Способ определения Т-лимфоцитов у детей Советский патент 1992 года по МПК A61M1/36 G01N33/53 

Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологии.

Известен способ определения Т-лимфоцитов, заключающийся в том, что путем выделения лимфоцитов из периферической крови и облучения их монохроматическим лазерным излучением в течение 2 мин повышается точность способа розеткообразования. Однако для осуществления способа необходим источник лазерного излучения, относящийся к дорогостоящим приборам. Точность способа повышается у здоровых доноров, у больных же детей стимулирующий эффект не достигается. Индекс стимуляции Т-лимфоцитов при этом достигает 36,7 ± 6,6%. Это свидетельствует-о том, что лазерное излучение не обладает однозначной стимулирующей активностью у здоровых и больных лиц.

Цель изобретения - повышение чувствительности способа.

Способ осуществляют следующим образом.

Из венозной гепаринизированной крови донора центрифугированием в градиенте плотности фиколл-верографии (d -1077) выделяют лимфовидные клетки. Отмывают их двукратно от сывороточных белков средой 199, количество лимфоцитов доводят до концентрации 2-2,5 х 10б клеток, жизнеспособность их определяют 0,1% раствором трипанового синего. К 0,2 мл взвеси лимфоцитов в среде 199 добавляют 0,2 мл 2% взвеси эритроцитов барана. Полученную смесь инкубируют при 37°С 10 мин, затем центрифугируют при 1000 об/мин 5 мин ив последующем выдерживают в холодильнике при 4°С 18-20 ч. Затем подсчитывают количество лимфоцитов, присоединивших эритроциты барана от 3 до 6 /Т 1 / от 7 до 11 /Т 2/ и от 11 и более /Т 3/. В другую пробирку с 0,2 мл взвеси лимфоцитов добавляют раствор теофиллина 5 мг/мл,

Ё

VI VI VI

00 Ч)

N

инкубируют в термостате в течение часа, отмывают затем средой 199. В последующем добавляют 0.2 мл 2% взвеси эритроцитов барана и повторяют операции как в случав с 1-й пробиркой, подсчитывают количество Етр-РОК. Эти исследования принимают за контроль. Параллельно в 2 другие пробирки добавляют 0,2 мл суспензии лимфоцитов в концентрации 2-2,5 мл х 108 клеток и подвергают воздействию постоянного магнитного поля ( ПМП) 33 ±5 мТл в течение 20 мин. В одну из пробирок добавляют раствор теофиллина 5 мг/мл, инкубируют при 37°С - 1 ч, отмывают лимфоциты средой 199. Затем в обе пробирки добавляют по 0,2 мл 2 % взвеси эритроцитов барана. Полученные взвеси инкубируют при 37°С 10 мин, центрифугируют при 1000 об/мин 5 мин и выдерживают в холодильнике при 4°С 18-20 ч Затем производят подсчет Е-РОК на 100 клеток и Етр-РОК на 100 клеток. Данное исследование принимают за опыт, и по количеству розеткообразующих клеток .определяют количество Т-лимфоцитов,

Учет результатов производят по сравнению опытного и контрольного исследования.

П р и м е р 1, Ребенок К., 1 год 10 мес., поступил с жалобами на повышение температуры до 38°С: заложенность носа, на сильный кашель жалобы. Болен второй день. Объективно: отмечено состояние средней тяжести, наличие катарального синдрома носоглотки. Со стороны других органов и систем патологии не выявлено. Анамнез отягощен токсикозом беременности у матери, перенесенными 4 раза острыми респираторными заболеваниями, бронхитом. Выделили лимфоидные клетки, из гепаринизированной венозной крови в градиенте плотности 1,077 фиколл-верогра- фина. Получили лимфоидные клетки - 2-2,5 млн. мл в-1 мл среды 199. Разлили полученную суспензию по 0,2 мл в 4 пробирки № 1, 2, 3, 4. В третью и четвертую пробирки добавили раствор теофиллина до концентрации 5 мг/мл и инкубировали в течение 1-го ч при 37°С. Затем отмывали лимфоциты от теофиллина средой.199. К суспензии 1-й и

3-й пробирки (контроль без ПМ Г) добавляли 0,2 мл 2% взвеси эритроцитов барана. Суспензию 2-й и 4-й пробирок (опыт) подвергали воздействию ПМП с напряженностью

поли на поверхности 33 ± 5мТл, время 20 мин, затем к лимфоцитам добавляли 0,2 мл 2% взвеси эритроцитов барана. В последующем 4 пробирки со смесью клеток инкубировали при 37°С в течение 10 мин,

центрифугировали при 1000 об/мин 5 мин и инкубировали при 4dC в течение 18 ч . В контрольной пробирке содержание Ti-13%, Т2-7%, Тз-4%.Т0бщ. - 24 % Ti - количество прикрепившихся эритроцитов от 3 до 6, Т2 от 6до 10,Тз -свыше 10морула . Етр-РОК (теофиллинрезистентных лимфоцитов) в контроле - 12%. В опытных пробирках: Tt- 24%, Т2-4%, Тз-10%. Тобщ -48%. Етр-РОК- 24%. Индекс сдвига Е-РОК (Т-лимфоцитов)

100%. Следовательно количество как популяции Т-лимфоцитов, так и субпопуляции Етр-РОК; что свидетельствует о повышении чувствительности способа розеткообразо- вания благодаря воздействия ПМП насостояние мембраны лимфоцитов, их рецепторного аппарата. Увеличивается в 2 раза с лишним содержание Т-высокоаффин- ных клеток -Тз.

По сравнению с прототипом увеличивается чувствительность способа в отношении выявления Т-лимфоцитов их авидности по прототипу, %: Ti - 26,4 ± 2,1; Т2 - 5,8 ± 1.04;Тз-9,2 ± 1,8; Е-РОК, 38,2 ± 3,2, при воздействии ПМП Ti - 24,9 ± 1,7; Та-9,3

1,3: Тз-21.3 ± 2.9. Е-РОК-55.9 ± 3,12.

Формула изобретения Способ определения Т-лимфоцитов у детей путем забора крови, выделения лимфоцитов, инкубации их с эритроцитами барана, подсчета розеткообразующих клеток, и по их количеству определяют содержание Т-лимфоцитов, отличающийся тем, что, с целью повышения чувствительности

способа перед инкубацией с эритроцитами лимфоциты подвергают воздействию постоянным магнитным полем напряженностью 33 ± 5 мТл в течение 20 мин.

Изобретение относится к медицине, а именно к клинической и экспериментальной иммунологии. Целью изобретения является повышение чувствительности способа определения Т-лимфоцитов у детей. Для реакции розеткообразования используют выделенные на градиенте плотности фиколл-верог- рафин лимфоциты ребенка, на которые воздействуют постоянным магнитным полем напряженностью 33- ± 5 мТл с последующей постановкой реакции розеткообразования. По сравнению с прототипом увеличивается чувствительность способа для Е-РОК в 1,3 раза, для Етр-РОК- хелперов в 2 раза.