Способ определения дефектности лимфоцитов Советский патент 1986 года по МПК A61K39/00 G01N33/49 

Изобретение относится к медии ине в частности им 3 иoлoгии а именно к методам диагностики им1-гунологи- ческой реактивности организма.

Целью изобретения является повышение точности способа определения дефектности лимфоцитов крови.

Способ осуществляют следующим образом.

Из вены больного набирают 3,5 - 5,0 мл крови, которую помешдют в пробирку с 0., 1 мл гепарина. В центрифужную пробирку наливают 2 мл фиколл-верографиновой смеси, затем осторожно в нее наслаивают разведенную изотоническим раствором хлорида натрия (1:) кровь, центрифугируют 20 мин при Q, После этого из пробирки сливают все слои до кольца которое пипеткой снимают в отдельную пробирку. В нее добавляют 5-6 мл среды 199. Центрифугируют при 400 G дважды в течение 10 мин, Надоса- дочную жидкость сливают, осадок ресуспендируют с 0,5 ют надосадочной жидкости. Во взвеси определяют количество лимфоцитов путем их подсчета в камере Горяева известным методом. Взвесь тшмфоцитов разливают в две пробирки по О 51 мл в каждую. В обе пробирки добавляют по Oj1 мл 1-2 мкмоль раствора третичной перекиси бутила в среде .199 и ста вят в термостат на 30 мин при +37°С, после чего центрифугируют 10 мин при 400 Q, затем отбирают по

О,

мл надосадочнои жидкости из

каждой пробирки. В первую пробирку добавляют 0,1 МП 055%-ной взвеси эритроцитов барана и ставят в холодильник на I ч при +4°С (для определения ), Во вторую пробирку добавляют Ojl мл 2%-ной суспензии эритроцитов барана, обраг ботанных мьгаотным комплементом, выдерживают в термостате 30 мин пpF +37°С (для определения ЕАС-РОК).

Поспе выдерживания обе пробирки центрифугируют 10 мин при 50 G ре- Ьуспендируют, На предметное стекло наносят каплю взвеси и под микроскопом подсчитывают число лимфоцитов, присоединивших не менее трех эритроцитов, и их процент по отношению к общему числу лимфоцитов. Сравнивая количество Т- и В-клеток (%) в пробах, полученных после обработки третичной перекисью бутила, и в пробах, где их количество определялось известным методом, рассчитывают (%) степень снижения числа Т- и В-клеток. При снижении количества Т- и В-клеток более чем на

5% по сравнению с исходным диагностируют дефектность лимфоцитов.

Пример 1. У больного Б.А. из периферической вены взяли .4 мл крови, перенесли в пробирку с 0,1 мл

гепарина, развели изотоническим раствором хлорида натрия 1:1. Затем наслоили на 2 МП фиколл-верографино- вой смеси, отцентрифугировали 20 мин при 400 G. Выделенное кольцо

дважды отцентрифугировали с 5 мл среды 199 в течение 10 мин при 400 Q-. , Определили количество лимфоцитов в осадке. Ресуспендированную взвесь разлили по О,1 мл в 4 пробирки. В

первой и второй определили число Т- и В-лимфоцитов (Е- и ЕАС-РОК). В третью и четвертую пробирки добавили по О,1 МП 1 мкмоль раствора третичной перекиси бутила и выдержали в

термостате при +37 С в течение

30 мин, после чего отцентрифугировали при 400 Q в течение 10,мин. . Отобрали из каждой пробирки по 0,1 мл надосадочнои жидкости. В получен

ном осадке определили число Т- и Влимфоцитов (А- и ЕАС-РОК), Выявлено, что в не обработанной третичной перекисью бутила взвеси количество Т- и В-лимфоцитов составило соответственно 30 и 34%. Во взвеси, обработанной 1 мкмоль раствором третичной перекиси бутила, число Т- и В-лимфоцитов составило соответственно 20 и 23%. Число Т-лимфоцитов после обработки уменьшилось на 33%, В-лимфоцитов - на 32%.

Диaг гocтиpoвaнa дефектность лимфоцитов, сопровождающая неосложненную острую пневмонию. Диагноз: двусторонняя очаговая бронхопневмония,

острое течение.

Пример 2.У больного С, В. из периферической вены взяли 3,5 мл крови, перенесли в пробирку с О,1 мл гепарина, развели изотоническим .

раствором хлорида натрия 1:1. Затем наслоили на 2 мл фиколл-верографино- вой смеси, отцентрифугировали в течение 20 мин при 400 Q, определили количество лимфоцитов в осадке. Выделенное кольцо дважды отцентрифугировали с 5. мл среды 199 в течение 10 мин при 400 G. Ресуспендированную взвесь разлили по О,1 мп по 4 пробир

ки. в первой и второй определили чило Т- и В-лимфоцитов (Е- и ЕАС-РОК) В третью и четвертую пробирки добавли по О , 1 мп мкмоль раствора третичной пeJ eкиcи бутила, выдержали в те .мостате при +37°С в течение 30 мин, после чего отцентрифугировали при 400 Q в течение 10 мин. Отобрали из каждой пробирки по 0,1 мп надосадоч ной жидкости. В полученном осадке .определили число Т- и В-лимфоцитов (Е- и ЕАС-РОК).

Выявлено, что в не обработанной третичной перекисью бутила взвеси клеток число Т- и В-лимфоцитов составило соответственно 33 и 30%. Во взвеси, обработанной 1 мкмоль раствором третичной перекиси бутила, количество Т- и В-клеток после обработки уменыпилось на 39%, В-клеток - на 50%.

Диагностирована дефектность лим- фоцитов, сопровождающая осложненную :острую пневмонию. Диагноз: двусто- ронняя бронхопневмония, токсическая форма, бронхообструктивньтй и кардио- респираторный синдром, острое течение.

Как следует из приведенных примеров, количество Т- и В-лимфоцитов в периферической крови было примерно одинаковым, хотя тяжесть заболева- ния бьта различной. Использование предложенного метода оценки дефектности лимфоцитов путем определения процента снижения числа Т- и В-лим- фоцитов После их обработки раствором третичной перекиси бутила показало, что во втором случае снижение числа Т- и В-лимфоцитов было более выраженным, что соответствовало большей тя- жести заболевания.

5

0

, о

5

Исследования проведены у 50 детей, больных острой пневмонией, а также у 10 здоровых детей в возрасте 1 - :6 мес.

Результаты проведенных исследований, а именно чувствительность Т- и В-лимфоцитов к действию перекисей при неосложненной и осложненной пневмонии (М+т) в процентах, приведены в :таблице.

Как следует из данных, представленных в таблице, использование предлагаемого способа позволяет установить наличие дефектности лимфоцитов между группой здоровых детей и детьми, б.ольными неосложненной пневмонией, в то время, как исполь- зование известного способа не позволяет выявить дефектность лимфоцитов между данными группами детей. Определение числа Т- и В-лимфоцитов в крови, не обработанной третичной перекисью бутила,не выявило достоверных различий их уровня между группами детей, больных осложненной и неосложненной пневмонией. При применении предлагаемого способа с высокой степенью достоверности (,001) выявляется дефектность лимфоцитов у детей указанных групп.

Таким образом, применение изобретения позволяет повысить точность определения дефектности лимфоцитов, в частности выявить дефектность лимфоцитов при неосложненной пневмонии.

Изобретение может быть использова- но при диагностике пневмоний и других заболеваний, сопровождающихся нарушением иммунологической-реактивности организма.