Способ получения иммобилизованной глюкозоизомеразы Советский патент 1991 года по МПК C12N11/00 

Изобретение относится к микробиологической промышленности, а именно к способам получения иммобилизованных ферментов, и может быть использовано в пищевой промышленности для получения глюкозофруктозных сиропов из крахмзлсо- держащего сырья.

Известен способ получения иммобилизованной глюкозоизомеразы путем сшивания биомассы продуцента глюкозоизомеразы, предварительно обработанной поверхностно-активными веществами, глутаровым альдегидом 1.

Однако из-за недоступности внутриклеточного фермента для субстрата активность иммобилизованной глюкозоизомеразы невысока и составляет 245-278 ЕД/r препарата.

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому результату к предлагаемому является способ получения иммобилизованной глюкозоиэомеразы путем культивирования микроорганизмов Streptomyces rubiginosus с внутриклеточной глюкозоизомеразой, выделения внутриклеточного фермента, ультрафильтрации, кристаллизации, повторного растворения фермента и иммобилизации его на предварительно гидратированном носителе, содержащем ДЭАЭ-целлюлозу, полистирол и оксид титана. Активность получаемого иммобилизованного препарата составляет в среднем 850 ЕД/г 2.-

Недостатками известного способа являются недостаточно высокая активность препарата и многостадийность процесса.

О

ю со

о ел о

Цель изобретения - повышение активности препарата иммобилизованной глюко- зоизомеразы и упрощение процесса.

При предлагаемом способе культивируют микроорганизмы Streptomyces rublginosus внутриклеточной глюкозоизо- меразой, выделяют внутриклеточный фермент, проводят ультрафильтрацию и затем осуществляют иммобилизацию глюкозоизомеразы на фенолформальде- гидном носителе с пористостью 1,1-1,2 см /г с алифатическими аминогруппами в количестве 4,6-8,3 мг-экв/г, причем в процессе иммобилизации вместе с глюкозоизо- меразой к носителю может быть добавлен сернокислый магний.

Способ позволяет повысить активность иммобилизованной глюкозоизомеразы в 1,5-2 раза, а при иммобилизации в присутствии сернокислого магния активность дополнительно возрастает на 18-20%. Кроме того, исключаются стадии кристаллизации, повторного растворения фермента, а также предварительная гидратация носителя, что упрощает процесс.

Пример 1. Культивирование продуцента глюкозоизомеразы Streptomyces rubiginosus ATCC 21175 проводят в ферментере емкостью 10 л при коффициенте заполнения 0,5. Для ферментера готовят 5 л питательной среды, для чего в ферментер заливают 4 л воды, загружают 0,15 кг глюкозы, 0,08 кг кукурузного экстракта, 0,004 кг аммония фосфорнокислого двузамещенно- го, 0,003 кг марганца сернокислого, 0,001 кг пеногасителя, объем доводят до 5 л водой. Смесь перемешивают до полного растворения компонентов и стерилизуют при 125°С в течение 40 мин, после стерилизации доводят рН до 6,3 аммиаком. Вносят посевной материал в количестве 0,5 л и начинают культивирование продуцента при 30°С и расходе воздуха 0,65 м на 1 м3 среды в 1 мин. Через 20 ч, когда содержание глюкозы в среде достигнет уровня 10 г/л, проводят подпитку 0,5 л 60%-ного стерильного раствора глюкозы. К концу ферментации через 80 ч после инокуляции величина активности внутриклеточного фермента достигает 50 ЕД/мл. Культуральную жидкость в количестве 5 л центрифугируют при охлаждении, при этом получают 3,0 кг биомассы с влажностью 90 %. К биомассе прибавляют 3.0 л М раствора сернокислого магния, охлаждают смесь в ледяной бане. Разрушение биомассы ультразвуком осуществляют в течение 1,5-2 мин (частота ультразвука 22 кГц). Активность глюкозоизомеразы после разрушения клеток и выхода фермента в раствор составляет 380 ЕД/мл суспензии. Разрушенную биомассу центрифугируют при охлаждении. Внутриклеточная глюкозоизоме- раза, освобожденная из клеток, остается в надосадочной жидкости, количество кото- рой составляет 4,5 л, активность глюкозоизомеразы в растворе 85 ЕД/мл. После ультрафильтрации активность глюкозоизомеразы в ультраконцентрате составляет 800 ЕД/мл, общее количество ультраконцентрата 0.4 л. К 0,4 л ультраконцентрата добавляют 0,15 кг фенолформальдегидного носителя пористостью (1,2 см3/г с алифатическими аминогруппами, количество аминогрупп 4,6 мг-экв/г). Иммобилизацию

