Способ выделения наружной и внутренней мембран возбудителя чумы Советский патент 1990 года по МПК C12N1/00 

Изобретение относится к области биотехнологии и касается выделения наружной и внутренней мембран гран- отрицательных микроорганизмов.

Целью изобретения является првы- гаение выхода целевого продукта и ускорение способа за счет модификации этапа вьщеления.

Пример. Клетки чумного микроба (штамм EV) выращивают в системе непрерывного культивирования в бульоне Хоттингера, рН 7,2 при 28 С и до середины логарифмической фазы развития и биомассу собирают центрифугированием в течение 15- 20 мин при 5000-6000 g. Клетки отмывают буфером (0,01 М трис-НС1, рН 7,2; 0,02 М MgCx 0,03 М 2-меркапто- зтанол) и оставляют в осадке при минус до использования.

Замороженные ucaAKrf (8-10 г бактериальной массы) суспендируют в 30 мл трис-НС1-буфера, рН 8,0, содержащего 20% сахарозы, добавляют РНКазу и ДНКазу (2 мг на 1 г клеток) , инкубируют 30 мин при А°С и дважды пропускают через Х-пресс (давление 16 т) в замороженном состоянии.

Обломки клеток и неразрушенные клетки удаляют центрифугированием при 1300-1400 g в течение 10 мин. Клеточные оболочки (общая фракция мембран) выделяют центрифугированием супернатанта при 120000 g (ротор SW-27, .ультрацентрифуга L ) в течение 1 ч в ступенчатом градиенте .сахарозы, содержащем 9 мл 70%-ной саРедактор А.Купряков

Заказ А362

Составитель, И.Красильников

Техред Л. 0л ейник Коррек Тор I Решетник

Тираж 490 . ВНИИПИ ГоЬударственного комитета СССР

по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Подписное

Производственно-полиграфическое предприятие, г.Ужгород, ул.Проектная, 4

5

0

5

0

харозы (п/объем) и 23,5 мл 20%-ной сахарозы (в/объем). Плотный оранжевый слой, расположенный в центр : пробирки, отсасывают с помощью шприца и используют для дальнейшего фракционирования.

Выделенную фракцию оболочек или суммарных мембран (наружные и цито- плазматические) промывают 0,01Мтрис- -НС1-буфером, рН 8,0, содержащим . 0,01 М дитиотреитола и 5 10 М Mg , и наслаивают на верх линейного сахарозного градиента (70-45%) (общий белок 200 мг). Градиенты приводят в равновесие за 6 ч на ультрацентрифуге L 5-65, используя ротор SW-27 и ускорение 120000 g. За это время материал отчетливо распределяется в два кольца. Оранжевый слой и серо-. вато-бельй на 0,5 см ниже первого, которые представляют собой материал внутренних и наружных мембран. Проводят измерение оптической плотности при 280 нм на Uvicord II после раскапывания (по 10-12 капель), полученных последовательно фракций градиента, которые в дальнейшем собирают и отмывают в трис-НС1-буфере, рН 8,0, содержащем и 0,01 М дитиотреитола . Выделенные чистые препараты наружных и внутренних мембран хранят при минус .

Способ позволяет в 3 раза по срав- 35.нению с прототипом ускорить процесс пьлучения мембранньт фракций с высо-- кой степенью чистоты и увеличить вы- ход конечного продукта в 4 раза.

Подписное