Способ выделения МВ-изоэнзима креатинкиназы из смеси ее изоэнзимов Советский патент 1985 года по МПК C12N9/12 G01N33/48 

1 Изобретение касается способа выделения МВ изоэнзима кресятиккпназы () из смесн СК изоэнзимов, Известны трл изоэпзима креатникиназы, обозначаемые услоп ю: ММ найденный первоначально в скелетко-мьиаечной ткани, БВ - найденный перв начально ш мозговой ткани и МБ найденный первоначально в сердечной ткани. Наличие повыи ен1гьгх; уровней МБ- изоэнзима в сыворотке яв,пяется показателем инфаркта NMOKapAa. Известен хроматограф гческий способ разделения ММ, ВВ- и Ш-изоэнзкмов креатннкиназы путем коитш ткрования смеси указанных нзоэнзимов (гомогенат ткани человека) с основной анионообменной смолой, представляющей co6oii макропористьБ-i синтетический полимер (марка AGMP-1 выпускается фирмой Био-Рзд Лабораториз, США), с использованием в качестве элюептов трис-И,С1 буфера с рН 8,2 и 6,9 1. Известен тшоке способ вг и7 еленпя Ш-изоэнзима креатинкииазы 1з смесн ее изоэнзимов путем контактиропа1и я указанной смеси с ионообменными сор бентом - диэтплам1 1озт1и;-за(:Г1генньп СЦП1ТЫМ дёкстраном (ДЭЛЭ-се адекс А-50) - при рН 7,5 с последующим элюированием градиентом NaCl от О до 0,5 М в 0,5 М трис-Н.С1 буфере рН 7,5 С23, В этих хроматограф11ческ х меГода первым элпируем1)П1 нзоэизимом являет ся обычно преобладающий И-нзоэнзим Таким образом, известньй способ тре бует допол}П тельного времени и дополнитель ой стадии ддя выделения . МВ-изоэнзима креатинкипазы, Цель изобретения - упрощение про цесса, что достигается за счет элюи рования МБ-изоэнзима в виде первой фракщ«1 из слоя ионообменной смолы, ускоряя II упрощая анализ и делая анализ СК-МВ более легко приспоЬабл ваем1лм для автоматизации. Указанная цель достигается спосо бом выделения МВ-изоэизима креатикк назы из смеси ее изозизимов, предусматривающим контактирование указан ной смеси с ионообменным сорбентом с последуюощм элюированием, согласно кoтopo ry, в качестве сорбента используют смесь слабоосповного аии нообменной смолы - диэт шакмноэтялзамещенного сшитого декстрана и 31I слабо)ислСП KaiHOifvf;MiMiHCM с- .:ь, up еде тапл яюнгей с обог к арОок с;;-;. Cj дер жанргТй гсл мер на OCHOBR мр П-.-чой КИСЛРМ:) и Д :П ИНИЛбегЗО.ГТа S с :i :,06,4 н при соотношении смолы И() а эл -ои15овангге осупи С1 вляюг в H.ioкратной среде, В качестве сорбента спользу-;.: : смесь указанных смол при соотиоиеНИИ аиионообменпой смольт к катионообменнои 1:6, Вьгбор criecH смол и paanj/r-irJbie параметры элгоирования, такие как рН размер слоя смолва и образца, скорость элгонрова пия и т.д., являются взаимозавкси1--ш1адг. В послед- пощем будут описан -. сггец.ифическне смолы и условтш. Поскольку определен выбор смеси смол ;7,пя слогц то ii отп-пзльный параметры элгоироваиия могут быть легко определены. Предпочтительной С - еп аииой смолой слоя является смесь ДЕМ -тамйщенпой СТШ-5ТОЙ декстранс)Бой аниогюобмеи с й смолы с 1сатионообме Г|ЮЙ смолой, v которой решетка акрилового полимера 3амещепа кислоТ| о 1 фуьл-сцгюиальной группой. Это а5-:ионообь;ениая смола ,ЦЕМ Са(.1)едекс Л-25 п катионообмеипая смола Бно-Рекс 70. При iipHTvifineHi-sH смесь яонообт сипых сноп: обычно погр 71сается и буфер рИ ,оля смол ,4. При ншкнеь5 пределе рН и ВВ-изознзимн более легко задерлапзаются смолой. При верхнем пределе рН более легко элюнруется МВ изоэнзим, но также происходит некоторое э.нопроваггие БВ-пзоэнзима. Под изократпой средой подразумевается, что ионная сила элюеита вода ялк раа - ичпьк буй;ер};ых растворов пе н:змепяется з процессе храчатограгри. Вид ионообмешюго сорбента, определенный выше и подготовлепньй к аяанизу с помощью бух1)ера5 обеспечивает изократкута среду элгаирования, удельная проводимость и значентте рН cticTet-gji опредапяют условия сорбции и элш)дан, Способ осядествляется следующим образом, ДЕ.АЕ-Сафедекс А-25 гидрат-фуется в )ере, предпочтительно в морфалинэтилсу/Пзфокислоте, доведенной до рН 6,0, в течение 48 ч, В конце этого периода рИ снова доводят до 6jO с помощью НС , F.Ho-.teKC 70 (100200 меш) (0,149-0.074 мм размер отверстия по ASTM) гндратнруется в том же буфере, доведенном до рН 6,0 в течение того же периода времени, после чего рИ повторно доводят до 6,0 едким натрием. Тонкие частицы удаляют из обеих смол, один объе слоя Сефадекса добавляют к шести объемам слоя Био-Рекс при спокойном перемешивании, которое продолжают 15 миHj рН доводится до 6,0. Слой смолы промывают тремя объемам буфера (по сравнению с объемом слоя) доведенного до рН 6,0. Смолу оставля ют погруженной в буфере рН 6,0. В этих условиях элюентом, приненяемь м для элюирования СК-МБ из колонки, является деиониз -фованная вода. Эти условия являются предпочтительными для приспособления метода разделения к аналитической набивке, применяемой на автоматическом клиническом анализаторе (ЛКА), продаваемой фирмой ЕЙ Дюпон де Немур эид. KobfflaHii, При м ер 1. Колонки коллекторов анализатора АКА объемом 1,7 мл набивают смесью Био-Рекс 70 и Сефадекс А-25, приготовлеииой, как указано. Каждая набивка приспособлена для приема одного образца объемом 0,34 мл, впрыскиваемым па смолу колонки. Образцы элюируют 2,0 шг деионизированной воды в реакционной камере насадки со скоростью 1,0 мл/мин. Присутствие креатиикиназы в элюен те определяется по модификации УФэпзиматического анализа, описанного Оливером И.Т Сз1 и Розалки С.Б. Д Скорость образования КАДИ , который поглощает при 340 нм, пропорциональна концентрации креатинкиназы.

Таблица 1 31 Эффективность хроматографического разделения изоэнзиг ов может быть продемонстнрована следующим образом. Извлечение трех изознзимов креатинкииазы может быть определено путем измерения их индивидуальной активности до и после элюирования через колонку со слоем смешанной смолы. Источигасом изоэнзимов, применяемым для этих определений, является человеческая ткань. В табл. 1 представлено типичное извлечение изознзимов с применением колонки со слоем смешанной смолы, как указано. Пример 2, При применении той же смеси ионообменных смол и колонки такой же величины с образоваш ем 0,20 ьш и элюировашш колонки объемом 2,0 МП деионизированной воды со скоростью 0,5 мл/мин на сорбенте задерживаются почти ролностью CK-lIM и и СК-ВВ, тогда как злюируется только СКЧ-И-изоэнзим. Влияние рН смолы на работу колонки со слоем из смешанной смолы в этих условиях показано в Ta6ji, 2. В табл. 3 дана зависимость результатов э/поции от соотношения используемых смол. Как В1адио из табл. 3, наг болсе предпочтительным при выделении МВизоэнзима креатинкиназы является соoTHomeiine анионообменной смолы к катионообменной 1 г 6, Изобретение позволяет значительно упростить процесс выделения МВ-изоэнзима из смеси изознзимов за счет выделения МБ-изознзима первым из указанной смеси.

(ЗА 286 197 785

1

69

1

46

Изоэнэимы (в человеческой сывоКол онк а вес/о бъемI Коло н к л ротке)

107 297 124

84

241 13

283

95

Выделение

МВ-нзоэнзима i Ь:М--пнозпз - мэ (% загрузки I (% загрузки 90 МЕ/л)I 1000 МЕ/л)

:-L3 6 76

23

69

97 iOO