Способ определения содержания свободных аминогрупп в пептидил-полимере при твердофазном синтезе пептидов Советский патент 1984 года по МПК C07C103/52 G01N21/78 

Изобретение относится к усовершенствованаому способу определения содержания свободных аминогрупп в пептидил-полимере при твердофазном синтезе пептидов и может найти при менение в синтезе биологически активных пептидов твердофазным методом. В настоящее время в синтезе пептидов широко используется тверд фазный метод, который заключается в последовательном наращивании, пептидной цепи, начиная с С-концев аминокислоты, ковалентно присоедин ной к нерастворимому полимерному , носителю to. Процесс твердофазного синтеза пептйлов включает последовательное чередование стадии деблокирования удаление - концевых защитных групп и-стадии конденсации - присоединен защищенной аминокислоты. . Наиболее важным условием для ус ного синтеза пепт{вдов твердофазньа4 тодом является количественное завершение всех реакций, так как очистка промежуточных продуктов невозможна. Степень завершенности химическшс. реакций определяется количеством свободных аминогрупп в пептидил-полимере. В идельаном случае к0; 1чество свободных амияогрупп в гфврГидил-полимере при дебл кировании должно равняться o6ine fy содержанию пептидных остатков в полийере а при конденсации должно снижаться до нуля. Однако из-за неполного прохожде ния реакций, а также из-за побочных реакций, протекающих в процессе синтеза, необходим контроль всех стадий твердофазного синтеза пептидов. 3toT контроль осуществляют путем определения содержания свободных аминогрупп в пептидялполимере после стадий деблокирования и конденсации. Большинство известных способов определет{я содержания свободных аниногрупй в пептидил-полимере осн вано на способности свободных аминогрупп стехиомет|«чески образовыв ать соли с кислотны агентами. Иавестея способ определения сво ных в iienT tfl№i-noj HMepe которйй В1К ввчает обработку всего пептвдил-яовимера нейтральным орга ническим раство| ггепем, кислотньм агентом, оргАНическим растворителе И раствором основания для высвобожде ния ионогенно связанного со свобод ными аминогруппами кислотного агента, количество которого определяют спектрофотометрически , В качестве кислотного агента используют п-толуолсульфокислоту C2J или кислотный ярко-оранжевый t33. К недостаткам этого способа следует отнести использование всей массы полимера или довольно большой навески полимера и большие затраты времени на проведение анализа. Обработка всей массы полимера создает опасность взаимодействия основных группировок пептидной цепи с аналитическим реагентом, что Мо жет привести к искажению результатов анализа. Кроме того, обработка всей массы полимера приводит к расходу больших количеств органических растворителей и аналитических реагентов. Наиболее близким к изобретению по технической сур1ности и достигаемому результату является способ определения содержания свободньи аминогрупп в пептидил-полимере при твердофазном синтезе пептидов, включакщий отбор пробы пепдидилполимера и последующую ее обработ- . ку органическими растворителями и пикриновой кислотой в качестве кислотного агента. Согласно STojiy способу пробу пептидил-полимера весом 50 мг помещают на взвешенный фильтр, промьшшот дихлорметаном, сушат до постоянного веса и определяют вес пробы. Затем пробу промывают дихлорметаном, обрабатывают раствором тризтиламина, дихлорметаном, дважды обрабатывают раствором пикриновой кислоты в дихлорметане