Способ выделения РНК-зависимой ДНК-полимеразы Советский патент 1984 года по МПК C12N9/14 

X

:л

Изобретение относится к биологической химии и может быть использовано для выделения и очистки РНК-зависимой ДНК-полимеразы (ревертазы) из вируса птичьего миелобластоза.

Известны различные способы выделения фермента ревертазы, основанные на применении ионообменных смол и комбинации из различных методов очистки.

Известен способ выделения ревертазы из вируса Птичьего миелобластоза, основанный на ионообменной хроматографии в градиенте концентрации глицерина С13.

Однако длительность многостадийной процедуры выделения для получения препарата высокой степени очистки приводит к потерям фермента в результате его инактивации; полученный фермент на конечной стадии имеет низкую удельную активность в результате разбавления и поэтому требуется дополнительно вводить процедуру концентрирования фермента, что также приводит к снижению общего количества ферментного препарата, наличие нуклеазных примесей не позволяет использовать весь пик ферментативной активности, поэтому приходится отбирать только зону фермента свободную от нуклеазных загрязнений что приводит куменьшению выхода фермента.

Известен способ выделения данного фермента из вируса птичьего миелобластоза путем обработки вирусной суспензии лизирующей смесью с последующим центрифугированием и хроматографией раствора в К-фосфатном буфере (рн 8,0) на ионообменной смоле ДЕАЕ-52, фосфоцеллюлозе Р-П с последующей очисткой аффинной хроматографией на гепарин-сефарозе в условидх трис-HCI буфера(рН 7,5)и хроматографией на поли-С-сефарозе, поли-У-сефарозе и в градиенте концентрации глицерина L27.

Известный способ рассчитан на выделение фермента лишь в аналитических количествах и для получения коммерческого препарата непригоден в связи с большими потерями в процессе выделения фермента и большой трудоемкостью способа. Резкое падегние общей ферментативной активности при переходе от стадии очистки на фосфоцеллюлозе Р-11 к гепарин-сефарозе и при длительном хранении препарата обусловлено использованием на стадии очистки фермента на гепарин-сефарозе 4в буферного раствора на основе трис-нС1 (рН 7,5), в то время как фермент находится в калийфосфатном буфере (рН 8,0).

Целью изобретения является повышение активности выделяемого фермента и его стабильности.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу выделения РНК-зависимой ДНК-полимеразы (ревертазы) из вируса птичьего миелобластоза путем обработки вирусной сус пензии лизирующей смесью с последующим центрифугированием и хроматографией раствора на фосфоцеллюлозе Р-П и аффинной хроматографией на гепарин сефарозе, после хроматографии на

10 фосфоцеллюлозе осуществляют диализ с предварительной обработкой диализного мешка бычьим сывороточным альбумином в концентрации 1-2 мг/мл. в течение 5-10 мин, а весь процесс

5 выделения ведут в условиях калийФосфатного буфера при рН 7,8-8,0.

Для получения фермента достаточно использовать ионообменную хроматографию на гепарин-сефарозе 4В и

0 ионообменную хроматографию на

фосфоцеллюлозе, выделение фермента проводится на всех стадиях в калийфосфатном буфере при рН 8,0-7,8. Все это приводит к уве5 личению активности фермента, значительному повышению выхода реверта|зы на конечной стадии очистки и стабильности ферментного препарата при сроке хранения . мес .

Проведение диализа между ионообменуой хроматографией на фосфоцеллюлозе Р-П и аф.финной хроматографией на гепарин-сефарозе 4В, перед которым осуществляют обработку диа5 лизного мешка раствором бычьего сывороточного альбумина в концентрации 1-2 мг/мл в течение 10 мин,приводит к тому, что молекулы бычьего сывороточного альбумина связывают0 ся с поверхностью диализной мембраны и создают биологически аинертную поверхность, которая при взаимодействии с ферментом не влечет за собой его инактивацию.

5 Результаты 10 экспериментов по выделению ревертазы предлагаемым способом показали, что для получения препарата фермента, пригодного в работах по генной инженерии, достаточно двух стадий очистки: фосфоцеллюлоза Р-П и гепарин-сефароза 4В. Полученный препарат обладает достаточной концентрацией, пригодной для проведения реакции обратной транскрипции, нуклеазная активность

5 отсутствует. При электрофорезе в 10%-ном полиакриламинном геле в денатурирующих условиях фермент представлен двумя субъединицами без посторонних примесей.

П р им ер 1. Проводят выделение и очистку ревертазы из вируса птичьего миелобластоза, количество вируса 160,5 мг. Вирус в объеме

5 14 мл разрушают добавлением лизиру

СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ РНК-ЗАВИСИМОЙ ДНК-ПОЛИМЕРАЗЫ ИЗ вируса птичьего миелобластоза путем обработки вирусной суспензии лизирующей смесью с последующим центрифугированием и хроматографией раствора на фосфоделлюлозе Р-П и аффинной хроматографией на гепарин-сефарозе, отличающийся тем, что, с целью повышения активности вьщеляемого фермента и его стабильности, после хроматографии на фрсфоцеллюлозе осуществляют диализ с предварительной обработкой диализного мешка бычьим сывороточным альбумином в концентрации 1-2 мг/мл в течение 5-10 мин, а весь процесс выделения ведут в условиях калийфосфатного (Л буфера при рН 7,8-8,0.