Способ дифференциации грибов @ . @ и @ . @ от других дрожжеподобных грибов Советский патент 1984 года по МПК C12N1/16 

4::) Л

:о 1 Изобретение относится к ветерина рии, а именно к ветеринарной миколо гии, и может быть использовано при микологической диагностике кандидам козов. Известен ускоренный способ дифференциации грибов С. albicans и С. tropicalis при их культивировани в натинной сыворотке крови, в которой при определенных условиях эти грибы через 24-48 ч инкубации образуют псевдомицелий,, что можно испол зовать для дифференциации этих грибов от других дрожжеподобных органи мов l , Однако указанный способ не обеспечивает высокой точности при дифференциации этих грибов, что обусловле но значительной изменчивостью дрожжеподобных грибов и недостаточной изученностью их морфологических осо бенностей. Известен способ дифференциации грибов С. albicans и С. tropicalis от других дрожжеподобных грибов, вк.гпочающи выращивание культуры грибов в течение 20-24 ч в среде, содер жащей сыворотку крови и лактозу, определение морфологических особенностей культуры гриба, добавление индикатора и регистрацию рН по изменению цвета культуральной жидкоети 2. Однако известный способ является довольно громоздким и требует длительного времени (24-48 ч). Целью изобретения является повьще ние эффективности способа. Цель достигается тем, что согласно способу дифференциации грибов С.albicans и С. tropicalis от други дрожжеподобных грибов, включающему выращивание культуры грибов в течени 20-24 ч в среде, содержащей сыворот ку крови и лактозу, определение мор фологических особенностей культуры гриба, добавление индикатора и регис рацию изменения цвета культуральной жидкости, в качестве индикатора используют метиловый красный, а перед добавлением индикатора проводят пере сев и дополнительное культивирование в течение 4-6 ч в среде, содержащей сахарозу и резазурин, а в качестве показателя дифференциации используют изменение окраски культуральной жид. кости соответственно после добавления в нее индикатора и изменения цве 53 та среды дополнительного культивирования. Способ осуществляют следующим образом. В сыворотку крови добавляют антибиотики (стрептомицин и пенициллин по 200-300 ед. на 1 мл), стерилизуют фильтрацией через асбестовую пластинку (СФ) в фильтре Зейтца, подкисляют 1 н. раствором соляной кислоты до рН 6,1-6,3 и добавляют по 20 об. % стерильного 15%-ного раствора лактозы на дистиллированной воде. Проверяют рН среды, который должен быть равен 6,2-6,4. При необходимости среду подкисляют или подп1елачивают стерильным 1 н. раствором соляной кислоты или едкого натрия. Среду асептически разливают в стерильные аглютинационные пробирки, примерно по 2,5 мл, закрывают марле-ватнымт пробками и хранят в рефрижераторе при 2-4°С. Посев гриба производят 24-часовой культурой, вьфащенной на агаре Сабуро с таким расчетом, чтобы в 1 мл содержалось примерно 5-7 млн. клеток гриба (определение по оптическому стандарту). Пробирку с посевом культуры гриба помещают в штатив ШСА (штатив для скашивания агара) в наклонном положении под углом 10-15°, что создает оптимальные условия аэрации культуры. Через 20-24 ч инкубации при определяют морфологические особенности культуры гриба. При микроскопическом исследовании культуры гриба С. albicans обнаруживают длинные извитые, часто переплетающиеся нити псевдомицелия с овальными или округлыми бластоспорами, расположенными в местах сочленения сильно удлиненных клеток псевдомицелия. В культуре гриба С. tropicalis преобладают длинные прямые, ветвистые нити псевдомицелия с овальноудлиненными бластоспорами, расположенными в местах сочленения клеток псевдомицелия. В культуре других дрожжеподобных грибов преобладают овальные или овально удлиненные дрожжевидные клетки, иногда обнаруживаются короткие нити псевдомицелия, состоящие преимущественно из 3-6 клеток. Окончательную дифференциацию грибов С.albicans и С.tropicalis производят после определения дегидрогеназной активности культуры гриба и активной реакции (рН) культуральнон жидкости, С этой целью применяют сре ду, приготовленную на фосфатном буфере с рН 6,35-6,45, содержащую 20Z сахарозы, 1,5% агар-агара. После двухкратной стерилизации текучим паром рН среды равен 6,10-6,25. Раство резазурина готовят на дистиллированной воде: растворяют 1 таблетку (50 мг) индикатора в 25 мл стерильной воды и кипятят На водяной бане 20 мин. Концентрация индикатора 0,02 В стер тьную бактериологическую пробирку к 1 мл расплавленной и охла денной до 45-50°С агаризированной среды с сахарозой добавляют 0,2 мл раствора резазурина и 1 мл культурал ной жидкости, содержащей 20-24-часовую культуру гриба, выращенную в сыроротке крови с лактозой. Содержимое пробирки перемешивают, помещают в обычный штатив и инкубируют в термостате при в течение 4-6 ч. Одновременно определяют активную реакцию культуральной жидкости (рН) 20-24-часовой культуры гриба, вьфащенной в сыворотке с лактозой. К 1-1,5 мл культуральной жидкости добавляют 2-3 капли метилового красного, приготовленного по общепринятой методике. Видовую принадлежность грибов определяют по таблице. Как видно из таблицы, изменение цвета среды с резазурином из синефиолетового в малиновый или красный в течение 4-6 ч и желтая окраска культуральной жидкости после добавления метилового красного позволяет с высокой точностью дифференцировать грибы C.albicans и C.tropicalis от других дрожжеподобных грибов. Предлагаемый способ позволяет за короткое время (24-28 ч) дифференцировать с высокой точностью грибы С. albicans и C.tropicalis, которые являются наиболее частыми возбудителями кандидамикоза, поэтому дифференциация этих грибов от других дрожжеподобных грибов представляет существенный практический интерес для микологической диагностики этого заболевания и проведения своевременных лечебно-профилактических мероприятийл

СПОСОБ ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ ГРИБОВ C.ALBICANS И C.TROP1CALIS ОТ ДРУГИХ ДРОЖЖЕПОДОБНЫХ ГРИБОВ, включающий вьфащивание культуры грибов в течение 20-24 ч в среде, содержалцей сьшоротку крови и лактозу,определение морфологических особенностей, культуры гриба, добавление индикатора и регистрацию изменения цвета культуральной жидкости, отличающийся тем, что, с целью повышения эффективности способа, в качестве индикатора используют метиловый красньй, а перед добавлением индикатора проводят пересев и дополнительное культивирование в -течение 4-6 ч в среде, содержащей сахарозу и резазурин, а в качестве показателя дифференциации используют изменение окраски культуральной жидкости соот(Л ветственно после добавления в нее С индикатора и изменения цвета среды дополнительного культивирования.