Способ иммобилизации @ -лизиндекарбоксилазы Советский патент 1983 года по МПК C12N9/88 C12N11/14 

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способам иммобилизации фермента L-лизиндекарбок силазы, и предназначено для исполь зования в микробиологической промышленности и в производстве биохи мических реактивов. Известен способ иммобилизации L-лизиндекарбоксилазы путем нанесения на поверхиоать СО - селектив ных электродов раствора бычьего сывороточного альбумина, растворения в нем фермента и обработки смеси глутаральдегидом l . Однако такой.способ иммобилизации пригоден только для получения иммобилизованной Ь-лизиндекарбоксил зы, локализованной на поверхность COj - селективного электрода. Полученная этаким способом иммобилизованная L-лизиндекарбоксилаза не может быть использована в установках других типов (кроме тех, где исполь зуется СО - селективный электрод) это ограничивает область ее применения. Наиболее близким к предлагаемому . по технической сущности является способ иммобилизации L-лизиндекарбо силазы путем связывания фермента с водонерастворимым носителем, в качестве которого используют внутреннюю поверхчость стеклянной трубки, силанизированную винилтриэтоксисиланом (используется смесь вйнилтризтоксисилана, метанола и воды). Иммобилизацию осуществляют,нанося на силанизированную поверхность сте лянной трубки раствор фермента, содержащий бензоинизобутиловый эфир {растворенный в полипропиленгликоле и преполимер эмульсионного типа, состоящий из поливинилацетата, поливинилового спирта и гидроксиметил акриламида. Смесь освещают ультрафи летовым светом в атмосфере азота. Слой иммобилизованного фермента еще дважды покрывают смесью бензоинизоб тилового эфира и преполимера, каждый раз повторяя освешение ультрафиолетовым светом в атмосфере азота 2 . Недостатком известного способа является то, что он технологически сложен и трудоемок, требует большог ассортимента реактивов, в том числе такого труднодоступного как бензоинизобутилсвый- эфир. Целью изобретения является упрощение способа получения иммобилизованной L-лизйндекарбоксилазы. Указанная цель достигается способом иммобилизации L-лизиндекарбок силазы путём связывания фермента с водонерастворимым носителем, в каче ве носителя используют аминопропилсилохром, модифицированный монобром уксусной кислотой и N,N-дициклогек силкарбодиимидом, взятыми в эквивалентных количествах В. качестве водонерастворимого носителя использован модифицированный бромацетаьаддными группами силохром и фермент связывают с таким силохромом .при помощи реакции алкилирования нуклёофильных групп фермента. Предлагаемый способ является достаточно простым по технологии и, кроме того, позволяет получить иммобилизованную L-лизиндекарбоксилазу с довольно высокой удельной активностью (3000-3500.мк моль/мин-г). Полученный по предлагаемому способу уровень активности значительно превышает средний уровень активности иммобилизованных ферментов (по известному способу 300-500 мк моль/мин получения иммобилизованного фермента с максимально высокой активностью (фиг,1 и 2) целесообразно осуществлять процесс при рН 6,6-7,3 и весовом соотношении белок/носитель 45-55 мг/г. При остальных значениях этих пара1иетров процесс имги{обилизации менее эффективен с точки зрения достигаемого уровня активности. На фиг.1 изображена зависимость активности иммобилизованной L-лизиндекарбоксилазы от рН иммобилизации; на фиг.2 - зависимость активности иммобиЛИЗрванной L-лизиндекарбоксилазы от исходного весового соотношения фермент/носитель при рН иммобилизации 7,2, Пример 1. Способ иммобилиза- ции L-лизиндекарбоксилазы. Получение силохрома, модигЪици-. рованного бромацетамидными группами, 10 г аминопропилсилохрома СХ-2,5 суспендируют в 4-0 мл диоксана, содержащего 1,12 г монобромуксусной кислоты, и прибавляют раствор эквивалентного количества (1,16. г) N,N-дициклогексилкарбодиимида в 10 мл диоксана. Смесь перемешивают на качалке при комнатной температуре в течение 2 ч, после чего носитель прозывают путем декантации водой для удаления побочного продукта реакции - дициклогексилмочевины. . Связывание L-лизиндекарбоксилазы с носителем, К 10 г модифицированного силохрома прибавляют 100 мл р.аствора L-лизиндекарбоксилазы Escherichia в 0,05 .М фосфатном буфере рН 7,2 и перемешивают на качалке 10-15 ч. Иммобилизованный фермент фильтруют и промывают на фильтре 0,05 М фосфатным буфаром рН 5,7, содержащим 510 М пиридоксильфосфат, 10- М трилон Б и 0,01% меркаптоэтанол. Полученный препарат хранят в холодильнике (+4-б°С). Активность, иммобилизованного фермента 3400 мк моль/мин-г, выход в процессе иммобилизации 55%.

Использование предлагаемого способа получения иммобилизованной L-лизиндекарбоксилазы обеспечивает по сравнениюс известным способом следующие преимущества: предлагаемый способ технологически проще, поскольку не требует таких трудномасштабируемых операций как силанизация/стеклянной поверхности, многократное нанэсение смеси реактивов тонким слоем на стеклянную поверхность , исключает необходимость работать в атмосфере азота. Для реализации способа не требуется большого ассортимента реактивов, в том числе такого труднодоступного и дорогостощего реактива как бензоиниэобутиловый эфир. Предлагаемый носитель и реактивы для его активации дешевы и выпускаются отечественной промышленностью. Остальные реактивы, а именно L-лизиндекарбоксилаза, пиридоксальфосфат, трилон Б и меркаптоэтанол, используют при любом спосо- бе иммобилизации, так как они необходимы для Проявления и стабилизации ферментивной активности.

Иммобилизованная L-лизиндекарбоксилаза используется для определения концентрации L-лизина при микробиологическом его производстве, а также для анализа L-лизина в пищевом и

0 кормовом сырье и продуктах, в научно-исследовательских работах и других областях. Высокая активность иммобилизованного фермента позволяет достичь полного декарбоксилирования субстрата в течение нескольких

5 минут. Это существенно ускоряет и упрощает определение концентрации L-лизина, в частности позволяет исключить термостатирование, которое необходимо при использовании мало0активных иммобилизованных препаратов, работающих в кинетическом режиме .. .

СПОСОБ ИММОБИЛИЗАЦИИ L-ЛИЭИНДЕКАРБОКСНЛАЗЫ путем связывания фермента с водонерастворимым носителем/ отличающийся тем, что, с целью упрощения процесса, в качестве носителя используют аминопропилсилохром, модифицированный монобромуксусной кислотой и N,N -дициклогексилкарбодиимидом, взятыми в зквивалентных количествах. а Jo т90ea-j 70Wясл со ю JsP Фиг.1

Л,%

fOO 80504529Ю 20 30 0 , 50

Ферпент носитель, иг/г Фиг.2