Способ внутривидовой дифференциации @ @ биотипа Эль Тор Советский патент 1983 года по МПК C12Q1/04 

со о

4 Изобретение относится к микробиологии, в частности к способам диффаренциации штаммов холерных вибрионов, и может быть использовано в диагностических и научно-исследовательских целях. Известен способ внутривидовой дифференциации vibrio cholerae биотипа Эль Тор путем выращивания микроорганизмов на питательной среде в толще агара в присутствии индикатора чувствительных, к вибриоцину микроорганизмов, с последующей дифференциацией по литической активности - величине зоны лизиса индикаторного штамма tl Однако известный способ сложен в осуществлении. Целью изобретения является упрощение способа, Эта цель достигается тем, что сог ласно способу внутривидовой дифферен циации vibrio cholei a-e. биотипа Эль Тор путем выращивания микроорганизмов на питательной среде в присутствии индикатора с после 1ующей дифференциацией по литической активности, выращивание осуществляют на поверхности питательной среды, содержащей в качестве индикатора дезохсихолат натрия в концентрации 0,5-3 мг/мл среды. Способ осуществляют следующим образом. Одну петлю агаровой культуры засевают в 5 мл бульона (рН 7,7-7,8), выращивают 4 ч при 37°С. Затем одну каплю полученной бульонной культуры наносят на поверхность агара Мартена содержащего дезоксихолат натрия. Рецепт приготовления агаровой среды: :iнавеска 50 мг дезоксихолата натрия вносится в 100 мл растопленного агара Мартена (рН 7,6-7,8). Среду разли вают в 5 чашек Петри, после застывания агар совершенно прозрачный. Чере сутки выращивания при 37°С .культуру убивают парами 40%-ного формалина в течение 48 ч, помещйя смоченную формалином вату в крышку, чашки Петри при кЪмнатной температуре. Учитывают результаты после удаления ваты-с фор малином. Среда приобретает молочносерую окраску, непрозрачная. Вокруг колоний культуры образуется зона пр светленйя агара в виде ореола. Каждый штамм холерного вибриона имеет Х рактерный ореол и различается по величине, степени прозрачности и по количеству ободков мутных и прозрач ных. По количеству ореолов холерные штаммы дифференцируются на 2 типа; Iтип - образующие один ореол, и IIтип - 2 ореола; по величине ореолов: 6 размеров - 0,5-1-1 f5-2-34 мм; по степени прозрачности на 3 типа - мутный, полупрозрачный и про рачный. Так, штамм 517/130 образует один узкий (1 мм), мутный ореол, что свидетельствует о его сл,абой литической активности. То есть величина ореола при измерении радиуса от края макроколонии до края плотной среды у штаммов, обладающих слабой литической активностью, будет 0,5-1 мм, и возрастает от 2 до 4 мм у активных по лизису культур. По этому признаку штаммы легко дифференцируются 1между собой. Так же культуры, образующие два ореола, отличаются .от кульТур с одним ореолом. Но и внутри штаммов, имеющих два ореола, возможна дифференциация. Так, штамм 2635 образует у края колонии прозрачный узкий ореол (1 мм), а потом мутный (1,5 мм), в то же время штамм 8556 полупрозрачный широкий ореол (3 мм) и узкий мутный (1 мм). Пр и м е р 1. Отсевают в две пробирки с 5 мл бульона по одной петле агаровых культур вибрионов Эль Тор 9949 и 517/130. Выращивают в течение 4 ч при 37°С так, чтобы концентрация микробных клеток составляла И«10°-,П10 кл/мл.Готовят плотную питательную среду,содержащую 0,5 мг/мл дезоксихолата натрия, для чего навеску 50 мг дезоксихолата натрия растворяют в 100 мл агара Мартена и разливают в 5 чашек Петри по 20 мл. На подсушенный агар на расстоянии 4 см друг от друга наносят по одной капле выросших бульонных культур и ставят в термостат при 37°С на сутки. Затем посевы культур убивают парами формалина путем нанесения 4б%-ного раствора формалина на тонкий слой ваты, помещенной в крышку чашки Петри. Чашки оставляют при комнатной температуре 48 ч. Учитывают результаты по наличию и величине (в мм) зоны просветления вокруг макроколоний сравниваемых штйммов. Штамм вибрионов Эль Тор образует широкий (2 мм) прозрачный ореол просветления в агаре. Штамм 517-130 образует узкий (1 мм) мутный ореол вокруг макроколонйи.. П р и м е р 2. Отсевают в две пробирки с 5 мл бульона по одной . петле агаровых культур вибрионов Эль Тор 9949 и 517/130. Выращивают в течеТние 4 ч при . Готовят плотную питательную среду с 1 мг/мл дезоксихолата натрия, для чего навеску 100 мг дезоксихолата натрия растворяют в 100 мл агара Мартена и разливают в 5 чашек Петри по 20 мл. Посев и учет проводят так же, как в. примере 1. Пример 3. Отсевают в 2 пробирки С 5 мл бульона по одной петле аГаровых культур вибрионов Эль Трр 9949 и 517/130, Выращивают в течение 4 ч при 37 С. Готовят плотную питательную среду с 2 мг/мл дизоксихолата натрия. Для этого навеску 20 мг дезоксихолата натрия растворяют в 100 мл агара Мартена и разливаюг в 5 чашек Петри по 20 мл. Посев и учет проводят так же, как в примере 1.

Предлагаемый способ дает возможность легко дифференцировать как типичные штаммы холерных вибрионов, так и мутанты, полученные различны ми методами. При этом облегчает я дифференциация шхаммов одного серо.вара и фаговара, что являетс я крайне удобным при Проведении генетических исследований, когда отсутствие отличительных признаков не позволяет использовать компетентные доноры и реципиенты. Кроме того, способность к продукции вибриоцина проявляется у штаммов только после 10-15 пересевов на жидких и плотных питательных средах.

Эффектив-ность предлагаемого способа составляет 100%, в то время как по известному способу ни is йДиом слу0чае не удается выявить вибриоцины у заведокю известных продуце тоЪ с использованием в качестве И21дикаторных культур типичньсс шта1ммов холерных вибрионов.

СПОСОБ ЙНУТРИВИДОВОЙ ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ VrBRIO CH01ERAE БИОТИПА ЭЛЬ ТОР путем выращивания микроорганизмов на питательной среде в присутствии индикатора с последующей дифференциацией по литической активности, о т л и ч а ю щ и и с я тем, что, с целью упрощения способа, выращивацие осуществляют На поверхности питател| ной среды, содержащей в качестве индикатора деэЬксихолат натрия в Кондейтрации 0,5-3 мг/мл среды.