Способ получения кормовой добавки на основе антибиотика @ 290 Советский патент 1983 года по МПК A23K1/17 C12P1/00 

4

00

s3

Изобретение относится к способу получения кормовой добавки на основе антибиотика.А 290 и может быть использовано в микробиологической промышленности для производства добавочных средств к кормам для усиле ния роста животных, например, домаш ней птицы, свиней и жвачных животных, например, крупного рогатого ск та, овец и коз. Известен способ получения добавк к кормам на основе антибиотика ЛУ 290, который образуется путем ферментативного биосинтеза в процессе культивирования в контролируе мых условиях штамма микроорганизма Streptomyces candidus NRRZ 3218 и его мутантовС, Проблема извлечения антибиотика экономически выгодным путем является довольно серьезной. В известном способе для извлечения антибиотика используют адсорбцию на угле с послед5ло1дим элюированием и хроматог фию на колонке. Такой способ нельзя считать слишком дорогим, если чисты антибиотик-необходим для применения ,в медицине. Однако, если антибиотик применяют в качестве компонента для добавки в корм животных, фактор стоимости становится серьезной проблемой и поэтому появляется необхо димость в создании недорогого спосо ба извлечения антибиотика для этой «дели.. Известен также способ получения кормовой добавки на основе антибиотика AV 290, включающий фильтрование ферментационной среды, содержащей антибиотик AV 290, подкисле-ние полученной ферментационной жидкоети до рН 2,0-2,2, добавление комплексообразующего соединения и виде синтана, отделение осажденного комплексного соединения антибиотика А V 290 и сушку егоГ2. Однако получаемая добавка по известному способу недостаточно эффективна при корг-шенииживотных. Цель изобретения - повышение эффективности получаемых -кормовых добавок на основе- антибиотика AV 290. Поставленная цель достигается те что согласно способу, включающему фильтрование ферментационной ереды, содержащей антибиотик AV 290, подкисление полученной ферментацион ной жидкости до рН . 2,0-2,2 добав-: ление комплексообразующего соединения, отделение осажденного комплекс ного соединения антибиотика AV 290 и сушку, в качестве комплексообразу щего соединения используют алкилсульфаты натрия, выбранные из группы, включающей децилсульфдт натрия, лаурилсульфат натрия и/ пасту Эмпикол сне 30 на основе цетилс/льфата натрия л олеилсульфата натрия. Алкилсульфаты, полезные для пред- . лагаемого способа, могут быть пред- , ставлены следующей общей формулой; CHf(CH2}f,-0-502-m, где п - целое число от 9 до 17 включительно; М - атом натрия или калия. Типичными такими алкилсульфатами щелочных металлов, которые можно .применять, являются, например, децилсульфат натрия, гендецилсульфат кали-я, лг1урилсульфат натрия, тридецилсульфат калия, меристилсульфат натрия, пенгадецилсульфат калия, цетилсульфат натрия, гептадецилсульфат калия и октадецилсульфат натрия. Можно использовать также смеси алкилсульфатов щелочных метал- . лов, например, смесь гландецилсульфата натрия и октадецилсульфата калия, смесь децилсульфата калия и гептадецилсульфата натрия, смесь лаурилсульфата калия и цетилсульфата калия, смесь тридецилсульфата натрия, меристилсульфата калия и пентадецил- . сульфата натрия, и т.п. При и спользовании смесей алкилсульфатов щелочных металлов получают соответствующие смеси комплексов антибиотика с алкилсульфатом. Способ предусматривает почти полное -удаление активного антибиотика из ферментативного сусла или бульона. Более того, полученный в результ тате комплекс антибиотика с алкилсульфатом можно использовать без разделения компонентов состава для кормовой добавки, что имеет большое экономическое значение. Поэтому в одном из вариантов комплекс антибиотика AV 290 и алкилсульфата щелочного металла включен в виде продукта. Продукт реакции антибиотика и алкилсульфата щелочно.го металла считается обратным комплексом антибиотика и алкилсульфата. Его точная химическая структура не установлена, но - ковалентных связей не; имеется и продукт не представляет собой физическую смесь. Этот комплекс, полученный взаимодействием антибиотика и алкилсульфата щелочного металла, не обязательно соединяется в какомлибо ограничивающем стехиометрическом соотношении. Химические связи обратимы ввиду того, что антибиотик AV 290 можно извлекать иЭ комплекса любыми способами, например, адсорбцией на карбоксиметилдекстрановом геле, помещенном в колонку, с последующим элюированием водным раствором кислоты. В качестве исходного материала для предлагаемого способа можно использовать цельное собранное сусло, полученное после завершения ферментацииштамма S. candidtis NRRZ 3218 или его мутантов, Предпочтктел но используют ферментативную жидкос или ферментативный бульон, предвари тельно осветленные путем удаления мицелия и других нерастворимых веществ фильтрованием. Для облегче, ния фильтрования можно использо-. вать диатомную землю или другие известные средства. В любом случае сначала доводят рН цельного сусла или фильтрованного бульона до величины в интервале 1,9-22, предпочтительно до примерно 2,0, с помощью кислоты. В качестве растворимых кис лот, применяемых для этой цели, могут быть, например, хлористоводород ная кислота, серная кислота, -трифторуксусная кислота и т.п., хотя можно использовать даже ледянуюуксусную кислоту.Эти значения рН имеют существенное значение, так как при рН ниже 1 ,г9 наблюдается разложение антибиотика AV 290 за время сушки осадка на фильтре даже при под вакуумом. Затем медлен но, при перемешивании окружгиощей среды, добавляют водный раствор алкилсульфата щелочного металла (или смеси алкилсульфатоЬ щелочных металлов ). Весь процесспредлагаемого способа предпочтительно осуществлять при температуре примерно 15-30°С, обычно при комнатной температуре. Антибиотик и алкилсульфат образуют комплекс,.который нерастворим в воде и поэтому выпадает IB осадок. Осажденный комплекс или, в случае применения цельного сусла, осажденный комплекс вместе с ферментационными компонентами сусла затем удаляют фильтрованием или центрифугированием и высушивают. По лученный в результате продукт можно высушивать наслаиванием увлажненных твердых частиц в среде полярного смешивающегося с водой осадителя, на пример ацетона, с прследукадими стади ми фильтрования, промывки и сушки на воздухе, или повторным наслаиванием увлажненных твердых частиц в во де и лиофильной сушкой или сушкой распылением. После тщателнной сушки продуктов предлагаемого- способа при температурных условиях-, не дгиощих разложения антибиотика AV 290 , получают обычно порошки от белого до коричневого цвета в случае применения комплекса алкилсульфата.Б случае применения комплекса алкилсульфата, ассоциированного с высушенными твердыми частицами высушенного собранного сусла, получают обычно порошки ил твердые частицы от серого До бурого цветов. В сухой форме эти продукты весьма устойчивы и не обладают значительной способностью терять антибиотическую активность в определенный период времени. Тдкая большая продолжительность срока хранения имеет большое .практическое значение. Преимущество предлагаемого способа состоит в .том, что количество алкилсульфата щелочного металла, добавляемого к осажденному комплексу с антибиотиком, не является особенно критичным и нет необходимости в применении точно стехиометрических количеств. Количество алкилсульфата щелочного металла, необходимое для осаждения антибиотика AV 290 из цельного собранного сусла, составляет 1,5-2,, 5 г на грамм в ещества с активностью антибиотика AV 290 в сусле. Предпочтительно примеление примерно 2,0 г алкилсульфата щелочного металла на грамм вещества с антибиологической активностью Содержание AV 290 в 1 ельном сусле можно легко установить микробиологическим анализом (после юведення рН до 8,0-9,0-. Предпочтительным способом является турбидиметрический анализ тетрациклина, основанный на использовани 3taphylococ.cus aureus. Определенное количество алкилсул ьфата щелочного металла затем предпочтительно раст;воряют или суспендируют в определенном количестве воды и водный раствор или суспензию добавляют к цельному . суслу, как описано выше. В растворе после фильтрования остается лишь избыток алкилсульфата щелочного металла. Количество алкилсульфата щелочного металла, необходимое для осаждения антибиотика AV 290 из осветленной жидкости, составляет примерно 1 г на грамм вещества с активностью AV290 в осветленной жидкости. Более высокое содержание алкилсульфата щелочного металла для необходимого осаждения AV 290 из цельного сусла или из осветленной жидкости приводит к соосаждению других белковых материал.лов, содержащихся в цельном сусле. Обычно минимальное количество алкилг сульфата щелочного мателла, необходимое для образования комплекса с ан-. тибиотиком в -осветленной жидкости, в любой ферментационной жидкости можно легко определить следующим образом. Образец (обычно 50-100 мл) ферментативного цельного сусла отбирают и осветляют удалением мицелия и других нерастворимых материгшов фильтрованием, предпочтительно с помощью средства, облегчающего фильтрование. Фильтрат затем подкисляют до рН 1,9-2,1 разбавленной водой минеральной кислотой, например разбавленной соляной кислотой, разбавленной серной кислотой и т.п. Этот раствор затем титруют 9 Рбделенным водным раствором алкилсульфата щелочно го металла, который применяют до появления В нем осадка или мути. Затем подсчитывают количество раствора алкилсульфата щелочного металл из титра взятого образца, предусмат ривая также небольшой избыток. Высушенный алкилсульфатный комплекс или высушенное твердое собранное сусло., содержащее алкилсульфатный комплекс, либо Б чистом виде, либо в сочетании с подходящими носителями, при введении в корм животных значительно усиливает их рос Кроме -того, происходит улучшение эффективности кормов. Преимущество предлагаемого способа состоит в том что значительно повышается прирост нёжвачньвс, например пти-ц и свиней, особенно отнятых от матери поросят и заметно улучшается усваиваемость кормов. , Составы для добавки в корм вводя в количествах, обеспечивающих примерно следующие дозировки, мг на го ву в день: Крупные жвачные животные 350 Мелкие жвачные животные 200 Нежвачные животные 100 Домашняя птица2 Количество антибиотика AV 290 в миллиграммах на фунт можно легко ус новить биоанализом (после доведения рН до 8,0-9,0). Предпочтительным.яв ляется турбидиметрический метод ана лиза тетрациклина на streptococcus aureus. Из полученных потенциальных данных можно легко подсчитать количество кормовой добавки в граммах в расчете на тонну .кормов. Для приготовления кормовой добавки по предлагаемому способу, со

