Способ получения @ 4- @ или @ прегненолона Советский патент 1984 года по МПК C12P35/00 

Изобретение относится к биохимии конкретно к усовершенствованному способу получения радиоактивно меченого. прегненолона из радиоактивно меченого холестерина, и может найтиi применение для ферментативного синтеза радиоактивно меченых стероид-- . ных гормонов, необходимых при создании медицинских радиодиагности.ческих наборов стероидного профиля, а также для исследовательских целей в химии, биологии и эндокринологии.

Ферментативная трансформация холестерина в прегненапон, { вляющийся предшественником всех кортикостероидных гормонов, осуществляется в

Митохондриях клеток коры нГадпочечни.ков млекопитающих многокомпонентной ферментной системой, включающей. NADPH-спеЦифичный флавопротеиД taдренодоксинредуктазу) , негемовый же- лезосеросодержащий белок (адренодок.син) и холестеринспецифичный цитохром Р-450 tlj .

Химический аналог этой реакции (две реакции гидроксилирования- молекулы холестерина при С-2О и С-22 и окислительное расщепление боковой .цепи 20,22-диоксихолестерина) также, как и микробиологическая трансформация холестерина в прегненолон, отсутствуют.

Химические способы получения С4- с прегненолона в литературе не описаны.

Известен способ получения 4- с илиРн прегненолона из 4- с или холестерина при помощи реконструированной холестерингидроксилирующей система, содержащей иммобилизованный на сефарозе белок - адре- нодоксин, сорбированные на адренодок синсефарозе препараты белков - адрендоксинредуктазы и холестеринспецифичного цитохрома Р-450 и NADPH-генерирующей систег ы, включающей NADPH, глюкозо-6-фосфат и глюкозо-б-фосфатдегидрогеназу. Радиактивный прегненолон получают пропусканием раствора субстрата через колонку с указанной ферментативной системой 2.

Недостатком данного способа является низкий выход радиоактивно меченого прегненолона, составляющий 1525%, что позволяет получить лишь микрограммовые количества прегненолона.

Цель изобретения - повышение выхода целевого- продукта.

Поставленная цель достигается тем чтб согласно способу получения 4- с или н прегненолона из .4- с или холестерина с помощьй реконструированной холестерингидроксилирующей системы, содержащей иммобилизованный на сефарозе адренодоксин, сорбированные,на адренодоксин-сефарозе трепараты адренодоксин|редуктазы и холестеринспецифичного цитохрома Р-450, и NADPHrгенерирующей системы, включающей NADPH, глюкозо-б-фосфат и глюкозо-б-фосфатдегидрогеназу, используют глюкозо-6фосфатдегидрогеназу, иммобилизованную на сефарозе.

Причем NADPH используют в концентрациях 0,25-10 -5-10 М.

При этом глюкозо-б-фосфат используют в концентрациях .

В результате способ обеспечивает повышение выхода целевого продук та до 80%.

На чертеже графически изображен : превращение холестерина в прегнанолон при пропускании через колонки.

Колонки, содержат реконструированную ковалентно-сорбционным способом холестерингидроксилирующую систему и ковалентно иммобилизованную глюкозо-б-фосфатдегидрогеназу растворов субстрата с различными концентрациями NADPH и глюкозо-6-фосфат. Кри|вая 1-5-10 -М NADPH и глюкозоб-фосфат; кривая 2 - М NADPH и глюкозо-6-фосфат; кривая 3 0,25-10 М NADPH и 10 М глюкоэо-бфосфат. Концентрации холестерина и добавляемого в среду т вина 20. во всех случаях составляют О,2510 М и 210 М соответственно.

Пример . Для ковалентно-сорбционной реконструкции холестерингидроксилирующей системы используют гомогенные белковые компоненты -этой системы - адренодоксинредуктазу, адренодоксин и цитохром Р-450,. выделенные из митохондрий коры надпочечников крупного рогатого ската з Ковалентную игЛмобилизадию адренодоксина осуществляют путем сочетания белка с CNBr-активированной сефарозой по общепринятой методике 4. Аналогичным образом проводят имг юбилизацию глюкозо-б-фосфатдегидр(2геназы,- Концентрации иммобилизованных адренодоксина и дегидрогеназы составляют 350-400 нмоль и 1,6-2 мг на 1 мл уплотненного геля, соответственно. Удельная активность иммобилизованной глюкозо-б-фосфатдегидрогеназы, определяемая из начальной скорости образования NADPH, составляет 14 международных единиц на 1 мг иммобилизованного фермента.