глюкозоизомеразы на носителе продолжают в течение 20 ч при 4-6°С при соотношении фермента и носителя 2100 ЕД на 1 г.

Активность полученного имобилизован- ного препарата составляет 1600 ЕД/г.

П р и м е р 2. Процесс осуществляют по примеру 1 с той разницей, что используют штамм СЗ, а при иммобилизации к раствору фермента предварительно добавляют сернокислый магний в количестве 5-10 М, при

этом активность составляет 1650 ЕД/г препарата. Пористость носителя 1,1 см /г, количество аминогрупп 6,8 мг-экв/г, а соотношение фермент: носитель 2160 ЕД на 1 г носителя.

П р и м е р 3. Способ осуществляют, как описано в примере 2, добавляя сернокислый магний в количестве, 1,0 М. Пористость носителя 1,3 см°/г. количество аминогрупп 8,3 мг-экв/г, а соотношение

фермент: носитель 2200 ЕД на 1 г носителя. Активность целевого продукта 1900 ЕД/г.

Использование концентрации сернокислого магния меньше чем М не дает эффекта, а увеличение концентрации выше

10 М не приводит к дальнейшему увеличению активности иммобилизованного препарата.

В таблице 1 показано, как влияют пористость носителя и количество аминогрупп в

нем на активность целевого продукта. Из этих данных следует, что при предложенном способе могут быть использованы носители с пористостью 1,1-1,3 см /г при содержании аминогруппы 4,6-8,3 мг-экв/г носителя. Соотношение фермент: носитель может варьировать от 2100 до 2200 Ед на 1 г носителя.

Таким образом, использование предложенного способа позволяет увеличить ак- 5 тивность целевого продукта в 1,5-2 раза (от 670-900 до 1600-1900 ЕД/г), а также упростить процесс за счет исключения ряда стадий. Введение ионов магния в процессе иммобилизации приводит к дополнительному увеличению активности на 18-20%.

Формула изобретения 1. Способ получения иммобилизованной глюкозоизомеразы, включающий культивирование продуцента Streptomyces rubiginosus, отделение клеток, их разрушение, выделение глюкозоизомеразы,ультрафильтрацию и ее иммобилизацию на нерастворимом носителе, отличающий- с я тем, что, с целью повышения активности препарата иммобилизованной глюкозоизо

меразы и упрощения процесса, в качестве носителя используют фенолформальдегид- ный носитель с пористостью 1,1-1,2 см /г, содержащий алифатические аминогруппы в количестве 4,6-8,3 мг-экв/г.

2. Способ по п. 1,отличающийся тем, что при иммобилизации к ультраконцентрату глюкозоизомеразы добавляют сернокислый магний в количестве 5-10 - М.

Изобретение относится к микробиологической промышленности, а именно к способу получения иммобилизованных ферментов, и может быть использовано в пищевой промышленности для получения глюкозно-фруктозного сиропа. Цель изобретения - повышение активности препарата иммобилизованной глюкозоизомеразы и упрощение процесса. Способ заключается в иммобилизации внутриклеточной глюкозоизомеразы, выделенной из Streptomyces rublginosus на фенолформальдегидном носителе с пористостью 1,1-1,2 см3/г с алифатическими аминогруппами в количестве 4,6-8,3 мг-экв/r при соотношении фермент: носитель 2100-2200 ЕД на 1 г носителя, причем для дополнительного повышения активности при иммобилизации вводят сернокислый магний в концентрации 5ИО - 10 М. Способ позволяет увеличить активность целевого продукта в 1,5-2 раза, а также упростить процесс. 1 з.п. ф-лы, 1 табл. ё