Способ получения альдолазы из скелетной мышцы человека Советский патент 1987 года по МПК A61K35/34 

Изобретение относится к биологии и может быть использовано в энзимологии и в медицине для изучения заболеваний на молекулярном уровне.

Известен способ получения альдолазы методом фракционного осаждения сульфатом аммония из скелетной мышцы кролика.

Однако, этот способ выделения фермента не позволяет получить альдолаз в кристаллически чистом виде из мышцы человека.

Известен также способ получения альдолазы из скелетной мьш1цы человека путем размельчения ткани, экстрагирования раствора белков, добавления к полученному раствору сульфата аммония, отделения балластных белков с последующей кристаллизацией целевого продукта.

Однако известный способ длителен.

Целью изобретения является ускоре1ше способа.

Для достижения этой цели при осуществлении способа получения альдолазы из скелетной мышцы человека путем размельчения ткани, экстрагирования раствора белков, добавления к полученному раствору сульфата аммония, отделения балластных белков с последующей кристаллизацией целевого продукта, отличительной особенностью является то, что экстракцию пробы проводят двузамещенным раствором К2ЫР04 в соотношении 1:2 в течение 60 - 80 мин, далее, экстракт отделяют от плотной части, добавляют сульфат аммония до степени насыщения 0,45 по объему, центрифугируют при 6000 об/мин .в течение 20-30, мин, к полученному сулернатанту добавляют сульфат аммония до насыщения 0,55, снова центрифугируют при 12000 об/мин в течение 10-15 мин, осадок растворяют в 0,03 М растворе ., доба;вляют сульфат аммония до рН 6,0- 6,2 и кристаллизацию целевого продукта ведут на холоде.

Способ осуществляют следующим образом.

I э т а п. Для вьщеления альдолазы берут 500 г мьппечной ткани с бедра умершего, с момента смерти которого прошло не более 24 ч. Мышцы хорошо охлаждают с помощью льда, очищают от жировой, соединительной ткани, пропускают дважды через охлажденную мясорубку. Полученный фарш

взвешивают и смешивают с двукратным объемом охлажденного раствора 0,03 М KjHPO. Экстрагируют 60 мин при периодическом помешивании стеклянной палочкой при температуре 2°С. Через 60 мин экстракции плотный остаток мышц отжимают через ткань, отбрасывают. Измеряют объем экстракта.

К полученному экстракту добавляют растертьй порошок сульфата аммония из расчета 32,4 г на каждые 100 мл, что составляет 0,45 насьш;ения. Порошок сульфата аммония добавляют не- л

5 большими порциями, медленно перемешивают, не взбивая пены. После полного растворения сульфата аммония через 15 мин стояния на холоде образовав1пийся осадок балластных белков отделяют центрифугированием в рефрижераторной центрифуге при 6000 об/мин в течение 30 мин или фильтрованием через складчатый фильтр.

II э т а п. К прозрачному центри5 фугату или фильтрату добавляют еще сульфат аммония из расчета 7,2 г на 100 мл, повьш1ая тем самым насьш1ение до 0,55 (фракц. 0,55). При помешивании стеклянной палочкой растворяют

0 добавленную соль и через 15 мин стояния на холоде центрифугируют в ре- фрижераторной центрифуге при 10000 об/мин в течение 15 мин. Пентрйфугат отбрасывают. Плотньш осад.ок, содержащий значительное количество альдолазы, собирают. В хорошо охлажденные пробирки к осадку, полученному из 500 г мышц, прибавляют 1520 мл 0,03 М . Первой порцией растворяют осадок в первой пробирке. Растворив, переливают во вторую пробирку и т.д. Второй порцией омывают белок в каждой пробирке и объединяют растворы в последней, перемешивая стеклянной палочкой. При растворении осадка указанным объемом 0,03 М раствором раствор может быть прозрачным или слегка ополесцировать. Такой раствор пропускают через ватный фильтр, смоченный 0,03 М раствором . Это позволяет избавиться от пузырьков воздуха и загрязнений. К полученному раствору добавляют мелкодисперсный сульфат аммония, тщательно перемешивая, до появления слегка заметной мути, дающей при перемешивании стеклянной палочкой шелковистость. Использование 0,03 М раствора для растворения осадка и последующее Добавление сульфата аммония приводит к получению рН маточного раствора 6,0-6,2 при котором и происходит кристаллизах ия альдолазы, рН раствора проверяют потенциометрически. Если в результате фильтрования, через ватный фильтр, предварительно сйоченный бидистиллированиой водой, раствор становится прозрачным, то насыщение следует повышать, прибавляя небольшими порциями сернокислый аммоний до появления шелковистости при медленном помешивании стеклянной палочкой. Оставляют в холодильнике для кристаллизации при температуре . Кристаллы альдолазы в вцде гексогональных бипирамид появляются через 6 сут. без внесения затравки. При до бавлении же затравки кристаллизация начинается через 12ч. Процесс кристаллизации заканчивается на 9 сут. III эта п. Перекристаллизация альдолазы. Осадок первичных кристаллов отделяют центрифугированием в, рефрижераторной центрифуге при 10 000 - 12 000 об/мин в течение 6 №1н. Осадок растворяют в минимальном количестве 0,03 М раствора KjHPO под контролем с помощью микроскопа. Раствор пропускают через смоченный 0,08 М раствором К2НР04 ватньй фильтр, освобоядаясь тем самым от воздуха. Затем добавляют мелкодисперсный порошок сульфата аммония до появления слабой мути и шелковистости при медленном помешивании стеклянной па1лочкой. рН маточного раствора, при котором начинается кристаллизация, составляет 6,3. Кристаллизация может протекать как при комнатной температуре , так и при стоянии на холоде. Первые кристаллы появляются через сутки. Активность фермента возрастает при перекристаллизации. Перекристаллизация обеспечивает получение гомогенных препаратов альдолазы, позволяет освободиться от миоглобина, дегидрогеназ и Других ферментов. Способ получения из ткани человека индивидуально чистого препарата альдолазы - одного из ведущих ферментов углеводного обмена, расширяет возможности в теоритической энзимологии, а именно, могут быть охарактеризованы физико-химические свойства, структурно-функциональные особенности энзима из мышц человека, про- слежены закономерности конформационной организации и каталитической функции и филогенезе, а в медицине возможность изучения заболеваний на молекулярном уровне.

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АЛЬДОЛАЗЫ ИЗ СКЕЛЕТНОЙ МЫШЦЫ ЧЕЛОВЕКА путем размельчения ткани, экстрагирования раствора белков, добавления к полученному раствору сульфата аммония, отделения баилластных белков с последукщей кристаллизацией целевого продукта, отличающийся тем, что, с целью ускорения способа, экстракцию пробы проводят двузамещенным раствором KiHP04 в соотношении 1:2 в течение 60 - 80 мин, далее экстракт отделяют от плотной части, добавляют сульфат аммония до степени насыщения 0,45 по объему, центрифугируют при 6000 об/мин в течение 20 30 мин, к полученному супернатанту добавляют сульфат аммония до насыщения 0,55, снова центрифугирую при 12000 об/мин в течение 10 - 15 мин, осадок растворяют в 0,03 М раствора , добавляют сульфат аммония до рН 6,0 - 6,2 и кристаллизацию целевого продукта ведут на холоде.