пациент Ш.П. был доставлен бригадой скорой медицинской помощи в эндокринологическое отделение ОБУЗ КГКБ СМП г. Курска, где получал стационарное лечение по 08.09.2016 г. При поступлении концентрация глюкозы крови составила 25,7 ммоль/л, гликированный гемоглобин 9,1%. Клинический диагноз: сахарный диабет, 2 тип, впервые выявленный, фаза декомпенсации от 28.08.2016 г., фаза компенсации от 08.09.2016 г. Индивидуальный целевой уровень HbA1c<7,0%. Целевой уровень гликемии плазмы натощак <7,0 ммоль/л, через 2 ч после еды <9,0 ммоль/л.

Применение данного способа позволит на доклиническом этапе формировать среди мужчин группы риска и своевременно реализовывать в этих группах необходимые лечебно-профилактические мероприятия по предупреждению развития сахарного диабета 2 типа.

Резюме

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что носительство генотипов rs3219484-C/Т и rs3219484-Т/Т MUTYH является генетическим фактором риска развития сахарного диабета 2 типа (OR=1,60, Р=0,0053) у мужчин.

Использование предложенного способа позволит прогнозировать развитие сахарного диабета 2 типа у мужчин, что даст возможность осуществлять мероприятия по профилактике данного заболевания – регулярный контроль уровня глюкозы в крови, нормализацию массы тела, достаточную физическую активность, правильное питание с ежедневным включением в рацион свежих овощей и фруктов и ограничением рафинированных углеводов и жиров.

Изобретение относится к медицине, а именно к клинической лабораторной диагностике, и может быть использовано для прогнозирования риска развития сахарного диабета 2 типа у мужчин. Осуществляют забор образца периферической венозной крови. После экстракции ДНК проводят анализ полиморфного варианта rs3219484 (C>T) гена MUTYH. В случае выявления генотипов rs3219484-C/T или rs3219484-T/T прогнозируют повышенный риск развития сахарного диабета 2 типа. При обнаружении генотипа rs3219484-C/C прогнозируют низкий риск развития сахарного диабета 2 типа. Способ обеспечивает получение новых критериев оценки риска развития сахарного диабета 2 типа у мужчин на основе генотипирования полиморфного варианта rs3219484 (C>T) гена MUTYH. 1 табл., 3 пр.

Способ прогнозирования риска развития сахарного диабета 2 типа у мужчин, включающий забор образца периферической венозной крови, отличающийся тем, что после экстракции ДНК проводят анализ полиморфного варианта rs3219484 (C>T) гена MUTYH и прогнозируют повышенный риск развития сахарного диабета 2 типа в случае выявления генотипов rs3219484-C/T или rs3219484-T/T, а при обнаружении генотипа rs3219484-C/C – низкий риск развития сахарного диабета 2 типа у мужчин.