Изобретение относится к способу получения новых производных тетрагид- роизохинолина, обладающих ценными фармакологическими свойствами, позволяющими их применять в медицине.
Цель изобретения - синтез новых соединений, обладающих противогипер- тензивной активностью и активностью
Н-бензилкарбетокси-Ь-1,2,3, рагидроизохинолин-3-карбоновую кислоту (46,5 Г;, 0,150 моль) растворяют в метиленхлориде (1000 мл) и добавляют концентрированную серную кислоту (7 мл), Получающуюся смесь охлажингибирующей Превращение ангиотензин-- дают в бане с сухим льдом и ацетоном превращающего энзима.
до -30 С, а затем через раствор в течение 3 ч пробулькивают изобутилен. Реакционный сосуд закрыв ают пробкой с клапаном, сбрасьпзающим давление и хранят в течение ночи при комнатной температуре. Реакционную смесь осторожно подщелачивают, добавляя по кап лям 10%-ный раствор водного карбоната калия. Органическую фазу отделяют и еще раз промывают 10%-ным , а затем дважды водой. Органический экстракт высушивают над сульфатом магния. После фильтрования и выпаривания раствора получают светло-желтое масло (45,3 г, 82,4%), которое можно использовать без дальнейщей очистки.
Пример 1. L-1,2,3,4-тетра- гидроизохинолин-3 карбоновая кислота.
Суспензию L-фенилаланина о(75 г, 15 0,455 моль) в концентрированной соляной кислоте (488 мл) и 37%-ньш формалин (165 мл) медленно нагревают с обратным холодильником при интенсивном перемещивании в течение 30 мин. По 20 проществии этого времени добавляют другую порцию 37%-ного формалина (75 мл) и концентрированной соляной кислоты (165 мл). Перемешивание и нагревание продолжают в течение 4ч, Реакционную смесь охлаждают до.крм- натной температуры и Образовавшийся твердый осадок отфильтровывают и про- мьшают небольшим количеством метанола; при этом получают гидрохлорид в 30 виде бесцветного твердого вещества (68,9 г, 71%), т.пл. 291-294°С,
2. L-бензилкарбедо -30 С, а затем через раствор в течение 3 ч пробулькивают изобутилен. Реакционный сосуд закрыв ают пробкой с клапаном, сбрасьпзающим давление и хранят в течение ночи при комнатной температуре. Реакционную смесь осторожно подщелачивают, добавляя по каплям 10%-ный раствор водного карбоната калия. Органическую фазу отделяют и еще раз промывают 10%-ным , а затем дважды водой. Органический экстракт высушивают над сульфатом магния. После фильтрования и выпаривания раствора получают светло-желтое масло (45,3 г, 82,4%), которое можно использовать без дальнейщей очистки.
Пример 4, трет-Бутил N-(1, 2,3,4-тетрагидроизохинолин)-3-карбоксилат .
трет-Бутил N-бeнзилкapбeтoкcи-L- -(1,2,3,4-тетрагидроизохинолин)-3- -карбоксилат (45 г, 0,123 моль) растворяют в абсолютном этаноле (600 мл)
Пример
токси-L-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин- 35 й добавляют Го% р1/с () Получаю-3-карбоновая кислота,
щуюся смесь гидрогенизируют в мешалГидрохлорид L-1,2,3,4-тетрагидро- изохинолин-3-карбоновой кислоты (58,8 г, 0,275 моль) растворяют в 1 N гидроокиси натрия (600 мл) и получающийся раствор охлаждают в ледяной бане. Добавляют по каплям бензил хлороформат (39,0 мл, 0,263 моль). После этого добавляют бензил-хлоро- формат (30 мин) при перемешивании в течение часа при комнатной температуре, а затем добавляют другую порцию 1 N гидроокиси натрия (100 мл). Перемешивание продолжают в течение последующих 2-2,5 ч. Реакционную смесь подкисляют до рП 4 концентрированной соляной кислотой и продукт экстрагируют хлороформом. Органическую фазу дважды промывают водой и суиат над сульфатом магния, йосле фильтрования и испарения растворителя получают бесцветное масло (86,3 г, 91,5%), которое можно использовать без дальнейшей очистки.
40
ке Парра низкого давления под давлением 50 футов на KB, дюйм в течение 16 ч. Катализатор отфильтровывают и растворитель вьтаривают с получением неочищенного продукта в виде бледно- голубого масла (24,8 г, 86,4%), кото рый используют без дальнейшей очистки.
5 Пример 5о трет-Бутил N-(3 ацетилтио-2 -метилпропаноил)-L-(1,2, 3,4-тетрагидроизохинолин)-3-карбоксилат, I
5Q К раствору трет-бутила ,-(1,2,3,
4-тетрагидроизохинолина)-3-карбокси- лата (8,1 г, 0,0349 моль) и 3-ацетил тио-2--мётилпропионовой кислоты (5,6 г 0,036 моль) в метиленхлориде (250мл) охлажденному в ледяной бане, добавляют дициклогексилкарбодиимид (7,2 г 0,0350 моль). Получающуюся смесь перемешивают со внешним охлаждением в течение 30 мин, а затем примерно 3 ч
Пример 3, трет-Бутил М-бен- зилкарбетокси-L-(1,2,3,4-тетрагидро- изохинблин)-3-карбоксилат.
Н-бензилкарбетокси-Ь-1,2,3, рагидроизохинолин-3-карбоновую кислоту (46,5 Г;, 0,150 моль) растворяют в метиленхлориде (1000 мл) и добавляют концентрированную серную кислоту (7 мл), Получающуюся смесь охлаждают в бане с сухим льдом и ацетоном
до -30 С, а затем через раствор в течение 3 ч пробулькивают изобутилен. Реакционный сосуд закрыв ают пробкой с клапаном, сбрасьпзающим давление и хранят в течение ночи при комнатной температуре. Реакционную смесь осторожно подщелачивают, добавляя по каплям 10%-ный раствор водного карбоната калия. Органическую фазу отделяют и еще раз промывают 10%-ным , а затем дважды водой. Органический экстракт высушивают над сульфатом магния. После фильтрования и выпаривания раствора получают светло-желтое масло (45,3 г, 82,4%), которое можно использовать без дальнейщей очистки.
