Способ получения обратной транскриптазы из ЕSснеRIснIа coLI Советский патент 1991 года по МПК C12N9/12 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для получения фермента, осуществляющего переписывание генетической информации с РНК в молекулы ДНК.

Целью изобретения является повышение степени очистки обратной транскриптазы из Е. colt.

Получение обратной транскриптазы включает гомогенизацию клеток Е. coli MRE 600, экстрагирование белка буферным раствором, фракционирование в двухфазной системе полиэтиленгликоль-декстран с последующей хроматографической очисткой, включающей последовательную хроматографию на фосфоцеллюлозе, диэтиламиноэтилцеллюлозе, сефадексе G-100 и носителе Био-Рекс 70.

Степень очистки и выход на каждой стадии приведены в таблице.

Способ иллюстрируется примерами.

Пример Получение обратной транскриптазы из Е. coli

1. Разрушение клеток бактерий и получение грубого экстракта.

К 1,5 кг биомассы MRE-600 ранней логарифмической фазы роста добавляют 750 мл водного раствора лизоцима с концентрацией 2 мг/мл. Суспензию титруют насыщенным раствором трис-(оксиметил)-аминометана до рН 8,3, выдерживают 30 мин при 5-7°С, замораживают смесь жидким азотом и разрушают клетки в механическом гомогенизаторе при

ON СО 00

О

го

8000 об./мин в течение 10 мин. К полученному порошку разрушенных клеток добавляют 3000 мл 0,05 М трис-HCI, рН 8,3, и с помощью механической мешалки ведут экстракцию в течение 1,5 мин. Экстракт осветляют центрифугированием (60 мин, 9000 об./мин).

Выход белка на этой стадии составляет 72 г; удельная активность фермента 42 е.а./мг.

2,Фракционирование в двухфазной системе полиэтиленгликоль-декстран.

К 3300 мл полученного грубого экстракта добавляют 1095 мл 30%-ного раствора полиэтиленгликоля (ПЭГ, мол.мае. 20000 D) и 200 мл 20%-ного раствора декстрана Т-500. Полученную смесь перемешивают в течение 30 мин при помощи механической мешалки. Затем центрифугируют 40 мин при 9000 об./мин. Верхнюю фазу отбрасывают, а к нижней добавляют раствор, содержащий 0,4 М KCI, 50 мМ трис-HCI (рН 8,3) и 6%-ный раствор ПЭГ(мол,мас. 20000 D), из расчета 8 об. этого раствора на 1 об нижней фазы. После 30 мин энергичного перемешивания вновь разделяют фазы центрифугированием (40 мин, 9000 об./мин) и отбрасывают верхнюю фазу. К нижней фазе добавляют раствор, содержащий 4М KCI и 6% ПЭГ (мол.мас. 6000D) в 50 мМ трис-HCI, рН 7,3, из расчета 3 об этого раствора на

Iоб нижней фазы и перемешивают механической мешалкой 40 мин. Затем после 40 мин центрифугирования при 9000 об./мин декантируют верхнюю фазу и подвергают очистке содержащийся в ней материал.

Выход белка 12,7 г; удельная активность 76 е.а./мг. Выход по активности 32%.

3.Хроматография на фосфоцеллюлозе Р-11.

Полученный на предыдущей стадии белковый материал освобождают от полиэтиленгликоля, фрагментов нуклеиновых кислот, других низкомолекулярных примесей/а также избытка соли путем пропускания через колонку с сефадексом G-25 (грубым, V 8 л), уравновешенную 50 мМ трис-HCI, рН 7,3,, содержащим 50 мМ КС, и наносят на колонку с фосфоцеллюлозой РI1(V 400 мл), уравновешенную буферным раствором того же состава. Разделение ведут в линейном градиенте КС 0,05-0,5 М в 50 мМ трис-HCI, рН 7.3 (общий объем градиента 4 л). Фракции, содержащие активность обратной транскриптазы, объединяют и ведут осаждение белка диализом против насыщенного раствора сульфата аммония, рН 7,5. Осадок белка собирают центрифугированием (9000 об./мин, 45 мин). ч

Выход белка на этой стадии 120 мг удельная активность 2300 е.а./мг.

