Способ получения эндонуклеазы рестрикции Fок1 из FLаVовастеRIUм океаNокоIтеS Советский патент 1988 года по МПК C12N9/16 C12N9/16 C12R1/20 

Изобретение относится к микробиологии и касается способа получения ферментов нуклеинового обмена, в частности рестриктаз.

Целью изобретения является повышение выхода фермента.

Способ заключается в том, что штамм F.okeanokoites выращивают на жидкой среде следующего состава,г/л:

Пептон 9,0 - 11,0

Дрожжевой

экстракт 4,0 - 6,0

NaCl 25,0 - 30,0

КС10,5 - 1,0

CaCl2-6 Н,20 . 2,0 - 3,0 MgS04-7 6,0 - 7,5

Глюкоза 0,5-1,5

р-Н7,2,

культивирование проводят при 27-29°С до стационарной фазы роста, что соответствует оптической плотности 2,2- 2,6 о.е. при нМ. Клетки разрушают ультразвуком и целевой продукт получают последовательной хроматогра фической очисткой на фосфоцеллюлозе Р-11, бензил-ДЕАЕ-целлюло36 и фосфоцеллюлозе Е-11 .

Культивирование бактерий на среде имеющей сбалансированный состав со- лей, ,и при оптимальной температуре 27-29 С приводит не к увеличению выхода биомассы, а к ее обогащению именно ферментом рестрикции и повышению выхода целевого продукта в 8-10

раз по сравнению с известным способом.

Выбор температуры культивирования обусловлен следующими эксперименталь ными фактами: изменение на 4-5°С в любую сторону от оптимального интервала (27-29 с) уменьшает скорость роста F.okeanokoites в 2 раза и не позволяет получить более высокий вы- ход фермента.

Результаты экспериментов по подбору компонентов питательной среды для культивирования F.okeanokoites представлены в таблице.

Наиболее оптимальной и сбалансированной по составу солей является среда 15.

Выход фермента в логарифмической фазе роста повышается в 1,1-1,2 раза по сравнению со стационарной фазой, однако полученный препарат фермента не стабилен при хранении (50% инактивация за 1 н еделю) .

о

5

0 5

O

5

„ с

0

5

Установлено, что для получения стабильного при хранении препарата фермента сбор урожая бактерий наиболее технологично производить на стадии стационарной фазы роста.

Пример. Получение рестрикта- зы Fok I.

Культивирование F.okeanokoites.

При культивировании клеток используют химреактивы отечественного производства без дополнительной очистки.

Для выращивания бактерий готовят растворы пита-т ельной среды.

Раствор 1: Пептон 10 г Дрожжевой

экстракт 5 г NaCl 27 г КС10,7 г

Вода 900 мл Раствор кипятят 5 мин, охлаждают до комнатной температуры, фильтруют через фильтровальную бумагу, доводят рН до 7,2 с помощью 5 н. раствора NaOH.

Раствор 2: MgS04-7H,0 7 г

Вода 50 мл

Раствор 3: 2,2 г Вода 40 мл

Раствор 4: Глюкоза 1 г

Вода 10 мл

Все растворы стерилизуют в автоклаве при 40 мин, затем сливают в стерильных условиях непосредственно перед приготовлением питательной среды.

Клетки бактерий подращивают на твердой питательной среде при 28 С в течение суток, затем готовят иноку- лят для засева ферментера. Объем ино- кулята 1/10 часть от объема ферментера. Культивирование проводят в ферментере (объем 20 л) при 28 С и аэрации 20 л/ч. Величина рН в процессе роста поддерживается автоматически на уровне 7,2 добавлением 0,2 н. NaOH.

Клетки выращивают до стационарной .фазы (оптическая плотность 2,5 при нм). Клетки собирают центрифугированием при 5000 g в течение 10 мин. Выход биомассы 3,5 г/л.

Выделение и очистка рестриктазы.

