Способ получения растворимого холерного @ -антигена для иммунизации продуцентов холерных агглютинирующих сывороток Советский патент 1986 года по МПК A61K39/02 

Изобретение относится к медицине, а именно,к получению диагностических препаратов, и может быть использовано в сывороточном производстве, в частности, для иммунизации кроликовпродуцентов холерной агглютинирующей 0-сыворотки. Известен способ получения растворимого холерного антигена путем экст рагирования и фракционирования. Од,нако этот способ трудоемок и позволяет получить 0-антиген с низкой специфичностью. Известен также способ получения растворимого холерного 0-антигена для иммунизации продуцентов холерных агглютинирующих сывороток, включающий вьфащивание холерньк вибрионов на питательном агаре, приготовление микробной взвеси, экстрагирование, .центрифугирование, диализ и лиофиль ую сушку. Однако этот способ также недостаточно производителен, а получаемый антиген имеет недостаточно высокую активность и специфичность. Целью изобретения, является повыш ние активности и специфичности 0-ан тигена. Указанная цель достигается тем, что вырав5ивают холерные вибрионы на питательном агаре, приготавливают взвесь, экстрагируют, центрифугирую диализуют и лиофильно высушивают. Отличительной особенностью является то, что микробную взвесь готовят в концентрации 1ПО мпрд.м.кл. в 1 МП дистиллированной воды, перед центрифугированием микробрую взвесь (Инактивируют формалином из расчета 0,75-0,85 мл на 100 мп и повторно экстрагируют в течение суток, затем сорбируют насадочную жидкость активированным углем в количестве 4,5 5,5 г на 100 мл, концентрируют раст воримый антиген вымораживанием, а после диализа проводят стерилизующую фильтрацию. Способ вьтолняется следующим образом. Холерные вибрионы, вьфащенные на агаре Мартена или Хоттингера, смывают дистиллированной водой. №1кробную взвесь доводят до концентрации 100 млрд. м.кл. в 1 мл дистиллирован ной воды, перед центрифугированием . инактивирутот формалином из расчета 0,75-0,85 мл на 100 мл взвеси и экст рагируют в течение суток. Формалин инактивирует вибрионы и денатурирует белки, которые удаляют центрифугированием. Оставишеся в надосадочной жидкости белки сорбируют активированным углем в количестве 4,5-5,5 г на 100 мл. Затем растворимый антиген концентрируют вымораживанием, диализуют против проточной воды, затем проводят стерилизующую фильтрацию . Пример. Культуру холерных вибрионов серотипов Инаба и Огава, выращенную в течение 3 ч на 1%-ной пептонной воде (рН 7f6), перес.евают в четверти с агаром Мартена или Хоттингера (рН 7,6) и инкубируют при 37°С в течение 18 ч. Культуру с.мывают дистиллированной водой (рН 7,2), концентрацию доводят до 100 млрд.м.кл. в .1 мл и помещают на 4 ч в термостат при 37°С, перемешивают каждые 30 мин. Добавляют на 100 мл взвеси, 0,8 мл формалина и выдерживают в бытовом холодильнике еще 20 ч. Затем взвесь центрифугируют при 8000G в течение 30 мин. В надосадочнун жидкость вносят активированный уголь - 5 г на 100 мл, постоянно перемешивая, вы(держивают при З7с в течение 1 ч, досле чего фильтруют через бумажные фильтры. Содержащийся в жидкости растворимый антиген концентрируют путем вымораживания воды. Сконцентрированньм растворимый 0-антиген Йеротипа Инаба и Огава соединяют в равных объемах и диализируют против проточной воды 3 сут. Затем раствор антигена фильтруют через стерилизирующие пластины и подвергают лиофильной сушке. Выход сухого вещества составляет 1 1,2 мг /мл. Полученное вещество является растворимым холерным антигеном, который содержит, %: белка 8,7, полисахаридов 38, НК 1,7, липидов 24,1. Преимуществом указанного способа . является то, что по разработанной технологии в любой лаборатории может быть приготовлено необходимое количество растворимого холерного 0- антигена и для получения растворимого антигена не требуется сложного дорогостоящего оборудования. Препарат высокоспецифичен, при постановке РП по Оухтерлони он образует одну линию преципитации с- холерным гаммаглобулином и нативными О- и ОН-холерными сыворотками, в то время как корпуск лярный холерный О-антиген, рекомендованный для производства технической документацией, и цельный раство римый холерный антиген, полученный по известному способу, образуют с холерным гамма-глобулином четыре линии, а с нативными холерными О- и ОН-сыворотками две - три линии. Растворимый и корпускулярный холерные антигены обладают неодинаковой антигенной активностью при одинаковых способах их введ)р,ния кроликами.. Растворимый холерный антиген высо коактивен при введении кроликам внут ривенно, в лимфоузлы и подушечки лапок; холерный корпускулярный 0-антиген пpoявляet антигенные свойства только при внутривенном введении. Сы воротки, полученные от кроликов, иммунизированных растворимым антигеном в подушечки лапок, в 2-2,5 раза активнее и специфичнее сывороток кроли ков, иммунизированных корпускулярным 0-антигеном (р 0,05). Сухой растворимый антиген, приготовл.енный по предложенному способу, может храниться длительное время (2 г - срок наблюдения), удобен в работе. Исследования биологических свойств показали, что препарат, полученный по предлагаемому способу, обладает большей антигенной активностью. При однократном введении кроликам на десятый День титры агглютининов достигали 1:3200, а при иммунизации кроликов известным препаратом титры агглютининов быпи в пределах 1:320. Титры вибриоцидных антител в крови кроликов, иммунизированных предложеннь1м препаратом, быпи также вьпае. Средняя иммунизирующая доза (ЕДс,. ) предлагаемого препарата была равна 0,14 мкг, а известного препарата 14,6 мкг, т.е. иммуногенность предлагаемого препарата превосходит в десятки раз. Следовательно, по данным иммунохимических и биологических исследоваНИИ растворимый специфический холерный антиген, полученный по предлагаемому способу, соответствует по специфичности полисахаридам, полученным Э.А. Яговкиным (1980), а по антигенным и иммуногенным свойствам превосходит их. Кроме того, способ получения предложенного препарата проще по технологии, менее трудоемок и более производителен,так как на технологический цикл затрачивается в 2,5 раза меньше времени по сравнению с известным способом.

СПОСОБ РАСТВОРИМОГО ХОЛЕРНОГО 0-АНТИГЕНА ДЛЯ ИММУНИЗАЦИИ ПРОДУЦЕНТОВ ХОЛЕРНЫХ АГГЛЮТИНИРУЮЩИХ СЫВОРОТОК, включающий выращивание холерных вибрионов на питательном агаре, приготовление микробной взвеси, экстрагирование, центрифугирование, диализ и лиофйльную сушку, отличающийся TBMj что, с целью повьшения активности и СП1ЕЦИФИЧНОСТИ 0-антигена, микробную взвесь готовят в концентрации 100 МЛРД. м.кл. в 1 мл дистиллированной воды, перед центрифугированием взвесь инактивируют формалином из расчета 0,75-0,85 мл на 100мн и повторно экстрагируют в течение суток, затем сорбируют насадочную (Л жидкость активированным углем в количестве 4,5-5,5 г на 100 мл, концентрируют растворимый антиген вьмораживанием, а после диализа проводят § стерилизующую фильтрацию. 00 СП