Содержание антибиотика AV 290 в фильтре и осадке

Таблица 1 держащей высушенный алкилсульф комплекс или высушенное собрание твердое сусло, можн.о использовать большое разнообразие носителей. В качестве носителей, применяемых для составления составов для кормовых добавок, можно использовать соевую муку, муку из люцерны, хлопковую, льняную, кукурузную муку, тростниковую мелассу, мочевину, костную муку, муку из кукурузных кочерыжек и т.п. Носитель способствует однородному распределению комплекса готового корма, в котором сме11.гивается добавка. Таким образом, осуществляется важная функция сообщения должного распределения комплекса во всем корме. . П р и м е р 1. Осаждение комплекса антибиотика AV 290 с лаурилсульфатом натрия- из осветленной жидкости. Применяют образец технического сульфата антибиотика ЛУ 290 с микробиологической способностью, составляющей 63,8%. Часть сульфата AV 290 растворяют в воде и доводят рН раствора до 2,0 добавлением 15%-ного раствора серной кислоты. В качестве средства, улучшающего фильтрование, добавляют Целит 545 (диатомовая .земля ), и по капля м при перемешивании добавляют 2%-ный водный раствор лаурилсульфата натрия. Полученную смесь выдерживают в течение 30 мин при комнатной температуре и твердые частицы удаляют фильтрованием и высушивают под вакуумом при . Отработанный фильтрат и сухую твердую массу подвергают микробиологическому анализу, результаты которого приведены в табл.1.

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОРМОВОП ДОБАВКИ НА ОСНОВЕ АНТИБИОТИКА AV290, включающий фильтрование ферментациоиной среды, содержащей антибиотик AV 290, подкисление полученной фермен. тационной яшдкости до. рН 2,0-2,2, добавлением комплексообраэующего соединения, отделение осажденного комплексного соединения антибиотика AV 290 и сушку, о л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью повыиения эффективности кормовой добавки, в качестве комплексообразующего соединения используют алкилсульфаты натрия, выбранные из группы, включающей децилсульфат натрия, лаурилсульфат натрия и пасту Эмпикол СНС 30 на основе цетилсульфата натрия и олеилсульфата натрия.

П р и м е р 2. Осаждение комплек са антибиотика AV 290 с лаурилсульфатом натрия из цельного собранного сусла. Собирают образцы из взбалтываемых колб для ферментации S.candidus

85,8 95,0 92,7 - 60 5 и повышают их силу добавлением технического сульфата AV 290. В опытах, результаты которых сведены в табл.2, используют 100 мл сусла, а рН сусла доводят до 2,0 добавлением 15%-ной водной серной кислотьл.

Затем добавляют 3,0 г Дикалита 478 (диатомовая земля )и 2%-ный водный раствор лаурилсульфата натрия по каплям и при перемешивании. Смеси выдерживают в течение 3 ч при комнатной температуре, осадок удаляют

Активность фильтрата и осадка Номер опыта

1300 1300

5130 5130

0,78 0,78

Примерз, Влияние рН на осаждение комплекса из цельного собранного сусла.

