Способ получения рибозо-5-фосфат изомеразы из листьев шпината Советский патент 1985 года по МПК C12N9/00 

а сд Kj

со

I. 1

Изобретение относится к производству ферментов, касается технологии их получения, и может быть использовано для получения рибозо-5-фосфата, а также при моделировании системы карбоксилирующей фазы фотосинтеза.

Цель изобретения - упрощение способа и повышение выхода целевого продукта.

Пример. 100 г листьев шпината промывают охлажденной водой, затем дистиллированной водой и подсушивают с помощью фильтровальной бумаги. Приливают 100 мл 0,05 М трис-НС1 буфера рН 8,5и гомогенезируютв ступке или гомогенизаторе рт-1, полученный гомогенат фильтруют через четыре слоя марли. Добавляют к нему твердый сульфат аммония из расчета 23 г на 100 мл полученного гомогената. После растворения сульфата аммония гомогенат центрифугируют на центрифуге (любой) при 8000 g в течение 25-30 мин. Полученньй осадок отбрасывают, а в супернатант добавляют твердый сульфЬт аммония из расчета 19 г на 100 мл супернатанта.

После растворения сульфата аммония помутневший супернатант вновь Центрифугируют при 8000 g в течение 2530 мин. Ползп1енньй супернатант отбра1сывают, а осадок растворяют в дистиллированной воде из расчета 65 мл на 100 г взятка листьев. Полученный раствор.(70 мп) прогревают на водяной бане 95С 1-1,5 мин, чтобы температура раствора достигла 60°С и вьщерживают в течение 10 мин в бане . Затем быстро охлаждают в ледяной бане до +4С и центрифугируют при 8000 g в течение 20-25 мин на любой центрифуге. Полученньш осадок отбрасьшают, а супернатант диализуют в диализных мешках против 10-12 л дистиллированной воды (воду по 1,52 л мейяют 6-8 раз втечение 40 ч). Помутневший раствор насыщают твердым сульфатом аммония .из расчета 29 г на 100 мл, затем центрифугируют при 8000 g в течение 25-30 мин. Осадок отбрасывают, а супернатант

132

вновь насыщают сульфатом аммония из расчета 32 г на 100 мл. Вновь центрфугируют при тех же условиях.

Полученный осадок растворяют в минимальном (3-5 мл) объеме 0,02 М трис-НС1 буфера рИ 8-8,5 и обессоливают, используя диализ против 0,02 М трис-НС1 буфера рН 8,0 или, что лучше - обессоливают на колонке 1,5x25 см, заполненной сефадексом Q 50 и забуференной тем же буфером. Обессоленный белок наносят на колонку с предварительно обработанной и забуференной ДЭАЭ-целлюлозой 0,02 М трис-НС рН 8,0. После связывания с целлюлозой пропускают градиент концентраций NaCl 0-0,5 М в том же буфере общим объемом 300 мл (на колонку 2,5x15 см Активные фракции появляются после прохождения примерно 150 мл градиента. Все остальные фракции (примерно 150 мл) объединяют и приливают к ним нacьш eнный раствор сульфата аммония мл, предварит-ельно оттированный аммиачной водой до рН 7,5. Помутневший раствор центрифугируют. Полученный осадок - очищенная рибозо-5-фосфат изомераза может быть растворена в буфере, обессолена и использована для дальнейщей работы (ее практического применения). Выхо составляет 1-2 мг.

В таблице представлены сравнителные данные для предлагаемого и известного способов.

Полученный ферментный препарат характеризуется электрофоретической однородностью в 5%, 7,5% и 10%-ном полиакриламидном гелях, имеет хара1 терную молекулярную массу в 53 000 дальтон и близкий аминокислотный состав к ферменту из табака.

Таким образом, предлагаемьй спос вьщеления рибозо-5-фосфат изомеразы из листьев шпината позволяет получать однородный высокоактивный ферментньй препарат со значительно меньшими затратами во времени и реактивах по сравнению с известным способом.

Количество затраченного

времени, ч

Количество очищенного

фермента на 100 г

листьев, мг

Электрофоретическая

однородностьУдельная активность,

нкат/мг белка

Количество растительного материала для получения 1 мг очищенного фермента г/листьев

2,1 раза

60,65

1,4

5,83 раза

1500

80

5 раз

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РИБОЗО-JФОСФАТ ИЗОМЕРАЗЫ ИЗ ЛИСТЬЕВ ШПИНАТА путем.гомогенизации листьев в буфере, многократного фракционирования сульфатом .аммония, диализа н ионообмен- I ной хроматографии на ДЗАЭ-целлкотозе, отличающийся тем, что, с целью упрощения способа и повышения выхода целевого продукта, в качестве буфера использзтот трис-HClj экстракт двзгкратно фракционируют сульфатом аммония при насыщении 3767%, активную фракцию фермента прогревают, проводят диализ против дистиллированной воды -однократно в те- . чение 40 ч, вновь двукратно фракционируют сульфатом аммония при насыщении 40-85%, а ионообменную хроматографию проводят однократно.