Способ обработки спермы сельскохозяйственных животных Советский патент 1985 года по МПК A61D7/02 

Изобретение относится к способу искусственного осеменения сельскохозяйственных животных, а именно к способам с)бработки и криогенного хранения спермы быков, и может быть использовано на станциях искусствен ного осеменения животных. Известны способы обработки спермы, включающие разбавление спермы защитными средами, ее охлаждение, эквилибрацию и последующее заморажи вание в парах жидкого азота. С целью сохранности биологической активности, сперму подвергают центрифугированию для удаления секретов добавочных половых желез 1 Недостатком известного способа является разрушение целостности мембраны спермиев, что приводит к снижению жизнеспособности спермиев Известно также, что разбавленную сперму подвергают вакуумированию с последующим насыщением углеки лым или инертным газами 2. Часто сперму обрабатывают постоянным магнитным полем з . Недостатком таких способов является повьшение стоимости спермы за счет использования дополнительного оборудования, рабочей силы ц электр энергии при относительно низком повьшении активности спермиев. Наиболее близким по технической сущности кпредложенному является спо соб, за ключ аюпщйся в разбавлении спер защитной средой из расчета получить 10 млн.активных спермиев в одной оттаянной сг ёрмодозе, охлажденииэквилибрации в холодильнике при температуре 5°С в теченне. ч и замораживании в парах жидкого азота до температуры - 196°С 4 . Существенным недостатком известного способа является значительное снижение биологической полноценнос спермы при ее замораживании, что вы ражается в гибели большого количес ва спермиев (30-70%), -в нарушении их мембранных структур, снижении показателей выживаемости и подвижности. Целью изобретения является стаби лизация биологической полноценности спермы в процессе замораживания. Поставленная цель достигается тем, что согласно способу обработки спермы сельскохозяйственных животны включающему разбавление цельной спе 98 , эквилибрацию и замораживание парах жидкого азота, перед разбавлением цельную сперму смешивают с метилаэросилом из расчета 3-30 мг метилаэросила на 1 млрд. спермиев. Способ обработки спермы сельскохозяйственных животных осуществляется следующим обра.зом. Свежеотобранную/ сперму оценивают согласно известному способу 4 и затем в зависимости от концентрации спермиев и общего количества полученной спермы в нее вводят метилаэросил из расчета 3-30 мг метилаэросила на 1 млрд.спермиев и перемешивают. Обработанную таким образом сперму разбавляют защитной средой, эквилибрируют при 5°С в течение 4-5 замораживают в парах жидкого азота до температуры -196°С. Было использовано 42 эякулята быков черно-пестрой и: симментальской пород, принадлежащих ЦСИО (г. Бровары). Взятие и оценку цельной спермы проводили по способу JJ4 . Каждый эякулят быка делили на две пробы, одну из которых обрабатьтали метилаэросилом, а другую обрабатывали по известному способу 4 . Пример 1. В пробы спермы вводили метилаэросил в следзгющих количествах: а)3 мг/млрд. спермнев 12 проб спермы б)15 мг/млрд.спермиев 10 проб спермы в)30 мг/млрд.спермиев 15 проб спермы Обработанную метилаэросилом пробу спермы разбавляли защитнойсредой из расчета 10 млн.активных спермиев в одной оттаянной спермодозеследующего состава: Лактоза, г11,5 Желток куриных яиц, мл20 Глицерин, мл5,0 Спермосан - 3 тыс. ед.50,0 Вода дистиллированная, мл100,0 Разбавленную сперму охлаждали в холодильнике до 5°С в течение 5 ч, а затем замораживали в виде гранул объемом 0,2 мл на фторопластовой пластине в парах азота. Замороженную сперму хранили в жидком азоте при . Одновременно параллельные пробы тех же эякулятов обрабатывали известным способом, т.е. без предварительного смешивания с метилаэросилом.

3

Биологическую полноценность спермы, обработанной известным и предлагаемым способами, оценивали по показателям подвижности и выживаемости спермиев согласно ГОСТУ 20909 4-75. Подвижность определяли в раздавленной капле спермы под микроскопом в проходящем свете при увеличении в 100-180 раз с использованием нагревательного столика-при 40-41°С. Оценку подвижности производили по десятибалльной шкале.

Выживаемость в часах определяли по количеству времени, прошедшего

6984

от размораживания спермы до ее гибели при хранении в термостате (t 38°С).

Для определения абсолютного показателя выживаемости (So.) проводили оценку ПОДВИЖН9СТИ оттаянной спермы, хранящейся при 38°С через каждьй час до ее гибели. Суммарная подвижнесть спермиев за время их жизни и является абсолютным показателем выживаемости.

Результаты проведенных исследований изложены в таблице 1.

Таблица 1

СПОСОБ ОБРАБОТКИ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ ЖИВОТНЫХ, включающий разбавление цельной спермы, эквилибрацию и замораживание в парах жидкого азота, о тличающи йс я тем, что, с цепью стабилизации биологической полноценности, цельную сперму перед разбавлением смешивают с метилаэросилом из расчета 3-30 мг метилаэросила на 1 млрд.спермиев. (О 4 О) СО 00

а) п 12

Пример 2. В пробы спермы вводили метилаэросил в количестве 5 мг/млрд.спермиев - 5 проб.

Обработанную метилаэ осилом сперму разбавляли средой из расчета 10 млн.активных спермиевв одной от5

таянной спермодозе следующего состава:

Сахароза, г11,5

Желток куриных яиц, мл 20,0 Глицерин, мл5,0

Спермосан - 3 тыс.ед. 50,0 Вода дистиллированная, мл 100,0 Разбавленную сперму охлаждали в холодильнике до 5°С в течение 5 ч, а затем замораживали в виде гранул на фторопластовой пластине в парах азота. Замороженную сперму хранили в жидком азоте при -196°С.

Подвижность спермиев, балл

Выживаемость при 38 С: Бремя, ч

Также провели цитохимические исследования сохранения активности ферментов - эндогенных дегидрогеназ в оттаянных образцах замороженной спермы, обработанных предлагаемым и известным Способами.

Для этого сразу же после оттаивания и через 4 ч инкубации при 38°С по капле спермы смешивали на специальном предметном стекле с забуференным раствором тетразолиевой соли Нитро ВТ (индикатор). Смесь терместатировали 30 мин 38°С. Делали

с высокой актив% .17,75 11,8

со слабой актив44,75 47,1

неактивные, % 37,5 41,1

11446986

Одновременно параллельные пробы тех же эякулятов обрабатывали известным способом, т.е. без предварительного смешивания с аэросилом.

Биологическую полноценность спермы, обработанной известным и предлагаемым способами, оценивали по показателям подвижности и выживаемости 10 спермиев согласно ГОСТу 20909,4-75.

Результаты исследования изложены в табл. 2 (п 5).

Таблица 2

4,72-t-0,079 9,8 0,01

6,27-0,324 32 0,01 25,69-2,08 50 0,01

мазок, фиксировали, докрашивали 0,1%-ным раствором эозина, высушивали и оценивали под световым микроскопом при 900-кратном увеличении. Все спермии дифференцировали на 3 класса: 1-й - спермии, имеющие высокую активность дегидрогеназ; 2-й - спермии со слабой активностью дегидрогеназ; 3-й - спермии с отсутствием дегидрогеназ.

Результаты исследований изложены в табл. 3.

Таблица 3

7,33

26,75 65,92