Все процедуры по выделению и очистке фермента проводят при О - 4°С. 4 г клеток суспендируют в 20 мл 0,01М трис-НС1 буфера, рН 7,5, содержащего 0,1% тритона Х-100, разрушают на ультразвуковом дезинтеграторе 4 раза по 40 с, клеточный дебрис отделяют

центрифугированием при 5000xg в течение 20 мин. Полученный грубый экстракт наносят на колонку с фосфоцеллю- лозой Р-11 размером 1, см, уравновешенную 0,02 М трис-HGl буфером, рН 7,5, содержащим 1 мМ 2-меркаптоэта- нола, 0,5 мМ ЭДТА и 5% глицерина (буфер А). Несорбированный на колонке материал элюируют 50 мл буфера А. Фермент эхооируют 20 мл буфера А, содержащего 1 М NaCl и диализуют лротив буфера Б (0,02 М калий фосфатный буфер, рН 7,5, содержащий 1 мМ 2-мер- каптоэтанола, 0,5 мМ ЭДТА и 5% глице- рина).

После диализа раствор фермента осветляют центрифугированием при в течение 5 мин и супернатант наносят на колонку размером 0, см с бензил-ДЕАЕ-целлюлозой.

Несорбированный материал, содержащий фермент, собирают и наносят на колонку размером 0,9 х2 см с фосфо- целлюлозой Р-11, уравновешенной буфе- ром Б, .Фермент элюируют 40 мл линейного градиента NaCl (0,1 М) в буфере Б. Фракции, содержащие растриктазу (элюируемые при 0,4 - 0,45 М NaCl), собирают и диализуют против буфера Б содержащего 50% глицерина. Выход продукта составляет 2000 ед./г биомассы. Полученный препарат имеет активность 3000 ед./мл. Активность фермента определяют в реакционной смеси которая в 20 мкл содержит 1 мкг ДНК фага Л, 0,02 М трис-НС1 буфера, рН 7,5, 0,01 М MgCl, 0,02 М КС1, 1 мМ 2-меркаптоэтанола.

Реакцию проводят при 37 С в течение 1 ч, затем пробы подвергают элекрофорезу в 1%-ном агарозном геле. За единицу активности принимают минимальное количество фермента, необходимое для полного расщепления 1 мкг ДНК фаза А при данных условиях реакции.

Отсутствие неспецифических эндо- нуклеаз и фосфотаз подтверждается

высокоэффективным лигированием фрагментов ДНК фага Д, полученных в результате гидролиза полученным препаратом фермента. Правильность лйгиро- вания подтверждается повторным гидролизом рестриктазой Fok I с образованием аналогичных фрагментов.

Формула изобретения

Способ получения эндонуклеазы рестрикции Fok I из Flavobacterium okeanokoites, включаюш11Й культивирование клеток в жидкой питательной среде, содержащей в качестве источника азота белковый гидролизат,-в качестве источника витаминов - дрожжевой экстракт, хлористый натрий, глюкозу и воду, разрушение клеток ультразвуком, хроматографию полученного экстракта на фосфоцеллюлозе и очистку целевого продукта ионообменной хроматографией, отличающийся тем, что, с целью noBbmie- ния выхода фермента, в качестве продуцента используют Flavobacterium okeanokoites ВКПМ-2835, в среду для культивирования дополнительно вводят хлористый кальций, хлористый калий и сульфат магния, в качестве белкового гидролизата используют пептон при

следующем соотношении комопнентов,

/

г/л:

Пептон

Дрожжевой экстракт Хлористый натрий Хлористый калий Хлористый кальций Сульфат магния Глюкоза Вода

Остальное

45

культивирование ведут при 27-29 С до достижения стационарной фазы роста, а при очистке целевого продукта ионообменную хроматографию проводят на бензил-ДЭАЭ-целлюлоза с последующей рехроматографией на фосфоцеллюлозе.

Изобретение относится к микробиологии, в частности к способу получения рестриктаз. Целью изобретения является повьшение выхода рект- риктазы Fok I. Для этого штамм-продуцент Flavobacterium okeanokoites В-2835 культивируют на жидкой питательной среде, содержащей, г/л: пептон 9,0-11,0; дрожжевой экстракт 4,0-6,0; NaCl 25,0-30,0; КС1 0,5- 1,0; ,,20 2,0-3,0; MgS04 7H20 6,0-7,5; глюкоза 0,5-1,5, до достижения стационарной фазы роста с последующим вьщелением и очисткой рест- риктазы, включающей 3 хроматографи- ческие стадии. Способ позволяет увеличить выход фермента в 8-10 раз.. Выход фермента 2000 ед. на 1 г биомассы, активность препарата 3000 ед./мл. 1 табл. с . (Л 4ik О Од а о