Способ получения неорганической пирофосфатазы из еSнеRIснIа coLI Советский патент 1988 года по МПК C12N9/14 C12N9/14 C12R1/19 

Изобретение относится к ферментной промьшшенности, а именно к способу получения неорганической пиро- фосфатазы из Escherichia coll.

Цель изобретения - упрощение процесса.

Способ предусматривает проведение термической обработки при температуре 53-88°С, что по сравнению с прототипом позволяет более полно отделить посторонние белки на этой стадии очистки. Длительность термической обработки в предлагаемом способе составляет 1-2 мин,

Зависимость продолжительности обработки, выхода и активности фермента представлена в табл. 1.

Таблица

Согласно этой таблице оптимальное время термообработки составляет 1,5- 2 мин.

Увеличение эффективности термической обработки происходит за счет того, что неорганическая пирофосфа- таза лучше выдерживает термическую обработку в течение короткого времени при повышенной по сравнению с прототипом температуре чем посторонние белки. Термическую обработку можно проводить согласно изобретению при 83-88°С. Оптимальной является температура 83-85°С. При меньших температурах остается больше посторонних белков, при больших - происходит значительная инактивация неорганической пирофосфатазы.

Хроматографирование на 1,6-диами- ногексилагарозе позволяет обеспечить эффективную очистку неорганической пирофосфатазы благодаря тому, что сродство неорганической пирофосфатазы Rscherichia coli к 1,6-диамино- гексилагарозе велико по сравнению с другими белками. Вследствие этого

0

0

5

0

j

они отделяются от 1,6-диаминогексил- агарозы при концентрации NaCl, не достаточной для элюции неорганической пирофосфатазы. Последняя отделяется при концентрации NaCl около 0,5 М, что редко встречается в практике хроматографирования белков на этом сорбенте.

То, что неорганическая пирофосфа- таза Escherichia coli лучше выдерживает нагревание при повышенной температуре в течение короткого времени чем посторонние белки и имеет высокое сродство к 1,6-диаминогексилага- розе, ранее не было известно и не г могло быть предсказано на основании имевшихся данных.

Увеличение эффективности термической обработки в сочетании с высокой эффективностью хроматографирования на 1,6-диаминогексилагарозе позволяет исключить стадии центрифугирования, обработки стрептомицин- сульфатом и кристаллизации и проводить Хроматографирование в одну стадию вместо двух.

В табл.2 приведены выход и удельная активность неорганической пиро- фосфатазы после термической обработки при разных температурах. Нижняя строка содержит данные, полученные при проведении термической обработки согласно известному способу.

I

Т а б л и ц а 2

П р и мер. Суспензию 2 кг биомассы Escherichia coli (штамм МРЕ- 600) в 6 л 0,05 М буфера трис-НС1 (рН 7,2), содержащего 10 мМ MgCli,,

обрабатывают на гомогенизаторе СКТБ Дезинтегратор или 15М (Gaulin США) в режиме 300-500 атм. Полученную суспензию последователь- но пропускают со скоростью 3,6 л/ч через два теплообменника, омываемые водой при температуре 85-и соответственно и центрифугируют, К надосадочной жидкости прибавляют сульфат аммония до насыщения 0,55, центрифугируют, осадок отбрасывают, к надосадочной жидкости прибавляют сульфат аммония до насыщения 0,75, центрифугируют. Осадок растворяют в 200 мл воды, диализуют против воды и наносят на колонку диаметром 4 см и длиной 50 см с 1,6-диаминогексил- агарозой. Колонку промывают буфером 0,05 М трис-НС1, содержащим 1 мМ MgCl/2 с возрастающей концентрацией NaCl (от О до 0,7 М) до десорбции неорганической пирофосфатазы. Выход неорганической пирофосфатазы с уделной активностью 1250 Е/мг составля- ет 170 мг/кг биомассы.

Технико-экономическая эффективность способа заключается в упрощеРедактор Л,Павлова Заказ 739

Составитель И,Привалова

Техред М.Ходанич Корректор Л,Патай

Тираж 520Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР

по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж-35, Раущская наб., д, 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г, Ужгород, ул. Проектная, 4

нии процесса выделения неорганической пирофосфатазы- за счет сокращения числа стадий и обеспечения технологичности при крупномасштабном производстве,, что дает возможность обеспечить потребность в неорганической пирофосфатазе для развития прогрессивного иммуноферментного анализа в СССР,

Формула изобретени

Способ получения неорганической пирофосфатазы из Escherichia coli, предусматривающий разрушение исходных клеток, термическую обработку, . фракционирование сульфатом аммония и хроматографирование с использованием ионообменного сорбента, отличающийся тем, что, с целью упрощения процесса, температуру термической обработки устанавливают равной 83-88°С и продолжительность воздействия 1-2 мин, а при хромато- графировании в качестве ионообменного сорбента используют 1,6-диамино- гексилагарозу.

Изобретение позволяет упростить процесс получения неорганической пирофосфатазы из Escherichia coli. Разрушение клеток осуществляют дезинтеграцией. Термическую обработку ведут в проточном теплообменнике при 83-88 С в течение 1-2 мин. Фракционирование сульфатом аммония и хроматография на 1,6-диаминогексилагарозе обеспечивают получение пирофосфатазы с удельной активностью 1250 Е/мг белка при выходе 170 мг/кг биомассы. 2 табл.