и промывают дихлорметаном. Ионогенно связанную с аминогруппами пептидил-полимера пикриновую кислоту высвобождают обработкой раствором триэтиламина в дихлорметане. Количество соли тризтиламина с пикриновой кислотой определяют спектрофотометрически С. К недостаткам этого способа следует отнести большой расход пептидил-полимера и органических растворителей для проведения одного анализа и большой расход времени на проведение анализа 60-90 мин, что снижает производительность способа. Цель изобретения - снижение расхода пептидил-полимера и органических растворителей и сокращение продолжительности определения содержания свободных аминогрупп в пептидил полимере при твердофазном синтезе. Поставленная цель достигается тем, что согласно способу определения содержания свободных аминогрупп в пептидил-полимере отбирают пробы пептидил-полимера капилляром, с фильтрующей перегородкой и последовательной обработки пробы в капилляре органическими растворителями, раствором кислотного агента и раств ром основания под давлением 0,12,0 кг/см2. Осуществление предлагаемого спос ба позволяет снизить расход пептиди полимера до 4-8 мг и органического растворителя для проведения одного анализа до 7-70 мл (с 220 мл), сокр тить время проведения анализа до 25-40 мин С до 90 мин в известном способе). Сущность предлагаемого способа заключается в отборе пробы пептидил полимера из реакционной среды точно взвешенным капилляром с фильтрующей перегородкой, который после отбора пробы подключают к резервуару с рас ворителем и интенсивным потоком растворителя под давлением отмывают от реагентов синтеза. Затем ка пилляр с пробой сушат до постоянного веса, взвешивают, подсоединяют к распределительному устройству и поочередно под давлением пропускают непрерывно следующие реагенты: 1.Раствор триэтиламина в органи ческом растворителе. 2.Органический растворитель. 3.Раствор кислоты в органическо растворителе. 4.Органический растворитель. 5.Раствор триэтиламина в органи ческом растворителе. Раствор №5,который вытекает из капилляра, собирают отдельно для спектрофотомётрического определения содержания кислоты, ионогенно связанной со свободными аминогруппами пептидил-полимера. Количество кислоты, высвобожденной при обработке раствором триэтил амина, эквивалентно содержанию свободных аминогрупп в пробе, пептидилполимера. Пример 1. Контроль реакции деблокирования трет-бутилоксикарбон глицил-сефадекса. 1,0 г гранул трет-бутилоксикпр о-нил-глицил-сефадекса помещают в реакционньй сосуд, добавляют 5,0 мл 50%ного раствора трифторуксусной кислоты в дихлорметане. Через определенные промежутки времени с помощью взвешенного капилляра с фильтрующей перегородкой отбирают пробы полимера. Затем капилляр подсое диняют к трубке для подачи органических растворителей и аналитических реагентов и пропускают в течение 5 мин под давлением 1,0 кг/см дихлорметан и сушат до постоянного веса в вакууме и взвещивают. Затем обработку проб в капиллярах осуществляют под давлением 1,0 кг/ см согласно программе, приведенной в табл.1. т а б л и ц а 1 10%-ный триэтиламин в дихлорметане5Дихлорметан 5 0,5 н. пикриновая кислота 5 Дихлорметан 10 10%-ньй триэтиламин в дихлорметане1 О Итого: 35 Вытекающий из капилляров раствор №5, который содержит пикриновую р:ислоту, соб.ирают отдельна и разбавляют ацетоном до объема 200 мл. Концентрацию пикриновой кислоты определяют спектрофотометрически .при 362 нм по калибровочным кривым. Полученные результаты представлены в табл.2.