Образцы цельного собранного сусла после ферментации доводят до активности 4,930 J-/мл добавлением технического сульфата AV 290 и доводят образцов добавлением 15%-ной водной серной кислоты, как показано в / табл.3. Затем добавляют по каплям при

рН сусла для ферментации

Количество активного вещества, %:

В отработанном фильтрате

Ф1шьтрованием и высушивают под вакуумом при 40°С. Отработанные фильтры и сухие осал1 и подвергают микробиологическому анализу, результаты которого приведены в

табл-. 2,

Таблица

ИЗО 975 975

1400 1400 ИЗО

5230 5230 . 4960

4960

2,02 3,08 4,10

1,15 1,53 1,61

I перемешивании 3,0 г Дикалита 478 , после чего дббавляют 2%-ный водный раствор лаурилсульфата натрия до соотношения ) SO NajAV 290, составляющего 1,62, Смеси выдерживают

IТаблица 3

2,4

2,2

2,0

1,8

10,1

6,9

6,1

6,4 IL; ::::L: :::L:I::::LI::L: ::L;I::Z:::I:

. В сухом осадке на фильтре55,3

;Общее содержание AV 290,%62,6 П р и м е р 4. Осгихдение антибио тика AV 290 из цельного собранного сусла с применением лаурилсульфата натрия. 30 л образца сусла, полученного из полупроизводственного ферментера, с содержанием, найденным микробиологическим путем и составляющим 3-, 740у/МП (Обрабатывают следующим об разом. Значение рН сусла доводят до 2,0 добавлением 219 мл концентри рованной серной кислоты, а затем в качестве средства, способствующего фильтрованию, добавляют 1 кг Ди :Калита 478. К перемешиваемому суслу медленно добавляют раствор 240 мг лаурилсульфата натрия в 3 л ды. Обработанное сусло затем выдерж вают в течение часа при комнатной температуре и твердые частицы-удаляют на фильтр-прессе. Мокрый осадо на фильтре высушивают под вакуумом при , в результате чего получают 1,978 г сухого продукта, микроби логический анализ которого показал 4,72%. Это соответствует извлечению антибиотика AV 290 из сусла в сухой осадок на .фильтре, составляющему 83,2%. Пример 5. Осаждение антибио тика AV 290 из цельного собранного сусла с применением децилсульфата натрия. 400 мл образца из взбалтываемой колбы (с активностью 4,590у/мл под кисляют до рН 2,О-добавлением 3,0 м .концентрированной серной кислоты/ а затем добавляют 5 г Дикалита j478. в качестве средства, облегчакщ го фильтрование. К перемешиваемому суслу медленно добавляют 9,68 г Эмпикола 0137 раствор децилсульфата натрия с активностью 30,5%, пр изводимой- фирмой Олбрайт энд Вилсон Кемикэлс, Лтд ), разбавленного ВОДОЙ до 50 мл. Обработанное сусло затем выдерживают при перемешивании в течение часа при комнатной температуре и нерастворенные вещества удаляют на вакуумном фильтре. Осадок на фильтре высушивают под вакуумом при и получают 20,2 г сухого продукта(микробиологический анализ показал 9,14%). Это составля ет 100,5%-ное извлечение антибиотика AV 290 из сусла. П р и м е р 6, Осаждение антибио тика AV 290 из цельного собранного

Продолжение табл

rI

- I

71,6

Контроль

Комплекс AV, 290-лаурил В расчете на А 290 i

Примере. Однодневным, цеплятам (штаммRoss-f дают одинаковый корм, содержаишй дозы антибиотика AV 290 25 в виде синтанового или ёшкилсульфат- ного комплекса в течение 56 дней: j 1 группа А получала антибиотик AV 290 в виде лаурилсульфатного комплекса натрия; It группа В получала ЗО антибиотик AV 290 в виде синтаноВ контрольный и экспериментальный корм добавляют средства для предотвращения кокцидиоза: к начальной и ростовой частям - препарат ребенеТаблица 5

1,46

191,38

вого комплекса, III группа - контрольная. El каждой группе было 51 пег .тушок и 51 курочка, которых содержали в загоЕЮженных площадках. Всем цыплятг1м Е1 возрасте 29-ти дней была сделана прививка против ньюкастлской болезни. Корм для цыплят разного возраста имеет характеристи1 у, приведенную в.агабл.6.

Таблица 6

Таблица 7 дин, а к конечной части - пано.коксин. Результаты опытов представлены в табл.7.

В0,005 17512,287

17502,286

В0,0015 17652.273

Результаты опытов показывают, что-ших лаурилсульфатный;комплекс AV 290, обе формы AV 290 при всех испытывае-выражено сильнее, чем усравнимых дозировках улучшают скоростьмой дозы синтанового комплекса привеса и уменьшают количество кор-AV 290 как в отношении увеличения ма, необходимое на единицу привеса. живого веса, так и в отношении Однако действие на птиц, потребляв-эффективности корма.

Продолжение табл. 7,