Пример 4, трет-Бутил N-(1, 2,3,4-тетрагидроизохинолин)-3-карбоксилат .
трет-Бутил N-бeнзилкapбeтoкcи-L- -(1,2,3,4-тетрагидроизохинолин)-3- -карбоксилат (45 г, 0,123 моль) растворяют в абсолютном этаноле (600 мл)
й добавляют Го% р1/с () Получаю
ке Парра низкого давления под давлением 50 футов на KB, дюйм в течение 16 ч. Катализатор отфильтровывают и растворитель вьтаривают с получением неочищенного продукта в виде бледно- голубого масла (24,8 г, 86,4%), который используют без дальнейшей очистки.
Пример 5о трет-Бутил N-(3 ацетилтио-2 -метилпропаноил)-L-(1,2, 3,4-тетрагидроизохинолин)-3-карбоксилат,
К раствору трет-бутила ,-(1,2,3,
4-тетрагидроизохинолина)-3-карбокси- лата (8,1 г, 0,0349 моль) и 3-ацетил- тио-2--мётилпропионовой кислоты (5,6 г, 0,036 моль) в метиленхлориде (250мл), охлажденному в ледяной бане, добавляют дициклогексилкарбодиимид (7,2 г, 0,0350 моль). Получающуюся смесь перемешивают со внешним охлаждением в течение 30 мин, а затем примерно 3 ч
313
при комнатной температуре. Осажденную дициклогексилмочевину отфильтровывают .и промьшают небольшим количеством метиленхлорида. При концентрировании фильтрата получают неочищенный продукт в виде бледно-желтого масла, который используют без дальнейшей очистки.
Пример 6. N-(3 -Ацетилтио
-2 -метилпропанил)-Ь-(1,2,3,4-тетра- гидроизохинолин),-3-карбоновая кислота,
Неочитенный трет-бутил N-(3 -ацетил тио-2 -метилпропанрил)-L-(1,2,3,4- -тетрагидроизохинолин)-3-карбокси- лат (14 г, 0,371 моль) растворяют в смеси анизола (25 мл) и трифторуксус - ной кислоты (75 мл), Получающийся раствор перемешивают при комнатной температуре примерно -в течение часа, Трифторуксусную кислоту удаляют под вакуумом и остаток распределяют между этилацетатом и насыщенным бикарбонатом натрия, Водную бикарбонатную фазу отделяют и дважды промывают этилацетатом, а затем осторожно подкисляют до рН 2-А с помощью концентрированной соляной кислоты, Осажден- яый продукт несколько раз экстрагируют хлороформом и объединенный орга- нический экстракт дважды промывают водой и высушивают над сульфатом магния, фильтруют и вьтаривают с получением бледно-желтого масла (7,3 г). Этот грубый продукт очищают с помощью жидкостной хроматографии высокого давления с использованием смеси п-гексана : этилацетата : уксусной кислоты (30:60:1) в качестве злюанта для получения чистого продукта в виде бесцветного масла (5,9 г). Продукт был описан в виде его диц,иклогексил- аминовой соли (ДЦГА), которую получали в эфире таллов,
Пример 7, N-(3 -MepKanTO- -2 -метилпропаноил)-L-(,2,3,4-тетра- гидроизохинолин)-3-карбоновая кислота ,
Безводный аммиак пробулькивают в течение 15 мин через метанол (100 мл) и получающийся насьщенный раствор добавляют к N-(3 -ацетилтио-2 -мев виде бесцветных крис- т,пл, 161-163°С.
тилпропаноил)-Ь-(1 ,2,3,4,-тетрагидро- „ Реакционную смесь помещают в атмосизохинолин-3-карбоновой кислоте (2,0 г, 0,00623 моль) и помещают в атмосферу азота. Реакционную смесь перемешивают при комнатной темпераферу азота продолжают перемешивание при комнатной температуре в течение часа. Метанол испаряют и остаток наносят на катион-обменную колонку . (fs
O
5
5 0 0
4
туре в течение часа. Растворитель удаляют в вакууме и остаток наносят на колонку АС-50 W - Х2 катионобмен- ной смолы и элюируют метанолом. Метанол выпаривают и остаток растворяют в хлороформе, Хлороформ вымывают водой один раз и высушивают над сульфатом магния. После фильтрования и вьтаривания растворителя получают бесцветное масло (1,7 г, 98%), Свободную кислоту переводят в ДЦГА соль в простом эфире с получением бесцветных кристаллов, т.пл, 146-147 С, Продукт -описывают в виде его ДЦГА соли.
Пример 8, 2-(3 -Ацетилтио- -2 -метилпропанолил)-1-фенил-3-кар- бометокси-1 ,2,3,4-тетрагидро-(0-кар- болин,
1-Фенил-3-карбометокси-1,2,3,4- -тетрагидро- -карболин (10 г, 0,04 моль) и триэтиламин (4,1 г, 0,04 моль) растворяют в ацетонитри- ле (250 мл) и получающуюся смесь охлаждают в ледяной бане, З-Ацетшттио- -2 метилпропионилхлорид (6,5 г, 0,036 моль) добавляют небольшими порциями. После этого добавляют кисльш хлорид и убирают ледяную баню; смесь перемешивают при комнатной температуре в атмосфере азота в течение 2,5 ч. Растворитель выпаривают и остаток растворяют в хлороформе. Хлороформ промывают водой, 5%-ным водным раствором NaOH, 5%-ным водным раствором НСЕ и водой. Выпаривают хлороформ высушиванием над сульфатом магния, фильтруют и испаряют с получением неочищенного продукта в виде слегка окрашенного масла. Продукт подвергают дальнейшей очистке хроматографией на силикагеле () с получением чистого продукта в виде бесцветного масла (9,6 г, 65%),
Пример 9, 2-(з -Меркапто- -2 -метилпропаноил)-1-фенил-3-карбо- метокси-1,2,3,4-тетрагидро-/3-карбо- лин,
2-(З -Ацетилтио-2 -метилпропаноил)- 1- фенил-3-карбометокси-1 ,2,3, 4-тетрагидро-й-карболин (2 г, 0,0045 моль) растворяют в метаноле (75 мл) и через раствор пробулькивают безводный аммиак в течение 15 мин.