К 10 мл 0,05 М натрий-фосфатного буфера рН 7,2 (буфер А) добавляют 0,5 мл уплотненного геля адренодоксин-сефарозы, содержащего 200 нмоЛь иммобилизованного адренодоксина, К полученной суспензии при непрерывном перемешивании добавляют 2 мл эквимольной смеси (по 25 нмоль каждого белка) препаратов адренодоксинредуктазы и цитохрома Р-450, диализованных против буфера А, Смесь перемешивают в течение часа при комнатной температуре, после чего несорбированные на адренодоксин-сефарозе белки отделяют центрифугирование .при ЗООд X 10 мин. Для полного отде ления несорбированных белков гель дважды -промывают 10-ти мл порциями буфера А с последующим центрифугиро ванием -при ЗОООд X 10 мин. Степень сорбции адренодоксинредуктазы и цитохрома Р-450, определяемая по убыли содержания этих белков в водной фазе, составляет 90-95%. Осажденный гель с реконструирова ной ковалентно-сорбционным способом холестерингидроксилирующей системой суспендируют в 5 мл буфера А и до бавляют к полученной суспенизии пор цию ковалентно иммобилизованной глю козо-6-фосфатдегидрогеназы, содержа щую 5 единиц фермента. Приготовленной таким.образом смесью заполняют колонку с диаметром 1 см и уравновешивают 50 мл буфера А с твином 20 в концентрации 200 мкМ (,03% объем/ объем), Раствор холестерина готовят на 200 мл буфера А, содержащего 200 мкМ твин 20, конечная концентра ция стерина составляет 25 мкМ. К раствору субстрата добавляют н или 4- с холестерин из расчета, чтобы удельная радиоактивность суммарного стероида составляла не менее 200000 имп. нмоль . К раст вору субстрата добавляют далее NADPH и глюкозо-6-фосфат до необходимых ко нечных концентраций.Полученный раст вор пропускают при комнатной температуре через колонку с иммобилизованными белкаг/1и со скоростью 8 мл/ч Элюат собирают по фракциям 8 мл с помощью коллектора фракций. Для анализа превращения холестерина в прегн нолон во времени используют 1 мл порции каждой фракции. Стероиды из этих порций экстрагируют 4 мл этилшдетата, упаривеиот досуха, остаток растворяют в этилацетате и подвергают разделению тонкослойной хроматографией на пластинках с закрепленным слоем силикагеля в системе гексан .диэтиловый эфир - уксусная кислота (15:15:1). После проявления хроматограмм парами иода пятна, соответству ющие по хроматографической подвижнос ти прегненолону и холестерину, удаляют с пластин и определяют радиоактивность с помощью жидкостного сцинт ляционного счетчика. Степень трансформации холестерина в прегненолон , рассчитывают по формуле А «100% /А + В + В; где А - радиоактивность в пят не прегненолона; В - радиоактивность в пятне холестерина; В - радиоактивность всего силикагеля от старта пла тинки до фронта растворителя, за исключением пятен, соответствующих холестерину и прегненолону. Для каждого опыта используют количество |смеси сорбентов, соотвествующее 0,7мл уплотненного геля и содержащее 5 ед. глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы, 200 нмоль адренодоксина и по 22 нмоль цитохрома Р-450 и адренодоксинредуктазы.Образующийся прегненолон очищают с помощью тонкослойной хроматографии и идентифицируют на основании сравнения хроматографических подвижностей со стандартом прегненолона в различных системах растворителей.(Радиохимическая частота полученного продукта составляет не менее 95%. Из :чертежа видно, что во всех случаях степень трансформации выходила на .максимум,- составляющий 50-80%, через .2-6 ч проведения реакции. Общей закономерностью для кривых 1-3 является снижение уровня образования прегне:нолона после выхода активности колонок по трансформации холестерина на максимум. Сравнение кривых 1 и 2 показывает, что уменьшение концентрации NADPH в 5 раз приводит к уменв -ению степени трансформации в максимуме (60%), но менее резкому, чем для кривой 1 падению активности колонки. Из сравнения кривых 1-3 йидно, что уменьшение концентрации NADPH и глюкозо-6 фосфата в 20 и 10 раз соответственно сопровох дается некоторым снижением степенитрансформации в максимуме (50%), при аналогичном ходе инактивации, как и для кривой 2. В таблице приведены суммарные выходы прегненолона, рассчитанные из кривых 1-3. Из представленных в таблице данных следует, что использование ана- , литических вариантов колонок с им,мобилизованными холестерингидроксилирующей системой и глюкозо-6-фосфатдегидрогеназой позволяет получать в отличие от известного способа миллиграммовые количества радиоактивно меченного прегненолона (выход до 80%), При этом значительно сокращается расход дорогостоящих NADPH, глюкозо 6фосфата и глюкозо-б-фосфатдегидрогеназы. Введение в буфер для приготовления субстрата 200 1мкМ твина 20 сопровождается повышением растворимости холестерина более чем на по1РЯДОК, кроме того, этот детергент повышает активность холестерингидроксилазы в растворе 5. Использование иммобилизованной глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы сопровождается эффективной регенерацией кофактора в объеме колонки, в результате чего исключается возможность локального накопления окисленного кофактора как ингибитора реакции, в различных вариантах опытов, указанных в таблице, используют 5 ед, иммобилизованной . г.люкозо-6-фосфатдегидрогеназы. Ана- . логичные опыты с применением раство

1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИЛИ Н ПРЕГНЕНОЛОНА из 4- . н холестерина с помощью реконструированной холестерингидроксилирующей системы, содержащей иммобилизованный на сефарозе адренодоксин, сорбированные на адренодоксин-сефароэе препараты адренодоксинредуктаэы и .холестеринспецифичного цитохрома Р-450, и .ОРН-генерирующей системы, включающей NADPH, глюкозо-6-фосфат к глюкозо-6-фосфатдегидрогеназу, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода целевого продукта, используют глюкозр-6-фосфатдегидрогенаэу, иммобилизованную на сефарозе.§ 2.Способ по п. 1, о т л и ч ающ и и с я тем, что NADPH используют СЛ в концентрациях О, 25 10 -5 10 М. JJ,,,, 3.Способ по п. 1, о т л и ч а ю- СИ щ и и с я тем, что глюкозо-б- фосфат используют в концентрациях 10 -lOTd.S SW QD О -sl а: