Способ получения водорастворимых антигенов Советский патент 1984 года по МПК A61K39/00 

// (ppQHt Uif 1 Изобретение относится к медицине, а Точнее к иммунохимии и касается выделения растворимых антигенов, и может найти применение в медицине, например в онкологии, для дифференциальной диагностики пролиферативных заболеваний и оценки состояния клеточного иммунитета, в трансплатологии для определения уровня специфических антител при кризах отторжения, а также в биохимии и биологии для изучения физико-химических свойств и биологической активности антигенов клеточных мембран. Известен способ получения водорастворимых антигенов из ткани живот ных и человека путем ее гомогенизации, обработки ЗМ раствором хлористого калия с последующим центрифугированием и выделением целевого продукта С П. Однако известный способ не обеспе чивает высокого выхода целевого продукта (10-13%) поскольку после добав ления к клеткам ЗМ КС образуется вязкий гомогенат, который подвергают диализу, что приводит к потере антигенного материала. Цель изобретения - -повышение коли чественного выхода целевого продукта Указанная цель достигается тем, что при осуществлении способа получе ния водорастворимых антигенов из тка ни животных и человека путем ее гомо генизации, обработки хлористым калием с последующим центрифугированием и выделением целевого продукта, гомо генат перед добавлением хлористого калия подкисляют до значения рН от 5,0 до i},0. При мер 1. г свежей ткани, полученной в .результате биопсии или хирургической резекции, или взятой от трупа не позднее 2- ч после .смерти, гомогенизируют на ледяной бане в стеклянном гомогенизаторе Пот. тера в Q, растворе NaCI - . О,О М трис-HCI буфере рН 7.3. температура которого (вес: объем 1:9). В полученный гомогенат добавЛяют 0,1 М НС1 до достижения рН ,5. В подкисленный гомогенат при.постоянном перемешивании вносят по мере растворения сухой КС1 до конечной кон центрации ЗМ и оставляют при постоянном перемешивании на 16 ч при 4 С (в холодильнике). Гомогенат центрифугируют при 48 000 об/мин (центрифуга +6 Beckman povop 60 Ti) 90 мин, при k С, супернатант обессоливают на колонке с сефадексом G-10 (2,5-10 см/, концентрируют на мембранных фильтрах ИМ-2 (при . t с) и разбавляют на сефадексе G-200 (2,5-100 см). Элюцию осуществляют 0,о4 М трис-НС1 буфером рН 7,, содержащим 0,8 NaCI, Материал, содержащий водорастворимые трансплантационные антигены, выходит во внешнем объеме колонки (пробирки 13-16 на фиг. 1 сплошная линия) Количество полученных частично очищенных трансплантационных антигенов составляет 59,5% от исходной активности гомогената. П р и м е р 2. Все процедуры выполняют как в примере 1 за исключением того, что материал, взятый в качестве источника водорастворимых антигенов хранится от нескольких дней до нескольких месяцев при 20°С. Выход антигенного материала срставляет 59%. П р и м е р 3. Все процедуры выполняют как в примере 1 за исключением того,что рН гомогената доводят до значения ,7. Выход антигенного материала составляет 59,2%. П р И М е р А, Все про:,здуры выполнялись как в примере 1 за исключением того, что рН гомогената доводят до значения ,9. Выход антигенного материала составляет 58,9%. П р и м е р 5.. Все процедуры выполняют как в примере Г за исключением того, что рН гомогената доводят до значения 5,0. В этом случае дезокси- и рибонуклеопротеиды выходят в раствор, гомогенат становится вязким и выделение ведется по прототипу. Выход антигенного материала составляет 13,3% П.римерб, Все процедуры как примере 1 за исключением того, что рН гомогената доводят до значения 4,0. Выход антигенного материала составляет 45%. Пример. Все процедуры выполняют как в примере 1 за исключением того, что рН гомогената доводят до значения 3,5. Выход антигенного материала составляет 11%. П р и м е р 8. Все процедуры выполняют как в примере 1 за исключением того, что рН гомогената доводят до значения 2,0. Выход антигенного материала составляет 2%.

При м е р 9- Все процедуры выпо няют как в примере 1 за исключением того, что сначала к исходному гомогеиату добавляют сухой 1(С1 до конечной концентрации ЗМ, а затем в полученный вязкий гомогенат добавляют 0,1 М НС1 до исчезновения вязкости. Это достигается при значении рН 2,0 Выход антигенного материала составляет 1,

Предлагаемый способ получения водорастворимых антигенов пoзвoляet получать, в отличие от прототипа, довольно высокое количество растворимых антигенов (45-60) вне зависимости от того, использовались ли в качестве исходного материала живые клетки или ткани животных и человека, хранившиеся при -20 С.

Последнее очень важно, так как позволяет накапливать материал и длительно сохранять его при отсутствии возможности провести выделение антигенов непосредственно

после забора материала. Проведена сравнительная оценка распределения на сефадексе G-200 антигенного материала, полученного по предлагаемому способу и по прототипу. .

На чертеже представлены профили элюции препаратов растворимых трансплантационных антигенов на сефадёксе G-200.

Сплошная линия - профиль элюции антигенного материала, полученного по предлагаемому способу, пунктирная линия - разделение препарата, полученного по прототипу. На колонку

с сефадексом G-200 12,5100 см) уравновешенную 0,0 М трис-НС1 буфером, содержащим 0,8 NaCI, нанесены равные объемы проб препаратов (.11 мл I, полученных двумя разными методами, содержащие одинаковую концентрацию белка (10 мг/мл). Элюция провс5дится тем же буферным раствором при скорости 20 мл/ч. Антигенный материал, определяемый по методу ингибирования цитотоксического действия специфической антисыворотки содержится в 13-16 фракциях, т.е. в свободном объеме колонки. Из представленных на чертеже профилей элюции видно, что препарат, полученный по предлагаемому методу, присутствует в максимально недеградированной форме,- по сравнению с антигенным препаратом, полученным по прототипу. . Удельная активность препарата, полученного по предлагаемому способу в объединенных фракциях составляет 21 АЕ/мг по сравнению с удельной активностью препарата, полученного по прототипу и равной 110 АЕ/мг (ЛЕ - антигенная единица).

Таким образом, способ получения водорастворимых антигенов позволяет расширить сырьевую базу (возможность использования наряду с живыми клетками материал, хранившийся при -20 С увеличить количественный выход растворимого антигенного материала с 10-13 до 55-59, получить антигенный материал внедеградированной форме с большой удельной активностью уменьшить затрачиваемое по получению антигенов рабочее время на 1520% за счет ликвидации этапа диализа

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВОДОРАСТВОРИМЫХ АНТИГЕНОВ из ткани животных и человека путем ее гомогенизации, обработки хлористым калием с . последующим центрифугированием и выделением целевого продукта, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода целевого продукта, гомогенат перед добавлением хлористого калия подкисляют до значения рН от 5.0 до k,0.