феру азота продолжают перемешивание при комнатной температуре в течение часа. Метанол испаряют и остаток наносят на катион-обменную колонку . (fs10
f5
танол), Метанол испаряют и остаток растворяют в хлороформе, промывают водой, высушивают над сульфатом магния, фильтруют и выпаривают с получением продукта в виде бесцветного масла (1,6 г, 88%).
Пример 10. N-(З -Ацетил- тис- 2 метилпропаноил)-Ь-1 ,2,3,4- -тетрагидроизохинолин)-3-карбоновая кислота.
К перемешанной суспензии L-1,2,3, 4-тетрагидроиЗохинолин-З-карбоновой кислоты 40,0 г, 187,2 моль) примерно в литре р-диоксана и воды (200 мл)
добавляют триэтиламин (78 Йл, 560,8 моль), а затем по каплям добавляют З-ацетилтио-2-метилпропионил- хлорид (33,8 г, 187,2 моль). По мере прохождения реакции смесь становится в основном гомогенной. По протест-20 ВИИ примерно 3 ч отфильтровывают небольшое количество растворимого материала и фильтрат концентрируют на вращающемся испарителе. Получающийся раствор разбавляют водой и подкисля- ют до рН 2 концентрированной НСВ, после чего экстрагируют в этилацетат. Раствор этилацетата дважды промывают водой, один раз соляным раствором, высушивают над сульфатом магния, фильтруют и испаряют с получением примерно .55 г масла. Неочищенньй продукт отделяют методом препаративной хроматографии с элюированием 2%-ной уксусной кислоты, 40%-ным этилацета- том и 60%-ным гексаном с выходом
30,2 г (50,2%) чистого вещества, 1
Испытание in vitro на ингибирова- ние ангиотензин-превращаюр его энзима (АСЕ).
Испытание на ингибирование ангио- тензин-превращающего энзима.
Введение. Этот тест обеспечивает метод идентификации ингибирования ан- гнотензин-превращающего энзима (АСЕ). Активность энзима испытывают в присутствии и отсутствии испытуемого соединения и определяют процентное ингибирование активности энзима.
Превращающий энзим катализирует гидролиз трипептида, гиппурил-гисти- дил-лейцина (HHL), Продуктами этой реакции являются гиппуровая и гистидил-лейцин.
Активность энзима может быть определена путем измерения количества гиппуроБой кислоты, образуемой за данное время. Дпя этой цели превраща45
30
35
40
50
кислота о
5
0
ющий энзим инкубируют с HHL в течение 10 мин при 37 С, Реакцию энзима останавливают с помощью добавления соляной кислоты. Затем гиппуровую кислоту отделяют с помощью экстракции реакционной смеси этилацетатом. После выпаривания растворителя остаток „ содержащий гиппуровую кислоту, растворяют в воде. Концентрацию гип- пуровой кислоты определяют спектро- фотометрически путем сравнения поглощения раствора при 228 нм с поглощением раствора известной концентрации чистого соединения, Удельную активность энзима выражают в наномолях образуемой гиппуровой кислоты мин/мг протеина. Тестуемые соединения оценивают по их способности уменьшать удельную активность АСЕ.
Препарат сырого ангиотензин-прев- ращающего энзима.
Экстракция ацетонового порощка из легкого кролика. Влили 80 мл холодного раствора 0,05 М , доведенного до рН 8,3 с помощью гидроокиси калия, в мини-контейнер из нержавеющей стали (емкость 100 мл), предварительно охлажденный льдом. Добавили 5,0 г ацетонового порошка из легкого кролика и гомогенизировали смесь в течение одной минуты с использованием смесителя Waring Blender (установка 4). Контейнер охладили и продержали во льду в течение 2 мин. Повторили гомогенизацию и охлаждающую процедуру более двух раз.
Перенесли гомогенат в 250 мл лабораторный стакан, охлаждаемый льдом. Промыли мини-контейнер.20 мл холодного фосфатного буфера, рН 8,3, и объединили промывочную жидкос гь с гомогенатом. Перенесли гомогенат в поликарбонатные центрифугационные 5 пробирки (27x103 мм), охлаждаемые льдом. Центрифугировали в течение 40 мин при 40000 g (21500 об/мин) в роторной N 30, предварительно охлажденной до 4° С центрифуге Beckmon L 3-50. Перенесли верхний слой жидт кости в 250 мл лабораторный стакан, охлаждаемый льдом.
0
5
0
0
Влили 80 мл охлажденного раствора 0,05 М при рН 8,3 в мини-контейнер из нержавеющей стали, охлаждаемый льдом. Перенесли щарики из центрифугационных пробирок в мини- контейнер и повторили процедуру гомогенизации три раза, как это описано вьпче. Центрифугировали гомогенат, как это .описано выше, и объединили поверхностные слои с поверхностным ело ем, полученным после первого центри- фугирования. Хранили препарат при 4°С.
После стояния в течение нескольких недель при 4 С раствор энзима может становиться мутным и может иметь место седиментация в колбе. Раствор энзима может быть очищен путем центрифугирования при без какого-либо существенного изменения его удель- ной активности.
Диализ сырого экстракта. Превращающий энзим, которьм должен был использоваться для целей скрининга, диализовали для удаления низкомоле кулярных ингибиторов. Для этой цели около 30-40 мл сырого.экстракта поместили в диализирующую трубку Spect- rapor № 1 (отсекаемые молекулярные веса: 6000-8000), которую предварительно промыли 0,05 М буферным раствором фосфата калия с рН 8,3. Энзим диализовали в течение ночи (около 18 ч) против такого же буфера при
энзим хранили
4 С, Диализованный при 4 С; он. сохранял полную активность в течение трех недель.
I
Определение концентрации протеина Концентрацию протеина энзимного
препарата определяли согласно методу
Lowry (2). -;
Вода
BSA, 1 мг/мл
0,05 М , рН 8,3
Энзим в 0,05 М , рН 8,3
0,20 0,18 0,160,140,120,100,200,20
0,02 0,040,060,080,10
0,05 0,05 0,050,050,050,050,030,01
----0,020,04
Щелочной сульфат меди
1,0 1,0 1,0 1.0 1.0 1,0 1,0 1,0 Инкубировали в течение 10 минут при комнатной температуре
Фенольный реагент 0,1 0,1
.
O 5
0
5
0
5
Требуемые растворы получены в стекле с применением дистиллированной воды.
