Способ выделения ферредоксина Советский патент 1985 года по МПК A61K35/78 

со

4 4;: ГО

ю I . Изобретение относится к биохимии фотосинтеза, а именно к способам вьщеления белков, играющих ключевую роль в окислительно-восстановительных процессах при фотосинтезе, и мо жет быть использовано для биохимиче ких исследований. Цель изобретения - повышение выхода и степени очистки целевого продукта.. Пример. 1кг листьев кукурузы, срезанных на стадии образов ния початков и хранившихся при -ЗО, заливают жидким Азотом, механически размельчают в двухслойном бязевом мешке, заливают 1,3 л 0,005 М HCt буфером с защитными добавками, г: Аскорбат натрия5,3 Диэтилдитиокарбамат , 0,5 (1000 мл ПоЛИВИИИЛпирролидон 2,5 Экстракт отжимают. К 1,5 л экстракта добавляют 495 г сульфата аммония марки х.ч. ИЛИ о.с.ч. Через 0,5 ч центрифугируют в течение 30 мин при 5000 об/мин. Осадок отб сывают, а к 1,8 л супернатанта добавляют 450 г сульфата аммония. Через 1,5-2 ч производят центрифугирование как и в первом, случае. Ферредоксин (Фд), находящийся в оса ке, растворяют в 75 мл 0,05 М трис HCt буфера, рН 7.8. При 14000 об/ми в течение 10 мин центрифугированием освобождают раствор белка от невастворившихся примесей. Для обесс щивания наносят прозрачный раствор неочищенного Фд на предварительно уравновешенную 0,005 М трис HCt буфером, рН 7,8 колонку с сефадекс G-50 средний (диаметр 2 см, высота 75 см), окрашенный в коричневый 22 цвет Фд вместе с пластоцианином собирают отдельной фракцией. Наносят ее на колонку с ДЭАЭ-цехшюлозойs (диаметр 2,5 см, высота 7 см), предварительно уравновешенную 0,17 М трис HCt буфером рН 7,8 с 0,08 М NaCf. Последовательно промывают колонку 0,05 М трис HCt буфером: , 0,17 М трис HCt буфером с 0,08 М NaCf (элюируется пластоцианин), 0,17 М трис HCt буфером с 0,18 М NaC (элюируется Фд). Окрашенный в синий цвет при добавлении феррицианида калия пластоцианин концентрируют на ДЭАЭ-целлюлозе (диаметр 1 см, высота 2,5 см), предварительно понизив ионную силу раствора разбавлением 0,005 М трис НС буфером в 2-3 раза. Элюат Фд, окрашенный в коричневый цвет, концентрируют на ДЭАЭцеллюлозе (диаметр колонки 1 см, высота 2 см). Снимают концентриро- , ванный Фд 0,17 М трис HCt буфером с 0,55 М NaCt. Хроматографией на сефадексе G-50 сверхтонкий существенно очищают от примесей белков и сопутствующей .бурой окраски. Повторная хроматография на ДЭАЭ-целлюлозе и сефадексе G-50 сверхтонкий позволяет получить Фд с предельным ко-. эффициентом 0,44 служащим А Z78 критерием чистоты для Фд кукурузы. Препаративный форез после 1гй. G-50 сверхтонкий позволяет получить белок ,44 красно-коричневого п Z7S , , цвета. Выход белка при этом 45 мг. Схематически вьщеление и очистку Фд можно представить следующим образом. Схема получения .ферредоксина . кукурузы из листьев 12-недельных растений:

1.Гомогенизация.

2.Экстракция.

3.Отжим.

4.Ступенчатое высаливание,

5.Центрифугирование.

6.Ресуспендирование.

7.Обессоливание.

СПОСОБ ВЬЩЕЛЕНИЯ ФЕРРЕДОКСИНА путем гомогенизации растительного сырья, экстракции белков трис-буфером, отжима, ступенчатого высаливания сульфатом аммония, центрифугирования, суспендирования, обессоливания на сефадексе g 50, хроматографии на ДЭАЭ-целлюлоза с элюцией хлористым натрием и последующей гельфильтрации на сефадексе g 50, отличающийся тем, что, с целью повьппения выхода и степени очистки целевого продукта, в качестве источника сырья используют листрья кукурузы на стадии образования початков, в трис-буфер добавляют аскорбат натрия 5-7 г/л, диэтилдитиокарбамат натрия 0,40,6 г/л и поливинилпирролидон 2-3 г/л, а элюцию проводят 0,15-0,18 М хлористым натрием.

7. G-50 средний

t ДЭАЭ - целлюлоза (ДЭАЭ-Ц)

0,17 М трис нет 0,18 М NaCt

Фд ДЭАЭ - ц концентрационная .0,017 М трис HCt 0,55 М NaGt

G - 50 сверхт. ДЭАЭ-Ц

0,17 М трис HCI 0,18 NaCt .

ДЭАЭ-Ц концентрационная 0,17 М трис HCt 0,55 М NaCf

G-50 сверхтонкий

Все процедуры очкстк можно проводить при комнатной температуре. Выделенный таким способом Фд сохраняет устойчивость в течение 2-3 лет. Вьзделение Фд из листьев кукурузы

0,17 М трис HCt 0,08 М NaCf

ДЭАЭ-Ц - пластоцианин

на стадии образования початков по той же схеме, что и в примере 1, но без защитных добавок снижает выход белка в 1,5-2 pkза.