Таблица 2

Продолжение табл.3

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СОДЕРЖАНИЯ СВОБОДНЫХ АМИНОГРУПП В ПЕПТИДШЪ ПОЛИМЕРЕ ПРИ ТВЕРДОФАЗНОМ СИНТЕЗЕ ПЕПТИДОВ путем отбЪра пробы пептидилполимера и последукнцей последовательной- обработки ее раствором основания, органическим растворителем, раствором кислоты, органическим растворителем и раствором основания и последующим определением ионогенно связанной со свободными аминогруппами пептидил-полимера кислоты спектрофотометрическим способом, о т л и ч а root и и с я тем, что, с целью снижения расхода пептиднл-полимера и органических растворителей и сокращения продолжительности определения, отбор щ Проб осуществляют капилляром с фильтс рующей перегородкой и последующую обработку пробы ведут в капилляре под давлением 0,1-2,0 кг/см.

и м е р 2. Контроль реакции. деблокирования трет-бутйлоксикарбонил-глицил-еефадекса.

1,0 г трет-бутилоксикарбонил-; глицип-сефадекса подвергают деблокированию аналогично примеру 1. Пробы промывают 10 мин в капиллярах. ; дихлорметаном под давлением 0,1 кг/см и затем обрабатывают аналогично примеру 1 с тем отличием обработку проводят под давлением О,1 кг/см по программе, придеденной в табл.3.

Т а б л и ц. а 3

10%-ньй триэтиламин

Дихлорметан

0,5 н, пикринозая кислота

Дихлорметан 20

10%-HbD триэтиламин в дихлорметане20

1,8

И т о г о:70 6,8

Полученные результаты представлены в табл.4.

Таблица 4

Пример 3. Контроль реакции деблокирования трет-бутилоксикарбонил- глицил-сефадекса .

1,0 г трет-бутилоксикарбоНил-гли цил-сефадекса подвергают деблокированию аналогично примеру 1. Дальнейший контроль осуществляют аналогично примеру 1 с тем отличием, что промывку проб в капилляре осуществляют в течение 4 мин дихлорметаном

под давлением 2,0 кг/см, а дальнейшую обработку проводят под давлением. 2,0 кг/см2 по программе, приведенной, в табл.5.

91084271

ния свободных аминогрупп р пептидилполимере осзпцествляют аналогично прит меру 1. Полученные результаты представлены в табл. 8.

Таблица 8 Пример 6. Контроль реакции конденсации трет-бутилокси-карбонил фенилаланина с лейцилсефадексом. К 10 г лейцил-сефадекса с содер.жанием лейцина 0,60 ммоль на 1 г приливают свежеприготовленный раст-вор симметричного ангидрида третбу оксикарбонил-фенилаланина, приготовленный из 6,36 г (24 ммоль) защищенной аминокислоты и 2,5 г (12 ммол дициклогексилкарбодиимида. Ход реакции контролируют путем отбора проб пептидил-полимераи onpe деления в них содержания свободных аминогрупп аналогично примеру 1 .Полученные результаты представлены в табл Таблица

10 Таблица

Пример 7. Контроль реакции деблокирования трет-бутил-оксикарбонил-лейцил-сефадекса.

К 1 г трет-бутилоксикарбониллейцил-сефадекса прибавляют 5 мл 1 и раствора h-толуолсульфокислоты в уксусной кислоте и через определенные промежутки времени отбирают пробы пептидил-полимера,как описано в примере 1. Дальнейшзто обработку проб осуществляют аналогично примеру 1 с тем отличием, что обработку проб осуществляют под давлением 2,0 кг/см по программе, приведенной ниже..

Таблица 10

Раствор

Время подачи, мин 10%-ный триэтиламин в дихлорметане5 Этиловый спирт5 0,5 М раствор п-толуолсульфоната пиридиния в дихлорметане5 Этиловый пирт5 10%-ный триэтиламин в дихлорметане5 Итого:25 Вытекающий из капилляров раствор №5 собирают для каждой пробы отдельно (3-5 мл) и упаривают досуха на ротационном испарителе, остаток растворяют в воде, разбавляя в колбе до объема 10 мл. Концентрацию п-тотуолсульфокислоты определяют спектрофотометрически при 260 нм. Данные анализов приведены в табл. II..

Таблица 11

Отбор пробы пептидил-полимера с помощью капнлляра с фильтрующей перегородкой и проведение; последующей обработки пробы растворителями и аналитическими реагеитами под давлением 0,1-2,0 кг/см позволяет снизить расход пептиднп-полимера цля проведения одного определения до 4-8 мг, а расход органических растворителей с 220 мл до 7-70 МП.

Отсутствие периодического перемеошвания и последующей фильтрации позволяет сократить расход времени на одно определение с 90 мин до 30-40 мин.