1.2%-ный , Растворили 5,0 г в воде и добавили достаточное количество воды для получения 250 мл раствора.
2.4%-ный натрий калий тартрат. Растворили 10,0 г натрий калий тарт- рата в воде и разбавили водой до 250 мл.
3.2%-ный карбонат натрия в О,1 М гидроокиси натрия. Растворили 20,0 г карбоната натрия и 4,0 г едкого натра в воде и разбавили раствор до 1000 мл водой.
4.Щелочной раствор сульфата меди. В день определения протеина смешали 0,1 мл 2%-ного раствора сульфата меди, 0,1 мл натрий калий тартратного раствора и 20 мл 2%-ного раствора карбоната натрия и 0,1 М раствора гидроокиси натрия в 25 мл;мерной мензурке.
5.Фенольный реагент. Разбавили 1 мл реагента (Sigma Chemical Со)
1 мл в день определения протеина.
6.Альбумин бычьего серума (BSA), Растворили 25 мг BSA (Sigma Chemical Со) в воде и разбавили до 25 мл водой. Хранение раствора при 4 С.
Методика, Концентрация протеина растворов энзима определяется с помощью стандартной кривой, полученной с BSA.
Растворы добавляли к испытуемьм пробиркам 13x10 мм в порядке, перечисленном в табл.1.
Таблица 1
.Oil
о,:
0,1
0,1
.Oil
9 .130А748
Проводили смешивание сразу же после добавления фенольного реагента и инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре.
5 в
Прослеживали поглощение ( ) каждого образца относительно воды,
Образец 1 был контрольным. Образцы 2 - 6 были стандартными, используемыми для получения стандартной кривой в диапазоне 20-100 мкг BSA,
Образцы 7 и 8 были неизвестными,
Расчеты, Провели вычитание для образца 1 из неизвестного образца. Для этого из стандартной кривой нашли количество протеина в мкг с огласно формулы: мг/мл протеина
1 OQtO мкг протеина х
мл, использование для испытания X фактор разбавления.
Определение активности ангиотен- зин-превращающего энзима и действие ингибиторов,
Для определения коэффициента экс- тинкции гиппуровой кислоты приготовили пять образцов (аналогичных),, содержащих 0,98, 0,96, 0,94, 0,92- и 0,90 мл..воды добавили 0,02, 0,04, 0,06, 0,08 и 0,1 мл водного раствора гиппуровой кислоты до 1 мл в такой же последовательности. Это привело к получению образцов, содержащих 20, 40, 60, 80 и 100 мкМ гиппуровой кислоты соответственно, зарегистрировали поглощение каждого образца относительно водного контроля при; 228 нм на ультрафиолетовом спектрометре. Использовали 1 мл кварцевую ячейку. Отложили зависимость поглощения каждого образца от соответствующей концентрации гиппуровой кислоты. График имел вид прямой линии, проходящей через нуль. Наклон прямой
Требуемые растворы бьши получены 5 в стеклянной посуде с использованием дистиллированной воды,
1,ЗМ NaCl, Растворили 175 г хлористого натрия в 800 мл воды. Перенесли раствор в мерный цилиндр и доtO вели объем до 1000 мл,
2,0,3 М КН, 1,5 М NaCl, рН 8,3. Растворили 12,2 г фосфата калия в 120 мл воды в лабораторном стакане Добавили 150 мл ЗМ хлористого натрия
f5 Перемешали раствор магнитной мешалкой и добавили разбавленную гидроокись калия для доведения рН раствора до 8,3, Перенесли раствор в мерный цилиндр и довели объем до 300 мл ,20 водой,
3,0,05 М ,, рН 8,3, Раство- рили 1,701 г фосфата калия в 220 мл воды. Довели рН раствора до рН 8,3 с помощью добавления разбавленной гид роокиси калия. Перенесли раствор в мерный цилиндр и довели объем раствора до.250 мл,
4,0,001 М гиппуровой кислоты - 0,05 М рН 8,3, Растворили
30
1,701 г КК,РО в 200 мл воды. Доба-.
вили 0,0448 г гиппуровой кислоты. Раствор перемешивали магнитной мешалкой и добавили разбавленной гидроокиси калия, чтобы довести рН раст- 35 вора до рН 8,3,-Перенесли раствор в мерньш цилиндр и довели объем раствора до 250 мл водой,
5.0,001 М гиппуровой кислоты. Растворили 0,0448 г гиппуровой кис40 лоты в 200 мл воды. Довели объем раствора до 250 мл водой,
6,0,025 М гиппурил-гистидил-лей- цина (HHL) - 0,04 М KHjP04, рН 8,3, Растворили 0,170 г в 20 мл
линии равен микромолярному коэффици- 1воды, Добавили 0,2685 г KHL и пере- енту экстинкции и Имел величину мешивали раствор магнитной мешалкой, 0,0103+5%, .Эта величина используется Добавили разбавленной гидроокиси каЛИЯ для доведения рН раствора до рН 8,3,
для, расчета концентраций гиппуровой кислоты в эксперименте с превращающим энзимом,
Методика измерения активности ан- гиотензин-превращающего энзима в присутствии и отсутствии потенциальных ингибиторов,
Реагенты для испытания. Неорганические реагенты и этилацетат были марки ХЧ, Гиппуровая кислота была получена от Sigma Chemical Со, Гиппу
8
10
риллистиднн-лейцин являлся продуктом, поставляемым Reseoreh Plus, Inc.
Требуемые растворы бьши получены 5 в стеклянной посуде с использованием дистиллированной воды,
1,ЗМ NaCl, Растворили 175 г хлористого натрия в 800 мл воды. Перенесли раствор в мерный цилиндр и доO вели объем до 1000 мл,
2,0,3 М КН, 1,5 М NaCl, рН 8,3. Растворили 12,2 г фосфата калия в 120 мл воды в лабораторном стакане, Добавили 150 мл ЗМ хлористого натрия,
f5 Перемешали раствор магнитной мешалкой и добавили разбавленную гидроокись калия для доведения рН раствора до 8,3, Перенесли раствор в мерный цилиндр и довели объем до 300 мл 0 водой,
3,0,05 М ,, рН 8,3, Раство- . рили 1,701 г фосфата калия в 220 мл воды. Довели рН раствора до рН 8,3 с помощью добавления разбавленной гид роокиси калия. Перенесли раствор в мерный цилиндр и довели объем раствора до.250 мл,
4,0,001 М гиппуровой кислоты - 0,05 М рН 8,3, Растворили
30
1,701 г КК,РО в 200 мл воды. Доба-.
вили 0,0448 г гиппуровой кислоты. Раствор перемешивали магнитной мешалкой и добавили разбавленной гидроокиси калия, чтобы довести рН раст- 35 вора до рН 8,3,-Перенесли раствор в мерньш цилиндр и довели объем раствора до 250 мл водой,
5.0,001 М гиппуровой кислоты. Растворили 0,0448 г гиппуровой кис40 лоты в 200 мл воды. Довели объем раствора до 250 мл водой,
6,0,025 М гиппурил-гистидил-лей- цина (HHL) - 0,04 М KHjP04, рН 8,3, Растворили 0,170 г в 20 мл
1воды, Добавили 0,2685 г KHL и пере- мешивали раствор магнитной мешалкой, Добавили разбавленной гидроокиси каводы, Добавили 0,2685 г KHL и пере- мешивали раствор магнитной мешалкой, Добавили разбавленной гидроокиси ка
ЛИЯ для доведения рН раствора до рН 8,3,
7,1 М НСЕ, Добавили 83 мл 37%-ной соляной кислоты к 500 мл воды в мерном цилиндре. Раствор сметали и дог вели объем раствора до 1000 мл водой.
8,0,00 М SQ 20,881, Растворили 3,0 мг SQ 20,881 в 2,72 мл воды,
9,4 мкМ SQ 20,881, Разбавили 0,01 мл раствора 8 2.49 мл 0,05 М KHjPO,, рН 8,3,
1304748 2
Растворы 2, 3, 4, 5, 6, 8 и 9 хра- - ,КОН, рИ 8,3 н хранили во
нили при 4 С,льду. Растворы внесли пипеткой в исМетод. Разбавили диализированную пытуемые пробирки 13x100 мм в порядАСЕ до 2 мг/мл раствором 0,05 М - ке, указанном в табл.2.
Таблица 2
0,05 М - 1-,5 М NaCI, рН 8,3
0,05 М рН 8,3
1 м1-1 гиппуровая кислота - 0,05 М , рН 8,3
0,025 К НН1 - 0,05 М KH,, рН 8,3
4микромоля SQ 20,881 0,05 М , рН 8,3
5мМ ингибитор (в 95%-ном этаноле)
95%-ньй этанол
.0,050,050,050,050,050,050,05
0,0450,0950,070,0950,0950,0950,07
0,05- .-0,020,020,020,020,020,020,02
0,025 0,025
- - - 0,005 . - 0,005 0,005 0,005 0,005 - 0,005 0,005
Опыт с каждьи образцом дублировался.
Образец 1 использовали для определения извлечения гиппуровой кислоты, Образец 2 - контроль активности АСЕ, Образец 3 - активность АСЕ в присутствии стандартного ингибитора. Образец 4 - активность АСЕ в присутствии спирторастворимого ингибитора.
НС, 1 М
Диализованный АСЕ, 2 мг/мл
НСЕ, 1 М
0,25
0,25 0,25 0,25
0,08 0,08 0,08 -0,08 0,08 0,08 0,08 0,25 0,25. 0,25 Образцы 1, 5, 6 и 7 удаляли из водяной бани после добавления энзима. Образцы 2, 3 и 4 инкубировали при 37°С в течение 10 мин перед добавлением НСЕ.
0,025 0,025
Образцы 5, 6 и 7 эталоны сравнения в начальный момент времени для образцов 1 и 2, 3 и 4 соответственно,
Вышеуказанные образцы и разбавленные растворы энзима инкубировали (2 мг/мл) при 37 С в водяной бане в течение 5 мин перед добавлением растворов, приведенных в табл.З.
Таблица 3
0,25 0,25 0,25
Конечная концентрация компонентов смеси составляла фосфат, 0,01 М, гиппуровой кислоты, 50 мкМ хлористого натрия, 300 мкМ и НН1 2 мМ. Концентрация стандартного ингибитора
SQ 20,881 составляла 0,4 мкМ, Удельная активность препарата АСЕ, использованного в этой методике составила 48 нм/мин/мг.
После добавления ко всем образцам НС 8 к каждому образцу добавили 1,5 мл .этилацетата и смешали в вихревом смесителе (установка 6) в течение 15 с, Центрифугировали образцы в течение 5 мин на верхнем столе, центрифугировали для отделения двух слоев жидкости. Отделили 1,0 мл из этилацетатного слоя каждого образца и перенесли в испытуемые пробирки 13x100 мл. Поместили испытуемые пробирки в аналитический испаритель (Organomation Associates, Inc.) с температурой воды 65°С. Выпарили образцы досуха в потоке азота чистоДоля поглощение при 228 нм извлечения микромолярный коэффициент
экстинкции
Активность энзима. Вычитают погло-25 дорастворимый ингибитор и о.бразце.
щение образцов 5, 6 и 7 из поглощения образцов 2, 3 и 4 соответственно, Это приводит к величине чистого поглощения за счет гиппуровой кислоты в контрольном образце, содержащем во30
содержащем спирторастворимьй ингиби тор.
2. Расчет образуемой гиппуровой кислоты, нМ, проводят следующим образом:
Гиппуровая чистое поглощение при 228 нм
кислота, мм
микромолярный коэффициент экстинкции
Активность превращающего энзима35 активность выражается в наномо- выражается в наномаля образуемой лях гиппуровой .кислоты/мин/мг про- гиппуровой кислоты/мин. Удельная теина.
Удельная активность активностьх ...- . . . . .-.... ... ...................
мг протеина в образце (0,16) .
% ингибирования рассчитывается следующим образом:
удельная активность - удельная активность .,,,,
% ингибирования - ............ . ./сГ..... . .....,..,. .,„,....,.., х 100.
удельная активность контроля
Концентрация испытуемого соедине- контрольный образец, извлекаемый об- ния Для целей скрининга все соедине- разец и образец в начальный момент
времени должны содержать одинаковое количество органического растворителя. Не обнаружено существенного влияния на активность АСЕ 5%-ного этанола или 2%-ного диметилсульфоксида. дартного ингибитора на актив ность АСЕ определяют каждый раз при испытании неизвестного соединения.
При растворении испытуемых соединия были испытаны при концентрации . 100 мкМ.
В качестве стандартного ингибитора активности АСЕ использовали нона- пептид SQ 20,881. Воздействие стано
50
2 Повышение концентрации этих растворителей приводят к ингибированию активности энзима.
Влияние испытуемого соединения на
нений в органических растворителях,
той 99,94% (10 мин). Удалили образ- цы из испарителя. Добавили 1 мл воды к к1аждой испытуемой пробирке и мешали в течение 20 с на вихревом
смесителе (установка 6).для растворения осадка. Зарегистрировали поглощение при 228 нм .() относительно воды. Использовали 1 мл кварцевую кювету.
Расчеты.
Извлечение гиппуровой кислоты. Вычитают величину поглощения образца 5 из величины поглощения образца 1. Чистое поглощение при 228 нм,
обусловленное 50 нМ гиппурой кислоты, добавляют к образцу 1. Долю гиппуровой кислоты, извлекаемую из образца 1 рассчитывают следующим образом;
X 1 ,5 X
50
дорастворимый ингибитор и о.бразце.
содержащем спирторастворимьй ингибитор.
2. Расчет образуемой гиппуровой кислоты, нМ, проводят следующим образом:
X 1,5 X
1
извлеченная
доля
времени должны содержать одинаковое количество органического растворителя. Не обнаружено существенного влияния на активность АСЕ 5%-ного этанола или 2%-ного диметилсульфоксида.
2 Повышение концентрации этих растворителей приводят к ингибированию активности энзима.
Влияние испытуемого соединения на
рН реакционной смеси определяют разбавлением 0,02 мл 5 мМ раствора испытуемого соединения 0,2 мл 0,05 М КНдР04- 1,5 М NaCl, рН 8,ЗиО,78 мл 0,05 М КН2Р04,рН 8,3. Концентрации испытуемого соединения, буферного раствора, органического растворителя и хлористого натрия в этом разбавленном растворе равны концентрациям этих компонентов в реакционной смеси. Если рН разбавленного раствора находится между 8,2 и 8,5, то5мМ раствор испытуемого соединения в органическом растворителе используется для испытания на воздействие на активность АСЕ. Если рН разбавленного раствора меньше 8,2 или больше 8,5, то алик- воту 5 мМ раствора разбавляют в 0,05М KHjP04 и рН доводят до 8,3.
Соединения, которые являются активными ингибиторами АСЕ, испытываются при нескольких .различных концентрациях ингибитора для того, чтобы определить 1 fo или константу ин- гибирования, . .
Вновь суспендировали шарики в 10 мл охлажденного 0,03 М 1-0-н-ок- тил-р-В-глюкопиранозид - 0,05 М ,, рН 8,3 в дробилке и повтори ли методику, описанную выше для гомогенизации и центрифугирования. Об единенные поверхностные слои жидкос ти, как было найдено, содержали око ло 70% активности, присущей первона
Активные соединения. Соединения, которые содержат активные группы и потенциально воздействуют как активные целенаправленные необратимые ин- ЗО гибиторы АСЕ, испытьгоаются на их способность к необратимому ингибирова- нию АСЕ, Такие соединения, предварительно инкубируют с АСЕ в 0,05 М
, рН 8,3 при 37°С. В различные чальному гомогенату. Энзим диализо- моменты времени отделяют аликвоты и
вали перед использованием.
испытьгеают на активность превращающего энзима, как это описано вьше. Параллельно проводят опыт с контрольной предварительно инкубированной смесью без испытуемого соединения.
Заключения об активности - Менее 20% ингибирования АСЕ, Соединения, вызывающие менее 20% ингибирования АСЕ активности рассматриваются как неактивные и далее не испытываются .
Соединения, вызывающие 20-50%-ное ингибирование активности АСЕ, рассматриваются как соединения средней активности. Такие соединения вновь испытываются для подтверждения процента ингибирования.
Соединения, которые имеют воспроизводимое ингибирование активности АСЕ более 50% при концентрации 100 мкМ, рассматриваются как активные. Такие соединения испытываются при различных концентрациях для того чтобы определить Igo или К.
Соединения, которые необратимо ин- гибируют АСЕ, испытываются далее для определения минимальной концентрации ингибитора, необходимой для инактивации АСЕ и скорости инактивации.
Активность соединения при О,1 мМ. Неактивное L 20% ингибирования.
Получение сырого ангиотензин-прев- ращающего энзима. (Pel - Freer) в 20 мл 0,03 М 1-0-н-октил-Р-1 -глюкопи-- ранозид - 0,05 М , рН 8,3 в 30 мл измельчителе ткани Potbr Elve- hjem, охлаждаемом льдом. Гомогенизо- вали., суспензию с применением мрхани- ческого тефлонового пестика (%) 3 прохода.
Гомогенат перенесли в охлажденную поликарбонатную пробирку (50 мл) для центрифугирования и центрифугировали в течение 25 мин при скорости
20000 об/мин (36900 х) в центрифуге SS-34 с использованием Sorval RC 5Е при 4°С. Перенесли верхний слой жидкости в лабораторный стакан 50 мл, охлаждаемый льдом.
Вновь суспендировали шарики в 10 мл охлажденного 0,03 М 1-0-н-ок- тил-р-В-глюкопиранозид - 0,05 М ,, рН 8,3 в дробилке и повторили методику, описанную выше для гомогенизации и центрифугирования. Объединенные поверхностные слои жидкости, как было найдено, содержали около 70% активности, присущей первона
чальному гомогенату. Энзим диализо-
чальному гомогенату. Энзим диализо-
вали перед использованием.
Следующие соединения были испытаны in vitro на ингибирование ангио- тензин-превращающего энзима, прила- гаемому здесь. Ингибирование пред- ставлено в виде величин Ij СоединениеI,
50
СООСНо,
NC-CHCH-iSCCHs II I II
о сн о соосн
NC-CHCH2.SH II I
о ш
19 мМ
245 мМ
to
N-(3 -Меркаптопропаноил)- -L-(1,2,3,4-тетрагидро- нзохинолин)-3-кар6оновая кислота3,8
N-(3 -Ацетилтио-2 -метил- пропаноил)-L- (1,2,3,4- -тетрагидроизохинолин)-3- -карбоновая кислота 0,04
4 С.