4. Хроматография на диэтиламиноэтил- целлюлозе ДЕ-52,

Полученный на предыдущей стадии белковый материал обессоливают на колонке с сефадексом G-50 (средний V 100 мл), уравновешенной 0,05 М трис-HCI, рН 7,3, содержащим 50 мМ KCI, и наносят на колонку с

диэтиламиноэтилцеллюлозой ДЕ-52 (V 100 мл), уравновешенную буферным раствором того же состава. Хроматографиче- ское разделение ведут в линейном градиенте KCI 0,05-0,5 М трис-HCI, рН 7,3.

Суммарный объем градиента 1,0 л. Хрома- тографические фракции, содержащие белок с активностью обратной транскриптазы и не содержащие нуклеаз, объединяют, проводят осаждение белка диализом против суспензии сульфата аммония, как на стадии 3, и собирают белковый осадок центрифугированием.

Выход белка 8,7 мг; удельная активность - 12000 е.а./мг.

5. Гельфильтрация на сефадексе G-100.

Осадок белка растворяют в объеме 1-2 мл 0,05 М трис-HCI, рН 7,3, содержащего 0,05 М KCI, раствор осветляют центрифугированием и наносят белковый материал на

колонку с сефадексом G-100 (сверхтонкий, V 100 мл, размеры колонки: диаметр 1 см, высота 70 см), Скорость нанесения и гель- фильтрации 12-14 мл/ч. Элюент - 0,05 М трис-HCI. Фракции, содержащие белок с активностью обратной транскриптазы и не содержащие нуклеаз, объединяют и проводят следующую стадию очистки.

Выход белка на этой стадии 6 мг; удельная активность 15000 е.а./мг.

6. Хроматография на Био-Рекс 70.

Белковый материал, полученный на предыдущей стадии, наносят на колонку (V 2 мл) с Био-Рекс 70, уравновешенную 0,05 М трис-HCI, рН 7,3, содержащим

0,05 М KCI, со скоростью 4 мл/ч. Разделение ведут в линейном градиенте KCI 0,05- 0,5 М трис-HCI, рН 7,3 (суммарный объем градиента 20 мл) со скоростью 3 мл/ч. Фракции, содержащие обратную транскриптазу,

объединяют.

Выход белка 1,5 мг (концентрация около 0,5 мг/мл); удельная активность 57000 е.а./мг.

Фермент хранится в виде замороженного раствора при -20°С без потери активности не менее одного года.

Формула из.обретения Способ получения обратной транскриптазы из Escherichia coll MRE-600, включающий разрушение клеток бактерий, экстрагирование белка буферным раствором, фракционирование со ступенчатым повышением концентрации соли в двухфазной системе полиэтиленгликоль-декстран и рчистку методом колоночной хроматографии, отличающийся тем, что, с целью повышения степени очистки, фракционирование в двухфазной системе полиэтиленгликоль-декстран осуществляют со ступенчатым повышением концентрации КСГ до 3 М,

а очистку методом колоночной хроматографии выполняют последовательно на фосфоцел- люлозе Р-И в линейном градиенте концентрации KCI от 0,05 до 0,5 М в буфере рН 7,3,

на ДЭАЭ-целлюлозе ДЕ-52 в линейном градиенте концентрации KCI от 0,05 до 0,5 М в буфере низкой ионной силы, рН 7,3, на се- фадексе G-100 и на носителе Био-Рекс 70 в линейном градиенте концентрации KCI от

0,05 до 0,5 М в буфере низкой ионной силы, рН 7,3.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для получения фермента, осуществляющего переписывание генетической информации с РНК в молекулы ДНК. Целью изобретения является повышение степени очистки обратной транскриптазы из Е coli. Получение обратной транскриптазы включает гомогенизацию клеток Е coli MRE-600, экстрагиро- вание белка буферным раствором, фракционирование в двухфазной системе ПЭГ-декстран с последующей очисткой методами колоночной хроматографии на фос- фоцеллюлозе, ДЭАЭ-целлюлозе, сефадексе G-100 и носителе Био-Рекс 70. Степень очистки 1358, удельная активность препарата 57000 ед/мг, выход по активности 2,8%, выход по белку 0,002%. 1 табл