N-(3 -Меркапто-2 -метил- пропаноил)-L-(1,2,3,4- -тетрагидроизохинолин)- -3-карбоновая кислота 0,045
М-(3-Меркапто-2 метилпр паноил)- J5 -L-(1,2,3,4-тетрагидроизохинолин)-3- -карбоноиая кислота;
N-(3 -Ацетилтио-2 -метилпропано- ил)-Ь(1,2,3,4-тетрагидроизохинолин)- -3-карбоновая кислота,20
Это испытание дает предваритель - ные данные, указывающие на присутствие активности, направленной на центральную нервную систему и автономной активности, а также косвенно указы- 25 вающие на циркуляторную активность соединения. В этом испытании получают также предварительные данные по смертности, в результате-чего можно выбрать нелетальные дозы для использования в каких-либо дальнейших нужных фармакологических испытаниях,
Для каждой дозы используют . группу из 4 мы1ией, которым внутрибрюшинно инъекцией вводят соединение в количестве 60 мг/кг. Животных наблюдают для определения сильных явных симптомов в течение 1,5 ч после введения лекарства. Симптомы фиксируют и эти данные анализируют для проведения определения в том случае, если соединение имеет какую-либо пригодную, активность по отноп:ению к ЦНС и/или автономную активность. Определяют максимальную нелетальную дозу 45 и, если это возможно, приблизительные значения LDjo и EDjo t
В приложении А представлены результаты, полученные с использованием N-(3 меркапто-2 -метилпропано- 50 ил-L-(1,2,3,4-тетрагидроизохинолин)- -3-карбоновой кислоты (соединения № 3371), В приложении В представле1304748 8
для лакримации, расширения зрачков и птоза, и на активность по отношению к центральной нервной системе, тремор, конвульсии, моторную актив- 5 ность, атаксию и потерю рефлекса выпрямления. Наблюдали также одьтку и цианоз. Там, где эт.о возможно, указаны также ЕВзоИ LD.
Приложение А, Первичный фармакологический отбор. Испытание 100 особей на сильную реакцию в интервале доз.
Испытывали соединение (-) К 3371 (1 ч).
Автономная
Усиление лакри- мацин-22 Расширение зрач- ка-23
Общая
понижение ректальной темпера туры-3 О
EDso тела
715
640
мг/кг веса
НД
НД-ЕВ о не достигается
30 LDg 640 мг/кг веса тела
Код №: SKI-D 59-B
35 Источник: специалист/виварий
Проект: алкано- иламинокислоты
Цвет желтый
форма: жидкий раст- Носитель Tween
вор80
40 Основной фактор: 1,0
Вид: кры.са, вьздер- жанная без пищи 18ч.рН 3,0
Пол: самцы
Использованные дозы: Комнатная темпе- 640-10 мг/кг ратура: 22,4°С . ,Доведение рН: -.
перорально
Способ введения: перорально
соон UH
Количество живот- ных.на 1-ю дозу: 6
Структура:
ны результаты, полученные с использованием N-(3 -ацетилтио-2 -метил- пропаноил-L-(1,2,3,4-тетрагидроизохинолин) -3-карбоновой кислоты (соединение № 3370), Соединение № 3371 испытано на автономную активность
EDso тела
мг/кг веса
Автономная
Усиление лакри- мацин-22 Расширение зрач ка-23
Общая
понижение ректальной темпера туры-3 О
5
30 LDg 640 мг/кг веса тела
5
45
Код №: SKI-D 59-B
35 Источник: специалист/виварий
форма: жидкий раст- Носитель Tween
45
50
вор
40 Основной фактор: 1,0
Вид: кры.са, вьздер- жанная без пищи 18ч.
Использованные доз 640-10 мг/кг . ,
Количество живот- ных.на 1-ю дозу:
Структура:
55
О
HS
N
Ш
1913,04748. 20
Первичный фармакологический отбор. Центральная нерв- Испытание 100 особей на сильную ре- ная система акцию в интервале доз. Испытывали соединение № 3371 (1/2 ч)
снижение моторной 5 активности
ЕП,о. тела
мг/кг веса
Автономная
усиление лакрима- ции 22НД
расширение зрачка 23
640 мг/кг веса тела
од №: SKI-D-59-B
НД
НД-ЕВуд не достигается
Общая
15
еиижение темпе туры пищевода
LDyg приблизитель равна 320 мг/кг веса тела
Проект: алкано- 20 LD равна прибли- иламинокислоты
зительно 160 мг/к веса тела
Цвет желтый
специа
Носитель: Tween 80
Форма: жидкий растворрН 3,0
Основной фактор: 1,0
Вид: крыса, выдержанная без пищи 18 ч
Использованные дозы:
640-10 кг/кг веса тела
Количество животных на 2-ю дозу: 6
Пол: самць
Температура 22,3°С Доведение рН 30 Форма: жидкий раст- Носитель: 15% вор
Основной фактор: .1,0
Носитель: Tween 80
рН: 3,5
, Вид: мышь, не выдержанная без пищи
Пол: самцы
Температура 2,8°С
Способ введения: 40 Использованные до- Доведение рН: перорально
зы:
320-20 мг/кг
Способ введения: внутрибрюшинно
тральная нерв- система
снижение моторной 5 активности
Автономная птоз 20
расширение зрачка 23
Общая
120
НД
еиижение температуры пищевода 32 160
LDyg приблизительно не дос- равна 320 мг/кг веса тела
тигается s-o 7 LDjo
LD равна прибли-
зительно 160 мг/кг веса тела
Код №: SKI-D-59-B
Проект: алкано- иламинокислоты
Источник: специалист/виварий
Форма: жидкий раст- Носитель: 15% вор
Основной фактор: .1,0
Цвет: желтый
Носитель: Tween 80
рН: 3,5
Вид: мышь, не выдержанная без пищи
Пол: самцы
Температура 2,8°С
зы:
320-20 мг/кг
Способ введения: внутрибрюшинно
Структура:
О
HS
соон
сн,
Первичный фармакологический отбор. Испытание 100 особей на сильную секцию в интервале Доз. Испытьгоали сое- динение N 337 1 .
EIVo . тела
мг/кг веса
Количество животных на 1-ю дозу: 4
Структура: .
О соон
СНо,
Первичный фармакологический отбор. Испытание 100 особей на сильную реакцию в интервале доз, Испытьюали соединение № 3371 (3,5 и 24 ч).
211304748
томы
еса не достигается
59-В Проект: алканоил- аминокислоты
Ко
Ис ли ви
Источник: специалист/виварий
Цвет желтый
Носитель:Tween 80
рН 3,0 Пол: самцы
Комнатная температура: 21,7°С
Доведение рН: Количество животных на 1-ю дозу: 6 Способ введения;
перорально
О
соон
HS
ш,Ч
Первичный фармакологический отбор. Испытание 100 особей на сильную реакцию в интервале доз. Испытывали соединение № 3371 (1ч).
EDjj EDyo /1Л),0 ЬП„/ ЕВ„ , мг/кг веса тела
Автономная
усиление лакрима- ции 22 320
715 0,9
зрач
0,9 0,4
320 640 1 0,5
1
НД нд нд нд
нд 50 не достигается
22
640 мг/кг веса тела
Проект: алканоил- аминокислоты
Цвет: желтый
Форма: жидкий рас- Носитель: Tween
80
рН 3,0
Пол: самцы
Температура 22,4 С
Доведение рН: Способ введения: перорально
твор
Основной фактор: 1,0
Вид: крыса, выдержанная без пищи 18 ч
Использованные
дозы:
640-10 мг/кг
Количество животных на 1 дозу: 6
Первичный фармакологический отбор. Испытание 100 особей на сильную pev акцию в интервале доз. Испытывали со единение № 3371.
EDo EDso /ЬП„ /LD
ED,j ED,oo, МГ/КГ веса тела
35 Центральная нервная
система
снижение моторной активности - 5
Автономная птоз 20
39 113 2,83 1,42 0,48
39 120 2,67 1,33 0,44
расширение зрачка 23
нд нд
нд нд нд
5Q Общая
5
снижение температуры пищевода 32
равна приблизительно320 мг/кг веса тела
80 160 0,5
2 1
не достигается
23
Проект: алканоил аминокислоты
1304748
Общая
24
5
снижение температуры пищево- да 32
42 .
,о не достигается
130474826
ED о ED so ЬП-го EDjp EDjjj ED,gQ МГ/КГ веса тела
8 40. 2,1 1,05 0,22 34 108 0,78 0,39 0,12
40 57 0,74 0,53
20 40 2,1 1,05 0,53
42 84 1 0,5 0,25
(
21 42 2 1 0,5
не достигается
ьно равна 84 мг/кг веса тела ьно равна 42 мг/кг веса тела Проект: алканоиламинокислоты
т
Цвет белый
Носитель г вода
рЦ 6
Пол самцы
130474828
Температура 22,5 С
Доведение рН Способ введения: внутрибрюптьтитт
шинно
птьтитт
шинно
(Количество животных на 1-ю дозу: 4
( Формула изобретения
Способ получения производных тет- рагидроизохинолина общей формулы
где R,-R - независимо друг от друга водород или низший алкил с 1-6 атомами, углерода;
RP - водород или низший алканоил с 1-ft атомами углерода, отличающийся тем, что тетрагидроизохинолин общей формулы
COOY
.где Y - низший алкил,. подвергают ацилированию формулы
кислотой
Нз RI ОН II / R5-8-C-C-C I I li Нг О
где R4-R4 имеют указанные значения, в присутствии дициклогексилкарбодии- мида с последующим гидролизом и выделением целевого продукта.
название | год | авторы | номер документа |
---|---|---|---|
Способ получения замещенного октагидро-1-( @ -меркаптоалканоил)- @ -индол-2-карбоновой кислоты или их фармацевтически пригодных солей | 1981 |
|
SU1246893A3 |
ЗАМЕЩЕННЫЕ 6- И 7-АМИНОТЕТРАГИДРОИЗОХИНОЛИН-КАРБОНОВЫЕ КИСЛОТЫ | 1998 |
|
RU2212405C2 |
Способ получения производных бистетрагидроизохинолин-N-сульфонимидов или их солей с щелочным металлом | 1981 |
|
SU1017169A3 |
ПРОИЗВОДНЫЕ ПИРИМИДИНА | 1999 |
|
RU2236407C2 |
НОВЫЕ ГЕТЕРОЦИКЛИЧЕСКИЕ ПРОИЗВОДНЫЕ И ИХ МЕДИЦИНСКОЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ | 2002 |
|
RU2287529C2 |
Способ получения производных пролина | 1979 |
|
SU1115668A3 |
Способ получения оптически активного бромзамещенного 2-амино-1,2,3,4-тетрагидронафталина | 1990 |
|
SU1826966A3 |
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПЕНИЦИЛЛИНОВ | 1973 |
|
SU367605A1 |
ПРОИЗВОДНЫЕ БЕНЗОКСАЗИНА, СПОСОБЫ ИХ ПОЛУЧЕНИЯ, ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИЙ ПРЕПАРАТ | 1994 |
|
RU2130020C1 |
ПРОИЗВОДНЫЕ ТЕТРАГИДРОИЗОХИНОЛИНА И ИХ СОЛИ И ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ НА ИХ ОСНОВЕ | 2000 |
|
RU2256661C2 |
Изобретение касается производных азотогетероциклических соединений, в частности соединений общей формулы I СЮЮУ СН-Ш-С-f-CH -CHi СН-СН- сCHi-N-CtObCRiRj-CRjpik-S-Rs , где Y - низший алкил; R, 4 за- висимо друг от друга Н или С,-Cg-алкил; Ry-H, С -С -алконоил, которые как проявляющие противогипертензив- ную активность могут быть использованы в медицине. Для выявления активно сти у соединений указанного класса бьши получены новые соединения Т, Реакцию ведут из тетрагидроизохинолина и алкилирующей кислоты в присутствии дициклокарбодиимида с последующим гидролизом и выделением целевого со- .единения I с выходом до 91%. Соединения I являются активными ингибиторами ангиотензинпревращения энзима; токсичность LDj.Q 84 мг/кг живой массы. с S (У) 00 о 4 4 00
Вейганд-Хильгетаг | |||
Методы эксперимента в органической химии | |||
М.: Химия, 1964, с.445-450 |
Авторы
Даты
1987-04-15—Публикация
1981-05-11—Подача